HUT77921A - Eljárás multivalens influenza hemagglutinin vakcinák előállítására - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás rekombináns influenza hemagglutinin fehérje előállítására rovarsejtekben, baculovirus kifejező rendszer alkalmazásával. Az így előállított fehérje alkalmas multivalens influenza vakcina előállításához. A rekombináns hemagglutinin fehérjék teljes hosszúságú, hasítatlan glikoproteinek mind a HA1, mind a HA2 alapegységgel. Ezeket nem denaturáló körülmények között tisztították legalább 95, előnyösebben 99% tisztaságig.

A találmány foglalkozik a klónozási eljárásokkal is elsősorban az influenza A és influenza B vírustörzsek klónozásához, amelyhez speciális oligonukleotid próbákat és polimeráz láncreakciót alkalmaznak. A hemagglutinin géneket a klónozási folyamatban előnyösen úgy módosítják, hogy a természetes szignál szekvenciát baculovirus szignál szekvenciára cserélik ki, és az így kapott kiméra géneket baculovirus kifejező vektorba viszik át, ezáltal a kifejeződés a rovarsejtekben a baculovirus promotor irányítása alá kerül. Előnyös, ha a vektor úgy van tervezve, hogy a szignál peptid és a hemagglutinin fehérje közé más aminosav ne kerüljön a kifejezéskor.

A találmány foglalkozik továbbá a rekombináns fehérjék tisztításával, vakcinává kiszerelésével, továbbá a vakcina alkalmazásával a betegekben. Többféle, elsősorban immunológiai vizsgálati eljárással mérik a vakcina által kiváltott reakciókat. Állatokon és embereken végzett toxikológiai és hatástani vizsgálatok támasztják alá a vakcinák hatékonyságát.

I

65042/SZE

S.B.G. & K.

S líinzetközi Á.- •ηηόΛίΓΏ! kod*

H ÍÍXv; ifeapes!, Aixtrassy ut 113. Teletvm. 34-24-950, i^:ax. 34-24-323

P9 8 Ο 1395

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY ELJÁRÁS MULTIVALENS INFLUENZA HEMAGGLUTININ VAKCINÁK ELŐÁLLÍTÁSÁRA

A jelen találmány tárgya a rekombináns influenza vakcinák területére esik.

A járványos influenza évenként megjelenik és az egész világon jelentős morbiditással és mortalitással jár. A gyermekeknél a legnagyobb a támadási arány, és ők azok, akik nagy mértékben felelősek az influenza vírusok átviteléért a közösségben. Az idősebbek és azok a személyek, akik lappangó egészségügyi problémákkal küszködnek, fokozottan ki vannak téve komplikációk kockázatának és a kórházi ápolásnak az influenza fertőzés következtében. Egyedül az Egyesült Államokban több, mint 10.000 ember halt meg a hét influenza szezon mindegyikében 1956 és 1988 között tüdőgyulladás és influenza következtében, és több mint 40.000 halálesetről számoltak be két szezon mindegyikében. [Update: Influenza Activity - United States and Worldwide, and Composition of the 1992-1993 Influenza Vaccine, (Átadok; Influenza és aktivitás az Egyesült Államokban és világszerte, és az 1992-1993as influenza vakcina összetétele), Morbidity and Mortalitv Weekly Report. U.S. Department of Health and Humán Services, Public Health Service, 41, No. 18, 315-323 (1992)]

Az influenza vírusok nagy mértékben pleomorf, vagyis több alakú részecskék, amelyek két felületi glikoproteinből, a hemagglutininből (HA) és a neuramidinázból (NA) állnak. A HA közvetíti a vírus rögződését a gazdasejthez, és a vírus-sejt membrán fúzióját a vírus behatolása esetén a i

i • · · · ··· ·*« sejtbe. Az influenza vírus genom nyolc egyszálú, negatív-sense RNS szegmensből áll, amelyekből a négy legnagyobb szegmens kódolja a HA gént. Az influenza vírusokat A, B és C típusokra osztják antigén különbségeik alapján. Az influenza A vírust egy olyan nomenklatúra írja le, amely magában foglalja a altípust vagy típust, a földrajzi eredetet, a törzs számát és az izolálás évét, pl. A/Beijing/353/89. A HA-nak legalább 13 altípusa (H1-H13), az NA-nak legalább 9 altípusa (N1-N9) van. Minden altípus megtalálható madarakban, de csak a H1-H3 és N1-N2 találhatók emberekben, disznókban és lovakban. [Murphy és Webster: Orthomyxoviruses (Orthomyxovírusok), in Viroloqy, (szerkesztők: Fields B.N., Knipe D.M., Chanock R.M., kiadó: Raven Press, New York), 1091-1152 oldal (1990)]

A HA elleni antitestek semlegesítik a vírust, és az influenza fertőzésre való természetes immunitás alapját képezik [Clements, Influenza Vaccines (Influenza vakcinák); in: Vaccines: Λ/ew Approaches to Immunological Problems (szerkesztő: Rónáid W. Ellis; kiadó: Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA) 129-150 oldal (1992)]. A HA molekulákban levő antigén módosulása felelős az influenza gyakori kitöréséért és a fertőzés korlátozott ellenőrizhetőségéért immunizálással.

A HA három dimenziós szerkezetét és a kölcsönhatást sejtreceptorával, a szialinsavval, már alaposan tanulmányozták [Wilson és munkatársai: Structure of the hemagglutinin membráné glycoprotein of influenza vírus at 3A* resolution (Az influenza vírus hemagglutinin membrán glikoproteinjének szerkezete a 3A* felbontásnál), Natúré 289:366-378 (1981); Weis és munkatárai: Structure of the influenza vírus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid (Receptorával, a szialinsavval komplexbe vitt influenza vírus hemagglutinin szerkezete), Natúré, 333, 426-431 (1988); Murphy és Webster: korábban idézett munka (1990)] A HA molekula trimerként van jelen a virionban. Minden monomer két láncban van, ezek a HA1 és HA2, amelyeket egyetlen diszulfid híd köt össze. A fertőzött gazdasejtek egy prekurzor glikozilált polipeptidet (HAO) termelnek, amelynek molekulatömege mintegy 85.000, ez azután elhasad HA1-re és.HA2-re.

···

Az influenza HA-ra fajlagos semlegesítő IgG és IgA antitestek jelenléte rezisztenciával társul a fertőzésre és a betegségre. [Clements: korábban idézett munka (1992)]. Az inaktivált teljes vírus vagy részlegesen tisztított (hasított alegység) influenza vakcinák szabványosítva vannak a HA mennyiségére minden egyes törzsből. Az influenza vakcinák általában 7-25 mikrogramm HA-t tartalmaznak az influenza három törzsének mindegyikéből.

A másik fő felületi glikoproteinnek, az NA-nak a szerepe az antitest vagy T-sejt válaszokból eredő védő immunitásban az influenza ellen nincs meghatározva. A neuramidináz nagyon bomlékony a feldolgozás és a tárolás során. [Murphy és Webster: korábban idézett munka (1990)], és az NA mennyisége a jelenlegi influenza vakcinákban nincs szabványosítva. A tisztított HA vakcina megakadályozza, de az NA vakcina nem akadályozza az influenzával fertőzött állatokban a betegséget [Johansson és munkatársai: Purified influenza vírus hemagglutinin and neuramidinase are equivalent in stimultation of antibody response bút induce contrasting types of immunity to infection (A tisztított influenza vírus hemagglutinin és a neuramidináz egyenértékű az antitest válasz stimulálásában, de ellenkező típusú immunitást indukálnak a fertőzésre), J, Virology, 63, 1239-1246 (1989)]. Egy, a neuramidináz antigénre alapuló kísérleti vakcinából nem úgy találták, hogy védő hatású lenne emberi kipróbálásban. [Orga és munkatársai: J. Infect. Dis. 135, 499-506 (1977)]

Az engedélyezett influenza vakcinák formalinnal inaktivált teljes vagy kémiai úton hasított alapegység készítményekből állnak, két influenza A altípusból (H1N1 és H3N2) és egy influenza B altípusból. Minden egyes influenza szezon előtt az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszer Főigazgatóságának Oltóanyag és Biológiai Anyagok Tanácsadó Bizottsága (U.S. Food and Drug Administration's Vaccines and Related Biologicals Advisory Committee) tesz javaslatokat a trivalens (háromértékű) vakcina összetételére a következő idényben. Az 1992-93 évi vakcina A/Texas/36/91like (H1N1); A/Beijing/353/89-like (H3N2); és B/Panama/45/90 vírusokat

Λ tartalmaz. A Szövetségi Gyógyszer Adminisztráció (FDA) tanácsolta, hogy az 1993-94 évi influenza vakcina tartalmazza az azonos Texas és Panama törzseket és az új influenza A Beijing törzset. (A/Beijing/32/92).

Az influenza kitörésének csökkentésére a leghatásosabb intézkedés a magas kockázatú személyek vakcinálása minden évben az influenza szezon előtt. A jelenleg rendelkezésre álló vakcinák korlátái közt találhatjuk az alábbiakat: kis hasznossági arány; szerény hatékonyság az időseknél és a fiatal gyermekeknél; termelés tojásban; antigén módosulás; kedvezőtlen reakciók.

A Betegség Ellenőrző Központ [Center fór Disease Control (CDC)] úgy becsüli, hogy az influenzára magas kockázatú egyéneknek kevesebb, mint 30%-a van vakcináivá minden évben [MMWR (1992)]. A jelenlegi inaktivált vakcinák nagyarányú védelmet érnek el a betegség ellen a normálisan egészséges felnőttek között, amikor a vakcina antigénjei és az éppen elterjedt influenza vírusok közeli rokonságban vannak. Az idősek között a védelmi arány a betegség ellen sokkal kisebb, különösen azoknál, akik valamilyen intézményben élnek. [Clements: korábban idézett munka (1992)]. Egy nem régi tanulmányban [Powers és Belshe, J. Inf. Dis. 167, 584-592 oldal (1993)] jelentős antitest válaszokról csak kevesebb, mint 30%-ban számolnak be egy trivalens szubvirion influenza vakcinára 65 éveseknél és ennél idősebbeknél.

Az influenza A és B vakcinákhoz alkalmas oltóvirusok természetben előforduló törzsek, amelyek magas titerrel replikálódnak a csirketojások hugytömlő (allantoikus) üregében. Egy másik eljárás szerint az influenza A komponenshez szolgáló törzs egy újra összeállított vírus a korrekt felületi antigén génekkel. Egy újra összeállított vírus olyan, amely a vírus genom szegmentálása következtében rendelkezik mindegyik szülő törzs jellemzőivel. Amikor egynél több influenza vírus törzs fertőz egy sejtet, ezek a vírus szegmensek összekeverednek és egy olyan utód viriont képeznek, amely tartalmazza a gének különböző készleteit mindkét szülőből.

A jelenlegi teljes vagy hasított influenza vakcinákkal kapott oltalom rövid idejű és, csökkenő hatások, mint antigén elcsúszás fordulnak elő az influenza járványos törzseiben. Az influenza vírusok a vírusok immunszelekciójának eredményeképpen mennek át antigén elcsúszáson aminosav-szekvencia változásokkal a hemagglutinin molekulákban. Ideálisan a vakcina törzsek vetekednek a betegséget hordozó influenza vírus törzsekkel. A jelenlegi gyártási folyamat az influenza vakcinákhoz azonban korlátozott az embriót tartalmazó csirketojásokon való vírusszaporítással. Nem minden influenza vírus törzs replikálódik jól tojásokban, így a vírusokat adaptálni kell, vagy vírusok újra válogatását kell megoldani. Erőteljes heterogenitás lép fel a tojáson nőtt influenza vírusok hemagglutininjében, ha összehasonlítjuk a fertőzött egyénekből nyert primér izolátumokkal, amelyek emlős sejtekben nőttek. [Wang és munkatársai: Virol, 171, 275-279 (1989): Rajakumar és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4154-4158 (1990)]. A HA-ban történő változások a szelekció és az influenza vírusok gyártása közben a vírus antigenikusan különböző alpopulációinak keverékét eredményezhetik. A vírusok a vakcinákon ennél fogva különböznek a járványt okozó törzsekben levő variánsoktól, az optimálisnál alacsonyabb szintű oltalmat eredményezve.

Azonnali túlérzékenységi reakciók léphetnek fel azokban a személyekben, akik súlyos tojás allergiában szenvednek, mivel a vakcinákban maradék tojásfehérje található. Az 1976 sertés influenza vakcina a GuillainBarré szindróma megnövekedett gyakoriságával társult. A más influenza törzsekből készített későbbi vakcináknál viszont eddig nem volt megfigyelhető növekedés ennek a ritka betegségnek az előfordulásában.

Egy olyan eljárás influenza vakcina előállítására, amely nem igényel szaporítást tojásban, tisztább terméket eredményezhet, amelynél kevésbé valószínű, hogy káros immunreakciót okoz. Ezen kívül egy tisztább vakcina készítmény nem igényel vírus inaktiválást, vagy vírus membrán komponensek szerves extrahálását, ezáltal elkerülhető az antigén epitopok denaturálódása, és megszűnne a biztonsági aggodalmak, amelyet a maradék vegyi anyagok váltanak ki a vakcinában.

Ezen kívül egy influenza vakcina, amelyet tojás nélkül állítanak elő, elkerüli a genetikai heterogenitást, amely az adaptáció és a tojáson való passzálás során alakul ki. Az eredmény olyan vakcina, amely jobban illeszkedik a járványos influenza törzseihez, ez pedig megnövelt hatékonyságot eredményez.

A jelen találmány tárgya ennek megfelelően eljárás influenza vírus előállítására, amely nem igényel replikálást tojásokban.

A jelen találmány további tárgya eljárás influenza vírus előállítására, amely gyors és költségkímélő, terméke nagy mértékben tisztított, és lehetővé teszi vakcinák előállítását az influenza elsődleges forrásaiból.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

A találmány tárgya eljárás rekombináns influenza hemagglutinin fehérje előállítására rovar sejtekben történő kifejezéssel, baculovirus kifejező rendszert alkalmazva. Az így létrejövő fehérje alkalmas multivalens influenza vakcina készítésére, amely járványt okozó képességű influenza vírusokból klónozott rekombináns hemagglutinin antigének keverékén alapul. A rekombináns hemagglutinin fehérjék teljes hosszúságú, hasítatlan (HAO) glikoproteinek, megtalálhatók köztük mind a HA1, mind a HA2 alapegységek (HAO), amelyek nem denaturáló körülmények között vannak tisztítva 95% vagy nagyobb, előnyösen 99% tisztaságig.

A találmány feltár továbbá eljárást influenza A és B vírusokból származó influenza hemagglutinin gének kódolására speciálisan e célra tervezett oligonukleotid próbák és polimeráz láncreakció (PCR) módszer alkalmazásával. Az egyik előnyös kiviteli formában a klónozott HA géneket úgy módosítjuk, hogy a természetes hidrofób szignál pepiidet kódoló nukleotideket kiiktatjuk és helyettesítjük egy új baculovirus szignál peptiddel, hogy olyan szekvenciát kapjunk, amely a szignál pepiidet közvetlenül a hemagglutinin szomszédságában kódolja. Ezeket a kiméra géneket baculovirus kifejező vektorokba vezetjük be oly módon, hogy a baculovirus polihedrin promoter irányítja a rekombináns HA fehérjék kifejezését a fertőzött rovarsejtekben. A 18 aminosavból álló baculovirus szignál peptid irányítja az rHA transzlációját a • · · · ·

rovarsejt glikozilezési útvonalába, és nincs jelen az érett rHA glikoproteinben. Egy előnyös kiviteli módban a vektort úgy tervezzük, hogy ne kódoljanak semmiféle köztes aminosavakat a szignál peptid és a hemagglutinin fehérje között.

Ez a módszer kiterjeszthető az influenza vírusok összes típusára, beleértve, de nem csak ezekre korlátozva, a gyakori A(H1N1) altípust, az A(H3N2) altípust és a B típust, amelyek embereket fertőznek, valamint azokat az influenza vírusokat, amelyek más emlősöket és madárfajokat fertőznek.

A rovarsejtekben termelt rekombináns HA fehérje hatékony kivonásához és tisztításához az általános megközelítést az rHA fehérjék tisztításával kapcsolatban adjuk meg az A altípusú és B típusú influenza vírusokból. A rekombináns vakcinát az influenza primer forrásaiból fejlesztjük ki, például fertőzött egyének orrváladékaiból, és nem a csirketojásokhoz adaptált és csirketojásokban tenyésztett vírusokból. Ez lehetővé teszi a vakcina gyors kifejlesztését közvetlenül az influenza járványt okozó törzseiből, és elkerüli azt a problémát, amely a vírus adaptálásánál jelentkezik a tojásokon való tenyészthetőséghez, valamint a beteg reakcióját a tojás maradvány szennyezésre a létrejövő vakcinában.

Példákkal mutatjuk be a vakcina kiszerelését és klinikai hatékonyságát egy olyan immunizáló adag formájában, amely magában foglalja annak a három influenza törzsnek a tisztított rHA antigénjeit, amelyet az Amerikai Egyesült Államok Szövetségi Gyógyszer Igazgatósága (FDA) ajánlott az 1993/1994 és 1994/1995 évi járványos influenza szezonban. A működő immunitást azon antitestek mennyiségét mérő vizsgálatokkal mértük, amelyek az influenza hemagglutininhez kötődnek és amelyek blokkolják az influenza vírus vörös vérsejteket agglutináló képességét, vagy amelyek semlegesítik az influenza vírust. Az rHA vakcinákkal kapott védő immunválaszokat olyan állatokban mértük, amelyek fogékonyak az influenza fertőzésre, vagy emberi fertőzési tanulmányokban mértük.

• ·

Az alábbiakban az ábrák rövid leírását adjuk meg.

Az 1. ábra a HA gének klónozásának vázlatos ábrázolása influenza A törzsek tisztított vírus RNS készítményeiből, a kifejezett rHA tisztítása, és az rHA biológiai jellemzése.

Rövidítések: FDA: Amerikai Egyesült Államok Szövetségi Gyógyszer Igazgatósága: MDCK: Madin Darby Canine Kidney (Madin Darby macskavese sejttenyészet): TPCK: tozil-fenil-alanil-klór-metil-keton; RNS: ribonukleinsav; cDNS: komplementer dezoxinukleinsav; HA: hemagglutinin; FBS: borjúembrió szérum; PCR: polimeráz láncreakció; és BV: baculovírus.

A 2. ábra az 1. ábrákban bemutatott módszer részletesebb vázlatos ábrázolása az influenza A/Texas/36/91 törzs HA génjének klónozásához és kifejezéséhez alkalmazva. Az influenza HA gént influenza A/Texas/36/91-gyei fertőzött MDCK sejtekből tisztított RNS-ből kapjuk reverz transzkriptázt és univerzális prímért (lásd SEQ ID NO:1) alkalmazva, amelyet PCR kiterjesztés (amplifikáció) és klónozás két köre követ. Amint bemutatjuk, a PCR reakciók első körében az 5’ véghez SEQ ID NO.2 prímért és a 3’ véghez SEQ ID NO:3 prímért használnunk. A PCR reakciók második körében az 5’ véghez SEQ ID NO:4 prímért és a 3’ véghez SEQ ID NO:5 prímért használunk. Olyan baculovírus rekombináns vektort alkotunk meg, amely tartalmazza a polihedrin promotort és egy szignál peptid szekvenciát a baculovírus 61K génből (ez olyan baculovírus gén, amely egy mintegy 61.000 molekulatömegű szignál peptidet kódol), ezeket követik az érett HA fehérje komplett kódoló szekvenciái. Ezt a rekombináns vektort alkalmazzuk aztán egy baculovírus kifejező vektor készítésére, amely HA-t termel a vírus ezen törzsekből.

A 3. ábra az egyesekben kiváltott anti-HA immunválasz grafikus ábrázolása; 42. nap; n=5; az antitest-titer grafikus ábrázolása rHAO-tiszta-nál, Fluzone vakcinánál, és rHAO-alumíniumsónál, az alábbi dózisok alkalmazása mellett: 0,5 pg (sötét oszlopok), 0,1 pg (árnyékolt oszlopok), 0,02 pg (pontozott oszlopok) és 0,004 pg (üres oszlopok).

A 4a, 4b és 4c ábrák az anti-HA immunválasz grafikus ábrázolása rHAval vagy engedélyezett trivalens vakcinával)(1994-1995 összetétel) immunizált egerekben; hetek a vakcinálás után függvénybe állítva a HIA titerrel szemben HAI A/Texas/36/91-nél (4a ábra); HAI A/Shangdong/9/93-nál (4b ábra); és HAI B/Panama/45/90-nél (4c ábra); rHA esetén (deltoid) és a tojásban tenyésztett FLUVIRON gyengített vakcina esetén (négyzet).

Az alábbiakban részletesen ismertetjük az eljárást.

Eljárást ismertetünk rekombináns influenza vakcina előállítására. Teljes hosszúságú, hasítatlan (HAO) hemagglutinin antigént termelünk baculovirus kifejező vektorokkal tenyésztett rovarsejtekben, és tisztítjuk nem denaturáló körülmények között. Két vagy több tisztított hemagglutinin antigént influenza A és/vagy influenza B törzsekből egymással összekeverünk, így termelünk egy multivalens influenza vakcinát. A rekombináns vakcinát kombinálhatjuk valamilyen adjuváns hordozóval a növelt hatékonyság érdekében.

A rekombináns DNS technológia alkalmazása influenza vakcinák előállítására számos előnyt nyújt: egy rekombináns DNS influenza vakcina biztonságosabb és szigorúbban szabályzóit körülmények között állítható elő; nem szükséges a fertőző influenza szaporítása tojásban; a rekombináns HA fehérjét sokkal nagyobb mértékben lehet tisztítani, gyakorlatilag eltüntetve a fertőző fehérjéknek tulajdonítható mellékhatásokat; a rekombináns HA-hoz szükséges tisztítási eljárásoknál nem kell alkalmazni vírus inaktiválást vagy a vírus membrán komponensek szerves oldószeres extrahálását, ennek megfelelően elkerüljük az antigének denaturálódását és mindazokat a további biztonsági gondokat, amelyeket a maradék kémiai anyagok okozhatnak a vakcinában; a HA termelése a rekombináns DNS technológia útján azt az előny is nyújtja, hogy elkerüljük a tojáshoz való adaptálást és a tojáson való • · • · · · · t I passzálás során kialakuló genetikai heterogenitást, ez pedig lehetővé teszi a vakcina törzsek jobb hozzáillesztését a járványt okozó influenza törzsekhez, amely javított hatékonyságot eredményez; és egy rekombináns megközelítés lehetővé tesz egy törzsszelekciót az évben későbbi időpontban, ez pedig időt ad a sokkal megbízhatóbb járványtani adatokon alapuló szelekcióhoz.

Baculovirus kifejező rendszer,

A baculovirusok DNS vírusok a Baculoviridae családból. Ezekről a vírusokról ismeretes, egy szűk gazdaszervezet-tartományuk van, amely elsődlegesen a rovarok Lepidoptera fajára (pillangók és molylepkék) korlátozódik. Az Autographa californica polihedrózis vírus [Nuclear Polyhedrosis Vírus (AcNPV)] nevű baculovirus, amely a baculovirusok prototípusává vált, hatékonyan replikálódik fogékony tenyésztett rovarsejtekben. Az AcNPV-nek kettős szálú zárt kör alakú DNS genomja van mintegy 130.000 bázispárral, és jól jellemzett, ami a gazdaszervezettartományt, a molekuláris biológiát és genetikát illeti.

Sok baculovirus, köztük az AcNPV nagy fehérje kristály zárványokat képez a fertőzött sejtek magján belül. Egy egyedi polipeptid, amelyet polihedrinnek nevezünk, teszi ki ezen zárvány testek fehérjetömegének mintegy 95%-át. A polihedrin génje, mint egyetlen másolat van jelen az AcNPV vírus genomban. Mivel a polihedrin gén nem esszenciális a vírus replikációjához a tenyésztett sejtekben, ezt könnyen lehet módosítani, hogy kifejezzen idegen géneket. Az idegen gén szekvenciát az AcNPV génbe éppen 3’-nél iktatjuk be a polihedrin promoter szekvenciába úgy, hogy ez a polihedrin promotor átírási szabályzása alatt áll.

A rekombináns baculovirusokat, amelyek idegen gént fejeznek ki, a homológ rekombináció útján alkotjuk meg a baculovirus DNS és a kiméra plazmidok között, amelyek a szóban forgó szekvenciát tartalmazzák. A rekombináns vírusokat megkülönböztethető tarfolt morfológiájuk segítségével mutathatjuk ki és tarfolt-tisztítással lehet homogenitásig tisztítani.

A baculovirusok különösen jól illenek eukarióta klónozó és kifejező vektorokként való alkalmazáshoz. Ezek általában biztonságosak szűk

I gazdaszervezet tartományuk következtében, amely ízeltlábúakra korlátozódik. Az Egyesült Államok Környezetvédelmi Hivatala [U.S. Environmental Protection Agency (EPA] jóváhagyta három baculovirus fajta alkalmazását rovarkártevők leküzdésére. Az AcNPV-t több év óta alkalmazzák gabonafélékhez az EPA kísérleti használati engedélyével. (Experimental Use Permit).

Az AcNPV vad típusa és a rekombináns vírusok sokféle rovarsejtben replikálódnak, ezek között az amerikai sereghernyóból [Spodotera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae)] származó folyamatos sejtvonalakban is. A S. frugiperda sejtek populációs kettőzési ideje 18 és 24 óra között van, és lehet szaporítani egyrétegben vagy szabad szuszpenziós tenyészetekben.

Rekombináns HA fehérjéket lehet előállítani a Lepidopterák közé tartozó Spodoptera frugiperda fajtáktól származó sejtekben, de a lehetőség nem csak ezekre korlátozódik. Az egyéb rovarsejtek, amelyeket lehet baculovirussal fertőzni, között találjuk a Bombyx móri, Galleria mellanoma, Trichplusia ni vagy a Lamanthria dispar fajták sejtjeit, amelyeket szintén lehet megfelelő szubsztrátumként alkalmazni rekombináns HA fehérjék előállítására.

A legelőnyösebb gazdasejtvonal a rekombináns baculovirusokból való fehérjetermeléshez az Sf900+. Egy másik előnyös gazdasejtvonal a fehérje előállítására rekombináns baculovirusokból az Sf9. Az SÍ900+ és az Sf9 nem transzformált, nem tumorképző folyamatos sejtvonal, amely az amerikai sereghernyóból [Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae)]. Az Sf900+ és Sf9 sejteket 28±2 °C hőmérsékleten szaporítjuk szén-dioxid kiegészítés nélkül. Az Sf9 sejtekhez használt tenyésztő tápközeg a TNMFH, amely sók, vitaminok, cukrok és aminosavak egyszerű keveréke, kiegészítve 10% borjúembrió szérummal. A borjúembrió szérumtól eltekintve más állati eredetű terméket (pl. tripszin, stb.) nem használunk a sejtszaporításhoz. Szérummentes tenyésztő tápközegeket (Sf900 tenyésztő tápközeg néven férhető hozzá, gyártó: Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland, Amerikai Egyesült • · · ·

Államok) szintén alkalmazhatunk Sf9 sejtek növesztéséhez, és ez előnyös Sf900+ sejtek szaporításához is.

Az Sf9 sejtek populációs kettőződési ideje 18-24 óra, és lehet szaporítani egyrétegben vagy szuszpenziós tenyészetben. A S. frugiperda sejtekből nem írták le, hogy elősegítené bármely ismert emlős vírus replikációját.

Azok, akik a szakterületen járatosak, megértik, hogy a kifejező vektor nem korlátozódik a baculovirus kifejező rendszerre. A rekombináns HA fehérjék kifejezhetők más kifejező vektorokban is, mint pl. Entomopox vírusokban (CPV), és a rovarsejtek transzformálása a rekombináns HA génnel vagy génekkel konstitutív kifejezéshez vezet.

Az influenza törzsek izolálása

Egy vagy több influenza törzset izolálunk a betegséggel fertőzött egyénekből. Az influenza törzsek előnyösen azok, amelyeket az Egyesült Államok Élelmiszer és Gyógyszer Igazgatósága [Food and Drug Administration (FDA)] vagy a CDC azonosított és bizonyára járványt előidéző lehetőségük lesz a legközelebbi influenza szezonban. Az itt leírt módszer előnye az, hogy az influenzával fertőzött betegek klinikai mintáit, pl. orrváladékát lehet használni a vírus közvetlen forrásaként. Egy másik eljárás szerint ezeket az FDA-tól vagy a CDC-től lehet beszerezni.

Az influenza törzsek szaporítása

A törzseket azután nagy vírustitert termelő sejtekben, pl. Madin Darby macskavese (MDCK) sejtekben (beszerezhető az American Type Culture Collection-tól ATCC CCL34 deponálási számon). így például MDCK sejteket fertőzünk tozil-fenil-alanil-klór-metil-keton, részlegesen inaktivált tripszin és borjúembrió szérum koncentrátum jelenlétében a feltételeket úgy optimalizálva, hogy az első passzálásnál a legnagyobb vírustiter alakuljon ki. Az MDCK sejteket az influenza törzsekkel kis fertőzési mennyiséggel (0.1-0.5) fertőzzük, amint ezt standard HA vizsgálattal meghatározzuk [Rosen: Állati vírusok hemagglutinációja (Hemagglutination with Animál Viruses), in: Fundamental Techniques in Virology, szerkesztők: Habéi K. és Salzman Í>J. P.; kiadó:

Academic Press, New York, 276-78. oldal (1969); e közlemény kitanítása beleépül a jelen találmányba.] A fertőzött sejteket 33°C hőmérsékleten 48 órán át inkubáljuk, és a tápközeget megvizsgáljuk vírustermelésre a hemagglutinációs aktivitási vizsgálatot alkalmazva. A legnagyobb HA aktivitást kialakító körülményeket alkalmazzuk azután az influenza vírus nagyobb készleteinek előállítására.

A vírus tisztítása

Az első passzálásból keletkezett vírusrészecskéket a tápközegből ismert tisztítási eljárással tisztítjuk, mint pl. szacharóz sűrűség-gradiens centrifugálással. így pl. a vírust a fertőzés időpontjától számított 24-48 óra után az influenzával fertőzött MDCK sejtek tápközegének centrifugálásával kinyerjük. Az így kapott vírus üledéket pufferben újra szuszpendáljuk és centrifugáljuk pufferolt szacharóz gradiensen át. Az influenza vírus csíkot a gradiens 40-45% szacharóz területéről kinyerjük, pufferral hígítjuk és 100.000x g -vei végzett centrifugálással üledékbe visszük. A tisztított vírus üledéket pufferban újra szuszpendáljuk és -70°C hőmérsékleten tároljuk.

Az influenza hemaqqlutinin gének klónozása

A HA gének klónozási módszeréről az 1. ábrában nyújtunk áttekintést. A sejteket a klónozandó influenza génnel fertőzzük. A vírust a sejt tápközegéből kinyerjük és vagy a vírus RNS-t - az influenza A törzsek esetében -, vagy az mRNS-t - az influenza B törzs esetében - izoláljuk. A vírus RNS-t (-RNS) tisztított vírusokból vonjuk ki és formaldehid agaróz gélen elemezzük standard munkamenetet alkalmazva. cDNS-t szintetizálunk vagy egy univerzális primer rendszert alkalmazva az influenza A törzsekből való vírus RNS-hez, vagy random primereket alkalmazva az influenza B törzsekből való mRNS-hez. Plusz standard komplementer DNS-t (cDNS) készítünk egy univerzális oligonukleotid prímért (5’-AGCAAAAGCAGG-3’; SEQ ID NO:1) alkalmazva, amely homológ minden hemagglutinin RNS szegmenssel az influenza A és B vírusokban [Davis és munkatársai: Egy bakteriális klón, amely az influenza vírus WSN törzsének (H0N1) hemagglutinin génjét tartalmazza, • · * · meghatározása és jellemzése (Construction and characterization of a bacterial clone containing the hemagglutinin gene of the WSN strain (H0N1) of influenza vírus), Gene, 10, 205-218 (1980)]. A prímereket úgy tervezzük, hogy homológok legyenek az influenza hemagglutinin gének 5’ és 3’ végeinél levő megőrzött területekhez. Mind az 5’, mind a 3’ primerek rendelkeznek olyan restrikciós enzimhelyekkel is végeiken, amelyek nem találhatók a hemagglutinin géneken belül.

A megfelelő influenza A vagy influenza B primereket és az influenza cDNS-t összekeverjük és a hemagglutinin gén szegmenseket kiterjesztjük standard PCR munkameneteket alkalmazva. Az így létrejövő kettős szálú DNS fragmentumok tartalmazzák a teljes érett hemagglutinin kódoló szekvenciákat. A polimeráz láncreakciót (PCR) alkalmazzuk a teljes HA gén kiterjesztésére, amelyet azután klónozunk egy megfelelő bakteriális gazdaszervezetbe, pl. E. coli. Az 5’ végeket szekvenciaelemzésnek vetjük alá, hogy azonosítjuk a HA gének szignált peptidjét, majd PCR-t alkalmazunk, hogy kiterjesszük a HA géneket a szignál peptid nélkül. Ezt azután szubklónozzuk egy olyan plazmid transzfer vektorba, amely tartalmazza az AcNPV polihedrin promotort. Az így létrejövő transzfer vektorok tartalmazzák az alábbi 5’-> 3’ szekvenciákat: polihedrin promotor az A. californica NPV baculovirusból; egy ATG transzlációs start kodon; egy 61K-s baculovirus szignál peptid; az érett hemagglutinin kódoló szekvenciája; a természetes hemagglutinin transzlációs terminációs kodon; a polihedrin RNS poliadenilező szignál; és a szegélyező baculovirus DNS.

Egy tisztított kiméra transzfer plazmid DNS-t, amely egy klónozott hemagglutinin gént tartalmaz, azután összekeverjük az AcNPV vad típusú DNS-se, együtt kicsapjuk kalciummal, és átfertőzzük S. frugiperda sejtekbe. Rekombináns baculovirusokat szelektálunk tarfolt morfológia alapján, és tovább tisztítjuk a tarfolt-tisztítás további meneteivel. A klónozott rekombináns baculovirusokat átvizsgáljuk hemagglutinin kifejezésre, és egy egyedi baculovirus kifejező vektort szelektálunk, amely a mester vírusbank (Master Vírus Bank) alapját képezi.

Influenza A törzsek

Tisztított vírus RNS készítményekből klónozzunk influenza A eredetű HA géneket. Vírus RNS-t vonunk ki 100-200 mikroliter tisztított influenza A virionból, amely 1000-2000 influenza hemagglutinációs egységet (HAU) tartalmaz. Egy HAU egység a vírusnak azon mennyisége, amely a vörös vérsejtek 50%-át agglutinálja a standard agglutinációs vizsgálatban [Rosen: korábban idézett munka (1969)]. A virionokat proteináz K-val kezeljük, hogy a fehérjét elemésszük, azután a vírus RNS-t extraháljuk két térfogat fenollal és kloroformmal, és kicsapjuk etanollal tRNS hordozó jelenlétében. A vírus RNS-t újra szuszpendáljuk pufferben és emésztjük RNÁz mentes DNÁz-zal, hogy eltávolítsunk minden szennyező DNS-t, majd az extrakciós és kicsapási lépéseket megismételjük. A vírus RNS-t (vRNS) azután elemezzük formaldehid agaróz gélt alkalmazva, amint ezt Maniatis és munkatársai leírták. [Molekuláris klónozás: Laboratóriumi Kézikönyv (Molecular Cloning: A Laboratory Manual); kiadó: Cold Spring Harbor Láb., Cold Spring, New York, 86-96. oldal (1982)].

Influenza B törzsek

Az influenza B törzsekből való HA géneket az influenza B törzsekkel fertőzött sejtekből extrahált teljes hírvivő RNS-ből (mRNS) klónozzuk. A fertőzött sejtekből azután extraháljuk a teljes RNS-t. A kinyert sejteket lizáljuk guanidinium tiocianát jelenlétében, és a teljes sejt RNS-t tisztítjuk pl. az RNS extrakciós készlet [RNA Extraction Kit, Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, New Jersey)] alkalmazásával. A teljes mRNS-t extraháljuk a sejt RNS-ből oligo-(dT)-cellulóz fonott oszlopot alkalmazásával, például a Pharmacia Biotec Inc. mRNS tisztító készletét (mRNA Purification Kit) használva.

A rekombináns hemaqqlutinin kifejezése és feldolgozása rovarsejtekben.

Magas szinten fejezzük ki a rekombináns hemagglutinin antigéneket AcNPV-hemagglutinin vektorokkal fertőzött S. frugiperda sejtekben. A primer gén terméke fel nem dolgozott, teljes hosszúságú hemagglutinin (rHAO) és nem választódik ki, hanem társulva marad a fertőzött sejtek perifériális membránjaival. Ez a rekombináns HA0 68.000 molekulatömegű fehérje, amely » » • · · · · · « ·· ···«·« » ······*·<

• * * ·· ··· * · glikozilezve van N-kapcsolt, magas mannóz típusú glikánokkal, amelyek különböznek a vírus fehérjék emlős- vagy madársejtekben való kifejezésénél termelődött glikánoktól. Bizonyíték van arra, hogy az rHAO trimereket képez a transzláció után, amelyek a citoplazmás membránokban gyülemlenek fel.

Vektorok a HAO és egyéb fehérjék kifejezésére A HAO jobb vakcina különb stabilitása miatt a HA1/HA2 komplexszel összehasonlítva, és korrekt összehajtogatást tart fenn a tisztítás és tárolás során. A különb stabilitás különösen nyilvánvaló a B törzsnél, amely a titerekben jelentkezik, ez mintegy ötször nagyobb, mint amelyet a kereskedelmi forgalomban kapható gyengített B törzsekkel kapunk.

Amint az alábbiakban a példákban leírjuk, amikor a HA géneket pMGS12-ben klónozzuk a restrikciós helyek segítségével, a HA érett szignál peptidet eltávolítjuk és helyettesítjük a baculovirus kitináz szignál pepiiddel, melyre mint 61 kD szignál pepiidre fogunk utalni. Mivel a HA gén egy hasítási hely révén van összekötve a kitináz szignál peptiddel, itt a három és öt közötti mennyiségű aminosav van jelen, amely függ a kiválasztott restrikciós helytől az érett HAO fehérje és a 61 kD szignál peptid között. Miközben nincs gond az influenza A törzsével, a további aminosavakkal együtt kifejezett B törzs HAO hajtogatódik megfelelően.

Két utat fejlesztettünk ki ennek a problémának a leküzdésére. Az első egy új vektor, a pMGS3 alkalmazása, amely nem kódolja a 61 kD szignál peptidet. A HAO-t natív szignál peptidjével a vektorba klónozzuk és kifejezzük. Amikor jellemezzük SDS-PAGE-val, az ebben a vektorban kifejezett B törzs HAO jobb glikozilezést és feldolgozást mutat, mint amikor pMGS12-ben fejezzük ki. A HAO olyan jól hajtogatódik, hogy ez kvantitatívan konvertálható HA1/HA2-vé. Sajnos, amint ezt Western foltképzéssel meghatározzuk, a kitermelés nem túl magas. A másik módszer megnöveli a kitermelést a 61 kD szignál peptid alkalmazásával pMGS12-ben, hogy irányítsa a kifejezést, ahol a HAO gént restrikciós enzimek alkalmazása nélkül iktatjuk be. Az új vektort, amely magában foglalja a 61 kD szignál peptidet és a HAO gént többlet közbeeső aminosavakat kódoló szekvencia nélkQI, pMGS27-nek nevezzük.

A pMBS27-et alkalmazhatjuk bármilyen gén klónozásához és kifejezéshez baculovirus kifejező rendszerben. A cél-gént ahelyett, hogy hasítással és ligálással klónoznánk a vektorba, forrasztással (annealing) klónozzuk a vektorba. A reagensek a Clontech-nél kaphatók a PCR-direkt klónozó rendszerükben. (PCR-direct Cloning System). A pMGS27-et úgy terveztük, hogy linearizálható a kitináz szignál peptid kódoló terület végénél, és két hosszú egyszálú farok képződik a linearizált pMGS27 kezelésével T4 DNS polimerázzal és dATP-vel.

A cél-gént polimeráz láncreakció (PCR) vagy reverz transzkriptáz PCR (RT-PCR) alkalmazásával terjesztjük ki egy pár oligonukleotiddal, amelyek úgy vannak tervezve, hogy a kezelt pMGS27 farkaival komplementer egyszálú farkakat alakítsanak ki, miután a PCR fragmentum T4 DNS polimerázzal és dTTP-vel volt kezelve. Egy egyszerű forrasztás azután a két molekulát cirkuláris plazmiddá kapcsolja össze, amely képes a gazdaszervezet transzformálására. A mellett, hogy gyorsabb és egyszerűbb, mint a hagyományos restrikciós-ligálási eljárás egy HA gén klónozására pMGS12-be, a pMGS27-nek az a fő előnye, hogy nem termel többlet aminosavakat, amelyek a kitináz szignál peptid és az érett HA fehérje között megalkotott restrikciós helyek által egyébként kódolódnak. Ezek a többlet aminosavak néha nehézséget okoznak, pl. a szignál peptidáz nem tudja lehasítani a szignált, vagy a kódolt fehérje nem hajtogatódik megfelelően, amint ez a B törzs HA-jának esetében meg is történik.

A rekombináns HAO tisztítása

Néhány nappal a fertőzés után az rHAO-t szelektíven extraháljuk az AcNPV-hemagglutininnel fertőzött sejtek perifériális membránjaiból egy nem denaturáló, nem ionos detergenssel vagy más eljárásokkal, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen járatosak a rekombináns fehérjék tisztításával kapcsolatban rovarsejtekből. Ilyenek pl. az affinitás- vagy gélkromatográfia és az antitest kötés, de a lehetőségek nemcsak ezekre korlátozódnak. A detergenssel szolubilizált rHAO-t tovább tisztíthatjuk DEAE ioncserélő alkalmazásával és lencse lektin affinitás kromatográfiéval vagy más » · « · • · » 4 « egyenértékű eljárással, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen járatosak.

Egy előnyös kiviteli módban az rHAO-t olyan eljárás alkalmazásával tisztítjuk, amely szelídebb és az rHAO nagyobb kitermelését eredményezi az influenza B törzseiből. Ez az eljárás általánosan ismertetve az alábbi:

A HAO fehérjét, amely a rovarsejtek membránjának integráns részét képezi, elkülönítjük az oldható fehérjéktől, a perifériás membrán fehérjéktől és a DNS és RNS legnagyobb részétől olyan módon, hogy a sejteket viszonylag viszkózus alkálikus oldatban extraháljuk, ahol az alkálikus pH-t 9,5 és 10,5 között határozzuk meg. A viszkozitást szacharóz hozzáadásával növeljük mintegy 250 mmól/l koncentrációra beállítva. Egy diszulfid redukáló szert, pl. βmerkapto-etanolt is hozzáteszünk olyan koncentrációban, amely hatékony a fehérjék diszulfid hidjai kialakulásának meggátlására a keverékben. A sejteket az extraháló pufferben szuszpenzáljuk, homogenizájuk, majd centrifugáljuk. Az üledéket mossuk homogenizálással egy kis ionerősségű pufferban, amely diszulfid-redukálószert is tartalmaz, alkálikus pH-nál (a vezetőképesség általában kevesebb min 1 mS, pH 10,5), majd az üledéket centrifugáljuk. A HAO-t azután az üledékből extraháljuk olyan pufferban, amely 0,3 és 1,5% közti mennyiségben detergenst, pl. tritont tartalmaz, tartalmazza továbbá aggregálódást gátló szer megfelelő mennyiségét, amely hatékony a töltési kölcsönhatások következtében fellépő komplexképződés megakadályozására, ilyen lehet a bétáin vagy paurin 0,3 és 0,1 mól/liter közti mennyiségben; a puffer pH-ja alkálikus (előnyösen 9,5). A felülúszóban található HAO-t azután anioncserélő kromatográfiával tisztítjuk, ezt pedig kationcserélő kromatográfia követi. A HAO-t az anioncserélő oszlopra, pl. DEAE vagy Q-Sepharose (agaróz gyöngy oszlop kvaterner aminocsoportokkal) oszlopra azonos pufferben visszük fel, amivel extraháltunk, de hígítjuk legalább 1:2 arányban további pufferral; a felvitel előtt az oszlopot olyan pufferral egyensúlyozzuk ki, amely tartalmazza a detergens és a diszulfid redukáló szer koncentrációjának mintegy 1/10-ét A HAO-t azután eluáljuk olyan módon, hogy a pH-t • *·<» ·

csökkentjük mintegy 8,5-re. Az eluált HAO-t kationcserélő oszlopra visszük fel lényegében azonos pufferban. A szennyező anyagokat úgy eluáljuk, hogy a pH-t mintegy 7,4-re csökkentjük, majd a HAO-t eluáljuk úgy, hogy a sókoncentrációt 0,15 mól/liter NaCI-re növeljük.

A tisztításnak ezt az előnyös eljárását az alábbiakban részletesen ismertetjük.

A rekombináns HA-t tartalmazó membrán előállítása. Rekombináns HA-t kifejező sejteket (6,2 g sejt 0,34 liter tenyészetben) szuszpendálunk 100 mg/ml koncentrációban olyan jéghideg oldatban, amely 100 mmól/l nátriumpirofoszrátot, 100 mmól/l nátrium-kloridot, 250 mmól/l szacharózt és 0,1% βmerkaptoetanolt tartalmaz (pH 10,5). A sejteket Polytron homogenizálókban (Brinkman Instrument Inc., Westburg, New York) 4. behangolásnál 2 percig zúzzuk. A homogenizáló közegben alkálikus pH szükséges, hogy megnöveljük a szennyező fehérjék szolubilitását, és megnöveljük a membrán készítmény tisztaságát. A homogenizátumot 30 percig centrifugáljuk 9200 g-nél. A felülúszót elöntjük és az üledéket összegyűjtjük. A membrán frakció elkészítését egy kis ionerejű mosási lépés követi. Az üledéket újra szuszpendáljuk az eredeti térfogatra jéghideg, 0,1 %-os β-merkapto-etanollal (10,5) és homogenizáljuk 4. behangolásnál 2 percig. A homogenizátumot centrifugáljuk 30 percig 9200 g-nél. A felülúszót elöntjük és az üledéket összegyűjtjük. Ez a kis ionerejű mosás eltávolítja a perifériális membrán fehérjék további részét. A membrán frakció előállítása a rekombináns HA jelentős feldúsulását és a szennyező nukleinsavak eltávolítását eredményezi.

A rekombináns HA extrahálása. A rekombináns HA-t azután szelektíven extraháljuk a membrán üledékéből olyan körülmények között, amelyek nem denaturálják az antigént. A membrán üledéket homogenizáljuk 41 ml jéghideg oldatban, amely 10 mmól/l etanolamint (pH 6,5) 1% Triton N101-et, 0,1% β-merkapto-etanolt, 25 mmól/l NaCI-t és 400 mmól/l betaint tartalmaz; a homogenizálást 4. hangolásnál 2 percig végezzük Polytron homogenizálóban. 40 perces, 23°C hőmérsékleten végzett inkubálás után a

keveréket 30 percig 9200 g-nél centrifugáljuk. A rekombináns HA-t tartalmazó felülúszót dekantáljuk és kétszeresére hígítjuk azonos pufferral.

A fehérjéket elemezzük SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel. A mintákat forró vízfürdőben 10 percig zúzzuk 2% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) és 5% β-merkapto-etanol jelenlétében, majd elektroforézisnek vetjük alá 11 %os poliakrilamid gélen 0,1% SDS jelenlétében, majd megfestjük Coomassiekékkel.

Kromatográfiás tisztítás. A rekombináns HA kromatográfiás tisztítását egyszerűsítjük és a drága affinitás-kromatográfiát a lencse lektin szefarózon (Lentil Lectin Sepharose) kiiktatjuk a folyamatból olyan módon, hogy helyettesítjük egy kétlépcsős kromatográfiás tisztítási eljárással; ez nagy mértékben tisztított rekombináns HA antigént eredményez, amely nem denaturált és megfelelő, mint emberi használatra szánt influenza vakcina komponense. Az alkalmazott kromatográfiás gél mátrixok a Pharmacia QSepharose Fást Flow és a CM-Sepharose Fást Flow.

Anioncserlő kromatográfia. Minden kromatográfiát szobahőmérsékleten végzünk. A rekombináns HA-t tartalmazó, a fentiekben leírtak szerint előállított extraktumot felvisszük 1 ml/perccel Pharmacia QSepharose Fást Flow oszlopra (5 ml C10/10 Pharmacia oszlopban), amely 10 mmól/l etanolamint (pH 9,5), 0,1% Triton N101-et, 0,01% β-merkapto-etanolt, 2,5 mól/l NaCI-t és 400 mmól/l betaint tartalmazó oldattal volt kiegyensúlyozva. Az oszlopot ezután mossuk a kiegyensúlyozó pufferral, amíg az átfolyó oldat UV abszorbancia visszatér az alapvonalra. Ilyen körülmények között a rekombináns HA az oszlophoz kötődik, míg a szennyezők jó része keresztülfolyik. A részlegesen tisztított rekombináns HA-t azután eluáljuk 30 mmól/l dietanolamint (pH 8,5), 0,1% Triton N101-et, 0,01% β-merkapto-etanolt, 25 mmól/l NaCI-t és 400 mmól/l betadint tartalmazó oldattal.

Kationcseréiő kromatográfia. A Q-Sepharose eluátumot (23 ml) kétszeresére hígítjuk 30 mmól/l dietanol-amint (pH 8,5), 0,1% Triton N101-et, 0,001% β-merkapto-etanolt, 10 mmól/l NaCI-t és 400 mmól/l betaint tartalmazó • · · · · · · . ········· • · · ····· · ··· ·· ··· · · oldattal. Az oszlopot azután mossuk 35 ml oldattal, amely 10 mmól/l nátriumfoszfátot (pH 7,4), 10 mmól/l NaCI-t, 0,1% Triton N101-et, 0,01% β-merkaptoetanolt és 400 mmól/l betaint tartalmaz. Ez a kezelés kioldja az oszlopról a szennyező anyagokat, míg a rekombináns HA a CM Sepharosehez lesz kötve. A detergenst azután eltávolítjuk olyan módon, hogy az oszlopot 10 mmól/l nátrium-foszfátot (pH 7,4) és 10 mmól/l NaCI-t tartalmazó oldattal mossuk, amíg az elfolyó UV abszorbanciája visszatér az alapvonalra. A tisztított rekombináns HA-t foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal (pH 7,5) (PBS) eluáljuk.

A tisztított rHAO-t újra szuszpendáljuk pufferolt izotóniás oldatban. A detergens eltávolítását követően a tisztított rHAO hatásosan agglutinálja a vörös vérsejteket.

A rekombináns HAO szerkezeti és biológiai tulajdonságai.

Az rHAO-t legalább 95, előnyösebben 99%-ig tisztítjuk. Ez SDS poliakrilamid gélen zömmel egyedi nagy polipeptidként vándorol 66.000 molekulatömegnél. A tisztított rekombináns HAO kvaterner szerkezetét elektronmikroszkóppal, tripszin rezisztenciával, sűrűség ülepítési elemzéssel és a vörös vérsejteket agglutináló képességgel vizsgáljuk. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a rekombináns HAO trimereket képez, amelyek rozettákba állnak össze.

A tisztított rHAO nem agglutinálja a sejteket a detergens eltávolítása előtt, és ez azt sugallja, hogy az antigénnek komplexeket (rozettákat) kell képeznie abból a célból, hogy kereszt-kötést létesítsen vörös vérsejtekkel. A tisztított rHAO sejtagglutináló képességének kvantitatív mérési eredményeit használjuk az antigén állagának mennyiségi mértékeként. A hemagglutinin egységet úgy határozzuk meg, mint azt az antigén mennyiséget, amely 50%os agglutináció eléréséhez szükséges standard hemagglutinin vizsgálatokban csirke vörös vérsejtekben. Az összehasonlító adatok azt mutatjuk, hogy a tisztított rHAO antigének a vörös vérsejteket olyan hatékonysággal agglutinálják, amely a teljes influenza virionoknál megfigyelt értékekhez hasonló.

• ·· ····· ···· • · · · · · · , ·······>· t · · ····· · • · · ·· ··· · ·

A rekombináns HAO-t a diszulfid hídnál elhasíthatjuk, ezáltal olyan konformáció változást idézünk elő, amely két lánc, a HA1 és HA2 képződését eredményezi, amint ezt Carr C.M. és Kim P.S. leírták[Rugóterhelési mechanizmus az influenza hemagglutin konformációs változásainál (A Springloaded Mechanism fór the Conformational Change of Influenza Hemagglutin), Cell, 73, 823-832 oldal (1993)] Ez az irodalmi hely referenciaként épül be a jelen bejelentésbe A rekombináns HAO hasítását a későbbiekben, a 6. példánkban részletesebben is leírjuk. Úgy véljük, hogy a természetes HAO hasításakor HA1-gyé és HA2-vé a láncok fertőzővé válnak megszerezve azt a képességet, hogy egy sejttel egyesüljenek, ez által megnövelt immunválaszt alakítsva ki. Az antigének, mint pl. az influenza hemagglutinin működése úgy megy végbe, hogy az antigén peptidek kötődnek a nagyobb szövetbarát [Major Histocompatibility (MHC)] molekulákkal. Az antigén/MHC komplexet a T sejtek felismerik és immunválaszt indítanak be, amint ezt összefoglaló műveikben Harding és Geuze leírják [Current Opinion in Cell Biology 5, 596-605 oldal (1993)]. Ez az irodalmi hely referenciaként épül be a jelen bejelentésbe. A baculovirusokon termelt rHAO azonban nagyon stabil és olyan immunogén, mint az ép molekula. A rovarsejtekben kifejezett HAO-n levő cukormolekulák összehasonlítása azt mutatja, hogy a glikánok különböznek azoktól, amelyek az emlős vagy madársejtekben kifejezett HAO-n találhatók.

Fúziós fehérjék termelése

HAO-t tartalmazó fúziós fehérjék, amelyekben a HAO egy maradék antigén fehérjében van fuzionálva, is készíthetők, ahol a második fehérje antigenicitása alacsony vagy ahol immunválasz kiváltása többértékű antigénre előnyösnek mutatkozik. Például lehet egy előnyös második antigénre a neuraminidáz, amelyet az influenza alakít ki. Az antigén állhat sejt-, vírus- vagy baktériumfehérjéből, vagy ezek antigén részeiből, beleértve legalább 5-8 aminosavat. A további antigének között találjuk a hepatitis β antigént, a HÍV antigéneket és a karcinoembrionális antigént. Az “immunválasz” fogalma, ahogyan itt használjuk, vagy testnedv-válaszra utal, amelyet az antigén által kiváltott antitest termelésével mérünk, vagy sejtválaszra, amelyet az antigénre adott válasz által közvetített T-sejt kiváltással mérünk. Néhány esetben nemantigén aminosavak kapcsolótagját (“linker) iktathatjuk be a HA és az antigén közé, hogy tovább fokozzuk az antigén antigenicitását a HA-val összehasonlítva. Az eljárás magában foglalja egy DNS plazmid megalkotását a cél antigén gének fuzionálása céljából a teljes hosszúságú influenza vírus HA génhez vagy ennek fragmentumaihoz. A plazmid megalkotásához oligonukleotid próbákat és polimeráz láncreakciós (PCR) eljárást alkalmazunk.

A HA-célantigén fúziós géneket a rovarsejtekben való megfelelő kifejeződéshez úgy módosítjuk, hogy kiiktatjuk a természetes hidrofób szignál pepiid szekvenciákat és helyettesítjük új baculovirus szignál peptiddel. A fúziós gént úgy vezetjük be egy baculorirus kifejező vektorba, hogy a baculovirus polihedrin promoter irányítsa a fúziós fehérjék transzkripcióját a fertőzött rovarsejteken. A 18 aminosavas baculovirus szignál peptid indukálja a HAcélantigén fúziós polipeptid transzlációját a rovarsejt glikozilezési útjába, de nincs jelen az érett fúziós fehérjében.

így például a pA9440 plazmidot, amely az A/Beijing/32/92 törzs génjét tartalmazza a pMGS12 baculovirus transzfer plazmidban, amint a későbbiekben leírjuk, alkalmazzuk templátként a HA gén kiterjesztéséhez polimeráz láncreakcióval (PCR) a szállító cég (Gene Amp PCR cloning kit, Perkin Elmer Cetus) által javasolt munkamenetet alkalmazva. A PCR reakció keverék (100 mikroliter) 20 pmól olyan prímért tartalmaz, amelyet a HA gén részeinek forrasztásához terveztünk. Az 5’ és 3’ primereket a végeknél olyan restrikciós endonukleáz helyekkel tervezzük, amelyek a HA génen belül nem találhatók. Az 5‘ PCR primer (0-567) a HAO és HA1 fragmentumokhoz 52 bázispárral kezdődik a természetes HA gén kódoló szekvenciák 5’ végétől lefelé (downstream), kiiktatva a természetes szignál peptid szekvenciát, és egy Smal hely van hozzátéve közvetlenül a H1 kódoló szekvencia 5’ végéhez. Az 5’ PCR primer (0-651) a HA2 fragmentumhoz a természetes HA gén 1108. nukleotidjánál kezdődik, amelyet azonnal követ az arginin gyököt kódoló kodon, amely a HAO-nak HA1-gyé és HA2-vé való hasítása során tűnik el. A 3’ » · · · · « • · « • · · · · · • · · · · ·

PCR prímért (0-680) a HAO és HA2 fragmentumokhoz úgy tervezzük, hogy hozzáadunk egy Kpnl helyet közvetlenül a HA kódoló szekvenciát követően, eltávolítva a természetes stop kodont. A 3’ PCR primer a HA1-hez (0-679) megcsonkítja a gént közvetlenül az arginin gyök előtt, amely eltávolítódik a HAO hasítás során. A HA gén fragmentum kiterjesztését 30 ciklusban hajtjuk végre, minden ciklus az alábbiakból áll: 1 perc 94°C hőmérsékleten a denaturáláshoz, 2 perc 55°C hőmérsékleten a primerek forrasztásához, és 2 perc 72°C hőmérsékleten a kiterjesztéshez. Az így létrejövő kiterjesztett H1 géneket elektroforézisnek vetjük alá agaróz gélen, a gélről tisztítjuk GeneClean készlettel (Bio 101, Inc.), és egy olyan plazmidba ligáljuk, amely PCR-rel létrehozott fragmentumok befogadására van tervezve. így kapjuk meg a pB142, pB144 és pB330 plazmidokat, amelyek a HAO, illetve HA1, illetve HA2 gén fragmentumokat tartalmazzák.

A HA gén fragmentumokat eltávolítjuk a pB142, pB144 és pB330 plazmidokból Smal és Kpnl restrikciós enzimekkel, majd szubklónozzuk standard rekombináns DNS technikákkal [Sambrook és munkatársai (1989)] a pMGS12 AcNPV transzfer plazmidba. A pMGS12 plazmid tartalmazza az 5’-től a 3'-ig az AcNPV polihedrin promotort, egy ATG iniciációs kodont, az egy 61.000 molekulatömegei baculovirus glikoproteinről (61K) lehasítható szignál pepiidhez tartozó szekvenciát, Smal és Kpnl restrikciós enzim klónozó helyeket, és egy TAA univerzális stop kodon szekvenciát. Ezeket a szabályozó területeket egy DNS szegélyezi, amely az AcNPV genomból való EcoRI I. fragmentumból származik [Summers és Smith: Kézikönyv a baculovirus vektorokhoz alkalmazható módszerekről és a rovarsejt-tenyésztési eljárásokról (A manual of methods fór baculovirus vectors and insect cell culture procedures), Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987)] A klónozott HA PCR fragmentumokat kivágjuk a pCRII klónozó vektorból Smal-gyel és Kpnl-gyel tisztítjuk agaróz gélelektroforézissel és a GeneClean készlet segítségével, és ligáljuk pMGS12-be, amelyet előzőleg szintén emésztettünk Smal-gyel és Kpnl-gyel. Az így létrejött AcNPV transzfer ·* · « · *········ • · · «···· · ··· · · ··· · · plazmidokat, a pB879-et, pB1201-et és pB1205-öt, amelyek a HAO-hoz, illetve HA1-hez, illetve HA2-höz tartozó kódoló régiókat tartalmazzák, keretben kapcsoljuk a 61K génből lehasítható baculovirus szignál peptiddel és a polihedrin promotorral. A pB879, pB1201 és pB1205 AcNPV transzfer plazmidokat felhasználhatjuk arra, hogy a HAO-t, HA1-et, HA2-t fuzionáljuk bármely szóban forgó génnel.

A HA-CEA fúziós gén transzfer plazmidok megalkotásában a második lépés a CEA kódoló szekvencia beiktatása a HA-kódoló konstrukciókba. Smal és Kpnl restrikciós endonukleáz felismerő/hasító helyeket helyezünk el a CEA gén mindkét végére a pA9080 plazmid PCR kiterjesztése révén. Az 5’ PCR primer, 0-649, 82 bázispárral a gén 5’ végétől kezdődik, kiiktatva a természetes CEA szignál peptid szekvenciát. A 3’ PCR prímért, 0-650, úgy tervezzük, hogy iktassa ki az utolsó 72 bázispárt a gén 3’ végétől, amely a hidrofób C-terminális szekvenciát kódolja. A CEA gén fragmentum kiterjesztését 30 ciklusban végezzük, az egyes ciklusok az alábbi lépéseket tartalmazzák; 1 perc 94°C hőmérsékleten a denaturáláshoz, 2 perc 55°C hőmérsékleten az újra forrasztáshoz, és 2 perc 72°C hőmérsékleten a kiterjesztéshez. Az így létrejött kiterjesztett CEA gén fragmentumot elektroforézisnek vetjük alá agaróz gélen, GeneClean eljárással tisztítjuk és pCRII-be (Invitrogen) ligáljuk a gyártó cég útmutatása szerint. Az így létrejövő plazmid, a pB806, tartalmazza a CEA gént természetes szignál peptidje, Cterminális hidrofób területe vagy stop kodonja nélkül, de mind Smal, mind Kpnl helyekkel a gén mindkét végén.

Nagy léptékű plazmid előállítást végzünk a pB806 plazmiddal, és a DNSt Smal-gyel vagy Kpnl-gyel emésztjük. A CEA-t kódoló fragmentumokat agaróz gélelektroforézissel és GeneClean készlettel tisztítjuk a három HA-kódoló konstrukció (pB879, pB1201 vagy pB1205) mindegyikébe; ezeket előzőleg azonos restrikciós enzimmel emésztjük. így például Smal-gyel hasított végű CEA-kódoló fragmentumokat ligálunk a ΗΑ0-, HA1- és HA2-kódoló konstrukciókba (pB879, illetve pB1201, illetve pB1205), amelyek Smal-gyel vannak hasítva. Ilyen módon alkotjuk meg a pB1250, illetve pB1555, illetve pB1584 plazmidokat. Kpnl-gyel hasított végű CEA-kódoló fragmentumokat ligálunk a HA0-, HA1 és HA2 kódoló konstrukciókba, amelyek Kpn-nel vannak előzőleg hasítva. Ilyen módon alkothatjuk meg a pB1264, pB1564 és pB1593 plazmidokat. A CEA gén beiktatása az Smal helynél a CEA kódoló szekvenciákat a H1 kódoló szekvenciától lefelé helyezi el. A PCR prímért az összes konstrukciónál úgy tervezzük, hogy EA gént iktatunk be HA-val keretben, és a fúziós gén transzlációt az univerzális transzlációs terminációs kodonnál (TAATTAATTAA) (ID.NO: 4 szekvencia) fejezzük be a pMGS12 vektor szekvenciákban a Kpnl helytől lefelé.

Ez a konstrukció javítható a közbeeső aminosavak kiiktatásával vagy a szignál peptid és a HAO között, ahogyan később leírjuk, vagy a HAO és a fúziós gén között, hogy növeljük a hajtogatást és az immunogenicitást.

A vakcinák formázása és kiszerelése

Az rHA-t formázhatjuk és kiszerelhetjük egyedül vagy más influenza antigénekkel kombinálva olyan eljárásmenetet és anyagokat alkalmazva, amelyek ismerősek azok számára, akik az influenza vírusok szakterületén járatosak. Az egyik előnyös kiviteli formában két A törzsekből származó és egy B törzsből származó HA fehérjét egyesítünk, hogy multivalens vakcinát képezzünk.

Egy különösen előnyös kiviteli módban a HA-kat valamilyen adjuvánssal keverjük össze, az adjuváns mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy fokozza az immunogén választ a HA fehérjék ellen. Az emberekben való felhasználásra jelenleg széles körben elterjedtek az alumínium-származékok (alumínium-foszfát vagy alumínium-hidroxid). A szaponin és tisztított komponense, a Quil A, a Freund-féle komplett adjuváns és más, a kutatásban és az állatgyógyászati felhasználásban alkalmazott adjuvánsok bizonyos mértékig toxikusak és ez korlátozza a humán vakcinákban való lehetséges felhasználásukat. Új, kémiailag meghatározott készítmények, mint a muramii dipeptid, a monofoszforil lipid A, foszfolipid konjugátumok, amelyeket Goqdman-Snitkoff és munkatársai írtak le ÍJ. Immunoi. 147, 410_:415. oldal ··· · (1991); ez az irodalmi hely referenciaként szerepel a jelen bejelentésben], a fehérje kapszulázása egy proteinliposzómán belül, amint ezt Miller és munkatársai leírták fJ. Exp. Med.. 176, 1739-1744 oldal (1992); ez az irodalmi hely referenciaként szerepel a jelen bejelentésben], a fehérje kapszulázása lipid hólyagocskákon (vesiculum) belül, amelyek lehetnek Novasome lipid hólyagocskák (Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, New Hampshire) mindezek használhatók az említett célra.

Egy előnyös kiviteli módban a vakcinát egyedi dózisokban szereljük ki immunizáláshoz parenterális (vagyis intramuszkuláris, intradermális vagy szubkután) vagy orrszájüregi (pl. intranazális) bevitellel. A hatásos adagot úgy határozzuk meg, ahogy a a következő példákban leírjuk. A hordozó általában víz vagy pufferolt fiziológiás konyhasóoldat tartósítószerrel vagy a nélkül. Az antigént liofilezhetjük, így olyan készítményt kapunk, amelyet a beadás időpillanatában újra szuszpendálhatunk, vagy oldatban tarthatunk.

A hordozó lehet egy polimer késleltetve kibocsátó rendszer. Szintetikus polimerek különösen hasznosak egy vakcina formázásához, hogy hassanak az antigének szabályozott kibocsátására. Erre egy korábbi példa volt a metilmetakrilát polimerizálása kevesebb, mint 1 mikron átmérőjű gömböcskékké, így alakítva ki az ún. nano részecskéket, amint erről Kreuter J. beszámolt fMicrocapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacoloqy; Dobrow M. CRC Press 125-148. oldal] Az antitest válasz, valamint a védelem az influenza vírus fertőzése ellen lényegesen jobb, mint amikor az antigéneket alumíniumhidroxiddal kombinálva adjuk be. Más részecskékkel végzett kísérletek azt demonstrálják, hogy ezen polimerek adjuváns hatása függ a részecskemérettől és a hirofobicitástól.

A mikrokapszulázást mikrokapszulázott gyógyszerek injekciójához alkalmazzuk, hogy szabályozott kibocsátást kapjunk. Számos tényező járul hozzá egy adott polimer kiválasztásához mikrokapszulázás céljaira. A polimer szintézis és a mikrokapszulázási folyamat reprodukálhatósága, a kapszulázás anyagainak és eljárásának költségei, a toxikológiai profil, a polimer és az antigének változó kibocsátási kinetikájának. és fiziko-kémiai ·· ···· · • te* · összeférhetőségének igénye - mindezek olyan tényezők, amelyeket figyelembe kell venni. Az alkalmas polimerre példák lehetnek a polikarbonátok, poliészterek, poliuretánok, poliortoészterek és poliamidok, különösen azok, amelyek biológiailag lebonthatók.

A gyógyászati hordozóknál, de különösen az antigének hordozóinál gyakori választás a poli-(d,l-laktid-co-glikolid) (PLGA). Ez olyan biológiailag lebontható poliészter, amely orvosi felhasználásának hosszú története van felszívódó varratoknál, csontlemezeknél és más ideiglenes protéziseknél, ahol semmiféle toxicitást nem mutat. Gyógyszerek, ezen belül peptidek és antigének széles választéka van kiszerelve PLGA mikrokapszulákba. Adatok jelentős tömege gyűlt össze a PLGA adaptálásáról antigén szabályozott kibocsátásához, ilyenekről számolnak be Eldridge és munkatársai [Current Topics in Microbioloqy and Immunoloqy, 146, 59-99 oldal (1989)] Az antigének befogadásáról 1-10 mikron átmérőjű mikrogömböcskékbe kimutatták, hogy jelentős adjuváns hatást biztosít, amikor orálisan adják be. A PLGA mikrokapszulázási munkamenet egy víz-az-olajban emulzió fázisszeparálást alkalmaz. A szóban forgó anyagot vizes oldatban állítjuk elő, és a PLGA-t feloldjuk megfelelő szerves oldószerben, pl. metilén-kloridban és etilacetátban. Ezt a két, egymással nem keveredő oldatot együtt emulgeáljuk nagysebességű keveréssel. Az emulzióhoz hozzáadunk egy olyan folyadékot, amely a polimer számára nem oldószer, ez a polimer kicsapódását okozza a vízcseppek körül, így kezdetleges mikrokapszulákat képezve. A mikrokapszulákat összegyűjtjük és stabilizáljuk az alábbi szerek valamelyikével: polivinil-alkohol (PVA), zselatin, alginátok, polivinil-pirrolidon (PVP), metilcellulóz, majd az oldószert eltávolítjuk vákuumban történő szárítással vagy az oldószeres extrahálásával.

A jelen találmányt jobban megérthetjük, ha tanulmányozzuk az alábbi, nem korlátozó jellegű példákat.

1. példa: Az influenza vírusok szaporítása és tisztítása ··» · » · * 9 9 « i ··>*«<·«·.· • · * · *··· « · - ·· ··» .

Az alábbi influenza vakcina törzseket használjuk fel az FDA készletéből csirketojás hugytömlő folyadékában:

A/Beijing/353/-szerű (H3N2)

A/Beijing/32/92-szerű (H3N2)

A/Texas/36/91-szerű (H1N1)

B/Panama/45/90.

Abból a célból, hogy szaporítsuk az FDA-tól kapott influenza vírus eredeti tenyészetet, MDCK sejteket fertőzünk TPCK-val kezelt tripszin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) és borjúembrió szérum különböző koncentrációi jelenlétében, ahol a koncentrációkat optimalizáljuk, hogy a vírus első passzálásánál a legmagasabb titert érjük el. Az MDCK sejteket az influenza törzsekkel kis fertőzéshányadú tömeggel (0,1-0,5) fertőzzük, amint azt standard HA vizsgálattal maghatározzuk [Rosen: Hemagglutinálás állati vírusokkal (Hemagglutination with Animál Viruses) in: Fundamental Techniques in Virology, szerkesztők: Habéi K. és Salzman N.P., kiadó: Academic Press, New York (1969)] A fertőzött sejteket 33OC hőmérsékleten inkubáljuk, és a tápközeget megvizsgáljuk vírustermelésre a hemogglutinációs aktivitási vizsgálat segítségével. A legmagasabb HA aktivitást kialakító körülményeket alkalmazzuk nagy mennyiségű influenzavírus készlet előállításához. A TPCK tripszin és a borjúembrió szérum optimális koncentrációit a fenti influenza vírusokhoz az 1. táblázatban adjuk meg.

- · 4 « Ί * • ·»· r » * » 4 «··· · *· «· · »

1. táblázat A TPCK tripszin és a borjúembrió szérum optimális koncentrációja

B/Panama/45/90	5,0%	£ ~OT X CO
A/Texas/36/91	0,25%	45 pg/ml
A/Beijing/32/92	0,25%	45 pg/ml
A/Beijing/353/89	0,25%	45 pg/ml
	% borjúembrió szérum	TPCK-val kezelt tripszin mennyisége

• · · · «

Az influenza vírus tisztítása. A vírust a fertőzéstől számított 24-48 óra múlva kinyerjük a 10 T175 szövettenyésztő palackból az influenzával fertőzött MPCK sejtek tápközegének derítésével. (1000x g 10 percen át). A vírust a tápközegből üledékbe visszük (100.000x g 1 órán át). Az így létrejövő vírus üledéket újra szuszpendáljuk 1 ml foszfáttal puffereit fiziológiás konyhasóoldatban (PBS; pH 7,4), és centrifugáljuk 20 ml-es, 20-60%-os (tömeg/térfogat) PBS-ben levő szacharóz gradiensen át. Az influenza vírus csíkot kinyerjük a gradiens 40-45%-os szacharóz területéről, PBS-sel hígítjuk és 100.000g-vel üledékbe visszük. A tisztított vírusüledéket újra szuszpendáljuk 0,5 ml PBS-ben, és -70°C hőmérsékleten tároljuk.

2. példa. Az influenza A/Texas/36/91 gén klónozása

A 2. ábra példaként mutatja be az influenza HA gének egyikének klónozási lépését Vírus RNS-t extrahálunk, ahogyan fentebb leírtuk, influenza A/Texas/36/91-bői, amelyet CDC-ből kaptunk. Az influenza RNS szegmensek 3’ végével komplementer univerzális prímért, 5’-AGCAAAAGCAGG-3’-t (SEQ ID NO:1) alkalmazzuk rágcsáló Maloney Leukémia vírus (M-MuLV) reverz transzkriptázzal, hogy influenza cDNS-eket termeljünk. Tisztított vírus RNS-t vagy mRNS-t (5 pg) alkalmazunk templátként, hogy cDNS-t állítsunk elő, MMuLV reverz transzkriptázt használva, amely a Pharmacia Inc. termékében a “First-Strand cDNA Synthesis Kit”-ben megtalálható. Az influenza A törzsekből származó vírus RNS cDNS-éhez alkalmazott primer egy szintetikus oligonukleotid primer (5’-AGCAAAAGCAGG-3’) (SEQ ID NO:1), amely homológ az összes HA gén virion szegmens 3’ végével.

A HA gének kiterjesztését cDNS-ből polimeráz láncreakcióval (POR) végezzük standard reakciókörülményeket alkalmazva (Gene Amp készlet; Cetus/Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut). A PCR reakciókeverék (100 μΙ) 20 pmólt tartalmaz a primerekből, amelyek speciálisak az influenza A(H3) vagy A (H1) vagy influenza B törzsek HA génjének 5’ és 3’ végeihez, amint ezt

GenBank DNS adatfájlokban található konszenzus szekvenciákkal meghatározzuk. Ezt a 2. táblázatban mutatjuk be. A kiterjesztést 30 ciklusban végezzük, minden ciklus az alábbi lépéseket tartalmazza: 1 perc denaturálás 94°C hőmérsékleten, 2 perc 55°C hőmérsékleten újra forrasztáshoz és 3 perc 72°C hőmérsékleten a kiterjesztéshez. A PCR termékeket 0,8%-os agaróz gélen elemezzük, helyes méretre klónozás előtt. Az alábbi PCR prímért alkalmazzuk a PCR-ben a HA gén 5’ végéből: 5’-GGG GGT ACC CCC GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA AAA-3’ (SEQ ID NO:2) és a HA gén 3’ végéből: 5’-GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC3’ (SEQ ID NO:3), hogy kialakítsuk a helyes hosszúságú HA gént.

Egy új 5’ PCR prímért tervezünk a gén 5’ végéből: 5’ vég mínusz szignál szekvencia: 5’-GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GCC TAC CAT-3’ (SEQ ID NO:4) és a gén 3’ végéből: 5’-GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3’ (SEQ ID NO:5). Ezeket alkalmazzuk PCR-ben, hogy kialakítsuk a HA gén mínusz szignál peptid szekvenciát. Ezt azután beiktatjuk a Kpnl-gyel tisztított TA vektorba. A 61K szignál pepiidet a baculovirus kifejezéshez és a polihedrin promotort azután beiktatjuk a TA vektorba, amely tartalmazza a HA gén mínusz influenza szignál peptid szekvenciát. Az így létrejövő baculovirus rekombinációs vektor tartalmazza a polihedrin promotort, a 61K baculovirus szignál pepiidet és az influenza A/Texas/36/91 HA-jának génjét.

Az influenza B törzsekből való HA géneket az influenza B B/Panama/45/90 törzzsel fertőzött MDCK sejtekből extrahált teljes hírvivő RNS-ből (mRNS) klónozzuk. Teljes RNS-t készítünk fertőzött sejtek 5 T175 palackjából. A kinyert sejteket lizáljuk guanídinium tiocianát jelenlétében, és a teljes sejt RNS-t tisztítjuk, ahogy fentebb leírtuk. A teljes mRNS-t extraháljuk a sejt RNS-ből az oligo-(dT)-cellulóz fonatos oszlopokat alkalmazva, amint a korábbiakban már leírtuk.

Az influenza B törzsekből való mRNS-hez alkalmazott primer egy random oligonukeleotid primer. (Pharmacia, Inc.) • · · *

2. táblázat. A PCR kiterjesztéshez alkalmazott primerek

2. táblázat (folytatás)

• · ·

Felhozunk egy példát, ahol cDNS termékekhez vírus A/Texas/36/91 vírus RNS-t használunk templátként. A cDNS szegmensek, amelyek kódolják az influenza fehérjéket, elhelyezkedését a következőképpen határozhatjuk meg. Tisztított vírus RNS-t egyesítünk a reakciókeverékben univerzális egyszálú DNS primerrel, 5’-AGCAAAAGCAGG-3’-vel (SEQ ID NO:1). Ez a primer komplementer az influenza virion szegmensek 5’ végével, amint fentebb leírtuk. A reakciókeverékhez adunk [cc-³²P]dCTP-t is, hogy láthatóvá tegyük a cDNS termkeket, amelyeket 1.5%-os alkálikus hidrolízis gélen különítünk el [Maniatis és munkatársai (1982)], és X-OMAT-AR filmen exponáljuk.

3. példa. HA gének klónozása bakteriális plazmidokba

A PCR-rel kiterjesztett rHA géneket egy pUC-szerű plazmid vektorba klónozzuk, a TA klónozó rendszert alkalmazva (Invitrogen, Inc.). A HA gének jelenlétét a standard munkamenetekkel tisztított plazmid DNS restrikciós enzimes emésztési termékének elemzésével igazoljuk [Maniatis és munkatársai (1982)]. Az rHA gének 5’ végét azután DNS szekvenciaelemzéssel elemezzük, és új primereket tervezünk, hogy eltávolítsuk a hidrofób szignál peptideket kódoló szekvenciákat a HA fehérjék terminálisánál N-terminálszámnál. A speciális 5’ és 3’ oligonukleotid primereket amelyek a 2. táblázatban vannak felsorolva, használjuk a cDNS termékek kiterjesztésére PCR-rel, és E.coli TA plazmid vektorokba (Invitrogen, Inc.) klónozzuk standard klónozási eljárásokat alkalmazva. Az így létrejövő DNS kiónok tartalmazzák az érett HA-k kódoló szekvenciáit.

Az A/Texas/36/91; A/Beijing/353/89, A/Beijing/32/92 és B/Panama/45/90 törzsekből való rHA géneket szubklónozzuk standard munkamenetet alkalmazva [Maniatis és munkatársai (1982)] baculovirus kifejező vektorokba. A HA géneket eltávolítjuk a TA klónozó plazmidokból a megfelelő restrikciós enzimekkel, és a tisztított HA DNS fragmentumot egy baculovirus rekombináns plazmidba iktatjuk be. Az így létrejött bakteriális kiónokat átvizsgáljuk ampicilin • · ♦ · ·« ···· · • · · · * ········ • · · ····· · ··· ·· · · ♦ * · rezisztenciára, majd elhasítjuk restrikciós enzimekkel, hogy kiszabaduljon a beiktatott HA gén, igazolva saját jelenlétét. A HA géneket tartalmazó rekombináns plazmidokat cézium-klorid - etidium-bromid grádiensen tisztítjuk [Maniatis és munkatársai (1982)]. A plazmidok 5’ végét szekvenciaelemzésnek vetjük alá, hogy meghatározzuk a korrekt baculovirus szignálok (AcNPV polihedrin promotor, ATG transzlációs start szignál és baculovirus szignál peptid szekvencia) és megfelelő HA kódolási szekvencia jelenlétét a korrekt leolvasó keretben. A DNS szekvenciákat a HA gének 5’ végénél és a szegélyező AcNPV polihedrin promotort és baculovirus szignál peptidet (az első 18 aminosav az egyes aminosavszekvenciákkal) a SZEKVENCIA LISTÁban mutatjuk be a későbbiekben.

A SEQ ID NO:6 az A/Beijing/32/92 HA génjének 5’ végi szekvenciáját kódolja (a szekvencia 1-481. tartománya). A SEQ ID NO:7 a megfelelő aminosavszekvencia [amely az “ATG” start kodonjánál (21. nukleotid) kezdődik]. A 61 k szignál peptid a SEQ ID NO:7-ben helyezkedik el mint 1-18. aminosavak.

A SEQ ID NO:8 az A/Texas/36/91 HA génjének 5' végi szekvenciáját kódolja (1-481. szekvenciatartomány). A SEQ ID NO:9 a megfelelő aminosavszekvancia [amely a SEQ ID NO:8 “ATG” start kodonjánál (21. nukleotid) kezdődik]. A 61K szignál peptid a SEQ ID NO:9-ben helyezkedik el mint 1-18 aminosavak.

A SEQ ID NO:10 a B/Panama/45/90 HA génjének 5’ végi szekvenciáját kódolja (1-434. szekvencia tartomány). A SEQ ID NO:11 a megfelelő aminosav-szekvencia [amely a SEQ ID NO:10 “ATG” start kodonjánál (21. nukleotid) kezdődik]. A 61K szignál peptid a SEQ ID NO:11-ben helyezkedik el mint 1-18. aminosavak.

A SEQ ID NO:6, NO:8 és NO:10-ben az 1-20 nukleotidok képviselik a polihedrin promotor 3’ végét, a 21-74. nukleotidok kódolják a 61K szignál peptidet, és a 75. nukleotid a végnél kódolja a HA gén 5’ végét.

4. példa: Rekombináns HA kifejezése rovarsejtekben ··;

A klónozott HA géneket tartalmazó kiméra rekombináns plazmidokat tisztítjuk és 2 ng-ot összekeverünk 1 μg AcNPV vad típusú DNS-sel. A DNSeket kalciummal együtt kicsapjuk és átfertőzzük S. frugeperda sejtekbe standard munkamenetet alkalmazva [Smith, Summers és Fraser: Mól, and Cell Bioi. 3, 2156-2165 oldal (1983)] A rekombináns baculovirusokat tarfolt morfológiájuk alapján azonosítjuk, majd tovább tisztítjuk tarfolt-tisztítás további köreivel. A tarfolt-tisztított rekombináns baculovirusokat átvizsgáljuk rHA kifejezőre, és egy egyedi baculovirus kifejező vektort választunk ki további kifejlesztéshez.

S. frugiperda sejteket fertőzünk olyan baculovirus vektorral, amely a B/Panama/45/90 influenza törzs HA génjét tartalmazza. 24, 48 és 72 órával a fertőzés után 1 x10⁶ sejtet rázatunk 25 μθΐ[³⁵8] metioninnal 15 percen át, hogy megjelöljük a szintetizálandó fehérjéket. A sejteket összegyűjtjük és a fehérjéket 11%-os poliakrilamid gélen elválasztjuk 0,1% SDS jelenlétében. A radioaktívan jelzett fehérjéket X-OMAT-AR filmen exponáljuk. A fehérje standardok elhelyezkedése és méretük kilodaltonban azt jelzi, hogy a 85kD-s rekombináns HA fehérje egyike a szintetizált fő fehérjéknek a sejtekben 48 órával és 72 órával a fertőzés után.

5. példa: A rekombináns HA termelése és tisztítása

Az A8611 baculovirus kifejező vektort, amely tartalmazza az influenza A/Beijing/353/89 génjét, és amelyet lényegében úgy alkottunk meg, amint fentebb leírtuk az A/Beijing/32/92 hemagglutininnal a polihedrin promotor szabályozása alatt, használunk S. frugiperda sejtek fertőzésre. A sejteket 27°C hőmérsékleten növesztjük 1x10⁶ sejt/ml sűrűségig TNMFH tápközegben (Gibco BRL, Gaithersburg, Margland), amelyet kiegészítettünk 10% borjúembrió szérummal, és fertőzzük ezeket 1 fertőzési sokszorozással (MOI) A 6811 rekombináns baculovírussal. A fertőzés során az A/Beijing/353/89 ·:

hemagglutinin a baculovirus polihedrin promotor transzlációs kontrollja alatt termelődik. A sejteket 72 órával a fertőzés után 15 perces, 3400xg-nél végzett centrifugálással kinyerjük, és mossuk szérummentes TNMFH tápközegben való újra szuszpendálással, amelyet centrifugálás követ 30 percen át 10.400xg-nél. A felülúszót dekantáljuk és a fertőzött sejtek üledékét -70°C hőmérsékleten tároljuk.

Eljárást fejlesztünk ki, amelyben a rekombináns HA-t szelektíven extraháljuk a fertőzött sejtekből olyan körülmények között, amelyek nem denaturálják az antigént. Hacsak másképpen nem nevezzük meg, minden extrahálási lépést 4°C hőmérsékleten végzünk. 0,5 liter tenyészetből (mintegy 5x10⁸ sejt) kinyert sejtüledéket 2 percig zúzzuk 40 ml jéghideg oldatban, amely 30 mmól/l trisz-HCI-t (pH 8,4), 25 mmól/l LiCI-t, 1% (térfogat/térfogat) Tween20-at és 1 mg/ml leupeptint tartalmaz, a zúzáshoz Polytron homogenizálót (Brinkmann Instruments Inc., Westbury, New York), használva. A homogenizátumot 30 percig centrifugáljuk 9200xg-nél. A felülúszót elöntjük, és az üledéket összegyűjtjük. Ez a lépés eltávolítja az oldható és perifériás membrán fehérjéket a rovarsejtekből a nélkül, hogy extrahálná az összeépült membrán fehérjéket, mint pl. az rHA-t. Abból a célból, hogy az rHA-t extraháljuk, az üledéket homogenizáljuk 2 percig 4. hangolásnál 40 ml jéghideg oldatban, amely 30 mmól/l triszt, 10 mmól/l etanol-amint (pH 11), 25 mmól/l LiCI-t és 2% Tween-20-at tartalmaz. 60 perces jégen végzett inkubálás után a homogenizátum pH-ját 8,4-re állítjuk be 1 n HCI segítségével, és az oldhatatlan anyagot 30 perces, 9200xg-nél végzett centrifugálással eltávolítjuk. Az oldható rHA-t tartalmazó felülúszót dekantáljuk, a pH-t ellenőrizzük, és ha szükséges, szobahőmérsékleten 8,4 értékre állítjuk. Az oldhatatlan anyagot újra szuszpendáljuk 40 ml vízben az elemzéshez. Az összeépült membrán fehérjét magas pH-η és Tween 20 detergens körülmények között szolulilizáljuk, és oldatban hagyjuk, miután a pH-t csökkentettük.

A fehérjéket SDS poliakrilamid gélelekroforézissel elemezzük. A mintát forró vízben 10 percig zúzzuk 2% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) és 5% béta··· · «····· «'··«··« • · * ·*··· · ··· Λ· ··· * · merkapto-etanol jelenlétében, majd elektroforézisnek vetjük alá 11 %-os poliakrilamid gélen 0,1% SDS jelenlétében, majd megfestjük Coomassie kékkel.

Kromatográfiás tisztítási eljárást fejlesztünk ki rekombináns HA tisztítására, amely nagy mértékben tisztított rekombináns HA antigént eredményez; ez nem denaturált és alkalmas emberi felhasználásban influenza vakcina komponenseként. Az alábbi munkamenetet alkalmazzuk A/Bejing/353/89 HA tisztítására A8611 rekombináns vírussal fertőzött S. frugiperda sejtekből.

A 0,5 I fertőzött S. frugiperda sejtből való HA tisztítására alkalmazott kromatográfiás gél mátrixok 30 ml Pharmacia DEAE Sepharose Fást Flow (Pharmacia C16/20 oszlopban) és 4 ml Pharmacia lencse lektin szefaróz [Lentit Lectin Sepharose (Pharmacia C10/10 oszlopban)]. A DEAE oszlop kimenetele össze van kötve a lencse lektin oszlop bemenetelével, és a korábbiakban leírtak szerint előállított S/N 2 sejtextraktumot felvisszük az összekapcsolt oszlopokra 1 ml/perc átfolyási sebességgel. Az oszlopokat olyan oldattal mossuk, amely 30 mmól/l trisz-HCI-t (pH 8,4), 25 mmól/l LiCI-t és 0.5% Tween-20-at tartalmaz, a mosást addig végezzük, amíg a lencse lektin elfolyója visszatér az alapvonalra. Ilyen körülmények között a szennyező fehérjék legnagyobb része a DEAE-hez kötődik, míg a rekombináns HA keresztülszalad az oszlopon. A maradék szennyező anyag keresztülmegy a lektin oszlopon és a glikozilezett rHA a lencse lektin affinitás mátrixhoz kötődik.

A DEAE oszlopot lekapcsoljuk, és a lektin oszlopot mossuk újabb 40 ml oldattal, amely 30 mmól/l trisz-HCI-t, (pH 8,4), 25 mmól/l LiCI-t és 0,5% Tween20-at tartalmaz. Ezután a lektin oszlopot mossuk 40 ml oldattal, amely 30 mmól/l trisz-HCI-t (pH 8,4), 25 mmól/l LiCI-t és 0,4% (térfogat/térfogat) nátriumdezoxikolátot (DOC) tartalmaz. Ez a lépés helyettesíti a Tween-20 detergenst egy olyan másik detergenssel, mint pl. DOC-cal, amelyet a fehérjéből el lehet rávolítani dialízissel. A rekombináns HA-t azután eluáljuk a lektin oszlopról mintegy 20-40 ml oldattal, amely 30 mmól/l trisz-HCI-t (pH 8,4), 25 mmól/l LiCI·« ·ν * · · »«** «···«· «»**«··»· • · · » ··»· · ··· ·· ··· · «V t és 0,4% (térfogat/térfogat) nátrium-dezoxikolátot, valamint 0,3 mól/l a-D-metilmannozidot tartalmaz. Az eredményeket 11 %-os PAGE-vel elemezzük.

Az influenza HA fehérjék genetikai variálhatósága miatt a fenti tisztítási eljárás részletei változhatnak minden egyes rekombináns HA fehérjénél. így pl. az rHA kötődhet a DEAE ioncserélő oszlophoz a helyett, hogy átfolyna rajta. Amennyiben ez történik, az rHA-t az oszlop mosásával lehet eltávolítani a DEAE oszlopról, a mosást olyan pufferban végezve, amely magasabb koncentrációban tartalmaz LiCI-t, NaCI-t vagy más sókat.

Abból a célból, hogy eltávolítsuk a DOC detergenst és a további puffer alkotórészeket, a lektin oszlopról lejövő eluátumot, amely a tisztított rHA-t tartalmazza, dializáljuk foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal (PBS; pH 7.5) szemben. A tisztított rekombináns HA legalább 95% tisztaságú, amint ezt SDS poiiakrilamid gélen meghatározzuk.

6. példa. Az rHA proteáz reziszetnciájának vizsgálata

Az érett HA trimer szerkezetekbe áll össze, amely rezisztens sokféle proteázra, többek közöt tripszinre is, amelyek egyébként degradálják a HA monomereket. [Murphy és Webster (1990)]. A tripszin kezelésre való rezisztenciát használhatjuk ennek megfelelően a funkcionális trimer képződés mérésére. Az alábbi munkamenetet alkalmazzuk, hogy tanulmányozhassuk az rHA ellenállását a proteáz kezelésre.

Két alikvot tisztított rHA-t (A/Beijing/353/89) 60 μg/ml koncentrációban inkubálunk jégen 30 percen át olyan oldatban, amely 30 mmól/l trisz-HCI-t (pH 8.4) és 150 mmól/l NaCI-t tartalmaz, 50 μg/ml TPCK-kezelt tripszin jelenlétében vagy anélkül. A reakciót izopropanolban levő, 57.4 mmól/l fenilmetil-szulfoníl-fluorid hozzáadásával állítjuk le úgy, hogy a hatóanyag végső koncentrációja 1 mmól/l legyen. Az egyes mintákból vett alikvotokat denaturáljuk 3% SDS-ben való forralással redukáló körülmények között, elektroforézisnek vetjük alá 11,5%-os poiiakrilamid gélen, és átvisszük <«. · * « ·» · · « · » « 9 * * » *««· «Η » • · · * · · · · • 4 · ·» * ♦* i « nitrocellulóz szűrőre standard Western foltképzési eljáráshoz. A HA polipeptideket tisztított rHA ellen készített tengeri malac anti-HA szérumot alkalmazva és kecske-anti-tengeri malac-lgG-alkálikus foszfatáz konjugátumot alkalmazva határozzuk meg.

A nem kezelt rHA a HA prekurzor (HAO) méretéhez vándorol. A proteáz kezelés két nagyobb csíkot eredményez, amelyek ahhoz a mérethez vándorolnak, amely a HA1 és HA2 influenza hemogglutininekhez várható. Az eredmények azt mutatják, hogy a tripszin egyszer hasítja el az rHA-t és két polipeptidet képez, amelyek a HA1-nek és HA2-nek felelnek meg méret szerint. További proteolitikus folyamat nem lép fel. Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy a fenti munkamenettel tisztított rHA rezisztens a proteázokkal való degradálással szemben. Ez a tulajdonság egybevág azzal, hogy a tisztított rHA trimerek formájában létezik.

7. példa Az rHA immunogenicitása a szabványosított egér hatásvizsgálattal (Mouse Potency Assay)

Az egyik megközelítés egy antigén antigenicitásának mérésére az, hogy meghatározzuk egy kimutatható antitest válasz indukálásához szükséges mennyiséget egérben (egér hatásvizsgálat, Mouse Potency Assay). 5-10 tagú egércsoportokat immunizálunk rHA szérumhigitásait tartalmazó vakcinával, a szérumhigítás: 0,500 pg; 0,1 pg; 0,02 pg és 0,0004 pg tisztított rHA. A szérumokat az immunizálás után 28 nappal összegyűjtjük, és az rHA antigén elleni antitesteket mérjük standard, enzimmel kapcsolt immunológiai szilárd fázisú vizsgálatokban (ELISA), 96 üreges mikrotitráló lemezeken. Egy egér akkor szerokonvertálódott, ha az OD450 érték a 28 napos antiszérum 1:100 hígításánál nagyobb, mint az egér immunizálás előtti szérumai OD450 értékének átlaga, beszámítva a standard eltérést három eredményből. Az egerek 50%-ának szerokonvertálásához szükséges vakcina hatékony adagja (ED50) az antigén immunogenicitásának mércéje.

* * ·» · · /> 9 •'•t 9 λ » • * ν 999· · «« ·#· t · így pl. négy csoportot, ahol minden csoport 10 egérből áll, immunizálunk egyszer 0,1 pg; 0,02 pg; 0,004 pg vagy 0,0008 pg (ötszörös hígítások) rHAO vakcinával. A szérumokat 28 nappal az immunizálás után összegyűjtjük és mérjük a vakcinában levő egyes rHAO antigének ellen szerokonverzióval ELISA vizsgálatban. A szükséges adagot, amely az egerek 50%-ának szerokonvertálásához szükséges, kiszámítjuk és egy minimális ED50 értéket állapítunk meg minden egyes rHAO antigénhez.

Az előzetes adatok azt mutatják, hogy 0.004 pg rHAO egyetlen dózisra szerokonvertálhatja az egerek legalább 50%-át.

8. példa: rHA beadása valamilyen adjuvánssal együtt, és összehasonlítás a rendelkezésre álló influenza vakcinákkal.

Az influenza A/Beijing/353/89-ből származó tisztított rHA egér hatásvizsgálatát vizsgáljuk alumíniumsókkal és ezek nélkül (üres), és összehasonlítjuk egy kereskedelmi influenza vakcinával, a FLUZONE-nal (Connaught Laboratories, Inc. Swiftwater, Pennsylvania), amely az influenza A/Beijing/353/89 törzset tartalmazza. A vakcinát 0,5 pg, 0,1 pg, 0,02 pg és 0,04 pg adagolásban adjuk be. Az egerek a 28. napon kapnak emlékeztető oltást a fentebb leírt tisztított rHA adagokkal. A 42. napon szérumot gyűjtünk és megvizsgáljuk a titerét ELISA vizsgálattal IgG anti-Ha antitestekre.

Az eredményeket a 3. ábrában mutatjuk be. Adjuváns távollétében csak a 0.5 pg-os adag indukálja a jelentős antitest titer (200.000) kialakulását. Adjuváns jelenlétében már a 0,004 pg-os rHAO adagolás is jelentősen termel antitesteket. Az rHA-val (üres) immunizált állatok mintegy azonos szinten termelik az anti-HA antitesteket, mint a kereskedelmi vakcina. Az alumíniumsók fokozzák az rHA immunogenicitását és olyan anti-HA titereket alakítanak ki, amelyek tízszer magasabbak, mint az adjuváns nélküli értékek.

Összességében a tisztított rHAO-k immunogenicitásának összehasonlítása egy teljes influenza virion vakcinával, a FLUZONE-nal azt

• · · · · demonstrálja, hogy az rHAO hasonló immunválaszt vált ki egerekben egy 42 napos időtartam során. Az rHAO adszorpciója aluminiumsókra jelentősen növeli a tisztított rHA immunogenicitását egerekben, amint ezt a 7. példában leírt vizsgálattal mérjük. Az alumíniumsókkal való kombinálás IgG hemagglutinin antitesteket alakít ki, többet, mint a Fluzone influenza vakcináknál.

9. példa Hemagglutináció gátlási tanulmányok

A hemagglutinálást gátló (HAI) antitestek a hemagglutininen levő négy ismert epitóp közül háromhoz kötődnek és blokkolják az influenzának azt a képességét, hogy agglutinálják a vörös vérsejteket [Wilson és munkatársai: Az influenza vírus hemagglutinin membrán glikoproteinjének szerkezete a 3A* felbontásnál (Structure of the hamagglutinin membráné glycoprotein of influenza vírus at 3A* resolution) Natúré, 289, 366-378 oldal (1981).] Ezek az antigén determinánsok a hemagglutinin trimereken levő sziálsav receptor kötő helyek körül csoportosulnak. Ezen helyek elleni antitestek semlegesítik a vírus fertőzőképességét [Weis és munkatársai: Az influenza vírus hemagglutininnak receptorával, a sziálsavval képzett komplexének szerkezete (Structure of the influenza hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid) Natúré, 333, 426-431 oldal (1988).] A HAI antitestek titere és fajlagossága az influenza vakcina potenciáljának fontos mérőszáma, vajon hogyan véd az influenza hasonló és rokon törzseinek fertőzése ellen.

Tanulmányokat végzünk egereken, összehasonlítva az A/Beijing/353/89ből tisztított rHAO képességét a FLUZONE (Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, Pennsylvania) képességével HAI antitestek kiváltására. 5 egérből álló csoportokat injektálunk a 0. és a 28. napon 0,5 pg, 0,1 pg, 0,02 pg vagy 0,004 pg rHAO-val, vagy háromszor ilyen mennyiségű FLUZONE hemagglutininnel úgy, hogy rekombináns vagy vírus A/Beijing/353/89 hemagglutinin azonos szintjeit adjuk be. így például a legnagyobb adagot kapó ,«······ • · · ···♦·· ·· · · · ··· · · csoportban levő egereket 1,5 pg FLUZONE hemagglutininnel (0,5 pg hemagglutinin minden egyes törzsből) és 0,5 pg rHAO-val immunizálunk. Egy további hemagglutinin antigén jelenléte a FLUZONE-ban két másik influenza törzsből keresztreaktív antitesteket eredményezhet.

Anti-hemagglutinin antitesteket (hemagglutinin IgG) mérünk standard higításos ELISA-val tisztított rHAO-val szemben. HAI antitesteket mérünk a következő antigének 4 hemagglutinin egysége ellen: teljes influenza A/Beijing/353/89 vírus (A/Bei), tisztított rHAO A/Beijing/353/89 antigén, és FLUZONE. A HAI titer az antiszérumok azon legnagyobb hígításának reciproka, amely a csirke vörösvérsejtek agglutinálódását 50%-ban gátolja.

A 3. táblázat összegzi a szérum hemagglutinin IgG és HAI titereket egerekben a 42. napon. Az anti-hemagglutinin antitestek magas szintjei termelődnek a rekombináns rHAO vakcinával. Ezek a titerek mintegy tízszer nagyobbak, mint a FLUZONE-nál. A legfontosabb az, hogy az rHAO vakcina jó titereket alakít ki olyan antitestekből, amelyek blokkolják a vörös vérsejtek agglutinálódását, amely az A/Beijing/353/89 vírussal és rHAO antigénekkel kialakulnak. így az rHAO vakcina olyan HAI antitesteket alakít ki, amelyek egyformán jól ismerik fel az immunogént és az influenza A/Beijing vírust. Az alacsonyabb HAI titerek a FLUZONE-nal szemben valószínűleg az antiszérumok azon képességének hiányából erednek, hogy blokkolják a FLUZONE vakcinákban levő hemagglutinin másik két törzse általi agglutinálódást. Ezzel ellentétben a FLUZONE-nal immunizált egerek magas HAI antitest szintet termelnek, amikor csak saját maga ellen mérjük. A HAI titerek az influenza A/Beijing/353/89 vírus és az rHAO antigén ellen jelentősen lecsökkennek. Hasonló eredmények figyelhetők meg az alacsonyabb dózisú csoportba tartozó egerekben is.

·· ····· ··· I · · · » ···· ·· · » « · · · · · · • · · · · * ·

3. táblázat HAI triterek rHAO és Fluzone ellen

		FLUZONE	009	009	300	400	o o θ’	460
			o	o	o	o	o	00
				CM	co	co	00	io
Q-		o	V
(Ü c	<	<
	X	X
c\i
o-
LLJ
z			o	o	o	o	o	00
o			T—	CM	co	co	00	m
N		ö	V	T—
		m
FL
			o	o	o	o	o	o
	o OT		o	o	o	o	o	o
	O	6.0	2.0	6.0	o 00	2.0	2.8
		X	UO	T	in	CM		co
	< X	CM	in	CM		in	co
		LU z	m	m	in	o	o	h-
					co	co	CM
		o
		N
		=)
		_l
		u.
			o	o	o	o	o	o·
			co	CO	co	CD	co	CO
		O	OT	O	OT	OT	OT	co
	<	<
	X	X
Q.
Π3
C
CM			O	O	O	O	o	o
		CM	co	CM	CO	CM	o-
			OT	M-	OT	OT	OT	θ'
'0		<D
	CO	y—		V“		*”	▼
m
O
<			o	o	o	O	o	o
			o	o	o	O	o	o
		O	o	o	o	O	o	©
		<r	eb	eb	CM	eb	eb	in
		X u.	OT	OT	OT	OT	OT	T“
	o	o	O	^7	o	o	OT
		o·	θ’	oo	xT	θ’	O
	OT
	<
	X							0
		u. -<1>						<
		OT		CM	co	xr	in
		LU						1-
								><

··

Ezek az adatok azt is sugallják, hogy genetikai különbségek vannak a FLUZONE-ban levő influenza A/Beijing/353/89 törzs és ugyanezen törzs között, amelyet azonban az FDA-tól kaptunk és a HAI vizsgálatokhoz való alkalmazás előtt egyszer tojásban passzáltunk. Az a tény, hogy az influenza A/Beijing/353/89-ből klónozott rekombináns HAO-ra adott válaszban termelődött antitestek blokkolják a vörösvérsejtek ezen influenza törzsei által, valamint saját maga által előidézett agglutinálódást, jó bizonyíték arra, hogy nem történik olyan genetikai változás a klónozási munkamenet során, amely hatna a tisztított rHAO antigénen levő sziálsav receptor kötőhelyekre.

10. példa Az 1993/94 influenza vakcina kiszerelése és klinikai hatékonysága

Egy sor humán klinikai kísérletet hajtottunk végre, hogy jellemezzük egy rekombináns HA-t tartalmazó kísérleti influenza vakcina biztonságát és immunogenicitását emberekben, és hogy előzetes adatokat kapjunk egy ilyen vakcina védő hatékonyságát illetően természetes fertőzés ellen egy járványszezon során. Az eredmények azt demonstrálják, hogy az itt leírt eljárásokkal összhangban készített rekombináns influenza hemagglutinint (rHAO) tartalmazó vakcinák meglepően kevés ártalmas helyi reakciót okoznak és egyenértékű vagy jobb védő immunválaszt adnak, ha összehasonlítjuk egy kereskedelmi forgalomban kapható engedélyezett influenza vakcinával, amelyet tojásban állítottak elő.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Vakcinák. A jelen találmányban alkalmazott rekombináns HA vakcinák tartalmazzák a teljes hosszúságú hasítatlan HA (HAO) glikoproteint az influenza A/Beijing32/92 (H3N2) vírusból. Rekombináns HAO-t (rHAO) termelünk Lepidoptera (rovar) sejtek tenyészeteiben, miután a HA gént kódoló cDNS beiktatást tartalmazó baculovirus hatásának tettük ki. A kifejezett fehérjét nem denaturáló körülmények között több, mint 95%-os tisztaságig tisztítjuk, amint ezt nátriunvdodecil-szulfát-poliakrilamid gélen, elektroforézisnek kitett antigén kvantitatív letapogató denzitometriás mérésével megállapítjuk. A peptid azonosságát aminosav-elemzéssel, N-terminális szekvenciaelemzéssel és anti influenza A/Beijing/32/92 szérumokkal végzett Western-folt elemzéssel igazoljuk. Az rHAO vakcinák a szintetikus HA antigén meghatározott mennyiségét tartalmazzák foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasó oldatban vagy alumínium-foszfát adjuvánsra adszorbeálva gélszuszpenzió formájában. Az engedélyezett háromértékű (trivalens) szubvirion vakcina, amelyet a jelen tanulmányban alkalmazunk, 15 pg/adagot tartalmaz az alábbi törzsek HA-iból: influenza A/Texas/36/91 (N1N1), A/Beijing/32/92 (H3N2) és B/Panama/45/90 vírusok (FLUZONE gyengített influenza vakcina, amelyet tojásokban állítottak elő; a Connaught Laboratories, Swiftwater, Pennsylvania terméke).

Klinikai tanulmányok. Azonos tanulmányi munkamenetet alkalmazunk a Saint Louis Egyetem és a Rochester Egyetem Intézményi Felülvizsgáló Testületéinél (Institutional Review Board). 18 és 45 közötti egészséges felnőtteket szerződtetünk mindkét intézménynél. Az alanyokat véletlenszerűen jelöljük ki, hogyan kapják meg az alábbi öt vakcina készítmény egyikét kettős vak összeállításban: (1)15 pg rHAO, (2) 15 pg rHAO plusz alumíniumsó, (3) 90 pg rHAO, (4) engedélyezett inaktivált influenza vakcina, vagy (5) fiziológiás konyhasóoldat placebo. A vakcinákat intramuszkuláris injekció formájában adjuk be 0.5 ml térfogatban. Abból a célból, hogy a három rHAO-t tartalmazó vakcina készítmény biztonságának kezdeti becslését elvégezhessük, az első 25 vakcinálandó alanyt véletlenszerűen (vagyis 5 személy tanulmányi csoportonként) kiválasztjuk a további tárgyaktól függetlenül, és szoros megfigyelésnek vetjük alá telefonkapcsolat segítségével 48 órán át a vakcinálás után, mielőtt előrehaladnánk a további vakcinálással. Minden alanynak útmutatást adunk, hogyan töltsenek ki egy napi beszámoló lapot a káros reakciókról, mind a helyi, mind a szervi tünetekről, a vakcinálás utáni első hat napon. A tüneteket természetük szerint osztályozzuk enyhe, mérsékelt vagy súlyos kategóriákba. Méretjük a szájüreg hőmérsékletét, és a résztvevőkkel azt is rögzíttetjük, ha lázasnak érzik magukat. Ha van lokális duzzanat vagy vérömleny az injekció helyén, ezt minősítjük a szerint, hogy területének átmérője kisebb vagy nagyobb, mint egy negyeddolláros pénzdarab. (Minden vakcinálást november utolsó hetében és december első hetében végeztünk 1993-ban). Szérummintákat veszünk a vakcinálás időpontjában, 3 héttel a vakcinálás után, és még egyszer néhány hónap múlva, amikor az influenza vírusok tovább már nem keringenek a helyi közösségben (ez a mi esetünkben 1994 március végén és áprilisban történt.) Az egyes intézményeknél önkénteseket oktatunk ki, hogy lépjenek kapcsolatba a tanulmány központjával, ha influenza-szerű betegséget tapasztalnak a téli influenza járvány idényben. Egy influenza-szerű betegséget úgy határozunk meg, mint két- vagy több napon át tartó légzőszervi tünetek jelenlétét, amelyek lázzal és/vagy megfázásos és izomfájásos tünetekkel járnak. Azok az alanyok, akik influenza-szerű tünetekről számolnak be, orr- és garat tamponokat kapnak, hogy abból vírus tenyésztést és azonosítást végezhessünk. A klinikai mintákat kódolt azonosító számokkal látjuk el és vak minősítéssel dolgozzuk fel.

Szerológia. A szerológiai vizsgálat minden típusához a két intézmény összes mintáit egy tételben, egyetlen laboratóriumban vizsgáljuk. Az influenza A/Beijing/32/93 (H3N2) vírus antigén elleni hemagglutinációt gátló (HAI) antitesteket a szérumban standard mikrotitráló vizsgálatban mérjük, miután a receptor elroncsoló enzimmel a nem fajlagos inhibitort eltávolítottuk, és eltávolítottuk a hideg agglutinineket is 4°C hőmérsékleten végzett hemadszorpcióval. A titert úgy határozzuk meg, mint azt a legnagyobb szérumhígitást, amely teljesen kizárja a vírus 4 antigén-egysége által kiváltható hemagglutinációt, a kiindulási hígításhoz 1:4 arányt alkalmazva. A szérum HAfajlagos immunglobulin G (IgG) antitesteket enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) mérjük, bevonó antigénként influenza A/Beijing/32/92 (H3N2) törzsből származó tisztított rHAO-t alkalmazva. A reagensek sorrendje a szilárd fázistól kifelé az alábbi: (1) tisztított rHAO • · · ·

antigén, (2) szérumminta, (3) alkálikus foszfatáz-konjugálva kecske antihuman lgG-vel,és (4) dinátrium-p-nitro-fenil-foszfát szubsztrátum. Az ELISA titert úgy fejezzük ki, mint azt a legnagyobb hígítást, amelynél az antigént tartalmazó üreg optikai-sűrűsége legalább kétszer annyi, mint a megfelelő antigén kontoll üreg optikai sűrűsége. A semlegesítő antitesteket a mikrosemlegesítő vizsgálat alkalmazásával mérjük, amelyet Treanor J.J. és Betts R.T. írtak le [J. Infect. Dis. 168, 455-459 oldal (1993)]. Röviden ismertetve: hővel inaktivált szérumok sorozathígitásait összekeverjük mintegy 100 TCID50 influenza A/Beijing/32/92 (H3N2) vírussal, és 37°C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk. A víus-szérum keveréket azután Madin-Darby macskavese sejtek (MDCK) egybefüggő egyrétegére (monolayer) adszorbeáljuk egy 96 üreges lemezen 1 órán át szobahőmérsékleten. A lemezeket mossuk, hogy eltávolítsuk a maradék inokulumot, újra tápláljuk szérummentes Dulbecco-féle MÉM tápközeggel, amely 2 pg/ml tripszint is tartalmaz, és inkubáljuk 5% CO2 jelenlétében 33°C hőmérsékleten 72 órán át. A sejteket ezután metanollal rögzítjük, és a vírus replikációt felbecsüljük a mátrixra és az influenza A vírus nukleoproteinjeire fajlagos rágcsáló monoklonális antitesteket (Centres fór Disease Control, Atlanta, Georgia) alkalmazva, ezt követi az alkálikus foszfatáz-konjugálva anti-egér-lgG-vel. A szérumok végpont-titrálását úgy határozzuk meg, mint azt a legnagyobb hígítást, amely a jelben nagyobb, mint 50% csökkenést eredményez, összehasonlítva a nem semelegesített kontroll üregekkel.

Virológia. Az orr-garati tampon-minták vírustenyésztését minden intézménynél standard technikákkal hajtjuk végre. A mintákat MDCK-ban vagy Rhesus majom vesesejtekbe inokuláljuk és 33°C hőmérsékleten 14 napon át inkubáljuk. A sejt egyrétegek hemadszorpcióját 0.4% tengeri malac eritrocitával vizsgáljuk. Az influenza vírusokat hemadszorpció-pozitív tenyészetként azonosítjuk HAI-val, H3-fajlagos antiszérumokat (Centers fór Disease Control) alkalmazva.

ti·» • ·* ··· · · ··♦··· ·······« • · · · ···· ♦ ··· ·· ··· * * 50

Statisztikai elemzés. A reciprok HAI-t, az ELISA IgG-t és a semlegesítő antitest titert logaritmikusán transzformáljuk statisztikai elemzéshez. A vakcinálásra való szignifikáns választ úgy határozzuk meg, mint egy négyszeres vagy nagyobb növekedést az antitest titerben a vakcinálás előtti és a vakcinálás után 3 héttel nyert szérumminták között. Az influenza A (H3N2) vírus-fertőzés laboratóriumi bizonyítékát úgy határozzuk meg, mint egy vírus izolálását az orr-garati váladékból és/vagy négyszeres vagy nagyobb növekedést a szérum HAI antitest titerben a vakcinálás utáni 3. heti (idény előtti), decemberben begyűjtött minták és a megfelelő szezon utáni minták között, amelyeket a következő ősszel gyűjtünk. A vakcina csoportok közötti különbségeket Fisher-féle exakt teszt alkalmazásával elemezzük, összehasonlítva a káros reakciókat, szignifikáns antitest válaszokat vagy laboratóriumban igazolt influenza betegséget vagy fertőzést mutató alanyok hányadosát, és variancia analízissel (ANOVA) elemezzük összehasonlítva a vakcinálás utáni reciprok Iog2 antitest titerek átlagait. A módosított Bonferroniféle egyenlőtlenséget és a Tukey-Kramer tesztet alkalmazzuk, ahol ezek alkalmasak, hogy kiszámolhassuk a lehetséges többszörös összehasonlításokat.

EREDMÉNYEK

Reagálási képesség. A jelen tanulmányban alkalmazott rHAO vakcinák biztonságosak és jól tolerálhatok. A káros reakciók gyakoriságát az rHAO antigén adagjának változása 15 pg és 90 pg között nem befolyásolja, de ez enyhén növekszik alumíniumsó hozzáadására. A lokalizált véraláfutás, fájdalom és nyomásérzékenység az injekció helyén a beszámolók szerint jelentősen gyakoribb az engedélyezett szubvirion vakcina befogadóinál, mint a fiziológiás konyhasóoldatban levő 15 pg vagy 90 pg rHAO befogadóinál. Egyetlen egyén kivételével, aki viszonylag erős fájdalmat, nyomásérzékenységet és feszességet tapasztalt a karjában az engedélyezett vakcinával végzett immunizálást követően, az összes tünetet természete szerint enyhének lehet minősíteni, és ezek időtartama csupán 1-2 nap. A

*·· « • ·«» » lokalizált véraláfutás és/vagy megkeményedés, ha van egyáltalán, mindig kisebb mérete szerint, mint egy negyeddolláros érme.

Immunogenicitás. Az influenza A/Beijing/32/92 (H3N2) vírusra keletkező szérum (HA) antitest alapvonal-titerek kisebbek, vagy egyenlők mint 1:8 a szegödtetett 127 alanyból 64-nél (50%). A legtöbb alany a négy vakcinacsoport mindegyikében HA-fajlagos szerológiai válaszokkal bír HAI-val és ELISA-val (4. táblázat). A szérum HAI antitest vakcinálás utáni titerei nagyobbak, vagy egyenlőek mint 1:32 minden vakcina befogadónál két személy kivételével, akik 15 pg rHAO-t kaptak és egy személy kivételével, aki engedélyezett vakcinát kapott. A vakcinálás hasonlóképpen társul semlegesítő antitestek kialakulásával is az önkétesek többségénél. Az átlagos növekedés az antitest titerekben és a szerokonverziós hányadosokban olyan irányt mutat, hogy enyhén kisebb a 15 pg rHAO-val végzett immunizálás után, mint az engedélyezett vakcinával végzett immunizálás után, bár ezek a különbségek statisztikailag nem szignifikánsak. Az rHAO-ra adott antitest válasz nem fokozódik alumíniumsók hozzáadására. A 90 pg rHAO-val immunizált alanyok vakcinálás után olyan átlagos HAI és ELISA IgG antitest titereket érnek el, amelyet 2-5-ször nagyobbak, mint a másik három vakcinálási csoport bármelyikében (a különbséget statisztikailag szignifikánsak, amikor a szérum HAI titereket hasonlítjuk össze).

Védő hatékonyság. A felügyeleti időtartam során 26 alany összesen 28 influenza-szerű betegségről számolt be. Ezen egyének közül négynek (közülük három placebot kapott és egy 15 pg rHAO-t) influenza A vírusa volt, amely az orr-garat üregi tenyészetekből volt izolálható. Jelentős növekedés volt az influenza A/Beijing/32/92 (H3N2) HAI antitest titerekben a szezon előtti és szezon utánni szérum minták között a négy, tenyésztéssel igazolt eset közül háromban, de nem volt több olyan egyén, aki betegségről számolt volna be. Az egyedüli rHAO befogadó, akinél később laboratóriumilag is igazolt influenza betegség alakult ki, pozitív tenyészetet produkált 31 nappal az immunizálás után, és szerokonvenciója a vakcinálás előtt kevesebb, mint 1:4 értékről • w»< * ··* · vakcinálás után (szezon előtt), 1:32 titerre változott. Két további placebo befogadó és egy önkéntes, aki engedélyezett vakcinával volt immunizálva, az influenza A (H3N2) fertőzésnek szerológiai bizonyítékát adta a járványidényben, bár klinikai betegség nélkül, összehasonlítva az összes vakcináit alannyal (vagy az összes alannyal, aki bármiféle rHAO vakcinát kapott), mint egy csoportot, a placebot befogadottak jelentősen nagyobb hányadban szenvedtek laboratóriumilag igazolt influenza A (H3N2) betegségben (p<0,05) vagy fertőződtek meg (p<0,005).

A fenti ténymegállapítások azt jelzik, hogy a tisztított rHAO antigént tartalmazó, a jelen szabadalmi bejelentésben leírtak szerint előállított influenza vakcinák jól tolerálhatok és képesek védő immunválaszok kiváltására emberi alanyokban. Az rHAO még 90 pg-os adagban sem mutat a jelen tanulmány értékelése szerint több reagálási képességet, mint a placeboként használt fiziológiás konyhasóoldat, és jelentősen kevesebb káros helyi reakciót okoz, mint az engedélyezett trivalens szubvirion vakcina, amelyik pedig csak fele mennyiségű (azaz 45 pg) teljes HA antigént tartalmaz.

A semlegesítés, a HA-fajlagos antitest válaszok a 15 pg rHAO tartalmú készítményekre ahhoz hasonlók, amelyeket a szubvirion vakcina kivált, és jelentősen javulnak ezek az értékek, amikor az rHAO adagját 90 pg-ra növeljük.

Az influenza A (H3N2) vírus terjedő járványos törzsének természetes módon való fertőzéséből származó fertőzés és betegség általános aránya jelentősen kisebb a vakcináit alanyok között, mint a placebot befogadottak között. Az adatok azt sugallják, hogy az rHAO által átadott védő immunitás, különösen ha nagy adagban alkalmazzuk, hasonló vagy jobb, mint amelyet a jelenleg rendelkezésre álló vakcinák indukálnak.

. táblázat Szérum antitest válaszok fiatal felnőtt alanyokban influenza A/Beijing/32/92 (H3N2) törzsből való tisztított rekombináns hemogglutinint (rHAO) tartalmazó vakcinával, 15 gg, A/Beijing/32/92 (H3N2) törzsből való HA-t tartalmazó engedélyezett trivalens szubviriont tartalmazó vakcinával, vagy fiziológiás konyhasóoldat placeboval.

CO

Φ

C (D ω Φ 0) £ σ>~ j) -o

E ω <D Φ

W j?

E ω

(Z) o

ΙΛ

Φ

Al

O c

ιΓ)

ŰO

Γcű σ

ro c

•ra φ

a o

Φ (Λ

Φ w Ό ®

ΛΙ £

O c

ο

-Η

Ο ο

-Η

Γ~ kk un

CM

Ο +ι

C0 ο

+ι

U0

Γο +Ι

CM

Ok ο

C0

ο.

ο +ι

Γο

-Η σι σ

ο +Ι ’Τ

Ok u~>

Ξ c •φ >03 Ν « Ο u.

Έ .2•03 Ο •ε: φ

Ο ιη <

X ο >- ν Ο) °=t + Ο · η kk ο

+ι co ιΓ) ο

+| η

k, ιΓ)

W •03 ΐ₊₁ > CM < ⁰⁵ ο

ο

V

ο.

* CD φ

CM σ

ez) φ

c <D

O σ>

<

ω

UJ (Λ

Φ

C ro <

x

	n				ΓΩ
				0.	o.
	0	O	0	O	0
	+1	+1	+1	+1	+1
CD	0	un	t-4	0	rH
C	%	*	<0	«Ο
2S	CM	r-l	co	CM	σ
3	rH	r—1		rH
	CO			^r	n
	%	Ok	Ok
	0	0	0	O	0
	+1	+1	+1	+1	+1
φ	r-		m	r-H	rH
£3	»»	0»
5O Φ	00		00	CO	σ
	CM	0	0	kO	00
CN	σ	0	0		m
CQ		r-1	r—1

(Π •π σι £ ω = ν Ε >

ω Η c ω .9, ^c jy =s *· E >.

ε -S⁵

Ο Φ

8-S

Q. 203 O Jé £

ΛΙ ω

$

ΛΙ £ ο

c ιΓ)

ΟΟ

		LO	+		co	+ m	4»! Ln
		k.	k.		-	k.	Ok
		0	O		0	0	0
		+1	+1		+1	+1	+1
		0	kO		t—1	co	00
	CD		k.		-
	C ‘CD		00		i-M t-H	cn	co
	3
		CO	m		*^3*	’ςρ	uo
		0.	Ok		Ok	Ok	Ok
u.		O	0		0	0	0
Φ		+1	+1		+1	+1	+1
s	Φ	r-	co		co		r-
—		kk	kk		0.	Ok	Ok
<	Ο	co			co	m	co
X	Φ
						e
				‘O		φ
		O)	O)	(Z)	O)	N
		3.	3.	c	3.	_· o> c
m		un	<0 in	c	co 0	co 0	<P Γϊ

ο c cd _ ο (£5, £ 9 ω σ'Ε < •S5 ωΐ <ΝτΟ Ν <

X c Ν c <η Ε 3 3 Ű. φ ± 'σ 3 φ .5 g¹ 3 in ^Ν

LLI (/>

JÉ

Φ

C

Φ k_

Φ >

•φ ’JE·

N (fi

Φ to Φ c □ < Q X « ._ -Π3 c '03 -p *-> L_ □ o (fi (fi 03 •03 j= •03 9 C N

2“ ^{> :}O tí *o Q.

O (fi ü

N (fi n

XJ :o φ με ^w E®

N C iQ 03 C « ° N <<

UJ ·£ cí í «=

2 O) 3 CD <2

E

ÍN «I « S N •co ™ σ>_ •o£ Ο ·φ •03 X l|

J= φ 0) _c

2» < -2 X S

Φ '53 <u φ (Λ c ^OT t -Φ N

E φ φ c :3 N 03 CO c Φ 77 «4-· CJ •03 >

C ^:O ο N (fi ^:O 03

CD (fi 25 :O 03 2 ~ O n 52 (fi 03 03

Lω o . CL •ro ° ,_· ο ^υ o Ό 03 O 55 .9 O >· O V ^C JÉ Oj '03 03 r S=. > %

11. példa Eljárás javított HAO klónozó vektor elkészítésére

Az érett HA kifejezéshez olyan javított klónozó vektort tervezünk, amelyben a HA-t kódoló gén közvetlenül lefelé (downstream) helyezkedik el a kitináz szignál pepiidet kódoló szekvenciától.

Megalkotjuk a pMGS27-et egy szálú farkakkal,

A HA-t a pMGS27 plazmidba klónozzuk az Smal vagy Kpnl helyekre közvetlenül a kitináz szignál peptidtől lefelé. A nukleinsav és aminosav szekvenciákat a SEQ ID NO:22 illetve SEQ ID NO:23 mutatja be:

5'-kitináz szignál peptid Smal Kpnl

TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG ATT CCC GGG GGT ACC

TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA ILE PRO GLY GLY THR

Ezt a területet változtatjuk meg oligo-irányított mutagenezissel, így alkotjuk meg a pMGS27-et (a megváltozott bázisokat aláhúztuk) (SEQ ID NO: 24):

'TGG TTA GTC GCC GTG TCCTGCAGGCCAGAGAGGCCTT GGT ACC

Pstl

A pMGS27-et Pstl-gyel végzett hasítással linearizáljuk, (a SEQ ID NO:24 6-35 közti gyökeit mutatjuk be):

A GTC GCC GTG TCC TGCA 5' GGCCAGAGAGGCC T

T CAG CGG CAC AGG 5' ACGTCCGGTCTCTCCGG A majd a lineáris pMGS27-et T4 DNS polimerázzal kezeljük dATP jelenlétében, így alkotjuk meg az egyszálú farkakat, amint az alábbiakban bemutatjuk (a SEQ ID NO:24 23-36 gyökeit és a 6-18 gyökeinek komplementereit láthatjuk):

A 5' GGCCAGAGAGGCC T

T CAG CGG CAC AGG 5 • · · · • · * ····· · ··· ·· ··· · ·

A cél HA gént pMGS27-be klónozzuk

1. lépés PCR primereket szintetizálunk.

Első (forward) oligo (SEQ ID NO:25):

5’ GTC GCC GTG TCC AAC GCG (az érett HA 5' végének 20 bázisa)

Reverz oligo (a SEQ ID NO: 26 komplementere):

ATT AA CCGGTCTCTCCGG 5' (az érett HA 3' végének 20 bázisa)

A HA gén PCR-je

A cél HA gént a két oligoval használjuk, hogy megkapjuk a SEQ ID NO:25-öt és SEQ ID NO:26-ot.

5' GTC GCC GTG TCC AAC GCG (érett HA)

CAG CGG CAC AGG TTG CGC (érett HA)

TAA TTGGCCAGAGAGGCC 3'

ATT AACCGGTCTCTCCGG

A cél HA gén beforrasztása pMGS27-be, és E. coli transzformálása

A lineáris pMGS27-et és a HA gén T4 DNS polimerázzal kezelt PCR fragmentumát összekeverjük. A két molekula összeforrad egymással és egy köralakú plazmidot képez, amely alkalmas az E. coli transzformálására, amelyet el is végzünk. Az alábbi ábra bemutatja mindezeket a SEQ ID NO:25 és NO:26 szekvenciák, valamint a SEQ ID NO:24 23-26 és 6-18 gyökeinek felhasználásával:

GTCGCCGTGTCCAACGCG (érett HA) TAATT

TTGCGC (érett HA) ATTAACCGGTCTCTCCGG +

A GGCCAGAGAGGCCT

TCAGCGGCACAGG az alábbiakhoz: kitináz szignál peptid stop • · « • ·· ····· ₄ ······ • · · · · · · • · · ·· ···

GTCGCCGTGTCCAACGCG (érett HA) TAATTGGCCAGAGAGGCCT

Amint a fentiekből látható, nincs többlet aminosav a szignál peptid és az érett HA között.

12. példa Egy trivalens, A és B típusú, 1995-1996 évi influenza vírus vakcina elkészítése és hatékonysága

Az influenza vírus vakcina, tisztított rekombináns hemagglutinin, trivalens, A és B típusú (A/Texas/36/92\1 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2) és B/Harbin/7/94) nem fertőző alapegység, amely tisztított, rekombináns influenza hemagglutinin antigénekből (HA) származik. A HA géneket az influenza A és B vírusok Központi Betegségellenőrző, Élelmiszer és Gyógyszerigazgatóság (Center fór Disease Control/Food and Drug Administration) által ajánlott, fentebb leírt törzseiből klónozzuk, és az egyes klónozott gének azonosságát DNS szekvenciaelemzéssel határozzuk meg. Az A/Texas/36/91 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2), B/Harbin/7/94 influenza vírus törzsekből klónozott HA géneket tartalmazó baculovirus kifejező vektorokat alkalmazzuk, hogy a rekombináns HA antigéneket előállítsuk tenyésztett rovarsejtekben. A rekombináns HA fehérjék teljes hosszúságú, hasítatlan hemagglutininok (rHAO) mintegy 69.000 molekulatömeggel. Az rHAO-t Spodoptera frugiperda (Lepidoptera) sejtvonalon állítjuk elő, amelyet szérummentes tenyésztő tápközegen tartunk fenn. A trivalens vakcinákat tisztított (95%-nál, de inkább 99%-nál nagyobb tisztaságú) rHAO-kból állítjuk össze, két influenza A törzsből és egy influenza B törzsből, ezeket egymással egyenlő arányban állítjuk össze. A vakcinákat a klinikai felhasználáshoz tisztított A típusú és B típusú rHAO fehérjeként adjuk át foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldatban tartósítószer hozzáadása nélkül.

A monovalens, bivalens és trivalens rHAO vakcinákkal végzett állatkísérletek azt demonstrálják, hogy ezek mentesek a komolyabb toxicitástól. A vakcinákban nincs kimutatható toxikus vagy idegen szer. Az

A/Beijing/32/92 és A/Texas/36/91 rHAO-val végzett általános biztonsági és ·«··· ··· «····· • · ···· ·· • · ····· · ··· ·· ··· · · immunogenicitási tanulmányokat egerekben és tengeri malacokban végezzük. Káros reakció nem jegyezhető fel. Egerekben egyetlen immunizálás 15 pg rHAO antigénnel, adjuváns nélkül két-három héten át magas szinten indukálja az anti-HA IgG antitestek, hemagglutinin gátló (HAI) antitestek és semlegesítő antitestek kialakulását.

Az egyik tanulmányban 10 egérből álló csoportokat immunizálunk 15 mikrogramm tisztított rHAO-kkal, amelyek A/Beijing/32/92 (H3N2) törzsből származnak. Az egyik rHAO 10% borjúembrió szérumot tartalmazó tápközegben adaptált sejtekben készült, egy másik rHAO olyan rovarsejtekben készült, amelyek 10% borjúembrió szérumot tartalmazó tápközeghez voltak adaptálva, egy harmadik rHAO olyan rovarsejtekben készült, amelyek szérummentes tápközeghez voltak adaptálva (rHAO-SF). Két és három héttel az injektálás után az egereket elvéreztetjük és szérummintákat készítünk. Minden szérumot megmérünk anti-HA IgG-re és HAI antitestekre. Mint az rHAO, mind az rHAO-SF antigének az anti-HA és HA antitestek hasonló titereit váltják ki. Az egyetlen immunizálást követő két hét után az egerek legtöbbjének jelentős HAI antitest titere volt, és a harmadik hét után az egyes csoportokban 10 egérből 8-nak a titere 32 vagy nagyobb volt. Ezek és más biokémiai és immunológiai tanulmányok azt demonstrálják, hogy a szérummentes rovarsejt-tenyészetben termelt rHAO megkülönböztethetelen a szérumot tartalmazó fermentációs körülmények között gyártott rHAO-tól.

Tanulmányt végeztünk a célból, hogy összehasonlítsuk a trivalens rHAO influenza vakcina 1994-95 évi kiszerelését egy engedélyezett tisztított vírus felületi antigén vakcinával, a Fluvirinnel (gyengített influenza vírus vakcina, amelyet tojásban való tenyésztéssel állítanak elő). Mindegyik vakcina 15 mikrogramm rHAO-t vagy vírus HA-t tartalmaz 0,5 ml-enként az A/Texas/36/91 (H1N1), A/Shangdong/9/93 (H3N2) és B/Panama/45/90 influenza törzsekből. Mind a három rekombináns rHAO, mind a Fluvirin vakcinák foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldatot tartalmaznak. Az injekciók után nulla, két és három héttel 10 egérből álló csoportokat kivéreztetünk és szérumot állítunk elő. A • ·

szérummintákat mérjük anti-HA IgG antitestekre, a tojáson nőtt influenza vírus elleni gátló antitestekre és semlegesítő antitestekre tojáson nőtt influenza vírusok ellen mindegyik vírustörzs esetében.

Amint a 4a., 4b. és 4c ábrákon bemutatjuk, mind a rekombináns rHAO, mind az engedélyezett influenza vakcinák magas szinten indukálnak antitesteket hamagglutinin ellen a vakcinában levő három influenza törzs mindegyikénél. Négytől közel tízig terjed a szorzószám, ahányszor nagyobb antitest titereket indukál az rHAO vakcina, ha az engedélyezett vakcinához viszonyítjuk. Olyan antitestek is termelődnek, amelyek gátolják a csirke vörösvérsejtek hemagglutininját, mind az influenza A, mind az influenza B törzsbeli vírusokból, amint ez az 5. táblázatból látható. A HAI titerek egyenértékűek vagy magasabbak a három influenza vírus törzs ellen azokban az egerekben, amelyek a trivalens rHAO vakcinát kapták, ha összehasonlítjuk az engedélyezett vakcinával. A vakcinák magas szinten indukálnak semlegesítő antitesteket is a speciális A és B influenza törzsek ellen, amint ezt egy standard mikrotitráló semlegesítési vizsgálattal mérjük. A geometrikus semlegesítő antitest titerek mintegy kétszer magasabbak az rHAO-val immunizált egerekben, mint az engedélyezett tisztított vírus felületi antigén vakcinával, a Fluvirinnal immunizált egerekben. Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy az rHAO vakcina trivalens kiszerelése olyan vakcinának tekinthető, amely funkcionális HAI és semlegesítő szérum antitesteket indukál a vakcinában levő minhárom influenza törzs ellen.

• · ·

5. táblázat A trivalens rHAO vakcina összehasonlítása Fluvirinnal

Trivalens rHAO Fluvirin

GMT (n=10 egér) Influenza vakcina GMT (n=10 egér)

Antigénként anti-HA IgG anti-HA IgG használt

vírustörzs	0. hét	3. hét	0. hét	3. hét
A/Texas/36/91 (H1N1)	<1000	103.000	<1000	11.200
A/Shangdong/32/92 (H3N2)	<1000	162.400	<1000	41.000
B/Panama/45/90 Antiqénként használt vírustörzs	<1000	164.800 HAI	<1000 HAI	26.000
A/Texas/36/91 (H1N1)	<8	1.522	<8	1.088
A/Shangdong/32/92 (H3N2)	<8	494	<8	435
B/Panama/45/90	<8	174	<8	42
Antiqénként használt vírustörzs	Semleqesítő Ab	Semleqesítő Ab
A/Texas/36/91 (H1N1)	<100	5.800	<100	2.720
A/Shangdong/32/92 (H3N2)	<100	840	<100	360
B/Panama/45/90	<100	1.300	<100	700
Az itt leírt eljárásokban és	kompozíciókban	számos módosítás	és
változat lehetséges,	amikor rekombináns influenza	vakcinát készítünk	és
alkalmazunk; ezek	nyilvánvalóak	azok számára,	akik a szakterületen

járatosak. Az ilyen módosításokat és változatokat úgy tekintjük, hogy belül vannak a mellékelt igénypontok oltalmi körén.

Claims (26)

100

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1., Rekombináns influenza HAO hemagglutinin fehérje, amely baculovirus kifejező rendszerben van kifejezve tenyésztett rovarsejtekben.

2., Az 1. igénypont szerinti fehérje, amely egy baculovirus szignál peptidet tartalmaz közvetlenül összekötve a HAO fehérjével, köztes aminosavak nélkül.

3., Az 1. igénypont szerinti fehérje, amely vakcinaként való beadásához egy gyógyászatilag elfogadható hordozót is tartalmaz.

4., Az 1. igénypont szerinti fehérje, amely vakcinaként való beadásához egy adjuvánst és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót is tartalmaz.

5., A 3. igénypont szerinti fehérje, amelyben a gyógyászatilag elfogadható hordozó valamely polimer szolgáltató rendszer.

6., Az 1. igénypont szerinti fehérje, amelynél az influenza típusa az influenza A és influenza B törzsek által alkotott csoportba tartozik.

7., A 6. igénypont szerinti fehérje, amelynél az influenza embereket fertőző típusú.

8., Az 1. igénypont szerinti fehérje, amelyben egy második fehérje is található a hemagglutininhez fuzionálva.

9., A 8. igénypont szerinti fehérje azzal jellemezve, hogy a nevezett második fehérje a hepatitisz B vírusfehérjék, HÍV fehérjék, karcinoembrionális antigének és neuraminidáz által alkotott csoportból kerül ki.

10., Vektor rekombináns influenza HAO hemagglutinin fehérje előállításához, amely 5'->3' irányban az alábbi szekvenciákat tartalmazza: egy transzlációs start kodon; egy szignál peptid; valamely influenza törzs érett hemagglutininjét kódoló szekvencia; egy transzlációs terminációs kodon; és egy polihedrin RNS poliadenilező szignál.

11., A 10. igénypont szerinti vektor, amelyben a szignál peptid valamely baculovirus fehérje mintegy 61K molekulatömeggel és aminosavszekvenciája a szekvenoialistában levő SEQ ID NO;7 első 18 aminosavjának felel meg. * »»«· · * * · · • · · * · „ .

_ · ····· .

• · · · 4 , ,

101

12., Α 10. igénypont szerinti vektor, amelyben a szignál peptid valamely influenza hemagglutinin fehérje promotor.

13., A 10. igénypont szerinti vektor, amelyben a szignál peptid és a hemagglutinint kódoló szekvencia nem kódol semmiféle köztes aminosavat.

14., A 10. igénypont szerinti vektor, amelyben egy második fehérjét kódoló szekvencia is van, amely fehérje a hemagglutininnel fúziós fehérjeként fejeződik ki.

15., A 10. igénpont szerinti vektor tenyésztett rovarsejtekbe fertőzve át.

16., Eljárás rekombináns influenza hemagglutinin fehérje előállítására azzal jellemezve, hogy tenyésztett rovarsejteket fertőzünk olyan vektorral, amely 5’->3' irányban az alábbi szekvenciákat tartalmazza: egy polihedrin promotor valamely baculovirusból, egy ATG transzlációs start kodon, egy szignál peptid, az influenza A és influenza B törzsek által alkotott csoportból kiválasztott influenza törzsből való hemagglutinint kódoló szekvencia, egy transzlációs terminációs kodon, és egy polihedrin RNS poliadenilező szignál, majd a sejteket valamely tápközegben tenyésztjük.

17., A 16. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a sejtből a HAO influenza hemagglutinin fehérjét legalább 95% tisztaságig izoláljuk.

18., A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fehérjét olyan módon izoláljuk, hogy a hemagglutinint a nem-membrán fehérjékből alkálikus pH-η elválasztjuk, a membránhoz kötött fehérjét mossuk, hogy a hemagglutinint eluáljuk, a hemagglutinint az egyéb fehérjékből elválasztjuk anioncserélő gyantákhoz kötve a pH változtatásával, és a hemagglutinint a további egyéb fehérjékből elválasztjuk kationcserélő gyantákhoz kötve a sókoncentráció változtatásával.

19., Eljárás vektor előállítására, amely 5'->3' irányban az alábbi szekvenciákat tartalmazza: egy polihedrin promotor valamely baculovirusból, egy ATG transzlációs start kodon, egy szignál peptid, az influenza A törzsek és az influenza B törzsek által alkotott csoport valamely kiválasztott törzséből való hemagglutinint kódoló szekvencia, egy transzlációs terminációs kodon, és egy polihedrin RNS poliadenilező szignál, azzal jellemezve, hogy

102

- a sejt tápközegéből a vírust kinyerjük és izoláljuk az influenza A törzsek esetében a vírus RNS-t és az influenza B törzsek esetében a vírus mRNS-t;

- cDNS-t szintetizálunk az influenza A törzsek esetében egy univerzális prímért [5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO:1)] és az influenza B törzsek esetében random primereket alkalmazva, ahol az 5' és 3' primerek végeiken olyan enzimhelyeket tartalmaznak, amelyek a hemagglutinin géneken belül nem találhatók;

- az influenza A vagy B primereket és a hemagglutinin gén szegmensekkel kevert influenza cDNS-t összeforrasztjuk, hogy a teljes érett hemagglutinin kódoló szekvenciát tartalmazó kettős szálú DNS fragmentumokat megalkossuk;

- azonosítjuk a szignál peptidet a hemagglutinin génekből, majd a szignál peptid nélküli hemagglutinin géneket összeforrasztjuk; és

- a szignál peptid nélküli hemagglutinin géneket olyan vektorba klónozzuk, amely tartalmazza az AcNPV polihedrin promotort.

20., A 19. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a hemagglutinin gént PCR alkalmazásával úgy klónozzuk a vektorba, hogy a vektor a szignál pepiidet közvetlenül a hemagglutininhez kapcsolva kódolja köztes aminosavak nélkül.

21., A 19. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vektort rovarsejtekbe fertőzzük át, és a sejteket kiválasztjuk a hemagglutinin kifejezésére.

22., Eljárás állatok vakcinálására influenza ellen azzal jellemezve, hogy egy állatnak olyan rekombináns influenza HAO hemagglutinin fehérje hatékony mennyiségét adjuk be, amely valamely baculovirus kifejező rendszerben fejeződött ki tenyésztett rovarsejtekben.

23., A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fehérjét valamely polimer szolgáltató rendszerben adjuk be.

24., A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az influenza valamely, az influenza A és influenza B törzsek által alkotott csoportba tartozó influenza.

103 *· ·->»«

25., A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a szóban forgó állat valamely, az emlősök és madarak által alkotott csoportba tartozó állat.

26., A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a szóban forgó állat valamely ember.

A meghatalmazott δ n

1/5

PÉLDÁNY

TELI

LÁBRA

INFLUENZA VÍRUS KÉSZLET AZ FDA-TÖL

VÍRUS TITER (HEMAGGLUTINÁCIÓS VIZSGÁLAT)

INJEKTÁLÁS 10 NAPOS TOJÁSOKBA