BR112013015001B1

BR112013015001B1 - Peptídeo antitumor isolado ou sintético, composição farmacêutica, e, usos de um peptídeo

Info

Publication number: BR112013015001B1
Application number: BR112013015001-7A
Authority: BR
Inventors: Luiz Rodolpho Raja Gabaglia Travassos
Original assignee: Recepta Biopharma S.A.
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2021-10-13
Also published as: BR112013015001A8; JP2014510699A; EP2654769A2; JP6087289B2; PT2654769T; ES2804476T3; US9193797B2; BR112013015001A2; US20160108132A1; EP2654769A4; WO2012080822A9; CO6721014A2; WO2012080822A2; US20130315902A1; US9896512B2; EP2654769B1

Abstract

peptídeo antitumor isolado ou sintético, composição farmacêutica, e, usos de um peptídeo. são aqui descritos novos peptídeos isolados ou sintéticos derivados de uma sequência de aminoácido de domínio hipervariável de região determinadora de complementaridade de um anticorpo monoclonal humanizado para o transportador napi2b, assim como seus derivados, e uma composição farmacêutica e um método para inibir o crescimento de tumor ou tratar um tumor ou tratar um câncer usando os peptídeos antitumores e seus derivados.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica prioridade para o pedido de patente provisório U.S. Ser. No. 61/422.856, depositado em 14 de dezembro de 2010, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO

[002] A presente assunto focalizado diz respeito a peptídeos biologicamente ativos. Em particular, o presente assunto focalizado fornece novos peptídeos antitumores derivados de uma região determinadora de complementaridade de um anticorpo monoclonal humanizado para o transportador NaPi2B, e às composições farmacêuticas e métodos para inibir ou tratar um tumor ou câncer. O presente assunto focalizado diz respeito ainda aos métodos de triagem para identificar compostos antitumor, por exemplo, peptídeos antitumores.

FUNDAMENTOS

[003] Por todo o mundo, vários carcinomas (cânceres) destacam-se como assassinos dominantes, com milhões de pessoas morrendo de câncer a cada ano.

[004] Esta doença é caracterizada pela proliferação de células anormais ou neoplástica derivadas de um tecido normal, que forma uma massa de tumor, a invasão de tecidos adjacentes por estas células anormais, e a geração de células malignas que eventualmente se espalham por intermédio do sangue ou sistema linfático para os linfonodos regionais e para sítios distantes (metástase). Com muito poucas exceções, doença metastática de um carcinoma é fatal.

[005] Devido às taxas de retorno e efeitos colaterais do tratamento contra o câncer corrente, existe uma necessidade enorme quanto a novos agentes terapêuticos capazes de inibir o crescimento da célula neoplástica. Neste cenário, as moléculas de imunoglobulina (Ig) (tanto IgM e IgG) foram recentemente relatadas como fontes de peptídeos bioativos que podem demonstrar atividades antimicrobianas, antivirais e antitumor diferencial IN VITRO e IN VIVO (Polonelli ET AL. PLoS A. 3(6): e2371, 2008; Magliani ET AL., Curr Med Chem. 6(18): 2305-23, 2009). Tal distribuição interna de sequências de aminoácido bioativas se assemelha àquela de outras sequências de peptídeo expressadas em receptores de imunidade nativa (Litman ET AL., Nat. Rev. Immunol., 5: 866-879, 2005). Entretanto, não existe nenhuma similaridade estrutural entre elas. Os peptídeos bioativos com tamanhos variando de 10 aa a 20 aa foram obtidos a partir dos domínios hipervariáveis da região determinadora de complementaridade (CDR), a partir de sequências que incluem estrutura e aminoácidos de CDR, e ao=inda a partir de regiões constantes de Ig. Para serem testadas, as preparações sintéticas de peptídeos foram usadas que foram no geral amidadas no aminoácido do terminal C. Embora a bioatividade seja no geral independente da especificidade de anticorpo, a CDR3 de VH pode compartilhar as propriedades de ligação de antígeno do anticorpo original. Isto é especialmente verdadeiro quando o antígeno é uma sequência de peptídeo e menos quando a mesma é um carboidrato. Os peptídeos de CDR3 da cadeia pesada que atuam como o anticorpo original são chamados de “microanticorpos (=microAbs)”.

[006] A conformação dos peptídeos CDR3 VH (H3) foi revisada por Morea ET AL. (J. Mol. Biol., 275: 269-294, 1998). Diferente das estruturas canônicas das outras cinco CDRs (H1, H2, L1, L2, L3), as alças H3 têm vários tamanhos flanqueados por C92e G104de acordo com Kabat ET AL. (Sequences of proteins of immunological interest, 5a edição, Public Health Service, N.I.H., Washington, DC., 1991) numerando nas sequências prolongadas de 10 a 22 aminoácidos.

[007] Um exemplo de uma CDR3 VH bioativa identificada em um anticorpo monoclonal (mAb) é descrito a seguir. Usando o mAb de melanoma antiB16F10 A4 (Dobroff ET AL., Hybrid. Hybridomics 21: 321-331, 2002), todas as seis CDRs foram testadas na forma de peptídeos sintéticos quanto a citotoxicidade. Os peptídeos H3 prolongados lineares e cíclicos ligados às células de tumor, competiram com mAb A4 quanto a ligação e eles foram citotóxicos nas células que expressam protocaderina β-13, mas não nas células de leucemia HL-60 que não o expressam (Dobroff ET AL., Translat. Onc., 3: 204-217, 2010). A vantagem de usar microAbs está no seu tamanho pequeno tornando fácil conduzir a análise de estrutura-função e a sua acessibilidade aos sítios de reação complexos.

[008] As sequências de peptídeo internas nas imunoglobulinas (por exemplo anticorpos monoclonais) pertencem às regiões constantes e variáveis. As CDRs, ou as sequências que reconhecem antígeno, embora consideradas como domínios hipervariáveis, podem ser individualmente compartilhadas pelas imunoglobulinas ou anticorpos diferentes. Tal similaridade entre anticorpos pode envolver todas as CDRs (cada uma em uma família de moléculas de Ig) com a exceção de CDR3 VH. Esta CDR tende a ser única para um dado anticorpo na sua sequência C92-G104original.

[009] Mattes ET AL obtiveram, em 1987, uma IgG1 de murino monoclonal chamada de MAb MX35, pela imunização de camundongos com uma mistura de quatro espécimes de carcinoma ovariano fresco. A mesma mostrou reatividade com aproximadamente 90 % de cânceres epiteliais ovarianos humanos e um número limitado de tecidos normais como determinado pela imuno-histoquímica (Mattes ET AL., Cancer Res. 47: 6741-6750, 1987). MAb MX35 mostrou reagir também com linhagens de célula de carcinoma pulmonar e renal mas não com a maioria das outras linhagens de célula de carcinoma assim como linhagens de célula derivadas de melanoma, astrocitomas, sarcomas, teratocarcinomas, coriocarcinomas e tumores hematopoiéticos. A mesma reagiu com 5/5 espécimes de células de ascite de carcinoma ovariano fresco pela imunofluorescência, com 3/6 cistos benignos e 18/18 carcinomas de tecido sólido pelo tingimento de imunoperoxidase de seções congeladas (Mattes ET AL., Cancer Res. 47: 6741-6750, 1987).

[0010] Subsequentemente, a localização e biodistribuição de anticorpo de murino radiorrotulado foi estudado em pacientes com carcinoma ovariano em testes clínicos de fase I. F(ab’) de MAb MX35 mostrou localizar aos depósitos de carcinoma ovariano micrometastáticos na cavidade peritoneal (Finstad ET AL., Clin Cancer Res. 3(8): 1433-1442, 1997). MAb MX35 e seus fragmentos rotulados com nuclídeo emissor de partícula alfa 211astatina (At-a) mostrou alta eficácia no tratamento do crescimento do tumor micrometastático em um modelo de camundongo nu de câncer ovariano humano (Elgqvist et al.,J Nucl Med. 46 (11): 1907-15, 2005). Também, o MX35 MAb mostrou localização de tumor seletiva eficiente IN VIVO como indicado pela formação de imagem PET e histologia. O mesmo também alvejou tumores em pacientes com câncer ovariano sem nenhum evento adverso severo relatado (Hultborn ET AL., Cancer Biother Radiopharm 21: 373381, 2006).

[0011] Mais recentemente, uma versão humanizada de MX35 (chamada de huMX35 ou RebMab200) foi obtida e é descrita em um pedido de patente internacional depositado em 29 de janeiro de 2009 (PCT/US2009/000576).

[0012] Por todo este relatório descritivo, várias publicações científicas e patentes ou pedidos de patente publicados são dados como referência. A divulgação de todas estas publicações em suas totalidades é por meio deste incorporada por referência no seu relatório descritivo de modo a descrever mais completamente o estado da técnica à qual o presente assunto focalizado pertence. A citação ou identificação de qualquer referência nesta seção ou qualquer outra parte deste pedido não deve ser interpretado como uma admissão de que tal referência esteja aqui disponível como técnica anterior.

SUMÁRIO

[0013] É um objetivo do presente assunto focalizado identificar e fornecer peptídeos capazes de inibir o crescimento de células neoplásticas, tais como células cancerosas. Foi descoberto que os peptídeos derivados do anticorpo monoclonal humanizado RebMab200 (huMX35) afetam o crescimento IN VITRO de várias linhagens de célula de tumor humano e também inibem o crescimento metastático IN VIVO em um modelo singênico. Foi descoberto que os peptídeos alvejam as células cancerosas imprimindo respostas dependentes da dose significantes, que variam de hiperaderência até a inibição da migração da célula traduzida ainda em inibição da invasão e metástase celulares.

[0014] Consequentemente, um aspecto do presente assunto focalizado é fornecer um peptídeo antitumor isolado ou sintético que compreende uma sequência de aminoácido derivada da região determinadora de complementaridade de um anticorpo monoclonal humanizado RebMab200, como identificado pela SEQ ID NO: 3, ou um derivado da mesma. O derivado da SEQ ID NO: 3 pode incluir uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 8, 9 e 14 a 33. Os presentes peptídeos mostram atividade antitumor mesmo contra células de tumor que não reagiriam com mAb MX35, tais como melanoma e podem ser usados como um ativo em uma composição farmacêutica ou um método para inibir o crescimento de tumor ou tratar um tumor ou câncer.

[0015] Consequentemente, um outro aspecto do presente assunto focalizado é fornecer uma composição farmacêutica que compreende um ou mais dos peptídeos antitumores e um carreador farmaceuticamente aceitável. Ainda um outro aspecto do presente assunto focalizado é fornecer um método de inibir o crescimento de tumor ou tratar um câncer, que compreende administrar a um indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz dos peptídeos antitumores.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016] A Figura 1A é uma representação gráfica do efeito de RB9 sobre a adesão celular em B16F10-Nex2.1 de murino.

[0017] A Figura 1B é uma representação gráfica do efeito de RB10 sobre a adesão celular em B16F10-Nex2.1 de murino.

[0018] A Figura 1C é uma representação gráfica do efeito de RB9 sobre a adesão celular em glioblastoma U87MG humano.

[0019] A Figura 1D é uma representação gráfica do efeito de RB10 sobre a adesão celular em glioblastoma U87MG humano.

[0020] A Figura 2A é uma representação gráfica do efeito de RB9 sobre a adesão celular em câncer mamário SKBR3 humano.

[0021] A Figura 2B é uma representação gráfica do efeito de RB10 sobre a adesão celular em câncer mamário SKBR3 humano.

[0022] A Figura 2C é uma representação gráfica do efeito de RB9 sobre a adesão celular em melanoma A2058 humano.

[0023] A Figura 2D é uma representação gráfica do efeito de RB10 sobre a adesão celular em melanoma A2058 humano.

[0024] A Figura 3A é uma representação gráfica do efeito de RB9 sobre a adesão celular em células de tumor cervical SiHa humano.

[0025] A Figura 3B é uma representação gráfica do efeito de RB10 sobre a adesão celular em células de tumor cervical SiHa humano.

[0026] A Figura 4A é uma representação gráfica do efeito de RB9 sobre a adesão celular em células de tumor colônico HCT humano.

[0027] A Figura 4B é uma representação gráfica do efeito de RB10 sobre a adesão celular em células de tumor colônico HCT humano.

[0028] A Figura 5 demonstra os efeitos antitumor IN VIVO de RB9 e RB10 sobre as células de melanoma B16F10-Nex2, que foram tratadas com controle, um microanticorpo verdadeiro de um mAb antimelanoma citotóxico (A4 H3), RB9 e RB10.

[0029] A Figura 6 é uma representação gráfica de nódulos de melanoma pulmonar reduzidos pelo tratamento de RB9 e RB10 quando comparado com o controle e A4 H3.

[0030] A Figura 7A é uma representação gráfica de uma citotoxicidade branda de RB9 para células HL-60 de leucemia humana medida pelo azul de Tripano.

[0031] A Figura 7B é uma representação gráfica de uma citotoxicidade branda de RB9 para as células HL-60 da leucemia humana medida pelo ensaio de MTT.

[0032] A Figura 8A é uma representação gráfica da falta de citotoxicidade de RB9 para as células de tumor ovariano OVCAR-3 humano medida pelo azul de Tripano.

[0033] A Figura 8B é uma representação gráfica da falta de citotoxicidade de RB9 para as células de tumor ovariano OVCAR-3 humano medida pelo ensaio de MTT.

[0034] A Figura 9 é uma representação gráfica de efeitos de células aderentes pelos derivados de RB10 para a série de varredura de alanina: RB10a, RB10 A1, RB10 A3, RB10 A4, RB10 A5, RB10 A6 e RB10 A8, cada um em uma concentração de 1 mM, quando comparado ao controle e RB10.

[0035] A Figura 10A é uma representação fotográfica da produção IN VITRO de superóxido aniônico em células de tumor B16F10-NEx2 não tratadas (controle).

[0036] A Figura 10B é uma representação fotográfica da produção IN VITRO de superóxido aniônico em células de tumor B16F10-NEx2 tratadas com H2O2 (positivo).

[0037] A Figura 10C é uma representação fotográfica da produção IN VITRO de superóxido aniônico em células de tumor B16F10-NEx2 tratadas com RB10.

[0038] As Figuras 11A a 11C são representações gráficas de HPLC Espectrometria de Massa quanto à meia-vida de RB9.

[0039] A Figura 11A é uma representação gráfica de HPLC Espectrometria de Massa de plasma humano não tratado.

[0040] A Figura 11B é uma representação gráfica de HPLC Espectrometria de Massa de plasma humano tratado com RB9, em 0 hora.

[0041] A Figura 11C é uma representação gráfica de HPCL Espectrometria de Massa de plasma humano tratado com RB9, em 24 horas.

[0042] A Figura 12 é uma representação gráfica de 50 % de degradação do peptídeo RB9 em plasma humano depois de 2 horas.

[0043] A Figura 13A é uma representação fotográfica da migração de células de melanoma B16F10-Nex2 em controle, em 0 hora (esquerda) e 24 horas (direita).

[0044] A Figura 13B é uma representação fotográfica da migração de células de melanoma B16F10-Nex2 inibida pelo tratamento com RB10 500 μM, em 0 hora e 24 horas.

[0045] A Figura 14 é uma representação gráfica da inibição dependente da dose de RB10 da migração em células de melanoma B16F10- Nex2 de murino.

[0046] A Figura 15 é uma representação fotográfica da Inibição parcial pelo RB10 do crescimento de células de melanoma B16F10-Nex2 de murino, depois de 12 horas de incubação.

[0047] A Figura 16A é uma representação gráfica da inibição completa da migração de célula B16F10-Nex2 por RB9 e inibição parcial pelo RB9 Misturado, RB9M1, RB9 M2, RB9 M3 e RB9 M4.

[0048] A Figura 16B é uma representação gráfica da inibição completa da migração de célula B16F10-Nex2 por RB9 e inibição parcial por RB9 M5.

[0049] A Figura 16C é uma representação gráfica da inibição parcial da migração de célula B16F10-Nex2 por RB9 Sc2 e Rb9 Sc3.

[0050] A Figura 16D é uma representação gráfica da inibição completa da migração de célula B16F10-Nex2 por RB10 e RB10 M3 e inibição parcial por RB10 Misturado e RB10 M4.

[0051] A Figura 16E é uma representação gráfica da não inibição da migração de célula B16F10-Nex2 por RB10 A1.

[0052] A Figura 16F é uma representação gráfica da inibição parcial da migração de célula B16F10-Nex2 pelo RB10 M1, RB10 A3, RB10 A4, RB10 A6 e RB10 A8.

[0053] A Figura 17A é uma representação gráfica da inibição completa da migração de célula A2058 de melanoma humano por RB9.

[0054] A Figura 17B é uma representação gráfica da inibição parcial da migração de célula U87 de glioblastoma humano por RB9.

[0055] A Figura 17C é uma representação gráfica da inibição parcial da migração de célula HCT de câncer colônico humano por RB9.

[0056] A Figura 17D é uma representação gráfica da não inibição da migração de célula SiHa do câncer do colo do útero humano por RB9.

[0057] A Figura 17E é uma representação gráfica da inibição parcial da migração de célula OVCAR-3 do câncer ovariano humano por RB9.

[0058] A Figura 17F é uma representação gráfica da inibição completa da migração de célula SKBr-3 do câncer mamário humano por RB9.

[0059] A Figura 18A é uma representação gráfica da inibição parcial da migração de célula U87 de glioblastoma humano por RB10.

[0060] A Figura 18B é uma representação gráfica da inibição parcial da migração de célula U87 de glioblastoma humano por RB10 M3.

[0061] A Figura 18C é uma representação gráfica da inibição quase completa da migração de célula SiHa do câncer do colo do útero humano por RB10 M3.

[0062] A Figura 18D é uma representação gráfica da inibição quase completa da migração de célula HeLa do câncer de colo do útero humano por RB10 M3.

[0063] A Figura 19A é uma representação gráfica da não inibição da migração de fibroblastos 3T3 de murino por RB9.

[0064] A Figura 19B é uma representação gráfica da não inibição da migração de fibroblastos FibroRP humanos primários por RB9.

[0065] A Figura 19C é uma representação gráfica da não inibição da migração de fibroblastos humanos primários T75 por RB9.

[0066] A Figura 20 é uma representação gráfica da inibição dependente da dose por RB9 da invasão de células de melanoma B16F10- Nex2 de murino através de Matrigel.

[0067] A Figura 21 é uma representação gráfica do efeito não hemolítico de RB10 M3.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0068] As definições abaixo servem para fornecer um entendimento claro e consistente do relatório descritivo e reivindicações, que incluem o escopo a ser dado tais termos.

[0069] Pela frase “citotoxicidade de célula de tumor,” efeitos diferentes são aludidos, que incluem inibição do crescimento, parada do ciclo celular, inibição da motilidade celular, aumento na aderência de célula, inibição da invasão de célula através de um substrato matriz, morte de célula induzida por receptor, interferência no metabolismo da célula e caminhos de sinalização que levam à senescência ou morte. Estes efeitos podem ser estudados IN VITRO ou IN VIVO.

[0070] O termo “peptídeo” como aqui usado significa um composto que é fabricado de dois ou mais aminoácidos unidos por ligações covalentes que são formadas pela eliminação de uma molécula de H2O do grupo amino de um aminoácido e do grupo carboxila do aminoácido seguinte. Para o propósito do presente assunto focalizado, um peptídeo pode estar em um arranjo linear ou cíclico de resíduos de aminoácido, isto é, as extremidades do peptídeo linear ou as cadeias laterais de aminoácidos dentro do peptídeo podem ser unidos, por exemplo, por uma ligação química.

[0071] O termo “isolado” para os propósitos do presente assunto focalizado refere-se a um estado de materiais biológicos (por exemplo, ácido nucleico, peptídeo ou proteína) que foram removidos de seu ambiente original (o ambiente no qual estão naturalmente presentes), ou o estado onde os materiais separadamente existem do ambiente original. Por exemplo, um peptídeo presente no estado natural em uma planta ou um animal não é isolado; entretanto, o mesmo peptídeo separado dos aminoácidos adjacentes em que o mesmo está naturalmente presente, é considerado “isolado.” Os termos “peptídeos isolados” para os propósitos do presente assunto focalizado podem incluir aqueles preparados ou sintetizados por um método conhecido ser correspondente aos peptídeos naturais.

[0072] A frase “peptídeo sintético” para os propósitos do presente assunto focalizado refere-se a um peptídeo preparado por uma reação química conhecida de aminoácidos ou pela isolação e purificação de um material biológico como descrito acima.

[0073] A frase “que corresponde a” é aqui usado para se referir às sequências similares ou homólogas, se a posição exata é idêntica ou diferente da molécula à qual a similaridade ou homologia é medida. Um alinhamento de ácido nucleico ou sequência de aminoácido pode incluir espaços. Assim, o termo “que corresponde a” refere-se à similaridade de sequência, e não à numeração dos resíduos de aminoácido ou bases de nucleotídeo.

[0074] O termo “derivado(s)” de um peptídeo aqui usado refere-se a um peptídeo que inclui variações por exemplo, de modificação, substituição, deleção e/ou adição na sua sequência de aminoácido, feita com respeito a um peptídeo de referência, que retêm uma relação identificável com o peptídeo de referência. A modificação pode incluir modificação química, por exemplo, pela glicosilação, PEGuilação, PEG alquilação, alquilação, acetilação, amidação, glicosil-fosfadilinositalização, farnesilação, ADP-ribosilação, sulfatação, ligação de lipídeo, hidroxilação, e/ou fosforilação. Este termo é entendido como sendo intercambiável com o termo “análogo funcional.”

[0075] Como aqui usado, os termos “administrar,” “administração,” e termos semelhantes, referem-se a qualquer método que, na prática médica criteriosa, libera a composição presentemente fornecida a um indivíduo em uma tal maneira como para fornecer um efeito terapêutico. Um aspecto do presente assunto focalizado fornece a administração intravenosa de uma quantidade terapeuticamente eficaz da presente composição a um paciente em necessidade deste.

[0076] Como aqui usado o termo “tratar” inclui a profilaxia de um tumor ou câncer em um paciente ou um indivíduo tendo uma tendência para desenvolver tal tumor ou câncer, e a melhora ou eliminação do tumor ou câncer desenvolvido uma vez que o mesmo foi estabelecido ou alívio dos sintomas característicos de tal câncer.

[0077] Como aqui usado os termos “tumor” ou “câncer” refere-se a todos os tipos de tumor ou câncer. Em algumas formas de realização, o termo “tumor” refere-se a carcinomas ovarianos, pulmonares, renais ou colônico, glioblastomas, melanomas, astrocitomas, sarcomas, teratocarcinomas, coriocarcinomas ou tumores hematopoiéticos. Do mesmo modo, o termo “câncer” refere-se a câncer ovariano, câncer pulmonar, câncer renal, câncer dérmico, câncer cerebral, câncer uterino, câncer mamário, câncer colônico, câncer prostático, câncer hepático, câncer intestinal, câncer esofágico e estomacal, câncer da cabeça e pescoço, ou leucemia. Os termos “tumor” e “câncer” podem ser intercambiável entre si.

[0078] Como aqui usado, o termo “indivíduo” refere-se a qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo mamífero, para o qual o diagnóstico, prognóstico, ou terapia são desejados, por exemplo, um ser humano. O termo pode ser usados para se referir a um “paciente.”

[0079] Como aqui usado, os termos “carreador,” “excipiente,” ou “diluentes” referem-se a qualquer componente de uma composição farmacêutica que não é a substância medicamentosa. Consequentemente, o termo “carreador farmaceuticamente aceitável” refere-se a um enchedor, diluente, material de encapsulação, auxiliar de formulação não tóxicos, inertes, sólidos, semissólidos ou líquidos de qualquer tipo, ou simplesmente um meio aquoso estéril, tal como solução salina. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, amidos tais como amido de milho e amido de batata, celulose e seus derivados tais como carboximetil celulose sódica, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte, gelatina, talco; excipientes tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; óleos tais como óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de açafroa, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como propileno glicol, polióis tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ésteres tais como oleato de etila e laurato de etila, ágar; agentes tamponantes tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirógeno; solução salina isotônica, solução de Ringer; álcool etílico e soluções tampão de fosfato, assim como outras substâncias compatíveis não tóxicas usadas nas formulações farmacêuticas.

[0080] O agente ativo é preferivelmente administrado em uma quantidade eficaz. Como aqui usado, a frase “quantidade eficaz” refere-se à quantidade de um componente que é suficiente para produzir uma resposta terapêutica desejada sem efeitos colaterais adversos indevidos (tais como toxicidade, irritação, ou resposta alérgica) comensurado com uma razão benefício/risco razoável quando usado na maneira presentemente descrita. Por exemplo, uma “quantidade terapeuticamente eficaz,” pode ser uma quantidade suficiente do agente ativo para causar a regressão do tumor, ou pelo menos deter parcialmente a tumorigênese e metástase em uma razão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico. A quantidade real administrada, e a taxa e curso de tempo de administração, dependerá da natureza e severidade da condição que é tratada. A prescrição de tratamento, por exemplo as decisões na dosagem, tempo, etc., está dentro da responsabilidade de técnicos e especialistas gerais, e tipicamente considera o distúrbio a ser tratado, a condição do paciente individual, o sítio de liberação, o método de administração e outros fatores conhecidos pelos técnicos. Os exemplos de técnicas e protocolos podem ser encontrados, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences.

[0081] Por todo o pedido, descrições de várias formas de realização usam o termo “que compreende,” que será entendido por uma pessoa de habilidade na técnica que em alguns casos específicos, uma forma de realização pode ser alternativamente descrita usando a linguagem “que consiste essencialmente de” ou “que consiste.”

[0082] A menos que de outro modo definido todos os termos técnicos e científico aqui usado têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual o assunto focalizado presentemente descrito pertence.

[0083] Para os propósitos de melhor entendimento das presentes divulgações e de nenhum modo limitando o escopo das divulgações, a menos que de outro modo indicado, todos os números que expressam quantidades, porcentagens ou proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificado em todos os casos pelo termo “cerca de.” Consequentemente, a menos que indicado ao contrário, os parâmetros numéricos apresentados no relatório descritivo que segue e reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se procura obter. No mínimo, cada parâmetro numérico deve ser pelo menos interpretado considerando-se o número de dígitos significantes relatado e pela aplicação de técnicas de arredondamento comuns. Preparação de peptídeos

[0084] Os peptídeos bioativos presentemente descritos (SEQ ID NOs: 1-6) com tamanhos variando de menos do que 30 ou 25 aminoácidos podem ser isolados ou separados dos domínios hipervariáveis da região determinadora de complementaridade (CDR) da RebMab 200 (huMX35), que é descrita na PCT/US2009/000576, com um método conhecido para isolar, separar e purificar peptídeos bioativos, e eles podem ser ainda modificados. Os peptídeos presentemente descritos também podem ser preparados pela síntese química ou fabricação usando a tecnologia de DNA recombinante. Por exemplo, os peptídeos podem ser obtidos pelos métodos que usam azida, cloreto ácido, anidrido ácido, anidrido ácido composto, DCC, éster ativado, reagente K de Woodward, carbonilimidazol, desoxidixação, DCC/HONB, reagente BOP, etc., como conhecido na técnica. Também, eles podem ser preparados pela síntese química usando um sintetizador de peptídeo automatizado.

[0085] A seguir de uma tal reação química, os peptídeos podem ser separados e purificados por um método de purificação conhecido. Um exemplo de tais métodos de purificação podem incluir uma combinação de extração com solvente, destilação, cromatografia de coluna, cromatografia líquida, recristalização e os semelhantes.

[0086] Além disso, sistemas de expressão recombinantes na E. COLI podem ser usados para expressar os peptídeos presentemente descritos como proteínas de fusão, com um sítio de clivagem enzimática específico, por exemplo, enterocinase. Em seguida, as bactérias são quebradas e centrifugadas e a sopa resultante contém a proteína de fusão. A proteína de fusão pode ser depois carregada em uma coluna de afinidade específica, por exemplo, uma coluna de Ni2+ou glutationa, a ser eluída. Depois da eluição, a proteína de fusão purificada é individualizada para uma reação de clivagem enzimática específica. Depois, o peptídeo é purificado da mistura resultante pela HPLC ou cromatografia de troca iônica. Os métodos que envolvem as técnicas de química convencional e analítica, biológicas moleculares e biológicas celulares são descritos em detalhes em muitas referências publicamente conhecidas, que incluem aquelas aqui listadas.

[0087] O presente assunto focalizado fornece o uso de um peptídeo menor do que 30 ou 25 aminoácidos para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de um indivíduo que sofre de câncer. Um tamanho preferido dos peptídeos antitumores para a inclusão em uma composição farmacêutica de acordo com o presente assunto focalizado é no máximo de 30 ou 25 aminoácidos, preferivelmente no máximo 20 aminoácidos, com moléculas menores de 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos no comprimento sendo particularmente eficazes. Derivados, biodistribuição e farmacocinéticas

[0088] Os derivados (ou análogos funcionais) de peptídeos podem ser preparados, por exemplo, pela substituição de um resíduo de L-aminoácido com um resíduo de D-aminoácido ou outros resíduos não naturais. Pela geração de muitos derivados posicionais de uma sequência de aminoácido original e triagem quanto a uma atividade específica, um peptídeo melhorado, por exemplo, que compreende D-aminoácidos pode ser identificado e usado de acordo com o presente assunto focalizado.

[0089] Os derivados ou análogos funcionais podem ser compostos peptidomiméticos que funcional ou estruturalmente se parecem com o peptídeo original tomado como o ponto de partida, mas que são, por exemplo, compostos de aminoácidos ou poliamidas que não ocorrem naturalmente. Com “substituição de aminoácido conservativa”, um resíduo de aminoácido é substituído com um outro resíduo com propriedades no geral similares (tamanho, hidrofobicidade, e/ou carga), tal que o funcionamento global de uma sequência de peptídeo tendo tal substituição é provável de não ser seriamente afetado. Na “substituição de aminoácido não conservativa”, um resíduo de aminoácido é substituído com um outro resíduo com propriedades no geral diferentes (tamanho, hidrofobicidade, e/ou carga), tal que o funcionamento global de uma sequência de peptídeo tendo tal substituição seria seriamente afetado. Um derivado também pode ser fornecido alterando- se sistematicamente pelo menos um aminoácido do peptídeo de referência. Isto pode ser feito, por exemplo, por uma varredura de alanina (varredura de Ala) e/ou análise líquida de substituição, em que cada aminoácido é substituído um após o outro com um dos 19 outros aminoácidos (ou 21, se selenocisteína e pirrolisina são incluídos). Com estes métodos, muitos peptídeos diferentes podem ser gerados, com base em uma sequência de aminoácido original mas cada um contendo uma variação ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido. Deste modo, muitas variantes posicionais da sequência de aminoácido original são sintetizados e/ou enzimaticamente preparados.

[0090] Os peptidomiméticos incluem ainda pseudopeptídeos tendo substitutos para as ligações de peptídeo entre os aminoácidos originais (ver por exemplo a US 6.689.753). Tais substitutos para as ligações de peptídeo incluem, mas não são limitados a CH2, CH2CH2, CH=CH, C=C, CH2NH, COCH2, CH2S, CH2SO2 e NHCO.

[0091] No caso de células de tumor que alvejam peptídeos diretamente, uma circulação de sangue prolongada é necessária e assim derivados e/ou conjugados são sintetizados para estabilidade aumentada. Em uma forma de realização do presente assunto focalizado, os peptídeos podem ser ainda modificados ou conjugados para se obter peptídeos estabilizados. A introdução de D-aminoácidos, ou pseudo aminoácidos, e ciclização de peptídeo são as estratégias mais comuns para aumentar a estabilidade de peptídeo (Adessi e Soto, Curr Med Chem. 9(9): 963-78, 2002). Uma modificação comum é aquela de peptídeos cíclicos C-C (como realizado em RB10a da SEQ ID NO: 3, dando origem a RB9 da SEQ ID NO: 8) que também são expressados em certas bibliotecas de demonstração de fago. Os peptídeos podem ser alterados de outros modos para prevenir a degradação pelas endopeptidases e exopeptidases. Estas incluem modificações de terminal N (acetilação, glicosilação) ou terminal C (amidação) e o uso de aminoácidos não naturais (por exemplo aminoácidos de β-amino e α- trifluorometila) em sítios particularmente instáveis dentro de um peptídeo.

[0092] Arap ET AL. (Science 279: 377-380, 1998) identificaram três motivos de peptídeo principais que alvejaram fagos em tumores em desenvolvimento IN VIVO. O fago que carrega o motivo CDCRGDCFC reside em vários tipos de tumor, que incluem carcinoma, sarcoma, e melanoma em uma maneira altamente seletiva, e a residência é especificamente inibida pelo peptídeo cognato. Os peptídeos capazes de mediar a localização seletiva de fago para os vasos sanguíneos cerebrais e renais foram identificados e têm mostrado seletividade de até 13 vezes para estes órgãos. Um dos peptídeos demonstrados pelo fago que se localiza no cérebro foi sintetizado e mostrado especificamente inibir a localização do fago homólogo dentro do cérebro (Pasqualini e Ruoslahti, Nature 380: 364-366, 1996; Pasqualini et al., Nat. Biotechnol. 15: 542-546, 1997). Estes experimentos, à parte de identificar alvos específicos nos tecidos de tumor para o reconhecimento de fago, têm também mostrado que os peptídeos cognatos administrados sistemicamente reconhecem os mesmos alvos, implicando também estabilidade suficiente IN VIVO. Praticamente, quando revestido sobre células sanguíneas vermelhas fixadas com glutaraldeído, o peptídeo causou localização seletiva de células intravenosamente injetadas no tecido alvo.

[0093] Em uma forma de realização do presente assunto focalizado, são fornecidos peptídeos derivados e/ou conjugados para o uso em testes clínicos, que permitem maior estabilidade e farmacocinéticas melhoradas. Tais derivados e/ou conjugados podem ser sintetizados com base nas sequências de peptídeo apresentadas como SEQ ID NOs: 1 a 6, particularmente SEQ ID NO: 3. Tais derivados e/ou conjugados são testados quanto a citotoxicidade de célula de tumor e inibição de célula de tumor de migração e metástase. Uma vez que um derivado é selecionado com base na meia- vida aumentada IN VIVO e atividade antitumor, o mesmo se torna um candidato a ser testado em pacientes. No caso de peptídeos antimetastáticos, pode-se esperar que o mesmo seja eficaz ou útil em testes clínicos para pacientes que tiveram o seu tumor primário excisado, ou estejam no estágio de envolvimento de linfonodo ou têm desenvolvimento de tumor limitado com metástases regionais ou estão passando pela quimioterapia. Os peptídeos selecionados com atividade antitumor IN VITRO e IN VIVO precisam ser avaliados, em paralelo, para a biodistribuição e farmacocinéticas de peptídeo IN VIVO.

[0094] Em uma forma de realização do presente assunto focalizado, os peptídeos presentemente descritos podem ser avaliados quanto a sua biodistribuição e suas farmacocinéticas. Para estes estudos, os peptídeos devem ser apropriadamente rotulados com biotina, radioatividade ou um outro rótulo conveniente. Os peptídeos biotinilados podem ser reconhecidos pela estreptavidina em placas de ELISA ou pela ligação às pérolas de Sefarose- estreptavidina incubadas com fluidos corporais e homogenados de tecido. A eluição dos peptídeos biotinilados firmemente ligados às placas de reservatório múltiplo revestidos com estreptavidina que pode ser obtida por meio de 70 % de acetonitrila, 0,5 % de ácido fórmico, 1 mM de solução aquosa de biotina, e peptídeos são identificados pela LC-MS. Por exemplo, no caso de RebMab200 CDR H3, os mesmos podem ser facilmente rotulados com 125I visto que os mesmos têm um resíduo de tirosina (Y) neles. Também, o resíduo de cisteína de terminal N podem ser usados para a biotinilação usando reagente de Pierce. Outras metodologias adequadas também podem ser usadas dependendo da estrutura do peptídeo bioativo.

[0095] Um outro método para a avaliação da biodistribuição e ligação de célula de tumor específica é o uso de bacteriófago M13 como um vetor de expressão. Consequentemente, em uma forma de realização do presente assunto focalizado, os peptídeos presentemente descritos podem ser avaliados usando o bacteriófago M13 quanto à sua biodistribuição e ligação em célula de tumor específica de alvo. O plasmídeo que gera o fago na transfecção em ESCHERICHIA COLI pode ser planejado de modo que o oligonucleotídeo que codifica o peptídeo é fundido àquele que codifica a proteína de fago. Uma série de peptídeos análogos a serem expressados pelos fagos também podem ser construídos usando vários oligonucleotídeos. A distribuição de fago IN VIVO pode ser seguido pela titulação viral.

[0096] As farmacocinéticas e biodistribuição de peptídeos e a captação resultante no tumor e tecidos normais podem ser alteradas tanto pelo tamanho molecular quanto pela especificidade de ligando, com o tamanho molecular afetando as farmacocinéticas e a captação em órgão em uma maneira prognosticável. O tamanho molecular aumentado pode ser obtido pela conjugação do peptídeo com polietileno glicol (PEGuilação) ou albumina sérica. Em uma forma de realização do presente assunto focalizado, os peptídeos podem ser conjugados. Visto que as proteínas maiores (>50 kDa) não são filtradas pelos rins, PEG pode servir para aumentar o raio hidrodinâmico de conjugados de peptídeo e impedir a sua depuração renal. Em ambos os casos é importante testar a atividade do peptídeo conjugado. Usando aminoácidos nucleofílicos (por exemplo cisteína ou aminoácidos não naturais), PEG também pode ser ligado dentro de uma sequência de peptídeo e, se o mesmo não inibir a função de peptídeo, então as endopeptidases também seriam excluídas de degradar resíduos internos particularmente instáveis. Em uma forma de realização, os peptídeos presentemente descritos podem formar uma proteína de fusão.

[0097] As interações não covalentes também são possíveis. A fusão de uma sequência com 20 aminoácidos à extremidade de terminal C de um fator Fab de anti-sentido permitiu a associação não covalente com albumina IN VIVO e aumentou a meia-vida do Fab em 40 vezes em coelhos (McFarland et al.,Cancer Res. 67(1):254-61, 2007). Uma construção similar seria testada usando a Ig-CDR fundida ao terminal C com peptídeo QRLMEDICLPRWGCLWEDDF para estar associada com albumina para aumentar a meia vida do peptídeo efetor. A fusão genética de peptídeos para o domínio Fc de gama imunoglobulina humana (IgG) é um método alternativo para aumentar o tamanho molecular do peptídeo. A fusão Fc tira vantagem da função de proteção IgG do receptor Fc neonatal (FcRn). A albumina sérica, além de escapar da depuração renal, também é reciclada por intermédio de FcRn pela ligação a uma superfície diferente do receptor do que IgG. A conjugação química de peptídeos para albumina pela ligação covalente para a cisteína livre na posição de aminoácido 34 da albumina também é eficaz na extensão da meia-vida terapêutica do peptídeo. Uma lista de outras estratégias está sendo desenvolvida para estender o tempo de residência no plasma.

[0098] Os peptídeos selecionados quanto a citotoxicidade de tumor direta não deve ser imunogênica, e são assim incapazes de evocar uma resposta de anticorpo de neutralização forte ou ser apresentado pela MHC para reatividade imune celular ou mediar as reações de hipersensibilidade. A incorporação de D-aminoácidos na estrutura de peptídeo deve diminuir tanto a clivagem proteolítica quanto a reatividade imune de peptídeos. Outros tipos de derivação devem ser checados também quanto à imunogenicidade.

Atividade Biológica

[0099] A “atividade biológica” no contexto do presente assunto focalizado é usada para se referir à capacidade dos peptídeos para invocar um ou mais dos efeitos citotóxicos aqui listados em conexão com a definição de uma “quantidade terapeuticamente eficaz.” Em uma forma de realização específica, “atividade biológica” é a capacidade para inibir o crescimento ou proliferação da célula neoplástica. Uma atividade biológica preferida é a inibição, que inclui a diminuição da velocidade ou a parada completa, do crescimento de uma célula de tumor alvo (por exemplo, câncer). Uma outra atividade biológica preferida é a atividade citotóxica que resulta na morte da célula de tumor alvo (por exemplo, câncer). Já uma outra atividade biológica preferida é o aumento da aderência da célula das células neoplásticas.

[00100] O presente assunto focalizado, em um aspecto, fornece um método para identificar um ou mais peptídeos; e/ou determinar a atividade biológica de um ou mais peptídeos, que compreende, por exemplo, a triagem de um peptídeo para determinar a atividade do peptídeo; analisar o resultado; e/ou identificar um ou mais peptídeos tendo atividade antitumor. A eficácia dos peptídeos contra um tipo de tumor particular pode ser determinada IN VITRO ou IN VIVO, por exemplo, pela submissão das células derivadas do tumor à presença ou ausência do peptídeo IN VITRO ou pelo tratamento de um camundongo inoculado com um tumor e monitorando o tumor com o tempo, como descrito por exemplo em Polonelli ET AL. (PLoS A. 3(6): e2371, 2008) e Dobroff ET AL. (Translat. Onc., 3: 204-217, 2010). Em algumas formas de realização, os peptídeos antitumor são aqueles derivados de RebMab200, particularmente aqueles derivados de CDRs RebMab200, particularmente de CDR H3 (SEQ ID NO: 3), como apresentado nas SEQ ID NOs: 8, 9 e 14-33. Preferivelmente, os peptídeos são aqueles como apresentados na SEQ ID NO: 3 (RB10a), SEQ ID NO: 8 (RB9), SEQ ID NO: 9 (RB10), SEQ ID NO: 16 (RB9 M3), SEQ ID NO: 24 (RB10A4), SEQ ID NO: 26 (RB10 A6) e SEQ ID NO: 31 (RB10 M3).

[00101] A inibição do crescimento da célula refere-se à redução significante das células alvo, especialmente células cancerosas, IN VITRO ou IN VIVO. Informação adicional pode ser encontrada em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado “Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs” por Murakami ET AL., (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente p. 13.

[00102] A aderência de célula de uma linhagem de célula é dita ser “aumentada” por um tratamento de peptídeo se um aumento da ligação da célula é observado depois do cultivo e incubação da célula com concentrações diferentes do peptídeo, em comparação com um controle negativo.

[00103] Em uma forma de realização, um efeito dependente da dose é observado: isto é em uma dose mais baixa do peptídeo, as células seriam descoladas com tripsina/EDTA em taxas inversamente proporcionais para a concentração de peptídeo.

[00104] Além, ou ao invés de testar o peptídeo quanto à eficácia contra um tipo de célula de tumor particular IN VITRO, o médico pode testar os efeitos antitumores do peptídeo IN VIVO. Para os testes IN VIVO, as células derivadas de um tipo de tumor são injetadas em animais de laboratório tais como camundongos. Os animais são depois monitorados para determinar se os tumores surgem no sítio de injeção, ou em outro lugar no animal. Os animais de laboratório que são tratados com um peptídeo depois da inoculação da célula de tumor tipicamente não desenvolverão tumores ou significantemente reduzirá a formação de tumor.

Composições farmacêuticas

[00105] Uma composição contendo uma quantidade eficaz dos peptídeos aqui descritos pode ser administrada a um indivíduo que requer tratamento. A composição pode ser administrada parenteral, intravenosa, tópica, oral, bucal, nasal, retal, subcutânea, intramuscular ou intraperitonealmente.

[00106] A composição do tratamento pode ser formulada para ser compatível com a via de administração. A composição pode ser formulada como um tablete, cápsula, solução, pó, inalante, loção, tintura, pastilha, supositório, ou emplastro transdérmico.

[00107] Uma solução para a administração parenteral, intradérmica, ou subcutânea pode compreender, por exemplo: um diluente estéril tal como água, solução salina, glicerina, óleos fixos, polietileno glicóis, propileno glicol, ou outros solventes sintéticos; um agente antibacteriano tal como álcool benzílico ou metil parabenos; um antioxidante tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; um agente quelante; um agente tamponizante tal como acetato ou fosfato. A solução pode ser armazenada em ampolas, seringas descartáveis, ou frascos plásticos ou de vidro.

[00108] Uma formulação para injeção ou administração intravenosa pode incluir um carreador que é um solvente ou um meio de dispersão. Os carreadores adequados incluem água, solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL®(BASF, Parsippany, NJ), solução salina tamponada com fosfato (PBS), etanol, polióis (por exemplo, glicerol, glicol, propileno glicol, e os semelhantes), e misturas destes. Estas composições devem ser estéreis e fluidas para permitir a injeção. A fluidez pode ser mantida com um revestimento tal como lecitina ou um tensoativo. A contaminação microbiana pode ser prevenida pela inclusão de agentes antibacterianos e antifúngicos, tais como parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, e timerosal. Açúcares e poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, e cloreto de sódio, podem ser usados para manter a isotonicidade na composição.

[00109] A esterilidade pode ser garantida pela esterilização em filtro da solução. Alternativamente, a solução pode ser produzida a partir dos componentes que foram individualmente esterilizados em filtro. Um componente esterilizado em filtro pode ser secado a vácuo ou secado por congelamento para produzir um pó estéril. Um tal pó pode ser reidratado antes da injeção com uma solução de carreador estéril.

[00110] As composições orais incluem, por exemplo: tabletes; cápsulas; pastilhas; suspensões; e soluções. As composições podem ser adaptadas com um diluente inerte ou um carreador comestível. Cápsulas podem ser formuladas pela combinação de um diluente apropriado com um peptídeo ou sua formulação e enchendo a cápsula com a mistura. Os diluentes comuns são amidos tais como celulose em pó, ou açúcares tais como sacarose, frutose, ou manitol. Os tabletes podem ser fabricados pela granulação úmida ou seca, pela compressão ou por outros métodos conhecidos. Além do peptídeo/composto desejados, as composições para tabletes podem incluir, por exemplo: um aglutinante tal como celulose microcristalina, ou gelatina; um excipiente tal como um amido; um açúcar (por exemplo, lactose, frutose, glicose, metilcelulose, etilcelulose); uma goma (por exemplo goma tragacanto, acácia); um agente desintegrante (por exemplo, ácido algínico, Primogel, ou amido de milho); um lubrificante (por exemplo, estearato de magnésio ou Sterotes); um deslizante (por exemplo, dióxido de silício coloidal); um agente adoçante (por exemplo, sacarose ou sacarina); um agente flavorizante (por exemplo, hortelã, salicilato de metila, ou sabor de laranja); ou qualquer composto de uma natureza similar. Os polímero biodegradáveis tais como poli-D,L-lactídeo-co-glicolídeo ou poliglicolídeo, podem ser usados como uma matriz para retardar a liberação da composição.

[00111] Para a administração pela inalação, os compostos podem ser liberados, por exemplo, na forma de uma pulverização de aerossol a partir de dispensador de recipiente pressurizado, que contém um propelente adequado, por exemplo, um gás, ou por outros métodos conhecidos. Por exemplo, a administração também pode ser transmucósica, por exemplo, com uma pulverização nasal ou supositório, ou por meios transdérmicos, por exemplo, como uma pomada, unguento, gel, ou creme. Tais modos de administração podem usar formulações que compreendem, por exemplo, sais biliares, e derivados do ácido fusídico.

[00112] As preparações de liberação controlada também podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o peptídeo, matrizes estas que estão na forma de artigos formados, por exemplo, películas, ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietila), ou poli(álcool vinílico), polilactídeos (Pat. U.S. No.3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e Y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradável tal como o LUPRON DEPOT®(microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto que polímeros tais como etileno-acetato de vinila e ácido láctico-ácido glicólico possibilita a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por curtos períodos de tempo.

[00113] Também é fornecido o uso de um peptídeo antitumor, preferivelmente um derivado de RebMab200, para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer, preferivelmente um carcinoma metastático.

Modo de Administração e Método de Tratamento

[00114] Os peptídeos aqui descritos podem ser administrados, por exemplo, pela injeção de bolo, pela infusão contínua, por exemplo, de modo a prolongar o contato com a região epidural ou por outros métodos conhecidos. O peptídeo pode ser infundido por qualquer quantidade de tempo. A dosagem e controle do tempo de administração podem ser modificados de acordo com as necessidades do indivíduo particular, por exemplo, dentro da estrutura dos protocolos clínicos padrão para tratar a dor. O peptídeo também pode ser liberado pelas vias intratecais, e dentro da corrente sanguínea. Além disso, bombas implantáveis ou montáveis no corpo podem ser usadas para liberar o peptídeo aqui descrito em uma taxa controlada. Alternativamente, a administração prolongada pode ser obtida pelas formulações de depósito ou de liberação controlada conhecidas na técnica.

[00115] As administrações únicas ou múltiplas das composições de peptídeo podem ser realizadas com níveis de dose e padrão que é selecionado pelo médico responsável pelo tratamento. Em qualquer evento, as formulações farmacêuticas devem fornecer uma quantidade de peptídeo suficiente para eficazmente tratar o paciente. A administração deve começar na primeira indicação de proliferação celular indesejável ou logo depois do diagnóstico, e continua até que os sintomas sejam substancialmente minorados e por um período depois disso. Em casos bem estabelecidos de câncer, as doses de carrega seguidas pelas doses de manutenção serão requeridas.

[00116] Além disso, é fornecido um método de tratar ou inibir o crescimento de tumor, que compreende administrar a um indivíduo em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de pelo menos um peptídeo antitumor ou um derivado ou um seu análogo funcional que compreende ou que consiste das sequências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOs: 1 a 33 junto com um diluente farmaceuticamente aceitável para o indivíduo. Um tamanho preferido de um peptídeo antitumor para a inclusão em uma composição farmacêutica de acordo com o presente assunto focalizado é de no máximo 30 aminoácidos, preferivelmente de no máximo 20 aminoácidos, embora moléculas menores de 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos no comprimento possam ser particularmente eficazes.

[00117] Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração dos peptídeos antitumores do presente assunto focalizado. Por exemplo, o paciente a ser tratado com tais peptídeos antitumores também pode receber terapia de radiação. Alternativamente, ou além disso, um agente quimioterapêutico pode ser administrado ao paciente. A preparação e programas de dosagem para tais agentes quimioterapêuticos podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante ou como determinado empiricamente pelo praticante habilitado. A preparação e programas de dosagem para tal quimioterapia também são descritos em Chemotherapy Service, ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). O agente quimioterapêutico pode preceder, ou seguir a administração do agente antitumor do presente assunto focalizado, ou pode ser dado simultaneamente com o mesmo.

[00118] Pode ser desejável administrar anticorpos também contra antígenos associados a tumor, tais como anticorpos que se ligam ao ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, ou fator endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, ou além disso, dois ou mais anticorpos que ligam o mesmo ou dois ou mais antígenos associados com o câncer diferentes podem ser coadministrados ao paciente. Algumas vezes, pode ser benéfico administrar também uma ou mais citocinas ao paciente. Em uma forma de realização preferida, os agentes anticâncer aqui são coadministrados com um agente inibidor do crescimento. Por exemplo, o agente inibidor do crescimento pode ser administrado primeiro, seguido pela administração de um peptídeo antitumor do presente assunto focalizado. A administração simultânea ou administração do peptídeo antitumor primeiro também é considerada. As dosagens adequadas para o agente inibidor de crescimento são aqueles presentemente usados e podem ser diminuídos devido à ação combinada (sinergia) do agente inibidor de crescimento e os peptídeos aqui.

Dosagem

[00119] Uma dosagem apropriada para o tratamento deve ser determinada. A determinação da quantidade ou dose requerida para tratar um indivíduo individual é rotina para uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo, um médico, farmacêutico ou pesquisador.

[00120] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um peptídeo antitumor aqui dependerá do tipo de doença a ser tratado, como definido acima, da severidade e curso da doença, se o agente é administrado com propósitos preventivos ou terapêuticos, a terapia anterior, a história clínica do paciente e resposta ao agente, e a prudência do médico atendente. O peptídeo é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou em uma série de tratamentos. Os experimentos com animal fornecem orientação confiável quanto à determinação de doses eficazes para a terapia humana. A escala interespécies de doses eficazes podem ser realizadas seguindo os princípios estabelecidos por Mordenti, J. e Chappell, W. “The use of interspecies scaling in toxicokinetics” em Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi ET AL., eds., Pergamon Press, Nova Iorque 1989, pp. 42-96.

[00121] A toxicidade e eficácia terapêutica do peptídeo e/ou formulações de peptídeo também podem ser determinados. Os protocolos de rotina são disponíveis para determinar a LD50 (a dose letal para 50 % da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50 % da população) em animais não humanos. O índice terapêutico é medido como a razão da LD50 /ED50. As razões adequadas incluem, por exemplo, razões de mais do que cerca de 2, 5, 10, 50, ou 100. Compostos, formulações, e métodos de administração com altos índices terapêuticos podem ser determinados, visto que tais tratamentos têm pouca toxicidade nas dosagens que fornecem alta eficácia. Os compostos com efeitos colaterais tóxicos ou indesejáveis podem ser usados, se meios são disponíveis para liberar o composto ao tecido afetado, enquanto minimiza o dano ao tecido não afetado, por exemplo, tecido endotelial. Em uma forma de realização, os peptídeos presentemente descritos mostram valor ED50 de cerca de 920 a 930 μM (ver a Fig. 7).

[00122] Na formulação de uma faixa de dosagem para o uso em seres humanos, a dose eficaz de uma preparação de peptídeo pode ser estimada a partir dos estudos com animais de laboratório, por exemplo, como descrito abaixo. Por exemplo, as dosagens terapeuticamente eficazes nos ensaios de cultura de célula incluem, por exemplo, de cerca de 0,1 mM a 1 mM, preferivelmente de 0,25 mM a 1 mM do peptídeo, e varia entre eles. Uma dose pode ser formulada em um animal de modo a obter uma concentração plasmática circulante de inibidor que cai nesta faixa. Uma dose exemplar produz uma concentração plasmática que excede a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que alcança uma inibição semi máxima de um sintoma) como determinado nos ensaios de cultura de célula. A concentração plasmática circulante pode ser determinada, por exemplo, pela obtenção de uma amostra de sangue, e pela análise da amostra usando um ensaio de ELISA específico com base em anticorpo ou com a cromatografia líquida de alto desempenho ou espectroscopia de massa.

[00123] Alternativamente, a dose pode ser estimada a partir de testes em um modelo de animal, como descrito abaixo. O alívio de sintomas é observado quando os camundongos recebem um peptídeo ou composição farmacêutica em uma dose de pelo menos cerca de 1 μg/kg até 10 mg/kg. Por exemplo, a dose pode ser de 6 mg/kg para um peptídeo livre, não derivado ou não conjugado, susceptível à hidrólise plasmática e depuração renal. As interrelações de dosagens para animais e seres humanos (com base em miligramas por metro quadrado de superfície corporal) é descrito, por exemplo, por Freireich ET AL., Cancer Chemother. Rep. 1966, 50, 219. A área de superfície corporal pode ser aproximadamente determinada a partir da altura e peso do paciente. Ver, por exemplo, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, Nova Iorque, 1970, 537. Uma dose eficaz para tratar pacientes humanos não pode ser estimada no presente porque dependerá da estabilidade do derivado de peptídeo usado e suas farmacocinéticas. O peptídeo pode ser administrado com uma frequência ou continuamente de modo a manter uma concentração local eficaz para reduzir a dor no indivíduo.

[00124] Dependendo do método de administração, a dose apropriada pode variar, por exemplo, de cerca de 1 μg/kg/dia até cerca de 10 mg/kg/dia. Também, considerando a natureza imunogênica baixa de peptídeos pequenos, a dosagem de até 100 mg/kg com peptídeos pequenos, e em alguns casos quando necessário para o tratamento é determinada ser precisa considerando a condição do indivíduo em necessidade de tratamento, de até 200 mg/kg, 500 mg/kg ou ainda 1 g/kg serão possíveis.

[00125] A dose para um paciente pode ser otimizada enquanto o paciente está sob cuidados de um médico, farmacêutico, ou pesquisador. Por exemplo, uma dose relativamente baixa dos peptídeos descritos pode ser administrada inicialmente. O paciente pode ser monitorado quanto aos sintomas e sensação de dor como descrito abaixo. A dose pode ser aumentada até que uma resposta apropriada seja obtida. Além disso, o nível de dose específico para qualquer indivíduo particular pode variar dependendo da idade, peso corporal, saúde geral, gênero, e dieta do indivíduo, do tempo de administração, da via de administração, da taxa de excreção, e outros medicamentos fornecidos em combinação.

[00126] Os exemplos que seguem são fornecidos por via de ilustração e não são intencionados a limitar o escopo das reivindicações.

EXEMPLOS Material e Métodos Preparação de linhagens de célula de tumor e cultura de célula.

[00127] As células de melanoma de murino B16F10-Nex2.1 foram clonadas na Experimental Oncology Unit, Federal University of São Paulo (UNIFESP). As células de melanoma humano (A2058), carcinoma colônico humano (HCT-8), carcinoma mamário humano (MCF-7, MDA e SKBR3), carcinoma cervical humano (SiHa) e carcinoma ovariano (OVCAR-3) foram fornecidas pelo Ludwig Institute for Cancer Research, São Paulo, Brasil. Todas as linhagens de célula foram cultivadas a 37° C, sob atmosfera úmida e 5 % de CO2, em meio RPMI-1640 com 10 mM de ácido N-2-hidroxietil- piperazino-N-2-etanossulfônico (HEPES), 24 mM de bicarbonato de sódio, 40 mg/L de gentamicina, pH 7,2 e 10 % de FCS. As células HeLa (carcinoma cervical humano) foram fornecidas pelo Dr. Hugo P. Monteiro, Department of Biochemistry, UNIFESP, e as células U87-MG (glioblastoma) foram fornecidas pelo Dr. Osvaldo K. Okamoto, USP. As células HeLa e U87-MG foram mantidas em meio DMEM suplementado como indicado acima. Crescimento de célula de tumor in vitro e in vivo

[00128] Os detalhes do cultivo de célula de tumor IN VITRO, testes de citotoxicidade, determinação de células viáveis e experimentos de proteção IN VIVO com células B16F10 em um modelo metastático de camundongo são descritos em Polonelli ET AL. (PLoS A. 3(6): e2371, 2008) e Dobroff ET AL. (Translat. Onc., 3: 204-217, 2010).

Ensaio de migração de célula

[00129] Para os estudos de migração, 5 x 105ou 106células foram distribuídas em placas de 6 reservatórios e deixando-as aderir por 2 horas a 37° C/5 % de CO2. O meio de cultura foi trocado e o peptídeo foi adicionado a 500 μM durante a noite. A monocamada de célula foi “ferida” com uma ponta P1000 e incubada por 24 horas. As imagens de células não tratadas (controle) e células tratadas com peptídeo foram capturadas com uma câmera JENOPTIK. Os números de célula (núcleos) foram determinados usando a versão 5.0 do software Pixcavator.

Exemplo 1: Identificação e preparação dos peptídeos

[00130] A sequência RebMab 200 (huMX35) da região variável (PCT/US2009/000576) foi estuda quanto aos domínios de CDR e os peptídeos correspondentes foram selecionados para a síntese de peptídeo.

[00131] Sete (7) peptídeos foram sintetizados com pureza alta (>95 %) (adquirida da Peptide 2.0 Inc. Chantilly, VA, USA). RB8 AIYPGNGDTSYKQKFRG-NH2 (H2) (SEQ ID NO: 7) RB9 CARGETARATFAYWGQGC-NH2 (H3) (SEQ ID NO: 8) RB10 CARGETARATFAYWGQG-NH2 (H3) (SEQ ID NO: 9) RB10a CARGETARATFAYWGQG (H3) (SEQ ID NO: 3) RB11 GYTFTGYNIH-NH2 (H1) (SEQ ID NO: 10) RB12 SASQDIGNFLN-NH2 (L1) (SEQ ID NO: 11) RB13 YTSSLYS-NH2 (L2) (SEQ ID NO: 12) RB14 QQYSKLPLT-NH2 (L3) (SEQ ID NO: 13)

[00132] Cinco (5) peptídeos derivados de RB9 foram sintetizados que corresponde às sequências abaixo. Os aminoácidos D-Isoméricos, D-Alanine (dA), D-Citrulina (dCit), D-Fenilalanina (dF), e D-Arginina (dR) foram introduzidos tanto no peptídeo derivado RB9 quanto no RB10. RB9 M1 RB9 M2 RB9 M3 RB9 M4 RB9 M5 C(dA)RGETA(dCit)ATFAYWGQ(dA)C-NH2 (SEQ ID NO: 14) C(dA)RGETA(dCit)AT(dF)AYWGQ(dA)C-NH2 (SEQ ID NO: 15) C(dA)RGETARATFAYC-NH2 (SEQ ID NO: 16) CARGETA(dCit)ATFAYWGQGC-NH2 (SEQ ID NO: 17) C(dA)RGETARATFAYWGQGC-NH2 (SEQ ID NO: 18)

[00133] Três (3) peptídeos misturados RB9 foram sintetizados que correspondem às sequências que seguem: RB9 misturado CGTFEYRAQAGWAGRTAC-NH2 (SEQ ID NO: 19) RB9 Sc2 RB9 Sc3 YWCRAAFTTEAGRACQGG-NH2 (SEQ ID NO: 20) CFTARAGWYATEARGGQC-NH2 (SEQ ID NO: 21)

[00134] Seis (6) outros peptídeos foram sintetizados que correspondem à série de varredura de alanina de RB10 com as sequências que seguem: RB10 A1 RB10 A3 RB10 A4 RB10 A5 RB10 A6 RB10 A8 AARGETARATFAYWGQG-NH2 (SEQ ID NO: 22) CAAGETARATFAYWGQG-NH2 (SEQ ID NO: 23) CARAETARATFAYWGQG-NH2 (SEQ ID NO: 24) CARGATARATFAYWGQG-NH2 (SEQ ID NO: 25) CARGEAARATFAYWGQG-NH2 (SEQ ID NO: 26) CARGETAAATFAYWGQG-NH2 (SEQ ID NO: 27)

[00135] O peptídeo de terminal C de RB10 (excluindo o fragmento WGQG) com a sequência que segue foi também sintetizado: RB10 C-t TFAYWGQG-NH2 (SEQ ID NO: 28)

[00136] Quatro (4) peptídeos derivados de RB10 foram sintetizados que correspondem às sequências: RB10 M1 RB10 M2 RB10 M3 RB10 M4 CARGETA(dCit)AT(dF)AYWGQ(dA)-NH2 (SEQ ID NO: 29) CA(dR)GETA(dR)AT(dF)AYWGQ(dA)-NH2 (SEQ ID NO: 30) C(dA)RGETARATFAYWGQG-NH2 (SEQ ID NO: 31) C(dA)RGETA(dCit)ATFAYWGQ(dA)-NH2 (SEQ ID NO: 32)

[00137] Um (1) peptídeo RB10 misturado foi sintetizado que corresponde à sequência: RB10 misturado CGTFEYRAQAGWAGRTA-NH2 (SEQ ID NO: 33)

[00138] Em resumo, nenhuma atividade antitumor foi encontrada para as CDRs de RebMab 200 L1, L2, L3 e H1. A CDR H2 de RebMab 200 Amidada (SEQ ID NO: 7) compartilha até dezesseis (16) aminoácidos idênticos com fragmentos H2 similares de diversos anticorpos de murino de várias especificidades. Isto, entretanto, não mostrou nenhum efeito antitumor em contraste com a atividade forte anteriormente descrita para a CDR H2 de mAb C7 (IgM) que tem uma especificidade diferente e células de melanoma mortas pela apoptose e inibição de angiogênese (Polonelli ET AL., PLoS A. 3(6): e2371).

[00139] A CDR H3 de RebMab 200 (SEQ ID NO: 3) em uma forma estendida que contém a sequência WGXG conservada, compartilha até 82 % de aminoácidos idênticos com sequências H3 de uns poucos outros anticorpos. Entretanto, a sequência H3 com base na de Kabat GETARATFAY mostra identidade parcial (8 a 9/10) ou total (9/9) com várias proteínas de diversas fontes, principalmente de organismos procarióticos, com muitas poucas referências para sequências de Ig. Surpreendentemente, a sequência H3 estendida de RebMab 200 mostrou efeitos antitumor mesmo contra células de tumor que não reagiriam com mAb MX35 (por exemplo melanoma), que sugere que a mesma não atua como um microanticorpo e provavelmente usa um outro receptor de superfície celular para a ligação às células de tumor.

Exemplo 2: Ensaio de aderência de célula

[00140] O tratamento de células de tumor com peptídeos RB9, RB10, e RB10a (SEQ ID NOs: 8, 9 e 3, respectivamente) supriram as células que mostram aumento dependente da dose com aderência ao substrato (placas de 96 reservatórios, RPMI com 10 % de meio de cultura FCS). Em uma concentração de peptídeo de 1 mM, a maioria das células de tumor demonstraram hiper-aderência e não puderam ser colocadas em suspensão mesmo pelo tratamento de longa duração com tripsina/EDTA. Em uma dose mais baixa, as células seriam descoladas com tripsina/EDTA em taxas inversamente proporcionais à concentração de peptídeo. De modo concebível, os peptídeos RB9 e RB10 afetaram as dinâmicas de citoesqueleto das células, sinalizando assim a adesão celular aumentada. Tal resposta foi observada nas células B16F10-Nex2.1 de melanoma de murino, U87MG de glioblastoma humano, A5028 de melanoma, SKBR3 de câncer mamário, SiHa cervical e HCT de câncer colônico (Figs. 1, 2, 3 e 4).

[00141] As células tanto colocadas em suspensão quanto aderentes foram viáveis como mostrado pelo tingimento com azul de Tripano e ensaio com MTT brometo de [3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio; um tetrazol amarelo], indicando que os peptídeos não são diretamente citotóxicos mas fortemente estimulam a aderência de célula em um modo que inibiria a migração e invasão de células de tumor. Os peptídeos H1 (RB11, SEQ ID NO: 10), H2 (RB8, SEQ ID NO: 7), L1 (RB12, SEQ ID NO: 11), L2 (RB13, SEQ ID NO: 12), L3 (RB14, SEQ ID NO: 13) não mostram nenhuma atividade antitumor e foram usados como controles negativos.

Exemplo 3: Efeitos dos peptídeos RB9 e RB10 sobre as células de melanoma de murino e glioblastoma humano.

[00142] As células B16F10-Nex 2.1 (5 x 103) e células U87-MG (1 x 104) foram cultivadas em placas de 96 reservatórios e incubadas com concentrações diferentes de RB9 (SEQ ID NO: 8) e RB10 (SEQ ID NO: 9) de 0,01 a 1 mM (isto é, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,7, 0,8 e 1 mM de RB9 e RB10 para as células B16F10-Nex 2.1; e 0,25, 0,5, 0,75 e 1 mM de RB9 e RB10 para as células U87-MG). Depois de 18 horas de incubação, as células viáveis descoladas com tripsina/EDTA foram contadas usando o tingimento de exclusão com azul de Tripano. Todos os ensaios foram realizados em triplicata em dois experimentos independentes. Os resultados são mostrados nas Figs. 1A a 1D.

Exemplo 4: Efeitos de RB9 e RB10 sobre as células SKBR3 de câncer mamário humano e A2058 de melanoma.

[00143] As células SKBR3 (1 x 104) foram cultivadas em placas de 96 reservatórios e incubadas com RB9 (SEQ ID NO: 8) e RB10 (SEQ ID NO: 9). Depois de 18 horas de incubação, as células viáveis descoladas com tripsina/EDTA foram contadas usando o tingimento de exclusão com azul de Tripano. Os ensaios foram realizados em triplicata em dois experimentos independentes. As células A2058 de melanoma humano (1 x 104) foram incubadas por 4 horas a 37° C em uma câmara umidificada com 5 % de CO2. Meio fresco contendo concentrações de peptídeo diferentes de RB9 e RB10 variando de 0 a 1 mM (isto é, 0, 0,25, 0,5 e 1 mM) foi adicionado aos reservatórios e incubados por 24 horas. Os meios foram depois aspirados, as células foram descoladas com 30 μl/reservat0rio de tripsina-EDTA por cinco minutos a 37° C e as células viáveis foram contadas em uma câmara Neubauer usando azul de Tripano. Como mostrado nas Figs. 2A-2D, 50 % das células foram resistentes à tripsina-EDTA a 630 e 610 μM de RB9 e RB10, respectivamente.

Exemplo 5: Detecção de células SiHa hiper aderentes tratadas com peptídeo.

[00144] As células SiHa viáveis (1 x 104)/reservatório foram distribuídas em uma placa de cultura de 96 reservatórios e incubadas por 4 horas a 37° C em uma câmara umidificada com 5 % de CO2. Meio fresco contendo concentrações de peptídeo diferentes de RB9 (SEQ ID NO: 8) e RB10 (SEQ ID NO: 9) variando de 0 a 1 mM (isto é, 0, 0,25, 0,5 e 1 mM) foi adicionado aos reservatórios e incubados por 24 horas. O meio foi depois aspirado; as células foram descoladas com 30 μl/reservat0rio de tripsina-EDTA por cinco minutos a 37° C e suavemente lavadas com PBS. As células hiperaderentes foram incubadas por 4 horas com 0,5 mg/ml de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] em meio fresco e cristais de formazan foram solubilizados adicionando 1 volume de solução a 10 % de SDS durante a noite. A intensidade foi medida usando uma leitora de placa a 570 nm. Como mostrado nas Figs. 3A e 3B, RB10 foi mais eficaz do que RB9 contra a linhagem de célula SiHa; a 500 μM o mesmo fez com que 80 % e 30 % respectivamente, das células de tumor se tornassem resistentes à tripsinização.

Exemplo 6: Detecção de células HCT hiperaderentes tratadas com peptídeo.

[00145] Células HCT viáveis (1 x 104)/reservatório foram distribuídas em uma placa de cultura de 96 reservatórios e incubadas por 4 horas, seguindo o mesmo protocolo do Exemplo 5. Como mostrado nas Figs. 4A e 4B, o efeito de RB10 (SEQ ID NO: 9) foi similar ao RB9 (SEQ ID NO: 8) na linhagem de célula HCT, onde 80 % das células foram resistentes à tripsinização a 500 μM de peptídeo.

Exemplo 7: Efeitos antitumor in vivo de RB9 e RB10.

[00146] Os peptídeos RB9 e RB10 junto com o peptídeo apoptótico A4H3, um microanticorpo verdadeiro de mAb citotóxico antimelanoma (A4) (Dobroff ET AL., Translat. Onc., 3: 204-217, 2010), foram testados quanto aos seus efeitos protetivos contra a colonização pulmonar pelas células de melanoma B16F10-Nex2 (2 x 105) injetadas intravenosamente em camundongos C57Bl/6 (6 animais/grupo). Os peptídeos foram intraperitonealmente administrados (250 μg i.p.) nos dias 1, 3, 5, 7, 9, 11 depois da inoculação da célula de tumor. Os pulmões dos animais tratados com peptídeo são mostrados na Fig. 5 depois de 22 dias de inoculação de tumor. Como observado, o tratamento com peptídeo foi interrompido 10 dias antes do sacrifício do animal.

[00147] Os peptídeos RB9 (SEQ ID NO: 8) e RB10 (SEQ ID NO: 9) protegeram com êxito contra melanoma metastático reduzindo significantemente a colonização pulmonar. A proteção IN VIVO pelos peptídeos RB9 e RB10 (e controle A4H3) contra a colonização pulmonar pelas células de melanoma B16F10-Nex2 (2 x 105) injetados intravenosamente em camundongos C57Bl/6 (6 animais/grupo) é mostrado na Fig. 6. As outras 5 CDRs de RebMab200 (SEQ ID NOs: 7, 10, 11, 12, 13) não foram protetivos IN VIVO. Os peptídeos foram administrados do mesmo modo como descrito acima, e o número de nódulos pulmonares foi determinado.

[00148] A proteção pelo RB9 e RB10 foi observada mesmo quando o tratamento com peptídeo foi interrompido 10 dias antes do sacrifício do animal, sugerindo um efeito precoce sobre a migração e invasão de célula de tumor. Estes resultados apontam para um amplo espectro de reatividade destes peptídeos além daquele estabelecido para huMX35.

[00149] Os peptídeos RB9 e RB10 foram moderadamente citotóxicos para as células HL-60 da leucemia humana cultivadas em suspensão (Fig. 7) e foram inativas contra células de câncer ovariano OVCAR-3 (Fig. 8). As células de câncer ovariano tratadas com peptídeo foram normalmente descoladas com tripsina/EDTA, diferente das outras células de tumor testadas sugerindo uma falta de efeito de ambos os peptídeos nestas células. Visto que huMX35 se liga mas não é diretamente citotóxica para as células de câncer ovariano OVCAR-3 (dados não mostrados), este experimento não fornece evidência de que RB9 e RB10 representariam microanticorpos funcionalmente relacionados com o mAb original. Os experimentos de competição foram conduzidos usando ELISA de célula, mas RB10 reagiu com um anticorpo secundário (isto é, IgG anti-humano da GE Healthcare); assim, uma metodologia diferente será requerida para responder esta questão. Não obstante, os peptídeos RB9 e RB10 reagiram com um receptor expressado nas células de tumor e fortemente afetaram a adesão celular dependente de citoesqueleto ao substrato. Tal adesão aumentada parece inibir a metástase, compatível com a inibição da colonização pulmonar pelas células de melanoma tratadas com peptídeo.

Exemplo 8: Efeito de RB9 sobre as células de leucemia humana.

[00150] As células HL-60 viáveis (1 x 104)/reservatório foram distribuídas em uma placa de cultura de 96 reservatórios e incubadas por 4 horas com concentrações diferentes de RB9 (SEQ ID NO: 8) variando de 0 a 1 mM por 24 horas. A viabilidade da célula foi diretamente medida pela contagem em uma câmara de Neubauer com Azul de triptano ou estimada pelo ensaio MTT colorimétrico. Como mostrado nas Figs. 7A e 7B, RB9 reduziu em 50 % a viabilidade da célula a 920-930 μM.

Exemplo 9: Efeito de RB9 sobre as células de carcinoma ovariano

[00151] As células OVCAR-3 viáveis (1 x 104)/reservatório foram distribuídas em uma placa de cultura de 96 reservatórios e incubadas por 4 horas com concentrações diferentes de RB9 (SEQ ID NO: 8) variando de 0 a 1 mM por 24 horas. As células foram descoladas com 30 μl/reservat0rio de tripsina-EDTA por cinco minutos a 37° C e contadas em uma câmara Neubauer com Azul de triptano ou estimadas pelo ensaio MTT colorimétrico. Como mostrado na Fig. 8, RB9 teve efeito baixo sobre esta linhagem sem nenhuma diminuição significante na viabilidade pelo ensaio de MTT. A 1 mM de RB9, a maioria das células não foram afetadas pelo efeito hiperaderente como mostrado nas Figs. 1 a 4.

Exemplo 10: Série de varredura de alanina e ensaio de adesão celular.

[00152] O peptídeo RB10 (SEQ ID NO: 9) foi engendrado para substituir cada aminoácido pela alanina usando a metodologia de varredura de Ala, e assim ajuda a avaliar o papel de cada aminoácido sobre o efeito biológico, especificamente sobre a hiper-aderência observada com 1 mM de peptídeo.

[00153] Para este propósito, as células de melanoma viáveis B16F10- Nex2 (1 x 104)/reservatório foram distribuídas em uma placa de cultura de 96 reservatórios e incubadas por 4 horas. Meio fresco contendo 1 mM da série de varredura de alanina para RB10 foi adicionado e incubado por 24 horas. As células tratadas foram descoladas com 30 μl/reservat0rio de tripsina-EDTA por cinco minutos a 37° C e suavemente lavadas com PBS. As células foram incubadas por 4 horas com 0,5 mg/ml de MTT [brometo de 3-(4,5- Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] em meio fresco e os cristais de formazano foram solubilizados adicionando 1 volume de uma solução a 10 % de SDS durante a noite. A intensidade foi medida usando uma leitora de placa a 570 nm. Como mostrado na Fig. 9, derivados de RB10 A4 (SEQ ID NO: 24) e RB10 A6 (SEQ ID NO: 26), assim como o peptídeo RB 10a (com uma extremidade carboxílica) (SEQ ID NO: 3), atuaram como peptídeo o RB10 (SEQ ID NO: 9) induziram a aderência de célula resistente a tripsina/EDTA alto. Os derivados de RB10 A1 substituídos com alanina (SEQ ID NO: 22), A3 (SEQ ID NO: 23), A8 (SEQ ID NO: 27), e menos eficientemente A5 (SEQ ID NO: 25), supriram as células que, diferente de RB10, foram normalmente descoladas quando tratadas com 1 mM de peptídeo. O valor de 100 % para cada peptídeo representou as células tratadas que não foram tripsinizadas.

Exemplo 11: Inibição da invasão de célula de tumor.

[00154] Uma suspensão de 2 x 105células B16F10-Nex2 em 500 μl de RPMI foi incubada com 0,5 mM de RB9 e adicionada à câmara superior de um Transreservatório de 8 μm (Becton-Dickinson) pre-revestida com Matrigel (Becton-Dickinson). Como um quimioatraente, 10 % de FCS em RPMI foram usados na câmara inferior do transreservatório. Depois de 24 horas a 37° C em atmosfera umidificada com 5 % de CO2, as células não invasivas foram excluídas com um cotonete, e as células que cruzaram a membrana foram fixadas com metanol e tingidas com Giemsa. As células foram contadas em cada membrana de transreservatório, e os números de células invasivas são expressadas como porcentagens. O peptídeo RB9 (SEQ ID NO: 8) foi capaz de inibir a invasão de célula de tumor de Matrigel em um sistema de transreservatório. A inibição da invasão de célula B16F10-Nex2 pelo RB9 foi dependente da dose com 60 % de inibição a 25 μM de RB9 (Fig. 20).

Exemplo 12: Produção de ânion de superóxido realçada mostrada no ensaio de di-hidroetídio (DHE).

[00155] O efeito protetor foi mostrado em um modelo singênico metastático de melanoma de murino quando administrados intraperitonealmente e a hiper-aderência de células tratadas mostradas em testes IN VITRO sugere que os peptídeos RB9 (SEQ ID NO: 8) e RB10 (SEQ ID NO: 9) interferem com a migração e invasão de célula pela afetação das dinâmicas do citoesqueleto das células. Com base nas interações internas dos componentes, tais como, actina e peróxidos em células de tumor, levando ainda à apoptose, a produção de superóxido aniônico em células de tumor tratadas com RB10 foi examinada pelo ensaio de di-hidroetídio (DHE).

[00156] As células B16F10-Nex2 foram tratadas com 1 mM de RB10 por 18 horas ou 5 mM de H2O2 por 20 minutos. As células tratadas com peptídeo ou H2O2 e as células não tratadas foram depois incubadas com DHE. A conversão de DHE para etídio pela oxidação foi observada usando a microscopia de fluorescência (Ampliação 600X).

[00157] A reação com di-hidroetídio foi positiva nestas células (Fig. 10).

Exemplo 13: Estabilidade do Peptídeo - Degradação do peptídeo RB9 pelo plasma humano

[00158] Os peptídeos têm meias-vidas variáveis no plasma devido à atividade proteolítica e a filtração renal, que são aspectos relevantes nas farmacocinéticas de candidatos a medicamento. Para estudar estes aspectos, o peptídeo RB9 (2 mg) (SEQ ID NO: 8), que é mais solúvel do que RB10 (SEQ ID NO: 9), foi dissolvido em 200 μL de água MilliQ e incubado com 1 mL de plasma humano a 37° C e as cinéticas da degradação foi seguida por 24 horas quando o peptídeo inteiro foi degradado.

[00159] Para analisar o peptídeo na HPLC e Espectro de Massa, uma alíquota de 200 μL foi transferida a um novo tubo Eppendorf e as proteínas foram precipitadas com 20 μL de ácido trifluoroacético por 5 minutos a 4° C. Depois da centrifugação por 10 minutos a 14.000 rpm, o sobrenadante foi analisado em um LC/ESI-MS (Waters). As Figs. 11A-11C mostram o pico do peptídeo na HPLC e Espectro de massa (0 hora) e a sua degradação total depois de 24 horas.

[00160] Com respeito aos ensaios para determinar a degradação plasmática no lapso de tempo do peptídeo RB9, a degradação do peptídeo pelo plasma humano foi monitorada na HPLC e Espectros de massa a cada 30 minutos como descrito acima (Fig. 12). Cerca de 50 % de RB9 foram clivados depois de 2 horas de incubação a 37° C.

[00161] Para comparação, RB8 foi igualmente incubado em plasma. A sua meia-vida foi menor do que 1 hora. O mesmo método pode ser usado para monitorar a resistência do peptídeo à proteólise plasmática depois de procedimentos de derivação. A meia-vida de RB9 é comparável com as meias-vidas de outros peptídeos derivados de CDR estudados antes (Polonelli ET AL., PLoS A. 3(6): e2371, 2008), que, não obstante, permitiram exposição suficiente nas células de tumor para que tivessem efeitos protetivos IN VIVO no modelo metastático de camundongo.

Exemplo 14: Migração de Célula de Tumor - Ensaio de cicatrização de ferimento.

[00162] As células B16F10-Nex2 viáveis (5 x 105)/reservatório foram distribuídas em uma placa de cultura de 6 reservatórios e incubadas durante a noite a 37° C em uma câmara umidificada com 5 % de CO2. Uma ponta P1000 foi usada para ferir a monocamada de célula e a imagem foi imediatamente capturada (0 hora) usando uma câmera (Jenoptik) com o software Progres 2.8. Depois de 24 horas uma nova imagem do mesmo campo foi obtida e registrada (24 horas).

[00163] As células B16F10-Nex2 de controle não tratadas migraram para reconstituir a monocamada depois de 24 horas (Fig. 13A). No tratamento com peptídeo RB10 (SEQ ID NO: 9) em uma concentração de 500 μM, ocorreu 100 % de inibição de migração de 1 x 106células de tumor (Fig. 13B).

[00164] A inibição total da migração de células de melanoma B16F10- Nex2 foi observada com RB9 (SEQ ID NO: 8) e RB10 a 500 μM, ou com RB10M3 (substituição dAla2Ala, SEQ ID NO: 16). Outras substituições como na série de varredura de alanina e outras derivações e peptídeos misturados mostraram a inibição parcial da migração ou nenhum efeito (Fig. 16). Esta resposta aponta para uma especificidade acentuada dos peptídeos H3 para a inibição da migração de células B16F10-Nex2.

[00165] O peptídeo RB9 completamente inibiu a migração de células de melanoma humano A2058, carcinoma colônico HCT e câncer mamário SKBr3. Ele inibiu pela metade a migração de célula Ovcar-3 e de modo insuficiente as células de tumor de glioblastoma U87. Ele não mostrou nenhum efeito sobre as células cancerosas de colo do útero SiHa (Fig. 17).

[00166] O peptídeo RB10 ou RB10M3 (SEQ ID NO: 31) mostrou inibição parcial da migração de células de glioblastoma U87 e inibição completa ou quase completa de células cancerosas do colo do útero HeLa e SiHa (Fig 18).

[00167] O Peptídeo RB9 não afetou a migração de células não tumorigênicas normais, uma linhagem de célula de fibroblasto de murino (3T3) e dois fibroblastos humanos primários (Fig 19).

Exemplo 15: Inibição dependente da dose da migração de célula de tumor pelo peptídeo RB10.

[00168] As células B16F10-Nex2 viáveis (3 x 105)/reservatório foram distribuídas em uma placa de cultura de 12 reservatórios e incubadas por 4 horas a 37° C em uma câmara umidificada com 5 % de CO2. Meio fresco contendo RB10 (SEQ ID NO: 9) em concentrações diferentes foi adicionado aos reservatórios e incubados mais uma vez por 4 horas. O ferimento da monocamada foi realizado como descrito acima no Exemplo 12, e as imagens obtidas consequentemente. Depois de 24 horas uma nova imagem no mesmo campo foi obtida e registrada (24 horas). Como mostrado na Fig. 14, a inibição da migração foi dependente da dose e mesmo em baixa concentração (30 μM) RB10 foi capaz de inibir a migração em mais do que 30 %. A 500 μM ele inibiu 100 % de migração de célula como mostrado na Fig. 14. Ampliação X100.

Exemplo 16: Inibição do crescimento por RB10.

[00169] As células B16F10-Nex2 viáveis (5 x 105)/reservatório foram distribuídas em uma placa de cultura de 6 reservatórios e incubadas por 4 horas. Meio fresco contendo 0 ou 500 μM de RB10 (SEQ ID NO: 10) foi adicionado aos reservatórios e incubados por 12 horas. A imagem foi capturada usando uma câmera (Jenoptik) com o software Progres 2.8. O número de células foi detectado usando o software pixcavator (percepção inteligente). Depois de 12 horas com 0,5 mM de RB10, as células de melanoma tiveram menos células em 39 % (Fig. 15); Estas células foram ainda capazes de proliferar mas não migrar. Estes efeitos de RB10 parecem explicar porque o peptídeo é protetor contra um modelo metastático de melanoma mas não contra o desenvolvimento de um tumor primário em um modelo subcutâneo, ambos em camundongos susceptíveis. Ampliação X100.

Exemplo 17: Avaliação da toxicidade de peptídeo in vivo

[00170] Os camundongos foram injetados com RB9 (SEQ ID NO: 8) durante sete dias consecutivos (300 μg via i.p.) e foram sacrificados depois disso para histopatologia. Nenhum sinal de toxicidade ou alterações morfológicas foram observados no fígado, pulmão, coração, rim e baço. Também os peptídeos não foram hemolíticos como mostrado na Fig. 21 para RB10M3 (SEQ ID NO: 31).

[00171] Será avaliado por aqueles habilitados na técnica à qual o presente assunto focalizado pertence que várias modificações podem ser feitas sem divergir da sua natureza essencial. È intencionado abranger toda de tal modificação dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Peptídeo antitumor isolado ou sintético, caracterizadopelo fato de que consiste de uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 8, 9 e 14 a 33.

2. Peptídeo antitumor isolado ou sintético de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o peptídeo de SEQ ID NO: 8 é cíclico.

3. Composição farmacêutica, caracterizadapelo fato de que compreende um, dois, três, quatro ou cinco do(s) peptídeo(s) antitumor como definido(s) na reivindicação 1 ou 2 e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

4. Uso de um peptídeo como definido nas reivindicações 1 ou 2, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica para inibir o crescimento de tumor ou câncer em um indivíduo.

5. Uso de um peptídeo como definido nas reivindicações 1 ou 2, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica para inibir a migração e invasão de células tumorais.

6. Uso de um peptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica para tratar um tumor ou câncer em um indivíduo.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizadopelo fato de que o câncer ou célula tumoral ou célula tumoral é um selecionado do grupo que consiste de melanoma, câncer colônico, câncer pulmonar, câncer renal, câncer mamário, câncer cerebral, câncer da cabeça e pescoço, câncer gástrico e intestinal, câncer prostático, câncer hepático e glioblastoma.

8. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de ser para inibir o crescimento de tumor ou câncer em um indivíduo.

9. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser para tratar um tumor ou câncer em um indivíduo.

10. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica para inibir a migração e invasão de células tumorais.

11. Peptídeo ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o câncer ou célula tumoral é um selecionado do grupo que consiste de melanoma, câncer colônico, câncer pulmonar, câncer renal, câncer mamário, câncer cerebral, câncer da cabeça e pescoço, câncer gástrico e intestinal, câncer prostático, câncer hepático e glioblastoma.