LT4461B - Gripo hemagliutinino multivalentinių vakcinų gamybos būdas - Google Patents

Gripo hemagliutinino multivalentinių vakcinų gamybos būdas Download PDF

Info

Publication number
LT4461B
LT4461B LT97-201A LT97201A LT4461B LT 4461 B LT4461 B LT 4461B LT 97201 A LT97201 A LT 97201A LT 4461 B LT4461 B LT 4461B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
protein
hemagglutinin
influenza
influenza virus
leu
Prior art date
Application number
LT97-201A
Other languages
English (en)
Other versions
LT97201A (lt
Inventor
Gale Eugene Smith
Franklin Volvovitz
Bethanie E. Wilkinson
Andrei I. Voznesensky
Craig Stanway Hackett
Original Assignee
Protein Sciences Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27508642&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=LT4461(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority to US08/120,607 priority Critical patent/US5762939A/en
Priority to CZ20080037A priority patent/CZ299862B6/cs
Priority to DK05076536.1T priority patent/DK1605052T3/da
Priority to DK95922133T priority patent/DK0833933T3/da
Priority to NZ288026A priority patent/NZ288026A/xx
Priority to EP11159899.1A priority patent/EP2374894B1/en
Priority to AT95922133T priority patent/ATE304602T1/de
Priority to ES95922133T priority patent/ES2248799T3/es
Priority to AT05076536T priority patent/ATE518000T1/de
Priority to BR9510590-5A priority patent/BR9510590A/pt
Priority to HU9801395A priority patent/HUT77921A/hu
Priority to DE69534449T priority patent/DE69534449T2/de
Priority to EP95922133A priority patent/EP0833933B1/en
Priority to PT05076536T priority patent/PT1605052E/pt
Priority to EP05076536A priority patent/EP1605052B1/en
Priority to CA2222129A priority patent/CA2222129C/en
Priority to PCT/US1995/006750 priority patent/WO1996037624A1/en
Priority to CNB951979280A priority patent/CN100390289C/zh
Priority to DK02076629T priority patent/DK1275726T3/da
Priority to JP53561796A priority patent/JP3757318B2/ja
Priority to AU26925/95A priority patent/AU712776B2/en
Priority to SK1588-97A priority patent/SK286441B6/sk
Priority to CZ0373897A priority patent/CZ301021B6/cs
Priority to US08/453,848 priority patent/US5858368A/en
Priority to IS4620A priority patent/IS4620A/is
Priority to FI974319A priority patent/FI974319A/fi
Priority to NO975434A priority patent/NO975434L/no
Priority to LT97-201A priority patent/LT4461B/lt
Application filed by Protein Sciences Corporation filed Critical Protein Sciences Corporation
Publication of LT97201A publication Critical patent/LT97201A/lt
Publication of LT4461B publication Critical patent/LT4461B/lt
Priority to HK06106203.4A priority patent/HK1083867A1/xx

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/816—Viral vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds

Description

Pateikiamas rekombinantinio gripo hemagliutinino baltymo gavimo būdas ekspresuojant šį baltymą vabzdžių ląstelėse ir tam tikslui panaudojant bakuloviruso ekspresijos sistemą.
Šiuo būdu gautas baltymas naudojamas multivalentinės gripo vakcinos gamybai, kurios pagrindą sudaro mišinys rekombinantiniu hemagliutininų antigenų mišinys, gautų klonavimui panaudojus gripo virusus, pasižyminčius epideminiu potencialu. Rekombinantininiai hemagliutinino baltymai yra viso ilgio nesuskaidyti (HAO) glikoproteinai įskaitant abu HA1 ir HA2 subvienetus (HAO), kurie išvalomi nedenatūruojančiomis sąlygomis iki 95% ar didesnio, o geriausiai iki 99% grynumo.
Geriausiame išradimo įgyvendinime pateikiama, kokiu būdu gripo hemagliutinino genai, paimti iš A ir B virusų, yra klonuojami panaudojant tam tikslui specialiai sukurtas oligonukleotidų sekas ir polimerazės grandininės reakcijos metodologiją.
Pateikiamas bendras būdas kaip ekstrahuoti ir išskirti rekombinantinį HA baltymą, pagamintą vabzdžių ląstelėse, aprašant rHA baltymų išskyrimą iš A potipių ir B tipo gripo virusų.
Šis išradimas priklauso rekombinantinių gripo vakcinų sričiai.
Išradimo prielaidos
Gripo epidemijos kyla kasmet ir yra viena iš svarbių žmonių sergamumo ir mirtingumo pasaulyje priežasčių. Dažniausiai suserga vaikai ir jie daugiausiai išplatina gripo virusą žmonių bendruomenėje. Vyresnio amžiaus ir ligoti žmonės daugiau rizikuoja, kad jiems gripo infekcija komplikuosis ir juos reikės hospitalizuoti. Vien tik Jungtinėse valstijose 1956 ir 1988 metų laikotarpyje kiekvieno iš septynių gripo sezonų metu užregistruota daugiau kaip 10,000 mirčių atvejų dėl pneumonijos ir gripo, ir daugiau kaip 40,000 mirčių atvejų užregistruota kiekvieno iš dviejų sezonų metu ( Šiuolaikiniai Duomenys: Gripo Aktyvumas - Jungtinės Amerikos Valstijos ir Pasaulis, ir 1992-1993 metų Gripo Vakcinos Sudėtis , Morbiditv and Mortality VVeeklv Report. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, 41/No. 18: 315-323, 1992).
Gripo virusai yra labai pleomorfiškos dalelės, sudarytos iš dviejų paviršiaus glikoproteinų - hemagliutinino (HA) ir neuraminidazės (NA). HA sąlygoja viruso prikibimą prie šeimininko ląstelės ir viruso bei ląstelės apvalkalėlių susiliejimą virusui skverbiantis į ląstelės vidų. Gripo viruso genomą sudaro aštuoni vienasiūliai neigiamos prasmės RNR fragmentai, iš kurių keturi didžiausi segmentai koduoja HA geną. Gripo virusai, priklausomai nuo jų antigenų, skirstomi j A, B ir C tipo virusus. Gripo A virusai įvardijami naudojant nomenklatūrą, j kurią įeina potipis ar tipas, geografinė kilmė, kamieno numeris ir išskyrimo metai. Pavyzdžiui, A/Pekinas/353/89. Nustatyta mažiausiai 13 HA potipių (H1-H13) ir 9 NA potipiai -N1-N9). Visi šie potipiai aptinkami paukščiuose ir tik H1-H3 ir N1N2 aptinkami pas žmogų, kiaules ir arklius (Murphy and VVebster Ortomiksovirusai, Virology, red. Fields, B.N., Knipe D.M., Chanock R.M., 1091-1152 (Raven Press, New York, (1990)).
Antikūnai HA neutralizuoja virusą ir sudaro natūralaus imuniteto gripo infekcijai pagrindą (Clements, Gripo vakcinos, knygoje Vakcinos: Imunologinių problemų nauji sprendimo būdai, red. Ronald W. Eliis, P. 129-150 (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA 1992)). HA molekulės antigeninis variavimas sąlygoja dažnus gripo protrūkius ir ribotą infekcijos kontrolę imunizuojant.
Trimatė HA sandara ir jo sąveika su atitinkamu ląstelės receptoriumi, sialo rūgštimi, ištirta gerai (Wilson ir kt. Gripo viruso apvalkalėlio glikoproteino hemagliutinino sandara 3 A skiriamoje geboje, Nature 289:366-378 (1981); Weis ir kt., Gripo viruso hemagliutinino, sujungto su jo receptoriumi, sialo rūgštimi, sandara, Nature. 333:426-431 (1988); Murphy ir VVebster, 1990). HA molekulė virione yra trimero forma. Kiekvienas monomeras sudarytas iš dviejų grandinių, HA1 ir HA2, sujungtų bisulfidine jungtimi. Infekuotos šeimininko ląstelės gamina 85,000 molekulinės masės glikozilintą polipeptidą kaip pirmtaką, kuris vėliau suskyla j HA1 ir HA2.
IgG ir IgA antikūnų, specifinių gripo HA, buvimas yra susijęs su organizmo atsparumu infekcijai ir ligai (Clements, 1992). Inaktyvuotos gripo vakcinos, sudarytos iš viso viruso ar dalinai išgrynintos (subvienetinės), standartizuojamos pagal pagal kiekvieno kamieno HA kiekį. Paprastai gripo vakcinos turi nuo 7 iki 25 mikrogramų kiekvieno iš trijų gripo viruso kamienų HA.
Kito pagrindinio apvalkalėlio glikoproteino - NA vaidmuo apsauginiame gripo imunitete (humoraliniame ar T-ląstelių sąlygotame) kol kas neištirtas. Neuraminidazė yra labai neatspari gryninant ir saugojant (Murphy ir VVebster, 1990), ir todėl NA kiekis dabartinėse gripo vakcinose nestandartizuojamas. Išgryninta HA, bet ne NA, vakcina apsaugo gyvūnus nuo gripo (Johansson ir kt., Išgrynintas gripo viruso hemagliutininas ir neuraminidazė yra ekvivalentiški stimuliuojant antikūnų atsaką, tačiau sukelia skirtingo pobūdžio imunitetą infekcijai, J, Virology, 63:1239-1246 (1989)). Tiriant žmones, nenustatyta, kad bandomoji vakcina, paruošta neuraminidazės pagrindu, gali apsaugoti (Orga ir kt., J. infect. Pis. 135: 499-506 (1977)).
Licenzinės gripo vakcinos sudarytos iš formaiinu inaktyvuotų ar chemiškai suskaidytų subvienetų, pagamintų iš dviejų gripo A potipių (H1N1 ir H3N2) ir vieno gripo B potipio virusų. Prieš kiekvieną gripo sezoną JAV Maisto ir Vaistų Administravimo (FDA) Vakcinų ir Giminingų Biologinių Medžiagų Patarėjų Komitetas rekomenduoja ateinančiam sezonui trivalentės gripo vakcinos sudėtj. 1992-93 metų vakcina savo sudėtyje turėjo A/Teksasas/36/91 (H1N1), A/Pekinas/353/89 (H3N2) ir B/Panama/45/90-panašius virusus.
FDA rekomendavo, kad 1993-94 metų gripo vakcina turėtų turėti tuos pačius Teksaso ir panamos kamienus ir naują gripo A Pekino kamieną (A/Pekinas/32/92).
Asmenų, priklausančių aukštos rizikos grupei, vakcinavimas kiekvienais metais prieš gripo sezoną yra efektyviausia priemonė, padedanti sumažinti gripo infekcijos poveikj. Dabartinių vakcinų trūkumai yra : mažas jų vartojimo lygis; mažas efektyvumas vyresnio ir jaunesnio amžiaus vaikams; jų gamyba kiaušiniuose; antigeninės variacijos ir pašalinės reakcijos.
Ligų Kontrolės Centras (LKC) nustatė, kad mažiau kaip 30% individų, priklausančių didelės rizikos susirgti gripu grupei, yra kasmet vakcinuojami (MMWR, 1992). Šiuolaikinės inaktyvuotos vakcinos sveikiems suaugusiems sąlygoja aukštą apsaugos prieš infekciją lygį tuo atveju, kai vakcinos antigenai yra giminingi cirkuliuojačių virusų antigenams. Tuo tarpu vyresnio amžiaus žmonėms, ypač ligotiems, apsauga prieš infekciją yra silpnesnė (Clements,1992). Ankstyvesniuose tyrimuose, kuriuos atliko Povvers ir Belshe, J. Inf. Pis. 167:584-592 (1993), žymus antikūnų atsakas j trivalentę gripo subvirionų vakciną stebėtas mažiau kaip 30% individų, kuriems buvo 65 ir daugiau metų.
A ir B gripo vakcinoms naudojami gamtiniai virusų kamienai, kurie dauginasi dideliais titrais viščiuko kiaušinio alantojinšinio alantojinėje ertmėje. Tuo tarpu kamienas, naudojamas gripo A komponentui gauti, priklauso perršiuotam virusui, turinčiam reikalingus paviršiaus antigenų genus. Perrūšiuotas virusas - tai toks virusas, kuris turi reikalingus paviršiaus antigenų genus. Perrūšiuotas virusas - tai toks virusas, kuris dėl virusinio genomo segmentacijos pasižymi kiekvieno tėvo kamieno charakteristikomis. Kuomet ląstelę infekuoja daugiau negu vienas viruso kamienas, tuomet šie virusiniai segmentai susimaišo ir jų palikuonių virionai turi įvairų abiejų tėvų genų rinkinį.
Apsauga, gaunama panaudojant vakcinacijai šiuolaikines pilnas ar suskaidytas gripo vakcinas, yra trumpalaikė ir tampa neveiksminga, jeigu gripo epideminiuose kamienuose įvyksta antigeninis poslinkis (dreifas). Gripo virusams būdingas antigeninis poslinkis vyksta dėl imuninės selekcijos, atrenkančios virusus, kurių hemagliutinino molekulėje yra pakitusios aminorūgščių sekos. Idealiai, tai vakcinos kamienai turėtų atitikti ligą sukeliančius viruso kamienus. Tačiau šiuolaikinių gripo vakcinų gamybą riboja viruso auginimas viščiuko embriono kiaušiniuose. Ne visi viruso kamienai vienodai gerai dauginasi kiaušinyje. Tokie virusai turi būti adaptuoti arba turi būti sukurti perrūšiuoti virusai. Kiaušiniuose auginamų virusų hemagliutininas labai greitai heterogenizuojasi ir skiriasi nuo pirminio viruso, išskirto iš infekuotų individų ir augintų žinduolių ląstelėse, hemagliutinino (Wang ir kt., Virol. 171:275-279 (1989); Rajakumar ir kt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4154-4158 (1990)). HA pokyčiai dėl selekcijos ir gripo vakcinų gamyba gali duoti antigeniškai skirtingų virusų subpopuliacijų mišinj. Todėl vakcinos virusai gali skirtis nuo epideminio kamieno variantų. To pasėkoje apsaugos lygis gali būti suboptimalaus lygio.
Asmenims, kurie yra labai alergiški kiaušinio baltymui, dėl šio baltymo likučių vakcinoje gali išsivystyti ūmaus hiperjautrumo reakcijos. 1976 metais kiaulių gripo vakcina buvo susieta su Guillain-Barrė sindromu. Kol kas nepastebėta, kad vėlesnės vakcinos, pagamintos iš kitų gripo kamienų, būtų iššaukusios šios retos ligos atvejų pagausėjimą.
Gripo vakcinos gamybos būdas, nereikalaujantis kiaušinių panaudojimo, galėtų pateikti grynesnį produktą, kuris nesukeltų pašalinių imuninių reakcijų. Be to, grynesnės vakcinos paruošimas nereikalautų viruso inaktyvacijos ar organinio virusinio apvalkalėlio komponentų ekstrahavimo, todėl būtų išvengta antigeninių epitopų denatūracijos bei chemikalų likučių vakcinoje.
Be to, gripo vakcina pagaminta nenaudojant viruso auginimo kiaušinyje padėtų išvengti genetinio heterogeniškumo, kuris pasitaiko adaptacijos metu pasažuojant ir auginant virusą kiaušinyje. Tai duotų tokią vakciną, kuri labiau atitiktų gripo epideminiams kamienams ir būtų efektingesnė.
Šio išradimo objektas yra gripo vakcinos gamybos būdo, nereikalaujančio viruso auginimo kiaušinyje, pateikimas.
Kitas šio išradimo objektas yra greito ir pigaus gripo vakcinos gamybos būdo, leidžiančio gauti labai gryną produktą iš pirminių gripo šaltinių, pateikimas.
Trumpas iliustracijų aprašymas
Fig. - tai HA genų, gautų iš gripo A kamienų išskirtos virusinės RNR, klonavimo, ekspresuoto rHA išskyrimo ir rHA biologinės charakteristikos schema.
Santrumpos: FDA - Maisto ir Vaistų Administravimas; MDCK Madin Darby šunų inkstas; TPCK - tozilfenilalanil chlorometilketonas; RNA ribonukleino rūgštis; cDNA - komplementari dezoksiribonukleino rūgštis; HA - hemagliutininas; FBS - fetalinis veršiuko serumas; PCR polimerazės grandininė reakcija ir BV - bakulovirusas.
Fig. -metodo, paminėto 1 Fig. ir skirto gripo viruso kamieno A/Teksasas/36/91 HA geno klonavimui ir ekspresijai, detalesnė schema. Gripo HA genas gautas iš RNR, išskirtos iš MDCK ląstelių, užkrėstų gripo virusu A/Teksasas/36/91. Tam tikslui panaudota atvirkštinė transkriptazė ir universalus pradmuo (SEQ ID No. 1), atlikti du PCR amplifikacijos ciklai ir klonuota. Kaip parodyta schemoje, PCR pirmojo ciklo metu naudotas 5’ galo pradmuo SEQ ID No. 2 ir 3' galo pradmuo SEQ ID No. 3. PCR antrojo ciklo metu naudotas 5’ galo pradmuo SEQ ID No. 4 ir 3’ galo pradmuo SEQ ID No. 5. Bakuloviruso rekombinacijos vektorius sudarytas iš polihedrino promotoriaus ir signalinio peptido sekų, gautų iš bakuloviruso 61K geno ( bakuloviruso genas, koduojantis apie 61,000 molekulinės masės signalinį peptidą ) bei sekų, koduojančių subrendusį HA baltymą. Šis rekombinacijos vektorius panaudotas bakuloviruso ekspresijos vektoriaus, sąlygojančio šio kamieno viruso HA produkciją, konstravimui.
Fig. 4a, 4b ir 4c - grafikai, rodantys anti-HA imuninį atsaką pas peles, kurios buvo imunizuotos rHA arba licenzine 1994-1995 metų sudėties trivalentine vakcina, ašyse: savaitės po vakcinacijos if H1A titras. Fig. 4a- HA1 A/Teksasas/36/91; Fig. 4b - HA1 A/Šangdongas/9/93 ir Fig. 4c - HA1 B/Panama/45/90; rHA (daugiakampiai) ir FLUVIRON® patenuota vakcina, kultivuota kiaušiniuose (kvadratai).
Ί
Detalus išradimo aprašymas
Detaliai aprašomas rekombinantinės gripo vakcinos gavimo būdas. Gripo viruso viso ilgio nesuskaldytas (HAO) hemagliutinino antigenas gaunamas panaudojant bakuloviruso ekspresijos vektorius vabzdžių ląstelių kultūroje ir po to jis išskiriamas nedenatūruojančiose sąlygose. Gripo A ir/ar gripo B kamienų du ar daugiau išgrynintų hemagliutinino antigenų sumaišomi kartu tam, kad būtų gauta multivalentinė gripo vakcina. Tam, kad būtų padidintas efektyvumas, rekombinantinius antigenus galima sumaišyti su adjuvantiniais nešėjais.
Rekombinantinės DNR technologijos panaudojimas gripo vakcinų gamybai pasižymi keletu privalumų: rekombinantinė gripo vakcina gali būti pagaminta saugesnėmis ir labiau kontroliuojamomis sąlygomis; nereikia gripo viruso auginti kiaušiniuose; rekombinantinis HA baltymas gali būti labiau išgrynintas; išvengiama galimų pašalinių efektų dėl užteršimo kitais baltymais; išskiriant rekombinantinį HA, nereikia inaktyvuoti viruso ar organiniais tirpikliais ekstrahuoti virusinio apvalkalėlio komponentus, ir todėl išvengiama antigenų denatūracijos, o be to nėra pavojaus, kad vakcinoje lieka chemikalų; HA gamyba panaudojant rekombinantinę DNR technologiją, leidžia išvengti genetinio heterogeniškumo, kuris gali atsirasti viruso adaptacijos ir pasažavimo kiaušiniuose metu, o tai savo ruožtu sudaro prielaidas tam kad vakcinos kamienai labiau atitiks gripo epideminius kamienus ir tai savo ruožtu padidins vakcinos efektyvumą; rekombinantinis metodas leidžia geriau parinkti kamieną, suteikdamas laiko atrenkant vadovautis patikimesniais epidemiologiniais duomenimis.
Bakuloviruso ekspresi jos sistema
Bakulovirusai -.tai DNR virusai, priklausantys Baculoviridae šeimai. Žinoma, kad šie virusai turi siaurą šeimininkų ratą, kuris apima tik vabzdžių Lepidopteran rūšis (drugelius ir kandis). Bakuiovirusas Autographa californica branduolio polihedrozės virusas (Nuclear Polyhedrosis Virus) (AcNPV), kuris tapo bakulovirusų prototipu, sėkmingai dauginasi jautriose vabzdžių ląstelių kultūrose. AcNPV turi dvisiūlės uždaros žiedinės DNR genomą, susidedantį iš apie 130,000 bazių porų ir jo priklausomybė šeimininkui, molekulinė biologija ir genetika yra gerai apibūdinta.
Daugelis bakulovirusų, įskaitant AcNPV, infekuotų ląstelių branduoliuose sudaro didelius baltymo kristalinius darinius - kūnelius. Šiuose kūneliuose beveik 95% visos baltymo masės sudaro vienarūšis polipeptidas, vadinamas polihedrinu. Polihedrino genas AcNPV viruso genome egzistuoja vienos kopijos forma. Kadangi polihedrino genas nevaidina jokio vaidmens viruso replikacijoje užkrėstose ląstelėse, todėl jj galima modifikuoti svetimų genų ekspresijai. Svetimo geno seka įterpiama j AcNPV genomą 3’ gale kaip tik prie polihedrino promotoriaus sekos tam, kad šis svetimas genas atsidurtų polihedrino promotoriaus transkripcijos kontrolėje.
Rekombinantiniai bakulovirusai, ekspresuojantys svetimus genus, yra sukonstruojami panaudojant homologinę rekombinaciją tarp bakuloviruso DNR ir chimerinių plazmidžių, turinčių norimo geno sekas. Rekombinantiniai virusai detektuojami pagal skirtingą poveikio zonos morfologiją bei homogeniškai išgryninus.
Bakulovirusai itin gerai tinka eukariotiniam klonavimui ir kaip ekspresijos vektoriai. Jie yra saugūs, kadangi jų šeimininkų ratas apsiriboja artropodais - nariuotakojais. JAV Aplinkos Apsaugos Agentūra (EPĄ) aprobavo trijų bakulovirusų naudojimą vabzdžių kenkėjų kontrolei. Pagal EPĄ Eksperimentinio Naudojimo leidimą AcNPV daugelį metų naudojamas derlingumui pakelti.
Laukinio tipo AcNPV bei rekombinantiniai virusai dauginasi įvairiose vabzdžių ląstelėse, Įskaitant pastovias ląstelių linijas, kilusias iš Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). S. frugiperda ląstelių populiacijos padvigubėjimo laikas yra nuo 18 iki 24 valandų. Jos gali būti auginamos kaip vienasluoksnės arba kaip suspenzinės kultūros.
Rekombinantiniai HA baltymai gali būti produkuojami ląstelių kultūrose, kilusiose iš S. frugiperda (ir ne tik jose). Ląstelių kultūras, kilusias iš kitų rūšių vabzdžių, tokių kaip Bombix mori, Galleria mellanoma, Trichplusia ni, arba Lamanthria dispar, taip pat galima panaudoti rekombinantinių HA baltymų gamybai.
Tinkamiausia šeimininko ląstelių linija rekombinantinio bakuloviruso baltymo produkcijai yra linija Sf900+. Kita tinkama šeimininko ląstelių linija rekombinantinio bakuloviruso baltymo produkcijai yra linija Sf9. Sf900+ ir Sf9 yra netrasformuotos, netumorogeninės pastovios ląstelių linijos, kilusios iš Spodoptera f rūgi perda (Lepidoptera); Noctuidae). Sf900+ ir Sf9 ląstelės auginamos 28±2° C temperatūroje be anglies dvideginio priedo. Sf9 ląstelėms naudojama TNMFH terpė (paprastas mišinys druskų, vitaminų, angliavandenių ir aminorūgščių) su 10% fetalinio veršiuko serumo. Jokie kiti gyvūninės kilmės produktai (pvz., tripsinas ir pan.), išskyrus fetalinį veršiuko šėrimą, nenaudojami. Kultūros terpes be serumo (prieinamas kaip Sf900 kultūros terpė, Gibco BRL, Gaitersburg, MD) galima taip pat naudoti Sf9 ląstelių auginimui, o taip pat ir Sf900 ląstelių.
Sf900 ląstelių populiacijos padvigubėjimo laikas yra 18-24 vai. Jas galima auginti ir kaip vienasluoksnes, ir kaip suspenzines kultūras. Nepaskelbta jokių duomenų, kad S. frugiperda ląstelėse gali replikuotis koks nors žinomas žinduolių virusas.
Specialistai supranta, kad ekspresijos vektoriumi gali būti panaudota ne tik bakuloviruso ekspresijos sistema. Rekombinantiniai HA baltymai gali būti ekspresuojami ir panaudojant kitus ekspresijos vektorius, tokius kaip Entomopox virusai (vabzdžių poksvirusai), citoplazminės polihedrozės virusai (CPV). Vabzdžių ląsteles galima galima transformuoti rekombinantinių HA genu ar genais ir gauti pastovią ekspresiją.
Gripo viruso kamienu išskyrimas
Vienas ar daugiau gripo viruso kamienų išskiriami iš asmenų, segančių gripu. Tinkamiausi yra tie gripo viruso kamienai, kuriuos nustatė FDĄ arba CDC ir apibūdino, kad jie turės epideminį potencialą sekančiam gripo sezonui. Čia aprašomo būdo 'privalumas yra tai, kad tiesioginiu viruso gavimo šaltiniu gali būti panaudota klinikinė medžiaga tokia, kaip ligonių, infekuotų gripo virusu, nosies išskyros.
Gripo viruso kamienu auginimas
Kamienai auginami ląstelėse, kurios gali produkuoti didelius viruso titrus, tokiose kaip Madin Darby šunų inkstų (MDCK) ląstelės (jas galima gauti iš Amerikietiškos Kultūrų Kolekcijos, numeris ATCC CCL34. MDCK ląstelės, pavyzdžiui, užkrečiamos j terpę pridėjus tozilfenilalanil chlorometilketono (TPCK) ir dalinai inaktyvavus tripsiną bei pridėjus fetalinio veršiuko serumo tokia koncentracija, kuri yra optimaliausia didžiausių titrų pirmojo pasažo viruso produkcijai. MDCK ląstelės užkrečiamos gripo viruso kamienais mažiausia infekcijos dauginimosi doze (0.1 - 0.5 ), nustatoma pagal standartinį HA vertinimo būdą ( Rosen, Hemagliutinacija, sukeliama gyvūnų virusų“ knygoje “Virusologijos Pagrindiniai Metodai, red. K. Habel ir N.P. salzman, p. 276-28 (Academic Press, New York 1969), kuris pateikiamas ir šiame išradimo aprašyme. Infekuotos ląstelės inkubuojamos prie 33° C 48 valandas ir terpėje vertinama viruso produkcija panaudojant hemagliutinacijos aktyvumo testą. Tos auginimo sąlygos, kurių metu gautas didžiausias HA aktyvumas yra naudojamos ir ruošiant didelius gripo viruso kiekius.
Viruso išskyrimas
Virusinės dalelės, produkuotos pirmojo pasažo metu, išskiriamos iš terpės panaudojant žinomą išskyrimo būdą - centrifugavimą sacharozės gradiente. Pavyzdžiui, virusas, praėjus 24-48 vai. po infekcijos, surenkamas centrifuguojant gripo virusu infekuotų MDCK ląstelių terpę. Virusinės nuosėdos resuspenduojamos buferyje ir centrifūguojamos užbuferintame sacharozės gradiente. Gripo virusai, esantys gradiento 4045% sacharozės zonoje, surenkami, atskiedžiami buferiu ir centrifūguojami 100,000 x g. Išskirto viruso nuosėdos resuspenduojamos buferyje ir.saugojamos -70° C temperatūroje.
Gripo viruso hemagliutinino genu klonavimas
HA genų klonavimo, panaudojant šį metodą , schema pateikiama Fig. 1. Ląstelės užkrečiamos tuo gripo viruso kamienu, kurį norima klonuoti. Virusas išskiriamas iš iš ląstelių kultūros terpės ir po to, jeigu tai yra gripo viruso A kamienai, išskiriama virusinė RNR, o , jeigu tai yra B kamienai, išskiriama mRNR. Virusinė RNR (- RNR) ekstrahuojama iš išgrynintų virionų ir tiriama formaldehido agarozės geliuose standartiniu metodu. cDNR sintezuojama naudojant arba universalią pradmenų sistemą, skirtą gripo viruso A kamienų virusinei RNR, arba naudojant atsitiktinius pradmenis, skirtus gripo viruso B kamienų mRNR. Pliusstandartinė komplimentari DNR (cDNR) sintezuojama panaudojant universalų oligonukleotidų pradmenį (5' -AGCAAAAGCAGG-31 (SEQ ID No. 1), kuris yra homologiškas A ir B gripo virusų visų hemagliutinino RNR segmentams (Davis ir kt. Bakterinio klono, turinčio gripo viruso WSN kamieno (HON1) hemagliutinino geną, konstravimas ir apibūdinimas , gene, 10: 205-218 (1980). Sukuriami pradmenys, kurie yra homologiški gripo viruso hemagliutinino geno 5' ir 3' galų konservatyviesiems rajonams. Tiek 5', tiek 3' galo pradmenys turi galuose vietas restrikcijos fermentams, kurių nėra hemagliutinino gene.
Atitinkami gripo viruso A arba B pradmenys yra sumaišomi su gripo viruso cDNR ir, naudojant standartinį PCR būdą, atliekama hemagliutinino geno segmentų amplifikacija. Reakcijos metu gauti dvisiūlės DNR segmentai turi subrendusį hemagiiutininą koduojančias sekas. Polimerazės grandininė reakcija (PCR) yra naudojama viso HA geno amplifikacijai. Po to genas klonuojamas panaudojant tinkamą bakteriją šeimininką tokį, kaip E. coli. 5' galai sekvenuojami tam, kad būtų identifikuotas HA genų signalinis peptidas. Tada vėl panaudojamas PCR būdas tam, kad būtų amplifikuoti HA genai, bet jau be signalinio peptido. Gautas produktas subklonuojamas plazmidiniame pernešimo vektoriuje, kuris turi AcNPV polihedrino promotorių. Tuomet pernešimo vektoriai turi tokias 5' - >3‘ sekas: A. californica NPV bakuloviruso polihedrino promotorius, ATG transliacijos startinis kodonas, 61K bakuloviruso signalinis peptidas, sekos, koduojančios subrendusį hemagiiutininą, natūralus hemagliutinino transliacijos terminacijos kodonas, polihedrino RNR poliadenilinimo signalas ir aprėminanti bakuloviruso DNR,
Išskirta chimerinė pernešant! plazmidinė DNR, turinti klonuotą hemagliutinino geną, sumaišoma su AcNPV laukinio tipo DNR, išsodinama precipituojant su kalciu ir transfekuojama j S. frugiperda ląsteles. Rekombinantiniai bakulovirusai atrenkami, remiantis poveikio zonų morfologijos skirtumais, ir toliau yra atrenkami naudojant papildomą selekciją. Klonuoti rekombinantiniai virusai patikrinami, kaip jie ekspresuoja hemagliutininą, atrenkamas vienintelis bakuloviruso ekspresijos vektorius, kuris panaudojamas Pagrindinio Viruso Banko sukūrimui.
Gripo viruso A kamienai:
Gripo viruso A kamienų HA genai klonuojami panaudojant išskirtus virusinės RNR preparatus. Virusinė RNR ektrahuojama paėmus 100-200 mikrolitrų išvalytų gripo A virionų, turinčių 1,000-2,000 hemagliutinacijos vienetų (HAU). Vienas HAU - tai viruso kiekis, kuris agliutinuos 50% raudonųjų kraujo kūnelių, vertinant standartiniu agliutinacijos metodu (Rosen, 1969). Virionai paveikiami proteinaze K, kuri suskaido baltymą, tuomet virusinė RNR yra ekstrahuojama fenolu/chloroformu lygiomis dalimis ir nusodinama etanoliu panaudojant tRNR nešėją. Virusinė RNR resuspenduojama buferyje ir paveikiama DNR-aze, neturinčia RNR-azės, tam, kad būtų pašalinta bet kokia DNR priemaiša, po to ekstrakcija ir precipitacija yra pakartojamos. Virusinė RNR (vRNR) tiriama formaldehido agarozės geliuose pagal metodą, aprašytą Maniatis ir kt. Molekulinis klonavimas: Laboratorinis vadovas. P. 86-96 ir 366-367 (Cold Spring Harbor lab., Cold Spring, N.Y. 1982).
Gripo viruso B kamienai:
Gripo virusų B kamienų HA genai klonuojami panaudojant visuminę (totalinę·) mesendžerinę-RNR (mRNR), išskirtą iš ląstelių, užkrėstų gripo viruso B kamienu. Visuminė RNR ektrahuojama iš infekuotų ląstelių. Užaugintos ląstelės lizuojamos panaudojant guanidium tiocianatą ir visuminė RNR yra išvaloma, panaudojant, pavyzdžiui, RNR Ektrahavimo Rinkinį, pagamintą Pharmacia Biotech Ine. (Piscatavvay, N J). Totalinė mRNR išskiriama iš ląstelinės RNR panaudojant Oligo-(dt)-celiuliozės pluošto kolonėles, panaudojant, pavyzdžiui, mRNR Išskyrimo Rinkinį, pagamintą Pharmacia Biotech Ine.
Rekombinantinio hemagliutinino ekspresija ir brendimas vabzdžiu ląstelėse
Rekombinantinio hemagliutinino antigenai ekpresuojami dideliais kiekiais S. frugiperda ląstelėse, infekuotose AcNPV-hemagliutinino vektoriais. Pirminis geno produktas yra nesubrendęs pilno ilgio hemagliutininas (rHAO) ir jis iš ląstelės nėra sekretuojamas, o lieka susijungęs su infekuotos ląstelės periferinėmis membranomis. Šis rekombinantinis HAO yra 68,000 molekulinės masės baltymas, kurj glikozilina prie N-galo prisijungę manozės tipo glikanai, besiskiriantys nuo glikanų, produkuojamų virusinių baltymų ekspresijos žinduolių ar paukščių ląstelėse metu. jrodyta, kad rHAO sudaro posttransliacinius trimerus, kurie kaupiasi citoplazminėse membranose.
HAO ir kitu baltymu ekspresijos vektoriai
HAO labiau tinka vakcinai, kadangi jis yra žymiai stabilesnis, palyginus su HA1/HA2 kompleksu, ir jo sankloda nepakinta valant ar saugojant. Stabilumo privalumai ypač išryškėja dirbant su B kamienais, jų titrai yra penkis kartus didesni palyginus su komerciniais atenuotais B kamienais.
Kaip aprašyta žemiau pateiktuose pavyzdžiuose, kuomet HA genai buvo klonuoti pMGS12 per restrikcijos saitus, HA subrendęs signalinis peptidas buvo pašalintas ir pakeistas bakuloviruso chitinazės signaliniu peptidu, nurodomu kaip 61 kD signalinis peptidas. Kadangi HA genas yra sujungtas su chitinazės signaliniu peptidu per skaidymo vietą, tai, priklausomai nuo pasirinkto restrikcijos saito, tarp subrendusio HAO baltymo ir 61 kD signalinio peptido yra trys - penkios aminorūgštys. Su gripo viruso A kamienais šiuo požiūriu nėra problemų, tačiau B kamienų HAO, ekspresuotas su papildomomis aminorūgštimis, klostosi ne taip kaip įprasta.
Sugalvoti du būdai šiai problemai išspręsti. Pirmas būdas panaudoti naują vektorių, pMGS3, kuris nekoduoja 61 kD signalinio peptido. HAO su savo įprastu signaliniu peptidu yra klonuojamas vektoriuje ir ekspresuojamas. SDS-PAGE analizė rodo, kad B kamienų HAO, ekspresuotas šiame vektoriuje, pasižymi geresniu glikozilinimu ir brendimu negu tuomet, kai yra ekspresuotas pMGS12. HAO susiklosto taip gerai, kad gali būti kiekybiškai konvertuotas j HA1/HA2. Tačiau, deja, kaip parodė tyrimai VVestern blotingo būdu, baltymo išeiga nėra didelė. Antras būdas - padidinti išeigą panaudojant 61 kD signalinj peptidą pMGS12 nukreipiant ekspresiją, tuo atveju, kai HAO genas įterptas nepanaudojant restrikcijos fermentų. Naujas vektorius, turintis 61 kD signalinj peptidą ir HAO geną, bet neturintis sekų, koduojančių įsiterpiančias aminorūgštis, yra nurodomas kaip pMGS27.
PMGS27 gali būti panaudotas bet kokio geno klonavimui ir ekspresijai bakuloviruso ekspresijos sistemoje. Genas - taikinys, vietoje to, kad būtų klonuotas vektoriuje, panaudojant restrikciją ir ligavimą, yra klonuojamas j vektorių anylingo būdu. Reikalingi reagentai gaunami iš Clontech panaudojant jų PCR-sąlygotą Klonavimo Sistemą. pMGS27 konstruojamas tokiu būdu, kad jis galėtų būti linearizuotas chitinazės signalinj peptidą koduojančio rajono gale. Prie linijinės pMGS27 fago T4 DNR pridėjus dATP ir veikiant polimeraze, gaunamos dvi ilgos vienasiūlės uodegėlės .
Genas - taikinys amplifikuojamas panaudojant polimerazės grandininę reakciją (PGR) arba atvirkštinės transkriptazės-PGR (RT-PGR), naudojant porą oligonukleotidu, tinkamų sukūrimui vienasiūlių uodegėlių, kurios yra komplementarios uodegėlėms paveiktos pMGS27, kuri buvo gauta PGR fragmentą veikiant T4 DNr-polimeraze ir dTTP. Paprastu anylingu galima sujungti dvi molekules j žiedinę plazmidę, kuri galės transformuoti ląstelę šeimininkę. Be to, kad šis būdas yra greitesnis ir paprastesnis negu tradicinis restrikcijos-ligavimo metodas, naudojamas klonuojant HA geną pMGS12, ši pMGS27 pasižymi tokiu svarbiu privalumu, kad ji neduoda papildomų aminorūgščių, koduojamų restrikcijos saitų, sukurtų tarp chitinazės signalinio peptido ir subrendusio HA baltymo. Šios papildomos aminorūgštys kartais sukelia sunkumų, kuomet signalinė peptidazė negali skaidyti signalinio peptido arba kai baltymas susiklosto neteisingai, kaip tai atsitinka, pavyzdžiui, kamieno B HA atveju.
Rekombinantinio HA išskyrimas
Praėjus keletai dienų po užkrėtimo, rHAO galima selektyviai ekstrahuoti iš AcNPV-hemagliutininu infekuotų ląstelių periferinių membranų, panaudojant nedenatūruojantį nejoninį detergentą ar kitus būdus, kurie naudojami rekombinantinių baltymų išskyrimui iš vabzdžių ląstelių, įskaitant tame tarpe ir gelio chromatografiją bei jungimą prie antikūnų. Detergente tirpale esantį rHAO galima toliau išskirti DEAE jonų kaitos būdu ir panaudojant lęšių lektinoafininę chromatografiją, arba kitus ekvivalentinius žinomus metodus.
Variante, kuriam skiriama pirmenybė, rHAO išskiriamas naudojant būdą, kuris yra švelnesnis ir leidžia gauti didesnį gripo viruso B kamienų rHAO kiekį. Darbo eiga atrodo sekančiai:
HAO baltymas, sudarantis vabzdžių ląstelių membranų integralinę dalį, išskiriamas iš tirpių baltymų, periferinės membranos baltymų, daugumos DNR ir RNR , gauto ekstrahavus ląsteles santykinai klampiame šarminiame tirpale, kurio pH yra tarp 9.5 ir 10.5. Klampumas didinamas pridedant sacharozės iki 250 mM koncentracijos. Pridedama disulfidines jungtis redukuojančio agento, pavyzdžiui, β-merkaptoetanolio, tokia koncentracija, kuri padėtų išvengti disulfidinių jungčių tarp baltymų, esančių mišinyje, susidarymo. Ląstelė suspenduojamos ekstrakcijos buferyje, homogenizuojamos ir po to centrifūguojamos. Nuosėdos plaunamos homogenizuojant mažos joninės jėgos buferyje, kuriame pridėta disulfidus redukuojančio agento šarminiame pH (laidumas mažiau negu 1 mS, pH 10.5) ir po to nuosėdos centrifūguojamos. HAO ekstrahuojamas iš nuosėdų buferyje, kuriame yra nuo 0.3 iki 1.5 % detergento tokio, kaip Tritonas, dezagreguojančio agento tokiame kiekyje, kuris neleidžia susidaryti kompleksams dėl jų elektrinu krūvių sąveikos, tokio kaip nuo 0.3 iki 1.o M betaino ar paurino, 6arminiame pH (geriausiai 9.5). HAO iš supematanto išskiriamas anijonų kaitos chromatografijos būdu, po to panaudojant katijonų kaitos chromatografiją. HAO kraunamas j anijonų kaitos kolonėlę, pavyzdžiui, DEAE ar Q-sefarozė® (agarozės rutuliukų kolonėlė suketvirtinėmis amino grupėmis), tame pačiame buferyje, kuris naudotas ekstrahavimui, tačiau atskiestame mažiausiai 1:2 papildomu buferiu, ekvilibruojant kolonėlę buferiu, kuriame yra apie 1/10 dalį detegento ir disulfidus-redukuojančio agento. Po to HAO eliuojamas mažinant pH iki 8.5. Eliuotas HAO kraunamas ų katijonų kaitos kolonėlę tame pačiame buferyje. Kontaminantai pašalinami eliuojant mažinant pH iki maždaug 7.4, po to, padidinus druskos koncentraciją iki 0.15 M NaCl, eliuojamas HAO.
Šis išskyrimo būdas, kuriam skiriama pirmenybė, aprašomaa toliau smulkiai:
Membranų frakcijos, savo sudėtyje turinčios rekombinantinį HA, išskyrimas. Ląstelės, ekspresuojančios rekombinantinį HA, ( 6,2 g ląstelių iš 0,34 L kultūros) suspenduojamos iki 100 mg/mL koncentracijos ledo vonioje atšaldytametirpale, kuriame yralOO mM natrio pirofosfato, 100 mM natrio chlorido, 250 mM sacharozės, 0.1% β-merkaptoetanolio, pH 10,5. Ląstelės suardomos panaudojant panaudojant Polytron® homogenizatorių (Brinkman Instruments Ine., VVestbury, NY), 4 ciklai po 2 min. Homogenizacinė terpė yra šarminio pH, kadangi siekiama padidinti pašalinių baltymų tirpumą ir membranų preparatų grynumą. Homogenatas centrifuguojamas 30 min. 9,200 g. Supematantas pašalinamas ir ir nuosėdos surenkamos. Po to membraninė frakcija plaunama mažos joninės jėgos tirpalu. Nuosėdos resuspenduojamos iki pradinio tūrio ledo vonioje atšaldytame tirpale, kurio sudėtyje yra 0.1% βmerkaptoetanolio, pH 10.5, ir homogenizuojamos panaudojant Polytron® homogenizatorių , 4 ciklai po 2 min. Homogenatas centrifuguojamas 30 min, 9,200 g. Supematantas pašalinamas ir nuosėdos surenkamos. Plaunant mažos joninės jėgos tirpalu, pašalinami papildomi -periferinių membranų baltymai. Membranų frakcijos paruošimas suteikia galimybę gauti didesnį rekombinantinio HA kiekį bei pašalinti nukleino rūgštis.
Rekombinantinio HA ekstrahavimas. Po to rekombinantinis HA selektyviai ekstrahuojamas iš membraninių nuosėdų naudojant sąlygas, kuriose nedenatūruojamas antigenas. Membraninės nuosėdos homogenizuojamos 41 mL ledo vonioje atšaldyto tirpalo, kurio sudėtyje yra 10 mM etanolamino pH 9.5, 1% Tritono N101, 0.1% βmerkaptoetanolio, 25 mM NaCl, 400 mM betaino, homogenizuojama 4 ciklais po 2 min. Po inkubuojama 40 min 23°, mišinys centrifūguojamas 3o min. 9,200 g. Supernatantas su rekombinantiniu HA filtruojamas ir atskiedžiamas per pusę tuo pačiu buferiu.
Baltymai tiriami SDS poliakrilamido gelio elektroforezės būdu. Bandiniai, pridėjus 2% natrio dodecilsulfato (SDS) ir 5% βmerkaptoetanolio, kaitinami verdančio vandens vonioje 10 min, po to atliekama elektroforezė 11% poliakrilamido gelyje, kurio sudėtyje yra 0.1% SDS, po to dažoma Coomassie mėliu.
Chromatografinis išskyrimas. Rekombinantinio HA chromatografinis išskyrimas buvo supaprastintas ir apsieita be brangios afininės chromatografijos, naudojančios Lęšinio Lėktino Sefarozę, pakeičiant ją dvižingsniu chromatografinio išskyrmo procesu, leidžiančiu gauti labai išgrynintą rekombinantinį HA antigeną, kuris yra nedenatūruotas ir tinkamas kaip komponentas gripo viruso vakcinai, skirtai žmonėms. Naudojamos Pharmacia Q-Sepharose ® Fast Flow ir CM-Sepharose Fast Flow® chromatografijos gelio matricos.
Anijonų-kaitos chromatografija. Visos chromatografijos atliekamos kambario temperatūroje. Rekombinantinio HA ekstraktas, gautas kaip nurodyta aukščiau, 1 mL tūryje pakraunamas į kolonėlę su Pharmacia Q-Sepharose -Fast Flow® (5 mL C10/C10 Pharmacia kolonėlė), išlyginama su 10 mM etanolaminu pH 9.5, 0.1% Tritonu® N101, 0.01% β-merkaptoetanoliu, 25 mM NaCl, 400 mM betainu. Po to kolonėlė plaunama ekvilibravimo buferiu tol, kol efluento UV absorbcija grįžta prie pagrindinės linijos. Šiomis sąlygomis rekombinantinis HA prisiriša prie kolonėlės, kai tuo tarpu pašalinės medžiagos išplaunamos. Po to dalinai išvalytas rekombinantinis HA eliuojamas 30 mM dietanolaminu pH 8.5, 0.1% Tritonu N101®, 0.01% β-merkaptoetanoliu, 25 mM NaCl, 400 mM betainu.
Katijonų-kaitos chromatografija. Q-Sefarozės eliuatas (23 mL) skiedžiamas du kartus 30 mM dietanolaminu pH 8.5, 0.1% Tritonu N101®, 0.01% β-merkaptoetanoliu, 25 mM NaCl, 400 mM betainu. Kolonėlė po to praplaunama 35 mL 10 mM natrio fosfato pH 7.4, 0.1% Tritonu N101®, 0.01% β-merkaptoetanoliu, 25 mM NaCl, 400 mM betainu. Plovimas pašalina pašalines medžiagas iš kolonėlės, kai tuo tarpu rekombinantinis HA lieka prisijungęs prie CM Sefarozės. Po to detergentas pašalinamas praplaunant kolonėlę 10 mM natrio fosfatu pH 7.4, 10 mM NaCl, kol efluento UV absorbcija grjžta prie pagrindinės linijos. Išvalytas rekombinantinis HA eliuojamas fosfatiniu buferiniu druskos tirpalu, pH 7.5 (PBS).
Išvalytas rHAO resuspenduojamas izotoniniame buferiniame tirpale. Nuo detergento išvalytas rHAO efektyviai agliutinuoja eritrocitus.
Rekombinantinio HA0 struktūriniai ir biologiniai ypatumai rHAO išvalomas iki mažiausiai 95% grynumo, o geriausiai iki 99% grynumo. SDS-poliakrilamido gelyje jis keliauja kaip vienas pagrindinis 68,000 molekulinės masės polipeptidas. Išskirto rekombinantinio HA0 ketvirtinė struktūra ištirta elektroniniu mikroskopu, nustatytas rezistentiškumas tripsinui, atlikta sedimentacijos gradiente analizė, nustatytas sugebėjimas agliutinuoti eritrocitus. Tyrimų duomenys rodo, kad rekombinantinis HAU sudaro trimerus, kurie susirenka į rozetes.
Išskirtas rHAO neagliutinuoja ląstelių tol, kol nepašalinamas detergentas, todėl spėjama, kad tam, kad jis galėtų suklijuoti viščiuko eritrocitus, antigenas turi sudaryti kompleksus (rozetes). Išskirto rHAO kiekybinis sugebėjimas agliutinuoti ląsteles naudojamas antigeno buvimo įvertinimui. Vienas hemagliutinino vienetas apibrėžiamas kaip antigeno kiekis, reikalingas 50% . agliutinacijai pasiekti standartiniame hemagliutinacijos teste su viščiukų eritrocitais. Palyginamieji duomenys rodo, kad išskirti rHAO antigenai agliutinuoja eritrocitus panašiu efektyvumu kaip ir gripo virionai.
Rekombinantinis HA0 gali būti suskaidytas ties disulfidine jungtimi, tai sukelia konformacinius pokyčius, pasireiškiančius dviejų grandinių HA1 ir HA2 atsiradimu, kuris buvo aprašytas Carr C.M. ir Kim P.S. “Gripo viruso hemagliutinino konformacinio pokyčio mechanizmas, Cell , 73: 823-832 (1993) (nuoroda įtraukta). Rekombinantinio HAO skaidymas aprašytas detaliau žemiau pateikiamame 6 pavyzdyje. Tikimasi, kad suskaidžius natūralų HAO j HA1 ir HA2, grandinės tampa infekcinėmis, įgyja sugebėjimą įsilieti j ląstelę, tuo būdu sukeldamos geresnį imuninį atsaką. Tokų antigenų, kaip gripo viruso hemagliutininas, paruošimas (procesingas) vyksta prisijungiant antigeniniams peptidams prie pagrindinio audinių suderinamumo komplekso (MHC) molekulių. Antigeno/MHC kompleksą atpažįsta T ląstelės ir inicijuojamas imuninis atsakas taip, kaip tai aprašyta Harding ir Heuze apžvalgose, Current Opinion in Cell Biology 5: 596-605 (1993), kurios taip pat įjungtos į literatūros sąrašą. rHAO, produkuojamas bakuloviruse, tačiau yra labai stabilus ir imunogeniškas kaip intaktinė molekulė. Palyginus ekspresuoto vabzdžių ląstelėse HAO angliavandenių molekules, rasta, kad glikanai skiriasi nuo tų, kurie yra pas HAO, kuriuos ekspresuoja žinduolių ar paukščių ląstelės.
Sulietu baltymu gamyba .
Sulieti baltymai, susidedantys iš HAO, sulieto su antru antigeninių baltymu, gali būti ruošiami tais atvejais, kuomet antrojo baltymo antigeniškumas yra mažas arba yra privalumai sukeliant imuninį atsaką į daugelį antigenų. Antrojo antigeno, kuriam teikiama pirmenybė, pavyzdžiu yra gripo viruso produkuojama neuraminidazė. Antigeną gali sudaryti ląstelinis, virusinis ar bakterinis baltymas arba antigeno dalis, turinti nors nuo penkių iki -aštuonių aminorūgščių. Kiti antigenai gali būti sudaryti iš hepatito B viruso, ŽIV antigenų ar karcinoembrioninio antigeno. Šiuo atveju kaip “imuninis atsakas bus vertinamas arba humoralinis atsakas pagal antikūnų antigenui produkciją, arba ląstelinis atsakas pagal J ląstelių sąlygotą atsaką j antigeną. Kai kuriais atvejais neantigeninių aminorūgščių “sąsaja” gali būti įterpta tarp HA ir antigeno tam, kad būtų padidintas antigeno antigeniškumas palyginus pastarąjį su HA. Darbo eiga susideda iš DNR plazmidės, reikalingos norimų taikininių antigenų genų suliejimui su visu gripo viruso HA genu ar jo fragmentais, sukūrimo tam tikslui panaudojant oligonukleotidus ir polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodologiją.
HA taikininiai antigenų suliejimo genai modifikuojami tokiu būdu, kad jų ekspresija vabzdžių ląstelėse būtų geresnė, tuo tikslu pašalinant gamtinio hidrofobinio signalinio peptido sekas ir pakeičiant jas nauju bakuloviruso signaliniu peptidu. Suliejamas genas įterpiamas bakuloviruso ekspresijos vektorių taip, kad bakuloviruso polihedrono promotorius reguliuotų sulietų baltymų transkripciją infekuotose vabzdžių ląstelėse. 18 aminorūgščių bakuloviruso signalinis peptidas nukreipia HA taikininio antigeno sulieto polipeptido transliaciją vabzdžių ląstelėse glikozilinimo keliu ir jo jau nebebūna subrendusiame sulietame baltyme.
Pavyzdžiui, plazmidė pA9440, turinti gripo viruso kamieno A/Bejing/32/92 HA geną pMGS12 bakuloviruso nešančioje plazmidėje, aprašytoje žemiau, buvo panaudota kaip matrica HA geno amplifikacijai polimerazės grandininės reakcijos (PGR) būdu darbe prisilaikant protokolo, kurį pasiūlė tiekėjas ( Gene Amp PCR cloning kit, Perkin Elmer Cetus). PGR reakcijos mišinyje (100 μΙ), buvo 20 pmol HA genui tinkamų pradmenų. 5’ ir 3’ pradmenys buvo sukurti taip, kad galuose būtų restrikcinės endonukleazės saitai, kokių paprastai nėra HA gene. HAO ir HA1 fragmentų 5’ pradmuo (0-567) prasideda gamtinio HA geno koduojančių sekų 5' galo 52 bazių pora, pašalinus gamtinio signalinio peptido seką ir prijungus Smal saitą 5’ gale tuoj po HA koduojančių sekų. HA2 fragmento 5' PGR pradmuo (0-651) prasideda gamtinio HA geno 1108 nukleotidu tuojau pat po kodono, koduojančio arginino liekaną, pašalinamą skaidant HAO į HA1 ir HA2. HAO ir HA2 fragmentų 3’ PGR pradmuo (0-680) sukurtas taip, kad pasibaigus HA koduojančioms sekoms būtų prijungtas Kpni saitas pašalinant gamtinį stop kodoną. HA1 3’ PGR pradmuo (0-679) sutrumpina geną prieš pat arginino liekaną, pašalinamą HAO skaidymo metu. HA geno fragmento amplifikacija atliekama 30 ciklų , kurių kiekvieną sudaro 1 min. 94° C denatūracijai, 2 min. 55° C pradmenų sujungimui ir 2 min. 72° C ekstencijai. Gauti amplifikuoti HA fragmentai elektroforezuojami agarozės geliuose ir išskiriami iš gelio panaudojant GeneCIean rinkinį (Bio 101, Ine.), prijungiami prie plazmidės, sukurtos priimti PGR-generuotus fragmentus (pCRII, Invitrogen). Taip gaunamos plazmidės pB142, pB144 ir pB330, į kurių sudėtį įeina atitinkamai HAO, HA1 ar HA2 geno fragmentai.
HA geno fragmentai, panaudojus Smal ir Kpni restrikcijos fermentus, išskiriami iš plazmidžių pB142, pB144 ir pB330 ir subklonuojami naudojant standartinius DNR metodus (Sambrook ir kt., 1989) AcNPV nešančioje plazmidėje pMGS12. PMGS12 plazmidė turi, pradedant 5’ ir einant link 3’ galo, AcNPV polhedrono promotorių, ATG inicijuojantį kodoną, 61000 molekulinės masės bakuloviruso glikoproteino (61 K) atskeliamo signalinio peptido seką, Smal ir Kpni restrikcijos fermentų klonavimo saitus ir TAA universalaus stop kodono seką. Šiuos reguliuojančius rajonus riboja AcNPV genomo EcoRI I fragmento DNR (Summers ir Smith, “ Bakuloviruso vektorių ir vabzdžių ląstelių kultūrų metodų vadovas. Tekxas Agricultural Experimental station Bulletin No. 1555 (1987). Klonuoti HA PGR fragmentai išskiriami iš pCRII klonuojančio vektoriaus, panaudojant Smai ir Kpni ir elektroforezę agarozės gelyje, ir naudojant GeneCIean rinkinį, įjungiami j pMGS12, kuri taip pat buvo skaidyta Smal ir Kpni. Gautos AcNPV nešančios plazmidės, pB879, pB1201 ir pB1205, turinčios atitinkamus HAO, HA1 ar HA2 koduojančius rajonus, jungiamos rėmelyje su atskeliamu 61K geno bakuloviruso signaliniu peptidu ir polihedrono promotoriumi. AcNPV nešančios plazmidės, pB879, pB1201 ir pB1205 gali būti naudojamos sulieti HAO, HA1 ar HA2 su bet kuriuo norimu genu.
Sekantis žingsnis konstruojant HA-CEA sulietą geną nešančias plazmidės buvo susijęs su CEA koduojančių sekų įterpimu j HAkoduojančias konstrukcijas. Panaudojus PGR ampiifikaciją, plazmidės pA9080 abiejuose CEA geno galuose įtaisyti restrikcinių endonuklezių Smal ir Kpni atpažinimo/skaidymo saitai. 5’ PGR pradmuo, 0-649, prasideda geno, neturinčio gamtinio CEA signalinio peptido sekos,*5’ galo 82 bazių pora. 3’ PGR pradmuo 0-650, sukurtas išmesti geno 3’ galo, paskutiniąsias 72 bazių porų, koduojančias hidrofobinio C-terminalinio rajono seką. CEA geno framento amplifikacija atlikta 30 ciklų, kurių kiekvieną sudarė 1 min. 94° C denatūracijai, 2 min. 55° C atjungimui ir 2 min. 72° C ekstencijai. Gauti ampiifikuoti CEA geno fragmentai elektroforezuojami agarozės geliuose ir išskiriami iš gelio panaudojant
GeneCIean rinkinį, prijungiami prie plazmidės pCRII (Invitrogen) pagal gamintojo instrukciją. Gaunama plazmidė pBS06, turinti CEA geną be jo gamtinio signalinio peptido, C-terminalinio hidrofobinio domeno, ar stop kodono, bet su abiem Smal ir Kpnl saitais abiejuose geno galuose.
Naudojant pB806 plazmidę, atliktas plačios apimties darbas, DNR suskaidyta naudojant arba Smal, arba Kpnl. CEA-koduojantys fragmentais išskirti naudojant agarozės gelio elektroforezę ir GeneCIean rinkinj, išskirti fragmentai įjungiami į kiekvieną iš trijų HA-koduojančių konstruktų (pB879, pB1201 ar pB1205), suskaidytų tuo pačiu restrikcijos fermentu. Pavyzdžiui, CEA-koduojantys fragmentai su Smal-nuskeitais galais buvo sujungti su HA0-.HA1- ir HA2-koduojančiais konstruktais (atitinkamai pB879, pB1201 ir pB1205) ir suskaidyti Smal, gaunant atitinkamai plazmidės pB1250, pB1555 ir pB1584. CEA-koduojantys fragmentai su Kpnl atskeltais galais sujungti su HA0-.HA1- ir HA2koduojančiais konstruktais, suskaidoma Kpnl ir gaunamos plazmidės pB1264, pB1564 ir pB1593. {terpiant geną CEA Smal saite , pasiekiama, kad CEA geną koduojančios sekos atsiduria už HA koduojančių sekų. PGR pradmenys visiems konstruktams sukurti tokie, kad EA genas būtų įterpiamas rėmelyje su HA ir sulieto geno transliacija būtų terminuota universaliu transliacijos terminacijos signalu (TAATTAATTAA) (Seka ID No. 4) pMGS12 vektoriaus sekose toliau nuo Kpnl saito.
Šis konstruktas gali būti pagerintas išmetant jsiterpiančias aminorūgštis, esančias arba tarp signalinio peptido ir HAO, kaip tai aprašyta žemiaus, arjsa esančias tarp HAO ir suliejamo geno, tam, kad pagerėtų baltymo sankloda ir imunogeniškumas.
Vakcinų vaisto forma ir pakuotė rHA gali būti paruoštas pakuotėje vienas arba derinyje, su kitais gripo viruso antigenais, panaudojant metodus ir medžiagas, žinomas gripo vakcinų gamyboje. Variante, kuriam teikiama pirmenybė, multivalentinės vakcinos gamybai naudojamas dviejų A kamienų ir vieno B kamieno HA baltymų derinys.
Ypatingu privalumu pasižymi tas variantas, kuomet HAi yra derinami su adjuvantu, pridedamu tokiu kiekiu, kuris užtikrina imunogeninio atsako prieš HA baltymus padidėjimą. Šiuo metu vienintelis adjuvantas, plačiai naudojamas žmonėms yra alūnas (aliuminio fosfatas ar aliuminio hidroksidas). Saponinas ir jo igrynintas komponentas Quil A, Freund’o pilnas adjuvantas bei kiti adjuvantai, naudojami eksperimente ir veterinarijoje, pasižymi toksiškumu, mažinančiu potencialią galimybę juos panaudoti vakcinų žmonėms gamyboje. Tačiau nauji cheminiai preparatai tokie, kaip muramilo dipeptidas, monofosforilo lipidas A, fosfolipido konjugatai tokie, kaip Goodman-Snitkoff ir kt. aprašytieji J. Immunol. 147: 410-415 (1991) (yra literatūros sąraše), baltymo inkapsuliacija proteoliposomoje , aprašyta Miller ir kt., J. Exp. Med. 176: 1739-1744 (1992) (yra literatūros sąraše), baltymo inkapsuliacija lipidinėse pūslelėse tokiose kaip Novasome ™ lipidų pūslelės (Micro Vescular Systems, Ine., Nashua, NH) taip pat galėtų būti naudingi.
Variante, kuriam teikiama pirmenybė, paruošta vakcina pateikiama vienkartinės dozės pavidalu, kuri gali būti panaudota parenteraliai imunizacijai (j raumenis, į odą ar į paodę) ar nosiaryklinei imunizacijai ( pvz. j nosį). Efektyvi dozė nustatoma būdu, kuris pateikiamas žemiau aprašomuose pavyzdžiuose. Nešėju paprastai būna vanduo ar užbuferintas druskos tirpalas su ar be konservanto. Antigenas gali būti liofilizuotas ir prieš panaudojimą resuspenduotas arba gali būti ištirpintas.
Nešėjas taip pat gali būti ir polimerinė uždelsto skleidimo sistema. Gaminant kontroliuojamą antigenų skleidimo vakciną ypač naudingi yra sintetiniai polimerai . Tarp pirmųjų tokio tipo pavyzdžių buvo metilo metakrilato rutuliukų, kurių diametras mažiau už vieną mikroną, taip vadinamų nano dalelių, polimerizacija, aprašyta Kreuter J., Mikrokapsulės ir nano dalelės medicinoje ir farmakologijoje. M. Donbrovv (red.) CRC Press, p. 125-148. Tokiu atveju antikūnų atsakas ir apsauga prieš gripo virusą būna žymiai geresnė negu naudojant derinį su aliuminio hidroksidų. Bandymai, atlikti naudojant kitas daleles, parodė, kad šių polimerų adjuvantinis efektas priklauso nuo dalelės dydžio ir hidrofobiškumo.
Mikroinkapsuliacija panaudota suleidžiant mikroinkapsuliuotą vaisto formą tam, kad pastaroji duotų kontroliuojamo skleidimo efektą. Daugelis veiksnių sąlygoja mikroinkapsuliacijai tinkamo polimero pasirinkimą. Polimero sintezės reprodukcibilumas ir mikroinkapsuliacijos procesas, mikroinkapsuliacijos medžiagų ir proceso kaštai, toksikologiniai ypatumai, variabilios skleidimo kinetikos parametrai ir polimero bei antigenų fizikocheminis suderinamumas - tai faktoriai, j kuriuos būtina atsižvelgti. Naudingų polimerų pavyzdžiais yra polikarbonatai, poliesterai, poliuretanai, poliortoesterai ir poliamidai, ypač tie kurie, pasižymi biodegradacinėmis savybėmis.
Dažniausiai nešėju farmaciniams preparatams, o neseniai ir antigenams, pasirenkams poli (d.l - laktid - ko - glikolidas) (PLGA). Tai biodegraduojantis poliesteras, kuris jau seniai naudojamas medicinoje laikiniems protezams, kaip kaulų plokštelėms ir kt. gaminti, ir per tą laiką neparodė jokio toksiškumo. Jvairūs farmaciniai preparatai, tame tarpe peptidai ir antigenai, yra ruošiami inkapsuliuojant j PLGA mikrokapsules. Sukaupta daug duomenų apie PLGA panaudojimą kontroliuojamam antigeno skleidimui, pavyzdžiui, tai pateikiama Eldrige J.H. ir kt. apžvalgoje Šiuolaikinės mikrobiologijos ir imunologijos problemos. 1989, 146: 59-66. Nustatyta, kad antigenų inkapsuliacija nuo 1 iki 10 mikronų diametro PLGA mikrosferose sąlygoja didesnį adjuvantinj efektą tuo atveju, kai preparatas naudojamas per os. PLGA mikroinkapsuliacijos metu reikalingas vandens-aliejaus emulsijos fazių atskyrimas. Tikslinis preparatas paruošiamas kaip vandeninis tirpalas ir PLGA ištirpinamas atitinkamuose organiniuose tirpykliuose, kaip antai metileno chloride ir etilo acetate. Šie du nesumaišomi tirpalai yra ko-emulsionuojami didelio greičio plakimo būdu. Po to pridedamas polimero ne-solventas, sukeliama polimero precipitacija apie vandeninius lašelius ir prasideda pirminių mikrokapsulių susidarymas. Mikrokapsules surenkamos ir stabilizuojamos vienu iš šių agentų - polivinilo alkoholiu (PVA), želatina, alginatais, polivinilpirolidonu (PVP), metilo celiulioze, tirpiklis pašalinamas arba džiovinant vakuume arba jj ekstrahuojant.
Pateikiamas išradimas aiškinamas sekančiais neribotais pavyzdžiais.
Pavyzdys 1: Gripo virusų auginimas ir išskyrimas
Sekantys gripo vakcinos viruso kamienai buvo gauti iš FDA viščiukų kiaušinio alantoitinio skysčio pavidalu:
. A/Pekinas/353/89-tipo (H3N2)
A/Pekinas/32/92-tipo (H3N2)
ATeksasas/36/91-tipo (H1N1)
B/Panama/45/90
Iš FDA gautų virusų kamienai kultivuoti infekuotose MDCK ląstelėse, pridėjus TPCK-paveikto tripsino (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ir fetalinio veršiukų serumo tokia koncentracija, kuri yra optimali aukščiausių pirmojo pasažo viruso titrų gavimui. MDCK ląstelės infekuotos gripo viruso kamienais naudojant mažiausią infekcijos dauginimosi koncentraciją, kuri buvo nustatyta standartiniu HA testu (Rosen, “ Gyvūnų virusų sukelta hemagliutinacija knygoje Virusologijos metodų pagrindai, red. K. Habel ir N.P. Salzman, p. 276-28 (Academic Press, New York 1969). Infekuotos ląstelės inkubuotos 33 ° C 48 vai. ir hemagliutinacijos aktyvumo testu terpėje įvertinta viruso produkcija. Auginimo sąlygos, kurių metu pasiektas didžiausias HA aktyvumas, naudotas ruošiant plačios apimties gripo viruso kiekius. Lentelėje 1 pateikiamos optimaliausios gripo viruso auginimui TPCK tripsino ir fetalinio veršiuko serumo koncentracijos.
Lentelė 1. Optimalios TPCK tripsino ir fetalinio veršiukų serumo koncentracijos
* A/Pekinas/353/8 9 A/Pekinas/32/ 92 A/Teksasas/ 36/91 B/Panama/45/ 90
%. fetalinio serumo 0.25% 0.25% 0.25% i 5.0% !
TPCK- paveikto tripsino kiekis 45 pg/ml 45 pg /ml 45 pg /ml 3 pg/ml
Gripo viruso išskyrimas: Virusai surinkti praėjus 24-48 vai. po užkrėtimo nuskaidrinant (1,000 x g 10 min.) virusu užkrėstų MDCK ląstelių terpę, surinktą iš10 kultivavimo flakonų T175. Virusas surenkamas centrifuguojant terpę 100,000 x g 1 vai. gautos virusinės nuosėdos resuspenduojamos 1 ml fosfatais užbuferinto druskos tirpalo (PBS) pH 7.4 ir centrifūguojamos 20 ml 20-60% (w/v) sacharozės gradiente PBS tirpale. Gripo viruso juostelė surenkama iš 40-45% sacharozės gradiento zonos, atskiedžiama PBs ir centrifūguojama 100,000 x g. Išskirto viruso nuosėdos resuspenduojamos 0.5 ml PBS ir saugomos -70 0 C.
Pavyzdys 2. Gripo viruso A/Teksasas/36/91 HA geno klonavimas.
Fig. pateikiamas specialus vieno iš gripo viruso HA genų klonavimo etapas. Iš CDC gauto gripo viruso kamieno A/Teksasas/36/91 virusinė RNR ekstrahuota panaudojant aukščiau aprašytą būdą. Universalus pradmuo, komplementarus gripo viruso 3' galo RNR segmentams 5' -AGCAAAAGCAGG (SEQ ID No. 1), drauge su pelių Maloney leukemijos viruso (M-MuLV) atvirkštine transkriptazę panaudotas gripo viruso cDNR gamybai. Išskirta virusinė RNR ar mRNR (5gg) panaudota kaip matrica cDNR gamybai drauge su M-MuLV atvirkštine transkriptazę ( cDNR pirmojo siūlo sintezės rinkinys, Pharmacia Ine.) Pradmeniu gripo viruso A kamienų virusinės RNR cDNR sintezei naudotas sintetinis oligonukleotidinis pradmuo (5' -AGCAAAAGCAGG-3') (SEQ ID No. 1), homologiškas visų viriono HA geno segmentams.HA genų amplifikacija panaudojant cDNR atlikta polimerazės grandininės reakcijos (PGR) būdu standartinėmis reakcijos sąlygomis (Gene Amp kits; Cetus/Perkin Elmer, NorwalK, CT). PGR reakcijos mišinys (100 μϊ) susidėjo iš 20 pmol pradmenų, specifinių gripo viruso A (H3) arba A (H1) , arba B kamienų HA geno 5' ir 3' galams, nustatytų pagal konsensusines sekas, rastas GenBank DNR duomenų bazėje (lentelė 2). Amplifikacija vykdyta 30 ciklų, kiekvieną ciklą sudarė 1 min denatūracijai 94°C, 2 min 55° C sujungimui ir 3 min 72° C ekstencijai. PGR produktai tirti 0.8% agarozės geliuose atrenkant pagal dydj prieš klonavimą.
Lentelė 2. Pradmenys, naudoti PGR amplifikacijai
A/Pekinas/
32/93
5' galo genas (SEQ ID No. 27) 5' GGG GGA TCC GGT ACC AGC AAA AGC AGG GGA TAA TTC TAT 3' BamH1 Kpn1
5’ galas be HA signalinio peptido (SEQ ID No. 28) 5' GGG GGT ACC CCC GGG GAC TTT CCA GGA AAT GAC AAC AG 3' Kpn1 Sma1
3' galas (SEQ ID No.29) 3’ TAA TTA ATT TTT GTG GGA ACA AAG ATC CTA AGC CAT GGC CC 5’ Kpn1
A/Teksasa s/36/91
5' galo genas 5' GGG GGT ACC CCC GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA AAA 3' Kpn1 Sma1
5' galas be HA signalinio peptido (SEQ ID No. 4) 5' GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GGC TAC CAT 3' Kpn1 Sma1
3' galas (SEQ ID No. 3) 3' GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC 5' Kpn1
B/Panama /45/90
5' galo genas (SEQ ID No. 30) 5' GGG GAA KC GGT ACC CCC GGG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC . ATG GT 3' EcoRl Kpn1 Sma1
5' galo be signalinio peptido (SEQ ID No. 31) 5' GGT ACC CCC GGG GAT CGA ATC TGC ACT GGG ATA ACA 3' Kpn1 Sma1
3' galas (SEQ ID 3' TG TTA CAA AGA ACA/G AGG TAG ACA GAC ACT CCA TGG CCT AGG
CTT AAG GGG 5’ Kpnl
No. 32) BamHl EcoFH
HA geno 5' galo PGR pradmenys: 5' - GGG GGT ACC CCC GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA AAA-3' (SEQ ID No. 2) ir HA geno 3' galo : 5' - GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3' (SEQ ID No. 3) naudoti PGR viso ilgio HA geno sintezei.
Naujas 5' PGR pradmuo sukurtas geno 5'-galui: 5' galo minus signalinė seka: 5' -GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GGC TAC CAT -3' (SEQ ID No.4) ir geno 3' galo: 5' -GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CC- 3' (SEQ ID No.5). Jie panaudoti PGR HA geno be signalinio peptido sekos gavimui. Po to šis genas įterptas j TA vektorių suskaidytą Kpn\. 61K signalinis peptidas bakuloviruso ekspresijai ir polihedrino promotoriui buvo įterptas į TA vektorių, turintį HA geną be signalinio peptido sekos. Gautas bakuloviruso rekombinantinis vektorius turi polihedrino promotorių, 61K bakuloviruso signalinj peptidą ir gripo viruso A/Teksasas/36/91 HA geną.
Gripo viruso B kamienų HA genai klonuoti panaudojant totalinę mesendžerinę RNR (mRNR), išskirtą iš MDCK ląstelių, užkrėstų B kamieno gripo virusu B/Panama/45/90. Totalinė RNR išskirta iš infekuotų ląstelių, augintų T175 flakonuose. Surinktos ląstelės lizuotos pridėjus guanidiumo tiocianato ir išskirta totalinė RNR panaudojant būdą, aprašytą aukščiau. Totalinė mRNR išskirta iš ląstelinės RNR panaudojant Oligo- (dT) celiuliozės pluošto kolonėles pagal aukščiau aprašytą būdą.
Gripo viruso B kamienų mRNR gavimui pradmeniu naudotas atsitiktinis oligonukleotidinis DNR pradmuo (Pharmacia, Ine.).
Pateikiamas pavyzdys reagentų, naudotų cDNR sintezei, kuomet gripo viruso A/Teksasas/36/91 virusinė RNR buvo panaudota kaip matrica. cDNR segmentų, koduojančių gripo viruso baltymus, lokalizacija apibūdinama sekančiai. Išskirta virusinė RNR reakcijos mišinyje buvo sujungta su universaliu vienasiūlės DNR pradmeniu 5' AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID No. 1). Šis pradmuo komplementarus gripo viriono 3' galo segmentui, aprašytam aukščiau. Reakcijos mišinyje taip pat buvo pridėta ir [a-32P]dCTP tam, kad būtų vizualizuoti cDNR produktai, kurie buvo išskirti 1.5% šarminės hidrolizės gelyje (Maniatis ir kt., 1982) ir eksponuoti ant X-OMAT-AR filmo.
Pavyzdys 3: HA genų klonavimas bakterinėse plazmidėse
Amplifikuoti PGR būdu rHA genai klonuoti pUC tipo plazmidiniame vektoriuje panaudojant TA Klonavimo Sistemą (Invitrogen, Ine.). HA genų buvimas verifikuotas plazmidinės DNR, išskirtos standartiniu būdu (Maniatis ir kt., 1982), restrikcijos fermentų analize. rHA genų 5' galas ištirtas nustatant DNR sekas ir sukurti nauji pradmenys sekų, koduojančių HA baltymų N-galo hidrofobinj signalinį peptidą, pašalinimui. Specifiniai 5' ir 3' galo oligonukleotidiniai pradmenys, išvardinti lentelėje 2, panaudoti cDNR produktų amplifikacijai PGR būdu ir po to klonuoti E. coli TA plazmidiniame vektoriuose (invitrogen, Ine.) panaudojant standartinius klonavimo metodus. Gauti DNR klonai turėjo sekas, koduojančias subrendusius HA.
A/Teksasas/36/91, A/Pekinas/353/89, A/Pekinas/32/92 ir B/Panama/45/90 rHA genai buvo subklonuoti standartiniu būdu (Maniatis ir kt., 1982) bakuloviruso ekspresijos vektoriuose. HA genai pašalinti iš TA klonavimo plazmidės panaudojant atitinkamus restrikcijos fermentus ir išskirtas HA DNR fragmentas įterptas j bakuloviruso rekombinantinę plazmidę. Gauti bakterijų klonai patikrinti pagal rezistentiškumą ampicilinui ir po to apdoroti restrikcijos fermentais tam, kad būtų išlaisvintas įterptas HA genas ir patvirtintas jo buvimas. Rekombinantinės plazmidės, turinčios HA genus, išskirtos cezio chlorido-etidijum bromido gradiente (Maniatis ir kt., 1982). Plazmidžių 5' galas sekvenuotas tam, kad būtų nustatytas buvimas teisingų bakuloviruso signalų ( AcNPV polihedrino promotorius, ATG transliacijos starto signalas ir bakuloviruso. signalinio peptido seka) ir atitinkama HA koduojanti seka teisingame skaitymo rėmelyje. HA genų 5' galo DNR sekos ir ribojantis AcNPV polihedrino promotorius ir bakuloviruso signalinis peptidas (pirmosios 18 aminorūgščių) parodyti SEKŲ LAPE.
SEQ ID No.6 koduoja gripo viruso A/Pekinas/32/92 HA geno 5' galo sekas (sekos 1-481). SEQ ID No. 7 yra atitinkama aminorūgščių seka (pradžia starto kodone ATG [nukleotidas 21] SEQ ID No.6). 61K signalinio peptido amino rūgščių seka yra ketvirtas rinkinys SEQ ID No.7 kaip aminorūgštys 1-18.
SEQ ID No.8 koduoja gripo viruso A/Teksasas/36/91 HA geno 5' galo sekas (sekos 1-481). SEQ ID No.9 yra atitinkama aminorūgščių seka (pradžia starto kodone ATG [nukleotidas 21] SEQ ID No8). ). 61K signalinio peptido amino rūgščių seka yra ketvirtas rinkinys SEQ ID No.9 kaip aminorūgštys 1-18
SEQ ID No.10 koduoja gripo viruso B/Panama/45/90 HA geno 5' galo sekas (sekos 1-434). SEQ ID No.11 yra atitinkama aminorūgščių seka (pradžia starto kodone ATG“ [nukleotidas 21] SEQ ID No10).). 61K signalinio peptido amino rūgščių seka yra ketvirtas rinkinys SEQ ID No.11 kaip aminorūgštys 1-18.
SEQ ID No. 6, 8 ir 10 nukleotidai 1-20 yra polihedrino promotoriaus 3' galas, nukleotidai 21-74 koduoja 61K signalinj peptidą ir gale nukleotidai pradedant 75 koduoja HA geno 5' galą.
Pavyzdys 4: rekombinantinio HA ekspresija vabzdžių ląstelėse
Chimerines rekombinantinės plazmidės, turinčios klonuotus HA genus, išskirtos ir 2ųg sumaišyti su 1 pg AcNPV laukinio tipo DNR. DNR kalciu koprecipituota ir standartiniu metodu transfekuota j S. frugiperda ląsteles (Smith, Summers, Fraser. Mol. and Cell. Biol. 3: 2156-2165 (1983). Rekombinantiniai bakulovirusai identifikuoti pagal jų poveikio zonos morfologiją ir po to išskirti atliekant pakartotinius užkrėtimus ir atrenkant poveikio zonas. Išskirti rekombinantiniai bakulovirusai ištirti, ar ekspresuoja rHA, ir tolimesniai darbo eigai atrinktas vienas bakuloviruso ekspresijos vektorius.
S. frugiperda ląstelės užkrėstos bakuloviruso vektoriumi, turinčiu gripo viruso B/Panama/45/90 HA geną. Praėjus 24, 48 ir 72 vai. po infekcijos, 1 x106 ląstelių 15 min. inkubuota su 25 Ci [35S]metionino tam, kad pasižymėtų naujai sintezuoti baltymai. Po to ląstelės surinktos ir išskirti baltymai, tam tikslui panaudojant 11% poliakrilamido geli su 0.1% SDS. Radioaktyviai pažymėti baltymai detektuoti eksponuojant Χ-ΟΜΑΤAR filme. Baltymo tyrimai pagal standartus ir masę kilodaltonais (kd) parodė, kad 85 kd rekombinantinis HA baltymas yra vienas didžiausių baltymų, kurie buvo sintezuoti ląstelėse praėjus 48 vai. ir 72 vai. po užkrėtimo.
Pavyzdys 5: rekombinantinio HA gamyba ir išskyrimas
Bakuloviruso ekspresijos vektorius A8611, turintis gripo viruso A/Beijing/353/89 geną, sukurtas kaip aprašyta aukščiau apie A/Beijing/32/92 hemagiiutininą, esanti polihedrino promotoriaus kontrolėje, panaudotas užkrečiant S. frugiperda ląsteles. Ląstelės kultivuotos 27° C temperatūroje 1 χ 106 ląstelių/ml tankiu TNMFH terpėje (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), j kurią pridėta 10% fetalinio veršiuko serumo, ir užkrėstos 1 infekcijos dauginimosi intensyvumu (MOI) panaudojant A8611 rekombinantinj bakulovirusą. Infekcijos metu gripo viruso A/Beijing/353/89 hemagliutininas gaminamas bakuloviruso polihedrino promotoriaus transkripcinėje kontrolėje, Praėjus 72 vai, po infekcijos, ląstelės surenkamos centrifuguojant 15 min 3,400 x g, plaunamos resuspenduojant beseruminėje TNMFH terpėje ir po to vėl centrifūguojamos 30 min. 10,400 x g. Supematantas pašalinamas ir ir infekuotų ląstelių nuosėdos saugomos -70° C.
Rastas būdas, kurio metu rekombinantinis HA yra selektyviai ekstrahuojamas iš infekuotų ląstelių tokiomis sąlygomis, kurios nedenatūruoja antigeno. Visa ekstrakcija atliekama prie 4° C. Ląstelės, surinktos iš 0.5 L kultūros (maždaug 5 χ 108 ląstelių), suardytos veikiant 2 min Polytron ™ homogeniZatoriumi (Brinkmann Instruments Ine. VVestbury, NY) ledo vonioje atšaldytame 40 mL tirpale, kuriame yra 30 mM tris-HCI, pH 8.4, 25 mM LiCI, 1% (v/v) Tween-20, 1 mg/mL leupeptino. Gautas homogenatas centrifūguotas 30 min 9,200 x g. Supematantas pašalinamas ir nuosėdos surenkamos. Šios darbo eigos metu pašalinami vabzdžių ląstelių tirpūs ir periferinių membranų baltymai ir nereikia integralinių membranų baltymų, kuriems priklauso rHA, ekstrakcijos.
Tam, kad būtų ekstrahuotas rHA, nuosėdos homogenizuojamos 2 min ledo vonioje atšaldytame 40 mL tirpale, kurj sudaro 30 mM Tris, 10 mM etanolamino, pH11,25 mM LiCI, 2% Tween-20. Po to inkubuojama 60 min ledo vonioje, homogenato pH keičiamas iki 8.4 pridedant 1N HCI ir netirpioji frakcija pašalinama centrifuguojant 30 min 9,200 x g. Supernatantas, turintis tirpų rHA, surenkamas, patikrinamas ph ir, jeigu reikia, keičiamas iki 8.4 kambario temperatūroje. Netirpi frakcija resuspenduojama 40 mL vandens analizei. HA integralus membranos baltymas soliubilizuojamas esant aukštam pH, Tween-20 detergente ir lieka tirpus net sumažėjus pH.
Baltymai tirti SDS poliakrilamido gelio elektroforezės metodu. Pavyzdžiai suardyti verdančio vandens vonioje 2% natrio dodecilsulfato (SDS) ir 5% beta-merkatoetanolio tirpale, po to elektroforezuoti 11% polakrilamido gelyje, kuriame buvo 0.1% SDS, ir nudažyti Coomassie mėliu.
Rekombinantinio HA išskyrimui panaudota chromatografija, kurios metu gautas labai išgrynintas rekombinantinio HA antigenas, kuris buvo nedenatūruotas ir tiko kaip komponentas žmogaus gripo vakcinos gamybai. Sekantis būdas buvo panaudotas gripo viruso A/Pekinas/353/89 HA išskyrimui iš S. frugiperda ląstelių, užkrėstų rekombinantinių virusu A8611.
HA išskyrimo iš 0.5 L infekuotų S. frugiperda ląstelių metu chromatografijos gelio matricoms naudota - 30 mL Pharmacia DEAE greitos tėkmės Sefarozė (Pharmacia C16/20 kolonėlė) ir 4 ml_ Pharmacia Lęšinio Lėktino Sefarozė 4B (Pharmacia' C10/10 kolonėlė). DEAE kolonėlės išleidimas buvo sujungtas su lęšinio lėktino kolonėlės įleidimu, ir S/N 2 ląstelių ekstraktas, paruoštas kaip aprašyta aukščiau, įvestas į suporintas kolonėles tėkmės greičiu 1mL/min. Kolonėlės plautos-30 mM Tris-HCI, pH 8.4, 25 mM LiCI. 0.5% Tween-20, pakol lęšinio lėktino efluento 280 nm UV absorbcija sugrįžo prie pamatinės linijos. Esant šioms sąlygoms, dauguma pašalinių baltymų jungėsi prie DEAE, o rekombinantinis HA pratekėjo pro kolonėlę. Likusieji kontaminantai praėjo pro lęšinio lėktino kolonėlę, o glikozilintas rHA prisijungė prie lęšinio lėktino afininės matricos. DEAE kolonėlei buvo atjungta, o lektininio lęšio kolonėlė praplauta kita porcija 40 mL 30 mM tris-HCI, 25 mM LiCI. 0.5 naudota Tween-20. Po to lektininė kolonėlė praplauta 40 mL 30 mM TrisHCI, pH 8.4, 25 mM LiCI, 0.4 % (v/v) natrio dezoksicholato (DOC). Šio plovimo metu detergentas Tween-20 pakeičiamas kitu detergentu - DOC, kuris gali būti pašalintas nuo baltymo dializės metu. Rekombinantinis HA eliuotas iš lektininės kolonėlės panaudojant 20 mL‘ iš 40 ml_ 30 mM TrisHCI, pH 8.4, 25 mM LiCI, 0.4% (v/v) natrio dezoksicholato, turinčio 0.3 M a - D -metilo manozido. Gautas baltymas ištirtas PAGE būdu.
Dėl gripo viruso HA baltymų genetinio variabilumoaukščiau aprašyta išskyrimo eiga gali varijuoti, priklausomai nuo kiekvieno unikalaus rekombinantinio HA baltymo. Pavyzdžiui, rHA gali jungtis prie DEAE jonų kaitos kolonėlės vietoje to, kad ją pratekėtų. Jeigu tai atsitiktų rHA galima būtų pašalinti iš DEAE kolonėlės plaunant kolonėlę buferiu, turinčiu didesnes LiCI, NaCl ar kitų druskų koncentracijas.
Tam, kad būtų pašalinta DOC detergentas bei kiti buferio komponentai. Lektininės kolonėlės eliuatas, turintis išskirtą rHA, buvo dializuotas panaudojant fosfatais užbuferintą druskos tirpalą, pH 7.5 (PBS), Išskirtas rekombinantinis rHA, patikrintas SDS poliakrilamido gelio elektroforeze, pasirodė besą mažiausiai 95% grynumo.
Pavyzdys 6: rHA atsparumo proteazei analizė
Subrendę HA buriasi į trimeres struktūras, kurios yra atsparios įvairių proteazių, įskaitant tripsiną, poveikiui, kai tuo tarpu HA monomerai yra jų degraduojami (Murphy ir VVebster, 1990). Todėl atsparumas tripsino poveikiui gali būti panaudotas kaip funkcionalaus trimero susidarymo įrodymas. rHA atsparumas proteazės poveikui patikrintas sekančiu būdu.
Išskirto r-HA (A/Pekinas/353/89) du bandiniai po 60 ąg/mL buvo inkubuoti 30 min. ledo vonioje su 30 mM Tris-HCI, pH 8.4, 150 mM NaCl, pridėjus ar nepridėjus 50 //l/mL TPCK-paveikto tripsino. Reakcija sustabdyta pridėjus 57.4 mM fenilo metilo sulfonilfluorido izopropanolyje iki 1 mM galutinės koncentracijos. Kiekvieno bandinio reakcijos mišinys denatūruotas virinant 3% SDS redukcinėmis sąlygomis, po to tirti elektroforezės 11.5% poliakrilamido geliuose būdu ir pernešti ant nitroceliuliozės filtrų pagal standartinį VVestern blotingo metodą. HA polipeptidai nustatyti panaudojant jūros kiaulyčių anti-HA serumą, gautą imunizuojant išskirtu rHA, ir ožkos antiserumą jūros kiaulytės imunoglobulinams, konjuguotą su šarmine fosfataze.
Nepaveiktas rHA keliauja kaip HA pirmtakas (HAO). Paveikus proteaze, gaunamos dvi pagrindinės juostos, kurios keliauja kaip gripo viruso hemagliutininas HA1 ir HA2. Gauti rezultatai parodė, kad tripsinas skaido rHA baltymą į du polipeptidus, kurie yra panašaus j HA1 ir HA2 dydžio. Tolimesnė proteolizė nebevyksta. Šie rezultatai rodo, kad rHA, išskirtas aukščiau aprašytu būdu, yra atsparus proteazės degradacijai. Šis ypatumas susijęs su išskirtojo rHA trimerine forma.
Pavyzdys 7: rHA imunogeniškumo nustatymas standartiniu pelių potencijos įvertinimo būdu.
Vienas iš antigeno imunogeniškumo nustatymo būdų yra kiekio, reikalingo apčiuopiamo antikūnų atsako pelėse indukcijai, nustatymas (pelių potencijos įvertinimo būdas). Standartinis pelių potencijos potencijos įvertinimo būdas naudojamas rHAO vakcinos imunogeniškumo nustatymui. 5-10 pelių grupės vieną kartą imunizuojamos vakcina, turinčia įvairius išskirto rHA atskiedimus, pvz., 0.500 pg, 0.1 pg, 0.02 pg, ir 0.004 pg. Serumai surenkami praėjus 28 dienoms po imunizacijos ir naudojant standartini imunofermentinės analizės metodą (ELISA) 96 šulinėlių mikroplokštelėse, nustatomi antikūnai rHA antigenui. Pelė laikoma serokonvertuota, .jeigu OD450 esant 1:100 atskiedimui yra didesnis negu trys standartiniai nuokrypiai nuo pelės preimuninio · serumo OD450 vidurkio. Vakcinos efektyvi dozė, reikalinga pelės 50 % serokonversijai (ED50), yra antigeno imunogeniškumo matas.
Pavyzdžiui, keturios grupės po 10 pelių, yra imunizuojamos vieną kartą rHAO vakcinos arbaO.lpg, 0.02 pg, 0.004 pg, arba 0.0008 pg (5kartis atskiedimas). Serumai surenkami praėjus 28 dienoms po imunizacijos ir ELISA metodu įvertinama serokonversija rHAO antigenui. Dozė, reikalinga pelės 50 % serokonversijai (ED50) apskaičiuojama kaip minimali ED50, nustatyta kiekvienam rHA antigenui.
Preliminarus duomenys rodo, kad vienkartinė rHAO 0.004 pg dozė sukels pelių 50% serokonversiją.
Pavyzdys 8: rHA panaudojimas derinyje su adjuvantu ir palyginimas su kitomis komercinėmis gripo viruso vakcinomis.
Pelių potencijos įvertinimo būdu testuotas išskirto gripo viruso A/Pekinas/353/89 rHA imunogeniškumas panaudojant jj drauge su alūnu arba be jo (gryną) ir palygintas su komercine gripo viruso vakcina, FLUZONE® (Connaught Laboratories, Ine. Swiftwater, PA), turinčia gripo virusą A/Pekinas/353/89. Naudotos šios vakcinos dozės 0.5 pg, 0.1 pg. 0.02 pg ir 0.04 pg. 28 dieną pelės buvo paskiepytos išskirto rHA dozėmis, nurodytomis aukščiau. 42 dieną serumai surinkti ir titruoti naudojant ELISA būdą ir nustatant IgG anti-HA antikūnus.
Rezultatai pateikti Fig. 3. Imunizuojant be adjuvanto, tik 0.5 pg doze indukavo žymesnį antikūnų gamybos titrą (200,000). Naudojant su adjuvantu, prireikė tik tokios mažos, kaip 0.004 pg, rHA dozės, kad būtų indukuoti žymūs antikūnų titrai. Gyvuliukai, imunizuoti rHA (grynu) produkavo beveik tuos pačius anti-rHA antikūnų kiekius kaip ir imunizuotieji komercine vakcina. Alūnas padidino rHA imunogeniškumą ir buvo indukuoti tokie anti-rHA antikūnų titrai, kurie buvo 10 kartų ar daugiau didesni negu imunizuojant be adjuvanto.
Tokiu būdu, išskirtų rHAO imunogeniškumo palyginimas su gripo viruso pilno viriono vakcina FLUZONE® (Connaught Laboratories, Ine. Swiftwater, PA) rodo, kad rHAO sukelia pelėse panašų imuninį atsaką 42 dienų laikotarpyje. rHAO absorbcija alūnu ženkliai padidina išskirto rHAO imunogeniškumą pelėse, kaip tai buvo įvertinta būdu, aprašytu 7 pavyzdyje. Imunizuojant derinyje su alūnu indukuojami didesni IgG hemagliutininiai antikūnų kiekiai negu imunizuojant gripo vakcina FLUZONE®'
Pavyzdys 9: Hemagliutinacijos slopinimo tyrimai.
Hemagliutinacijos inhibicijos (HAI) antikūnai jungiasi prie trijų iš keturių žinomų hemagliutinino epitopų ir blokuoja gripo viruso gebą agliutinuoti eritrocitus (Wilson ir kt., Gripo viruso apvalkalėlio glikoproteino hemagliutinino sandara 3A skiriamoje geboje, Nature, 289: 366-378 (1981). Šie antigeniniai determinantai yra susikaupę apie hemagliutininių trimerų sialo rūgšties receptoriaus jungiamąją vietą. Antikūnai šioms vietoms neutralizuos viruso infektyvumą (Weis ir kt., Gripo viruso hemagliutinino, sujungto su jo receptoriumi, sialo rūgštimi, sandara, Nature, 333: 426-431 (1988). HAI antikūnų titras ir specifiškumas yra svarbus gripo viruso vakcinos apsauginės galios prieš panašių ar giminingų gripo viruso kamienų infekciją rodiklis.
Tyrimai atlikti pelėse palyginant iš kamieno A/Pekinas/353/89 išskirto rHA ir vakcinos FLUZONE® (Connaught Laboratories, Ine. Swiftwater, PA) sugebėjimą indukuoti HAI antikūnus. Grupėms po 5 peles 0 ir 28 dieną suleista po 0.5 pg, 0.1 pg. 0.02 pg ar 0.04 pg rHAO arba tris kartus didesnes dozes FLUZONE® hemagliutinino taip, kad būtų suleisti vienodi rekombinantinio ar virusinio A/Pekinas/353/89 hemagliutinino kiekiai. Pavyzdžiui, didesnės dozės grupės pelės buvo imunizuotos 1.5 ?g FLUZONE® hemagliutinino (kiekvieno kamieno po 0.5 pg hemagliutinino) ir 0.5 pg rHAO. Tai, kad FLUZONE® yra papildomas hemagliutininis antigenas dėl kitų dviejų gripo viruso kamienų, gali būti kai kurių kryžmiškai reaguojančių antikūnų priežastimi.
Anti-hemagliutinininiai antikūnai (hemagliutinininiai IgG) nustatyti standartiniu skiedimo ELISA metodu kaip antigeną naudojant rHAO. HAI antikūnai įvertinti prieš 4,sekančių antigenų hemagliutinino vienetus: pilnas gripo kamieno A/Pekinas/353/89 virusas (A/bei), išskirtas iš kamieno A/Pekinas/353/89 rHA antigenas, ir FLUZONE® . HAI titrai yra reciprokiniai didžiausio antiserumo atskiedimo, slopinančio 50 % viščiuko eritrocitų agliutinaciją, atžvilgiu.
Lentelėje 3 susumuoti pelių serumo hemagliutinino IgG ir HAI titrai 42 dieną. Dideli anti-hemagliutinino antikūnų kiekiai gauti imunizuojant rekombinantinio rHA vakcina. Jų titrai buvo apie 10 kartų didesni negu FLUZONE® atveju. Svarbiausia yra tai, kad rHAO vakcina sąlygojo gerus titrus antikūnų, blokuojančių eritrocitų agliutinaciją, kurią galėjo sukelti A/pekinas/353/89 virusas ir rHAO antigenai. Tokiu būdu, rHAO vakcina indukavo HAI antikūnus, kurie gerai atpažino tiek pati imunogeną, tiek ir gripo virusą A/Pekinas/353/89. Žemesni HAI titrai FLUZONE® .atveju gali būti sąlygoti antiserumo nesugebėjimo blokuoti agliutinaciją, kurią sukelia kitų kamienų virusų, esančių FLUZONE® hemagliutininas. Tuo tarpu, priešingai, pelės, imunizuotos FLUZONE®, gamina didelius HAI antikūnų titrus, kurie nustatomi tik prieš FLUZONE® antigenus. Tuo tarpu HAI titrai prieš gripo virus1 A/Beijing/353/89 ir rHA antigeną yra sumažėję. Panašus atsakas stebėtas ir žemesnių dozių grupėse.
Šie duomenys taip pat pagrindūia prielaid1, kad galimi genetiniai skirtumai tarp gripo viruso kamieno A/Pekinas/353/89, esančio FLUZONE® ir to paties viruso kamieno, gauto iš FDA ir auginto kiaušinyje, kol buvo atliktas HAI testas. Tai, kad antikūnai, pasigaminę atsakant į rekombinantini HAO, gautą klonuojant gripo viruso kamieną A/Pekinas/353/89, blokuoja eritrocitų agliutinaciją, kurią sukelia šio kamieno gripo virusas, jau savaime yra geras įrodymas , kad klonavimo eigoje neįvyko genetiniai pokyčiai, galėję paveikti sialo rūgšties receptoriaus sujungimo vietą, esančią išskirtame rHAO antigene.
Lentelė 3 HAI titrai rHAO ir FLUZONE® atžvilgiu
RHA A/Bei (42 diena) FLUZONE® (42 diena)
HA IgG HAI HA IgG HAI
Pelė rHAO A/Bei rHA FLUZ ONE® rHAO A/Bei RHAO FLUZ ONE®
1 4,096,000 1,920 960 15 256,000 <10 <10 600
2 4,096,000 480 480 15 512,000 120 120 600
3 8,192,000 1,920 960 15 256,000 60 60 300
4 4,096,000 960 960 30 128,000 30 30 400
5 4,096,000 1,920 960 60 512,000 80 80 400
Vidur kis 4,915,000 1,440 864 27 332,800 58 58 460
Pavyzdys 10: 1993/1994 gripo vakcinos vaisto forma ir klinikinis efektyvumas
Su žmonėmis atlikta kelios serijos klinikinių tyrimų nustatant eksperimentinės gripo vakcinos, j kurios sudėtį įeina rekombinantinis HA, saugumą ir imunogeniškumą bei gaunant preliminarius duomenis apie tokios vakcinos apsauginį efektyvumą prieš natūralią infekciją epideminio sezono metu. Gauti rezultatai rodo, kad vakcinos, turinčios savo sudėtyje rekombinantinį gripo viruso hemagliutininą (rHAO), pagamintos pagal aukščiau aprašytą metodiką, sukėlė stebėtinai mažai pašalinių vietinių reakcijų ir sąlygojo ekvivalentinį ar didesnį apsauginį imunini atsaką, palyginus su komercine, licenzine atenuota gripo vakcina, pagaminta auginant virusą kiaušiniuose.
MEDŽIAGA IR METODAI
Vakcinos. Rekombinantinės HA vakcinos, naudotos šiame tyrime, savo sudėtyje turėjo pilno ilgio nesuskaldytą HA (HAO) (H3N2) virusą. Rekombinantinis HAO (rHA) produkuotas Lepidopteran (vabzdžių) kultūros ląstelėse, kuomet j jas buvo eksponuotos su bakuloviruso vektoriumi, savo sudėtyje turinčiu cDNR su HA koduojančiu genu. Ekpresuotas baltymas buvo išskirtas nedenatūruojančiomis sąlygomis iki >95% grynumo, vertinant kiekybine skenuojančia densitometrija antigeną, gautą po elektroforezės natrio dodecilsulfato poliakrilamido geliuose. Peptidas identifikuotas panaudojant aminorūgščių analizę, N-terminalinj sekvenavimą ir VVestern bloto analizę su antiserumu prieš gripo virusą A/Pekinas/32/92. rHAO vakcinos turėjo nustatytą kiekį sintetinio HA antigeno, ištirpinto fosfatais užbuferintame druskos tirpale arba aliuminio fosfato (alūno) adjuvanto adsorbuoto gelio suspenzijos formoje. Licenzinė trivalentinė subviriono vakcina, naudota šiame tyrime, turėjo po 15 ?g/dozei įvairių gripo viruso kamienų A/Teksasas/36/91 (N1N1), A/Pekinas/32/92 (H3N2) ir B/Panama/45/90 hemagliutininų (FLUZONE® atenuotos gripo vakcinos, pagamintos kiaušiniuose, Connaught Laboratories, Swiftwater, PA).
Klinikiniai tyrimai. Saint Louis Universiteto ir Rochester Universiteto Institucinių Peržiūrų Tarybos išbandė tapačius tyrimų protokolus. Abiejų institucijų organizuotuose tyrimuose dalyvavo sveiki suaugę žmonės nuo 18 iki 45 metų amžiaus. Tiriamieji buvo parinkti atsitiktinai tam, kad panaudotų vieną iš sekančių penkių vakcinų pagal dvigubo-aklumo būdą: (1) 15 p.g rHAO, (2) ąg .rHAO plius alūnas, (3) 90 μρ rHAO, (4) licenzine trivalentė inaktyvuota gripo viruso vakcina, arba (5) druskos tirpalo -placebo. Vakcinos suleistos j raumenis 0,5 ml tūryje. Tam, kad būtų preliminariai įvertintas trijų vakcinų preparatų, j kurių sudėtj įėjo rHAO, saugumas, pirmieji 25 asmenys buvo vakcinuoti randomizuotai (t.y. 5 asmenys tyrimui) nepriklausomai nuo kitų asmenų ir buvo sekami apklausiant telefonu 48 vai po vakcinacijos pakol vėl bus atiktos likusios vakcinacijos.. Visi asmenys buvo apmokyti, kaip pirmąsias 6 dienas po vakcinacijos pildyti kasdienę pašalinių reakcijų stebėjimo kortelę, Įskaitant tiek vietinius, tiek sisteminius simptomus. Simptomai buvo suskirstyti j silpnai išreikštus, vidutinius ir stipriai išreikštus. Temperatūra matuota kasdien oraliniu būdu ir tyrimų dalyviai ją užrašydavo karščiavimo atveju. Injekcijos vietoje atsiradęs patinimas ar paraudimas buvo įvertinami pagal pasireiškimo laipsnį priklausomai nuo to, ar plotas savo diametru buvo didesnis ar mažesnis už ketvirčio dolerio monetą. Visos vakcinacijos atliktos laikotarpyje tarp 1993 metų lapkričio mėnesio paskutinės savaitės ir gruodžio mėnesio pirmosios savaitės. Serumo bandiniai imti iš kiekvieno tiriamojo prieš pradedant vakcinaciją, 3 savaitės po vakcinacijos ir dar vieną kartą 1994 metais kovo pabaigoje ar balandžio mėnesį, praėjus mažiausiai 2-3 savaitėms po to, kai gripo virusai jau nebecirkuliavo vietinėje bendruomenėje. Kiekvienoje institucijoje savanoriai buvo apmokyti, kaip susisiekti su tyrimų centru, jeigu pajustų j gripą panašius požymius žiemos epideminio sezono metu. į gripą panašiems požymiams buvo priskiriami bet kuris respiratorinis simptomas (ai), besitęsiantys dvi ar ilgiau dienų ir lydimas karščiavimo ir/ar tokių sisteminių simptomų kaip raumenų skausmai ar šalčio krėtimas. Iš asmenų, kurie pranešdavo apie į gripą panašius simptomus, buvo imami šluostiniai bandiniai iš nosies ir ryklės tam, kad būtų gauta viruso kultūra ir virusas būtų identifikuotas. Klinikiniai bandiniai buvo numeruojami koduojant ir tiriami aklai.
Serologija. Kiekvienam serologiniam tyrimui abiejų institucijų visi bandiniai buvo testuoti kaip vienas rinkinys vienoje laboratorijoje. Hemagliutinacijos inhibicijos (HAI) antikūnai gripo viruso A/Pekinas/32/93 (H3N2) antigenui nustatyti serumuose - panaudojant standartinį mikrotitravimo būdą, prieš tai pašalinus nespecifinį inhibitorių receptorių skaidančiu fermentu bei šalčio agliutininus tam tikslui panaudojus hemadsorbciją 4° C. Titras nustatytas. kaip didžiausias serumo atskiedimas, kuris apsaugo nuo hemagliutinacijos viruso 4 antigeninius vienetus, pradėjus skiesti serumą nuo 1 : 4. Serumo HA-specifiniai imunoglobulininiai G (IgG) antikūnai tirti imunofermentiniu metodu (ELISA), panaudojant išskirtą gripo viruso A/Pekinas/32/93 (H3N2) rHAO kaip dengianti antigeną. Kietoje fazėje naudotų reagentų seka buvo ši: (1) išskirtas rHAO antigenas, (2) serumo bandinys, (3) su šarmine fosfataze konjuguotas ožkos serumas prieš žmogaus IgG, ir (4) p-nitrofenilo dinatrio fosfato substratas. ELISA titras išreikštas kaip didžiausias atskiedimas, kuriam esant šulinėlio, padengto antigenu, optinis tankis yra bent du kartus didesnis negu atitinkamo kontrolinio šulinėlio be antigeno. Neutralizuojantys antikūnai išmatuoti panaudojant mikroneutralizacijos testą, anksčiau aprašytą pas Treanor J.J., Betts R.F.. J. Infect. Dis. 168: 455-459 (1993). Trumpai, karščiu inaktyvuoto serumo serijiniai skiedimai buvo sumaišyti su gripo viruso A/Pekinas/32/93 (H3N2) maždaug 100 TCID50 ir inkubuoti 37° C 1 vai. Po to viruso-serumo mišinys adsorbuotas ant Madin-Darby šuns inksto ląstelių (MDCK) ištisinio vienasluoksnio 96šulinėlių planšetėse 1 vai. kambario temperatūroje. Planšetės atplautos, kad būtų pašalintas likęs inokuliumas, pripilta beseruminės Dulbecco MEM terpės su 2μg/ml tripsino ir inkubuota 5% CO2 atmosferoje 33° C 72 vai. Ląstelės fiksuotos metanoliu ir viruso replikacija įvertinta panaudojant pelių monokloninių antikūnų, specifinių matriksui ir gripo viruso A kamieno nukleoproteinams panelį (Ligų Kontrolės Centrai, Atlanta.GA) bei po to sekančiame etape - su šarmine fosfataze konjuguotus antikūnus pelių IgG. Galutinis serumo titras nustatytas kaip didžiausias jo atskiedimas, sąlygojantis didesnį negu 50% signalo sumažėjimą palyginus su kontroliniais neneutralizuotais šulinėliais.
Virusologija. Nosiaryklės šluostinių bandinių virusų kultūros užaugintos kiekvienoje institucijoje naudojant standartinius metodus, Bandiniai inokuliuoti arba j MDCK, arba rhesus beždžionių inkstų ląsteles ir inkubuoti 33° C 4 dienas. Hemadsorbcija ant ląstelių vienasluoksnių išbandyta panaudojant 0.4% jūros kiaulytės eritrocitų suspenziją, Gripo virusai identifikuoti HAI būdu hemadsorbcijos pozityviose kultūrose panaudojant H3-specifinius antiserumus (Ligų Kontrolės Centrai).
Statistinė analizė. Statistinei analizei reciprokiniai HAI, ELISA IgG ir neutralizuojančių antikūnų titrai buvo logaritmiškai transformuoti. Žymiu atsaku j vakcinaciją buvo laikomas 4-kartis ar didesnis antikūnų titrų pakilimas, nustatytas palyginus antikūnų titrą prieš vakcinaciją su antikūnų titru, praėjus 3 savaitėms po vakcinacijos. Gripo viruso A (H3N2) infekcijos laboratorinis įrodymas buvo laikomas tuomet, jeigu iš nosiaryklės išskyrų buvo išsirtas virusas ir/arba serume buvo nustatytas 442 kartis ar didesnis HAI antikūnų titras tarp postvakcinacijos 3 savaitės (prieš sezoną) bandiniuose, surinktuose gruodžio mėnesį ir atitinkamuose posezoniniuose bandiniuose, surinktuose sekantį pavasarį. Skirtumai tarp vakcinuojamų grupių išanalizuoti naudojant Fisher'io tikslųjį testą, skirtą palyginti asmenų su pašalinėmis reakcijomis kiekį, žymų antikūnų atsaką arba laboratoriškai patvirtintą gripo susirgimą ar infekciją, o taip pat panaudojant variantų analizę (ANOVA) tam, kad būtų palyginti postvakcinaciniai vidurkiniai reciprokiniai log2 antikūnų titrai. Modifikuoti Bonferroni nelygybės ir Tukey-Kramer testai buvo panaudoti daugybiniams galimiems palyginimams.
REZULTATAI
Reaktogeniškumas. rHAO vakcinos, naudotos šiame tyrime, buvo saugios ir gerai toleruojamos. Pašalinių reakcijų dažnis nebuvo įtakojamas besikeičiančių rHAO antigeno dozių nuo 15 pg iki 90 pg, tačiau jos nežymiai padažnėdavo pridėjus alūno. Vietinis paraudimas, skausmas ir jautrumas injekcijos vietoje buvo stebimi žymiai dažniau, kai recipientai naudojo licenzinę subviriono vakciną, negu tada, kai recipientai naudojo arba 15 pg, arba 90 pg rHAO druskos tirpale. Išskirtinai tik vienas asmuo patyrė stiprų skausmą, jautrumą ir nepatogumą žąste po imunizacijos licenzine vakcina, kai tuo tarpu kitiems visi simptomai buvo priskirti vidutiniškai išreikštiems ir tęsėsi 1-2 dienas. Jei išsivystydavo vietinis paraudimas ir/ar sukietėjimas, jis buvo mažesnis negu ketvirčio dolerio moneta.
Imunogeniškumas. Pagrindiniai serumo HAI titrai gripo viruso A/Pekinas/32/92 (H3N2) buvo mažesni ar lygūs 1 8 pas 64 (50%) asmenis iš 127 tiriamųjų. Dauguma asmenų kiekvienoje iš 4 vakcininių grupių pasižymėjo HA-specifiniais serologiniais atsakais, įvertintais HAI ir ELISA- būdais (lentelė 4). Serume HAI antikūnų postvakcinaciniai titrai buvo didesni arba lygūs 1 : 32 pas visus vakcinos recipientus, išskyrus du asmenis, kurių vienas gavo 15 pg rHAO, o kitas gavo licenzine vakciną. Atrodo, kad pas daugumą savanorių vakcinacija buvo susijusi su neutralizuojančių antikūnų produkcija. Vidutiniškai antikūnų titrų ir serokonversijos lygio pakilimas turėjo tendenciją būti truputi mažesniu po imunizacijos 15 pg rHA, palyginus su licenzine vakcina, tačiau šie skirtumai statistiškai nebuvo patikimi. Pridėjus alūno, antikūnų atsakas j rHAO nepadidėjo. Pas asmenis, imunizuotus 90 ųg rHAO, vidutiniškai postvakcinaciniai HAI ir ELISA IgG antikūnų titrai buvo nuo dviejų iki penkių kartų aukštesni negu bet kurioje kitoje iš trijų vakcinavimo grupių (skirtumai buvo statistiškai patikimi palyginus serumo HAI titrus). Apsauginis efektyvumas. Tiriamuoju laikotarpiu 26 asmenys pranešė apie 28 j gripą panašius susirgimus. Keturi iš šių individų (trys iš jų gavo placebo ir vienas buvo imunizuotas 15 ųg rHAO) turėjo gripo A kamieno (H3N2) virusą, išskirtą iš jų nosiaryklės kultūrų. Žymus HAI antikūnų gripo virusui A/Pekinas/32/92 titrų pakilimas stebėtas tiriant presezoninius ir postsezoninius serumų bandinius trijų iš keturių kultūrose patvirtintų atvejų metu, tačiau šis reiškinys nebuvo stebėtas tiriant gripu susirgusius individus. Vienintelis rHAO recipientas, kuris vėliau susirgo laboratoriškai patvirtintu gripu, turėjo pozityvią kultūrą, gautą praėjus 31 dienai po imunizacijos ir turėjo išreikštą serokonversiją nuo prevakcinacinio HAI titro mažiau kaip 1 : 4 iki postvakcinacinio (presezoninio) titro 1 : 32. Dviems papildomiems placebo recipientams ir vienam savanoriui, imunizuotam licenzine vakcina, serologiškai įrodyta gripo viruso A (H3N2) infekcija, įvykusi epideminio sezono metu, tačiau praėjusi be klinikinių ligos požymių. Palyginant visus vakcinuotus asmenis (arba visus asmenis, gavusius bet kurią rHAO vakciną) kaip vieną grupę, žymiai didesnė placebo recipientų dalis turėjo laboratoriškai patvirtintą A kamieno (H3N2) gripo viruso sukeltą susirgimą (p< .05) arba infekciją (p<.005).
išvardinti duomenys rodo, kad gripo vakcinos, j kurių sudėti įeina išskirtas rHAO antigenas, paruoštas kaip aprašyta aukščiau patentinėje paraiškoje, yra gerai toleruojamos ir sugeba pas žmones sukelti apsauginį imuninį atsaką. Netgi naudojant 90 ųg dozę, šiame tyrime rHAO nebuvo reaktogeniškespis negu druskos tirpalo placebo ir sukėlė žymiai mažiau vietinių pašalinių reakcijų negu licenzinė trivalentė subviriono vakcina, turinti pusę (t.y. 45 ųg) totalinio HA antigeno.
Neutralizuojantys, HA-specifiniai antikūnų atsakai j 15 ųg rHAO preparatą buvo panašūs į tuos, kuriuos sukėlė subvirioninė vakcina, ir žymiai išaugo, kai rHAO dozė buvo padidinta iki 90 ųg.
Visumoje infekcijos ir susirgimų dažnis, kurį sąlygojo gamtinė ekspozicija su cirkuliuojančiu epideminiu gripo viruso A (H3N2) kamienu, buvo žymiai mažesnis tarp vakcinuotų asmenų negu tarp placebo recipientų. Duomenys leidžia prielaidą, kad apsauginis efektas, kurį sukėlė rHAO, ypač tais atvejais, kai buvo taikytas didesnėmis dozėmis, gali būti prilygintas arba yra aukštesnis už tą, kurį sąlygojo šiuolaikinės komercinės vakcinos.
Pavyzdys 11: Pagerinto HAO klonavimo vektoriaus gavimo būdas
Pagerintas klonuojantis vektorius, skirtas subrendusio HA ekspresijai, lokalizuotas tuoj pat žemiau sekos, koduojančios chitinazės signalinį peptidą, buvo sukurtas.
Lentelė 4: Serumo antikūnų atsakas pas jaunus žmones, kurie buvo imunizuoti vakcinomis, į kurių sudėtį ω
C
HAI, hemagliutinacijos inhibicija; HA, hemagliutininas; ELISA, imunofermentinės analizės metodas. Postvakcinaciniai serumų bandiniai buvo paimti praėjus 3 savaitėms po imunizacijos. Antikūnų titrai išreikšti kaip reciprokiniai vidurkiai log2±SEM. Statistiniai palyginimai atlikti tarp tam tikros grupės postvakcinacinio HAI titro vidurkio ir tarp tos vakcinacinės grupės, kuri imunizuota 90 pg rHAO, analizuojant variavimą Dunnet testu, skirtu daugybiniams palyginimams. *, P<0.01; P<0.005; #, P<0.01.
Linijinė pMGS27 su vienasiūlėmis uodegomis buvo sukurta
Plazmidėje pMGS27 HA buvo klonuotas Sma1 ar Kpn1 vietoje žemiau tuoj už chitinazės signalinio peptido. Nukleino ir aminorūgščių sekos parodytos atitinkamai kaip SEQ ID No.22 ir SEQ ID No.23:
5'- chitinazės signalinis peptidas Sma1 Kpn1
TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG ATT CCC GGG GGT ACC TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA ILE PRO GLY GLY THR
Panaudojant oligo kryptingą mutagenezę, pakeistas šis rajonas sukuriant pMGS27 (pakeistos bazės pabrauktos) (SEQ ID No. 24):
5'TGG TTA GTC GCC GTG TCCTGCAGGCCAGAGAGGCCTT GGT ACC Pst1
Plazmidė pMMGS27 paversta linijine panaudojant Pst1.
(SEQ ID No. 24 liekanos 6-35 parodytos):
A GTC GCC GTG TCC TGCA 5’ GGCCAGAGAGCC T
T CAG CGG CAC AGG 5' ACGTCCGGTCTCTCCGG A ir po to linijinė pMGS27 paveikta T4 DNR polimeraze +dATF tam, kad būtų sintezuotos vienasiūlės uodegėlės, kaip tai parodyta žemiau (liekanos 23-36 ir SEQ ID No.24 komplementarios liekanos):
A 5' GGCCAGAGAGGCC T
T CAG CGG CAC AGG 5' A
Tikslinis genas HA buvo klonuotas pMGS27 - 1 etapas. PGR pradmenys buvo sintezuoti.
Pradinis oligonukleotidas (SEQ ID No. 25):
5' GTC GCC GTG TCC AAC GGG (subrendusio HA 5' galo 20 bazių) Reversinis oligonukleotidas (SEG ID No.26 komplementarus): (subrendusio HA 3' galo 20 bazių) ATT AA
CCGGTCTCTCCGG 5'
HA geno PGR
Tikslinio HA geno PGR atlikta panaudojant du oligonukleotidus tam, kad būtų gauta (SEG ID No.25 ir SEO ID No. 26):
5' GTC GCC GTG TCC AAC GCG (subrendęs HA)
CAG CGG CAC AGG TTG CGC (subrendęs HA)
TAA TTGGCCAGAGAGGCC 3'
ATT AACCGGTCTCTCCGG
Tikslinio HA geno prijungimas prie pMGS ir E. coli transformacija
Sumaišomi linijinė pMGS27 ir T4 DNR polimerazę paveiktas HA geno fragmentas. Dvi molekulės prijungiamos viena prie kitos taip, kad susidarytų žiedinė plazmidė, kurią galima būtų panaudoti E. coli transformacijai. Diagramoje parodytas SEQ ID No. 25 ir 26, ir SEQ ID No. 24 liekanos 23-36 ir 6-18.
GTCGCCGTGTCCAACGCG (subrendęs HA) TAATT
TTGCGC ATTAACCGGTCTCTCCGG -Ι- (subrendęs HA)
Α GGCCAGAGAGGCCT
TCAGCGGCACAGG iki A
Chitinazės signalinis peptidas stop
GTCGCCGTGTCCAACGCG (subrendęs HA)TAATTGGCCAGAGAGGCCT Kaip parodyta aukščiau, čia nėra papildomų aminorūgščių tarp signalinio peptido ir subrendusio HA.
Pavyzdys 12: 1995-1996 metų trivalentės gripo viruso A ir B tipų vakcinos paruošimas ir efektyvumas.
Gripo viruso vakcina, išskirtas rekombinantinis hemagliutininas, trivalentė, tipai A ir B (A/Teksasas/36/92\1 (H1N1),
A/Johanesburgas/33/94 (H3N2) ir B/Harbinas/7/94) yra neinfekcinis subvienetas, kilęs iš išskirto rekombinantinio gripo viruso hemagliutinino antigeno (HA). Naudojant aukščiau aprašytą būdą, buvo klonuoti A ir B kamienų gripo virusų, gautų iš Ligų Kontrolės Centro/Maisto ir vaistų administravimo, HA genai ir kiekvienas klonuotas genas buvo identifikuotas pagal sekų analizės duomenis. Bakuioviruso ekspresijos vektoriai, turintys gripo viruso kamienų A/Teksasas/36/91 (H1N1), A/Johanesburgas/33/94 (H3N2), B/Harbinas/7/94 klonuotus HA genus, buvo panaudoti rekombinantinių HA antigenų produkcijai vabzdžių ląstelių kultūrose. Rekombinantiniai HA baltymai yra pilno ilgio, nesuskaldyti hemagliutininai (rHAO), jų molekulinė masė apie 69,000. rHAO produkuoti Spodoptera frugiperda (Lepidopteran) ląstelių linijoje, augintoje beseruminėje terpėje. Trivalentės vakcinos sudarytos iš išvalytų (daugiau negu 95% ar net daugiau 99% grynumo) rHA, išskirtų iš dviejų gripo viruso A kamienų ir vieno B kamieno sumaišant juos lygiomis dalimis. Vakcina pateikiama klinikiniam naudojimui kaip išvalyti A ir B tipų rHAO baltymai fosfatais užbuferintame druskos tirpale nepridedant konservanto.
Monovalentinės, bivalentinės ir trivalentinės rHAO vakcinų eksperimentiniai tyrimai, atlikti su gyvuliukais, parodė, kad jos nepasižymi žymiu toksiškumu, Vakcinoje nestebėti toksiški ar atsitiktiniai agentai. A/Pekinas/32/92 ir A/Teksasas rHAO saugumo ir imunogeniškumo tyrimai atlikti pelėse ir jūrų kiaulytėse. Nepastebėta pašalinių reakcijų. Pelėse, vienkartinė imunizacija panaudojant 15 mikrogramų rHAO antigenų be adjuvanto, per dvi - tris savaites iššaukia anti-HA IgG antikūnų, hemagliutinino inhibicijos (HAI) antikūnų ir neutralizuojančių antikūnų aukštų lygių pasirodymą.
Viename tyrime, pelių grupės po 10 pelių buvo imunizuotos 15 mikrogramų išskirto A/Pekinas/32/92 (H3N2) rHAO, kuris buvo produkuotas vabzdžių ląstelių kultūroje, adaptuotoje augti beseruminėje terpėje (rHA-SF). Praėjus dviems - trims savitėms po injekcijos, pelės buvo nukraujinamos ir paruošiami serumo bandiniai. Serumuose įvertinti anti-HA IgG ir HAI antikūnai.. Tiek rHA, tiek rHAO-SF antigenai sukėlė panašius anti-HA ir HAI antikūnų titrus. Praėjus dviems savaitėms po vienkartinės imunizacijos, daugumoje pelių pastebėti aukšti HAI antikūnų titrai, o trečią savaitę 8/10 pelių HAI titrai buvo 32 ar dar aukštesni. Šie ir kiti biocheminiai ir imunologiniai tyrimai rodo, kad rHAO, produkuotas beseruminėje vabzdžių ląstelių kultūroje, savo ypatumais nesiskiria nuo rHA, pagaminto fermentacinėse sąlygose terpėje su serumu.
Atliktas tyrimas, norint palyginti 1994-1995 metų trivalentės gripo vakcinos rHAO vaistinę formą su licenzine išskirto viruso paviršiaus vakcina, Fluvirin® (atenuota gripo viruso vakcina, pagaminta kultivuojant kiaušiniuose), j kiekvienos vakcinos sudėtį įėjo 15 mikrogramų rHAO arba po 0.5 ml gripo viruso kamienų Teksasas/36/91 (H1N1), A/Šangdongas/9/93 (H3N2) ir B/Panama/45/90 virusinio HA. Tiek rekombinantinis rHAO, tiek Fluvirin® vakcinos pateikiamos fosfatais užbuferintame druskos tirpale. Pelių grupės po 10 pelių buvo nukraujinamos praėjus 0, 2 ir 3 savaitėm po injekcijos ir paruošti serumo bandiniai. Serume įvertinti anti-HA IgG antikūnų, antikūnų, slopinančių virusus, auginamus kiaušiniuose, ir neutralizuojančių antikūnų, nukreiptų prieš įvairių kamienų virusus, auginamus kiaušiniuose, kiekiai.
Kaip parodyta Fig. 4a, 4b, ir 4c, tiek rekombinantinis rHAO, tiek licenzinės gripo vakcinos, sukėlė pasirodymą didelių kiekius serumo IgG antikūnų, nukreiptų prieš kiekvieno iš trijų vakcinos viruso kamienų hemagliutininus. Palyginus su licenzine vakcina, rHAO vakcina sukėlė nuo 4 iki 10 kartų didesnius IgG antikūnų titrus. Kaip parodyta 5 lentelėje, pasigamino taip pat antikūnai, kurie slopino kamienų A ir B virusų sukeltą viščiukų eritrocitų hemagliutinaciją. Palyginus antikūnų kiekį, sukeltą po imunizacijos trivalente rHAO vakcina, su kiekiu, atsiradusiu po imunizacijos licenzine vakcina, rasta kad pirmuoju atveju HAI titrai buvo ekvivalentiški arba aukštesni kiekvieno iš trijų viruso kamienų atžvilgiu. Vakcinos taip pat indukavo atsiradimą didelių kiekių antikūnų, nukreiptų prieš specifinius gripo viruso A ir B kamienus, nustatant juos standartiniu mikrotitro viruso neutralizacijos testu. Geometriniai neutralizuojančių antikūnų titrai buvo beveik du kartus aukštesni pas peles, kurios buvo imunizuotos rHAO, palyginus su pelėmis, imunizuotomis licenzine išskirto viruso paviršiaus vakcina, Fiuvirin®. Šie duomenys rodo, kad rHAO vakcinos trivalentinė vaisto forma, kurios pagrindą sudaro 1994-1995 metų viruso A ir B kamienai, yra ekvivalentinė arba net efektyvesnė už licenzinę subvienetinę gripo vakciną ir sukelia serume veiklius HAI ir neutralizuojančius antikūnus, nukreiptus prieš visus tris vakcinos viruso kamienus.
Čia aprašytų būdų ir sudėčių, naudotų ruošiant ir vartojant rekombinantinę gripo viruso vakciną, modifikacijos ir variacijos bus aiškios patyrusiems. Tokias modifikacijas ir variacijas ketinama paminėti pridedamose išradimo apibrėžtyse.
Viruso kamienas, naudotas kaip antigenas Trivalentinė rHAO gripo vakcina (n=10) Gripo vakcina Fluvirin® (n=10)
' Anti-HA IgG Anti-HA-lgG
ΓΖ T 0 savaičių 3 savaitės 0 savaičių 3 savaitės
A/Teksasas/36/9 1 (H1N1) <1000 103,000 <1000 11,200
A/Šangdongas/3 <1000 2/ 92 (H3N2) į 162,400 <1000 41,000
B/Panama/45/90 i <1000 į 164,800 <1000 Į 26,000
Viruso kamienas, naudotas kaip antigenas HAI HAI
A/Teksasas/36/9 <8 1 (H1N1) 1,522 <8 1,088
A/Šangdongas/3 ’ <8 2/ j 92 (H3N2) ! 494 <8 435
B/Panama/45/90 ! <8 174 <8 42
Viruso i kamienas, naudotas kaip ; Neutralizuojantys antikūnai antigenas į Neutralizuojantys antikūnai
A/Teksasas/36/9 : <100 1 (H1N1) 5 i 5,800 I <100 j 2,700 i i Į
A/Šangdongas/3 <100 2/ 92 (H3N2) 840 <100 j 360 i I l i
B/Panama/45/90 <100
1,300 <100
700
SEKŲ SĄRAŠAS (1) BENDRA INFORMACIJA:
(I) PATEIKĖJAS: MicroGeneSys, Ine.
(II) IŠRADIMO PAVADINIMAS: GRIPO _ HEMAGLIUTININO
MULTIVALENTINIŲ VAKCINŲ GAMYBOS BUDAS (III) SEKŲ SKAIČIUS: 32 (IV) KORESPONDENCINIS ADRESAS :
(A) ADRESANTAS: Patrea L. Pabst (B) GATVĖ: 2800 One Atlantic Center
1201 West Peactree Street (C) MIESTAS: Atlanta (D) VALSTIJA: GA (E) VALSTYBĖ: JAV (F) KODAS: 3039-3450 (V) KOMPIUTERINĖ VERSIJA:
(A) IŠORINĖ ATMINTIS: diskelis (B) KOMPIUTERIS: IBM PC suderinamas (C) OPERACINĖ SISTEMA: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMINĖ ĮRANGA: Patentln Release # 1.0, versija #1.25 (vi) DABARTINIAI PARAIŠKOS DUOMENYS:
(A) PARAIŠKOS NUMERIS: PCT/US95/06750 (B) UŽPILDYMO DATA: 26-GEGUŽĖ-1995 (C) KLASIFIKACIJA:
(ix) TELEKOMUNIKACINĖ INFORMACIJA:
(A) TELEFONAS: (404) -873-8794 (B) TELEFAKSAS: (404) -873-8795 (1) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 1:
(I) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 12 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė) (iii) HIPOTETINĖ: NE (iv) ANTISENSINĖ: NE (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: gripo virusas (x) PUBLIKACIJOS DUOMENYS:
(A) AUTORIAI: Davis ir kt.
(B) PAVADINIMAS: Bakterinio klono, turinčio gripo, viruso WSN kamieno (H0N1) hemagliutinino geną, konstravimas ir apibūdinimas.
(C) ŽURNALAS: Gene (D) TOMAS: 10 (E) PUSLAPIAI: 205-218 (F) DATA: 1980 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 1:
AGCAAAAGCA GG (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 2:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 39 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 2:
GGGGGTACCC CCGGGAGCAA AAGCAGGGGA AAATAAAAA (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 3:
(1) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 35 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 3:
CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 4:
(1) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 39 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 4:
GGGGGTACCC CCCCCCACAC AATATGTATA GGCTACCAT (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 5:
(Xi) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 35 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė (xi) ' SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 5:
CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 6:
(xi) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 1793 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė (iii) HIPOTETINĖ: NE (iv) ANTISENSINĖ: NE (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
(B) ORGANIZMAS: gripo virusas (C) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: A/Pekinas/32/92/rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: polihedrino mRNR lyderinė (dalinė) (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signalinę seką (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 72 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: Smal restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 76 iki 81 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA (B) BUVIMO VIETA: 73 iki 1728 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: Kpnl restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 1771 iki 1777 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: Bg1 II restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 1776 iki 1782 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas (B) BUVIMO VIETA: 1783 iki 1793 (xi) SEKOS APRAYMAS: SEQ ID N: 6:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGACTTTCCA GGAAATGACA ACAGCACAGC AACGCTGTGC
CTGGGACATC ATGCAGTGCC AAACGGAACG CTAGTGAAAA CAATCACGAA TGATCAAATT 180
GAAGTGACTA ATGCTACTGA GCTGGTTCAG AGTTCCTCAA CAGGTAGAAT ATGCGACAGT 240
CCTCACCGAA TCCTTGATGG AAAAAACTGC ACACTGATAG ATGCTCTATT GGGAGACCCT 300
CATTGTGATG GCTTCCAAAA TAAGGAATGG GACCTTTTTG TTGAACGCAG CAAAGCTTAC 360
AGCAACTGTT ACCCTTATGA TGTACCGGAT TATGCCTCCC TTAGGTCACT AGTTGCCTCA 420
TCAGGCACCC TGGAGTTTAT CAATGAAGAC TTCAATTGGA CTGGAGTCGC TCAGGATGGG 480
GGAAGCTATG CTTGCAAAAG GGGATCTGTT AACAGTTTCT TTAGTAGATT GAATTGGTTG 540
CACAAATCAG AATACAAATA TCCAGCGCTG AACGTGACTA TGCCAAACAA. TGGCAAATTT 600
GACAAATTGT ACATTTGGGG GGTTCACCAC CCGAGCACGG ACAGAGACCA AACCAGCCTA 660
TATGTTCGAG CATCAGGGAG AGTCACAGTC TCTACCAAAA GAAGCCAACA AACTGTAACC 720
CCGAATATCG GGTCTAGACC CTGGGTAAGG GGTCAGTCCA GTAGAATAAG CATCTATTGG 780
ACAATAGTAA AACCGGGAGA catacttttg ATTAATAGCA CAGGGAATCT AATTGCTCCT 840
CGGGGTTACT TCAAAATACG AAATGGGAAA AGCTCAATAA TGAGGTCAGA TGCACCCATT 900
GGCACCTGCA GTTCTGAATG CATCACTCCA AATGGAAGCA TTCCCAATGA caaacctttt 960
CAAAATGTAA ACAGGATCAC ATATGGGGCC TGCCCCAGAT ATGTTAAGCA AAACACTCTG 1020
AAATTGGCAA CAGGGATGCG GAATGTACCA GAGAAACAAA CTAGAGGCAT ATTCGGCGCA 1080
ATCGCAGGTT TCATAGAAAA TGGTTGGGAG GGAATGGTAG ACGGTTGGTA CGGTTTCAGG 1140
CATCAAAATT CTGAGGGCAC AGGACAAGCA GCAGATCTTA AAAGCACTCA AGCAGCAATC 1200
GACCAAATCA ACGGGAAACT GAATAGGTTA ATCGAGAAAA CGAACGAGAA ATTCCATCAA 1260
ATCGAAAAAG AATTCTCAGA AGTAGAAGGG AGAATTCAGG ACCTCGAGAA ATATGTTGAA 1320
GACACTAAAA TAGATCTCTG GTCTTACAAC GCGGAGCTTC TTGTTGCCCT GGAGAACCAA 1380
CATACAATTG ATCTAACTGA CTCAGAAATG AACAAACTGT TTGAAAAAAC AAGGAAGCAA 1440
CTGAGGGAAA ATGCTGAGGA CATGGGCAAT GGTTGČTTCA AAATATACCA CAAATGTGAC 1500
AATGCCTGCA TAGGGTCAAT CAGAAATGGA ACTTATGACC ATGATGTATA CAGAGACGAA 1560
GCATTAAACA ACCGGTTCCA GATCAAAGGT GTTGAGCTGA AGTCAGGATA CAAAGATTGG 1620
ATCCTATGGA TTTCCTTTGC CATATCATGC TTTTTGCTTT GTGTTGTTTT GCTGGGGTTC 1680
ATCATGTGGG CCTGCCAAAA AGGCAACATT AGGTGCAACA TTTGCATTTG AGTGTATTAA 1740,
TTAAAAACAC CCTTGTTTCT AGGATGATTC GGTACCAGAT CTTAATTAAT TAA 1793
DUOMENYS APIE SEQ ED No: 7:
(xii) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 570 bazių porų (B) TIPAS: aminorūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČRJS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULES TIPAS: peptidas (iii) HIPOTETINĖ: NE (iv) ANTISENSINE: NE (v) FRAGMENTO TIPAS: N-terminalinis (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: gripo virusas (C) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: A/Pekinas/32/92/rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS:AcNPV 6IK. baltymo signalinė seka (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDASZRAKTAS: subrendęs rHA (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 552 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 7:
Met 1 Pro Leu Tyr Lys 5 Leu Leu Asn Vai Leu 10 Trp Leu Vai Ala Vai 15 Ser
Asn Ala Ile Pro 20 Gly Asp Phe Pro Gly 25 Asn Asp Asn Ser Thr 30 Ala Thr
Leu Cys Leu 35 Gly His His Ala Vai 40 Pro Asn Gly Thr Leu 45 Vai Lys Thr
Ile Thr 50 Asn Asp Gln Ile Glu 55 Vai Thr Asn Ala Thr 60 Glu Leu Vai Gln
Ser 65 Ser Ser Thr Gly Arg 70 Ile Cys Asp Ser Pro 75 His Arg Ile Leu Asp 80
Gly Lys Asn Cys Thr 85 Leu Ile Asp Ala Leu 90 Leu Gly Asp Pro His 95 Cys
Asp Gly Phe Gln 100 Asn Lys Glu Trp Asp 105 Leu Phe Vai Glu Arg 110 Ser Lys
Ala Tyr Ser 115 Asn Cys Tyr Pro Tyr 120 Asp Vai Pro Asp Tyr 125 Ala Ser Leu
Arg Ser 130 Leu Vai Ala Ser Ser 135 Gly Thr Leu Glu Phe 140 Ile Asn Glu Asp
Phe 145 Asn Trp Thr Gly Vai 150 Ala Gln Asp Gly Gly 155 Ser Tyr Ala Cys Lys 160
Arg Gly Ser Vai Asn 165 Ser Phe Phe Ser Arg 170 Leu Asn Trp Leu His 175 Lys
Ser Glu Tyr Lys 180 Tyr Pro Ala Leu Asn 185 Vai Thr Met Pro Asn 190 Asn Gly
Lys Phe Asp 195 Lys Leu Tyr Ile Trp 200 Gly Vai His His Pro 205 Ser Thr Asp
Arg Asp 210 Gln Thr Ser Leu Tyr 215 Vai Arg Ala Ser Gly 220 Arg Vai Thr Vai
Ser 225 Thr Lys Arg Ser Gln 230 Gln Thr Vai Thr Pro •23 5 Asn Ile Gly Ser Arg 240
Pro Trp Vai Arg Gly 245 Gln Ser Ser Arg Ile 250 Ser Ile Tyr Trp Thr 255 Ile
Vai Lys Pro Gly 260 Asp Ile Leu Leu Ile 265 Asn Ser Thr Gly Asn 270 Leu Ile
Ala Pro Arg 275 Gly Tyr Phe Lys Ile 280 Arg Asn Gly Lys Ser 285 Ser Ile Met
Arg Ser 290 Asp Ala Pro Ile Gly 295 Thr Cys Ser Ser Glu 300 Cys Ile Thr Pro
Asn 305 Gly Ser Ile Pro Asn 310 Asp Lys Pro Phe Gln 315 Asn Vai Asn Arg Ile 320
Thr Tyr Gly Ala Cys 325 Pro Arg Tyr Vai Lys 330 Gln Asn Thr Leu Lys 335 Leu
Ala Thr Gly Met 340 Arg Asn Vai Pro Glu '345 Lys Gln Thr Arg Gly 350 Ile Phe
Gly Ala Ile 355 Ala Gly Phe Ile Glu 360 Asn Gly Trp Glu Gly 365 Met Vai Asp
Gly Trp 370 Tyr Gly Phe Arg His 375 Gln Asn Ser Glu Gly 380 Thr Gly Gln Ala
Ala 385 Asp Leu Lys Ser Thr 390 Gln Ala Ala Ile Asp 395 Gln Ile Asn Gly Lys 400
Leu Asn Arg Leu Ile 405 Glu Lys Thr Asn Glu 410 Lys Phe His Gln Ile 415 Glu
Lys Glu Phe Ser 420 Glu Vai Glu Gly Arg 425 Ile Gln Asp Leu Glu 430 Lys Tyr
Vai Glu Asp 435 Thr Lys Ile Asp Leu 440 Trp Ser Tyr Asn Ala 445 Glu Leu Leu
Vai Ala 450 Leu Glu Asn Gln His Thr 4S5 Ile Asp Leu Thr 460 Asp Ser Glu Met
Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu
465 470 475 480
Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala
485 490 495
Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Vai Tyr Arg
• 500 505 510
Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Vai Glu Leu Lys
515 520 525
Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys
530 535 540
Phe Leu Leu Cys Vai Vai Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln
545 550 555 560
Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
DUOMENYS APE SEQ ID No: 8:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 1766 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULES TIPAS: DNR (genominė) (iii) HIPOTETINE: NE (iv) ANTISENSENE: NE (v) FRAGMENTO TIPAS: N-terminalinis (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDrVIDUALUS IZOLIATAS: A/Teksasas/36/91/rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: polihedrino mRNR lyderinė (dalinė) (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signalinį peptidą (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 72 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: SmaI restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 76 iki 81 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: KpnI restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 82 iki 87 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: SmaI restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 88 iki 93 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA (B) BUVIMO VIETA: 73 iki 1734 (ix) YPATUMAS
A)VARDAS/RAKTAS: KpnI restrikcijos saitas (B)BUVIMO VIETA: 1744 iki 1749 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: Bgl Π restrikęijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 1750 iki 1755 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas (B) BUVIMO VIETA: 1756 iki 1766 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 8:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGGTACCCCC GGGGĄCACAA TATGTATAGG CTACCATGCG 120
AACAACTCAA CCGACACTGT TGACACAGTA CTTGAGAAGA ACGTGACAGT GACACACTCT 180
GTCAACCTAC TTGAGGACAG TCACAACGGA AAACTATGTC GACTAAAGGG AATAGCCCCA 240
CTACAATTGG GTAATTGCAG CGTTGCCGGA TGGATCTTAG GAAACCCAAA ATGCGAATCA 300
CTGTTTTCTA AGGAATCATG GTCCTACATT GCAGAAACAC CAAACCCTGA GAATGGAACA 360
TGTTACCCAG GGTATTTCGC CGACTATGAG GAACTGAGGG AGCAATTGAG TTCAGTATCA 420
TCATTCGAGA GATTCGAAAT ATTCCCCAAA GAAAGCTCAT GGCCCAACCA CACCGTAACC 480
AAAGGAGTAA CGAGATCATG CTCCCATAAT GGGAAAAGCA gtttttacag AAATTTGCTA 540
TGGCTGACGG AGAAGAATGG CTTGTACCCA AATCTGAGCA AGTCCTATGT AAACAACAAA 600
GAGAAAGAAG TCCTTGTACT ATGGGGTGTT CATCACCCGT CTAACATAAG GGACCAAAGG 660
GCCATCTATC ATACAGAAAA TGCTTATGTC TCTGTAGTGT CTTCACATTA TAGCAGAAGA 720
TTCACCCCAG AAATAGCAAA AAGACCCAAA GTAAGAGATC AAGAAGGAAG AATTAACTAC 780
TACTGGACTC TGCTGGAACC CGGGGACACA ATAATATTTG AGGCAAATGG AAATCTAATA 840
GCGCCATGGT ATGCTTTCGC ACTGAGTAGA GGCTTTGGGT CAGGAATCAT CACCTCAAAC 900
GCATCAATGG ATGAATGTGA CGCGAAGTGT CAAACACCCC AGGGAGCTAT AAACAGTAGT 960
CTTCCTTTCC AGAATGTACA CCCAGTCACA ATAGGAGAGT GTCCAAAGTA TGTCAGGAGT 1020
ACAAAATTAA GGATGGTTAC AGGACTAAGG AACATCCCAT CCATTCAATC CAGAGGTTTG 1080
TTTGGAGCCA TTGCCGGTTT CATTGAAGGG GGGTGGACTG GAATGATAGA TGGATGGTAT 1140
GGTTATCATC ATCAGAATGA ACAAGGATCT GGCTATGCTG CGGACCAAAA AAGCACACAA 1200
AATGCCATTA ACGGGATTAC AAACAAGGTG AATTCTGTAA TCGAGAAAAT GAACACTCAA 1260
TTCACAGCTG TGGGCAAAGA ATTCAACAAA TTAGAAAGAA GGATGGAAAA CTTAAATAAA 1320
AAAGTTGATG ATGGATTTCT GGACATTTGG ACATATAATG CAGAATTGTT GGTTCTAOTG 1380
GAAAATGGAA GGACTTTGGA TTTTCATGAC TCAAATGTGA AGAATCTGTA TGAGAAAGTA 1440
AAAAGCCAAT TGAAGAATAA TGCCAAAGAA ATAGGGAACG GGTGTTTTGA ATTCTATCAC 1500
AAGTGTAACA ATGAATGCAT GGAAAGTGTG AAAAATGGAA CTTATGACTA TCCAAAATAT 1560
TCCGAAGAAT CAAAGTTAAA CAGGGGAAAA ATTGATGGAG TGAAATTGGA ATCAATGGGA 1620
GTCTATCAGA TTCTGGCGAT CTACTCAACT GTCGCCAGTT CACTGGTGCT TTTGGTCTCC 1680
CTGGGGGCAA tcagcttctg GATGTGTTCT AATGGGTCTT TGCAGTGCAG AATATGAATC 1740
TGAGGTACCA GATCTTAATT AATTAA 1766
DUOMENYS APIE SEQ ID No: 9:
(vii) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 572 bazių porų (B) TIPAS: aminorūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (viii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (ix> HIPOTETINĖ: NE (x) ANTISENSINE: NE (xi) FRAGMENTO TIPAS: N-terminaJinis (xii) PRADINIS ŠALTINIS:
(B) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: A/Teksasas/36/91/rHA (ix) YPATUMAS (A)VARDAS/RAKTAS: AcNPV 61K baltymo signalinė seka (B)BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: subrendęs rHA (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 554 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 9:
Met 1 Pro Leu Tyr Lys 5 Leu Leu Asn Vai Leu 10 Trp Leu Vai Ala Vai 15 Ser
Asn Ala Ile Pro 20 Gly Gly Thr Pro Gly 25 Asp Thr Ile Cys Ile 30 Gly Tyr
His Ala Asn 35 Asn Ser Thr Asp Thr 40 Vai Asp Thr Vai Leu 45 Glu Lys Asn
Vai Thr 50 Vai Thr His Ser Vai 55 Asn Leu Leu Glu Asp 60 Ser His Asn Gly
Lys 65 Leu Cys Arg Leu Lys 70 Gly Ile Ala Pro Leu 75 Gln Leu Gly Asn Cys 80
Ser Vai Ala Gly Trp 85 Ile Leu Gly Asn Pro 90 Lys Cys Glu Ser Leu 95 Phe
Ser Lys Glu Ser 100 Trp Ser Tyr Ile Ala 105 Glu Thr Pro Asn Pro 110 Glu Asn
Gly Thr Cys 115 Tyr Pro Gly Tyr Phe 120 Ala Asp Tyr Glu Glu 125 Leu Arg Glu
Gln Leu 130 Ser Ser Vai Ser Ser 135 Phe Glu Arg Phe Glu 140 Ile Phe Pro Lys
Glu 145 Ser Ser Trp Pro Asn 150 His Thr Vai Thr Lys 155 Gly Vai Thr Arg Ser 160
Cys Ser His Asn Gly 165 Lys Ser Ser Phe Tyr 170 Arg Asn Leu Leu Trp 175 Leu
Thr Glu Lys Asn 180 Gly Leu Tyr Pro Asn 185 Leu Ser, Lys Ser Tyr 190 Vai Asn
Asn Lys Glu 195 Lys Glu Vai Leu Vai 200 Leu Trp Gly Vai His 205 His Pro Ser
Asn Ile 210 Arg Asp Gln Arg Ala 215 Ile Tyr His Thr Glu 220 Asn Ala Tyr Vai
Ser 225 Vai Vai Ser Ser His 230 Tyr Ser Arg Arg Phe 235 Thr Pro Glu Ile Ala 240
Lys Arg Pro Lys Vai 245 Arg Asp Gln Glu Gly 250 Arg Ile Asn Tyr Tyr 255 Trp
Thr Leu Leu Glu 260 Pro Gly Asp Thr Ile 265 Ile Phe Glu Ala Asn 270 Gly Asn
Leu Ile Ala 275 Pro Trp Tyr Ala Phe 280 Ala Leu Ser Arg Gly 285 Phe Gly Ser
Gly Ile 290 Ile Thr Ser Asn Ala 295 Ser Met Asp Glu Cys 300 Asp Ala Lys Cys
Gln 305 Thr Pro Gln Gly Ala 310 Ile Asn Ser Ser Leu 315 Pro Phe Gln Asn Vai 320
His Pro Vai Thr Ile 325 Gly Glu Cys Pro Lys 330 Tyr Vai Arg Ser Thr 335 Lys
Leu Arg Met Vai 340 Thr Gly Leu Arg Asn 345 Ile Pro Ser Ile Gln 350 Ser Arg
Gly Leu Phe 355 Gly Ala Ile Ala Gly 360 Phe Ile Glu Gly Gly 365 Trp Thr Gly
Met Ile 370 Asp Gly Trp Tyr Gly 375 Tyr His His Gln Asn 380 Glu Gln Gly Ser
Gly 385 Tyr Ala Ala Asp Gln 390 Lys Ser Thr Gln Asn 395 Ala Ile Asn Gly Ile 400
Thr Asn Lys Vai Asn 405 Ser Vai Ile Glu Lys 410 Met Asn Thr Gln Phe 415 Thr
Ala Vai Gly Lys 420 Glu Phe Asn Lys Leu 425 Glu Arg Arg Met Glu 430 Asn Leu
Asn Lys Lys 435 Vai Asp Asp Gly Phe 440 Leu Asp Ile Trp Thr 445 Tyr Asn Ala
Glu Leu 450 Leu Vai Leu Leu Glu 455 Asn Gly Arg Thr Leu 460 Asp Phe His Asp
Ser 465 Asn Vai Lys Asn Leu 470 Tyr Glu Lys Vai Lys 475 Ser Gln Leu Lys Asn 480
Asn. Ala Lys Glu Ile 485 Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys
490 495
Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Vai Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro
500 505 510
Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Gly Lys Ile Asp Gly Vai
515 520 525
Lys Leu Glu Ser Met Gly Vai Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr
530 535 540
Vai Ala Ser Ser Leu Vai Leu Leu Vai Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe
545 550 555 560
Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile
565 570
DUOMENYS APIE SEQ ID No: 10:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 1799 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: RNR (genominė) (iii) HIPOTETINĖ: NE (iv) ANTISENSINĖ: NE (vii) PRADINIS ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Panama/45/90 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: polihedrino mRNR lyderis (dalinis) (B) BUVIMO VIETA: I iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis HA signalinio peptido seką (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 69 (ix) YPATUMAS (A) VARDASZRAKTAS: SmaI restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 22 iki 27 (ix) YPATUMAS (A) VARDASZRAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA (B) BUVIMO VIETA: 70 iki 1773 (ix) YPATUMAS (A) VARDASZRAKTAS: Kpnl restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 1777 iki 1782 (ix) YPATUMAS (A) VARDASZRAKTAS: Bgin restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 1783 iki 1788 (ix) YPATUMAS
A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas (B)BUVIMO VIETA: 1789 iki 1799 (») SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No:-10:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCGGGAAG GCAATAATTG TACTACTCAT GGTAGTAACA 60
TCCAACGCAG ATCGAATCTG CACTGGGATA ACATCTTCAA ACTCACCTCA TGTGGTCAAA 120
ACAGCTACTC AAGGGGAAGT CAATGTGACT GGTGTGATAC CACTGACAAC AACACCAACA 180
AAATCTCATT TTGCAAATCT AAAAGGAACA AAGACCAGAG GGAAACTATG CCCAAACTGT 240
CTCAACTGCA CAGATCTGGA TGTGGCCTTG GGCAGACCAA TGTGTGTGGG GACCACACCT 300
TCGGCAAAAG CTTCAATACT CCACGAAGTC AGACCTGTTA CATCCGGGTG CTTTCCTATA 360
ATGCACGACA GAACAAAAAT CAGACAGCTA CCCAATCTTC TCAGAGGATA TGAAAATATC 420
AGATTATCAA CCCAAAACGT TATCAACGCA GAAAGAGCAC CAGGAGGACC CTACAGACTT 480
GGAACCTCAG GATCTTGCCC TAACGTTACC AGTAGAGACG gattcttcgc AACAATGGCT 540
TGGGCTGTCC CAAGGGACAA CAAAAČAGCA ACGAATCCAC TAACAGTAGA AGTACCATAC 600
ATTTGTACCA AAGGAGAAGA CCAAATTACT GTTTGGGGGT TCCATTCTGA TAACAAAATC 660
CAAATGAAAA ACCTCTATGG AGACTCAAAT CCTCAAAAGT TCACCTCATC TGCCAATGGA 720
GTAACCACAC ATTATGTTTC TCAGATTGGT GGCTTCCCAA ATCAAACAGA AGACGGAGGG 780
CTACCACAAA GCGGCAGAAT TGTTGTTGAT TACATGGTGC AAAAACCTGG GAAAACAGGA 84 0
ACAATTGTCT ATCAAAGAGG TGTTTTGTTG CCTCAAAAGG TGTGGTGCGC AAGTGGCAGG 900
AGCAAGGTAA TAAAAGGGTC CTTGCCTTTA ATTGGTGAAG CAGATTGCCT TCACGAAAAA 960
TACGGTGGAT TAAACAAAAG CAAGCCTTAC TACACAGGAG AACATGCAAA AGCCATAGGA 1020
AATTGCCCAA TATGGGTGAA AACACCTTTG AAGCTTGCCA ATGGAACCAA ATATAGACCT 108 0
CCTGCAAAAC TATTAAAGGA AAGGGGTTTC TTCGGAGCTA TTGCTGGTTT CTTAGAAGGA 1140
GGATGGGAAG GAATGATTGC AGGTTGGCAC GGATACACAT CTCATGGAGC ACATGGAGTG 1200
GCAGTGGCAG CAGACCTTAA GAGTACGCAA GAAGCCATAA ACAAGATAAC AAAAAATCTC 1260
AATTCTTTGA GTGAGCTAGA AGTAAAGAAT CTTCAAAGAC TAAGTGGTGC CATGGATGAA 132 0
CTCCACAACG AAATACTCGA GCTGGATGAG AAAGTGGATG ATCTCAGAGC TGACACAATA 138 0
AGCTCGCAAA TAGAGCTTGC AGTCTTGCTT TCCAACGAAG GAATAATAAA CAGTGAAGAT 1440
GAGCATCTAT TGGCACTTGA GAGAAAACTA AAGAAAATGC TGGGTCCCTC TGCTGTAGAC 1500
ATAGGGAATG GATGCTTCGA AACCAAACAC AAGTGCAACC AGACCTGCTT AGACAGGATA 1560
GCTGCTGGCA CCTTTAATGC AGGAGAATTT TCTCTTCCCA CTTTTGATTC ACTGAATATT 1620
ACTGCTGCAT CTTTAAATGA TGATGGATTG GATAATCATA CTATACTGCT CTACTACTCA 1680
ACTGCTGCTT CTAGTTTGGC TGTAACATTG ATGATAGCTA TTTTTATTGT TTATATGGTC 174 0
TCCAGAGACA ATGTTTCTTG TTCCATCTGT CTGTGAGGTA CCAGATCTTA ATTAATTAA 1799
DUOMENYS APIE SEQ ID No: 11 :
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 585 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULES TIPAS: peptidas (iii) HIPOTETINE: NE (iv) ANTISENSINE: NE (v) FRAGMENTO TIPAS: N-terminalinis (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
. (A) ORGANIZMAS: gripo virusas (CjlNDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Panama/45/90 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTASHA signal peptide (B) BUVIMO VIETA: 1 to 17 (ix) YPATUMAS (A) VARDASZRAKTAS: subrendęs rHA) (B) BUVIMO VIETA: 18 iki 568 (xi)SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 11:
Met Pro Gly Lys Ala Ile Ile Vai Leu Leu Met Vai Vai Thr Ser Asn
10 15
Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Vai
Vai Lys Thr 35 Ala Thr Gln Gly Glu 40 Vai Asn Vai Thr Gly 45 Vai Ile Pro
Leu Thr 50 Thr Thr Pro Thr Lys 55 Ser His Phe Ala Asn 60 Leu Lys Gly Thr
Lys 65 Thr Arg Gly Lys Leu 70 Cys Pro Asn Cys Leu 75 Asn Cys Thr Asp Leu 80
Asp Vai Ala Leu Gly 85 Arg Pro Met Cys Vai 90 Gly Thr Thr Pro Ser 95 Ala
Lys Ala Ser Ile 100 Leu His Glu Vai Arg 105 Pro Vai Thr Ser Gly 110 Cys Phe
Pro Ile Met 115 His Asp Arg Thr Lys 120 Ile Arg Gln Leu Pro 125 Asn Leu Leu
Arg Gly 130 Tyr Glu Asn Ile Arg 135 Leu Ser Thr Gln Asn 140 Vai Ile Asn Ala
Glu 145 Arg Ala Pro Gly Gly 150 Pro Tyr Arg Leu Gly 155 Thr Ser Gly Ser Cys 160
Pro Asn Vai Thr Ser 165 Arg Asp Gly Phe Phe 170 Ala Thr Met Ala Trp 175 Ala
Vai Pro Arg Asp 180 Asn Lys Thr Ala Thr 185 Asn Pro Leu Thr Vai 190 Glu Vai
Pro Tyr Ile 195 Cys Thr Lys Gly Glu 200 Asp Gln Ile Thr Vai 205 Trp Gly Phe
His Ser 210 Asp Asn Lys Ile Gln 215 Met Lys Asn Leu Tyr 220 Gly Asp Ser Asn
Pro 225 Gln Lys Phe Thr Ser 230 Ser Ala Asn Gly Vai 235 Thr Thr His Tyr Vai 240
Ser Gln Ile Gly Gly 245 Phe Pro Asn Gln Thr 250 Glu Asp Gly Gly Leu 255 Pro
Gln Ser Gly Arg 260 Ile Vai Vai Asp Tyr 265 Met Vai Gln Lys Pro 270 Gly Lys
Thr Gly Thr 275 Ile Vai Tyr Gln Arg 280 Gly Vai Leu Leu Pro 285 Gln Lys Vai
Trp Cys 290 Ala Ser Gly Arg Ser 295 Lys Vai Ile Lys Gly 300 Ser Leu Pro Leu
Ile 305 Gly Glu Ala Asp Cys 310 Leu His Glu Lys Tyr 315 Gly Gly Leu Asn Lys 320
Ser Lys Pro Tyr Tyr 325 Thr Gly Glu His Ala 330 Lys Ala Ile Gly Asn 335 Cys
Pro Ile Trp Vai 340 Lys Thr Pro Leu Lys 345 Leu Ala Asn Gly Thr 350 Lys Tyr
Arg Pro Pro 355 Ala Lys Leu Leu Lys 360 Glu Arg Gly Phe Phe 365 Gly Ala Ile
Ala Gly 370 Phe Leu Glu Gly Gly 375 Trp Glu Gly Met Ile 380 Ala Gly Trp His
Gly 385 Tyr Thr Ser His Gly 390 Ala His Gly Vai Ala 395 Vai Ala Ala Asp Leu 400
Lys Ser Thr Gln Glu 405 Ala Ile .Asn Lys Ile 410 Thr Lys Asn Leu Asn 415 Ser
Leu Ser .Glu Leu 420 Glu Vai Lys Asn Leu 425 Gln Arg Leu Ser Gly 430 Ala Met
Asp Glu Leu 435 His Asn Glu Ile Leu 440 Glu Leu Asp Glu Lys 445 Vai Asp Asp
Leu ‘ 'Arg 450 Ala Asp Thr Ile Ser 455 Ser Gln Ile Glu Leu 460 Ala Vai Leu Leu
Ser 465 Asn Glu Gly Ile Ile 470 Asn Ser Glu Asp Glu 475 His Leu Leu Ala Leu 480
Glu Arg Lys Leu Lys 485 Lys Met Leu Gly Pro 490 Ser Ala Vai Asp Ile 495 Gly
Asn Gly Cys Phe 500 Glu Thr Lys His Lys 505 Cys Asn Gln Thr Cys 510 Leu Asp
Arg Ile Ala 515 Ala Gly Thr Phe Asn 520 Ala Gly Glu Phe Ser 525 Leu Pro Thr
Phe Asp 530 Ser Leu Asn Ile Thr 535 Ala Ala Ser Leu Asn 540 Asp Asp Gly Leu
Asp 545 Asn His Thr Ile Leu 550 Leu Tyr Tyr Ser Thr 555 Ala Ala Ser Ser Leu 560
Ala Vai Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Vai Tyr Met Vai Ser Arg
565 570 575
Asp Asn Vai Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580 . 585
DUOMENYS APE SEQ E) No: 12:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) EGIS: 1811 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TEAS: DNR (genominė) (iii) HIPOTETINE: NE (iv) ANTISENSINE: NE (vi)PRADINIS ŠALTINIS:
(A) ORANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/NyderIandai/13/94 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: polihedrino mRNR Ivderis (dalinis) (B) BUVIMO VETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signaline seka (B) BUVIMO VETA: 19 iki 72 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: Smal restrikcijos saitas (B) BUVIMO VETA: 76 iki 81 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusi rHA (B) BUVEMO VETA: 73 iki 1785 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: KpnI restrikcijos saitas (B) BUVIMO VETA: 1789 iki 1794 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: Bgin restrikcijos saitas (B) BUVIMO VETA: 1795 iki 1800 (ix) YPATUMAS
A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas (BjBUVIMO VETA: 1801 iki 1811 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 12
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA AGGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGATCGAATC TGCACTGGGA TAACATCTTC AAAATCACCT 120
CATGTAGTCA AAACAGCTAC TCAAGGGGAG GTCAATGTGA CTGGTGTGAT ACCACTGACG 180
ACAACACCAA CAAAATCTCA TTTTGCAAAT CTCAAAGGAA CAAAGACCAG AGGGAAACTA 240
TGCCCAAACT GTCTCAACTG CACAGATCTG GATGTGGCCT TGGGCAGACC AATGTGTGTG 300
GGGATCACAC CTTCGGCAAA AGCTTCAATA CTCCACGAAG TCAGACCTGT TACATCCGGG 360
TGCTTTCCTA tAatgcatga tAGAACAAAA ATCAGACAGC TACCCAATCT TCTCAGAGGA 420
TATGAAAACA TCAGACTATC AACCCAAAAC GTTATCAACG CAGAAAAGGC ACCAGGAGGA 480
CCCTACAGAC TTGGAACCTC AGGATCTTGC CCTAACGTTA CCAGTAGAAC CGGATTCTTC 540
GCAACAATGG CTTGGGCTGT CCCAAGGGAC AACAAAACAG CAACGAATCC ACTAACAGTA 600
GAAGTACCAT ACATTTGTAC GAAAGGAGAA GACCAAATTA CTGTTTGGGG GTTCCATTCT 660
GATAACAAAA CCCAAATGAA AAACCTCTAT GGAGACTCAA ATCCTCAAAA GTTCACCTCA 720
TCTGCCAATG GAGTAACCAC ACATTATGTT TCTCAGATTG GTGGCTTCCC AGATCAAACA 780
GAAGACGGAG GACTACCACA AAGCGGCAGA ATTGTTGTTG ATTACATGGT GCAAAAACCT 840
GGGAAAACAG GAACAATTGT CTATCAAAGA GGTATTTTGT TGCCTCAAAA GGTGTGGTGC 900
GCAAGTGGCA GGAGCAAGGT AATAAAAGGG TCCTTGCCTT TAATTGGTGA AGCAGATTGC 960
CTTCACGAAA AATACGGTGG ATTAAACAAA AGCAAGCCTT ACTACACAGG AGAACATGCA 1020
AAAGCCATAG GAAATTGCCC AATATGGGTG AAAACACCTT TGAAGCTTGC CAATGGAACC 1080
AGATATAGAC CTCCTGCAAA ACTATTAAAG GAAAGGGGTT TCTTCGGAGC TATTGCTGGT 1140
TTCTTAGAAG GAGGATGGGA AGGAATGATT GCAGGTTGGC ACGGATACAC ATCTCACGGG 1200
GCACATGGAG TGGCAGTGGC AGCAGACCTT AAGAGTACGC AAGAAGCCAT AAACAAGATA 1260
ACAAAAAATC TCAATTCTTT GAGTGAGCTA GAAGTAAAGA ACCTTCAAAG ACTAAGTGGT 1320
GCCATGGATG AACTCCACAA CGAAATACTC GAGCTGGATG AGAAAGTGGA TGATCTCAGA 1380
GCTGACACAA TAAGCTCGCA AATAGAGCTT GCAGTCTTAC TTTCCAACGA AGGAATAATA 1440
AACAGTGAAG ATGAGCATCT ATTGGCACTT GAGAGAAAAC TAAAGAAAAT GCTGGGTCCC 1500
TCTGCTGTAG ACATAGGGAA TGGATGCTTC GAAACAAAAC ACAAGTGCAA CCAGACCTGC 1560
TTAGACAGGA TAGCTGCTGG CACCTTTAAT GCAGGAGAAT TTTCTCTTCC cacttttgat 1620
TCACTGAATA TTACTGCTGC ATCTTTAAAT GATGATGGAT TGGATAATCA TACTATACTG 1680
CTCTACTACT CAACTGCTGC TTCTAGTTTG gctgtaacat TGATGATAGC TATTTTTATT 1740
GTTTATATGG TCTCCAGAGA CAATGTTTCT TGTTCCATCT GTCTGTGAGG TACCAGATCT 1800
TAATTAATTA A· 1811
DUOMENYS APIE SEQ ED No: 13:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 589 aminorūgštys (B) TIPAS: aminorūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (iii) HIPOTETINĖ: NE (iv) ANTIS ENS INE: NE (v) FRAGMENTO TIPAS: N-terminalinis (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Nyderlandai/13/94 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: AcNPV 61K baltymo signalinė seka (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: subrendęs rHA (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 571 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 13:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Vai Leu Trp Leu Vai Ala Vai Ser
1 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Asp Arg Ile Cys Thr 'Gly Ile Thr Ser Ser Lys
20 25 30
Ser Pro His Vai Vai Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Vai Asn Vai Thr
35 40 45
Gly Vai Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn
50 55 60
Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn
65 70 75 80
Cys Thr Asp Leu Asp 85 Vai Ala Leu Gly Arg 90 Pro Met Cys Vai Gly 95 Ile
Thr Pro Ser Ala 100 Lys Ala Ser Ile Leu 105 His Glu Vai Arg Pro 110 Vai Thr
Ser Gly Cys 115 Phe Pro Ile Met His 120 Asp Arg Thr Lys Ile 125 Arg Gln Leu
Pro Asn 130 Leu Leu Arg Gly Tyr 135 Glu Asn Ile Arg Leu 140 Ser Thr Gln Asn
Vai 14S Ile Asn Ala Glu Lys 150 Ala Pro Gly Gly Pro 155 Tyr Arg Leu Gly Thr 160
Ser Gly Ser Cys Pro 165 Asn Vai Thr Ser Arg 170 Thr Gly Phe Phe Ala 175 Thr
Met Ala Trp Ala 180 Vai Pro Arg Asp Asn 185 Lys Thr Ala Thr Asn 190 Pro Leu
Thr Vai Glu 195 Vai Pro Tyr Ile Cys 200 Thr Lys Gly Glu Asp 205 Gln Ile Thr
Vai Trp 210 Gly Phe His Ser Asp 215 Asn Lys Thr Gln Met 220 Lys Asn Leu Tyr
Gly 225 Asp Ser Asn Pro Gln 230 Lys Phe Thr Ser Ser 235 Ala Asn Gly Vai Thr 240
Thr His Tyr Vai Ser 245 Gln Ile Gly Gly Phe 250 Pro Asp Gln Thr Glu 255 Asp
Gly Gly Leu Pro 260 Gln Ser Gly Arg Ile 265 Vai Vai Asp Tyr Met 270 Vai Gln
Lys Pro Gly 275 Lys Thr Gly Thr Ile 280 Vai Tyr Gln Arg Gly 285 Ile Leu Leu
Pro Gln 290 Lys Vai Trp Cys Ala 295 Ser Gly Arg Ser Lys 300 Vai Ile Lys Gly
Ser 305 Leu Pro Leu Ile Gly 310 Glu Ala Asp Cys Leu 315 His Glu Lys Tyr Gly 320
Gly Leu Asn Lys Ser 325 Lys Pro Tyr Tyr Thr 330 Gly Glu His Ala Lys 33S· Ala
Ile Gly Asn Cys 340 Pro Ile Trp Vai Lys 345 Thr Pro Leu Lys Leu 350 Ala Asn
Gly Thr Arg 355 Tyr Arg Pro Pro Ala 360 Lys Leu Leu Lys Glu 365 Arg Gly Phe
Phe Gly 370 Ala Ile Ala Gly Phe 375 Leu Glu Gly Gly Trp 380 Glu Gly Met Ile
Ala 385 Gly Trp His Gly Tyr 390 Thr Ser His Gly Ala •395 His Gly Vai Ala Vai 400
Ala Ala Asp Leu Lys 405 Ser Thr Gln Glu Ala 410 Ile Asn Lys Ile Thr 415 Lys
Asn Leu Asn Ser 420 Leu Ser Glu Leu Glu 425 Vai Lys Asn Leu Gln 430 Arg Leu
Ser Gly Ala 435 Met Asp Glu Leu His 440 Asn Glu Ile Leu Glu 445 Leu Asp Glu
Lys Vai 450 Asp Asp Leu Arg Ala 455 Asp Thr Ile Ser Ser 460 Gln Ile Glu Leu
Ala 465 Vai Leu Leu Ser Asn' 470 Glu Gly Ile Ile Asn 475 Ser Glu Asp Glu His 480
Leu Leu Ala Leu Glu 485 Arg Lys Leu Lys Lys 490 Met Leu Gly Pro Ser 495 Ala
Vai Asp Ile Gly 500 Asn Gly Cys Phe Glu 505 Thr Lys His Lys Cys 510 Asn Gln
Thr Cys Leu 515 Asp Arg Ile Ala Ala 520 Gly Thr Phe Asn Ala 525 Gly Glu Phe
Ser Leu 530 Pro Thr Phe Asp Ser 535 Leu Asn Ile Thr Ala 540 Ala Ser Leu Asn
Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala
545 550 555 560
Ala Ser Ser Leu Ala Vai Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Vai Tyr
565 570 575
Met Vai Ser Arg Asp Asn Vai Ser cys Ser Ile Cys Leu
580 585
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 1757 bazių porų (B) TIPAS.' nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TEPĄS: DNR (genominė) (iii) HIPOTETINE: NE (iv) ANTISENSINE: NE (vi)PRADINIS ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: A/Šandongas/9/93 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: polihedrino mRNR lyderis (dalinis) (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signalą (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 72 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: SmaI restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 76 iki 81 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA (B) BUVIMO VIETA: 73 iki 1728 (ix) YPATUMAS (A)VARDAS/RAKTAS: KpnI restrikcijos saitas (BjBUVIMO VIETA: 1735 iki 1740 ( (ix) YPATUMAS
VARDAS/RAKTAS.'jBglII restriction site BUVIMO VIETA:: 1741 to 1746 (ix) YPATUMAS
A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas (B)BUVIMO VIETA: 1747 iki 1757 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 14:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GCAAGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTG 120
TGCCTGGGAC ATCATGCAGT GCCAAACGGA ACGCTAGTGA AAACAATCAC GAATGATCAA 180
ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGTTGGTT CAGAGTTCCT CAACAGGTAG AATATGCGGC 240
AGTCCTCACC GAATCCTTGA TGGAAAAAAC TGCACACTGA TAGATGCTCT ATTGGGAGAC 300
CCTCATTGTG ATGGCTTCCA AAATAAGGAA TGGGACCTTT TTGTTGAACG CAGCAAAGCT 360
TACAGCAACT GTTACCCTTA TGATGTGCCG GATTATGCCT CCCTTAGGTC ACTAGTTGCC 420
TCATCAGGCA CCCTGGAGTT TATCAATGAA GACTTCAATT GGACTGGAGT CGCTCAGGAT 480
GGGGGAAGCT ATGCTTGCAA AAGAGGATCT GTTAACAGTT TCTTTAGTAG ATTGAATTGG 540
TTGCACAAAT TAGAATACAA ATATCCAGCG CTGAACGTGA' CTATGCCAAA CAATGGCAAA 600
TTTGACAAAT TGTACATTTG GGGGGTTCAC CACCCGAGCA CGGACAGTGA CCAAACCAGC 660
CTATATGTTC GAGCATCAGG GAGAGTCACA gtctctacca AAAGAAGCCA ACAAACTGTA 720
ACCCCGAATA TCGGGTCTAG ACCCTGGGTA AGGGGTCAGT CCAGTAGAAT AAGCATCTAT 780
TGGACAATAG TAAAACCGGG AGACATACTT TTGATTGATA GCACAGGGAA TCTAATTGCT 840
CCTCGGGGTT ACTTCAAAAT ACGAAATGGG AAAAGCTCAA TAATGAGGTC AGATGCACCC 900
ATTGGCAACT GCAGTTCTGA ATGCATCACT CCAAATGGAA GCATTCCCAA TGACAAACCT 960
TTTCAAAATG TAAACAGAAT CACATATGGG GCCTGCCCCA GATATGTTAA GCAAAACACT 1020
CTGAAATTGG CAACAGGGAT GCGGAATGTA CCAGAGAAAC AAACTAGAGG CATATTCGGC 1080
GCAATCGCAG GTTTCATAGA AAATGGTTGG GAGGGAATGG TAGACGGTTG GTACGGTTTC 1140
AGGCATCAAA ATTCTGAGGG CACAGGACAA GCAGCAGATC TTAAAAGCAC TCAAGCAGCA 1200
ATCGACCAAA TCAACGGGAA ACTGAATAGG TTAATCGAGA AAACGAACGA GAAATTCCAT 1260
CAAATCGAAA AAGAATTCTC AGAAGTAGAA GGGAGAATTC AGGACCTCGA GAAATATGTT 1320
GAAGACACTA AAATAGATCT CTGGTCTTAC AACGCGGAGC TTCTTGTTGC CCTGGAGAAC 1380
CAACATACAA TTGATCTAAC TGACTCAGAA ATGAACAAAC TGTTTGAAAA AACAAGGAAG 1440
CAACTGAGGG AAAATGCTGA GGACATGGGC AATGGTTGCT TCAAAATATA CCACAAATGT 1500
GACAATGCCT GCATAGGGTC AATCAGAAAT GGAACTTATG ACCATGATGT ATACAGAGAC 1560
GAAGCATTAA ACAACCGGTT CCAGATCAAA GGTGTTGAGC TGAAGTCAGG ATACAAAGAT 1620
TGGATCCTAT GGATTTCCTT TGCCATATCA TGCTTTTTGC TTTGTGTTGT TTTGCTGGGG 1680
TTCATCATGT GGGCCTGCCA AAAAGGCAAC ATTAGGTGCA ACATTTGCAT TTGAGGTACC 1740
AGATCTTAAT TAATTAA 1757
DUOMENYS APIE SEQ ID No: 15:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 571 aminorūgštis (B) TIPAS: aminorūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (iii) HIPOTETINE: NE (iv) ANTISENSINE: NE (v) FRAGMENTO TIPAS: N-terminalinis (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: AZŠandong/9/93 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDASZRAKTAS: AcNPV 61K baltymo signalinė seka (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: subrendęs rHA (B) BUVTMO VIETA: 19 iki 553 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 15:
Met 1 Pro Leu Tyr Lys 5 Leu Leu Asn Vai Leu 10 Trp Leu Vai Ala Vai 15 Ser
Asn Ala Ile Pro Gly Gln Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala
20 25 Asn 30
Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Vai Pro Gly Thr Leu Vai Lys
35 40 45
Thr Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Vai Thr Asn Ala Thr Glu Leu Vai
50 55 60
Gln Ser Ser Ser Thr Gly Arg Ile Cys Gly Ser Pro His Arg Ile Leu
65 70 75 80
Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Vai Glu Arg Ser
100 105 110
Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Vai Pro Asp Tyr Ala Ser
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Vai Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu
130 135 140
Asp 145 Phe Asn Trp Thr Gly 150 Vai Ala Gln Asp Gly 155 Gly Ser Tyr Ala Cys 160
Lys Arg Gly Ser Vai 165 Asn Ser Phe Phe Ser 170 Arg Leu Asn Trp Leu 175 His
Lys Leu Glu Tyr 180 Lys Tyr Pro Ala Leu 185 Asn Vai Thr Met Pro 190 Asn Asn
Gly Lys Phe 195 Asp Lys Leu Tyr Ile 200 Trp Gly Vai His His 205 Pro Ser Thr
Asp Ser 210 Asp Gln Thr Ser Leu 215 Tyr Vai Arg Ala Ser 220 Gly Arg Vai Thr
Vai 225 Ser Thr Lys Arg Ser 230 Gln Gln Thr Vai Thr 235 Pro Asn Ile Gly Ser 240
Arg Pro Trp Vai Arg 245 Gly Gln Ser Ser Arg 250 Ile Ser Ile Tyr Trp 255 Thr
Ile Vai Lys Pro 260 Gly Asp Ile Leu Leu 265 Ile Asp Ser Thr Gly 270 Asn Leu
Ile Ala Pro 275 Arg Gly Tyr Phe Lys 280 Ile Arg Asn Gly Lys 285 Ser Ser Ile
Met Arg 290 Ser Asp Ala Pro Ile 295 Gly Asn Cys Ser Ser 300 Glu Cys Ile Thr
Pro 305 Asn Gly Ser Ile Pro 310 Asn Asp Lys Pro Phe 315 Gln Asn Vai Asn Arg 320
Ile Thr Tyr Gly Ala 325 Cys Pro Arg Tyr Vai 330 Lys Gln Asn Thr Leu 335 Lys
Leu Ala Thr Gly 340 Met Arg Asn Vai Pro 345 Glu Lys Gln Thr Arg 350 Gly Ile
Phe Gly Ala 355 Ile Ala Gly Phe Ile 360 Glu Asn Gly Trp Glu 365 Gly Met Vai
Asp Gly 370 Trp Tyr Gly Phe Arg 375 His Gln Asn Ser Glu 380 Gly Thr Gly Gln
Ala 385 Ala Asp Leu Lys Ser 390 Thr Gln Ala Ala Ile 395 Asp Gln Ile Asn Gly 400
Lys Leu Asn Arg Leu 405 Ile Glu Lys Thr Asn 410 Glu Lys Phe His Gln 415 Ile
Glu Lys Glu Phe 420 Ser Glu Vai Glu Gly 425 Arg Ile Gln Asp Leu 430 Glu Lys
Tyr Vai Glu 435 Asp Thr Lys Ile Asp 440 Leu Trp Ser Tyr Asn 445 Ala Glu Leu
Leu Vai 450 Ala Leu Glu Asn Gln 455 His Thr Ile Asp Leu 460 Thr Asp Ser Glu
Met 465 Asn Lys Leu Phe Glu 470 Lys Thr Arg Lys Gln 475 Leu Arg Glu Asn Ala 480
Glu Asp Met Gly Asn 485 Gly Cys Phe Lys Ile 490 Tyr His Lys Cys Asp 495 Asn
Ala Cys Ile Gly 500 Ser Ile Arg Asn Gly 505 Thr Tyr Asp His Asp 510 Vai Tyr
Arg Asp Glu 515 Ala Leu Asn Asn Arg 520 Phe Gln Ile Lys Gly 525 Vai Glu Leu
Lys Ser 530 Gly Tyr Lys Asp Trp 535 Ile Leu Trp Ile Ser 540 Phe Ala Ile Ser
Cys 545 Gln Phe Lys Leu Gly Leu Asn Cys Ile 565 Vai 550 Arg Vai Cys Leu 'Asn Leu Ile Gly Cys S70 Phe 555 Ile Ile Met Trp Ala Cys 560
(2)DU0MENYS APIE SEQ ID No: 16:
(i) SEK0S CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS :1814 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULES TIPAS: DNR (genominė) (iii) HIPOTETINE: NE (iv) ANTISENSINE: NE (vijPRADINIS ŠALTINIS.
(B) ORGANIZMAS: gripo virusas (C) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Šanchajus/4/94 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: polihedrino mRNR lyderis (dalinis) (B) BUVIMO VETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signalą (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 72 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: Smal restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 76 iki 81 (ix) YPATUMAS (A) VARDASZRAKTAS: Kpni restrikcijos saitas (B) BUVTMO VIETA: 82 iki 87 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA (B) BUVIMO VIETA: 73 iki 1794 (ix) YPATUMAS
A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas (B)BUVIMO VIETA: 1804 iki 1814 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 16:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGGTACCGAT CGAATCTGCA CTGGGATAAC ATCTTCAAAC 12 0
TCACCTCATG TGGTCAAAAC AGCTACTCAA GGGGAGGTCA ATGTGACTGG TGTGATACCA 180
CTGACAACAA CACCAACAAA ATCTCATTTT GCAAATCTCA AAGGAACAAA GACCAGAGGG 240
AAACTATGCC CAAACTGTCT CAACTGCACA GATCTGGATG TGGCCTTGGG CAGACCAATG 300
TGTGTGGGGA CCACACCTTC GGCAAAAGCT TCAATACTCC ACGAAGTCAG ACCTGTTACA 360
TCCGGGTGCT TTCCTATAAT GCACGACAGA ACAAAAATCA GACAGCTACC CAATCTTCTC 420
AGAGGATATG AAAATATCAG ATTATCAACC CAAAACGTTA TCAACGCAGA AAAGGCACCA 480
GGAGGACCCT ACAGACTTGG AACCTCAGGA TCTTGCCCTA ACGCTACCAG TAGAAGCGGA 540
tttttcgcaa CAATGGCTTG GGCTGTCCCA AGGGACAACA ACAAAACAGC AACGAATCCA 600
CTAACAGTAG AAGTACCATA CATTTGCACA AAAGGAGAAG ACCAAATTAC TGTTTGGGGG 660
TTCCATTCTG ATAACAAACC CCAAATGAAA AACCTCTATG GAGACTCAAA TCCTCAAAAG 720
TTCACCTCAT CTGCTAATGG AGTAACCACA cattatgttt CTCAGATTGG CGGCTTCCCA 780
GATCAAACAG AAGACGGAGG GCTACCACAA AGCGGCAGAA -TTGTTGTTGA TTACATGGTG 840
CAAAAACCTG GGAAGACAGG AACAATTGTC TATCAGAGAG GTGTTTTGTT GCCTCAAAAG 900
GTGTGGTGCG CTAGTGGCAG GAGCAAAGTA ATAAAAGGGT CCTTGCCTTT AATTGGTGAA 960
GCAGATTGCC TTCACGAAAA ATACGGTGGA TTAAACAAAA GCAAGCCTTA CTACACAGGA 1020
GAACATGCAA AAGCCATAGG AAATTGCCCA ATATGGGTGA AAACACCTTT GAAGCTTGCC 1080
AATGGAACCA AATATAGACC TCCTGCAAAA CTATTAAAGG aaaggggttt CTTCGGAGCT 1140
ATTGCTGGTT TCTTAGAAGG AGGATGGGAA GGAATGATTG CAGGTTGGCA CGGATACACA 1200
TCTCACGGAG CACATGGAGT GGCAGTGGCA GCAGACCTTA AGAGTACGCA AGAAGCCATA 1260
AACAAGATAA CAAAAAATCT CAATTCTTTG AGTGAGCTAG AAGTAAAGAA TCTTCAAAGG 1320
CTAAGTGGTG CCATGGATGA ACTCCACAAC GAAATACTCG AGCTGGATGA GAAAGTGGAT 1380
GATCTCAGAG CTGACACAAT AAGCTCGCAA ATAGAACTTG CAGTCTTGCT TTCCAACGAA 1440
GGAATAATAA ACAGTGAAGA TGAGCATCTA TTGGCACTTG AGAGAAAACT AAAGAAAATG 1500
CTGGGTCCCT CTGCTGTAGA CATAGGAAAT GGATGCTTCG AAACCAAACA CAAGTGCAAC 1560
CAGACCTGCT TAGACAGGAT AGCTGCTGGC ACCTTTAATG CGGGAGAATT TTCTCTTCCC 1620
acttttgatt CACTGAATAT TACTGCTGCA TCTTTAAATG ATGATGGATT GGATAACCAT 16Θ0
ACTATACTGC TCTACTACTC AACTGCTGCT TCTAGTTTGG CGGTAACATT GATGATAGCT 1740
ATTTTTATTG TTTATATGGT CTCCAGAGAC aatgtttctt GCTCCATCTG TCTGTGAGGA 1800
TCTTAATTAA TTAA 1814
(2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 17:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 592 aminorūgštis (B) TIPAS: aminorūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (vi) MOLEKULĖS TIPAS: peptidas (vii) HIPOTETINĖ: NE (viii) ANTISENSINĖ: NE (ix) FRAGMENTO TIPAS: N-terminalinis (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
(D) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS JZOLIATAS: B/Šanchajus/4/94 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: AcNPV 61K baltymo signalinis peptidas (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: subrendęs rHA (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 574 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 17:
Met 1 Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Vai Leu Trp Leu Vai Ala Vai Ser
5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser
20 25 30
Ser Asn Ser Pro His Vai Vai Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Vai Asn
35 40 45
Vai Thr Gly Vai Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe
50 55 60
Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys
65 70 75 80
Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Vai Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Vai
85 90 95
Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Vai Arg Pro
100 105 110
Vai Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg
115 120 125
Gln Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu As'n Ile Arg Leu Ser Thr
130 135 140
Gln Asn Vai Ile Asn Ala Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu
145 150 155 160
Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn Ala Thr Ser Arg Ser Gly Phe Phe
165 170 175
Ala Thr Met Ala Trp Ala Vai Pro Arg Asp Asn Asn Lys Thr Ala Thr
180 185 190
Asn Pro Leu Thr Vai Glu Vai Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly Glu Asp
195 200 205
Gln Ile Thr Vai Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Lys Pro Gln Met Lys
210 215 220
Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn
225 230 235 240
Gly Vai Thr Thr His Tyr Vai 245 Ser Gln lle Gly Gly 250 Phe Pro Asd 255 Gln
Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln Ser Gly Arg lle Vai Vai Asp Tyr
260 265 270
Met Vai Gln Lys Pro Gly Lys Thr Gly Thr lle Vai Tyr Gln Arg Gly
275 280 285
Vai Leu Leu Pro Gln Lys Vai Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Vai
290 • 295 300
lle Lys Gly Ser Leu Pro Leu lle Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu
305 310 315 320
Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His
325 330 335
Ala Lys Ala lle Gly Asn Cys Pro lle Trp Vai Lys Thr Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu
355 360 365
Arg Gly Phe Phe Gly Ala lle Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu
370 375 380
Gly Met lle Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly
385 390 395 400
Vai Ala Vai Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala lle Asn Lys
405 410 415
lle Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Vai Lys Asn Leu
420 425 430
Gln Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu lle Leu Glu
435 440 445
Leu Asp Glu Lys Vai Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr lle Ser Ser Gln
450 455 460
lle Glu Leu Ala Vai Leu Leu Ser Asn Glu Gly lle lle Asn Ser Glu
465 470 475 480
Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly
485 490 495
Pro Ser Ala Vai Asp lle Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys
500 505 510
Cys Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg lle Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala
515 520 525
Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn lle Thr Ala Ala
530 535 540
Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr lle Leu Leu Tyr Tyr
545 550 •555 560
Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Vai Thr Leu Met lle Ala lle Phe
565 570 575
lle Vai Tyr Met Vai Ser Arg Asp Asn Vai Ser Cys Ser lle Cys Leu
580 585 590 (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 18:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 1802 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (ii) MOLEKULES TIPAS: DNR (genominė) (iii) HIPOTETINE: NE (iv) ANTISENSINE: NE . ' (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
(E) ORGANIZMAS: gripo virusas (F) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Harbmas/7/94 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: polihedrino mRNR lyderis (dalinis) (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis HA baltymo signalinį peptidą (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 69 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: SmaI restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 22 iki 27 (ix) YPATUMAS (AjVARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA (B)BUVIMO VIETA: 70 iki 1776 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: Kpnl restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 1780 iki 1785 ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: BglΠ restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 1786 iki 1791 (ix) YPATUMAS
A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas (B)BUVIMO VIETA: 1792 iki 1802 (x) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ED No: 18:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCGGGAAG GCAATAATTG TACTACTCAT GGTAGTAACA 60
TCCAACGCAG ATCGAATCTG CACTGGGATA ACATCTTCAA ACTCACCTCA TGTGGTCAAA 120
ACAGCTACTC AAGGGGAAGT CAATGTGACT GGTGTGATAC CACTGACAAC AACACCAACA ISO
AAATCTCATT TTGCAAATCT AAAAGGAACA AAGACCAGAG GGAAACTATG CCCAAACTGT 240
CTCAACTGCA CAGATCTGGA TGTGGCCTTG GGCAGACCAA TGTGTGTGGG GACCACACCT 300
TCGGCAAAAG CTTCAATACT CCACGAAGTC AGACCTGTTA CATCCGGGTG CTTTCCTATA 360
ATGCACGACA GAACAAAAAT CAGACAGCTA CCCAATCTTC TCAGAGGATA TGAAAATATC 420
AGATTATCAA CCCAAAACGT TATCAATGCA GAAAAAGCAC CAGGAGGACC CTACAGACTT 480
GGAACCTCAG GATCTTGCCC TAACGCTACC AGTAGAAGCG GATTTTTTGC AACAATGGCT 540
TGGGCTGTCC CAAGGGACGA CAACAAAACA GCAACGAATC CACTAACAGT AGAAGTACCA 600
TACGTTTGTA CAGAAGGAGA AGACCAAATT ACTGTTTGGG GGTTCCATTC TGATAACAAA 660
GCCCAAATGA AAAACCTCTA TGGAGACTCA AATCCTCAAA AGTTCACCTC ATCTGCTAAT 720
GGAGTAACCA CACATTATGT TTCTCAGATT GGCGGCTTCC CAGATCAAAC AGAAGACGGA 780
GGGCTACCAC AAAGCGGCAG AATTGTTGTT GATTACATGG TGCAAAAACC TGGGAAAACA 840
GGAACAATTG TCTATCAAAG AGGTGTTTTG TTGCCTCAAA AGGTGTGGTG CGCGAGTGGC 900
AGGAGCAAAG TAATAAAAGG GTCCTTGCCT TTAATTGGTG AAGCAGATTG CCTTCACGAA 960
AAATACGGTG GATTAAACAA AAGCAAGCCT TACTACACAG GAGAACATGC AAAAGCCATA 1020
GGAAATTGCC .CAATATGGGT GAAAACACCT TTGAAGCTTG CCAATGGAAC CAAATATAGA 1080
CCTCCTGCAA AACTATTAAA GGAAAGGGGT TTCTTCGGAG CTATTGCTGG TTTCTTAGAA 1140
GGAGGĄTGGG AAGGAATGAT TGCAGGTTGG CACGGATACA CATCTCACGG AGCACATGGA 1200
GTGGCAGTGG CAGCAGACCT TAAGAGTACG CAAGAAGCCA TAAACAAGAT AACAAAAAAT 1260
CTCAATTCTT TGAGTGAGCT AGAAGTAAAG AATCTTCAAA GACTAAGTGG TGCCATGGAT 1320
GAACTCCATA ACGAAATACT CGAGCTGGAT GAGAAAGTGG ATGATCTCAG AGCTGACACT 1380
ATAAGCTCGC AAATAGAACT TGCAGTCTTG CTTTCCAACG AAGGAATAAT AAACAGTGAA 1440
GATGAGCATC TATTGGCACT TGAGAGAAAA CTAAAGAAAA TGCTGGGTCC CTCTGCTGTA 1500
GACATAGGGA ATGGATGCTT CGAAACCAAA CACAAGTGCA ACCAGACCTG CTTAGACAGG 1560
ATAGCTGCTG GCACCTTTAA TGCAGGAGAA TTTTCTCTCC CCACTTTTGA TTCACTGAAT 1620
ATTACTGCTG CATCTTTAAA TGATGATGGA 72 TTGGATAATC ATACTATACT GCTCTACTAC 1680
TCAACTGCTG CTTCTAGTTT GGCTGTAACA TTGATGATAG CTATTTTTAT TGTTTATATG 1740
GTCTCCAGAG ACAATGTTTC ATGCTCCATC TGTCTGTGAG GTACCAGATC TTAATTAATT 1800
AA 1802
(2) DUOMENYS APE SEQ ID No: 19:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 586 aminorūgštis (B) TIPAS: aminorūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA, linijinė (xi) MOLEKULES T IPAS: peptidas (xii) HIPOTETINĖ: NE (xiii) ANTISENSINE: NE (xiv) FRAGMENTO TIPAS: N-terminalinis (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
(G) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Harbmas/7/94 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: HA signalinis peptidas (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 17 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: subrendęs rHA (B) BUVIMO VIETA: 18 iki 569 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 19:
Met Pro Gly Lys Ala Ile Ile Vai Leu Leu Met Vai Vai Thr Ser Asn
1 5 10 15
Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Vai
20 25 30
Vai Lys Thr Ala Thr Gln Gly Glu Vai Asn Vai Thr Gly Vai Ile Pro
35 40 45
Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr
50 55 60
Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu
65 70 75 80
Asp Vai Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Vai Gly Thr Thr Pro Ser Ala
85 90 95
Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Vai Arg Pro Vai Thr Ser Gly Cys Phe
100 105 110
Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gln Leu Pro Asn Leu Leu
115 120 125
Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gln Asn Vai Ile Asn Ala
130 135 140
Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys
145 150 155 160
Pro Asn Ala Thr Ser Arg Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala
165 170 175
Vai Pro Arg Asp Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Vai Glu
180 185 ιίο
Vai Pro Tyr Vai Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gln Ile Thr Vai Trp Gly
195 200 205
Phe His Ser Asp Asn Lys Ala Gln Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser
210 215 220
Asn Pro Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Vai Thr Thr His Tyr
225 230 235 240
Vai Ser Gln Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gln Thr Glu Asp Gly Gly Leu
245 250 255
Pro Gln Ser Gly Arg Ile Vai Vai Aso Tyr Met Vai Gln Lys Pro Gly
260 265 270
Lys Thr Gly Thr Ile Vai Tyr Gln Arg Gly Vai Leu Leu Pro Gln Lys
275 280 285
Vai Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Vai Ile Lys Gly Ser Leu Pro
290 295 300
Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn
305 310 315 320
Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn
325 330 335
Cys Pro Ile Trp Vai Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys
340 345 350
Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala
355 360 365
Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp
370 375 380
His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Vai Ala Vai Ala Ala Asp
385 390 395 400
Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn
405 410 415
Ser Leu Ser Glu Leu Glu Vai Lys Asn Leu Gln Arg Leu Ser Gly Ala
420 425 430
Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Vai Asp
435 440 445
Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gln Ile Glu Leu Ala Vai Leu
450 455 460
Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala
455 470 475 480
Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Vai Asp Ile
485 490 495
Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gln Thr Cys Leu
500 505 510
Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro
515 520 525
Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly
530 535 540
Leu Asp Asn Kis Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser
545 550 555 560
Leu Ala Vai Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Vai Tyr Met Vai Ser
565 570 575
Arg Asp Asn Vai Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580 585
DUOMENYS APIE SEQ ID No: 20:
©SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 1757 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (v) MOLEKULES TIPAS: DNR (genominė) (vi) HIPOTETINE: NE (vii) ANTISENSINĖ: NE (vi)PRADINIS ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: A/Johanesburgas/33/94 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: polihedrino mRNR lyderis (dalinis) (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signalinį peptidą (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 72 (ix) YPATUMAS (A) VARDASZRAKTAS: Smal restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 76 iki 81 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA (B) BUVIMO VIETA: 73 iki 1731 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: Kpnl restrikcijos saitas (B) BUVIMO VIETA: 1735 iki 1740 (ix) YPATUMAS (A)VARDAS/RAKTAS: BglII restrikcijos saitas (B)BUVIMO VIETA: 1741 iki 1747 (ix) YPATUMAS
A)VARDASZRAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas (B)BUVIMO VIETA: 1747 iki 1757 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 20:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GCAGGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTG 120
TGCCTGGGAC ACCATGCAGT GCCAAACGGA ACGCTAGTGA AAACAATCAC GAATGATCAA 180
ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGCTGGTT CAGAGTTCCC CAACAGGTAG AATATGCGAC 240
AGTCCTCACC GAATCCTTGA TGGAAAGAAC TGCACACTGA TAGATGCTCT ATTGGGAGAC 300
CCTCATTGTG ATGGCTTCCA AAATAAGGAA TGGGACCTTT TTGTTGAACG CAGCAAAGCT 360
TACAGCAACT GTTACCCTTA TGATGTGCCG GATTATGCCT CCCTTAGGTC ACTAGTTGCC 420
TCATCAGGCA CCCTGGAGTT TATCAACGAA AACTTCAATT GGACTGGAGT CGCTCAGGAT 480
GGGAAAAGCT ATGCTTGCAA AAGGGGATCT GTTAACAGTT TCTTTAGTAG ATTGAATTGG 540
TTGCACAAAT TAGAATACAA ATATCCAGCG CTGAACGTGA CTATGCCAAA CAATGGCAAA 600
TTTGACAAAT TGTACATTTG GGGGGTTCAC CACCCGAGCA CGGACAGTGA CCAAACCAGC 660
CTATATGTCC GAGCATCAGG GAGAGTCACA GTCTCTACCA AAAGAAGCCA ACAAACTGTA 720
ATCCCGGATA TCGGGTATAG ACCATGGGTA AGGGGTCAGT CCAGTAGAAT AGGCATCTAT 780
TGGACAATAG TAAAACCGGG AGACATACTT TTGATTAATA GCACAGGGAA TCTAATTGCT 840
CCTCGGGGTT ACTTCAAAAT ACGAAATGGG AAAAGCTCAA TAATGAGGTC AGATGCACCC 900
ATTGGCAACT GCAGTTCTGA ATGCATCACT CCAAATGGAA GCATTCCCAA TGACAAACCT 960
TTTCAAAATG TAAACAGGAT CACATATGGG GCCTGCCCCA GATATGTTAA GCAAAACACT 1020
CTGAAATTGG CAACAGGGAT GCGGAATGTA CCAGAGAAAC AAACTAGAGG CATATTCGGC 1080
GCAATCGCAG GTTTCATAGA AAATGGTTGG GAGGGAATGG TAGACGGTTG GTACGGTTTC 1140
AGGCATCAAA ATTCTGAGGG CACAGGACAA GCTGCAGATC TTAAAAGCAC TCAAGCAGCA 1200
ATCGACCAAA TCAACGGGAA ACTGAATAGG TTAGTCGAGA AAACGAACGA GAAATTCCAT 1260
CAAATCGAAA AAGAATTCTC AGAAGTAGAA GGGAGAATTC AGGACCTCGA GAAATATGTT 1320
GAAGACACTA AAATAGATCT CTGGTCTTAC AATGCGGAGC TTCTTGTTGC TCTGGAGAAC 1380
CAACATACAA TTGATCTAAC TGACTCAGAA ATGAACAAAC TGTTTGAAAG AACAAGGAAG 1440
CAACTGAGGG AAAATGCTGA GGACATGGGC AATGOTTGTT TCAAAATATA CCACAAATGT 1500
GACAATGCCT GCATAGGGTC AATCAGAAAT GGAACTTATG ACCATGATGT ATACAGAGAC 1560
GAAGCATTAA ACAACCGGTT CCAGATCAAA GGTGTTGAGC TGAAGTCAGG ATACAAAGAT 1620
TGGATTCTAT GGATTTCCTT TGCCATATCA TGCTTTTTGC TTTGTGTTGT TTTGCTTGGG 1680
TTCATCATGT GGGCCTGCCA AAAAGGCAAC ATTAGGTGCA ACATTTGCAT TTGAGGTACC 1740
AGATCTTAAT TAATTAA 1757
(2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 21:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 571 aminorūgštis (B) TIPAS: aminorūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (iijMOLEKULĖS TIPAS: peptidas (iii) HIPOTETINE: NE (iv) ANTISENSIN£: NE (v) FRAGMENTO TIPAS: N-terminalinis (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
(A) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: A/Johanesburgas/33/94 rHA (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: AcNPV 61K baltymo signalinė seka (B) BUVIMO VIETA: 1 iki 18 (ix) YPATUMAS (A) VARDAS/RAKTAS: subrendęs rHA (B) BUVIMO VIETA: 19 iki 569 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 21:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Vai Leu Trp Leu Vai Ala Vai Ser
1 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gln Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala
20 25 30
Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Vai Pro Asn Gly Thr Leu Vai Lys
35 40 45
Thr Ile Thr Asn Asp Gln Ile Glu Vai Thr Asn Ala Thr Glu Leu Vai
50 55 60
Gln Ser Ser Pro Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Arg Ile Leu
65 70 75 80
Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Gln Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Vai Glu Arg Ser
100 105 110
Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Vai Pro Asp Tyr Ala Ser
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Vai Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu
130 135 140
Asn Phe Asn Trp Thr Gly Vai Ala Gln Asp Gly Lys Ser Tyr Ala Cys
145 150 155 160
Lys Arg Gly Ser Vai Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Vai Thr Met Pro Asn Asn
160 185 190
Gly Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Vai His His Pro Ser Thr
195 200 205
Asp Ser Asp Gln Thr Ser Leu Tyr Vai Arg Ala Ser Gly Arg Vai Thr
210 215 220
Vai Ser Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Vai Ile Pro Asp Ile Gly Tyr
225 230 235 240
Arg Pro Trp Vai Arg Gly Gln Ser Ser Arg Ile Gly Ile Tyr Trp Thr
245 250 255
Ile Vai Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu
260 265 270
Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile
275 280 285
Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Asn Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr
290 295 300
Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Vai Asn Arg
305 310 315 320
Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Vai Lys Gln Asn Thr Leu Lys
325 330 335
Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Vai Pro 'Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile
340 345 350
Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Vai
355 360 365
Asp Gly 370 Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln
375 380
Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly
385 390 395 400
Lys Leu Asn Arg Leu Vai Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile
405 410 415
Glu Lys Glu Phe Ser Glu Vai Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys
• 420 425 430
Tyr Vai Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu
435 440 445
Leu Vai Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu
450 455 460
Met Asn Lys Leu Phe Glu Arg Thr Arg Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala
465 470 475 480
Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn
485 490 495
Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Vai Tyr
500 505 510
Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Vai Glu Leu
515 520 525
Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser
530 535 540
Cys Phe Leu Leu Cys Vai Vai Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys
545 550 555 550
Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
(2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 22:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 39 bazės (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 22:
TGGTTGGTCG CCGTTTCTAA CGCGATTCCC GGGGGTACC (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 23:
(1) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 13 aminorūgščių (B) TIPAS: aminorūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (ii) MOLEKULES TIPAS: peptidas (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 23:
Trp Leu Vai Ala Vai Ser Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr 1 5 10 (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 24:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 43 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (xi)SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 24:
TGGTTAGTCG CCTGTCCTG CAGGCCAGAG AGGCCTTGGT ACC (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 25:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė (xi)SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 25:
GTCGCCGTGT 18 (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 26:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi)SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 26: TAATTGGCCA GAGAGGCC 18 (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 27:
(1) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 39 bazės (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi)SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 27:
GGGGGATCCG GTACCAGCAA AAGCAGGGA TAATTCTAT 39 (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 28:
(1) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 38 bazės (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi)SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 28:
GGGGGTACCC CCGGGGACTT TCCAGGAAAT GACAACAG 38 (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 29:
(1) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 44 bazės (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi)SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 29:
CCCGGTACCG AATCATCCTA GAAACAAGGG TGTTTTAAT TAAT 44 (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 30:
(1) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 47 bazės (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi)SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 30:
GGGGAATTCG GTACCCCCGG GAAGGCAATA ATTGTACTAC TCATGGT 47 (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 31:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 36 bazės (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi)SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 31:
GGTACCCCCG GGGATCGAAT CTGCACTGGG ATAACA 36 (2) DUOMENYS APIE SEQ ID No: 32:
(i) SEKOS CHARAKTERISTIKOS:
(A) ILGIS: 50 bazių (B) TIPAS: nukleino rūgštis (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi)SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 32:
GGGGAATTCG GATCCGGTAC CTCACAGACA GATGGARCAA GAAACATTGT

Claims (26)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Rekombinantinis gripo viruso HAO hemagliutinino baltymas, ekspresuotas bakuloviruso ekspresijos sistemos pagalba vabzdžių ląstelių kultūroje.
  2. 2. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad bakuloviruso signalinis peptidas prijungtas tiesiogiai prie HAO baltymo be įsiterpiančių sekų.
  3. 3. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi vaistiniu požiūriu tinkamą nešiklį ir yra paruoštas naudoti kaip vakcina.
  4. 4. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi adjuvantą ir vaistiniu požiūriu tinkamą nešiklį ir yra paruoštas naudoti kaip vakcina.
  5. 5. Baltymas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad vaistiniu požiūriu tinkamas nešiklis yra polimerinė pateikimo sistema.
  6. 6. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad gripo virusas yra atrinktas iš grupės, sudarytos iš gripo viruso A ir B kamienų.
  7. 7. Baltymas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad gripo virusas infekuoja žmones.
  8. 8. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi antrąjį baltymą, kuris yra sulietas su hemagliutininu.
  9. 9. Baltymas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra atrinktas iš grupės, sudarytos iš hepatito B viruso baltymų, ŽIV baltymų, karcinoembrioninio antigeno ir neuraminidazės.
  10. 10. Vektorius, naudojamas, rekombinantinio gripo viruso HAO hemagliutinino baltymo gamybai, susidedantis iš šių 5' - >3' sekų: bakuloviruso polihedrino promotoriaus, ATG transliacijos startinio kodono, signalinio peptido, sekų, koduojančių gripo viruso kamieno subrendusi hemagliutininą, transliacijos terminacijos kodono ir polihedrino RNR poliadenilinimo signalo.
  11. 11. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo signalinis peptidas yra bakuloviruso baltymas, kurio molekulinė masė apie 61K ir aminorūgščių sekų rinkinys yra tarp pirmųjų 18 aminorūgščių, nurodytų Sekų Sąraše ID No. 7.
  12. 12. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi signalinį peptidą, kuris yra gripo viruso hemagliutinino baltymo promotorius.
  13. 13. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo seka, koduojanti signalinį peptidą ir hemagliutininą, nekoduoja jokių įsiterpiančių aminorūgščių.
  14. 14. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi seką, koduojančią antrąjį baltymą, kuris yra ekspresuojamas kaip sulietas su hemagliutininu baltymas.
  15. 15. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra transfekuotas į kultivuojamas vabzdžių ląsteles.
  16. 16. Rekombinantinio gripo viruso hemagliutinino baltymo gavimo būdas, susidedantis iš vabzdžių ląstelių kultūros užkrėtimo panaudojant vektorių, turintį šias 5' -> 3' sekas: bakuloviruso polihedrino promotoriaus, ATG transliacijos startinio kodono, signalinio peptido, sekų, koduojančių gripo viruso kamieno, atrinkto iš grupės, sudarytos iš gripo viruso A ir B kamienų, hemagliutininą, transliacijos terminacijos kodono ir polihedrino RNR poliadenilinimo signalo, ir ląstelių auginimo maitinančioje terpėje.
  17. 17. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad galima išskirti HAO gripo viruso hemagliutinino baltymą iki mažiausiai 95% grynumo.
  18. 18. Būdas pagal 17 punktą, besiskiriantis tuo, kacf baltymą gauna išskiriant hemagliutininą iš nemembraninių baltymų šarminiame pH, plaunant su membrana susijusius baltymus tam, kad būtų eliuotas hemagliutininas, išskiriant hemagliutininą iš kitų baltymų, pririšant juos prie anijonų kaitos celiuliozės keičiant druskos koncentraciją.
  19. 19. Vektoriaus, turinčio šias 5' -> 3' sekas: bakuloviruso polihedrino promotoriaus, ATG transliacijos startinio kodono, signalinio peptido, sekų, koduojančių gripo viruso kamieno, atrinkto iš grupės, sudarytos iš gripo viruso A ir B kamienų, hemagliutininą, transliacijos terminacijos kodono ir polihedrino RNR poliadenilinimo signalo, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad virusas surenkamas iš ląstelių kultūros terpės ir išskiriama arba gripo viruso A kamienų virusinė RNR , arba B kamienų mRNR; sintezuojama cDNR naudojant arba universalų pradmenį (5' - AGCAAAAGCAGG-3' ( SEQ ID No. 1), kuomet dirbama su gripo viruso A kamienų virusine RNR, arba atsitiktinius pradmenis, kuomet dirbama su gripo viruso B kamienų mRNR, ir kuomet 5' ir 3' pradmenys turi tokius restrikcijos enzimų saitus galuose, kurie nerandami hemagliutininų genų viduje; amplifikuojami A arba B gripo viruso pradmenys ir gripo viruso cDNR sumaišant su hemagliutinino geno segmentais, tam, kad būtų gauti dvisiūliai DNR fragmentai, turintys sekas, koduojančias pilną subrendusį hemagliutininą; identifikuojamas hemagliutinino genų signalinis peptidas ir tuomet amplifikuojami hemagliutinino genai be signalinio peptido; ir klonuojami hemagliutinino genai be signalinio peptido vektoriuje, turinčiame savo sudėtyje AcNPV polhedrino promotorių.
  20. 20. Būdas pagal 19 punktą, besiskiriantis tuo, kad hemagliutinino genus klonuoja vektoriuje, panaudojant PCR tokiu būdu, kad vektorius koduotų signalini peptidą, sujungtą tiesiogiai su hemagliutininų be įsiterpiančių aminorūgščių.
  21. 21. Būdas pagal 19 punktą, besiskiriantis tuo, kad vektorių transfekuoja j vabzdžių ląsteles ir atrenka ląsteles, ekspresuojančias hemagliutininą.
  22. 22. Rekombinantinio HAO hemagliutinino baltymas, ekspresuotas bakuloviruso ekspresijos sistemos pagalba vabzdžių ląstelių kultūroje, skirtas panaudoti vakcinacijai nuo gripo.
  23. 23. Baltymas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad naudoja baltymą polimerinėje pateikimo sistemoje.
  24. 24. Baltymas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad gripo virusą atrenka iš grupės, sudarytos iš gripo viruso A ir B kamienų.
  25. 25. Baltymas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad gyvūną pasirenka iš grupės, kuriai priklauso žinduolių ir paukščių rūšys.
  26. 26. Baltymas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad gyvūnas yra žmogus.
LT97-201A 1993-09-13 1997-12-23 Gripo hemagliutinino multivalentinių vakcinų gamybos būdas LT4461B (lt)

Priority Applications (29)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/120,607 US5762939A (en) 1993-09-13 1993-09-13 Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
DK05076536.1T DK1605052T3 (da) 1993-09-13 1995-05-26 Fremgangsmåde til at producere multivalente influenzahæmaglutininvacciner
CNB951979280A CN100390289C (zh) 1993-09-13 1995-05-26 生产流感血凝素多价疫苗的方法
CA2222129A CA2222129C (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
NZ288026A NZ288026A (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
EP11159899.1A EP2374894B1 (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
AT95922133T ATE304602T1 (de) 1993-09-13 1995-05-26 Vektor und methode zur herstellung von influenza hämagglutinin
ES95922133T ES2248799T3 (es) 1993-09-13 1995-05-26 Vector y procedimiento de produccion de hemaglutinina de virus gripales.
AT05076536T ATE518000T1 (de) 1993-09-13 1995-05-26 Methode für die produktion von multivalenten influenza hämagglutinin vakzinen
BR9510590-5A BR9510590A (pt) 1993-09-13 1995-05-26 Processo para produzir vacinas multivalentes de hemoglutinina de gripe.
HU9801395A HUT77921A (hu) 1993-09-13 1995-05-26 Eljárás multivalens influenza hemagglutinin vakcinák előállítására
DE69534449T DE69534449T2 (de) 1993-09-13 1995-05-26 Vektor und methode zur herstellung von influenza hämagglutinin
EP95922133A EP0833933B1 (en) 1993-09-13 1995-05-26 A vector and method for producing influenza hemagglutinin
PT05076536T PT1605052E (pt) 1993-09-13 1995-05-26 Método para produzir vacinas multivalentes de hemaglutinina de influenza
EP05076536A EP1605052B1 (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
CZ20080037A CZ299862B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid
DK95922133T DK0833933T3 (da) 1993-09-13 1995-05-26 En vektor samt fremgangsmåde til fremstilling af influenza-hæmagglutinin
PCT/US1995/006750 WO1996037624A1 (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
DK02076629T DK1275726T3 (da) 1993-09-13 1995-05-26 Fremgangsmåde til fremstilling af influenzahæmagglutinin-multivalente vacciner
JP53561796A JP3757318B2 (ja) 1993-09-13 1995-05-26 インフルエンザ血球凝集素多価ワクチンの製造方法
AU26925/95A AU712776B2 (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
SK1588-97A SK286441B6 (sk) 1993-09-13 1995-05-26 Vektor na výrobu rekombinantného chrípkového HAO hemaglutinínového proteínu a spôsob výroby hemaglutinínu
CZ0373897A CZ301021B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 V podstate cistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chripkový HAO hemaglutininový protein, vektor pro výrobu rekombinantního HAO hemaglutininového proteinu, zpusob výroby uvedeného proteinu a vakcína obsahující uvedený protein
US08/453,848 US5858368A (en) 1993-09-13 1995-05-30 Vaccine comprising a baculovirus produced influenza hemagglutinin protein fused to a second protein
IS4620A IS4620A (is) 1993-09-13 1997-11-25 Aðferð til framleiðslu á fjölgildum inflúensu hemagglútínín bóluefnum
FI974319A FI974319A (fi) 1993-09-13 1997-11-25 Menetelmä monenarvoisten influenssahemaglutiniinirokotteiden valmistamiseksi
NO975434A NO975434L (no) 1993-09-13 1997-11-26 Fremgangsmåte for fremstilling av influensa hemagglutinin multivalente vaksiner
LT97-201A LT4461B (lt) 1993-09-13 1997-12-23 Gripo hemagliutinino multivalentinių vakcinų gamybos būdas
HK06106203.4A HK1083867A1 (en) 1993-09-13 2006-05-29 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/120,607 US5762939A (en) 1993-09-13 1993-09-13 Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
CA2222129A CA2222129C (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
PCT/US1995/006750 WO1996037624A1 (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
CNB951979280A CN100390289C (zh) 1993-09-13 1995-05-26 生产流感血凝素多价疫苗的方法
LT97-201A LT4461B (lt) 1993-09-13 1997-12-23 Gripo hemagliutinino multivalentinių vakcinų gamybos būdas

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LT97201A LT97201A (lt) 1998-09-25
LT4461B true LT4461B (lt) 1999-02-25

Family

ID=27508642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LT97-201A LT4461B (lt) 1993-09-13 1997-12-23 Gripo hemagliutinino multivalentinių vakcinų gamybos būdas

Country Status (22)

Country Link
US (2) US5762939A (lt)
EP (2) EP1605052B1 (lt)
JP (1) JP3757318B2 (lt)
CN (1) CN100390289C (lt)
AT (2) ATE518000T1 (lt)
AU (1) AU712776B2 (lt)
BR (1) BR9510590A (lt)
CA (1) CA2222129C (lt)
CZ (2) CZ299862B6 (lt)
DE (1) DE69534449T2 (lt)
DK (3) DK1275726T3 (lt)
ES (1) ES2248799T3 (lt)
FI (1) FI974319A (lt)
HK (1) HK1083867A1 (lt)
HU (1) HUT77921A (lt)
IS (1) IS4620A (lt)
LT (1) LT4461B (lt)
NO (1) NO975434L (lt)
NZ (1) NZ288026A (lt)
PT (1) PT1605052E (lt)
SK (1) SK286441B6 (lt)
WO (1) WO1996037624A1 (lt)

Families Citing this family (167)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6387373B1 (en) * 1993-01-15 2002-05-14 Novavax, Inc. Vaccines containing paucilsmellar lipid vesicles as immunological adjuvants
EP2374894B1 (en) * 1993-09-13 2014-09-17 Protein Sciences Corporation A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
DE19612966B4 (de) * 1996-04-01 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren
DE19612967A1 (de) * 1996-04-01 1997-10-02 Behringwerke Ag Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, sowie die durch das Verfahren erhältlichen Influenzaviren
US7157089B1 (en) * 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
ATE327259T1 (de) 1997-08-05 2006-06-15 Stressgen Biotechnologies Corp Immunantwort gegen hpv antigene hervorgerufen von zusammensetzungen die ein hpv antigen und ein stressprotein enthalten oder einem expressionsvektor fähig zur expression dieser proteine
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) * 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6541011B2 (en) * 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
US8026096B1 (en) 1998-10-08 2011-09-27 Protein Sciences Corporation In vivo active erythropoietin produced in insect cells
MXPA01006214A (es) * 1998-12-17 2004-09-06 Aventis Pasteur Composicion inmunogenica multivalente que contiene una preparacion de virus de influenza y una composicion de subunidad del virus sincicial respiratorio.
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
CA2378097A1 (en) * 1999-07-08 2001-01-18 Stressgen Biotechnologies Corporation Induction of a th1-like response in vitro
US6544750B1 (en) 1999-08-17 2003-04-08 Thromgen, Inc. Peptide analogs as selective inhibitors of thrombin activation of protease activated receptor 1
DE19963857A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-26 Qiagen Gmbh Primer, insbesondere für Primer-abhängige Nukleinsäure-Syntheseprozesse und Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren
NZ523408A (en) 2000-06-26 2006-02-24 Stressgen Biotechnologies Corp Human papilloma virus treatment
US20060177416A1 (en) * 2003-10-14 2006-08-10 Medivas, Llc Polymer particle delivery compositions and methods of use
GB0022969D0 (en) * 2000-09-19 2000-11-01 Chiron Spa Influenza a virus subtype H16
JPWO2002062381A1 (ja) * 2001-02-05 2004-06-03 久光製薬株式会社 バキュロウイルスベクターワクチン
DE10144906B4 (de) * 2001-09-12 2013-11-28 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen
US7232670B2 (en) * 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
DE10218129A1 (de) * 2002-04-23 2003-11-20 Univ Ruprecht Karls Heidelberg Genetischer Impfstoff gegen RNA-Virus-Infektionen
WO2005018539A2 (en) 2003-06-16 2005-03-03 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
ATE478137T1 (de) * 2003-06-20 2010-09-15 Microbix Biosystems Inc Verbesserungen bei der virusproduktion
EP1668112A4 (en) 2003-06-20 2009-04-29 Protein Sciences Corp SARS IMMUNOGENOUS EXPRESSING VECTORS, SUCH VECTORS OR EXPRESSION PRODUCTS COMPRISING THOSE COMPOSITIONS, PROCESSES AND TESTS FOR THE PREPARATION AND USE THEREOF
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
US8992939B2 (en) 2003-07-11 2015-03-31 Novavax, Inc. Highly efficient influenza matrix (M1) proteins
US8506967B2 (en) 2003-07-11 2013-08-13 Novavax, Inc. Functional influenza virus like particles (VLPs)
US8080255B2 (en) 2003-07-11 2011-12-20 Novavax Inc. Functional influenza virus like particles (VLPs)
US20070160622A1 (en) * 2005-12-07 2007-07-12 Medivas, Llc Method for assembling a polymer-biologic delivery composition
US7527967B2 (en) * 2003-11-25 2009-05-05 Academia Sinica Recombinant baculovirus and virus-like particle
AU2005211385B2 (en) * 2004-02-02 2008-12-11 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone polypeptides and their uses
EP1773858B1 (en) 2004-05-27 2016-06-22 Janssen Biotech, Inc. Cynomolgus prostate specific antigen
US20050276758A1 (en) * 2004-06-15 2005-12-15 Marshall Deborah J Method for screening agents against human prostate disease
WO2006009901A2 (en) * 2004-06-18 2006-01-26 Ambrx, Inc. Novel antigen-binding polypeptides and their uses
US7638299B2 (en) * 2004-07-21 2009-12-29 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
MX2007007591A (es) * 2004-12-22 2007-07-25 Ambrx Inc Metodos para expresion y purificacion de hormona de crecimiento humano recombinante.
US7816320B2 (en) 2004-12-22 2010-10-19 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid at position 35
EP1836298B1 (en) * 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
ATE542920T1 (de) * 2004-12-22 2012-02-15 Ambrx Inc Modifiziertes menschliches wachstumshormon
MX2007007590A (es) 2004-12-22 2007-12-10 Ambrx Inc Composiciones que contienen, metodos que involucran y usos de aminoacidos no naturales y polipeptidos.
MY157941A (en) 2005-01-19 2016-08-15 Vaxinnate Corp Compositions of pathogen-associated molecular patterns and methods of use
JP2008531581A (ja) * 2005-02-23 2008-08-14 ユーエービー リサーチ ファウンデーション アルキル−グリコシドで増強されたワクチン接種
EP1856271A4 (en) 2005-03-08 2009-11-18 Medimmune Vaccines Inc INFLUENZA HEMAGGLUTININE AND NEURAMINIDASE VARIANTS
PT1861120T (pt) * 2005-03-23 2016-08-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Utilização de um vírus influenza e de um adjuvante de emulsão óleo-em-água para induzir células t cd4 e/ou melhorar a resposta de células b de memória
US11865172B2 (en) 2005-04-21 2024-01-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
CN103030690A (zh) * 2005-06-03 2013-04-10 Ambrx公司 经改良人类干扰素分子和其用途
US7871626B2 (en) 2005-08-04 2011-01-18 St. Jude Children's Research Hospital Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency
KR101285904B1 (ko) 2005-08-18 2013-07-15 암브룩스, 인코포레이티드 ｔＲＮＡ 조성물 및 이의 용도
EP1933881B1 (en) * 2005-09-22 2019-03-13 Medivas, LLC Solid polymer delivery compositions and methods for use thereof
CA2623198C (en) 2005-09-22 2014-08-05 Medivas, Llc Bis-(a-amino)-diol-diester-containing poly(ester amide) and poly(ester urethane) compositions and methods of use
US7468187B2 (en) * 2005-10-18 2008-12-23 Iowa State University Research Foundation, Inc. Canine influenza virus and related compositions and methods of use
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
JP2009514839A (ja) 2005-11-04 2009-04-09 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル サイトカイン誘導剤を含むアジュバントインフルエンザワクチン
US8697087B2 (en) 2005-11-04 2014-04-15 Novartis Ag Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators
ES2420829T3 (es) * 2005-11-04 2013-08-27 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Vacunas adyuvantadas con antígeno de no virión preparadas a partir de virus de la gripe cultivados en cultivo celular
NZ594482A (en) 2005-11-04 2012-11-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant
CN101400646A (zh) * 2005-11-08 2009-04-01 Ambrx公司 用于修饰非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促进剂
US20090018029A1 (en) * 2005-11-16 2009-01-15 Ambrx, Inc. Methods and Compositions Comprising Non-Natural Amino Acids
CN105384807A (zh) * 2005-12-14 2016-03-09 Ambrx公司 含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途
EA015271B1 (ru) 2006-01-27 2011-06-30 Новартис Вэксинс Энд Диагностикс Гмбх & Ко Кг Противогриппозные вакцины, содержащие гемагглютинин и белки матрикса
US9333249B2 (en) 2006-02-09 2016-05-10 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
TWI477602B (zh) 2006-02-09 2015-03-21 Educational Foundation Jichi Medical Univ Novel viral vector
CU23576A1 (es) 2006-02-28 2010-09-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la influenza aviar
EP1991264B1 (en) 2006-03-07 2015-01-07 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
EP2004226A1 (en) 2006-03-24 2008-12-24 Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH & Co. KG Storage of influenza vaccines without refrigeration
EP2019645A4 (en) * 2006-05-02 2013-03-06 Medivas Llc RELEASE OF OPHTHALMOLOGICAL ACTIVITIES OUTSIDE OR WITHIN THE EYE
CN102258778B (zh) * 2006-05-05 2014-08-13 淡马锡生命科学研究院有限公司 生物分子表面展示及其用途
WO2007133616A2 (en) * 2006-05-09 2007-11-22 Medivas, Llc Biodegradable water soluble polymers
MX2009000660A (es) 2006-07-17 2009-04-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna de influenza.
GB0614460D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
SG174781A1 (en) * 2006-09-08 2011-10-28 Ambrx Inc Hybrid suppressor trna for vertebrate cells
AU2007292903B2 (en) 2006-09-08 2012-03-29 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or Fc scaffolds and their uses
JP5451390B2 (ja) * 2006-09-08 2014-03-26 アンブルックス，インコーポレイテッド 脊椎動物細胞内におけるサプレッサーｔｒｎａの転写
US20100105025A1 (en) * 2006-10-12 2010-04-29 Engelhard Eric K Devices for generating detectable polymers
US20080124710A1 (en) * 2006-10-12 2008-05-29 Engelhard Eric K Devices for generating detectable polymers
WO2008118487A2 (en) * 2007-03-26 2008-10-02 University Of Massachusetts Medical School Compositions and methods for incresing immunogenicity of glycoprotein vaccines
KR101476472B1 (ko) * 2007-03-30 2015-01-05 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
PE20090146A1 (es) 2007-04-20 2009-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica contra el virus influenza
CA2685596A1 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
PL2185191T3 (pl) * 2007-06-27 2013-02-28 Novartis Ag Szczepionki przeciwko grypie o małej zawartości dodatków
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
US20090029937A1 (en) * 2007-07-24 2009-01-29 Cornell University Biodegradable cationic polymer gene transfer compositions and methods of use
NZ584825A (en) 2007-11-20 2013-03-28 Ambrx Inc Modified insulin polypeptides and their uses
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
PT2610345E (pt) * 2007-11-27 2016-01-11 Medicago Inc Partículas semelhantes ao vírus (vlps) da gripe recombinantes produzidas em plantas transgénicas que expressam hemaglutinina
JP5702150B2 (ja) 2008-02-08 2015-04-15 アンブルックス, インコーポレイテッドAmbrx, Inc. 修飾されているレプチンポリペプチドおよびそれらの使用
ES2594102T3 (es) 2008-04-18 2016-12-15 Vaxinnate Corporation Mutantes por deleción de la flagelina y métodos para su uso
CA2730171C (en) * 2008-07-08 2016-10-11 Medicago Inc. Soluble recombinant influenza antigens
RU2523587C2 (ru) 2008-07-11 2014-07-20 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Варианты гемагглютинина и нейрамидазы вируса гриппа
JP5680534B2 (ja) 2008-07-23 2015-03-04 イーライ リリー アンド カンパニー 修飾されているウシｇ−ｃｓｆポリペプチドおよびそれらの使用
EP2323671A4 (en) * 2008-08-13 2012-09-26 Medivas Llc BIODEGRADABLE AABB POLY (DEPSIPEPTIDE) POLYMERS AND METHOD FOR THEIR USE
US8658180B2 (en) 2008-08-15 2014-02-25 Mark A. Miller Vaccines against influenza virus
AU2009296267B2 (en) 2008-09-26 2013-10-31 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
PL2342223T3 (pl) 2008-09-26 2017-09-29 Ambrx, Inc. Zmodyfikowane polipeptydy zwierzęcej erytropoetyny i ich zastosowania
CN102307590A (zh) 2009-02-10 2012-01-04 诺华有限公司 具有减少量的角鲨烯的流感疫苗
USH2283H1 (en) 2009-04-27 2013-09-03 Novartis Ag Vaccines for protecting against influenza
JP5823379B2 (ja) 2009-05-29 2015-11-25 ノバルティス アーゲー インフルエンザウイルスヘマグルチニンについてのアッセイ
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
GB2471093A (en) * 2009-06-17 2010-12-22 Cilian Ag Viral protein expression in ciliates
ES2669303T3 (es) 2009-06-24 2018-05-24 Medicago Inc. Partículas pseudovíricas quiméricas de influenza que comprenden hemaglutinina
US9849173B2 (en) 2009-07-06 2017-12-26 Variation Biotechnologies Inc. Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
CA2803282C (en) 2009-07-06 2018-05-01 David E. Anderson Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
US9024766B2 (en) * 2009-08-28 2015-05-05 The Invention Science Fund, Llc Beverage containers with detection capability
US8898069B2 (en) * 2009-08-28 2014-11-25 The Invention Science Fund I, Llc Devices and methods for detecting an analyte in salivary fluid
BR112012008338A2 (pt) 2009-09-10 2019-09-24 Novartis Ag combinação de vacinas contra doenças do trato respiratório.
PT3354657T (pt) 2009-09-22 2022-05-06 Medicago Inc Método de preparação de proteínas derivadas de plantas
CN107674121A (zh) 2009-12-21 2018-02-09 Ambrx 公司 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途
CN104017063A (zh) 2009-12-21 2014-09-03 Ambrx公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途
IN2012DN06277A (lt) * 2009-12-28 2015-09-25 Dsm Ip Assets Bv
WO2011082189A1 (en) * 2009-12-28 2011-07-07 Martek Biosciences Corporation Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae
US20120009212A1 (en) * 2010-01-26 2012-01-12 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Conjugates utilizing platform technology for stimulating immune response
JP2013522231A (ja) * 2010-03-11 2013-06-13 イミューン デザイン コーポレイション インフルエンザのためのワクチン
EP3187585A1 (en) 2010-03-25 2017-07-05 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
KR102471356B1 (ko) 2010-06-01 2022-11-28 노파르티스 아게 동결건조하지 않는 인플루엔자 백신 항원의 농축
CA2801151A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Novartis Ag Concentration of vaccine antigens with lyophilization
AU2011276223C1 (en) 2010-07-06 2016-05-12 Variation Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treating influenza
MX346786B (es) 2010-08-17 2017-03-31 Ambrx Inc Polipeptidos de relaxina modificados y sus usos.
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
AU2011290471B2 (en) 2010-08-20 2015-08-20 Novartis Ag Soluble needle arrays for delivery of influenza vaccines
US8513006B2 (en) 2010-09-14 2013-08-20 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Tetravalent influenza vaccine and use thereof
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
CN102023213B (zh) * 2010-09-28 2014-04-02 汕头大学医学院 一种检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法
EP2663288B1 (en) 2011-01-13 2022-12-21 Variation Biotechnologies Inc. Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
MX359103B (es) 2011-01-13 2018-09-14 Variation Biotechnologies Inc Composiciones y sus usos en el tratamiento de infecciones virales.
KR20200044990A (ko) 2011-03-21 2020-04-29 알티뮨 인크. 급속 및 지속적 면역학적제제-치료제
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
PL2691530T3 (pl) 2011-06-10 2019-02-28 Oregon Health & Science University Glikoproteiny i rekombinowane wektory CMV
EP2723800B1 (en) 2011-06-23 2015-10-07 DSM IP Assets B.V. Micro- or nanoparticles comprising a biodegradable polyesteramide copolymer for use in the delivery of bioactive agents
US9873765B2 (en) 2011-06-23 2018-01-23 Dsm Ip Assets, B.V. Biodegradable polyesteramide copolymers for drug delivery
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
AU2012324398A1 (en) 2011-10-20 2014-05-01 Seqirus UK Limited Adjuvanted influenza B virus vaccines for pediatric priming
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
EP2780350B1 (en) 2011-11-18 2019-03-06 Variation Biotechnologies Inc. Synthetic derivatives of mpl and uses thereof
CA2858794A1 (en) 2011-12-12 2013-06-20 Novartis Ag Assays for influenza virus hemagglutinins
CN104302323A (zh) 2012-01-12 2015-01-21 变异生物技术公司 用于治疗病毒感染的组合物和方法
RU2698906C2 (ru) 2012-01-27 2019-09-02 Вэриэйшн Биотекнолоджиз, Инк. Способы и композиции для терапевтических агентов
TWI434933B (zh) * 2012-04-17 2014-04-21 Nat Univ Tsing Hua 抗多型禽流感病毒之ｄｎａ疫苗及其組合物
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
US8932598B2 (en) 2012-08-28 2015-01-13 Vaxinnate Corporation Fusion proteins and methods of use
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
JP2015015931A (ja) 2013-07-12 2015-01-29 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法
JP6479305B2 (ja) 2013-07-12 2019-03-06 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子の精製方法
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
KR102637699B1 (ko) 2014-10-24 2024-02-19 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도
US10434071B2 (en) 2014-12-18 2019-10-08 Dsm Ip Assets, B.V. Drug delivery system for delivery of acid sensitivity drugs
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
MX2017014146A (es) * 2015-05-04 2018-08-14 Epivax Inc Glicoproteína de hemaglutinina h7 modificada de la secuencia de influenza a/shanghai/2/2013 h7.
WO2016207853A2 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Seqirus UK Limited Antigenically matched influenza vaccines
CN108027371B (zh) * 2015-07-07 2020-08-18 思齐乐 流感效力试验
WO2017123652A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Verndari, Inc. Microneedle compositions and methods of using same
CN106749554B (zh) * 2017-01-20 2021-01-15 中山大学 一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法
SG11201907209QA (en) 2017-02-08 2019-09-27 Bristol Myers Squibb Co Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
US10874737B2 (en) 2018-06-01 2020-12-29 Iowa State University Research Foundation, Inc. Influenza nanovaccine
CA3190375A1 (en) 2020-08-24 2022-03-03 Natalie ANOSOVA Covid-19 vaccines with tocopherol-containing squalene emulsion adjuvants
KR20230054719A (ko) 2020-08-24 2023-04-25 사노피 파스퇴르 인크 Sars-cov-2 감염에 대한 백신
WO2023059857A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines
WO2023081798A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines comprising recombinant hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same
CA3237139A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Hybrid multivalent influenza vaccines comprising hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same
WO2024030856A2 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024077118A2 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Bicara Therapeutics Inc. Multispecific proteins and related methods
CN116763915B (zh) * 2023-08-17 2023-11-03 山东兴瑞生物科技有限公司 一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4029763A (en) * 1974-08-05 1977-06-14 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Influenza vaccine containing purified neuraminidase antigen and method of using the same
IN150740B (lt) * 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4659669A (en) * 1981-03-02 1987-04-21 Regents Of The Univ. Of California Microbial expression of human influenza hemagglutinin proteins
US4752473A (en) * 1984-10-12 1988-06-21 The Regents Of The University Of California Expression of glycosylated human influenza hemagglutinin proteins
US4920213A (en) * 1985-06-20 1990-04-24 Biotechnology Research Partners, Ltd. Method and compositions useful in preventing equine influenza
EP0349594A4 (en) * 1987-03-16 1990-09-26 American Biogenetic Sciences, Inc. Recombinant baculovirus occlusion bodies in vaccines and biological insecticides
GB9106185D0 (en) * 1991-03-22 1991-05-08 Wellcome Found Biological control agents
CA2084180A1 (en) 1991-12-11 1993-06-12 Paul P. Hung Expression of specific immunogens using viral antigens
AU2517995A (en) * 1994-05-20 1995-12-18 Microgenesys, Inc. Immunogenic carcinoembryonic antigen and methods of use and production

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A RAJAKUMAR, E M SWIERKOSZ, I T SCHULZE: "Sequence of an influenza virus hemagglutinin determined directly from a clinical sample", PROC NATL ACAD SCI USA., 1990, pages 4154 - 4158
B. N. KNIPE AT AL.: "Virology, red. Fields", pages: 1091 - 1152
DOUGLAS C. POWERS, ROBERT B. BELSHE: "Effect of Age on Cytotoxic T Lymphocyte Memory as well as Serum and Local Antibody Responses Elicited by Inactivated Influenza Virus Vaccine", J INFECT DIS., 1993, pages 584 - 592
I. A. WILSON, J. J. SKEHEL, D. C. WILEY: "Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 Ã… resolution", NATURE, 1981, pages 366 - 373, XP002689324, DOI: doi:10.1038/289366a0
JOHANSSON BE, BUCHER DJ, KILBOURNE ED: "Purified influenza virus hemagglutinin and neuraminidase are equivalent in stimulation of antibody response but induce contrasting types of immunity to infection", J VIROL., 1989, pages 1239 - 1246
OGRA PL ET AL.: "Clinical and immunologic evaluation of neuraminidase-specific influenza A virus vaccine in humans", J INFECT DIS., 1977, pages 499 - 506
R. W. ELLIS: "Vakcinos:Imunologinių problemų nauji sprendimo būdai", pages: 129 - 150
WANG ML, KATZ JM, WEBSTER RG.: "Extensive heterogeneity in the hemagglutinin of egg-grown influenza viruses from different patients", VIROLOGY., 1989, pages 275 - 279, XP023050181, DOI: doi:10.1016/0042-6822(89)90538-2
WEIS W ET AL.: "Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid", NATURE., 1988, pages 426 - 431, XP008152712, DOI: doi:doi:10.1038/333426a0

Also Published As

Publication number Publication date
US5762939A (en) 1998-06-09
CA2222129C (en) 2010-04-27
NO975434D0 (no) 1997-11-26
CZ299862B6 (cs) 2008-12-17
SK158897A3 (en) 1999-06-11
AU2692595A (en) 1996-12-11
WO1996037624A1 (en) 1996-11-28
FI974319A (fi) 1998-01-22
DE69534449T2 (de) 2006-07-06
CN1194005A (zh) 1998-09-23
CN100390289C (zh) 2008-05-28
CA2222129A1 (en) 1996-11-28
IS4620A (is) 1997-11-25
JP2000513922A (ja) 2000-10-24
SK286441B6 (sk) 2008-10-07
FI974319A0 (fi) 1997-11-25
CZ373897A3 (cs) 1999-02-17
EP1605052A3 (en) 2008-08-13
DE69534449D1 (de) 2006-01-26
PT1605052E (pt) 2011-10-19
EP0833933A1 (en) 1998-04-08
EP1605052B1 (en) 2011-07-27
NO975434L (no) 1998-01-19
DK0833933T3 (da) 2005-10-10
EP1605052A2 (en) 2005-12-14
AU712776B2 (en) 1999-11-18
ATE518000T1 (de) 2011-08-15
ES2248799T3 (es) 2006-03-16
DK1275726T3 (da) 2008-06-23
EP0833933B1 (en) 2005-09-14
ATE304602T1 (de) 2005-09-15
CZ301021B6 (cs) 2009-10-14
JP3757318B2 (ja) 2006-03-22
DK1605052T3 (da) 2011-11-07
NZ288026A (en) 1999-11-29
BR9510590A (pt) 1999-11-30
HUT77921A (hu) 1998-10-28
HK1083867A1 (en) 2006-07-14
LT97201A (lt) 1998-09-25
US5858368A (en) 1999-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6245532B1 (en) Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
LT4461B (lt) Gripo hemagliutinino multivalentinių vakcinų gamybos būdas
Wang et al. Incorporation of membrane-anchored flagellin into influenza virus-like particles enhances the breadth of immune responses
Roy et al. Long-lasting protection of sheep against bluetongue challenge after vaccination with virus-like particles: evidence for homologous and partial heterologous protection
Chambers et al. Protection of chickens from lethal influenza infection by vaccinia-expressed hemagglutinin
US20190314484A1 (en) FUNCTIONAL INFLUENZA VIRUS LIKE PARTICLES (VLPs)
US20140193447A1 (en) Functional influenza virus-like particles (vlps)
SG176419A1 (en) Novel h5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
JP2014505681A (ja) 改変インフルエンザヘマグルチニンタンパク質およびその使用
US20120064117A1 (en) Tetravalent influenza vaccine and use thereof
CA2529710A1 (en) Vectors expressing sars immunogens, compositions containing such vectors or expression products thereof, methods and assays for making and using
EP3599247A2 (en) Recombinant hemagglutinin protein of influenza virus and vaccine containing the same
Huang et al. Comparison of chicken immune responses after inoculation with H5 avian influenza virus-like particles produced by insect cells or pupae
AU733191B2 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
EP1275726B1 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
EP2374894B1 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
CN101353375A (zh) 生产流感血凝素多价疫苗的方法
BRPI9510590B1 (pt) composição compreendendo proteína de hemaglutina hao gripal recombinante
JP2005170945A (ja) インフルエンザ血球凝集素多価ワクチンの製造方法
Wee et al. Swine Influenza Virus Recombinant HA Protein Expressed in the Baculovirus System Elicited Protective Immunity in Mice

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 20020526