HUT77134A - Keratán-szulfát-oligoszacharid frakciók és ilyet tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás a fenti oligoszaharidok előállítására - Google Patents

Keratán-szulfát-oligoszacharid frakciók és ilyet tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás a fenti oligoszaharidok előállítására Download PDF

Info

Publication number
HUT77134A
HUT77134A HU9701820A HU9701820A HUT77134A HU T77134 A HUT77134 A HU T77134A HU 9701820 A HU9701820 A HU 9701820A HU 9701820 A HU9701820 A HU 9701820A HU T77134 A HUT77134 A HU T77134A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
keratin sulfate
sulfate
oligosaccharide
acetyl
keratin
Prior art date
Application number
HU9701820A
Other languages
English (en)
Inventor
Akira Asari
Hiroshi Maruyama
Satoshi Miyauchi
Kiyoshi Morikawa
Akira Tawada
Keiichi Yoshida
Original Assignee
Seikagaku Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seikagaku Corporation filed Critical Seikagaku Corporation
Publication of HUT77134A publication Critical patent/HUT77134A/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7024—Esters of saccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/12—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for climacteric disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)

Description

A találmány gyulladásgátló, allergiaellenes, immunmoduláló, sejtdifferenciálódást és apoptózist kiváltó hatású gyógyszerkészítményekre és ezekben hatóanyagként alkalmazható kératán-szulfát-o1igoszacharid-szármázékokra vonatkozik.
A keratán-szulfát N-acetil-laktóz-amin alapszerkezetű glükóz-amino-glükán-származék, mely az N-acetil-glükóz-aminrész hatos helyzetében O-szulfatált hidroxilcsoportot tartalmaz. A többszörösen szulfátéit keratán-szulfát diszacharid-egységében, az N-acetil-glükóz-amin-rész hatos helyzetű szulfátéit hidroxicsoportja mellett egy további szulfátéit hidroxilcsoportot tartalmaz, és különösen porcos halak, például cápák, és emlősök, például bálnák és szarvasmarhák porcában, csontjában és szaruhártyájában fordul elő. A keratán-szulfát-oligoszacharidot a keratán-szulfát hidrolízisével állították elő, a keratán-szulfátot a Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származó keratán-szulfát-hidrolázzal (keratanáz (II); 2-57 182 számú japán közrebocsátási irat) reagáltatva.
Egy másik irat szerint [Biochemistry, 33, 4836-4846 (1994)] szarvasmarhaporcból származó keratán-szulfátot hidrolizáltattak keratanáz (II)-vei, és a hidrolizátum frakcio85797-8844-FO/gcs • · · · nálásából származó 25 féle oligoszacharid frakciót analizálták. A kapott (I) általános képletű tetraszulfatált N-acetillaktóz-amin-tetraszacharid (továbbiakban keratán-szulfáttetraszacharid (I)),
Gál(6S)pl-4GlcNAc(6S)Pl-3Gal(6S)pl-4GlcNAc(6S) (I) , a· (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-aminpentaszacharid (a továbbiakban keratán-szulfát-pentaszacharid (II) ) ,
NeuAc~Galpl-4GlcNAc(6S)pi-3Gal(6S) pl-4GlcNAc(6S) (II), és a (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amindiszacharid (a következőkben keratán-szulfát-diszacharid (III) )
Gál(6S)pl-4GlcNAc(6S) (III) és hasonló vegyületek szerkezetét igazolták.
(A fenti képletekben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Neu jelentése neuraminsav, Ac jelentése acetilcsoport és 6S jelentése β-Ο-szulfát-észter-csoport, és jelentése a.2,3 kötés vagy ot2,6 kötés.)
A tiszta keratán-szulfát-oligoszacharid, különösen az (I) képletű keratán-szulfát-tetraszacharid, a (II) képletű keratán-szulfát-pentaszacharid és a (III) keratán-szulfát-diszacharid szennyeződésektől (például endotoxintól, nukleinsavtól, fehérjétől, proteáztól és más glükóz-amino-glükánoktól kivéve a keratán-szulfát-oligoszacharidot és hasonlókat) mentes formában, hatékonyan és nagy mennyiségben történő előállítását mostanáig nem ismertették. Ezek a szennyeződések különösen a gyógyszerkészítményekben használt keratán-szul• · fát-oligoszacharidok esetén okoznak komoly gondokat. Ezen túlmenően a keratán-szulfát-oligoszacharid farmakológiai hatása (különösen gyulladásgátló, anti-allergiás, immunmoduláló, sejtdifferenciálódást kiváltó és apoptózist kiváltó hatása) egyáltalán nem ismert.
Találmányunk célja hatóanyagként szennyeződésmentes keratán-szulfát-oligoszacharidot tartalmazó, elsősorban gyulladásgátló, allergiaellenes, immunmoduláló, sejtdifferenciálódást kiváltó (a továbbiakban differenciálódást kiváltó) vagy apoptózist kiváltó hatású gyógyszerkészítmények kifejlesztése .
Ebből a célból megvizsgáltuk a 2 és 5 közötti számú cukoregységet tartalmazó oligoszacharidok, különösen többszörösen szulfátéit keratán-szulfátnak keratán-szulfát-hidrolázzal történő hidrolízisével előállított hidrolizátumokból kinyert diszacharid, tetraszacharid vagy pentaszacharid gyógyászati hatását, melynek eredményeképpen azt találtuk, hogy a fent ismertetett oligoszacharidok és sóik kitűnő gyulladásgátló, allergiaellenes, immunmoduláló, sejtdifferenciálódást kiváltó és apoptózist kiváltó hatásúak.
Ennek megfelelően találmányunk hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazó gyulladásgátló, antiallergiás, immunmoduláló, differenciálódást és apoptózist kiváltó hatású gyógyszerkészítményekre vonatkozik (melyeket a következőkben találmányunk szerinti gyógyszerkészítményeknek is nevezünk). Ebben a meghatározásban a keratán-szulfát-oligoszacharid olyan keratán-szulfát-hidrolizátumot jelent, melyet keratán-szulfátból endo-p-N-acetil-glükóz-aminidáz típusú keratán-szulfát-hidrolázzal állítunk elő.
A találmányunk szerinti gyógyszerkészítményekben például olyan keratán-szulfát-oligoszacharid alkalmazható, melynek szulfátéit N-acetil-laktóz-amin egysége adott esetben sialsavat és/vagy fucose-t tartalmaz, olyan keratán-szulfátoligoszacharid, mely 2 és 5 közötti számú cukoregységet tartalmaz, olyan keratán-szulfát-oligoszacharid, mely redukáló végén szulfátéit N-acetil-glükóz-amint tartalmaz, olyan keratán-szulfát-oligoszacharid, melynek molekulájában legalább két szulfátéit hidroxilcsoport van, és különösen jól alkalmazható a fent ismertetett keratán-szulfát-oligoszacharidszármazék, mely legalább egy Gál (6S)-GlcNAc (6S) (ahol Gál galaktózt, GlcN glükózamint, Ac acetilcsoportot és 6S 6-0-szulfát-észter-csoportot jelent) képletű diszacharad szerkezeti egységet tartalmaz. Ezen túlmenően a fent megadott keratán-szulfát-oligoszacharidok közül előnyösek az (I) általános képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid,
Gál(6S)3l-4GlcNAc(6S)pl-3Gal( 6S)pi-4GlcNAc(6S) (I), a (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid,
NeuAc~Galpl-4GlcNAc(6S)pl-3Gal(6S)3l-4GlcNAc(6S) (II), a (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid
Gál(6S)pl-4GlcNAc(6S) (III) és hasonló vegyületek.
• · • · · · • · · · • · · ·· ··· · (A képletekben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükózamin, Neu jelentése neuraminsav, Ac jelentése acetilcsoport, 6S jelentése β-Ο-szulfát-észter-csoport és ~ jelentése ot2,3 kötés vagy ct2,6 kötés).
Találmányunk kiterjed a keratán-szulfát-oligoszacharid-származékot tartalmazó frakciókra is, melyekben legalább 99 %-ban olyan keratán-szulfát-oligoszacharid van, melynek molekulája 2 és 5 közötti számú cukoregységet, redukáló végén szulfátéit N-acetil-glükóz-amint és legalább 2 szulfátéit hidroxilcsoportot tartalmaz és tulajdonságai a következők:
a) a frakció lényegében nem tartalmaz endotoxint, és a frakció a nukleinsav-, fehérje- és proteáztartalma a kimutathatósági határ alatt marad és
b) a frakció lényegében nem tartalmaz hialuronsavat, chondroitin-szulfátot, dermatán-szulfátot, heparán-szulfátot és keratán-szulfátot.
A találmány kiterjed továbbá az olyan keratán-szulfát-oligoszacharid frakciókra is, amely legalább 99 %-ban olyan keratán-szulfát-oligoszacharidot tartalmaznak, melyben legalább egy Gál(6S)-GlcNAc (6S) képletű diszacharid szerkezeti részlet van, és melynek tulajdonságai megfelelnek a fenti a) és b) pontban megadottakkal. Továbbá az oligoszacharid frakció előnyösen az alábbi keratán-szulfát oligoszacharid-származékokat tartalmazza: (I) képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid, (II) triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid, (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid és hasonló vegyületek. A fentieken • · · · • · · · • · túlmenően a frakció olyan keratán-szulfát-oligoszacharidszármazékokat tartalmaz, melyeket porcos halakból származó, többszörösen szulfátéit keratán-szulfátból állítunk elő endoβ-Ν-acetil-glükóz-aminizált típusú keratán-szulfát-hidrolázzal történő hidrolízissel, és a kapott hidrolizátumot frakciónál j.uk.
A találmány kiterjed a keratán-szulfát-oligoszacharid frakció előállítási eljárására is, melynek során a keratán-szulfátot a következő fizikai és kémiai tulajdonságú keratán-szulfát-hidrolázzal reagáltatjuk:
1) Hatás
A hidroláz kölcsönhatásba lép a keratán-szulfáttal és annak N-acetil-glükóz-aminid kötését hidrolizálja.
2) Szubsztrátum specificitás
A hidroláz kölcsönhatásba lép a keratán-szulfát (I)gyel, a keratán-szulfát (II)-vei és a keratán-poliszulfáttal, és fő hidrolizátumként szulfátéit keratán-szulfát-diszacharid és szulfátéit keratán-szulfát-tetraszacharid keletkezik. A hidroláz fizikai és kémiai tulajdonságai előnyösen a következők:
3) Optimális reakció pH
A hidroláz optimális reakció pH-ja 0,1 mól acetát pufferben és 10 mmól trisz-acetát pufferben 37 °C-on 4,5 és 6 közötti érték;
• · · ·
4) pH stabilitás
A hidroláz pH stabilitása, 1 órán át 37 °C-on 0,1 mól acetátpufferben és 10 mmól triacetát-pufferben tartva 6 és 7 közötti érték;
5) Optimális reakcióhőmérséklet
A hidroláz optimális reakcióhőmérséklete 0,1 mól acetát pufferben, pH 6,0 értéken 10 percig végzett reakciónál 50 °C és 60 °C közötti tartományba esik; és
6) Hőstabilitás órán át 0,1 mól acetát pufferben pH 6,0 értéken tartva a hidroláz 45 °C-on vagy ez alatt stabil.
A hidrolizátum frakcionálásával kapott keratán-szulfát-oligoszacharid frakció tulajdonságai a következők:
a) a frakció fő alkotórésze a szulfátéit N-acetil-laktóz-amin alapvázú keratán-szulfát-oligoszacharid;
b) a frakció lényegében nem tartalmaz endotoxint, és nyomnyi mennyiségű nukleinsavat, fehérjét és proteázt tartalmaz, illetve ezek mennyisége a kimutathatóság határa alatt marad; és
c) a frakció lényegében nem tartalmaz hialuronsavat, chondroitin-szulfátot, dermatán-szulfátot, heparán-szulfátot és keratán-szulfátot.
Ha a fent ismertetett keratán-szulfát-oligoszacharid frakció előállítására szolgáló eljárás során keratán-szulfát-származékként például többszörösen szulfátéit keratán—szulfátot alkalmazunk, akkor olyan keratán-szulfát-oligoszacharid-frakciókat kapunk, melyek (I) képletű tetraszulfa8 tált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharidot, (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharidot, (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharidot és hasonló vegyületeket tartalmaznak, fő alkotórészként elsősorban (I) képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharidot és (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharidot tartalmazó keratán-szulfát-oligoszacharidot.
A találmányunk szerinti keratán-szulfát-oligoszacharid előnyösen 2-5 cukoregységet tartalmaz, és rendszerint 2-4 helyen szulfátéit. Ezen túlmenően keratán-szulfát-oligoszacharid-származékok sialsavat is tartalmazhatnak, sialsavként N-acetil-neuramin-savat vagy N-glikolil-neuraminsavat, előnyösen N-acetil-neuraminsavat alkalmazhatunk. A találmányunk szerinti keratán-szulfát-oligoszacharidok közé tartoznak azok a vegyületek is, melyekben a sialsav az a.2,3 kötésnél és az a2,6 kötésnél kapcsolódik, ezek közül előnyösek azok, melyekben a sialsav az <*2,3 kötésnél kapcsolódik.
Találmányunkat az alábbiakban mutatjuk be részletesen.
1) A találmányunk szerinti keratán-szulfát-oligoszacharid és keratán-szulfát-oligoszacharidot tartalmazó frakció
A találmányunk szerinti keratán-szulfát-oligoszacharid előállításánál kiindulási anyagként alkalmazott keratán-szulfát főleg galaktóz-diszacharid vagy galaktóz-6-szulfát és N-acetil-glükóz-amin-6-szulfát ismétlődő egységekből épül fel, és a szulfáttartalom az adott állatfajtól, szövettől stb. függően változik. Nyersanyagként általában porcos halak, például cápa, vagy emlősök, például bálna vagy szarvasmarha porcát, csontját és szaruhártyáját alkalmazzuk.
A keratán-szulfát megválasztása nincs különösebben korlátozva, így általában könnyen hozzáférhető keratán-szulfátot, előnyösen többszörösen szulfátéit keratán-szulfátot alkalmazunk (a diszacharid szerkezeti részletre vonatkoztatva
1,5 és 2 közötti mennyiségű szulfátcsoportot tartalmazó, többszörösen szulfátéit keratán-szulfátot, keratán-poliszulfátnak is nevezzük), melynél a cukorrész például szulfátéit galaktózegység. A szulfátcsoport előnyösen a galaktózmaradék hatos helyzetében helyezkedik el, ilyen többszörösen szulfátéit keratán-szulfát nyerhető ki például porcos halak - mint a cápa - porcának proteoglükán tartalmából. Ezenkívül kiindulhatunk a kereskedelemben beszerezhető vegyületekből is.
A találmány szerinti keratán-szulfát-oligoszacharidot úgy állítjuk elő, hogy a keratán-szulfátot — előnyösen többszörösen szulfátéit keratán-szulfátot — endo-p-N-acetil-glükóz-aminidáz típusú keratán-szulfát hidrolázzal, például a Bacillus nemzetséghez tartozó mikroorganizmusból származó keratanáz (II)-vei (2-57182 számú japán közrebocsátási irat) vagy a jelen bejelentők által Bacillus nemzetséghez tartozó mikroorganizmusból előállított új keratán-szulfát-hidrolázzal hidrolizáljuk pufferoldatban, és a hidrolizátumot frakcionáljuk. A hidrolízist például 1,0 mg/ml és 100 mg/ml közötti koncentrációjú pufferolt keratán-szulfát-oldatban végezzük 6,0 és 7,0 közötti pH-értéken, 25 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, 1-72 órán át. A reakciót általában 0,1 mól és 0,2 mól közötti pufferkoncentrációnál végezzük. Bármilyen puffért alkalmazhatunk, amennyiben beállítható a fent megadott pH-értékre, például acetát-puffért, foszfát-puffért vagy trisz-puffért. A hidrolízálási reakcióban alkalmazott enzimet 1 g keratán-szulfátra számítva például 0,1 és 1,0 egység közötti mennyiségben alkalmazzuk. Ebben az esetben az 1 egység azt az enzimmennyiséget jelenti, amely 1 perc alatt 1 pmól N-acetil-glükóz-aminnak megfelelő redukáló végződést hoz létre.
A fent ismertetett új keratán-szulfát-hidroxilázt Bacillus circulans mikroorganizmusokkal, például a jelen bejelentők által elválasztott kitűnő termostabilitású Bacillus circulans KsT202-vel állítjuk elő. A keratánszulfát-hidrolázt úgy állítjuk elő, hogy a Bacillus circulans KsT202-t megfelelő közegben tenyésztjük, és az enzimből ismert enzimtisztítási eljárással eltávolítjuk a közeget és/vagy a mikrobasejteket. A Bacillus circulans Kst202-t 1994. szeptember 5-én FERM P-14516 számon letétbe helyeztük [National Institute of Bioscience and Humán-Technology of Agency of Insturial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakai-ken, 305, Japan)], majd a Budapesti Egyezmény alapján 1995. november β-án FERM BP-5285 szám alatt nemzetközi letétbe is helyeztük.
• · · ·
Az általunk elválasztott új keratán-szulfát-hidroláz fizikai és kémiai tulajdonságai a következők:
1. Hatás
A hidroláz reakcióba lép a keratán-szulfáttal és hidrolizálja annak N-acetil-glükóz-aminid kötését.
2,. Szubsztrát specificitás
A hidroláz reakcióba lép a keratán-szulfát (I)-gyel, a keratán-szulfát (II)-vei és a keratán-poliszulfáttal, és fő hidrolizátumként szulfatált keratán-szulfát-diszacharid és szulfátéit keratán-szulfát-tetraszacharid keletkezik. Azt is bebizonyítjuk, hogy a hidrolázzal szulfatált keratán-szulfát-pentaszacharid állítható elő.
3. Optimális reakció pH
A hidroláz optimális reakció pH-ja 0,1 mól acetát-pufferben és 10 mmól trisz-acetát-pufferben 37 °C-on 4,5 és 6 közötti érték.
. pH-stabilitás
A hidroláz pH-stabilitása egy órán át 37 °C-on 0,1 mól acetát pufferben és 10 mmól trisz-acetát pufferben tartva 6 és 7 közötti érték.
5. Optimális reakcióhőmérséklet
A hidroláz optimális reakcióhőmérséklete 10 percig pH 6-on 0,1 mól acetát pufferben tartva 50 °C és 60 °C közötti tartományba esik.
···· ··♦·
6. Termostabilitás
A hidrolázt egy órán át pH 6 értéken 0,1 mólos acetát-pufferben tartva 45 °C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten stabil.
A találmány szerinti keratán-szulfát-oligoszacharid frakció, immobilizált keratán-szulfát-hidroláz enzimmel is előállítható, beleértve a fent ismertetett új keratán-szulfát-hidrolázt és a keratanáz (II)-t, melyet.a szokásos eljárásokkal immobilizálunk.
A fenti enzimmel végzett hidrolizálási reakcióban a keratán-szulfát-oligoszachariddá alakul.
A kapott oligoszacharidot ismert eljárásokkal, például etanolos kicsapással és különböző kromatográfiás eljárásokkal választjuk el és tisztítjuk, így állítjuk elő a kívánt keratán-szulfát-oligoszacharidot. Ezt a tisztítási eljárást részletesen bemutatjuk a keratán-szulfát-oligoszacharidok, nevezetesen a diszacharid, tetraszacharid és pentaszacharid tisztításánál. A tisztítási eljárás során a hidrolizátumot általában először etanollal kicsapjuk, majd gélszűréssel koncentráljuk (a frakcionált molekulatömeg tartomány 100 és 10000 közötti), így kapjuk meg a nyers keratán-szulfát-oligoszacharid-frakciókat, azaz a nyers diszacharid, tetraszacharid és pentaszacharid frakciókat. Ezután a nyers frakciókat elválasztjuk, és anioncserélő kromatográfiás oszlopon frakcionáljuk, melynek során lényegében tiszta diszacharidot, tetraszacharidot és pentaszacharidot állítunk elő, amelyek lényegében nem tartalmaznak endotoxint, és nukleinsav, ·· ♦ · • · · ·* ·♦· ··· fehérje és proteáz tartalmuk a kimutathatósági határ alatt marad, továbbá lényegében nem tartalmaznak hialuronsavat, chondroitin-szulfátot, dermatán-szulfátot, heparán-szulfátot és keratán-szulfátot. A leírásban a lényegében nem tartalmaz kifejezés azt jelenti, hogy a mennyiség érzékeny detektálási eljárásokkal kimutatható, de a keratán-szulfát oligoszacharid gyógyászati hatását, például gyulladásgátló, antiallergiás, immunmoduláló és sejtdifferenciálódást kiváltó és apoptózist kiváltó hatását nem befolyásolja.
A találmány szerinti keratán-szulfát-oligoszacharidot keratán-szulfát kiindulási anyagból állítjuk elő, oly módon, hogy a keratán-szulfátot endo-p-N-acetil-glükóz-aminidázzal hidrolizáltatjuk, és a diszacharid és pentaszacharid egységeket tartalmazó oligoszacharidot - mely lényegében nem tartalmaz keratán-szulfátot - frakcionáljuk.
A keratán-szulfát-oligoszacharid kémiai degradációs eljárással is előállítható a hidrolizált keratán-szulfát-hidrolizátumból, mégpedig a keratán-szulfátot alkotó galaktóz vagy galaktóz-6-szulfát és az N-acetil-glükóz-amin-6-szulfát közötti N-acetil-glükóz-amid kötés preferált és specifikus hidrolízisével.
A keratán-szulfát-oligoszacharid, különösen az (I) képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid, a (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid, a (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid és hasonló vegyületek a fentiek szerint állíthatók elő. A következő példákban az (I), (II) és (III) képletű ve* * · · ·· · • ♦ ·* gyületek magmágneses-rezonancia spektrumát /-NMR és 13C-NMR) és gyors atomokkal bombázott tömegspektrometriás analízisének eredményeit mutatjuk be.
A találmány szerinti keratán-szulfát-oligoszacharid magában foglalja az ionizált, protonált és gyógyászatilag elfogadható só formákat, ezek közül is a szervetlen bázisokkal, például alkálifémekkel (nátrium, kálium, lítium, stb.) vagy alkáliföldfémekkel (kalcium stb.) képzett sókat, ammóniumsókat és hasonlókat, vagy szerves bázisokkal képzett sókat, például dietanol-amin-, ciklohexil-amin- és aminosav-sókat.
A találmány szerinti keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy sóját hordozóanyagokkal és más gyógyászati adalékanyagokkal együtt tartalmazó gyógyszerkészítmény szintén új, és gyulladásgátlásra, allergia ellen, immunmodulációra, sejtdifferenciálódás kiváltására, apoptózis kiváltására és hasonló megbetegedések kezelésére alkalmazható.
A találmány szerinti keratán-szulfát-oligoszacharid frakció legalább 99 %-ban olyan keratán-szulfát-oligoszacharidot tartalmaz, amelyből eltávolítottuk az endotoxint, nukleinsavat, fehérjét, proteázt és más glükóz-amino-glükánokat, kivéve az előállítani kívánt keratán-szulfát-oligoszacharidot, melyet keratán-szulfát enzimatikus hidrolizátumából, különösen a következőkben ismertetésre kerülő eljárással előállított, többszörösen szulfátéit keratán-szulfát enzimatikus hidrolizátumából nyerünk ki.
**· • ·. :·*” , ,·♦ . · ’»ί· ·. ...
·· ···»··**»·
2) A találmány szerinti gyógyszerkészítmények
A fent ismertetett keratán-szulfát-oligoszacharid és/vagy gyógyászatilag elfogadható sója széleskörűen alkalmazható gyulladásgátló, allergiaellenes, immunmoduláló, sejtdifferenciálódást kiváltó, apoptózist kiváltó és egyéb hatású gyógyszerkészítmény.
A találmány szerinti gyulladásgátló hatású készítmény minden gyulladással kapcsolatos megbetegedés ellen hatásos, különösen jól használható krónikus reuma, szisztémás lupusz, erythematosus, deformációs csigolyagyulladás, osteoarthritis, lumbago, operációt és traumát követő gyulladás és megnagyobbodás csökkentése, lapockaízület körüli gyulladás, temporomandibuláris ízületi betegség, ínhüvelygyulladás, inak körüli gyulladás, a felkarcsont ízületi gyulladása (teniszkönyök) , izomfájdalom, szaru- és kötőhártyagyulladás és hasonlók gyógyítására. A találmány szerinti gyulladásgátló készítmény ezekkel a betegségekkel kapcsolatban többféle gyulladásgátló funkciót lát el, nevezetesen fájdalomcsillapító, gyulladásgátló és lázcsillapító funkciókat, a keratán-szulfát-oligoszacharid és/vagy gyógyászatilag elfogadható sói hatásának köszönethően.
A találmány szerinti allergiaellenes anyag az allergiával összefüggésbe hozható bármilyen megbetegedés, különösen allergiás nátha, allergiás kötőhártya- és szaruhártyagyulladás, tavaszi kötőhártyagyulladás, ekcéma, dermatitisz, csalánkiütés, atopiás dermatitisz és hasonlók kezelésére alkalmas.
«··· *
• · ·· · » «ν· • » “’β· ··»· '»*· · t* ·« »
A találmány szerinti immunmoduláló hatású anyag bármilyen immunitási rendellenességgel összefüggő megbetegedés ellen hatásos, különösen humán autoimmun limfoproliferatív szindróma [Cell 81, 935-946 (1995), Science 268, 1347-1349 (1995)], limfoproliferatív rendellenesség [Leukémia and Lymphoma 16, 363-368 (1995)], angioimmunoblasztikus nyirokmirigybántalom [Blood 85(10), 2862-2869 (1995)], immunoblasztikus nyirokmirigybántalom [The American Journal of Medicine 63, 849- (1977)], krónikus reuma, szisztémás lupusz erythematosus, discoid lupus erythematodes, multiple myositis (dermatomyositis), szkleroderma, kevert kötőszövetbetegség, krónikus pajzsmirigygyulladás, primer myxoedema, thyrotoxicosis, vészes vérszegénység, Good-pasture-szindróma, akut fejlődő glomerulonephritis, izomgyengeség, idült hólyagos pemphigus, bullous pemphigoid, nem-inzulin függő cukorbetegség, fiatalkori cukorbetegség, Addison-betegség, sorvadásos gastritis, férfi meddőség, korai klimax, phacogén uveagyulladás, szimpatikus angitis, szklerozis multiplex, fejlődő szisztémás szklerozis, gyulladásos bélbetegség (Crohn-betegség, fekélyes vastagbélgyulladás, stb.), elsődleges epecirozis, krónikus aktív hepatitisz, autoimmun hemolítikus anémia, paroxizmális hemoglobinuria, elsődleges trombocitopéniás purpura, Sjögren-szindróma, antifoszfolipid antitest szindróma és hasonlók kezelésére alkalmas.
A találmány szerinti differenciálódást kiváltó anyag minden olyan betegség esetén hatásos, mely a fiziológiás sejtdifferenciáció hibájával kapcsolatos, ilyen az immun• ·
rendellenesség, rosszindulatú tumor, stb., és speciálisan ajánlott humán autoimmun limfoproliferatív szindróma, limfoproliferatív rendellenesség, angioimmunoblasztikus limfadenopátia, krónikus reuma, szisztémás lupus erythematosus, gyulladásos bélbetegség (Crohn-betegség, fekélyes bélgyulladás stb.), fejlődő szisztémás szklerózis, dermatomyocitis, Sjögren szindróma, karcinóma, leukémia, limfóma, karcinóma áttétel gátlása, hiperplázia megelőzése (pszoriázis kezelése stb.), sebgyógyítás, oszteomielodiszplázia szindróma, szkleroderma és hasonlók.
A találmány szerinti apoptózist kiváló anyagok fiziológiai apoptózis, immunrendellenesség, rosszindulatú tumor stb. és más specifikus indikációk által okozott megbetegedések esetén hatásosak, például humán autoimmun limfoproliferatív szindróma, limfoproliferatív rendellenesség, angioimmunoblasztikus limfadenopátia, krónikus reuma, szisztémás lupus erythematosus, fekélyes vastagbélgyulladás, progresszív szisztémás szklerózis, dermatomyositis (dermatomyoma), Sjögren-szindróma, karcinóma, leukémia, limfoma, karcinóma áttétel gátlása, hiperplázia megelőzése (pszoriázis kezelése stb.), oszteomielodiszplázia szindróma, szkleroderma, apoptózis, beleértve az abnormális mesangiális sejteket (glomerulonephritis kezelése) és hasonlók esetén.
MRL-lpr/lpr egereken vizsgáljuk a nyirokcsomócsökkentő, differenciálódást kiváltó és apoptózist kiváltó hatást. A humán autoimmun limfoproliferatív szindróma kórtana az Fás génrendellenességgel hozható összefüggésbe, hasonló módon, • · · · mint az MRL-lpr/lpr egereknél, és a szindróma kórtana kifejezetten emlékeztet az MRL-lpr/lpr egerekére akárcsak a nyirokcsomó duzzanatoknál. A humán autoimmun limfoproliferatív szindróma MRL-lpr/lpr egereken elfogadhatóan modellezhető. Ezért a találmányunk szerinti gyógyszerkészítmények immunmodulátor differenciálódást és apoptózist kiváltó hatása legelőnyösebben a humán autoimmun limfoproliferatív szindrómára gyakorolt hatással indikálható.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények gyógyszerészetben alkalmazott szokásos eljárásokkal állíthatók elő, figyelembe véve a beadás módját, például injekció (intramuszkuláris, szubkután, intradermális, intravénás, intraartikuláris, intraokuláris, intraperitoneális stb.), szemcsepp vagy infúzió formájában, transzkután, szájon át, vagy inhalálással. Az alkalmazott dózisformák lehetnek injekciók (oldat, szuszpenzió, emulzió, szilárd injekciók, melyeket a felhasználás során oldanak, stb.), tabletták, kapszulák, granulátumok, porok, oldatok, liposzomazárványok, kenőcsök, gélek, külsőleg alkalmazott porok, spray-k, inhalációs porok, szemcseppek, szemkenőcsök stb. A gyógyszerkészítmények előállításánál szokás szerint használt adalékanyagok szokásos hordozók, kötőanyagok, síkosító anyagok, más színezőanyagok és diszintegrátorok alkalmazhatók. A találmány szerinti gyógyszerkészítményekben a keratán-szulfát-oligoszacharid más gyulladásgátló, allergiaellenes, immunmoduláló, differenciálódást kiváltó és apoptózist kiváltó, stb. hatóanyagokkal együtt alkalmazható.
• · · ·
Az 1. táblázatban a gyulladásgátló anyag és az allergiaellenes hatású anyag előnyös beadási módját és dózisformáját mutatjuk be. A 2. táblázatban az immunmoduláló, sejtdifferenciálódást kiváltó és apoptózist kiváltó anyagok adatai láthatók.
1. táblázat
Beadási mód Dózis forma
Intravénás, intramuszkuláris, szubkután, intradermális, intraartikuláris és intraokuláris beadás Injekciók
Szemesépp Szemcseppek
Infúziós beadás Kenőcsök
Szájon át történő beadás Tabletták, kapszulák, granulátumok, porok, oldatok és liposzomazárványok
Transzkután beadás Kenőcsök, gélek, külsőleg alkalmazható porok és spray-k
Inhalálás Spray-k és inhalációs porok
2. táblázat
Beadási mód Dózis forma
Intravénás, intramuszkuláris, szubkután és intradermális beadás Injekciók
Orális beadás Tabletták, kapszulák, granulátumok, porok, oldatok és liposzomazárványok
A találmány szerinti gyulladásgátló és allergiallenes anyag hatásos dózisa szisztémás beadásnál 30 mg/beteg/nap és 300 mg/beteg/nap közötti mennyiségű, helyi alkalmazásnál 1 mg/beteg/nap és 10 mg/beteg/nap közötti mennyiségű keratánszulfát-oligoszacharid. Immunmodulátor, differenciálódást kiváltó és apoptózist kiváltó anyagok esetén a hatásos dózis 30 mg/beteg/nap és 6000 mg/beteg/nap közötti mennyiségű keratán-szulfát-oligoszacharid.
Találmányunkat a következő ábrákon mutatjuk be.
Az 1. ábrán az 1. példa szerint előállított tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid [keratán-szulfát-tetraszacharid (I)] HPLC gélszűrési kromatogramja látható;
A 2. ábrán az 1. példa szerinti triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid [keratán-szulfát-pentaszacharid (II) ] HPLC gélszűrési kromatogramja látható;
A 3. ábrán az 1. példa szerinti diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid [keratán-szulfát-diszacharid (III)] HPLC gélszűrési kromatogramja látható;
A 4. ábrán az 1. példa szerinti keratán-szulfát-pentaszacharid (II) 1H-NMR spektruma látható 400 MHz-nél felvéve;
Az 5. ábrán keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel keratán-szulfát-pentaszacharid (II)-nel vagy keratán-szulfátdiszacharid (III)-nel kezelt papain arthritis model nyulak ízületi folyadékának mennyisége látható;
A 6. ábrán 5 perccel a gyulladás kiváltása előtt keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel vagy különböző teszt• · anyagokkal kezelt nyulak lábában a gyulladás hatására fellépő ödémásodás arányának változása látható;
A 7. ábrán 3 órával a gyulladás kiváltása előtt keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel vagy különböző tesztanyagokkal kezelt nyulak lábában a gyulladás hatására fellépő ödémásodás arányának változása látható;
A 8. ábrán keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel vagy dexamethasone-acetáttal kezelt karragén mellhártyagyulladás modell patkányok mellhártya folyadékának mennyisége látható;
A 9. ábrán keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel vagy dexamethasone-acetáttal kezelt karragen mellhártyagyulladás modell patkányok mellhártya folyadékában a leukociták száma látható;
A 10. ábrán a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és a keratán-szulfát-diszacharid (III) aktív oxigén (O2 _) fejlődésgátló hatása látható N-formil-Met-Leu-Phe-nal (FMLP) stimulált neutrofil tengeri malacokon;
A 11. ábrán keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt allergiás kötőhártyagyulladás modell tengeri malacoknál a kötőhártyagyulladás mértékének változása vagy változatlansága látható;
A 12. ábrán rendre keratán-szulfát-tetraszacharid (I)gyel, keratán-szulfát-pentaszacharid (II)-vei vagy keratán-szulfát-diszacharid (III)-mai kezelt allergiás kötőhártyagyulladás modell tengeri malacoknál a kötőhártyagyulladás mértékének változása vagy változatlansága látható;
• · • · • · · • · · • ·
A 13. ábrán különböző koncentrációjú keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt allergiás kötőhártyagyulladás modell tengeri malacoknál a kötőhártyagyulladás mértékének fejlődése vagy nem fejlődése látható;
A 14. ábrán 28 napig keratán-szulfát-diszacharid (III) különböző adagjaival ismételten kezelt MRL egerek (autoimmunbetegség modell egerek) állkapocs alatti nyirokcsomóinak tömege látható;
A 15. ábrán 56 napig keratán-szulfát-diszacharid (III) különböző dózisaival ismételten kezelt MRL egerek mezenteriális nyirokcsomóinak tömege látható;
A 16. ábrán 56 napig keratán-szulfát-diszacharid (III) különböző dózisával ismételten kezelt MRL egerek állkapocs alatti nyirokcsomóinak tömege látható;
A 17. ábrán keratán-szulfát-diszacharid (III) különböző dózisaival ismételten kezelt MRL egerek mezenteriális nyirokcsomó-metszeteinek megfestési koncentráció analízise (HE festés) látható;
A 18. ábrán keratán-szulfát-diszacharid (III) különböző dózisaival ismételten kezelt MRL egerek állkapocs alatti nyirokcsomó metszeteinek megfestési koncentráció analízise (HE festés) látható;
A 19. ábrán keratán-szulfát-diszacharid (III) különböző dózisaival kezelt MRL egerek CD3 és CD4 pozitív limfocita sejtjeinek aránya (%) látható;
• ·
A 20. ábrán keratán-szulfát-diszacharid (III) különböző dózisaival kezelt MRL egerek CD3 és CD8a pozitív limfocita sejtjeinek aránya (%) látható;
A 21. ábrán keratán-szulfát-diszacharid (III) különböző dózisaival kezelt MRL egerek CD3 és B220 pozitív limfocita sejtjeinek aránya (%) látható;
A 22. ábrán keratán-szulfát-diszacharid (III) különböző dózisaival kezelt MRL egerek állkapocs alatti nyirokcsomóiban az apoptózis sejtek száma látható.
Találmányunkat a következő példákon mutatjuk be részletesen. Az előállítási példában a genus Bacillus fajtához tartozó mikroorganizmusból kinyerhető új keratán-szulfát-hidroláz előállítását ismertetjük. Az 1. példában a keratán-szulfát-oligoszacharid frakció előállítását, a 2. példában a keratán-szulfát-oligoszacharid akut toxicitását és más farmakológiai tulajdonságait mutatjuk be. Az ezután következő 3-6. példákban gyógyszerkészítmény példákat ismertetünk.
ELŐÁLLÍTÁSI PÉLDA: keratán-szulfát-hidroláz előállítása
1) Bacillus circulans KsT202 elválasztása ml nitrogénforrást, szervetlen sót és keratán-szulfátot tartalmazó folyékony közeghez kis mennyiségű táptalajt adunk, és 45 °C-on 3 napig rázva tenyésztjük. A tenyésztés után a tenyészközeg felülúszójából 10 μΙ-t szűrőpapírra cseppentünk, és hasonló módon a szűrőpapírra 10 μΐ kontroll folyadékközeget cseppentünk. Levegőn történő szárítás után a • · · · szűrőpapírt toluidin-kék oldatba áztatjuk, és hígított ecetsav-oldattal megfelelően mossuk, majd a tenyészközeg felülúszójának megfelelő folt színét összehasonlítjuk a kontroll színével. A toluidin-kék színe a keratán-szulfáttal reakcióba lépve fejlődik ki, és a kísérletből látható, hogy a mintában keratán-szulfátot lebontó mikroorganizmus van jelen, amelynek hatására gyengébb szín fejlődik ki, mint a kontrollmintában.. A keratán-szulfátot lebontó mikroorganizmust ismert eljárással izoláljuk a kultúra oldatból táptalajon (például szívinfúziós agaron).
A kívánt keratán-szulfátot lebontó mikroorganizmust úgy kaptuk, hogy egy sor tisztán izolált mikroorganizmust vizsgáltunk meg a fent leírttal hasonló módon keratán-szulfát lebontó képessége szempontjából, folyékony táptalajban. A kapott törzs morfológiai, növekedési és fiziológiai tulajdonságainak vizsgálata alapján a mikroorganizmust Bacillus circulans-ként azonosítottuk.
A törzs új, és az ismert törzsektől keratán-szulfátot lebontó képessége alapján különböztethető meg. A Bacillus circulans KsT202-t 1994. szeptember 5-én FERM P-14516 számon letétbe helyeztük [National Institute of Bioscience and Humantechnology of Agency of Industrial Science and Technology], majd 1995. november 6-án a Budapesti Egyezmény értelmében nemzetközi letétbe helyeztünk FERM BP-5285 benyújtási számon.
2) Keratán-szulfát-hidroláz előállítása
1,5 % peptont (Kyokuto Seiyaku Kogyo), 0,75 % sörélesztő extraktumot (Nippon Seiyaku), 0,75 % cápaporcból előállított keratán-poliszulfátot (Seikagaku Corporation), 0,5 % K2HPO4-et, 0,02 % MgSO4-H2O-t, 0,5 % nátrium-kloridot és 0,0015 % habzásgátló anyagot és Adekanol LG109-et (Asahi Denka Kogyo) tartalmazó 20 liter közeget (pH 8,0) egy 30 literes kapacitású fermentáló edénybe adagolunk és 121 °C-on 20 percig autoklávba helyezzük. Sterilen beoltjuk 1 liter (5 %) KsT202 törzstenyészet oldattal, melyet előzőleg ugyanebben a közegben 37 °C-on 16 órán át rázva tenyésztünk, és 45 °C-on 24 órán át levegőztetéssel (1 vvm), kevertetés mellett (300 fordulat/perc) tenyésztjük. A tenyésztett oldat 20 literét folyamatosan centrifugáljuk, a mikrobasejtek és a körülbelül 20 liter sejten kívüli folyadék elválasztására.
A sejten kívüli folyadékhoz ammónium-szulfátot adunk 70 %-os telítettségig, a csapadékot centrifugálással nyerjük vissza, és 2,5 liter 10 mmol/1 trisz-acetát pufferben (pH 7,5) oldjuk. Ehhez az oldathoz ammónium-szulfátot adunk 35 %-os telítettségig, majd a csapadékot centrifugálással eltávolítjuk, és további ammónium-szulfátot adunk hozzá 55 %-os telítettségig ezután a csapadékot centrifugálással nyerjük vissza.
A csapadékot 2,5 liter 10 mmol/1 trisz-acetát pufferben (pH 7,5) oldjuk, és az oldatot 5,2 x 24 cm DEAE-cellulóz DE52 (Whatman Co.) oszlopra visszük, melyet előzőleg ugyanilyen pufferrel ekvilibrálunk az enzim adszorbeálására. Miután az ···· ·· oszlopot 1,5 liter pufferrel átmossuk, az oszlopon ugyanilyen puffért és 0 és 0,3 mól tartományban lineárisan emelkedő koncentrációjú nátrium-kloridot tartalmazó oldatot folyatunk át az enzim eluálására.
A hatásos frakciókat összegyűjtjük és ammónium-szulfátot adunk hozzá 55 %-os telítettségig, majd a csapadékot centrifugálással nyerjük vissza, és kis mennyiségű 10 mmol/1 trisz-acetát pufferben (pH 7,5) oldjuk. Az oldatot 3,4 x 110 cm-rel Sephacryl S-300 (Pharmacia) oszlopra visszük fel és 0,5 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó 50 mmol/1 trisz-acetát-pufferrel (pH 7,5) gélszűrésnek vetjük alá.
A hatásos frakciót UK-10 membránon (Advantec Toyo) ultraszűréssel koncentráljuk, és 10 mmol/1 trisz-acetát puffer (pH 7,5) körülbelül 100-szoros mennyiségével szemben dializáljuk. A belső oldatot 2,2 x 15 cm-es DEAE-Toyopearl (Tosoh Corporation) oszlopra visszük fel, melyet előzőleg ugyanilyen pufferrel ekvilibrálunk az enzim adszorbeálására. Ezután az oszlopot 150 ml 0,1 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó fenti pufferrel mossuk, és az enzim eluálására 0,1 mol/1 és 0,2 mol/1 tartományban lineárisan emelkedő koncentrációjú nátrium-kloridot tartalmazó fenti pufferrel mossuk át.
A hatásos frakciót ultraszűréssel koncentráljuk, majd 2,2 x 101 cm-es Sepharcryl S-300 oszlopra visszük fel és gélszűrésnek vetjük alá.
A hatásos frakcióhoz nátrium-kloridot adunk 4 mol/1 koncentráció eléréséig és az oldatot 1,6 x 15 cm-es PhenilSepharose (Pharmacia) oszlopra visszük, amelyet előzőleg mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó trisz-acetát pufferrel (pH 7,5) ekvilibrálunk az enzim abszorbeálására, majd az enzim eluálására 4 mol/1 és 0 közötti tartományban lineárisan csökkenő koncentrációjú nátrium-kloridot tartalmazó fenti pufferrel mossuk át. A kapott enzim 29 egység, specifikus aktivitása 2,09 egység milligrammonként (marhaszérum albuminra számítva). A tisztított enzim nem tartalmaz szennyező enzimeket, például glükozidázt.
Az így kapott keratán-szulfát-hidroláz tulajdonságai a következők:
1) Hatás:
A hidroláz hatást gyakorol a keratán-szulfátra és annak N-acetil-glükóz-aminid kötését hidrolizálja.
2) Szubsztrát specificitás:
A hidroláz reakcióba lép a keratán-szulfát (I)-re, keratán-szulfát (II)-re és a keratán-poliszulfátra és fő hidrolizátumként szulfátéit keratán-szulfát-diszacharidot és szulfátéit keratán-szulfát-tetraszacharidot eredményez. Az is bizonyítást nyert, hogy a hidrolázzal szulfátéit keratán-szulfát-pentaszacharid állítható elő.
3) Az optimális reakció pH:
A hidroláz optimális reakció pH-ja 37 °C-on 0,1 mol/1 acetát-pufferben és 10 mmol/1 trisz/acetát-pufferben 4,5 és 6 közötti érték.
···· « · · ·
4) pH-stabilitás:
A hidroláz pH-stabilitása 37 °C-on 1 órán át 0,1 mol/1 acetát-pufferben és 10 mmol/1 trisz-acetát-pufferben tartva 6 és 7 közötti érték.
5) Az optimális reakcióhőmérséklet:
A hidroláz optimális reakcióhőmérséklete 0,1 mol/1 acetát-pufferben pH 6,0 értéken 10 percig tartva 50 °C és 60 °C közötti tartományba esik.
6) Hőstabilitás:
A hidroláz, ha 0,1 mol/1 acetát-pufferben 6,0 pH-η egy órán át tartva 45 °C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten stabil.
A következő példákban a fentieknek megfelelően előállított keratán-szulfát-hidrolázt alkalmazunk. Találmányunk nem korlátozódik erre az enzimre, találmányunkban alkalmazhatók más keratán-szulfát-hidrolázok is, például endo-β-acetil-glükóz-aminidáz típusú hidroláz, például keratanáz (II) ·
1. példa g cápaporcból származó többszörösen szulfátéit keratán-szulfátot 300 ml 0,1 mol/1 acetát-pufferben (pH 6,0) oldunk. Az oldathoz 25 egység fent leírt keratán-szulfáthidrolázt adunk, és a többszörösen szulfátéit keratán-szulfátot 37 °C-on 24 órán át hidrolizáljuk. A hidrolizációs reakció befejeződése után a reakcióelegyhez kétszeres mennyiségű (térfogat stb.) etanolt adunk, és az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten kevertetjük. A következő napon »· )· az elegyet centrifugálással (4000 fordulat/perc, 15 perc) felülúszóra és csapadékra választjuk szét, és a felülúszót csökkentett nyomáson koncentráljuk, így kapjuk a következőkben A felülúszó néven nevezett koncentrátumot. Másrészt a csapadékot 300 ml desztillált vízben oldjuk, és háromszoros mennyiségű etanollal összekeverve keverhetjük. Az elegyet szobahőmérsékleten egy éjszakán át állni hagyjuk. A következő napon az elegyet centrifugálással felülúszóra és csapadékra választjuk szét, a felülúszót csökkentett nyomáson koncentráljuk, így kapjuk a következőkben B felülúszó néven nevezett koncentrátumot.
Az A felülúszót kis mennyiségű desztillált vízben oldjuk, és 3,6 x 134 cm-es Biogel P-2 oszlopon (Biorad) kromatográfiás gélszűrésnek vetjük alá desztillált víz oldószerben, majd ioncserélő kromatográfiát alkalmazunk, melynek során rendre keratán-szulfát-tetraszacharid (I), keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és keratán-szulfát-diszacharid (III) frakciókat kapunk. A frakciókat fagyasztva szárítjuk.
A keratán-szulfát-oligoszacharid frakciókat kis mennyiségű desztillált vízben oldjuk, és anioncserélő kromatográfiával tisztítjuk 4,3 x 35 cm-es Muromac oszlopon (Muromachi Kagaku Kogyo), melyet előzőleg desztillált vízzel ekvilibrálunk. Eluensként 0 és 0,3 mól tartományban lineárisan emelkedő koncentrációjú nátrium-kloridsó oldatot alkalmazunk, amely rendre keratán-szulfát-tetraszacharid (I), keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és keratán-szulfát-diszacharid (III) frakciókat eredményez.
• · · · • · · · • ·
A kapott keratán-szulfát-tetraszacharid (I), keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és keratán-szulfát-diszacharid (III) frakciókat csökkentett nyomáson koncentráljuk 3,2 x 125 cm-es Cellulofine GCL-25 oszlopon (Seikagaku Corporation), gélszűrés kromatográfiával sómentesítjük, és fagyasztva szárítjuk.·
A B felülúszót a fentiekkel hasonló módon kezeljük, és keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-et, keratán-szulfát-pentaszacharid (II)-t és keratán-szulfát-diszacharid (III)-t kapunk.
A keratán-szulfát-tetraszacharid (I), keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és keratán-szulfát-diszacharid (III) HPLC-vel (nagynyomású folyadékkromatográfia) kapott gélszűrési kromatogramját rendre az 1-3. ábrákon mutatjuk be.
g keratán-szulfátból 7,8 g (15,6 %) keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-et, 1,3 g (2,6 %) keratán-szulfát-pentaszacharid (II)-t és 10,4 g (20,8 %) keratán-szulfát-diszacharid (III)-t kapunk, egyik sem tartalmaz endotoxint, nukleinsavat, fehérjét, proteázt és más glükóz-amino-glükánt.
A keratán-szulfát-tetraszacharid (I), keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és keratán-szulfát-diszacharid (III) NMR spektrumát rendre XH-NMR spektrum esetén JNM-EX400 (400 MHz, JEOL Ltd.) és 13C-NMR spektrum esetén JNM-EX400 (100 MHz, JEOL Ltd.) spektrométereken vesszük fel, belső standard anyagként nátrium-3-(trimetil-szilil)-propionát-D4-et használunk. A kémiai eltolódást δ-val (ppm) és a csatolási állan• · • · · · • · · • ··· dót és Hz-vel jelöljük. A meghatározás eredményét a következőkben mutatjuk be.
Keratán-szulfát-tetraszacharid (I):
XH-NMR δ ( Ό2Ο, 40 °C ): 4,757 (1H, d) , 4,565 (1H, d) , 4,561
(1H, d) , 4,402 (1H, dd), 4,342 (2H, dd) , 3711 (1H, dd),
3,626 (1H, dd) , 3,555 ( 1H, dd), 2,069 (3H, S), 2,047
(3H, S) .
13C-NMR δ (D2O, 25 °C): 177 ,81, 177,63, 177,30 , 105,87,
105,69, 97,84, 93, 34, 84,98, 82,41, 81,91, 81,25,
75,55, 75,44, 75,20, 75,13, 75, 02, 73,70, 72 , 68, 72,07,
71,10, 71,01, 70,61, 69,82, 69, 59, 69,29, 58 ,92, 57,94,
56,42, 25,09, 24,76.
Keratán-szulfát-pentaszacharid (II):
XH-NMR δ (D20, 25 °C) : a spektrum a 4. ábrán látható.
NMR δ (D20, 25 °C) : 177,80, 177, 32, 176, 86, 105,92,
105,78, 104,94, 102 ,60, 97 ,86, 93, 32, 85, 08, 82,55,
82,04, 79,75, 78,16, 77,93, 75,69, 75, 59, 75, 48, 75,24,
74,98, 74,36, 72,68,· 72,33, 72,07, 71,38, 71,01, 70,66,
70, 35, 69, 62, 69,13, 65,38, 63,94, 58,92, 57, 99, 56,42,
54,57, 42,47, 25,07, 24,93, 24,76.
Keratán-szulfát-diszacharid (III):
δ (D2O, 40 °C) : 5,235 (0, 64H, d, J=l,46 Hz), 4,766
(0,41H, d, J=4,88 Hz), 4, 562 ( 1,15H, d, J= 7,82 Hz),
4,44 (0,15H, széles), 4,42 ( :0,22H, széles), 4,357
(l,30H, d, J=3,42 Hz), 4,313 (0,22H, d, J=4,88 Hz),
4,286 (0, 15H, d, J=3,90 Hz) , 4 ,213 (2 :,37H, d, J=5, 37
Hz), 4,183 (0,37H, t, J=3,42, 32, 93 Hz), 4,01-3,97
• · (2,06H, m) , 4,006 (d, J=2,44 Hz), 3, 927 (1, 27H, d,
J=5,37 Hz), 3,86-3,83 (0,37H, széles), 3,78-3,69 (2,78H, m) , 3, 59-3, 56 (l,04H, m) , 2,052 (3,00H, m). 13C-NMR δ (D2O, 25 °C) : 177, 61, 177,30, 105,80, 105, 63, 97,82,
93, 38, 82,02, 81,55, 75, 60, 75, 47, 75, 15, 75, 09, 73, 70,
7-2, 04, 71,12, 71,07, 69, 93, 69, 51, 59, 00, 56, 44, 25, 05, 24,76.
A keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-t, a keratán-szulfát-pentaszacharid (II)-t és a keratán-szulfát-diszacharid (III)-t gyors atom bombázó tömegspektrometriával (FABMS) vizsgáljuk.
1) Kation FABMS (kation gyors atomokkal bombázott tömegspektrometriás analízis)
A keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-t, a keratán-szulfát-pentaszacharid (II)-t és a keratán-szulfát-diszacharid (III)-t vízben oldjuk 25, 40 és 50 nmol/μΐ koncentrációjú vizes oldatokat állítunk elő, és mindegyik vizes oldatból 1,0 μΐ-t 1,0 μΐ α-tioglicerinnel (mátrixként alkalmazva) összekeverünk és ezt használjuk fel a meghatározáshoz. A meghatározást háromszoros tetrapoláris tömegspektrométerrel végezzük: finnigan MÁT TSQ700 xenonnal, bombázó atomként enont alkalmazunk (8 kV). Az eredmények a 3. táblázatban láthatók. A zárójelekben lévő számok a csúcsok relatív intenzitását (%) mutatják.
• ·
3. táblázat
Minta Molekula ion (m/z)
[M+Na]+ [M+2NaH] + [M+3Na2H) + [M+4Na3H] + [M+5Na-4H]+
keratán-szulfát- tetraszacharid (I) 1157(17) 1179(100)
keratán-szulfát- pentaszácharid (II) 1324(9) 1346(14) 1368(100) 1390(80)
keratán-szulfát- diszacharid (III) 566(10) 588(26) 610(37) [M-2H+3Na- 102] + 508(100) [M-2H+3Na- 102-102]+ 406(23)
([M-2H+3Na-102]+ és [M-2H+3Na-102-102]+ fragmens ionok).
2) Anion FABMS (anion gyors atomokkal bombázott tömegspektrometriás analízis)
A keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-ből, keratán-szulfát-pentaszacharid (II)-bői és keratán-szulfát-diszacharid (III)-bői 25, 40 és 40 nmol/μΐ koncentrációjú vizes oldatokat állítunk elő, és rendre 1,0 μΐ, 1,0 μΐ és 0,5 μΐ fent megadott módon előállított keratán-szulfát-oligoszacharid oldatot 1,0 μΐ α-tioglicerinnel (mátrixként használva) keverünk össze, és használjuk a meghatározáshoz. A meghatározást háromszoros tetrapoláris tömegspektrométerrel végezzük: finnigan MÁT TSQ700, bombázóatomként fenont (8 kV) alkalmazunk. Az eredmények a 4. táblázatban láthatók. A zárójelbe tett számok a táblázatban a csúcsok relatív intenzitását (%) j elentik.
• · · ·
4. táblázat
Minta Molekula ion (m/z)
[Μ-ΗΓ [M+Na- 2H]' [M+2Na- 3H)~ [M+3Na- 4H] * [M+4Na-5H]'
keratán-szulfát- tetraszacharid (I) 111(11) 1133(100)
keratán-szulfát- pentaszacharid (II) 1322(22) 1344(100) 1366(7)
keratán-szulfát- diszacharid (III) 542(5) 564(100) 586(6) [M+Na-2H- 102]' 462(23)
([M+Na-2H-102] fragmens ion).
Meghatározzuk a tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I), keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és keratán-szulfátdiszacharid (III) endotoxin, nukleinsav, fehérje és proteáztartalmát. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be.
5. táblázat
Keratán-szulfát- tetraszacharid (I) Keratán-szulfát- pentaszacharid (II) Keratán-szulfát- diszacharid (III)
Endotoxin3’ 6,5 pg/mg vagy kevesebb 1,9xl0'2EU/mg vagy kevesebb 0,2 pg/mg vagy kevesebb 5, 8xl0'4EU/mg vagy kevesebb 0,2 pg/mg vagy kevesebb 5,8xlO'4EU/mg vagy kevesebb
Nukleinsav1’’ 21,0 pg/mg vagy kevesebb 21,0 pg/mg vagy kevesebb 21,0 pg/mg vagy kevesebb
Fehérje1” 1,8 pg/mg vagy kevesebb 1,8 pg/mg vagy kevesebb 1,8 pg/mg vagy kevesebb
Proteáz01 a kimutathatósági határ alatt a kimutathatósági határ alatt a kimutathatósági határ alatt
• · · ·
Megjegyzés: a| : a keratán-szulfát-oligoszacharid mg-okban kifejezett endotoxin tartalmát Toxicolor (kereskedelmi név) rendszerrel (Seikagaku Corporation) határozzuk meg.
EU jelentése endotoxin egység. b) : a DNS-re vonatkozó nukleinsav tartalmat küszöbeljárással határozzuk meg (DNS analizátor: küszöb) (Molecular Device, US).
cl : a fehérjetartalmat Lowry eljárással határozzuk meg standardként marhaszérumalbumint alkalmazunk.
d) : a proteáztartalmat FITC-kazein szubsztrát alkalmazásával határozzuk meg.
A tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I), keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és keratán-szulfát-diszacharid (III) glükóz-amin-glükán, például hialuronsav, chondroitin-szulfát, dermatán-szulfát, heparán-szulfát, keratán-szulfát, stb. tartalmát elektroforézissel határozzuk meg, cellulóz acetát membránon (Cepallax, Fuji Photo Film) (puffer: 0,1 mol/1 piridin-hangyasav; pH 3,0; áram: 0,5 mA/cm; elektroforézis időtartam: 30 perc; megfestés: 0,5 % Aluciankék oldat). A meghatározás eredményeképpen megállapítjuk, hogy egyik keratán-szulfát-oligoszacharidban sem detektálhatok a fenti vegyületek (a kimutathatósági határ alatt maradnak).
2. példa
A keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-t, keratán-szulfát-pentaszacharid (II)-t és keratán-szulfát-diszacharid (III)-t akut toxicitás és más vizsgálatoknak vetjük alá.
Akut toxicitás vizsgálat
Az 1. példa szerint előállított tisztított keratánszulfát-oligoszacharid minták toxicitását 5 hetes nőstény és • · · · hím ICR egereken vizsgáljuk. A keratán-szulfát-tetraszacharid (I), keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és keratán-szulfátdiszacharid (III) PBS-sel (foszfát-puffér só) készült oldatát rendre intravénásán 1,000 mg/kg vagy 2,000 mg/kg dózisban beadjuk, és feljegyezzük az állatok általános állapotát, életben maradását, elpusztulását és mérjük tömegüket 14 napon át. Ezután az állatokat leöljük és felboncoljuk.
A vizsgálat eredményeképpen megállapítjuk, hogy egyetlen állat sem pusztult el, és általános állapotukban, tömegükben, továbbá a boncolás során semmilyen rendellenességet nem észlelünk.
A fent meghatározott eredményekből megállapítjuk, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid minimális halálos dózisa még intravénás beadásnál is több, mint 2000 mg/kg.
Gyulladáscsökkentő hatás vizsgálata
1) Gyulladáscsökkentő hatás vizsgálata papain által kiváltott artritisz modell nyulakon
A keratán-szulfát-oligoszacharid gyulladáscsökkentő hatását papain által indukált artritisz modell nyulakon vizsgáljuk az ízületi folyadék mennyiségének meghatározásával .
1-1. Intraartikulárisan beadott keratán-szulfát-tetraszacharid gyulladásgátló hatása kétoldali gonartritisz modellen
Az artritisz modell előállításához 3 kg tömegű, fehér nőstény japán nyúl mindkét oldali térd ízületének üregébe 150 μΐ papain sóoldatot (1 %) injektálunk. A papain injektá37 lása után egy nappal a bal térd ízületi üregébe 150 μΐ 1. példa szerint előállított, tisztított keratán-szulfáttetraszacharid (I) PBS-sel készült oldatát (1 %-os oldat;
1,5 mg/ízület) injektáljuk (a következőkben keratán-szulfáttetraszacharid (I)-gyel kezelt lábnak nevezzük) és a jobb térdbe · 150 μΐ PBS-t injektálunk (a továbbiakban keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel nem kezelt lábnak nevezzük). A következőkben az ilyen keratán-szulfát-tetraszacharid (I) kezelésnek kitett nyulakat kezelt csoportnak nevezzük és a csak papainnal beinjekciózott nyulakat (a továbbiakban kontrollcsoportnak nevezzük) és a papainnal be nem injekciózott normális nyulakat (a továbbiakban normális csoportnak nevezzük) hasonló módon vizsgáljuk.
Az injekciózás után 7 nappal a fül artériából vért veszünk és elválasztjuk a heparint tartalmazó plazmát. A vérvétel után a nyulakat felboncoljuk, és mindkét oldali térdízületet elválasztjuk. Az ízületi üreget az ízületi folyadék visszanyerésére háromszor 2 ml sóoldattal mossuk. Meghatározzuk a plazma és a visszanyert ízületi folyadék kalcium-koncentrációját, és a következő képlet alapján kiszámítjuk az ízületi folyadék mennyiségét.
ízületi folyadék mennyisége (μΐ/ízület) = kalcium mennyisége a visszanyert ízületi folyadékban ^g/ízület)/ kalcium koncentrációja a plazmában (pg/μΐ) • · α · ···· ·· • e
A kapott eredmények a 6. táblázatban láthatók. A táblázatban n jelentése a kísérlet során az egyes csoportokban a nyulak száma.
6. táblázat
Kontroll csoport (n=12) Kezelt csoport (n=8) Normális csoport (n=8)
Kezelt láb Nem kezelt láb
ízületi folyadék mennyisége (μΐ) 729 530 537 437
(standard szórás) (111) (147) (130) (63,3)
Szignifikancia* - p<0,05 p<0,05 p<0,01
Megjegyzés : A szignifikanciát Duncan-féle többszörös összehasonlító vizsgálattal határozzuk meg.
A fenti eredményekből látható, hogy a találmányunk szerinti keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoport ízületi folyadékának mennyisége szignifikánsan kevesebb, mint a kontrollcsoporté, ez megerősíti a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) artritiszre gyakorolt hatását,
1-2. Intramuszkulárisan beadott keratán-szulfát-tetraszacharid gyulladásgátló hatása ambilaterális térdízület gyulladás modellen
Az ízületi gyulladás modellt az 1-1. pontban ismertetett eljárással állítjuk elő és a papain beadása után egy nappal a bal csípőízületi izomba 150 μΐ 1. példa szerint előállított, tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I) PBS-sel készült oldatát (1 %-os oldat; 0,5 mg/kg tömeg) injektáljuk (a következőkben ezt a csoportot keratán-szulfát··«*»
-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoportnak nevezzük). Kontrollként 150 μΐ PBS-t injektálunk az ízületi gyulladás modellbe a keratán-szulfát-tetraszulfát (I) PBS-sel készült oldata helyett, és a továbbiakban ezeket a nyulakat kontrollcsoportnak nevezzük. A normális nyulakba, melyekbe nem injektálunk papaint (a továbbiakban eze-kre, mint normális csoportra hivatkozunk), a továbbiakban hasonló módon vizsgáljuk. Hét nappal az injektálás után az ízületi folyadék mennyiségét az 1-1. pontban megadottal hasonló módon számítjuk ki.
Az eredményeket a 7. táblázatban foglaljuk össze, ahol n jelentése a kísérlet egyes csoportjaiba tartozó nyulak s z áma.
7> táblázat
Kontroll csoport (n=12) Kezelt csoport (n=12) Normális csoport (n=8)
ízületi folyadék mennyisége (pl) 729 561 437
(standard szórás) (111) (65,8) (63,3)
Szignifikancia* - p<0,01 p<0,01
Megjegyzés : A szignifikanciát Duncan-féle többszörös összehasonlító vizsgálattal határozzuk meg.
A fenti eredményekből látható, hogy a keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoport ízületi folyadékának mennyisége szignifikánsan kevesebb, mint a kontrollcsoporté, ez megerősíti a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) artritiszre gyakorolt hatását.
1-3. Intramuszkulárisan beadott keratán-szulfát-tetraszacharid gyulladásgátló hatásának vizsgálata fél oldali térdízületi gyulladás modellen kg tömegű fehér nőstény japán nyúl bal térdízületi üregébe 150 μΐ papain sóoldatot (1 %) injektálunk és a jobb térdet nem kezeljük, ezáltal fél oldali térdízületi gyulladás modellt hozunk létre. A papain injektálása után egy nappal a bal csípőizomba 150 μΐ 1. példa szerint tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I) PBS-sel készült oldatát (2 %, 1 % és 0,5 %-os oldat rendre 1,0 mg/kg, 0,5 mg/kg és 0,25 mg/kg) injektáljuk (a továbbiakban ezt keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoportnak nevezzük). Kontrollként 150 μΐ PBS-t injektálunk az ízületi gyulladás modellbe a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) PBS-sel készült oldata helyett, és a továbbiakban ezeket a nyulakat kontrollcsoportnak nevezzük. A papain injekcióban nem részesített normális nyulakat (melyeket a továbbiakban normális csoportnak nevezünk) a továbbiakban hasonló módon kezeljük. Az injekciózás után 7 nappal az ízületi folyadék mennyiségét az 1-1. pontban megadotthoz hasonlóan számítjuk ki. Az eredmények a 8. táblázatban láthatók. A táblázatban n jelentése a kísérlet egyes csoportjaiban részt vett nyulak száma.
• ·
8. táblázat
Kontroll csoport PBS (n=10) Keratán-szulfát- tetraszacharid (I) Normális csoport (n=10)
Kezelt csoport (mg/kg)
0,25 (n=9) 0,5 (n=10) 1,0 (n=9)
ízületi folyadék mennyisége (μΐ) 722 619 597 528 433
(standard szórás) (70,0) (70,6) (68,9) (53,1) (46,1)
Szignifikancia* - p<0,05 p<0,01 p<0,01 p<0,01
Megjegyzés : A szignifikanciát a TUKEY többszörös összehasonlító vizsgálattal határozzuk meg.
A fenti eredményekből látható, hogy a találmányunk szerinti keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoportban az ízületi folyadék mennyisége szignifikánsan kevesebb, mint a kontrollcsoportban, és ez megerősíti a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) ízületi gyulladásra gyakorolt hatását.
1-4. Intramuszkuláris úton beadott keratán-szulfát-oligoszacharid változatok gyulladásgátló hatásának vizsgálata egyoldali térdízületi gyulladás modellen
A vizsgálatot az 1-3. pontban megadotthoz hasonló módon végezzük, azzal az eltéréssel, hogy 150 μΐ tisztított az 1. példa szerint előállított keratán-szulfát-tetraszacharid (I), keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és keratán-szulfát-diszacharid (III) PBS-sel készült oldatát használjuk (1 %-os oldat; 0,5 mg/kg). Az eredmények az 5. ábrán láthatók. Az ábrán *, ** és *** jelzi, hogy jelentős különbség észlelhető • · · • · · · ·· · • · ρ<0,05, ρ<0,01 és ρ<0,001 értékek között. A vizsgálat során mindegyik csoportban 10 nyulat alkalmazunk.
Az eredményekből látható, hogy a keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel, a keratán-szulfát-pentaszacharid (II)-vei és keratán-szulfát-diszacharid (III)-mai kezelt csoportok közül bármelyiknél az ízületi folyadék mennyisége szignifikánsan kevesebb, mint a kontrollcsoporté, és ez megerősíti a keratán-szulfát-oligoszacharid ízületi gyulladásra gyakorolt hatását.
2) Gyulladásgátlás vizsgálata lábödémás patkányokon fordított passzív Arthus reakcióval
A keratán-szulfát-oligoszacharid hatását vizsgáljuk lábödémás patkányokon fordított passzív Arthus reakcióval, amely egy (III) típusú allergiás gyulladás modell. Olyan patkányok talpába adtunk be szubkután nyúl antiovalbumin szérumot, melyek korábban tesztanyagokat kaptak, továbbá farokvégi vénájukba ovalbumint adtunk be gyulladás kiváltására (ödéma), és vizsgáljuk a tesztanyagok ödémára gyakorolt gátló hatását.
(Tesztanyagok beadása)
Öthetes hím Crj:SD patkányokat egy hétig nevelünk, majd körülbelül 17 órán át koplaltatunk, és a gyulladás kiváltása előtt tesztanyagként 1. példa szerinti tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-et indomethacint (Sigma; Lót No. 19F0018) vagy dexamethasone-t (Banyu Pharmaceutical; Decadron injection; Lót No. 8D307P) vagy negatív kontrollként sót (Otsuka Pharmaceutical; Lót No. K3H72) adunk be. A használat • · · · során a keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-et és a dexamethasone-t sóban oldjuk és az indometachint 0,5 %-os nátrium-karboxi-metil-cellulózban oldjuk (CMC-Na; Wako Pure Chemical Industries; Lót No. PTN1418). Mindegyik vizsgálatnál a dózis térfogata 100 g tömegre számítva 0,5 ml. A beadás módját -illetően a keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-t, a sót és a dexamethasonet a farokvégi vénába és az indomethacint szájon át adjuk be. Az indomethacin kivételével az anyagokat vakpróbával adjuk be.
Mindegyik tesztanyag dózis beadási ütemezése a következő: mindegyik csoport öt állatból áll.
i) Beadás öt perccel a gyulladás kiváltása előtt
1) Só (negatív kontroll)
2) Keratán-szulfát-tetraszacharid (I) 1 mg/kg
3) Keratán-szulfát-tetraszacharid (I)
4) Keratán-szulfát-tetraszacharid (I) ii) Beadás 30 perccel a gyulladás kiváltása előtt
5) Indomethacin (pozitív kontroll) 5 mg/kg iii) Beadás három órával a gyulladás kiváltása előtt
6) Keratán-szulfát-tetraszacharid (I)
7) Keratán-szulfát-tetraszacharid
8) Keratán-szulfát-tetraszacharid (I)
9) Dexamethasone (pozitív kontroli;
mg/kg 10 mg/kg
(I) 1 mg/kg
(I) 3 mg/kg
(I) ) 10 1 mg/kg mg/kg
(Gyulladás kiváltása)
A patkányok mindegyikének a talpába szubkután nyúl antiovalbumin szérumot adunk be, és a farokvégi vénába vénás injekcióban további ovalbumint adunk be gyulladásos lábödéma • · · ·
kiváltására. Az alkalmazott antiszérumot a következőképpen állítjuk elő. A nyulak hátrészébe 2 % ovalbumint tartalmazó só (10 mg állatonként, Egg albumin 5 x Cryst, Lót No. P93601; Seikagaku Corporation) és Freund komplett adjuvánst (FCA) egyforma mennyiségben összekevert oldatából (emulzió) 1 ml-t injektáltunk be egy héten egyszer, összesen háromszor az érzékenyítéshez. Az utolsó érzékenyítés után 34 nappal vért veszünk az antiszérum kinyerése céljából. Az antiszérum antitest-titerét kétréteges eljárással határozzuk meg, nevezetesen, sóval hígított antiszérum fehér kicsapási reakciót alkalmazunk, és a só indikátorként 0,1 % ovalbumint (1 mg/ml) tartalmaz. Ennek eredményeképpen a kapott antiszérum antitest titer x27.
Meghatározott időtartam elteltével 0,1 ml hatszorosan hígított antiszérumot adtunk be szubkután, mindegyik tesztanyaggal kezelt patkány bal hátsó talpába. Ezután a gyulladás kiváltására a farokvégi vénába 0,5 % ovalbumint tartalmazó sót (25 mg/5 ml/kg) adtunk be. Minden csoportnál meghatározzuk a kezelt láb térfogatát a gyulladás kiváltása előtt, továbbá egy, kettő, három és négy órával a gyulladás kiváltása után egy lábtérfogat-meghatározó eszközzel (TK-101, Unicom) a lábödémásodás sebességének meghatározására, mérve a gyulladás kiváltása előtti értéktől való eltérést és kiszámítjuk a tesztanyaggal kezelt csoportban az ödémásodásgátló arányt a kontrollcsoporthoz képest. Mindegyik meghatározott ödémásodási aránynál az átlagok közötti különbséget minimális jellemző eltérési vizsgálattal végeztük. A kezelt csopor45 • · • ·· « · toknál a lábödémásodás arányát és az ödémásodás gátlásának arányát a 9. táblázatban mutatjuk be, a kezelt csoportoknál a lábödémásodás arányát a 6. és 7. ábrán mutatjuk be abban az esetben, amikor a gyulladás kiváltása előtt 5 perccel, illetve 3 órával adtuk be az anyagot. Az ábrákon a * és a ** jelzi a szignifikáns különbséget rendre p<0,05 és p<0,001 érték esetén.
táblázat
4 órával később Ödémásodás aránya (%) Gátlás aránya (%) 44,912,5 ~ a - O l-Η *co co co -Η -Η Ή cd cm sr σ> r— to CQ CQ fQ 38,713,1* (13,8) J? ' (D CM CM « * Lf) CM kO 00 CM CO Ή -Η -H ο σ m <X> CC T 00 00 00 18,812,0** (58,1)
3 órával később Ödémásodás aránya (%) Gátlás aránya (%) 51,213,7 42,313,6 (17,0) 46,112,2 (9,5) 44,815,1 (12,3) 46,412,8 (9,0) m ? «Η 00 CM M 00 ~ kO 00 00 <t» *. K CM CM r-d Ή -Η -H Γ* «—1 Lfj k£5 O pH 30,711,5 (39,9)
2 órával később Ödémásodás aránya (%) Gátlás aránya (%) 46,314,4 29,412,9 (36,5) 42,314,2 (8,6) 42,112,9 (9,1) 38,212,9* (17,5) σ «3« OO ΤΓ <33 Q kO CO k0 00 CM CM -Η Ή Ή ^3* <O Μ CM UO kO 00 Μ1 31,612,2 (31,7)
1 órával később Ödémásodás aránya (%) Gátlás aránya (%) ro +1 σι o t oo cn 00 in cd ™ t-H CM CD CM 1— i—i in co -Η -Η -H CM D· rd σ eh CM (Ό CM 35,411,6 (13,5) 35,411,6 (13,4) 36,513,5 (10,6) 44,213,4 (-8,1) 00 r- l-1 oo -H oo t-H CM
Dózis (mg/kg) 1 rH m o i—1 m rH CO Ο rH rH
Tesztanyag Sóoldat (kontroll) Keratán-szulfáttetraszacharid (I) Beadás 5 perccel az ödéma kiváltása előtt Indomethacin Orális beadás 30 perccel az ödéma kiváltása előtt Keratán-szulfáttetraszacharid (I) Beadás 3 órával az ödéma kiváltása előtt Dexamethason Beadás 3 órával az ödéma kiváltása előtt
jelzi a szignifikáns különbséget a kontrollal összehasonlítva, p<0,05 (*) és p<0,01 érték esetén.
• · · · · • · ··· • ·
Az eredményekből látható, hogy a negatív kontrollcsoportban a sóoldat beadása után egy órával a lábödémásodási arány 40,9 %, míg a keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoportban 5 perccel a gyulladás kiváltása után ez az érték 29,1 % és 34,4 % közötti, és jelentős különbség figyelhető meg az 1 mg/kg és a 10 mg/kg koncentrációval kezelt csoportoknál. A gyulladás kiváltása után egy órával és később nem figyelhetünk meg dózisfüggő reakciót a 3 mg/kg koncentrációval kezelt csoportban és a 10 mg/kg koncentrációval kezelt csoportban, a láb ödemizációja rendre 37,2 % és 35,4 %, ez az érték jelentősen alacsonyabb még négy óra múlva is. A gyulladás kiváltása előtt három órával keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoportoknál azonban nem figyelhető meg szignifikáns különbség a gyulladás kiváltása után egy órával, figyelemre méltóan alacsony értékeket kapunk 3 mg/kg koncentrációban történő kezelés után két órával, 10 mg/kg koncentrációban történő kezelés után három órával és 1 mg/kg koncentrációban való kezelés után négy órával, amely értékek rendre 35,3 %, 41,5 % és 38 %. Az indomethacinnal kezelt csoportban ennél lényegesen alacsonyabb értékeket kapunk két órával és négy órával a kezelés után. A dexamethasone-val kezelt csoportnál is jelentősen kisebb értékeket kapunk bármely meghatározási pontban a gyulladás kiváltása után egy és négy óra közötti időtartamban.
Az indomethacinnal kezelt csoportban a lábödémásodás gátlásának aránya 9 % és 17,5 % közötti érték egy és négy óra múlva, míg az 5 perccel korábban keratán-szulfát-tetra48 szacharid (I)-gyel kezelt csoportnál 8,6 % és 36,5 % közötti értékeket kapunk. A beadás előtt három órával keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoportban a gátlási arány -8,1 % és 24,4 % közötti érték. Másrészről a dexamethasonenal kezelt csoportban a lábödémizáció gátlás aránya 31,7 % és
58,1 % közötti érték volt.
(3) Gyulladás gátlásának vizsgálata karragén mellhártyagyulladás modell patkányoknál
Megvizsgáljuk a keratán-szulfát-oligoszacharid hatását karragén mellhártyagyulladás modell patkányokon, melyeket általában gyulladásgátló anyagok tesztelésére alkalmaznak.
Körülbelül 150-170 g-os nőstény S.D. patkányokat (n=37) alkalmazunk a teszthez, λ-carrageenin-t (Sigma) oldunk sóoldatban 2 %-os koncentrációban, és az oldatot 0,8 pm-es szűrőn szűrjük. A kapott karragen oldatot intratorekálisan adjuk be állatonként 100 pl mennyiségben a mellhártyagyulladási modell előállításához.
A fent ismertetett mellhártyagyulladás modell patkányoknak (n=19) PBS-ben oldott keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-et adunk be szubkután (s.c.) 20 mg/kg vagy 10 mg/kg dózisban. Pozitív kontrollként a fent leírt nyolc patkánynak szteroidot (dexamethasone-acetát; Banyu Pharmaceutical) adunk be szubkután 150 pg/kg klinikai dózisban. Negatív kontrollként tíz patkánynak PBS-t adunk be szubkután. Mindegyik beadás közvetlenül a carraneegin beadása után történik. A kezelt csoportok eredményei a 10. táblázatban láthatók.
• · · • ·· ··
10. táblázat
Kezelt csoport Tesztanyag Dózis Beadási arány
(1) n=10 keratán-szulfát-tetraszacharid (I) 2 mg/ml 10 mg/kg s. c.
(2) n=9 keratán-szulfát-tetraszacharid (I) 4 mg/ml 20 mg/kg s. c.
(3) n=8 dexamethasone-acetát 30 pg/ml 150 pg/kg s . c.
(4) n=10 PBS (negatív kontroll) s. c.
Mindegyik patkányt a λ-karragen beadása után hat órával felboncoljuk. A patkányok mellüregét felnyitjuk, és egy 2 ml-es szondával ellátott fecskendővel összegyűjtjük a pangó mellkasi folyadékot. Ezután a mellkasüreg belsejét 1 ml sóoldattal mossuk, és a mosóoldatot visszanyerjük. Meghatározzuk a fecskendővel kinyert mellkasi folyadék mennyiségét, és egy automata citométerrel a mellkasi folyadékban a leukociták számát (sejtszám). Az eredmények a 8. és 9. ábrán láthatók. Az ábrákon a *-gal és **-gal jelezzük a p<0,05 és p<0,01 értékek közötti szignifikáns különbséget (ahol p jelentése a Duncan-teszttel meghatározott szignifikancia szintet jelenti).
Ahogy a 8. ábrán láhtató, a 10 mg/kg koncentrációban keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoportnál a mellkasi folyadék mennyisége szignifikánsan kevesebb, mint a negatív kontrollcsoportnál, de majdnem azonos a 20 mg/kg koncentrációban keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoportéval, tehát dózisfüggőség nem figyelhető meg. A dexamethasone-acetáttal kezelt csoport mellkasi folyadékának mennyisége lényegesen kevesebb, mint a negatív kontrollcsoporté. A 10 mg/kg és 20 mg/kg koncentrációban keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-gyel kezelt csoportnál a mellkasi folyadékban a leukociták száma szignifikánsan kevesebb, mint a negatív kontrollcsoportban és a leukociták számában dózisfüggő csökkenés figyelhető meg (lásd a 9. ábrát). A dexamethasone-acetáttal kezelt csoportban a leukociták száma lényegesen kevesebb, mint a kontrollcsoportban (lásd a 9. ábrát).
A fent ismertetett eredményekből látható, hogy a karragen mellhártyagyulladás modell patkányokon végzett vizsgálatok megerősítik a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) gyulladásgátló hatását.
(4) Aktív oxigén (O2~) fejlődést gátló hatás vizsgálata tengerimalac neutrofil leukocitán
Öt hetes Hartley nőstény tengerimalacoknak (Japan SLC) sóoldatban oldott glükogén (II. típus; osztriga; Sigma) 0,2 %-os vizes oldatából, melyet előzőleg nagynyomású gőzzel sterilizálunk, 20 ml-t adunk be intraperitoneálisan. A beadás után 16 órával a tengerimalacokat kivéreztetéssel lehljük, és 20 ml 10 U/ml koncentrációjú heparint tartalmazó sóoldatot injekciózzuk intraperitoneálisan a hasüregi váladék kinyerésére. A műveleteket jeges vizes hűtés mellett végezzük el, kivéve az inkubálást. A kinyert testváladékot 1000 fordulat/percen 10 percig centrifugáljuk, a kapott csapadékot 30 másodpercig tisztított vízzel hemolizáljuk és az izotóniát Hank-oldattal állítjuk be kétszeres koncentrációra (fenol51 vöröst nem tartalmaz; Nissui Seiyaku) , majd. ismét 1000 fordulat/percen 10 percig centrifugáljuk. A kapott csapadékot Hank-oldattal szuszpendáljuk, és centrifugáljuk, majd a műveleteket még egyszer megismételjük a neutrofil leukocita kinyerésére.
A. tengerimalac összegyűjtött neutrofil leukocitáit Hank-oldatban szuszpendáljuk, a szuszpenzió leukocita számát citométerrel határozzuk meg (System K-2000; Toa Iyo Denshi Co.) , és a szuszpenziót Hank-oldattal hígítjuk 2 x 106 sejt/ml koncentrációig, melyet sejtszuszpenzióként alkalmazunk a meghatározásnál. 1 ml sejtszuszpenziót és 10 μΐ 1. példa szerint előállított tisztított keratán-szulfátoligoszacharidot [keratán-szulfát-tetraszacharid (I) , keratán-szulfát-pentaszacharid (II) és keratán-szulfát-diszacharid (III)] összekeverünk, majd az elegyet 37 °C-on egy órán át előinkubáljuk. Ezután 50 μΐ 1,6 mmol/1 citokróm c-t (III) . típus; lószív; Sigma) és 10 μΐ 100 μπιοί/ΐ N-formilMet-Leu-Phe (a továbbiakban FMLP-nek nevezzük; Sigma) adunk hozzá és összekeverjük. Az elegyet 37 °C-on 10 percig inkubáljuk, ezután jéggel lehűtjük a reakció leállítására, és 3000 fordulat/percen centrifugáljuk 5 percig.
A centrifugálás után a felülúszót elválasztjuk, és 550 nm-nél meghatározzuk az abszorbanciát a 10 perc inkubálás utáni 2xl06 sejt citokróm c csökkent mennyiségének meghatározására. A citokróm c mennyiségének csökkenésével növekszik az aktív oxigén (O2“) fejlődése. A meghatározásnál vakpróbaként 20 pg/ml végső koncentrációjú rekombináns humán SÓD
I · · * • · • · · · • · • *
I »· • · (szuperoxid-diszmutáz) hozzáadásával kapott mintákat használunk. A kísérletben egymástól függetlenül hat tengerimalacot alkalmazunk. A keratán-szulfát-oligoszachariddal kezelt csoportoknál a redukáló citokróm c mennyiségének arányát úgy számítjuk ki, hogy a kontroll (keratán-szulfát-oligoszacharid hozzáadása nélkül) redukáló citokróm c mennyiségét 100 %-nak vesszük, és a kontrollcsoport mennyiségétől való eltérést az aktív oxigén (O2) fejlődés gátlási arányaként (%) számítjuk ki, ezen túlmenően minden kísérletnél meghatározzuk az átlagokat. Az eredményeket a 10. ábrán mutatjuk be. A keratán-szulfát-oligoszacharid koncentrációja az ábrán végső koncentráció.
Az eredmények azt mutatják, hogy a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml és 1,0 mg/ml koncentrációban a koncentrációtól függő mértékben figyelemre méltóan gátolja az aktív oxigén (O2~) fejlődését, és ez alátámasztja a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) gyulladásgátló hatását. A keratán-szulfát-diszacharid (III) és a keratán-szulfát-pentaszacharid (II) esetében gyenge aktív oxigén (O2~) fejlődésgátló hatás figyelhető meg. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid a gyulladásgátló hatást a neutrofil leukocitában az aktív oxigén (O2“) fejlődés útján fejti ki.
(Allergiaellenes hatás)
Allergiás kötőhártyagyulladásos tengerimalacok szemébe különböző keratán-szulfát-oligoszacharid-származékokat cseppentünk, és megvizsgáljuk ezek hatását.
(1) A keratán-szulfát-tetraszacharid (I) hatása az allergiás kötőhártyagyulladásra
Toluol-diizocianátot (következőkben TDI) etil-acetáttal 10 %-ra hígítunk. Körülbelül 10 db 900 és 1000 g közötti tömegű nőstény Hartley tengerimalac orrának mindkét oldali bejáratánál naponta egyszer 10 %-os TDI-t (10 μΐ/állat) alkalmazunk, öt napon keresztül, ezzel TDI érzékenyített modellt hozunk létre. A TDI érzékenyített modell bal szemébe 1. példa szerint előállított és tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I) PBS oldatot (100 mg/ml) cseppentünk, míg kontrollként a jobb szemébe PBS-t cseppentünk. A cseppentés dózisa egy csepp [48±4,6 μΐ (S.D.)] szemcseppentőbői. 10 perc múlva 6,5 μΐ 10 %-os TDI-t cseppentünk mindkét szembe a kötőhártyagyulladás kiváltására. 5 perc várakozási idő múlva a bal szembe keratán-szulfát-tetraszacharid (I) PBS oldatot cseppentünk (100 mg/ml) és a jobb szembe PBS-t cseppentünk. 15 perc múlva megvizsgáljuk mindkét szemet. A kötőhártyagyulladás mértékét három szempontból vizsgáljuk: a vérbőség, ödéma és könnyezés; négy fokozatra osztjuk: 0, +1, +2 és +3 pont. A vizsgálat eredményeképpen a pontok átlaga és a standard szórás a 11. ábrán látható. Az ábrán *-gal jelöljük a p<0,05 értéktől való szignifikáns eltérést (ahol p jelentése a χ2 vizsgálattal kapott szignifikancia szint).
A vizsgálat eredményeképpen megfigyelhetjük, hogy a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) mind a gyulladást, mind ödémát, mind könnyezést gátolja, és a kontrollal összehasonlítva különösen jelentősen gátolja az ödémát.
· ·* • * *· (2) Különböző keratán-szulfát-oligoszacharidok hatása allergiás kötőhártyagyulladásra
Vizsgálati anyagként a fent leírt 1. példa szerint előállított, tisztított keratán-szulfát-diszacharid (III), keratán-szulfát-tetraszacharid (I) és keratán-szulfát-pentaszacharid (II) (rendre 6,0 mg/ml) PBS oldatát tíz állatból álló TDI érzékenyített modell csoport bal szemébe cseppentjük, A csoportot a fent leírt (1) pontban megadotthoz hasonló módon készítjük elő, és kontrollként a jobb szembe PBS-t cseppentünk. A kötőhártyagyulladás mértékét a fenti (1) pontban megadott módon vizsgáljuk. A vizsgálat eredménye, a pontok átlaga és a standard szórás a 12. ábrán látható. Az ábrán *-gal jelöljük a p<0,05 értéktől való szignifikáns eltérést (ahol p jelentése a χ2 vizsgálattal kapott szignifikanciaszint).
A vizsgálat eredményeképpen megállapítjuk, hogy a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) és a keratán-szulfát-pentaszacharid (II) mind a gyulladásra, mind az ödémára, mind a könnyezésre gátló hatású, különösen kifejezetten jelentkezik a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) ödémagátló hatása.
(3) Különböző koncentrációjú keratán-szulfát-tetraszacharid (I) hatása az allergiás kötőhártyagyulladásra
Vizsgálati anyagként különböző koncentrációjú (6 mg/ml, 3 mg/ml, 1,5 mg/ml vagy 0,75 mg/ml) 1. példa szerint előállított és tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-et tartalmazó PBS oldatot cseppentünk 10 db (1) pont szerint TDI érzékenyített modell állat bal szemébe, és kontrollként jobb szemükbe PBS-t cseppentettünk. A kötőhártyagyulladás mértékét a fenti (1) pontban megadott módon vizsgáljuk. A vizsgálat eredményét, a pontok átlagát és a standard szórást a 13. ábrán mutatjuk be. Az ábrán *-gal jelöljük a p<0,05 értékű szignifikáns eltérést (ahol p jelentése a χ2 vizsgálattal meghatározott szignifikancia szint).
Az eredmények azt mutatják, hogy. a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) PBS-sel készült oldata a gyulladásra, az ödémára és a könnyezésre mindegyik koncentrációban gátló hatású, különösen 6 mg/ml, 3 mg/ml és 1,5 mg/ml koncentrációban mutat szignifikáns gátló hatást az ödémára nézve.
(Immunmoduláló hatás sejtdifferenciálódást kiváltó hatás és apoptózist kiváltó hatás)
Megvizsgáljuk a keratán-szulfát-oligoszacharid MRL, (autoimmun-betegség modell) egerekre gyakorolt hatását.
(1) Nyirokcsomó tömeg gátló hatás (1-1) Keratán-szulfát-tetraszacharid (I) ismételt intramuszkuláris beadása négy héten át MRL egereknek
Az 1. példa szerint előállított tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I) (100 mg/ml) PBS oldatát 10 mg/kg tömeg dózisban (melyet a továbbiakban kezelt csoportnak nevezünk), és kontrollként PBS-t intramuszkulárisan injektálunk hetente ötször, 4 héten keresztül MRL-lpr/lpr egerek femorális területére. Ezután az egereket felboncoljuk, és meghatározzuk lépük és mezenteriális nyirokcsomóik tömegét az átlag tömeg meghatározására. Az eredményeket és a standard hibákat a 11. táblázatban mutatjuk be. A táblázatban n jelentése a vizsgált egerek száma.
11. táblázat
Lép tömege (mg) Mezentériás nyirokcsomó tömege (mg)
Kontrollcsoport (n=8) 10131233 15631352
Kezelt csoport (n=9) 7041148 13381311
A vizsgálat eredményeképpen megállapíthatjuk, hogy a lépek és a mezentériás nyirokcsomók tömege a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) injekcióval kezelt csoportnál növekedett, ez azt mutatja, hogy a keratán-szulfát-tetraszacharid (I) immunmoduláló hatású.
(1-2) Keratán-szulfát-diszacharid (III) ismételt intramuszkuláris beadásának vizsgálata 28 napig MRL egereken
A fent ismertetett 1. példa szerinti tisztított keratán-szulfát-diszacharid (III) PBS oldatából 1 mg/kg, 5 mg/kg vagy 25 mg/kg tömegű dózist (a továbbiakban 1 mg/kg-mal kezelt csoportnak, 5 mg/kg-mal kezelt csoportnak és 25 mg/kg-mal kezelt csoportnak nevezzük) és kontrollként PBS-t (a továbbiakban általában kontrollcsoportnak nevezzük) intramuszkulárisan injektálunk be MRL-lpr/lpr egerek combcsonti területére hetente hétszer 4 héten át. Ezután az egereket felboncoljuk, és meghatározzuk állkapocs alatti nyirokcsomóik átlagtömegét. Az eredmények és a standard szórás a 14. ábrán látható, mindegyik csoportban hat egeret használunk. Az ábrán * jelzi a p<0,05 érték szignifikáns • · · · · · Λ ·· • · · · . - ··· ·· · ·· • · ·· ··.
• · · ···♦·· · · eltérését (ahol p jelentése a Bonferroni többszörös összehasonlító teszttel meghatározott szignifikanciaszint).
A fentiek eredményeképpen megállapítható, hogy a keratán-szulfát-diszacharid (III)-mai bármilyen dózisban kezelt csoportban az állkapocs alatti nyirokmirigyek tömegnövekedése gátolt, különösen az 5 mg/kg-mal kezelt csoportban volt megfigyelhető szignifikáns gátló hatás, összehasonlítva a kontrollcsoporttal, ezért ezek az eredmények azt mutatják, hogy a keratán-szulfát-diszacharid (III) immunmoduláló hatású.
(1-3) Keratán-szulfát-diszacharid (III) ismételt intramuszkuláris beadása 56 napig MRL egereknek
A fenti 1. példa szerint előállított tisztított keratán-szulfát-diszacharid (III) PBS oldatát 2,5 mg/kg, 5 mg/kg vagy 10 mg/kg tömegű dózisban (a továbbiakban ezeket
2,5 mg/kg-mal kezelt csoportnak, 5 mg/kg-mal kezelt csoportnak és 10 mg/kg-mal kezelt csoportnak nevezzük) és kontrollként PBS-t (a továbbiakban általában kontrollcsoportnak nevezzük) intramuszkulárisan injektálunk be MRL-lpr/lpr egerek combcsonti területére hetente hétszer 8 héten keresztül. Ezután az egereket felboncoljuk, és a mezentériás és állkapocs alatti nyirokcsomók tömegét meghatározzuk az átlagtömeg megállapítása céljából. A mezentériás és állkapocs alatti nyirokmirigyekre vonatkozó eredmények a 15. és 16. ábrán láthatók a standard hibákkal együtt. Mindegyik csoportban hét egeret használunk.
• · · · · • * ♦·
A 2,5 mg/kg keratán-szulfát-diszacharid (III)-mai kezelt csoportban a mezentériás nyirokcsomók és a 10 mg/kgmal kezelt csoportban a mezentériás és az állkapocs alatti nyirokcsomók tömegnövekedése figyelhető meg, ebből következik, hogy a keratán-szulfát-diszacharid (III) immunmoduláló hatást -mutat.
(2) Sejtdifferenciálódást kiváltó hatás (2-1) A sejtdifferenciálódás kiváltásának analízise sejtfestés koncentráció indikátor alkalmazásával
A fent ismertetett 1. példa szerinti tisztított keratán-szulfát-diszacharid (III) PBS oldatából 1 mg/kg, 5 mg/kg vagy 25 mg/kg tömegű dózist (a továbbiakban 1 mg/kgmal kezelt csoportnak, 5 mg/kg-mal kezelt csoportnak és 25 mg/kg-mal kezelt csoportnak nevezzük) és kontrollként PBSt (a továbbiakban általában kontrollcsoportnak nevezzük) intramuszkulárisan injektálunk be MRL-lpr/lpr egerek combcsonti területére hetente hétszer 4 hétig. Ezután az egereket felboncoljuk, mezentériás és állkapocs alatti nyirokcsomóikból metszetet készítünk (HE festés). A mintákban az egységnyi területre eső festékkoncentrációt képanalizátorral határozzuk meg (PIAS) . A nem differenciálódó sejteknél az egységnyi területre jutó festékkoncentráció alacsony, mivel a citoplazma aránya magas, és a sejtmagok gyengén festődnek. A differenciálódott sejtekben az egységnyi területre jutó festék koncentráció magas, mivel az erősen festődő sejtmagok aránya magas.
A mezentériák és állkapocs alatti nyirokmirigyek analízisének eredménye a 17. és a 18. ábrán látható a standard hibákkal együtt. Az ábrákon a ** jelzi a p<0,01 értékkel szignifikáns eltérést (ahol p jelentése a Bonferroni többszörös összehasonlító teszttel meghatározott szignifikancia szint). Mindegyik csoport hat egeret tartalmaz.
Az eredmények azt mutatják, hogy a keratán-szulfát-diszacharid (III)-mai kezelt csoportoknál bármilyen dózisban megfigyelhető az egységnyi területre jutó festék koncentráció növekedése (a relatív világosság csökkenése), és különösen az 5 mg/kg-mal kezelt csoportnál és a 25 mg/kg-mal kezelt csoportnál növekedett szignifikánsan a festési koncentráció a kontrollcsoporthoz képest. Ez azt mutatja, hogy a keratánszulf át-diszacharid (III) növeli a sejtdifferenciálódást, azaz a keratán-szulfát-diszacharid (III) sejtdifferenciálódást kiváltó hatású.
(2-2) A sejtdifferenciálódás kiváltásának analízise indikátorként nyirokcsomó limfocita felületi antigén alkalmazásával
A fenti 1. példa szerint előállított és tisztított keratán-szulfát-diszacharid (III) PBS oldatát 2,5 mg/kg, 5 mg/kg vagy 10 mg/kg tömegű dózisban (a továbbiakban
2,5 mg/kg-mal kezelt csoportnak, 5 mg/kg-mal kezelt csoportnak és 10 mg/kg-mal kezelt csoportnak nevezzük) és kontrollként PBS-t (a továbbiakban általában kontrollcsoportnak nevezzük) intramuszkulárisan injektálunk be MRL-lpr/lpr egerek combcsonti területére egy héten hétszer héten keresztül. Ezután az egereket felboncoljuk, és a nyirokcsomókat egy sejtszűrőn ledaráljuk (Falcon 2350) a limfociták előállítására. Minden csoport limfocitáit kétszeres immunfestésnek vetjük alá rendre anti-CD3 antitesttel (Seikagaku Corporation) és anti-CD4 antitesttel (Pharminjen), anti-CD3 antitesttel és anti-CD8a antitesttel (Pharminjen), továbbá anti-CD3 antitesttel és anti-B220 antitesttel (Pharminjen) . A CD3, CD4 és CD8a sejt felületi antigének a T-sejteken expresszálódnak, és a B220 a B sejteken expreszszálódik. Ismert, hogy a null limfocitákon a sejtfelületi antigének expressziója nem figyelhető meg.
A CD3 és CD4 pozitív sejteknek, (melyeket a továbbiakban néha CD3+CD4+ sejteknek, többnyire segítő T-sejteknek nevezünk), a teljes limfocitákra vonatkoztatott aránya (%) és a standard hibák a 19. ábrán láthatók. A CD3 és CD8a pozitív sejtek, (melyeket a továbbiakban néha CD3+CD8a+ sejteknek, főleg elnyomó T-sejtnek és citotoxikus T-sejtnek nevezzük), aránya és a standard hibák a 20. ábrán láthatók. A CD3 és B220 pozitív sejtekre (a továbbiakban néha CD3+B220+ sejteknek, B sejt felületi antigénekkel rendelkező abnormális T-sejteknek nevezzük) vonatkozó arány és standard hibák a 21. ábrán láthatók. Az ábrákon *-gal jelöljük a p<0,05 értékkel való szignifikáns eltérést (ahol p jelentése Ryan többszörös összehasonlító teszttel meghatározott szignifikancia szint). Mindegyik csoport hét egeret tartalmaz.
A 19. ábrából látható, hogy a 10 mg/kg keratán-szulfátdiszacharid (III)-mai kezelt csoportban a CD3+CD4+ sejtek • · φ · · · . : :··.
* ······ · ·· szignifikánsan megnovekednek a kontrollcsoporthoz, a
2,5 mg/kg-mal kezelt csoporthoz és az 5 mg/kg-mal kezelt csoporthoz képest. Ez azt jelzi, hogy megfelelő mennyiségű keratán-szulfát-diszacharid (III) beadásával a null limfociták CD3+CD4+ sejtekké differenciálódnak.
A· 20. ábrán látható, hogy a 10 mg/kg keratán-szulfát-diszacharid (III)-mai kezelt csoportban a CD3+CD8a+ sejtek növekednek a kontrollcsoporthoz, a 2,5 mg/kg-mal kezelt csoporthoz és az 5 mg/kg-mal kezelt csoporthoz képest. Ez azt jelzi, hogy a megfelelő mennyiségű keratán-szulfát-diszacharid (III)-mai való kezelés hatására a null limfociták
CD3+CD8a+ sejtekké differenciálódnak.
A 21. ábrán látható, hogy a 10 mg/kg keratán-szulfát-diszacharid '(III)-mai kezelt csoportban a CD3+B220+ sejtek csökkentek a kontrollcsoporthoz, a 2,5 mg/kg-mal kezelt csoporthoz és az 5 mg/kg-mal kezelt csoporthoz képest. Ez azt jelzi, hogy megfelelő mennyiségű keratán-szulfát-diszacharid (III) beadásával a CD3+B220+ sejtek — melyek abnormálisak — csökkennek és ezáltal elősegítik a normális limfocitává való differenciálódást.
Az eredmények azt mutatják, hogy a keratán-szulfát-diszacharid (III) sejtdifferenciálódást kiváltó hatású.
(3) Apoptózist kiváltó hatás
A fent ismertetett 1. példa szerint előállított és tisztított keratán-szulfát-diszacharid (III) PBS oldatából 1 mg/kg, 5 mg/kg vagy 25 mg/kg tömegű dózist (a továbbiakban 1 mg/kg-mal, 5 mg/kg-mal és 25 mg/kg-mal kezelt csoportnak ο
nevezzük) és kontrollként PBS-t (a továbbiakban általában kontrollcsoportnak nevezzük) intramuszkulárisan injektálunk be MRL-lpr/lpr egerek combcsonti területére hetente hétszer 4 hétig. Ezután az egereket felboncoljuk, és az állkapocs alatti nyirokcsomókból metszeteket készítünk, melyeket Gavrieli és munkatársai által ismertetett eljárással megfestünk [J. Cell Bioi., 119, 439-501 (1992)]. Ennél a festési eljárásnál az apoptózist kiváltó sejteket a fragmentáit DNS láncvégek detektálásával lehet kimutatni. Az így elkészített mintákat fénymikroszkóppal vizsgáljuk az egységnyi területre jutó megfestett sejtek (az apoptózist kiváltó sejtek; a továbbiakban ezeket általában apoptózisos sejteknek nevezzük) számának meghatározására. Az eredményeket és a standard hibákat a 22. ábrán mutatjuk be. Az ábrán a *-gal és a **-gal jelöljük a p<0,05 és p<0,01 értéktől való szignifikáns eltérést (ahol p jelentése Bonferroni többszörös összehasonlító teszttel meghatározott szignifikancia szint). Mindegyik csoport hat egérből áll.
A fentiek alapján megállapíthatjuk, hogy a keratánszulfát-diszacharid (III)-mai bármilyen koncentrációban kezelt csoportoknál az apoptózis sejtek száma növekszik, különösen 5 mg/kg-mal kezelt csoportnál növekedett meg jelentősen az apoptózis sejtek száma a kontrollcsoporthoz képest.
Mindegyik csoportba tartozó egerek állkapocs alatti nyirokcsomó metszetéből (HE festés) készített mintákon fénymikroszkóppal' megfigyelhető az apoptikus tesztek jelenléte. Az eredmények azt mutatják, hogy keratán-szulfát-diszacharid (III)-mai bármilyen dózisban kezelt csoportnál szétoszlanak az apoptikus testek.
Ebből az következik, hogy a keratán-szulfát-diszacharid (III) apoptózist kiváltó hatású.
A fenti eredmények megerősítik a keratán-szulfát-oligoszacharid immunmoduláló, sejtdifferenciálódást kiváltó és apoptózist kiváltó hatását.
3. példa - Kenőcs
Kenőcs előállítása céljából követve az 1. példa szerint előállított és tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-et szokásos eljárással 10 mg/ml koncentrációban japán Pharmacopoeia hidrofil kenőcsben eloszlatjuk. Ez a kenőcs gyulladásgátló és allergiaellenes anyagként alkalmazható.
4. példa - Szemcsepp
Szemcsepp előállítása céljából a szokásos eljárással az
1. példa szerint előállított tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-et és nátrium-hialuronátot foszfáttal 6,8 és 7,6 közé beállított pH-jú sóoldatban 10 mg/kg vagy 2 mg/kg koncentrációban eloszlatjuk. Az így előállított szemcsepp gyulladásgátló és allergiaellenes szerként használható.
5. példa - Liposzóma zárvány
Az 1. példa szerint előállított tisztított keratánszulfát-tetraszacharid (I)-et 10 mg/ml koncentrációban lecitint tartalmazó liposzóma zárványban eloszlatjuk (Aquasome LA; Nikko Chemicals), és ultrahanggal kezeljük clathration céljából. Az így kapott liposzóma zárvány gyulladásgátló, allergiaellenes, immunmoduláló hatású sejtdifferenciálódást kiváltó hatású és apoptózist kiváltó anyagként alkalmazható.
6. példa - Injekció
A szokásos eljárást követve az 1. példa szerint előállított tisztított keratán-szulfát-tetraszacharid (I)-et 10 mg/ml koncentrációban foszfáttal 6,8 és 7,6 közé beállított pH-jú sóoldatban oldjuk, és az oldatot sterilen szűrjük 0,22 pm-es szűrőn injekció előállítása céljából. Az injekció gyulladásgátló hatású, antiallergiás hatású, immunmodulátor hatású, sejtdifferenciálódást kiváltó hatású és apoptózist kiváltó hatású anyagként alkalmazható.
Ipari alkalmazhatóság
A találmány szerinti tisztított többszörösen szulfátéit keratán-szulfát-oligoszacharid frakció különösen nagy tisztaságú és nem tartalmaz endotoxint, nukleinsavat, fehérjét, proteázt és más glükóz-amino-glükánt, kivéve a fent leírt oligoszacharidot, ezért gyulladásgátló hatása alapján új gyógyszerként jól alkalmazható.

Claims (4)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Gyulladásgátló hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza.
    2. Gyulladásgátló hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza, mimellett a keratán-szulfát-oligoszacharid N-acetil-laktóz-amin-része adott esetben sialsavat és/vagy fucose-t tartalmaz.
    3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti gyulladásgátló hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfátoligoszacharid oligoszacharid része kettő-öt cukoregységet tartalmaz, redukáló végén szulfátéit N-acetil-glukóz-aminrészt tartalmaz és a keratán-szulfát-oligoszacharid molekulában legalább két hidroxilcsoport szulfátéivá van.
    4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti gyulladásgátló hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratánszulfát-oligoszacharid legalább
    Gál(6S)-GlcNAc (6S) képletű diszacharid szerkezeti részletet tartalmaz, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Ac jelentése acetilcsoport és 6S jelentése 6-O-szulfátészter-csoport.
    5. A 4. igénypont szerinti gyulladásgátló hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid
    Gál (6S) pl-4GlcNAc(6S)pl-3Gal(6S)pi-4GlcNAc(6S) (I) képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid, vagy
    NeuAc~Gaipi-4GlcNAc (6S) pl-3Gal (6S) pl-4GlcNAc (6S) (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid, vagy
    Gál(6S)pl-4GlcNAc(6S) (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Neu jelentése neuraminsav, Ac jelentése acetilcsoport, 6S jelentése 6-0-szulfát-észter-csoport, és ~ jelentése a2,3-kötés vagy a2,6-kötés.
    6. Allergiaellenes hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza.
    7. Allergiaellenes hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza, mimellett a keratán-szulfát-oligoszacharid szulfátéit N-acetil-laktóz-amin-része adott esetben sialsavat és/vagy fucose-t tartalmaz .
    8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti allergiaellenes hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid oligoszacharid része kettő-öt cukoregységet tartalmaz, redukáló végén szulfátéit N-acetil-glukóz-aminrészt tartalmaz és a keratán-szulfát-oligoszacharid molekulában legalább két hidroxilcsoport szulfátéivá van.
    • · · · · · • · • · · · · • ·
    9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti allergiaellenes hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid legalább
    Gál(6S)-GlcNAc(6S) képletű diszacharid szerkezeti részletet tartalmaz, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Ac jelentése acetilcsoport és 6S jelentése 6-O-szulfát-észter-csoport.
    10. A 9. igénypont szerinti allergiaellenes hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid
    Gál(6S)Pl-4GlcNAc(6S)pi-3Gal(6S)pl-4GlcNAc(6S) (I) képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid, vagy
    NeuAc~Galpl-4GlcNAc(6S)pl-3Gal(6S)pi-4GlcNAc(6S) (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid, vagy
    Gál(6S)pl-4GlcNAc (6S) (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Neu jelentése neuraminsav, Ac jelentése acetilcsoport, 6S jelentése 6-O-szulfát-észter-csoport, és ~ jelentése oc2,3-kötés vagy a2,6-kötés.
    11. Immunmoduláló hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza.
    • ··· · ···· ·· · • * · · · · · • · ··· ·· ··· • · · · · · · · • · ······ * ··
    12. Immunmoduláló hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza, mimellett a keratán-szulfát-oligoszacharid N-acetil-laktóz-amin-része adott esetben sialsavat és/vagy fucose-t tartalmaz.
    13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti immunmoduláló hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfátoligoszacharid oligoszacharid része kettő-öt cukoregységet tartalmaz, redukáló végén szulfátéit N-acetil-glukóz-aminrészt tartalmaz, és a keratán-szulfát-oligoszacharid molekulában legalább két hidroxilcsoport szulfátéivá van.
    14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti immunmoduláló hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid legalább
    Gál(6S)-GlcNAc(6S) képletű diszacharid szerkezeti részletet tartalmaz, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Ac jelentése acetilcsoport és 6S jelentése 6-0-szulfátészter-csoport.
    15. A 14. igénypont szerinti immunmoduláló hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid
    Gál(6S)Pl-4GlcNAc(6S)Pl-3Gal(6S)pl-4GlcNAc(6S) (I) képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid, vagy
    NeuAc~Galpl-4GlcNAc(6S)pl-3Gal(6S)pl-4GlcNAc(6S) (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid, vagy
    Gál(6S)pl-4GlcNAc(6S) (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Neu jelentése neuraminsav, Ac jelentése acetilcsoport, 6S jelentése 6-O-szulfát-észter-csoport, és ~ jelentése a2,3-kötés vagy a2,6-kötés.
    16. Sejtdifferenciálódást kiváltó hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza .
    17. Sejtdifferenciálódást kiváltó hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza, mimellett a keratán-szulfát-oligoszacharid szulfátéit N-acetil-laktóz-amin-része adott esetben sialsavat és/vagy fucose-t tartalmaz.
    18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti sejtdifferenciálódást kiváltó hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid oligoszacharid része kettő-öt cukoregységet tartalmaz, redukáló végén szulfátéit N-acetil-glukóz-amin-részt tartalmaz és a keratán-szulfát-oligoszacharid molekulában legalább két hidroxilcsoport szulfátéivá van.
    19. A 16. vagy 18. igénypont szerinti sejtdifferenciálódást kiváltó hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid legalább
    Gál(6S)-GlcNAc(6S) képletű diszacharid szerkezeti részletet tartalmaz, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Ac jelentése acetilcsoport és 6S jelentése 6-O-szulfátészter-csoport.
    20. A 19. igénypont szerinti sejtdifferenciálódást kiváltó hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid
    Gál(6S)Pl-4GlcNAc(6S)pl-3Gal(6S)pl-4GlcNAc(6S) (I) képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid, vagy
    NeuAc~Gaipi-4GlcNAc (6S) Pl-3Gal ( 6S) pl-4GlcNAc ( 6S) (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid, vagy
    Gál(6S)3l-4GlcNAc(6S) (III) (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Neu jelentése neuraminsav, Ac jelentése acetilcsoport, 6S jelentése 6-O-szulfát-észter-csoport, és ~ jelentése a2,3-kötés vagy a2,6-kötés.
    21. Apoptozist kiváltó hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza.
    • · · · · · ’ • · ··· · · ··· ·· · · · · · · ·· ······ · ··
    22. Apoptozist kiváltó hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként keratán-szulfát-oligoszacharidot és/vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza, mimellett a keratán-szulfát-oligoszacharid N-acetil-laktóz-amin-része adott esetben sialsavat és/vagy fucose-t tartalmaz .
    23. A 21. vagy 22. igénypont szerinti apoptózist kiváltó hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid oligoszacharid része kettő-öt cukoregységet tartalmaz, redukáló végén szulfatált N-acetil-glukóz-amin-részt tartalmaz és a keratán-szulfát-oligoszacharid molekulában legalább két hidroxilcsoport szulfátéivá van.
    24. A 21. vagy 23. igénypont szerinti apoptózist kiváltó hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid legalább
    Gál(6S)-GlcNAc(6S) képletű diszacharid szerkezeti részletet tartalmaz, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Ac jelentése acetilcsoport és 6S jelentése 6-0-szulfát-észter-csoport.
    25. A 24. igénypont szerinti apoptozist kiváltó hatású készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid
    Gál(6S)3l-4GlcNAc (6S)βΙ-SGal(6S)pl-4GlcNAc(6S) (I) képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid, vagy
    NeuAc~Gaipi-4GlcNAc(6S)Pl-3Gal(6S)pl-4GlcNAc(6S) (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid, vagy
    Gál(6S)pl-4GlcNAc(6S) (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Neu jelentése neuraminsav, Ac jelentése acetilcsoport, 6S jelentése 6-O-szulfát-észter-csoport, és ~ jelentése cc2,3-kötés vagy a2,6-kötés.
    26. Legalább 99 % keratán-szulfát-oligoszacharidot tartalmazó keratán-szulfát-oligoszacharid frakció, azzal jellemezve, hogy az oligoszacharid-rész kettő-öt cukoregységet tartalmaz, redukáló végén szulfátéit N-acetil-glukóz-aminrészt tartalmaz és a keratán-szulfát-oligoszacharid molekulában legalább két hidroxilcsoport szulfátéivá van, és
    a) a frakció lényegében nem tartalmaz endotoxint, és a frakció nukleinsav-, fehérje- és proteáz-tartalma a kimutathatósági határ alatt van és
    b) a frakció lényegében nem tartalmaz hialuronsavat, chondroitin-szulfátot, dermatán-szulfátot, heparán-szulfátot és keratán-szulfátot.
    27. Keratán-szulfát-oligoszacharid frakció, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfát-oligoszacharid legalább
    Gál(6S)-GlcNAc(6S) képletű diszacharid szerkezeti részletet tartalmaz, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Ac jelentése acetilcsoport és 6S jelentése 6-O-szulfátészter-csoport, és
    a) a frakció lényegében nem tartalmaz endotoxint és a frakció nukleinsav-, fehérje- és proteáz-tartalma a kimutathatósági határ alatt van és
    b) a frakció lényegében nem tartalmaz hialuronsavat, chondroitin-szulfátot, dermatán-szulfátot, heparán-szulfátot és keratán-szulfátot.
    28. A 26. vagy 27. igénypont szerinti keratán-szulfát-oligoszacharid frakció, azzal jellemezve, hogy a keratánszulfát-oligoszacharid
    Gál(6S)3l-4GlcNAc(6S)pl-3Gal ( 6S)3l-4GlcNAc(6S) (I) képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid, vagy
    NeuAc~Gal3l-4GicNAc (6S)3l-3Gal ( 6S)3l-4GlcNAc(6S) (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid, vagy
    Gál(6S)pi-4GlcNAc(6S) (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid, ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glükóz-amin, Neu jelentése neuraminsav, Ac jelentése acetilcsoport, 6S jelentése 6-O-szulfát-észter-csoport, és ~ jelentése a2,3-kötés vagy a2,6-kötés.
    29. A 26-28. igénypontok bármelyike szerinti keratánszulfát-oligoszacharid frakció, azzal jellemezve, hogy úgy állítjuk elő, hogy porcos halakból származó többszörösen szulfátéit keratán-szulfátot endo-p-N-acetil-glükóz-aminidáz típusú keratán-szulfát-hidrolázzal hidrolizáltatunk, és a hidrolizátumot frakciónáljuk.
    • · · · · ······ · ··
    30. Eljárás keratán-szulfát-oligoszacharid frakció előállítására, azzal jellemezve, hogy a keratán-szulfátot a következő tulajdonságú keratán-szulfát-hidrolázzal hidrolizáltatjuk:
    1) hatás:
    • a hidroláz a keratán-szulfátra hat, és hidrolizálja annak N-acetil-glükóz-aminid kötését; és
  2. 2) szubsztrát specificitás:
    a hidroláz a keratán-szulfát (I)-re, a keratánszulfát (II)-re és a keratán-poliszulfátra hat, és fő hidrolizátumként szulfátéit keratán-szulfát-diszacharid és szulfátéit keratán-szulfát-tetraszacharid keletkezik; és a hidrolizátum frakcionálásával keletkező keratán-szulfát-oligoszacharid frakció
    A) fő hatóanyagként bázisos szerkezetű szulfátéit N-acetil-laktóz-amint tartalmazó keratán-szulfát-oligoszacharidot tartalmaz;
    B) lényegében nem tartalmaz endotoxint, és a frakció nukleinsav-, fehérje- és proteáz-tartalma nyomnyi vagy a kimutathatósági határ alatt marad; és
    C) a' frakció lényegében nem tartalmaz hialuronsavat, chondroitin-szulfátot, dermatán-szulfátot, heparán-szulfátot és keratán-szulfátot.
    31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrolizálási lépésben keratán-szulfát-hidrolázként olyan enzimet használunk, amelynek további fizikai és kémiai tulajdonságai a következők:
    «· ·»· ♦ ·»
    1) optimális reakció pH:
    a hidroláz optimális reakció pH-ja 0,1 mól acetát pufferben és 10 mmól trisz-acetát pufferben 37 °C-on 4,5 és 6 közötti érték;
    2) pH-stabilitás:
    a hidroláz pH stabilitása 1 órán át 37 °C-on 0,1 mól acetátpufferben és 10 mmól triacetát-pufferben tartva 6 és 7 közötti érték;
  3. 3) optimális reakcióhőmérséklet:
    a hidroláz optimális reakcióhőmérséklete a 0,1 mól acetát pufferben pH 6, 0 értéken 10 percig végzett reakcióban 50 és 60 °C közötti tartományba esik; és
  4. 4) hőstabilitás:
    1 órán át 0,1 mól acetát pufferben pH 6,0 értéken tartva a hidroláz 45 °C-on vagy ez alatt stabil.
    32. A 30. vagy 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy keratán-szulfátként nagy szulfáttartalmú keratán-szulfátot, illetve keratán-szulfát-oligoszacharidként olyan oligoszacharidot használunk, amely
    Gál(6S)pl-4GlcNAc(6S)pl-3Gal(6S)3l-4GlcNAc(6S) (I) képletű tetraszulfatált N-acetil-laktóz-amin-tetraszacharid, vagy
    NeuAc~Gal3l-4GlcNAc(6S)pl-3Gal(6S)3l-4GlcNAc(6S) (II) képletű triszulfatált N-acetil-laktóz-amin-pentaszacharid, vagy
    Gál(6S)pl-4GlcNAc(6S) (III) képletű diszulfatált N-acetil-laktóz-amin-diszacharid, ···· ‘Τ' ·»· *♦ • · ahol a képletben Gál jelentése galaktóz, GlcN jelentése glü kóz-amin, Neu jelentése neuraminsav, Ac jelentése acetil csoport, 6S jelentése 6-O-szulfát-észter-csoport, és ~ jelen tése oc2,3-kötés vagy cc2,6-kötés.
HU9701820A 1994-12-01 1995-11-22 Keratán-szulfát-oligoszacharid frakciók és ilyet tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás a fenti oligoszaharidok előállítására HUT77134A (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP29829894 1994-12-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT77134A true HUT77134A (hu) 1998-03-02

Family

ID=17857841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9701820A HUT77134A (hu) 1994-12-01 1995-11-22 Keratán-szulfát-oligoszacharid frakciók és ilyet tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás a fenti oligoszaharidok előállítására

Country Status (10)

Country Link
US (2) US5939403A (hu)
EP (1) EP0795560B1 (hu)
JP (3) JP4429386B2 (hu)
CN (1) CN1174557A (hu)
AT (1) ATE256137T1 (hu)
AU (1) AU704429B2 (hu)
CA (1) CA2206611A1 (hu)
DE (1) DE69532293T2 (hu)
HU (1) HUT77134A (hu)
WO (1) WO1996016973A1 (hu)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5888984A (en) * 1994-05-12 1999-03-30 Dermal Research Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition of complex carbohydrates and essential oils and methods of using the same
JP4023848B2 (ja) * 1996-03-29 2007-12-19 生化学工業株式会社 硫酸化ラクトサミンオリゴ糖の製造方法
DE69722799T2 (de) * 1996-07-10 2004-05-06 Takara Bio Inc., Otsu Zellzusammenstellungen
CA2261877C (en) 1996-07-23 2009-04-07 Seikagaku Corporation Novel lactosamine oligosaccharide and method for producing the same
AU1214999A (en) * 1998-01-22 1999-08-12 Seikagaku Corporation Antifibrotic agent
US20050148541A1 (en) * 1998-01-29 2005-07-07 Yash Sharma Treatment and prevention of HIV and other viral infections
FR2774289B1 (fr) * 1998-02-03 2002-05-24 Goemar Lab Sa Medicament pour le traitement des dereglements de l'apoptose
JP4913272B2 (ja) * 1999-01-07 2012-04-11 生化学工業株式会社 オリゴ糖の製造方法ならびに新規オリゴ糖およびそれを含む医薬組成物
AU6557299A (en) 1999-01-07 2000-07-13 Seikagaku Corporation Method for producing oligosaccharide, and novel oligosaccharide and pharaceutical composition containing the same
ATE451382T1 (de) * 1999-01-20 2009-12-15 Takara Bio Inc 4-substituierte-3,6-anhydro-galaktosederivate und ihre pharmazeutische verwendung
EP1165097B1 (en) * 1999-02-01 2007-05-02 Dermal Research Laboratories, Inc. A pharmaceutical composition of complex carbohydrates and their use
FR2789587B1 (fr) * 1999-02-11 2003-01-24 Inst Nat Sante Rech Med Moyens pour la regulation de la differenciation hematopoietique
EP1074260B1 (en) * 1999-07-21 2004-02-18 Seikagaku Corporation IL-12 Production inhibitor
JP4676049B2 (ja) * 1999-07-21 2011-04-27 生化学工業株式会社 Ｉｌ−１２産生抑制剤
FR2808687B1 (fr) * 2000-04-27 2003-12-05 Goemar Lab Sa Medicament contenant des substances polysaccharidiques pour l'activation de l'apoptose
JP4676048B2 (ja) * 2000-07-10 2011-04-27 生化学工業株式会社 脱髄性疾患処置剤
US7879824B2 (en) 2001-07-31 2011-02-01 Dermal Research Laboratories, Inc. Methods of preventing or treating diseases and conditions using complex carbohydrates
JPWO2002103025A1 (ja) * 2001-06-14 2005-04-07 独立行政法人産業技術総合研究所 新規な硫酸化糖及びその製造方法
CA2459040A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-27 Mimeon, Inc. Methods of making glycolmolecules with enhanced activities and uses thereof
DE10214507A1 (de) * 2002-04-02 2003-10-16 Beiersdorf Ag Verwendung von Acarbose und deren Derivaten zur Behandlung und Prophylaxe degenerativer Hautzustände
JP4530633B2 (ja) * 2003-09-19 2010-08-25 生化学工業株式会社 シグナル伝達物質産生抑制剤
US20070099867A1 (en) * 2005-05-24 2007-05-03 Glycoscience Laboratories, Inc. Pharmaceutical agent containing hyaluronan as an active ingredient
JP2009091248A (ja) * 2006-01-17 2009-04-30 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬
EP1994934A4 (en) 2006-12-05 2010-03-10 Glycoscience Lab Inc THERAPEUTIC AGENT AGAINST DEGENERATIVE ARTHRITIS
US20110059508A1 (en) * 2007-06-29 2011-03-10 National University Corporation Nagoya University Improving agent for dysfunction due to neuropathy and rho kinase activation inhibitor
FR2920310B1 (fr) * 2007-09-03 2012-10-19 Natura Cosmeticos Sa Procede pour la preparation d'un extrait vegetal de passiflora alata et utilisation dudit extrait dans des compositions cosmetiques et pharmaceutiques
WO2011105424A1 (ja) * 2010-02-23 2011-09-01 国立大学法人東京大学 樹状細胞免疫受容体刺激剤
ES2602108T3 (es) 2010-04-07 2017-02-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Método para cuantificar glicoformas que contienen alta manosa
WO2012125553A2 (en) 2011-03-12 2012-09-20 Momenta Pharmaceuticals, Inc. N-acetylhexosamine-containing n-glycans in glycoprotein products
WO2013181575A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to denosumab
CN103006560B (zh) * 2012-12-12 2014-10-15 上海市第六人民医院 透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体及其制备方法
US10450361B2 (en) 2013-03-15 2019-10-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to CTLA4-Fc fusion proteins
ES2708759T3 (es) 2013-05-13 2019-04-11 Momenta Pharmaceuticals Inc Procedimientos para el tratamiento de la neurodegeneración
WO2015022907A1 (ja) 2013-08-13 2015-02-19 生化学工業株式会社 カチオン化キトサンを含有する医薬
US20160257754A1 (en) 2013-10-16 2016-09-08 Momenta Pharmaceuticals Inc. Sialylated glycoproteins
US10221252B2 (en) 2014-03-21 2019-03-05 Altergon S.A. Chondroitin sulphate purification method
WO2016006700A1 (ja) 2014-07-11 2016-01-14 学校法人東京理科大学 樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法
US11324809B2 (en) 2017-05-12 2022-05-10 Tokyo University Of Science Foundation Method of preventing aggravation of a disease involving a biological mechanism controlled by a dendritic cell immunoreceptor

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU561067B2 (en) * 1982-03-22 1987-04-30 Biocarb Ab Anti-bacterial composition containing an oligosaccharide
EP0240098A3 (en) * 1986-04-04 1989-05-10 Kabushiki Kaisha Ueno Seiyaku Oyo Kenkyujo Oligo and polysaccharides for the treatment of diseases caused by retroviruses
IT1213384B (it) * 1986-11-24 1989-12-20 Lab Derivati Organici Mediolan Processo per la preparazione controllata di gilcosaminoglicani a basso peso molecolare.
JP2726274B2 (ja) * 1988-08-24 1998-03-11 生化学工業株式会社 新規ケラタン硫酸分解酵素並びにそれを生産する微生物及び方法
JPH0296588A (ja) * 1988-09-29 1990-04-09 Rikagaku Kenkyusho 硫酸化オリゴ糖及びその関連物質
US5510418A (en) * 1988-11-21 1996-04-23 Collagen Corporation Glycosaminoglycan-synthetic polymer conjugates
AU6872691A (en) * 1989-10-27 1991-05-31 Case Western Reserve University Inhibition of cell growth by keratan sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate and other glycans
JP3037987B2 (ja) * 1990-09-28 2000-05-08 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカンの分析方法
WO1993024506A1 (en) * 1992-05-26 1993-12-09 Alberta Research Council IMMUNOSUPPRESSIVE AND TOLEROGENIC MODIFIED LEWISC AND LacNAc COMPOUNDS
MX9304638A (es) * 1992-07-31 1994-05-31 Neose Pharm Inc Composicion para tratar e inhibir las ulceras gastricas y duodenales.
AU4859793A (en) * 1992-09-11 1994-04-12 Regents Of The University Of California, The Sulfated ligands for l-selectins and use of chlorates and or sulfatases for the treatment of inflammation
AU7205894A (en) * 1993-06-08 1995-01-03 Neogenix, Inc. Purified natural and synthetic compounds for the treatment of osteoarthritis
AU1255695A (en) * 1993-11-19 1995-06-06 Regents Of The University Of California, The Sulfated ligands for l-selectin and methods of preventing sulfate addition
GB9422584D0 (en) * 1994-02-15 1995-01-04 Medical Res Council Immunomodulation using oligosaccharides
US5840546A (en) * 1994-11-22 1998-11-24 Seikagaku Corporation Keratin sulfate hydrolase obtainable by using Bacillus circulans and method for producing same

Also Published As

Publication number Publication date
DE69532293D1 (de) 2004-01-22
JP2010046070A (ja) 2010-03-04
JP5001989B2 (ja) 2012-08-15
CA2206611A1 (en) 1996-06-06
DE69532293T2 (de) 2004-10-21
AU3935695A (en) 1996-06-19
CN1174557A (zh) 1998-02-25
JP4429386B2 (ja) 2010-03-10
US5939403A (en) 1999-08-17
EP0795560A4 (en) 1998-09-02
JP2009019044A (ja) 2009-01-29
ATE256137T1 (de) 2003-12-15
EP0795560B1 (en) 2003-12-10
WO1996016973A1 (fr) 1996-06-06
US6159954A (en) 2000-12-12
AU704429B2 (en) 1999-04-22
EP0795560A1 (en) 1997-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT77134A (hu) Keratán-szulfát-oligoszacharid frakciók és ilyet tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás a fenti oligoszaharidok előállítására
US5925349A (en) Treating inflammation via the administration of specific sulfatase enzymes and/or sulfation inhibitor
AU623965B2 (en) Adhesion of mycoplasma pneumoniae and mycoplasma hominus to sulfatide
US5489578A (en) Sulfated ligands for l-selectin and methods of treating inflammation
Ward et al. Biology of Giardia lamblia. Detection of N-acetyl-D-glucosamine as the only surface saccharide moiety and identification of two distinct subsets of trophozoites by lectin binding.
JP4043533B2 (ja) 低分子量リポポリサッカライド
John et al. Neisseria gonorrhoeaeThat Infect Men Have Lipooligosaccharides with Terminal N-Acetyllactosamine Repeats
Weiss et al. The use of a phospholipase A-less Escherichia coli mutant to establish the action of granulocyte phospholipase A on bacterial phospholipids during killing by a highly purified granulocyte fraction
Nader et al. Selective distribution of the heparin in mammals conspicuous presence of heparin in lymphoid tissues
Schweda et al. Structural studies of lipooligosaccharides from Haemophilus ducreyi ITM 5535, ITM 3147, and a fresh clinical isolate, ACY1: evidence for intrastrain heterogeneity with the production of mutually exclusive sialylated or elongated glycoforms
WO1990003791A1 (en) Methods for interfering with hiv multiplication and composition for the treatment of aids
HUT70945A (en) Compositions for the regulation of cytokine activity contg. oligosaccharides and process to prepare them
JP2747293B2 (ja) 細菌感染に対する非特異的防御を刺激するための薬剤
JPS61257930A (ja) 感染防御剤
DE69531044T2 (de) Behandlung von entzündung durch die gabe von spezifischen sulfatase-enzymen und/oder inhibitoren der sulfatierung
JPH07502011A (ja) 免疫抑制性および寛容原性のオリゴ糖誘導体
Clausen et al. Chemical and enzymic studies of a family with skeletal abnormalities associated with mental retardation
Berra et al. Presence of glycoproteins containing the polylactosamine structure in brain and liver of G M1 gangliosidosis patients: Comparative study between clinical types I and II, using endo-β-galactosidase enzyme
RU2173154C2 (ru) Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат
DE69328097T2 (de) Akzeptor für fucosyltransferase
Percheron et al. Mammalian β-d-mannosidase and β-mannosidosis
JPH09227386A (ja) ストレス蛋白質発現増強剤
US20210401863A1 (en) Treatment and prevention of neisseria gonorrhoeae infection using cmp-activated nonulosonate analog compounds
Anastassiou et al. Nonfatal bacteremia caused by a mucoid, alginate-producing strain of Pseudomonas aeruginosa
Nichols et al. IMPORTANCE OF HUMAN RED CELL SURFACE STRUCTURES IN REACTIONS BETWEEN MAN AND MICROBES

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal