RU2173154C2 - Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат - Google Patents
Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препаратInfo
- Publication number
- RU2173154C2 RU2173154C2 RU97111163A RU97111163A RU2173154C2 RU 2173154 C2 RU2173154 C2 RU 2173154C2 RU 97111163 A RU97111163 A RU 97111163A RU 97111163 A RU97111163 A RU 97111163A RU 2173154 C2 RU2173154 C2 RU 2173154C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- keratan sulfate
- 4glcnac
- gal
- keratan
- sulfate
- Prior art date
Links
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 title claims abstract description 334
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N Keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 title claims abstract description 215
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 101
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 title claims abstract description 101
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title abstract description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 40
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 26
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 25
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 claims abstract description 23
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N D-(+)-Galactose Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 17
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 claims abstract description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 230000003266 anti-allergic Effects 0.000 claims abstract description 9
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N Fucose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract 2
- -1 sulfated keratan sulfate disaccharide Chemical class 0.000 claims description 162
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 65
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 65
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 47
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 32
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-Acetylglucosamine Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims description 25
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 19
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 229960002442 Glucosamine Drugs 0.000 claims description 16
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N α-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 13
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 12
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical group N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 claims description 9
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 229940060155 Neuac Drugs 0.000 claims description 9
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001640 apoptogenic Effects 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N Chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 claims description 5
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 claims description 5
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 claims description 5
- 108091005503 Nucleic proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 claims description 5
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 5
- MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M sodium;(2S,3S,4R,5R,6R)-3-[(2S,3R,5S,6R)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C([O-])=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M 0.000 claims description 5
- WKPUACLQLIIVJJ-RHKLHVFKSA-M (2S,3R,4R,5S,6R)-4-hydroxy-3-methoxy-6-[(2S,3R,4S,5S,6R)-6-methoxy-4-oxido-5-(sulfooxyamino)-2-(sulfooxymethyl)oxan-3-yl]oxy-5-sulfooxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [O-][C@H]1[C@H](NOS(O)(=O)=O)[C@H](OC)O[C@@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C([O-])=O)O1 WKPUACLQLIIVJJ-RHKLHVFKSA-M 0.000 claims description 4
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L Dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 claims description 4
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 claims description 4
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims description 4
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 claims description 4
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 4
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 229950006780 N-Acetylglucosamine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 12
- 230000001413 cellular Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 abstract 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 abstract 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 abstract 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 59
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 50
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 39
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 34
- 210000001165 Lymph Nodes Anatomy 0.000 description 27
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 25
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 22
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 21
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 18
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 17
- 206010003246 Arthritis Diseases 0.000 description 16
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 16
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 16
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N Indometacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 14
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 229940055729 Papain Drugs 0.000 description 12
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 12
- 210000001179 Synovial Fluid Anatomy 0.000 description 12
- 229940121363 anti-inflammatory agents Drugs 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 12
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 239000000043 antiallergic agent Substances 0.000 description 10
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 10
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 10
- 229940121354 immunomodulators Drugs 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 8
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 8
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 8
- 208000002151 Pleural Effusion Diseases 0.000 description 8
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 8
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 8
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 8
- 239000002609 media Substances 0.000 description 8
- 231100000716 Acceptable daily intake Toxicity 0.000 description 7
- 208000002205 Allergic Conjunctivitis Diseases 0.000 description 7
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 7
- 206010010744 Conjunctivitis allergic Diseases 0.000 description 7
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N Dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 7
- 229960000905 Indomethacin Drugs 0.000 description 7
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 7
- 208000008423 Pleurisy Diseases 0.000 description 7
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 210000000845 Cartilage Anatomy 0.000 description 6
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 6
- 229960003957 Dexamethasone Drugs 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 206010030124 Oedema peripheral Diseases 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 6
- 101710004063 Blon_2468 Proteins 0.000 description 5
- AKUJBENLRBOFTD-RPRRAYFGSA-N Dexamethasone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)COC(C)=O)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O AKUJBENLRBOFTD-RPRRAYFGSA-N 0.000 description 5
- 101700007082 EBAG Proteins 0.000 description 5
- 101710035898 ENGASE Proteins 0.000 description 5
- 102100011011 ENGASE Human genes 0.000 description 5
- 208000002971 Immunoblastic Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 5
- 210000000440 Neutrophils Anatomy 0.000 description 5
- 229940092253 Ovalbumin Drugs 0.000 description 5
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 5
- 229960003657 dexamethasone acetate Drugs 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 108010015332 keratanase II Proteins 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 4
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 4
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 229940012356 Eye Drops Drugs 0.000 description 4
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 4
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 4
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 125000004429 atoms Chemical group 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 201000009030 carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 102000022270 cytochrome c family Human genes 0.000 description 4
- 108091010617 cytochrome c family Proteins 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 201000010874 syndrome Diseases 0.000 description 4
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon(0) Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- 208000000659 Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 229940113118 Carrageenan Drugs 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 3
- 206010027665 Immune disorder Diseases 0.000 description 3
- 206010021425 Immune system disease Diseases 0.000 description 3
- 206010023644 Lacrimation increased Diseases 0.000 description 3
- 206010024324 Leukaemias Diseases 0.000 description 3
- 210000004287 Lymphocytes, Null Anatomy 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 206010061232 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 3
- 206010025310 Other lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 3
- 206010039073 Rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 102100001435 SH2D1A Human genes 0.000 description 3
- 101710013575 SH2D1A Proteins 0.000 description 3
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 3
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N acetic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 230000002146 bilateral Effects 0.000 description 3
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 201000003066 diffuse scleroderma Diseases 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 230000004317 lacrimation Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 201000001268 lymphoproliferative syndrome Diseases 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 201000009594 systemic scleroderma Diseases 0.000 description 3
- 201000006704 ulcerative colitis Diseases 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- GEDVVYWLPUPJJZ-UHFFFAOYSA-N (7-amino-8-methylphenothiazin-3-ylidene)-dimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].N1=C2C=CC(=[N+](C)C)C=C2SC2=C1C=C(C)C(N)=C2 GEDVVYWLPUPJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 3-Mercaptopropane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003816 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000988 Bone and Bones Anatomy 0.000 description 2
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 2
- 210000004087 Cornea Anatomy 0.000 description 2
- 206010011401 Crohn's disease Diseases 0.000 description 2
- 102100002445 DNTT Human genes 0.000 description 2
- 101710028159 DNTT Proteins 0.000 description 2
- 210000003722 Extracellular Fluid Anatomy 0.000 description 2
- 210000000416 Exudates and Transudates Anatomy 0.000 description 2
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 2
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 2
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 2
- 206010020718 Hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 2
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 2
- 206010028537 Myelofibrosis Diseases 0.000 description 2
- WJFVEEAIYIOATH-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-β-D-glucosamine 6-sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O WJFVEEAIYIOATH-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 2
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 2
- 108010012715 Superoxide Dismutase Proteins 0.000 description 2
- 210000000115 Thoracic Cavity Anatomy 0.000 description 2
- BCUVLMCXSDWQQC-KCDKBNATSA-N [(2R,3S,4S,5R)-2,3,4,5-tetrahydroxy-6-oxohexyl] hydrogen sulfate Chemical compound OS(=O)(=O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O BCUVLMCXSDWQQC-KCDKBNATSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 201000009596 autoimmune hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000593 degrading Effects 0.000 description 2
- 201000004624 dermatitis Diseases 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 2
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 201000004681 psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 230000001235 sensitizing Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000002522 swelling Effects 0.000 description 2
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N β-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 Abdominal Cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- KDXHLJMVLXJXCW-UHFFFAOYSA-J Alcian blue stain Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cu+2].[N-]1C(N=C2C3=CC(CSC(N(C)C)=[N+](C)C)=CC=C3C(N=C3C4=CC=C(CSC(N(C)C)=[N+](C)C)C=C4C(=N4)[N-]3)=N2)=C(C=C(CSC(N(C)C)=[N+](C)C)C=C2)C2=C1N=C1C2=CC(CSC(N(C)C)=[N+](C)C)=CC=C2C4=N1 KDXHLJMVLXJXCW-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 206010057380 Allergic keratitis Diseases 0.000 description 1
- 208000007502 Anemia Diseases 0.000 description 1
- 208000009094 Anemia, Hemolytic, Autoimmune Diseases 0.000 description 1
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000001367 Arteries Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010004661 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 1
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000000594 Bullous Pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 208000008684 Chronic Thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 208000002573 Connective Tissue Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000004921 Cutaneous Lupus Erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940026692 Decadron Drugs 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 229960004833 Dexamethasone phosphate Drugs 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N Diethanolamine Chemical class OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006926 Discoid Lupus Erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 208000005679 Eczema Diseases 0.000 description 1
- 229950010333 Exalamide Drugs 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 229940096919 Glycogen Drugs 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- BYSGBSNPRWKUQH-UJDJLXLFSA-N Glycogen Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O1 BYSGBSNPRWKUQH-UJDJLXLFSA-N 0.000 description 1
- 108020005128 Glycosidases Proteins 0.000 description 1
- 206010018987 Haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 210000002758 Humerus Anatomy 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 1
- 206010021972 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 1
- 208000009883 Joint Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010023332 Keratitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003127 Knee Anatomy 0.000 description 1
- 229940067606 Lecithin Drugs 0.000 description 1
- 208000008930 Low Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000009856 Lung Disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003584 Mesangial Cells Anatomy 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 Myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 208000003786 Myxedema Diseases 0.000 description 1
- 206010028665 Myxoedema Diseases 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N N-glycolylneuraminic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 208000000733 Paroxysmal Hemoglobinuria Diseases 0.000 description 1
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010034695 Pernicious anaemia Diseases 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003531 Phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 208000008425 Protein Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000002098 Purpura, Thrombocytopenic, Idiopathic Diseases 0.000 description 1
- 108050007843 RIDA Proteins 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 101710024753 SERPINB14 Proteins 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 210000001991 Scapula Anatomy 0.000 description 1
- 208000008864 Scrapie Diseases 0.000 description 1
- 229940010747 Sodium Hyaluronate Drugs 0.000 description 1
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 1
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N Sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003283 T-Lymphocytes, Helper-Inducer Anatomy 0.000 description 1
- 210000001138 Tears Anatomy 0.000 description 1
- 210000002435 Tendons Anatomy 0.000 description 1
- 208000002240 Tennis Elbow Diseases 0.000 description 1
- 208000004760 Tenosynovitis Diseases 0.000 description 1
- 206010043781 Thyroiditis chronic Diseases 0.000 description 1
- 208000005057 Thyrotoxicosis Diseases 0.000 description 1
- DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N Toluene diisocyanate Chemical compound CC1=CC=C(N=C=O)C=C1N=C=O DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010046736 Urticarias Diseases 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 231100000215 acute (single dose) toxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000011047 acute toxicity test Methods 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000172 allergic Effects 0.000 description 1
- 201000005794 allergic hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic Effects 0.000 description 1
- 230000001754 anti-pyretic Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 150000003946 cyclohexylamines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed Effects 0.000 description 1
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 1
- 231100000406 dermatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 231100001003 eczema Toxicity 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 201000011275 epicondylitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003885 eye ointment Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- FDTUVFSBEYKVAP-UHFFFAOYSA-N formic acid;pyridine Chemical compound OC=O.C1=CC=NC=C1 FDTUVFSBEYKVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 239000008311 hydrophilic ointment Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 150000004694 iodide salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000010666 keratoconjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 201000003265 lymphadenitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 231100000668 minimum lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 201000011152 pemphigus Diseases 0.000 description 1
- 201000001976 pemphigus vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- QVLTXCYWHPZMCA-UHFFFAOYSA-K phosphoric acid;phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.[O-]P([O-])([O-])=O QVLTXCYWHPZMCA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 201000002728 primary biliary cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000750 progressive Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 201000002661 spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229960001663 sulfanilamide Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Фармацевтический препарат содержит фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и в качестве активного ингредиента - эффективное количество кератансульфатолигосахарида с двумя-пятью сахаридными звеньями, сульфатированными N-ацетилглюкозамином на своем редуцирующем конце, с сульфатированным N-ацетиллактозаминным звеном, необязательно содержащим сиаловую кислоту и/или фукозу, имеющего, по меньшей мере, две сульфатированных гидроксильных группы в молекуле, и/или его фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительно кератансульфатолигосахарид содержит в качестве составного ингредиента, по меньшей мере, дисахарид формулы Gal(6S) - GlcNAc(6S), где Gal представляет галактозу, GlcN представляет глюкозамин, Ас представляет ацетильную группу и 6S представляет 6-О-сульфатный эфир. Фармацевтический препарат обладает противовоспалительным, противоаллергическим, иммуномодулирующим, индуцирующим апоптоз и клеточную дифференцировку действием. Технический результат заключается в реализации указанного назначения. 3 с. и 18 з.п.ф-лы, 11 табл., 22 ил.
Description
Настоящее изобретение относится к противовоспалительному средству, противоаллергическому средству, иммуномодулятору, индуктору клеточной дифференцировки, индуктору апоптоза и кератансульфатолигосахариду, который может использоваться в качестве активного ингредиента в указанных фармацевтических препаратах.
Предпосылки создания изобретения
Кератансульфат представляет собой гликозаминогликан, содержащий N-ацетиллактозамин в качестве основной структуры, у которой в положении C-6N-ацетилглюкозаминового остатка имеется О-сульфатированная гидроксильная группа. В частности, известно, что высокосульфатированный кератансульфат, который кроме положения C-6N-ацетилглюкозаминового остатка содержит сульфатировнную гидроксильную группу в структурном дисахаридном звене, содержится в хрящевых рыбах, таких как акулы, и в хрящах, костях и роговице млекопитающих, таких как киты и жвачные животные. Сообщается о способе получения кератансульфатолигосахарида, являющегося продуктом расщепления кератансульфата, который включает воздействие расщепляющего кератансульфат фермента (кератаназа II); выложенная заявка на патент Японии N 2-57182), полученного из микроорганизмов, относящихся к Bacillus, на кератансульфат.
Кератансульфат представляет собой гликозаминогликан, содержащий N-ацетиллактозамин в качестве основной структуры, у которой в положении C-6N-ацетилглюкозаминового остатка имеется О-сульфатированная гидроксильная группа. В частности, известно, что высокосульфатированный кератансульфат, который кроме положения C-6N-ацетилглюкозаминового остатка содержит сульфатировнную гидроксильную группу в структурном дисахаридном звене, содержится в хрящевых рыбах, таких как акулы, и в хрящах, костях и роговице млекопитающих, таких как киты и жвачные животные. Сообщается о способе получения кератансульфатолигосахарида, являющегося продуктом расщепления кератансульфата, который включает воздействие расщепляющего кератансульфат фермента (кератаназа II); выложенная заявка на патент Японии N 2-57182), полученного из микроорганизмов, относящихся к Bacillus, на кератансульфат.
Кроме того, есть сообщение (Biochemistry, 33, 4836-4846 (1994)), в котором дается анализ 25 видов олигосахаридных фракций, полученных путем фракционирования продуктов расщепления после расщепления кератаназой II кератансульфата, полученного из коровьих хрящей, и предлагается структура тетрасульфатированного N-ацетиллактозаминатетрасахарида, представленного следующей формулой (I) (называемого здесь далее также "кератансульфаттетрасахаридом (I)"), трисульфатированного N-ацетиллактозаминопентасахарида, представленного следующей формулой (II) (называемого здесь далее также "кератансульфатпентасахаридом (II)"), дисульфатированного N-ацетиллактозаминодисахарида, представленного следующей формулой (III) (называемого здесь далее также "кератансульфатдисахаридом (III)"), и т.п.:
Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S) β 1-3 Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S).....(I)
NeuAc~Gal β 1-4 GlcNAc(6S) β 1-3 Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S)...(II)
Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S)... (III)
(В приведенных выше формулах Gal представляет галактозу, GlcN представляет глюкозамин, Neu представляет нейраминовую кислоту, Ac представляет ацетильную группу, и 6S представляет 6-O-сульфатный эфир. "~" представляет связь α 2, 3 или связь α 2, 6).
Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S) β 1-3 Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S).....(I)
NeuAc~Gal β 1-4 GlcNAc(6S) β 1-3 Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S)...(II)
Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S)... (III)
(В приведенных выше формулах Gal представляет галактозу, GlcN представляет глюкозамин, Neu представляет нейраминовую кислоту, Ac представляет ацетильную группу, и 6S представляет 6-O-сульфатный эфир. "~" представляет связь α 2, 3 или связь α 2, 6).
Однако до настоящего времени не было сообщений, относящихся к эффективному массовому получению чистого кератансульфатолигосахарида, в особенности кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III), без загрязнения примесями (например, эндотоксинами, нуклеиновыми кислотами, белками, протеазами, другими гликозаминогликанами, исключая кератансульфатолигосахарид и тому подобное). Загрязнение такими примесями рассматривается как серьезный недостаток, особенно в случае, когда кератансульфатолигосахариды используют в качестве фармацевтических препаратов. Кроме того, о фармакологическом действии кератансульфатолигосахаридов (в частности, противовоспалительном действии, противоаллергическом действии, иммуномодуляторном действии, индуцирующем клеточную дифференцировку действии и индуцирующем апоптоз действии) ничего не известно.
Описание изобретения
На основе вышеуказанного осуществляют настоящее изобретение и его целью является применение кератансульфатолигосахарида, по существу не содержащего примеси, в качестве противовоспалительного средства, противоаллергического средства, иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки (называемых здесь далее также "индукторами дифференцировки") или индуктора апоптоза.
На основе вышеуказанного осуществляют настоящее изобретение и его целью является применение кератансульфатолигосахарида, по существу не содержащего примеси, в качестве противовоспалительного средства, противоаллергического средства, иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки (называемых здесь далее также "индукторами дифференцировки") или индуктора апоптоза.
Чтобы достичь указанной выше цели, заявители провели кропотливые исследования фармакологического действия олигосахарида, который содержит от двух до пяти сахаридных звеньев, в частности дисахарида, тетрасахарида или пентасахарида, полученного из продуктов расщепления, которые получаются при расщеплении высокосульфатированного кератансульфата расщепляющим кератансульфат ферментом, и в результате обнаружили, что описанный выше олигосахарид и его соли обладают превосходным противовоспалительным действием, противоаллергическим действием и иммуномодулирующим действием, индуцирующим клеточную дифференцировку действием и индуцирующим апоптоз действием. Таким образом осуществляют настоящее изобретение.
А именно противовоспалительное средство, противоаллергическое средство, иммуномодулятор, индуктор дифференцировки и индуктор апоптоза по настоящему изобретению (называемые здесь далее также обобщенно "фармацевтические препараты по настоящему изобретению") содержат кератансульфатолигосахарид и/или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента. В настоящем описании "кератансульфатолигосахарид" означает продукт расщепления кератансульфата, который можно получить путем расщепления кератансульфата расщепляющим кератансульфат ферментом типа эндо- β -N-ацетилглюкозаминидазы.
Примерами кератансульфатолигосахаридов, используемых для фармацевтических препаратов по настоящему изобретению, являются кератансульфатолигосахарид, который содержит сульфатированное N-ацетиллактозаминовое звено, необязательно содержащее сиаловую кислоту и/или фукозу, кератансульфатолигосахарид, который содержит олигосахарид с двумя-пятью сахаридными звеньями и имеет сульфатированный N-ацетилгликозамин на своем редуцирующем конце, и в молекуле которых сульфатированы, по меньшей мере, две гидроксильные группы, и, в частности, кератансульфатолигосахарид, описанный выше, который содержит в качестве структурного компонента, по меньшей мере, дисахарид, представленный формулой Gal(6S)-GlcNAc(6S) (где Gal представляет галактозу, GlcN представляет глюкозамин. Ac представляет ацетильную группу и 6S представляет 6-O-сульфатный эфир). Более того, предпочтительным примером кератансульфатолигосахарида, описанного выше, является тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный следующей формулой (I), трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой (II), дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой (III) и т. п.:
Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S) β 1-3 Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S)...(I)
NeuAc~Gal β 1-4 GlcNAc(6S) β 1-3 Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S)...(II)
Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S)... (III)
(В приведенных выше формулах Gal представляет галактозу, GlcN представляет глюкозамин, Neu представляет нейраминовую кислоту. Ac представляет ацетильную группу и 6S представляет 6-O-сульфатный эфир. И ~ представляет связь α 2, 3 или связь α 2, 6).
Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S) β 1-3 Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S)...(I)
NeuAc~Gal β 1-4 GlcNAc(6S) β 1-3 Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S)...(II)
Gal(6S) β 1-4 GlcNAc(6S)... (III)
(В приведенных выше формулах Gal представляет галактозу, GlcN представляет глюкозамин, Neu представляет нейраминовую кислоту. Ac представляет ацетильную группу и 6S представляет 6-O-сульфатный эфир. И ~ представляет связь α 2, 3 или связь α 2, 6).
Настоящее изобретение также относится к фракции кератансульфатолигосахарида, содержащей не менее 99% кератансульфатолигосахарида, который содержит олигосахарид с двумя-пятью сахаридными звеньями и сульфатированный N-ацетилгликозамин на своем редуцирующем конце, в молекулах которых сульфатированы, по меньшей мере, две гидроксильные группы, и обладающие следующими свойствами:
(а) фракция по существу не содержит эндотоксин, а содержание нуклеиновых кислот, белков и протеаз во фракции меньше относительно пределов их обнаружения; и
(б) фракция по существу не содержит гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфат, дерматансульфат, гепарансульфат и кератансульфат.
(а) фракция по существу не содержит эндотоксин, а содержание нуклеиновых кислот, белков и протеаз во фракции меньше относительно пределов их обнаружения; и
(б) фракция по существу не содержит гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфат, дерматансульфат, гепарансульфат и кератансульфат.
Настоящее изобретение также относится к фракции кератансульфатолигосахарида, содержащей не менее 99% кератансульфатолигосахарида, который содержит в качестве структурного компонента, по меньшей мере, дисахарид, представленный формулой Gal (6S)-GlcNAc (6S), и обладающий свойствами (а) и (б), описанными выше. Также предпочтительным примером кератансульфатолигосахарида, содержащегося в описанных выше олигосахаридных фракциях, является тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминатетрасахарид, представленный формулой (I), трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой (II), дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой (III), и т.п. Кроме того, кератансульфатолигосахарид включает кератансульфатолигосахарид, полученный путем фракционирования продуктов расщепления высокосульфатированного кератансульфата, получаемого из хрящевых рыб, расщепляющим кератансульфаты ферментом типа эндо- β -N-ацетилглюкозаминидазы.
Настоящее изобретение также относится к способу получения фракции кератансульфатолигосахарида, включающему стадии расщепления кератансульфата расщепляющим кератансульфаты ферментом, обладающим следующими физическими и химическими свойствами:
(1) действие:
расщепляющий фермент воздействует на кератансульфат и гидролизует его N-ацетилглюкозаминидную связь;
(2) специфичность к веществу:
расщепляющий фермент действует на кератансульфат I, кератансульфат II и кератанполисульфат и продуцирует сульфатированный кератансульфатдисахарид и сульфатированный кератансульфаттетрасахарид в качестве основных продуктов расщепления;
и предпочтительно обладающий физическими и химическими свойствами:
(3) оптимальный pH реакции:
расщепляющий фермент имеет оптимальный pH реакции от 4,5 до 6 в 0,1М ацетатном буфере или в 10 мМ трис-ацетатном буфере при 37oC;
(4) pH стабильность:
расщепляющий фермент обладает pH стабильностью от 6 до 7, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере или в 10 мМ трис-ацетатном буфере при 37oC в течение часа;
(5) оптимальная температура реакции:
расщепляющий фермент имеет оптимальную температуру реакции от 50 до 60oC, когда расщепляющий фермент реагирует в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение 10 мин; и
(6) термоустойчивость:
расщепляющий фермент устойчив, по меньшей мере, при 45oC или ниже, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение часа;
и фракционирования из продуктов расщепления фракции кератансульфатолигосахарида, обладающей следующими свойствами:
(A) фракция содержит в качестве основного ингредиента кератансульфатолигосахарид, который содержит сульфатированный N-ацетиллактозамин в качестве основной структурной составляющей;
(Б) фракция по существу не содержит эндотоксин, и содержание нуклеиновой кислоты, белка и протеазы во фракции является следовым или меньше относительно пределов их обнаружения; и
(В) фракция по существу не содержит гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, гепарансульфата и кератансульфата.
(1) действие:
расщепляющий фермент воздействует на кератансульфат и гидролизует его N-ацетилглюкозаминидную связь;
(2) специфичность к веществу:
расщепляющий фермент действует на кератансульфат I, кератансульфат II и кератанполисульфат и продуцирует сульфатированный кератансульфатдисахарид и сульфатированный кератансульфаттетрасахарид в качестве основных продуктов расщепления;
и предпочтительно обладающий физическими и химическими свойствами:
(3) оптимальный pH реакции:
расщепляющий фермент имеет оптимальный pH реакции от 4,5 до 6 в 0,1М ацетатном буфере или в 10 мМ трис-ацетатном буфере при 37oC;
(4) pH стабильность:
расщепляющий фермент обладает pH стабильностью от 6 до 7, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере или в 10 мМ трис-ацетатном буфере при 37oC в течение часа;
(5) оптимальная температура реакции:
расщепляющий фермент имеет оптимальную температуру реакции от 50 до 60oC, когда расщепляющий фермент реагирует в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение 10 мин; и
(6) термоустойчивость:
расщепляющий фермент устойчив, по меньшей мере, при 45oC или ниже, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение часа;
и фракционирования из продуктов расщепления фракции кератансульфатолигосахарида, обладающей следующими свойствами:
(A) фракция содержит в качестве основного ингредиента кератансульфатолигосахарид, который содержит сульфатированный N-ацетиллактозамин в качестве основной структурной составляющей;
(Б) фракция по существу не содержит эндотоксин, и содержание нуклеиновой кислоты, белка и протеазы во фракции является следовым или меньше относительно пределов их обнаружения; и
(В) фракция по существу не содержит гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, гепарансульфата и кератансульфата.
Кроме того, при способе получения фракции кератансульфатолигосахарида, описанной выше, например применение высокосульфатированного кератансульфата в качестве соединения кератансульфата дает кератансульфатолигосахарид, содержащий тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой (I), описанной выше, трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой (II), дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой (III), и т.п., в особенности кератансульфатолигосахариды, содержащие тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой (I) и дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой (III), в качестве основных ингредиентов.
В настоящем изобретении предпочтительным кератансульфатолигосахаридом, который содержит олигосахарид с двумя-пятью сахаридными звеньями, обычно является олигосахарид, который сульфатирован в двух-четырех позициях. Кроме того, предпочтительно, чтобы в кератансульфатолигосахариде, содержащем сиаловую кислоту, которая может использоваться по настоящему изобретению, сиаловая кислота включает N-ацетилнейраминовую кислоту и N-гликолилнейраминовую кислоту и N-ацетилнейраминовая кислота является предпочтительной. Кератансульфатолигосахарид, который может использоваться по настоящему изобретению, описанный выше, содержит олигосахариды, связывающие сиаловую кислоту по α 2,3 связи и по α 2,6 связи и, предпочтительно, связывающие сиаловую кислоту по α 2,3 связи.
Настоящее изобретение подробно описано далее.
(1) Кератансульфатолигосахарид и фракция кератансульфатолигосахарида, используемые в настоящем изобретении
Кератансульфат, который является исходным продуктом для кератансульфатолигосахарида, используемого по настоящему изобретению, содержит, главным образом, повторяющуюся структуру дисахарида галактозы или галактозо-6-сульфата и N-ацетилглюкозамино-6-сульфата, содержание сульфата в котором изменяется в зависимости от вида животного, ткани и т.д., и обычно добывается из такого сырья, как хрящи, кости и роговица хрящевых рыб, таких как акулы и млекопитающих, таких как киты и жвачные животные.
Кератансульфат, который является исходным продуктом для кератансульфатолигосахарида, используемого по настоящему изобретению, содержит, главным образом, повторяющуюся структуру дисахарида галактозы или галактозо-6-сульфата и N-ацетилглюкозамино-6-сульфата, содержание сульфата в котором изменяется в зависимости от вида животного, ткани и т.д., и обычно добывается из такого сырья, как хрящи, кости и роговица хрящевых рыб, таких как акулы и млекопитающих, таких как киты и жвачные животные.
Используемый в качестве исходного вещества кератансульфат является обычно доступным материалом и не имеет особых ограничений, но предпочтителен высокосульфатированный кератансульфат (высокосульфатированный кератансульфат, содержащий от 1,5 до 2 молекул сульфатной группы на структурный дисахарид, упоминается здесь так же как кератанполисульфат), у которого сульфатирован входящий в структуру моносахарид, такой как галактозный остаток. Сульфатная группа, предпочтительно, располагается в положении 6 на галактозном остатке. Такой высокосульфатированный кератансульфат можно получить, например, из протеогликана хрящей хрящевых рыб, таких как акулы. Коммерчески доступный кератансульфат также можно использовать.
Кератансульфатолигосахарид по настоящему изобретению можно получить путем воздействия на кератансульфат расщепляющего кератансульфаты фермента типа эндо- β -N-ацетилглюкозаминидазы, например, кератаназы II, получаемой из микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus (выложенная заявка на патент Японии N 2-57182), или нового расщепляющего кератансульфаты фермента, обнаруженного авторами настоящего изобретения в микроорганизме, принадлежащем к роду Bacillus, в буферном растворе и расщепления его, и последующего фракционирования полученных продуктов расщепления. Такую реакцию расщепления проводят, например, в буферном растворе, содержащем кератансульфат в концентрациях от 1,0 до 100 мг/мл при pH от 6,0 до 7,0 при от 25 до 40oC в течение от 1 до 72 ч. При этой реакции концентрация буфера обычно находится в области от 0,01 до 0,2М. Вид буфера особенно не ограничивают, если его pH можно установить в указанных выше пределах, и к числу таких буферов относятся, например, ацетатный буфер, фосфатный буфер и трис-буфер. Количество фермента, используемого в реакции расщепления, находится, например, в интервале от 0,1 до 1,0 единицы на 1 г кератансульфата. Здесь одна единица означает количество фермента, которое продуцирует редуцирующий конец, соответствующий 1 мкмоль N-ацетилглюкозамина в минуту.
Новый, описанный выше расщепляющий кератансульфат фермент продуцируется микроорганизмом, принадлежащим Bacillus circulans, например Bacillus circulans KsT202, был выделен заявителями, и он обладает превосходной термоустойчивостью. Этот фермент получают путем культивирования Bacillus circulans KsT202 в подходящей среде и очистки фермента от среды и/или микробных клеток методами, принятыми для очистки ферментов. Bacillus circulans KsT202 депонирован в National Institute of Bioscience and Human-Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Япония) 5 сентября 1994 г. под инвентарным номером FERM Р-14516 и затем передан для международного депонирования, согласно Будапештскому договору, 6 ноября 1995 г. , и депонирован под инвентарным номером FERM ВР-5285.
Физические и химические свойства нового расщепляющего кератансульфат фермента, описанного выше, описаны далее.
(1) Действие
Расщепляющий фермент действует на кератансульфат и гидролизует его N-ацетилглюкозаминидную связь.
Расщепляющий фермент действует на кератансульфат и гидролизует его N-ацетилглюкозаминидную связь.
(2) Специфичность к субстрату
Расщепляющий фермент действует на кератансульфат I, кератансульфат II и кератанполисульфат и продуцирует сульфатированный кератансульфатдисахарид и кератансульфаттетрасахарид в качестве основных продуктов расщепления. Подтверждено также, что расщепляющий фермент продуцирует сульфатированный кератансульфатпентасахарид.
Расщепляющий фермент действует на кератансульфат I, кератансульфат II и кератанполисульфат и продуцирует сульфатированный кератансульфатдисахарид и кератансульфаттетрасахарид в качестве основных продуктов расщепления. Подтверждено также, что расщепляющий фермент продуцирует сульфатированный кератансульфатпентасахарид.
(3) Оптимальный pH реакции:
Расщепляющий фермент имеет оптимальный pH реакции от 4,5 до 6 в 0,1М ацетатном буфере или в 10мМ трис-ацетатном буфере при 37oC.
Расщепляющий фермент имеет оптимальный pH реакции от 4,5 до 6 в 0,1М ацетатном буфере или в 10мМ трис-ацетатном буфере при 37oC.
(4) pH Стабильность:
Расщепляющий фермент обладает pH стабильностью от 6 до 7, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере или в 10мМ трис-ацетатном буфере при 37oC в течение часа.
Расщепляющий фермент обладает pH стабильностью от 6 до 7, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере или в 10мМ трис-ацетатном буфере при 37oC в течение часа.
(5) Оптимальная температура реакции:
Расщепляющий фермент имеет оптимальную температуру реакции от 50 до 60oC, когда расщепляющий фермент реагирует в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение 10 мин.
Расщепляющий фермент имеет оптимальную температуру реакции от 50 до 60oC, когда расщепляющий фермент реагирует в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение 10 мин.
(6) Термоустойчивость:
Расщепляющий фермент устойчив, по меньшей мере, при 45oC или ниже, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение часа.
Расщепляющий фермент устойчив, по меньшей мере, при 45oC или ниже, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение часа.
Фракция кератансульфатолигосахарида по настоящему изобретению может быть получена также путем взаимодействия иммобилизованного фермента, расщепляющего кератансульфат, в том числе такого нового расщепляющего кератансульфат фермента и кератаназы II, указанных выше, которые иммобилизованы обычными способами.
В результате реакции расщепления ферментом, как описан выше, кератансульфат расщепляется до олигосахарида.
Затем полученный таким образом олигосахарид отделяют и очищают обычными способами, такими как осаждение этанолом и различные виды хроматографии, и можно получить нужный кератансульфатолигосахарид. Эта очистка будет подробно описана при описании очистки кератансульфатолигосахарида из дисахарида, тетрасахарида и пентасахарида. Описанный выше продукт расщепления обычно концентрируют сначала осаждением этанолом и гель-фильтрацией (интервал фракционированной молекулярной массы от 100 до 10000), чтобы грубо фракционировать сырой кератансульфатолигосахарид из дисахарида, тетрасахарида и пентасахарида. Затем грубые фракции разделяют и фракционируют анионообменной хроматографией соответственно с получением по существу чистых дисахарида, тетрасахарида и пентасахарида, которые по существу не содержат эндотоксина, а содержание нуклеиновых кислот, белков и протеаз в которых меньше пределов их обнаружения и которые по существу не содержат гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, гепарансульфата и кератансульфата. В настоящем изобретении "по существу не содержат" означает такое содержание, которое может быть обнаружено чувствительными методами обнаружения, но не влияет на фармакологические функции кератансульфатолигосахарида, такие как противовоспалительная функция, противоаллергическая функция, иммуномодуляторная функция, функция индуцирования клеточной дифференцировки и функция индуцирования апоптоза.
Кератансульфатолигосахарид по настоящему изобретению получают из кератансульфата в качестве исходного продукта путем расщепления кератансульфата эндо- β -N-ацетилглюкозаминидазой и фракционирования олигосахарида из дисахаридных-пентасахаридных звеньев, который по существу не содержит кератансульфата и является для него исходным материалом.
Кератансульфатолигосахарид можно также получить из продуктов расщепления кератансульфата, расщепленного химическим способом, при котором предпочтительно или специфически разрушается связь между галактозой или галактозо-6-сульфатом и N-ацетилглюкозамин-6- сульфатом, которые составляют кератансульфат.
Кератансульфатолигосахарид, особенно тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминатетрасахарид, представленный формулой (I), описанной выше, трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой (II), дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой (III), и т.п., получают, как описано выше. В описанных далее примерах даны спектры ядерного магнитного резонанса (1H-ЯМР и 13C-ЯМР) и результаты масс-спектрометрического анализа при бомбардировке быстрыми атомами веществ, представленных формулами (I), (II) и (III).
Кератансульфатолигосахарид по настоящему изобретению также включает ионизованное вещество, протонированное вещество и фармацевтически приемлемую соль из числа солей с неорганическими основаниями, такими как щелочные металлы (натрий, калий, литий и т.п.), щелочноземельные металлы (кальций и т. п. ), аммоний и т. п., или солей с органическими основаниями, такие как соль диэтаноламина, соль циклогексиламина и соль аминокислоты.
Фармацевтическая композиция, содержащая кератансульфатолигосахарид и/или его соль, применяемые по настоящему изобретению, и носители, разбавители и другие добавки, обычно используемые в фармацевтических препаратах, также является новой и может вводиться с целью противовоспалительного, противоаллергического, иммуномодулирующего действия, с целью индуцирования клеточной дифференцировки, индуцирования апоптоза и т.п.
Фракция кератансульфатолигосахарида по настоящему изобретению содержит по меньшей мере 99% кератансульфатолигосахарида, который получают из продуктов ферментативного расщепления кератансульфата, удаляя из них эндотоксин, нуклеиновую кислоту, белок, протеазу и другие гликозаминогликаны, за исключением нужного кератансульфатолигосахарида, особенно из продуктов расщепления высокосульфатированного кератансульфата, следуя описанному выше способу.
(2) Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению
Кератансульфатолигосахарид и/или его фармацевтически приемлемая соль, описанные выше, могут широко применяться в качестве противовоспалительного средства, противоаллергического средства, иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки, индуктора апоптоза и фармацевтических препаратов для другого применения.
Кератансульфатолигосахарид и/или его фармацевтически приемлемая соль, описанные выше, могут широко применяться в качестве противовоспалительного средства, противоаллергического средства, иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки, индуктора апоптоза и фармацевтических препаратов для другого применения.
Противовоспалительное средство по настоящему изобретению эффективно при многих заболеваниях, связанных с воспалением, и характерные показания для которого включают хронический ревматоидный артрит, системную красную волчанку, спондилитные изменения, остеоартрит, люмбаго, ремиссию воспаления и гипертрофию после операций и травм, периартериит лопатки, височно-нижечелюстной артроз, тендовагинит, обволакивающее воспаление сухожилий, воспаление мыщелока плечевой кости (теннисный локоть), миалгию, кератоконъюнктивит и подобные воспаления. Противовоспалительное средство настоящего изобретения обладает противовоспалительным действием, таким как аналгезирующее действие, противовоспалительное действие и жаропонижающее действие, при заболеваниях и симптомах, при которых действует кератансульфатолигосахарид и/или его фармацевтически приемлемая соль.
Противовоспалительное средство по настоящему изобретению эффективно при любом заболевании, связанном с аллергией, и конкретные показания для которого включают аллергический ринит, аллергический кератоконъюнктивит, весенний конъюнктивит, экзему, дерматит, крапивницу, атопический дерматит и подобные заболевания.
Иммуномодулятор по настоящему изобретению эффективен при любом заболевании, связанном с иммунным нарушением, и конкретными показаниями для которого являются аутоиммунный лимфопролиферативный синдром человека (Cell 81, 935-946 (1995), Science 268, 1347-1349 (1995)), лимфопролиферативное нарушение (Leukemia and Lymphoma 16, 363-368 (1995), ангиоиммунобластная лимфаденопатия (Blood 85(10), 2862-2869 (1995)), иммунобластная лимфаденопатия (The American Journal of Medicine 63, 849-851 (1977)), хронический ревматоидный артрит, системная красная волчанка, дискоидная красная волчанка, дерматомиозит (дерматомиома), склеродермия, смешанная диффузная болезнь соединительной ткани, хронический тиреоидит, первичная микседема, тиреотоксикоз, пернициозная анемия, сочетание пневмопатии с тяжелой анемией, острый прогрессирующий гломерулонефрит, миастения gravis, обыкновенная пузырчатка, буллезный пемфигоид, инсулиннезависимый сахарный диабет, ювенильный сахарный диабет, болезнь Адиссона, атрофический гастрит, мужская стерильность, климактерический прекокс (precox), факогенный увеит, симпатический ангиит, рассеянный склероз, прогрессирующий системный склероз, воспалительное заболевание кишечника (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и т.п.), первичный билиарный цирроз, хронический активный гепатит, аутоиммунная гемолитическая анемия, пароксизмальная гемоглобинурия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, синдром Шегрена, синдром антифосфолипидных антител и подобные заболевания.
Индуктор дифференцировки по настоящему изобретению эффективен при любом заболевании, вызванном недостаточностью физиологической клеточной дифференцировки, иммунным нарушением, злокачественной опухолью и т.п., и конкретными показаниями для которого являются аутоиммунный лимфопролиферативный синдром человека, лимфопролиферативное нарушение, ангиоиммунобластная лимфаденопатия, иммунобластная лимфаденопатия, хронический ревматоидный артрит, системная красная волчанка, воспалительное заболевание кишечника (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и т.п.), прогрессирующий системный склероз, дерматомиозит (дерматомиома), синдром Шегрена, карцинома, лейкоз, лимфома, задержка карциномного метастаза, предупреждение гиперплазии (лечение против псориаза и т.п.), заживление ран, синдром остеомиелофиброза, склеродермия и подобные заболевания.
Индуктор апоптоза по настоящему изобретению эффективен при любом заболевании, вызванном недостаточностью физиологического апоптоза, иммунным нарушением, злокачественной опухолью и т.п., и конкретными показаниями для которого являются аутоиммунный лимфопролиферативный синдром человека, лимфопролиферативное нарушение, ангиоиммунобластная лимфаденопатия, иммунобластная лимфаденопатия, хронический ревматоидный артрит, системная красная волчанка, неспецифический язвенный колит, прогрессирующий системный склероз, дерматомиозит (дерматомиома), синдром Шегрена, карцинома, лейкоз, лимфома, задержка карциномного метастаза, предупреждение гиперплазии (лечение против псориаза и т. п.), синдром остеомиелофиброза, склеродермия, апоптозное индуцирование аномальных мезангиальных клеток (лечение против гломерулонефрита) и подобные заболевания.
Эффекты снижения массы лимфатических узлов, индуцирования дифференцировки и индуцирования апоптоза наблюдали на мышах MRL-lpr/lpr. Патогенез аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома человека считается таким же нарушением Fas-гена, как у мышей MRL-lpr/lpr, а патология синдрома имеет заметное сходство с патологией мышей MRL-lpr/lpr, как например, в отношении припухлости лимфоузлов. Мышей MRL-lpr/lpr можно принять в качестве подходящей модели аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома человека. Следовательно, наиболее предпочтительным показанием применения фармацевтических препаратов в иммуномодуляторе, индукторе дифференцировки и индукторе апоптоза настоящего изобретения является аутоиммунный лимфопролиферативный синдром человека.
Фармацевтические препараты по настоящему изобретению могут быть изготовлены с учетом способа введения, таким как инъекция (внутримышечная, подкожная, интрадермальная, внутривенная, интраартикулярная, внутриглазная, внутрибрюшинная и т.д.), закапывание в глаза, инстилляция, чрезкожное введение, пероральное введение и ингаляция. Лекарственные формы включают формы для инъекции (растворы, суспензии, эмульсии, твердые препараты для инъекций, растворимые перед применением и т.п.), таблетки, капсулы, гранулы, порошки, растворы, липосомные включения, мази, гели, порошки для наружного применения, спреи, порошки для ингаляций, глазные капли, глазные мази и тому подобное. При получении фармацевтических препаратов можно применять ингредиенты, обычно используемые в лекарственных средствах, такие как традиционные носители, связующие, смазывающие вещества, красители и разрыхлители. В фармацевтических препаратах по настоящему изобретению кератансульфатолигосахарид может использоваться одновременно с другими противовоспалительными ингредиентами, противоаллергическими ингредиентами, иммуномодулирующими ингредиентами, ингредиентами, индуцирующими дифференцировку, ингредиентами, индуцирующими апоптоз и т.п.
В табл. 1 указаны предпочтительные способы введения и лекарственные формы противовоспалительного и противоаллергического средства. В табл. 2 указаны предпочтительные способы введения и лекарственные формы иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки и индуктора апоптоза.
Эффективная доза противовоспалительного средства и противоаллергического средства по настоящему изобретению составляет от 30 до 300 мг/пациент/сутки кератансульфатолигосахарида при введении в организм и от 1 до 10 мг/пациент/сутки при наружном введении. Эффективная доза иммуномодулятора, индуктора дифференцировки и индуктора апоптоза находится в интервале от 30 до 6000 мг/пациент/сутки кератансульфатолигосахарида.
На фиг. 1 представлена хроматограмма гель-фильтрации с помощью ВЭЖХ тетрасульфатированного N-ацетиллактозаминотетрасахарида (кератансульфаттетрасахарид (I)), полученного в примере 1.
На фиг. 2 представлена хроматограмма гель-фильтрации с помощью ВЭЖХ трисульфатированного N-ацетиллактозаминопентасахарида (кератансульфатпентасахарид (II)), полученного в примере 1.
На фиг. 3 представлена хроматограмма гель-фильтрации с помощью ВЭЖХ дисульфатированного N-ацетиллактозаминодисахарида (кератансульфатдисахарид (III), полученного в примере 1.
Фиг. 4 демонстрирует спектр 1H-ЯМР при 400 МГц кератансульфатпентасахарида (II), полученного в примере 1.
Фиг. 5 представляет диаграмму, показывающую объем синовиальной жидкости у кроликов в случае модели артрита, вызванного папаином, которым вводили кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) или кератан сульфатдисахарид (III).
Фиг. 6 представляет графики, показывающие изменение времени развития отека стоп у крыс, у которых вызвано воспаление, когда кератансульфаттетрасахарид (I) или различные испытываемые соединения вводят крысам за пять минут до индуцирования воспаления.
Фиг. 7 представляет графики, показывающие изменение времени развития отека стоп у крыс, у которых вызвано воспаление, когда кератансульфаттетрасахарид (I) или различные испытываемые соединения вводят крысам за три часа до индуцирования воспаления.
На фиг. 8 приведена диаграмма, показывающая объем плеврального выпота у крыс в случае модели каррагининового (carrageenin) плеврита, которым вводили кератансульфаттетрасахарид (I) или дексаметазонацетат.
На фиг. 9 дается диаграмма, показывающая число лейкоцитов в плевральном выпоте у крыс в случае модели каррагининового плеврита, которым вводили кератансульфаттетрасахарид (I) или дексаметазонацетат.
На фиг. 10 представлена диаграмма, показывающая ингибирующее действие на генерацию активного кислорода (O ) кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III) для нейтрофилов морских свинок, которая стимулируется N-формил-Met-Leu-Phe (FMLP).
На фиг. 11 дается диаграмма, показывающая оценку степени развития конъюнктивита в случае модели аллергического конъюнктивита у морских свинок, которым вводят или не вводят кератансульфаттетрасахарид (I).
Фиг. 12 представляет диаграмму, показывающую оценку степени развития конъюнктивита в случае модели аллергического конъюнктивита у морских свинок, которым вводят или соответственно не вводят кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) или кератансульфатдисахарид (III).
Фиг. 13 представляет диаграмму, показывающую оценку степени развития конъюнктивита в случае модели аллергического конъюнктивита у морских свинок, которым вводят кератансульфаттетрасахарид (I) в различных концентрациях.
На фиг. 14 приводится диаграмма, показывающая массу подчелюстных лимфатических узлов у мышей MRL, которые являются моделью аутоиммунного заболевания, которым в течение 28 дней повторно вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).
На фиг. 15 приводится диаграмма, показывающая массу мезентериальных лимфатических узлов у мышей MRL, которым в течение 56 дней повторно вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).
Фиг. 16 представляет диаграмму, показывающую массу подчелюстных лимфатических узлов у мышей MRL, которым в течение 56 дней повторно вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).
Фиг. 17 является диаграммой, на которой даются результаты анализа концентраций окрашивания образцов срезов мезентериальных лимфатических узлов (НЕ-окрашивание) у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).
Фиг. 18 является диаграммой, на которой даются результаты анализа концентраций окрашивания образцов срезов подчелюстных лимфатических узлов (Не - окрашивание) у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).
Фиг. 19 является диаграммой, показывающей соотношение (%) CD3 и CD4 позитивных клеток для лимфоцитов у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).
Фиг. 20 является диаграммой, показывающей соотношение (%) CD3 и CD8a позитивных клеток для лимфоцитов у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).
Фиг. 21 является диаграммой, показывающей соотношение (%) CD3 и В220 позитивных клеток для лимфоцитов у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).
Фиг. 22 является диаграммой, показывающей число апоптозных клеток в подчелюстных лимфатических узлах у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).
Предпочтительные варианты осуществления изобретения
Настоящее изобретение подробно описано далее с помощью приведенных ниже примеров. В примере продуцирования описывается продуцирование нового расщепленного кератансульфат фермента, получаемого из микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus. В примере 1 описывается получение фракций кератансульфатолигосахаридов, а в примере 2 описывается острая токсичность и различные фармакологические свойства кератансульфатолигосахаридов. Кроме того, в примерах 3-6 даются примеры фармацевтических препаратов.
Настоящее изобретение подробно описано далее с помощью приведенных ниже примеров. В примере продуцирования описывается продуцирование нового расщепленного кератансульфат фермента, получаемого из микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus. В примере 1 описывается получение фракций кератансульфатолигосахаридов, а в примере 2 описывается острая токсичность и различные фармакологические свойства кератансульфатолигосахаридов. Кроме того, в примерах 3-6 даются примеры фармацевтических препаратов.
Пример продуцирования. Продуцирование фермента, расщепляющего кератансульфат
(1) Выделение Bacillus circulans KsT202
Небольшое количество почвы добавляют к 5 мл жидкой среды, содержащей источник азота, неорганические соли и кератансульфат и культивируют при встряхивании при 45oC в течение трех суток. После культивирования 10 мкл супернатанта культуральной среды капают на фильтровальную бумагу, и также таким же способом наносят на фильтровальную бумагу 10 мкл жидкой среды (контроль). После просушивания на воздухе фильтровальную бумагу смачивают в растворе толуидинового синего и соответственно промывают разбавленным раствором уксусной кислоты и окраску на стороне капли супернатанта культуральной среды сравнивают с окраской контрольного пятна. Так толуидиновый синий соединяется с кератансульфатом с образованием синего окрашивания, менее интенсивное окрашивание, чем в случае контрольного образца, подтверждает, что в образце находится усваивающий кератансульфат микроорганизм. Усваивающий кератансульфат микроорганизм выделяют в чистом виде из раствора культуры обычным способом с использованием пластинчатой среды (например, агара Heart infusion).
(1) Выделение Bacillus circulans KsT202
Небольшое количество почвы добавляют к 5 мл жидкой среды, содержащей источник азота, неорганические соли и кератансульфат и культивируют при встряхивании при 45oC в течение трех суток. После культивирования 10 мкл супернатанта культуральной среды капают на фильтровальную бумагу, и также таким же способом наносят на фильтровальную бумагу 10 мкл жидкой среды (контроль). После просушивания на воздухе фильтровальную бумагу смачивают в растворе толуидинового синего и соответственно промывают разбавленным раствором уксусной кислоты и окраску на стороне капли супернатанта культуральной среды сравнивают с окраской контрольного пятна. Так толуидиновый синий соединяется с кератансульфатом с образованием синего окрашивания, менее интенсивное окрашивание, чем в случае контрольного образца, подтверждает, что в образце находится усваивающий кератансульфат микроорганизм. Усваивающий кератансульфат микроорганизм выделяют в чистом виде из раствора культуры обычным способом с использованием пластинчатой среды (например, агара Heart infusion).
Выделенный вид микроорганизмов проверяют на усвоение кератансульфата с использованием жидкой среды так же, как описано выше, и получают нужный микроорганизм, усваивающий кератансульфат. В результате исследований морфологии, роста и физиологических свойств штамма, о котором идет речь, микроорганизм идентифицирован как Bacillus circulans. Указанный штамм является новым штаммом, который можно отличить от известных штаммов, так как он усваивает кератансульфат. KsT202 Bacillus circulans депонирован в National Institute of Bioscience and Human-Technology of Agency of Industrial Science and Technology 5 сентября 1994 г. под инвентарным номером FERM Р-14516, и он передан на международное депонирование, на основании Будапештского договора, 6 ноября 1995 г., и депонирован под инвентарным номером FERM ВР-5285.
(2) Получение фермента, расщепляющего кератансульфат
В ферментер емкостью 30 л загружают 20 л среды (pH 8,0), содержащей 1,5% пептона (Kyokuto Seiyaku Kogyo), 0,75% экстракта пивных дрожжей (Nippon Seiyaku), 0,75% кератанполисульфата, полученного из хрящей акулы (Seikagaku Corporation), 0,5% K2HPO4, 0,02% MgSO4•7H2O, 0,5% NaCl и 0,0015% противовспенивающего вещества Adekanol (торговое название, Asahi Denka Kogyo), автоклавируют при 121oC в течение 20 мин, инокулируют асептически 1 л (5%) раствора культуры штамма KsT202, который предварительно культивируют при встряхивании в такой же среде при 37oC в течение 16 ч, и культивируют при 45oC в течение 24 ч с одновременной аэрацией (1 о/ом (vvm)) и перемешиванием (300 об/мин). Обрабатывают 20 л раствора культуры на центрифуге непрерывного действия, чтобы удалить микробные клетки, и получают приблизительно 20 л внеклеточной жидкости.
В ферментер емкостью 30 л загружают 20 л среды (pH 8,0), содержащей 1,5% пептона (Kyokuto Seiyaku Kogyo), 0,75% экстракта пивных дрожжей (Nippon Seiyaku), 0,75% кератанполисульфата, полученного из хрящей акулы (Seikagaku Corporation), 0,5% K2HPO4, 0,02% MgSO4•7H2O, 0,5% NaCl и 0,0015% противовспенивающего вещества Adekanol (торговое название, Asahi Denka Kogyo), автоклавируют при 121oC в течение 20 мин, инокулируют асептически 1 л (5%) раствора культуры штамма KsT202, который предварительно культивируют при встряхивании в такой же среде при 37oC в течение 16 ч, и культивируют при 45oC в течение 24 ч с одновременной аэрацией (1 о/ом (vvm)) и перемешиванием (300 об/мин). Обрабатывают 20 л раствора культуры на центрифуге непрерывного действия, чтобы удалить микробные клетки, и получают приблизительно 20 л внеклеточной жидкости.
К этой внеклеточной жидкости добавляют сульфат аммония до 70% насыщения и центрифугированием извлекают выпавший осадок, и растворяют его в 2,5 л 10 мМ трис-ацетатного буфера (pH 7,5). К этому раствору добавляют сульфат аммония до 35% насыщения, выпавший осадок извлекают центрифугированием, затем добавляют сульфат аммония до 55% насыщения, и выпавший осадок извлекают центрифугированием.
Осадок растворяют в 2,5 л 10 мМ трис-ацетатного буфера (pH 7,5) и пропускают через колонку (5,2 х 24 см) с DEAE-целлюлозой (DE52, Whatman Co.), которую предварительно уравновешивают тем же буфером, и дают возможность ферменту адсорбироваться. Затем колонку промывают 1,5 л того же буфера, и фермент элюируют при линейном возрастании концентрации хлорида натрия от нуля до 0,3 М в том же буфере.
Активные фракции собирают, добавляют сульфат аммония до 55% насыщения, и затем выпавший осадок извлекают центрифугированием и растворяют в небольшом количестве 10 мМ трис-ацетатного буфера (pH 7,5). Затем раствор загружают на колонку с сефакрилом S-300 (Pharmacia) (3,4 х 110 см), и подвергают гель-фильтрации с 50 мМ трис-ацетатного буфера (pH 7,5), содержащего 0,5 М хлорида натрия.
Активную фракцию концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны UK-10 (Advantec Toyo) и диализуют против приблизительно 100-кратного количества 10 мМ трис-ацетатного буфера (pH 7,5). Диализованный внутренний раствор пропускают через колонку с DEAE-Toyopearl (Tosoh Corporation) (2,2 х 15 см), которую предварительно уравновешивают тем же буфером, и дают возможность ферменту адсорбироваться. Затем колонку промывают 150 мл того же буфера, содержащего 0,1 М хлорида натрия, и фермент элюируют при линейном возрастании концентрации хлорида натрия от 0,1 до 0,2 М в том же буфере.
Активную фракцию концентрируют ультрафильтрацией, загружают на колонку с сефакрилом S-300 (2,2 х 101 см), и подвергают гель-фильтрации.
После добавления к активной фракции хлорида натрия до концентрации 4 М раствор пропускают через колонку с фенилсефарозой (Pharmacia) (1,6 х 15 см), которую уравновешивают трис-ацетатным буфером (pH 7,5), содержащим 4 М хлорида натрия, и затем элюируют фермент при линейном снижении концентрации хлорида натрия от 4 М до нуля в том же буфере. Получают 29 единиц фермента, и его специфическая активность составляет 2,09 единиц/мг (вычислена на массу бычьего сывороточного альбумина). Очищенный фермент не содержит загрязняющих ферментов, таких как гликозидаза.
Полученный выше расщепляющий кератансульфат фермент имеет следующие свойства.
(1) Действие
Расщепляющий фермент воздействует на кератансульфат и гидролизует его N-ацетилглюкозаминидную связь.
Расщепляющий фермент воздействует на кератансульфат и гидролизует его N-ацетилглюкозаминидную связь.
(2) Субстратная специфичность
Расщепляющий фермент воздействует на кератансульфат I, кератансульфат II и кератанполисульфат и продуцирует сульфатированный кератансульфатдисахарид и сульфатированный кератансульфаттетрасахарид как основные продукты расщепления. Также подтверждено, что расщепляющий фермент продуцирует сульфатированный кератансульфатпентасахарид.
Расщепляющий фермент воздействует на кератансульфат I, кератансульфат II и кератанполисульфат и продуцирует сульфатированный кератансульфатдисахарид и сульфатированный кератансульфаттетрасахарид как основные продукты расщепления. Также подтверждено, что расщепляющий фермент продуцирует сульфатированный кератансульфатпентасахарид.
(3) Оптимальный pH реакции
Расщепляющий фермент имеет оптимальный pH реакции от 4,5 до 6 в 0,1М ацетатном буфере или в10мМ трис-ацетатном буфере при 37oC.
Расщепляющий фермент имеет оптимальный pH реакции от 4,5 до 6 в 0,1М ацетатном буфере или в10мМ трис-ацетатном буфере при 37oC.
(4) Стабильность pH
Расщепляющий фермент обладает pH стабильностью от 6 до 7, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере или в 10мМ трис-ацетатном буфере при 37oC в течение часа.
Расщепляющий фермент обладает pH стабильностью от 6 до 7, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере или в 10мМ трис-ацетатном буфере при 37oC в течение часа.
(5) Оптимальная температура реакции
Оптимальная температура реакции расщепляющего фермента составляет от 50 до 60oC, когда расщепляющий фермент реагирует в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение 10 мин.
Оптимальная температура реакции расщепляющего фермента составляет от 50 до 60oC, когда расщепляющий фермент реагирует в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение 10 мин.
(6) Термоустойчивость
Расщепляющий фермент устойчив, по меньшей мере, при 45oC или ниже, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение часа.
Расщепляющий фермент устойчив, по меньшей мере, при 45oC или ниже, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение часа.
Расщепляющий кератансульфат фермент, полученный так, как описано выше, используют в приведенных ниже примерах. Однако настоящее изобретение не ограничивается этим ферментом, и в настоящем изобретении могут использоваться другие расщепляющие кератансульфаты ферменты типа эндо- β -N-ацетилглюкозаминидазы, например кератаназа II.
Пример 1
Растворяют 50 г высокосульфатированного кератансульфата, полученного из хрящей акулы, в 300 мл 0,1 М ацетатного буфера (pH 6,0). К этому раствору добавляют 25 единиц расщепляющего
кератансульфат фермента, описанного выше, и высокосульфатированный кератансульфат расщепляют при 37oC в течение 24 ч. После реакции расщепления к реакционной смеси добавляют двойное (по объему, также и далее) количество этанола и смесь перемешивают, и оставляют стоять в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день смесь разделяют центрифугированием (4000 об/мин, 15 мин) на супернатант и осадок, и супернатант концентрируют при пониженном давлении, и получают концентрат (называемый здесь далее "супернатантом A"). С другой стороны, осадок растворяют в 300 мл дистиллированной воды, смешивают с тройным количеством этанола и перемешивают. Затем смесь оставляют на ночь при комнатной температуре. На следующий день смесь разделяют центрифугированием на супернатант и осадок и супернатант концентрируют при пониженном давлении, и получают концентрат (называемый здесь далее "супернатантом B").
Растворяют 50 г высокосульфатированного кератансульфата, полученного из хрящей акулы, в 300 мл 0,1 М ацетатного буфера (pH 6,0). К этому раствору добавляют 25 единиц расщепляющего
кератансульфат фермента, описанного выше, и высокосульфатированный кератансульфат расщепляют при 37oC в течение 24 ч. После реакции расщепления к реакционной смеси добавляют двойное (по объему, также и далее) количество этанола и смесь перемешивают, и оставляют стоять в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день смесь разделяют центрифугированием (4000 об/мин, 15 мин) на супернатант и осадок, и супернатант концентрируют при пониженном давлении, и получают концентрат (называемый здесь далее "супернатантом A"). С другой стороны, осадок растворяют в 300 мл дистиллированной воды, смешивают с тройным количеством этанола и перемешивают. Затем смесь оставляют на ночь при комнатной температуре. На следующий день смесь разделяют центрифугированием на супернатант и осадок и супернатант концентрируют при пониженном давлении, и получают концентрат (называемый здесь далее "супернатантом B").
Супернатант A растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, подвергают гель-хроматографии с использованием колонки с Bio-Gel Р-2 (Bio-Rad) (3,6 х 134 см) и дистиллированной воды в качестве растворителя, и затем подвергают ионообменной хроматографии, и получают фракции, содержащие кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) и кератансульфатдисахарид (III) соответственно. Каждую из фракций сушат вымораживанием.
Каждую из этих кератансульфатолигосахаридных фракций растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и дополнительно очищают анионообменной хроматографией с использованием колонки с Muromac (Muromachi Kagaku Kogyo) (4,3 x 35 см), которую предварительно уравновешивают дистиллированной водой. В качестве элюента используют физиологический раствор, содержащий линейно возрастающее количество хлорида натрия от нуля до концентрации 0,3 М, и элюируют кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) и кератансульфатдисахарид (III) соответственно.
Каждую из полученных фракций кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III) концентрируют при пониженном давлении, обессоливают гель-хроматографией с использованием колонки с целлулофином GCL-25 (Seikagaku Corporation) (3,2 x 125 см) и сушат вымораживанием.
Обрабатывают также супернатант B тем же способом, какой описан выше, и получают кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) и кератансульфатдисахарид (III).
Хроматограммы, полученные при гель-фильтрации с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III), полученных выше, приводятся на фиг. 1-3, соответственно.
Из 50 г кератансульфата получают 7,8 г (15,6%) кератансульфаттетрасахарида (I), 1,3 г (2,6%) кератансульфатпентасахарида (II) и 10,4 г (20,8%) кератансульфатдисахарида (III), и ни один из них не содержит эндотоксинов, нуклеиновых кислот, белков, протеаз и других гликозаминогликанов.
Спектры 1H-ЯМР и 13C-ЯМР кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III), полученных выше, определяют с помощью спектрометра JNM-EX400 (400 МГц, JEOL Ltd.) в случае спектров 1H-ЯМР и спектрометра JNM-EX400 (100 МГц, JEOL Ltd.) в случае спектров 13C-ЯМР, соответственно с натрий-3-(триметилсилил)пропионатом-D4 в качестве стандартного вещества. Химический сдвиг и константу взаимодействия представляют δ (м.д.) и Гц соответственно. Ниже приводятся результаты определения:
Кератансульфаттетрасахарид (I)
1H-ЯМР δ (D2O, 40oC): 4,757 (1H, д), 4,565 (1H, д), 4,561 (1H, д), 4,402 (1H, дд), 4,342 (2H, дд), 3,711 (1H, дд), 3,626 (1H, дд), 3,555 (1H, дд), 2,069 (3Н, с), 2,047 (3Н, с)
13C-ЯМР δ (D2O, 25oC): 177,81, 177,63, 177,30, 105,87, 105,69, 97,84, 93,34, 84,98, 82,41, 81,91, 81,25, 75,55, 75,44, 75,20, 75,13, 75,02, 73,70, 72,68, 72,07, 71,10, 71,01, 70,61, 69,82, 69,82, 69,59, 69,29, 58,92, 57,94, 56,42, 25,09, 24,76
Кератансульфатпентасахарид (II)
1H-ЯМР δ (D2O, 25oC): спектр приводится на фиг. 4
13C-ЯМР δ (D2O, 25oC): 177,80, 177,32, 176,86, 105,92, 105,78, 104,94, 102,60, 97,86, 93,32, 85,05, 82,55, 82,04, 79,75, 78,16, 77,93, 75,69, 75,59, 75,48, 75,24, 74,98, 74,36, 72,68, 72,33, 72,07, 71,38, 71,01, 70,65, 70,35, 69,62, 69,13, 65,38, 63,94, 58,92, 57,99, 56,42, 54,57, 42,47, 25,07, 24,93, 24,76
Кератансульфатдисахарид (III)
1H-ЯМР δ (D2O, 40oC): 5,235 (0,64H, д, J=1,46 Гц), 4,766 (0,41H, д, J= 4,88 Гц), 4,562 (1,15H, д, J=7,82 Гц), 4,44 (0,15H, ушир.), 4,42 (0,22H, ушир. ), 4,357 (1,30Н, д, J=3,42 Гц), 4,313 (0,22H, д, J=4,88 Гц), 4,286 (0,15H, д, J=3,90 Гц), 4,213 (2,37H, д, J=5,37 Гц), 4,183 (0,37H, т, J=3,42, 2,93 Гц), 4,01-3,97 (2,06H, м), 4,006 (д, J=2,44 Гц), 3,927 (1,27H, д, J= 5,37 Гц), 3,86-3,83 (0,37H, ушир.), 3,78-3,69 (2,78H, м), 3,59-3,56 (1,04H, м), 2,052 (3,00H, м)
13C-ЯМР δ (D2O, 25oC): 177,61, 177,30, 105,80, 105,63, 97,82, 93,38, 82,02, 81,55, 75,60, 75,47, 75,15, 75,09, 73,70, 72,04, 71,12, 71,07, 69,93, 69,51, 59,00, 56,44, 25,05, 24,76
Кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) и кератансульфатдисахарид (III), полученные выше, анализируют масс-спектрометрией с бомбардировкой быстрыми атомами (FABMS).
Кератансульфаттетрасахарид (I)
1H-ЯМР δ (D2O, 40oC): 4,757 (1H, д), 4,565 (1H, д), 4,561 (1H, д), 4,402 (1H, дд), 4,342 (2H, дд), 3,711 (1H, дд), 3,626 (1H, дд), 3,555 (1H, дд), 2,069 (3Н, с), 2,047 (3Н, с)
13C-ЯМР δ (D2O, 25oC): 177,81, 177,63, 177,30, 105,87, 105,69, 97,84, 93,34, 84,98, 82,41, 81,91, 81,25, 75,55, 75,44, 75,20, 75,13, 75,02, 73,70, 72,68, 72,07, 71,10, 71,01, 70,61, 69,82, 69,82, 69,59, 69,29, 58,92, 57,94, 56,42, 25,09, 24,76
Кератансульфатпентасахарид (II)
1H-ЯМР δ (D2O, 25oC): спектр приводится на фиг. 4
13C-ЯМР δ (D2O, 25oC): 177,80, 177,32, 176,86, 105,92, 105,78, 104,94, 102,60, 97,86, 93,32, 85,05, 82,55, 82,04, 79,75, 78,16, 77,93, 75,69, 75,59, 75,48, 75,24, 74,98, 74,36, 72,68, 72,33, 72,07, 71,38, 71,01, 70,65, 70,35, 69,62, 69,13, 65,38, 63,94, 58,92, 57,99, 56,42, 54,57, 42,47, 25,07, 24,93, 24,76
Кератансульфатдисахарид (III)
1H-ЯМР δ (D2O, 40oC): 5,235 (0,64H, д, J=1,46 Гц), 4,766 (0,41H, д, J= 4,88 Гц), 4,562 (1,15H, д, J=7,82 Гц), 4,44 (0,15H, ушир.), 4,42 (0,22H, ушир. ), 4,357 (1,30Н, д, J=3,42 Гц), 4,313 (0,22H, д, J=4,88 Гц), 4,286 (0,15H, д, J=3,90 Гц), 4,213 (2,37H, д, J=5,37 Гц), 4,183 (0,37H, т, J=3,42, 2,93 Гц), 4,01-3,97 (2,06H, м), 4,006 (д, J=2,44 Гц), 3,927 (1,27H, д, J= 5,37 Гц), 3,86-3,83 (0,37H, ушир.), 3,78-3,69 (2,78H, м), 3,59-3,56 (1,04H, м), 2,052 (3,00H, м)
13C-ЯМР δ (D2O, 25oC): 177,61, 177,30, 105,80, 105,63, 97,82, 93,38, 82,02, 81,55, 75,60, 75,47, 75,15, 75,09, 73,70, 72,04, 71,12, 71,07, 69,93, 69,51, 59,00, 56,44, 25,05, 24,76
Кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) и кератансульфатдисахарид (III), полученные выше, анализируют масс-спектрометрией с бомбардировкой быстрыми атомами (FABMS).
(1) Катионная FABMS (катионная масс-спектрометрия при бомбардировке быстрыми атомами)
Кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) и кератансульфатдисахарид (III) растворяют в воде и получают водные растворы с концентрациями 25, 40 и 50 нмоль/мкл соответственно, и каждые 0,1 мкл водных растворов смешивают с 1,0 мкл α -тиоглицерина (используемого в качестве матрицы) и используют для определения. Определения проводят с помощью трехфазного квадрупольного масс-спектрометра finnigan MAT TSQ700 с ксеноном (8 кВ) как источником бомбардирующих атомов. Результаты приводятся в табл. 3. Числа в скобках в таблице представляют относительную интенсивность пиков (%).
Кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) и кератансульфатдисахарид (III) растворяют в воде и получают водные растворы с концентрациями 25, 40 и 50 нмоль/мкл соответственно, и каждые 0,1 мкл водных растворов смешивают с 1,0 мкл α -тиоглицерина (используемого в качестве матрицы) и используют для определения. Определения проводят с помощью трехфазного квадрупольного масс-спектрометра finnigan MAT TSQ700 с ксеноном (8 кВ) как источником бомбардирующих атомов. Результаты приводятся в табл. 3. Числа в скобках в таблице представляют относительную интенсивность пиков (%).
(2) Анионная FABMS (анионная масс-спектрометрия при бомбардировке быстрыми атомами)
Кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) и кератансульфатдисахарид (III) растворяют в воде и получают водные растворы с концентрациями 25, 40 и 50 нмоль/мкл соответственно, и 1,0, 1,0 и 0,5 мкл водного раствора кератансульфатолигосахарида, полученного как описано выше, соответственно смешивают с 1,0 мкл α -тиоглицерина (используемого в качестве матрицы) и используют для определения. Определения проводят с помощью трехфазного квадрупольного масс-спектрометра finnigan MAT TSQ700 с ксеноном (8 кВ) как источником бомбардирующих атомов. Результаты приводятся в табл. 4. Числа в скобках в таблице представляют относительную интенсивность пиков (%).
Кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) и кератансульфатдисахарид (III) растворяют в воде и получают водные растворы с концентрациями 25, 40 и 50 нмоль/мкл соответственно, и 1,0, 1,0 и 0,5 мкл водного раствора кератансульфатолигосахарида, полученного как описано выше, соответственно смешивают с 1,0 мкл α -тиоглицерина (используемого в качестве матрицы) и используют для определения. Определения проводят с помощью трехфазного квадрупольного масс-спектрометра finnigan MAT TSQ700 с ксеноном (8 кВ) как источником бомбардирующих атомов. Результаты приводятся в табл. 4. Числа в скобках в таблице представляют относительную интенсивность пиков (%).
Кроме того, определяют содержание эндотоксинов, нуклеиновых кислот, белка и протеаз в очищенных кератансульфаттетрасахариде (I), кератансульфатпентасахариде (II) и кератансульфатдисахариде (III), которые получены так, как описано выше. Результаты приводятся в табл. 5.
Содержание гликозаминогликанов, таких как гиалуроновые кислоты, хондроитинсульфат, дерматансульфаты, гиперансульфаты, кератансульфаты и т.п., в очищенных кератансульфаттетрасахариде (I), кератансульфатпентасахариде (II) и кератансульфатдисахариде (III) определяют с помощью электрофореза с ацетатцеллюлозной мембраной (Cepallax, Fuji Photo Film) (буфер 0,1 М пиридинмуравьиная кислота; pH 3,0; ток 0,5 мА/см; время электрофореза 30 мин; краситель 0,5% раствор альцианового синего). В результате ни одно из указанных соединений не обнаружено ни в одном из кератансульфатолигосахаридов (меньше предела обнаружения).
Пример 2. Кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) и кератансульфатдисахарид (III), полученные как описано выше, испытывают на острую токсичность и подвергают различным фармакологическим испытаниям.
"Испытание на острую токсичность"
Очищенные кератансульфатолигосахариды, которые получают в примере 1, соответственно испытывают на острую токсичность на самцах и самках мышей ICR в возрасте пяти недель. Растворы кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III) соответственно, в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) вводят внутривенно при дозе 1000 или 2000 мг/кг и затем наблюдают за общим внешним видом и смертностью, и в течение 14 дней измеряют массу тела подопытных мышей. После этого животных умерщвляют и вскрывают.
Очищенные кератансульфатолигосахариды, которые получают в примере 1, соответственно испытывают на острую токсичность на самцах и самках мышей ICR в возрасте пяти недель. Растворы кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III) соответственно, в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) вводят внутривенно при дозе 1000 или 2000 мг/кг и затем наблюдают за общим внешним видом и смертностью, и в течение 14 дней измеряют массу тела подопытных мышей. После этого животных умерщвляют и вскрывают.
В результате обнаружено, что ни одно из животных не погибает и нет нарушений нормального внешнего вида, массы тела и при вскрытии.
На основании полученных результатов заключают, что минимальная летальная доза описанных выше кератансульфатолигосахаридов даже при внутривенном введении превышает 2000 мг/кг.
"Противовоспалительное испытание"
(1) Противовоспалительные испытания на кроличьей модели индуцированного папаином артрита
Противовоспалительное действие кератансульфатолигосахарида на кроличьей модели индуцированного папаином артрита проверяют, используя в качестве показателя объем синовиальной жидкости.
(1) Противовоспалительные испытания на кроличьей модели индуцированного папаином артрита
Противовоспалительное действие кератансульфатолигосахарида на кроличьей модели индуцированного папаином артрита проверяют, используя в качестве показателя объем синовиальной жидкости.
(1-1) Противовоспалительное действие кератансульфаттетрасахарида на модели билатерального артрита при интраартикулярном введении
В суставные полости обоих коленных суставов белых японских кроликов (самки) массой 3 кг инъецируют 150 мкл папаина (1%) в физиологическом растворе, и получают модель артрита. Через день после инъекции папаина в суставную полость левого колена инъецируют 150 мкл раствора очищенного кератансульфаттетрасахарида (I) в ЗФР (1% раствор; 1,5 мг/сустав), который получен в примере 1 (далее означает здесь "стопа, обработанная кератансульфаттетрасахаридом (I)"), а в первый сустав инъецируют 150 мкл ЗФР (далее означает здесь "стопа, необработанная кератансульфаттетрасахаридом (I)"). В дальнейшем здесь кролики, которым вводили кератансульфаттетрасахарид (I), называются "обработанной группой". Кроликов, которые получили только инъекцию папаина (называемые далее контрольной группой), и кроликов, которым не давали инъекции папаина (далее называемые нормальной группой), также проверяют тем же способом, который описан далее.
В суставные полости обоих коленных суставов белых японских кроликов (самки) массой 3 кг инъецируют 150 мкл папаина (1%) в физиологическом растворе, и получают модель артрита. Через день после инъекции папаина в суставную полость левого колена инъецируют 150 мкл раствора очищенного кератансульфаттетрасахарида (I) в ЗФР (1% раствор; 1,5 мг/сустав), который получен в примере 1 (далее означает здесь "стопа, обработанная кератансульфаттетрасахаридом (I)"), а в первый сустав инъецируют 150 мкл ЗФР (далее означает здесь "стопа, необработанная кератансульфаттетрасахаридом (I)"). В дальнейшем здесь кролики, которым вводили кератансульфаттетрасахарид (I), называются "обработанной группой". Кроликов, которые получили только инъекцию папаина (называемые далее контрольной группой), и кроликов, которым не давали инъекции папаина (далее называемые нормальной группой), также проверяют тем же способом, который описан далее.
Через семь суток после инъекции из суставной артерии берут образец крови и отделяют плазму, содержащую гепарин. После отбора крови кроликов препарируют и отделяют оба коленных сустава. Суставную полость промывают 2 мл физиологического раствора три раза, чтобы извлечь синовиальную жидкость. Определяют содержание кальция в плазме и в извлеченной синовиальной жидкости, и вычисляют объем синовиальной жидкости по следующей формуле:
Объем синовиальной жидкости (мкл/сустав) = количество кальция в извлеч. синов.жидк. (мкг/сустав)/содержание кальция в плазме (мкг/мл)
Результаты, полученные при описанном выше испытании, приводятся в табл. 6. В таблице "n" показывает число кроликов в каждой группе, использованных при эксперименте.
Объем синовиальной жидкости (мкл/сустав) = количество кальция в извлеч. синов.жидк. (мкг/сустав)/содержание кальция в плазме (мкг/мл)
Результаты, полученные при описанном выше испытании, приводятся в табл. 6. В таблице "n" показывает число кроликов в каждой группе, использованных при эксперименте.
Как видно из этих результатов, объем синовиальной жидкости в группе, обработанной кератансульфаттетрасахаридом (I) настоящего изобретения, значительно меньше, чем в контрольной группе, и, следовательно, подтверждается функция кератансульфаттетрасахарида (I) улучшать состояния при артрите.
(1-2) Противовоспалительное действие кератансульфаттетрасахарида на модели билатерального артрита при внутримышечном введении
Модель артрита получают по способу, описанному в (1-1), и через день после инъекции папаина в левую бедренную мышцу инъецируют 150 мкл раствора в ЗФР кератансульфаттетрасахарида (I) (1% раствор; 0,5 мг/кг массы), который получен в примере 1 (далее обозначается здесь как "группа, обработанная кератансульфаттетрасахаридом (I)"). В качестве контроля модели артрита инъецируют 150 мкл ЗФР вместо раствора кератансульфаттетрасахарида (I) в ЗФР, и таких кроликов далее называют контрольной группой. Кроликов, которым не давали инъекцию папаина (далее называемые нормальной группой), затем также проверяют тем же способом. Через семь суток после инъекции объем синовиальной жидкости определяют так же, как в разделе (1-1).
Модель артрита получают по способу, описанному в (1-1), и через день после инъекции папаина в левую бедренную мышцу инъецируют 150 мкл раствора в ЗФР кератансульфаттетрасахарида (I) (1% раствор; 0,5 мг/кг массы), который получен в примере 1 (далее обозначается здесь как "группа, обработанная кератансульфаттетрасахаридом (I)"). В качестве контроля модели артрита инъецируют 150 мкл ЗФР вместо раствора кератансульфаттетрасахарида (I) в ЗФР, и таких кроликов далее называют контрольной группой. Кроликов, которым не давали инъекцию папаина (далее называемые нормальной группой), затем также проверяют тем же способом. Через семь суток после инъекции объем синовиальной жидкости определяют так же, как в разделе (1-1).
Как видно из этих результатов, объем синовиальной жидкости в группе, обработанной кератансульфаттетрасахаридом (I) настоящего изобретения, значительно меньше, чем в контрольной группе, и, следовательно, подтверждается функция кератансульфаттетрасахарида (I) улучшать состояния при артрите.
(1-3) Противовоспалительное действие кератансульфаттетрасахарида на модели одностороннего артрита при внутримышечном введении
В суставные полости левого сустава белых японских кроликов (самки) массой 3 кг инъецируют 150 мкл папаина (1%) в физиологическом растворе, а правый сустав не обрабатывают и получают модель одностороннего артрита. Через день после инъекции папаина в левую бедренную мышцу инъецируют 150 мкл раствора очищенного кератансульфаттетрасахарида (I) в ЗФР (2, 1 и 0,5% раствор; 1,0, 0,5 и 0,25 мг/кг соответственно), который получен в примере 1 (далее эта группа называется здесь "группой, обработанная кератансульфаттетрасахаридом (I)"). В качестве контроля модели артрита инъецируют 150 мкл ЗФР вместо раствора кератансульфаттетрасахарида (I) в ЗФР, (далее эта группа называется здесь "группой, необработанная кератансульфаттетрасахаридом (I)"). Кроликов, которым не давали инъекцию папаина (далее называемые нормальной группой), затем также проверяют тем же способом. Через семь суток после инъекции вычисляют объем синовиальной жидкости таким же способом, как в разделе (1-1).
В суставные полости левого сустава белых японских кроликов (самки) массой 3 кг инъецируют 150 мкл папаина (1%) в физиологическом растворе, а правый сустав не обрабатывают и получают модель одностороннего артрита. Через день после инъекции папаина в левую бедренную мышцу инъецируют 150 мкл раствора очищенного кератансульфаттетрасахарида (I) в ЗФР (2, 1 и 0,5% раствор; 1,0, 0,5 и 0,25 мг/кг соответственно), который получен в примере 1 (далее эта группа называется здесь "группой, обработанная кератансульфаттетрасахаридом (I)"). В качестве контроля модели артрита инъецируют 150 мкл ЗФР вместо раствора кератансульфаттетрасахарида (I) в ЗФР, (далее эта группа называется здесь "группой, необработанная кератансульфаттетрасахаридом (I)"). Кроликов, которым не давали инъекцию папаина (далее называемые нормальной группой), затем также проверяют тем же способом. Через семь суток после инъекции вычисляют объем синовиальной жидкости таким же способом, как в разделе (1-1).
Результаты, полученные при описанном выше испытании, приводятся в табл. 8. В таблице "n" показывает число кроликов, использованных при эксперименте в каждой группе.
Как видно из этих результатов, объем синовиальной жидкости в группе, обработанной кератансульфаттетрасахаридом (I) настоящего изобретения, значительно меньше, чем в контрольной группе, и, следовательно, подтверждается функция кератансульфаттетрасахарида (I) улучшать состояния при артрите.
(1-4) Противовоспалительное действие различных кератансульфатолигосахаридов на модели одностороннего артрита при внутримышечном введении
Проверку осуществляют таким же способом, как в (1-3), за исключением того, что используют по 150 мкл растворов очищенных кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III) (1% растворы; 0,5 мг/кг), полученных в примере 1, в ЗФР. Результаты показаны на фиг. 5. На этой фигуре *, ** и *** представляют, что имеется значимое различие с р<0,05, р<0,01 и р<0,001 соответственно. В каждой группе для проверки берут по 10 кроликов.
Проверку осуществляют таким же способом, как в (1-3), за исключением того, что используют по 150 мкл растворов очищенных кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III) (1% растворы; 0,5 мг/кг), полученных в примере 1, в ЗФР. Результаты показаны на фиг. 5. На этой фигуре *, ** и *** представляют, что имеется значимое различие с р<0,05, р<0,01 и р<0,001 соответственно. В каждой группе для проверки берут по 10 кроликов.
Согласно этим результатам, количество синовиальной жидкости в любой из групп, обрабатываемых кератансульфаттетрасахаридом (I), кератансульфатпентасахаридом (II) и кератансульфатдисахаридом (III), значительно меньше, чем в контрольной группе, и, следовательно, подтверждается функция улучшения состояния при артрите для каждого из описанных выше кератансульфатолигосахаридов.
(2) Противовоспалительные испытания с измененной пассивной реакцией Артюса отека стопы у крыс
Действие кератансульфатолигосахаридов проверяют по измененной пассивной реакции Артюса отека стопы у крыс, которая представляет собой модель аллергического воспаления типа III. Для этого кроличью антиовальбуминную сыворотку вводят подкожно в подошвы стоп крысам, которым предварительно вводят испытываемые вещества, затем вводят овальбумин посредством инъекции в каудальную вену, чтобы вызвать воспаление (отек), и проверяют ингибирующее действие на отек испытываемых веществ.
Действие кератансульфатолигосахаридов проверяют по измененной пассивной реакции Артюса отека стопы у крыс, которая представляет собой модель аллергического воспаления типа III. Для этого кроличью антиовальбуминную сыворотку вводят подкожно в подошвы стоп крысам, которым предварительно вводят испытываемые вещества, затем вводят овальбумин посредством инъекции в каудальную вену, чтобы вызвать воспаление (отек), и проверяют ингибирующее действие на отек испытываемых веществ.
(Введение испытываемых веществ)
Самцов крыс Crj: SD в возрасте пяти недель выдерживают около 17 ч без пищи после недельного карантина и перед индуцированием воспаления вводят в качестве испытываемых веществ очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), который получен в примере 1, индометацин (Sigma; серия N 19F0018) или дексаметазон (Banyu Pharmaceutical; инъекция Decadron; серия 8D307P), или физиологический раствор (Otsuka Pharmaceutical; серия N КЗН72) как негативный контроль. При применении кератансульфаттетрасахарид (I) и дексаметазон растворяют в физиологическом растворе соответственно, а индометацин растворяют в 0,5% натрийкарбоксиметилцеллюлозе (CMC-Na; Wako Pure Chemical Industries; серия N PTN1418). Объем дозы составляет 0,5 мл на 100 г массы при каждом испытании. Что касается способа введения, то кератансульфаттетрасахарид (I), физиологический раствор и дексаметазон вводят через каудальную вену, а индометацин вводят перорально. Вещества, за исключением индометацина, вводят скрытно (blind method).
Самцов крыс Crj: SD в возрасте пяти недель выдерживают около 17 ч без пищи после недельного карантина и перед индуцированием воспаления вводят в качестве испытываемых веществ очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), который получен в примере 1, индометацин (Sigma; серия N 19F0018) или дексаметазон (Banyu Pharmaceutical; инъекция Decadron; серия 8D307P), или физиологический раствор (Otsuka Pharmaceutical; серия N КЗН72) как негативный контроль. При применении кератансульфаттетрасахарид (I) и дексаметазон растворяют в физиологическом растворе соответственно, а индометацин растворяют в 0,5% натрийкарбоксиметилцеллюлозе (CMC-Na; Wako Pure Chemical Industries; серия N PTN1418). Объем дозы составляет 0,5 мл на 100 г массы при каждом испытании. Что касается способа введения, то кератансульфаттетрасахарид (I), физиологический раствор и дексаметазон вводят через каудальную вену, а индометацин вводят перорально. Вещества, за исключением индометацина, вводят скрытно (blind method).
Расписание введения каждого испытываемого вещества приводится ниже. Каждая группа состоит из пяти животных.
(I) Введение за пять минут до индуцирования воспаления
(1) Физиологический раствор (негативный контроль)
(2) Кератансульфаттетрасахарид (I) 1 мг/кг
(3) Кератансульфаттетрасахарид (I) 3 мг/кг
(4) Кератансульфаттетрасахарид (I) 10 мг/кг
(II) Введение за 30 мин до индуцирования воспаления
(5) Индометацин (положительный контроль) 5 мг/кг
(III) Введение за три часа до индуцирования воспаления
(6) Кератансульфаттетрасахарид (I) 1 мг/кг
(7) Кератансульфаттетрасахарид (I) 3 мг/кг
(8) Кератансульфаттетрасахарид (I) 10 мг/кг
(9) Дексаметазон (положительный контроль) 1 мг/кг
(Индукция воспаления)
Каждой из крыс, описанных выше, вводят подкожно в подошвы стоп кроличью антиовальбуминную сыворотку, а затем посредством инъекции в каудальную вену вводят овальбумин, чтобы вызвать воспалительный отек стоп. Применяемую антисыворотку получают следующим образом. Кроликам в участки на спине инъецируют интрадермально 1 мл смешанных в равных частях раствора (эмульсии) физиологического раствора, содержащего 2% овальбумина (10 мг на животное, яичный альбумин 5 х Cryst, серия Р93601; Seikagaku Corporation) и полного адъюванта Фрейнда (FCA) один раз в неделю всего три раза для их сенсибилизации. Через 34 дня после последней сенсибилизации отбирают кровь и получают антисыворотку. Титр антител полученной антисыворотки определяют методом двойного слоя. А именно определение осуществляют с использованием реакции "белой" преципитации и антисыворотки, разбавленной физиологическим раствором, и физиологического раствора, содержащего 0,1% овальбумина (1 мг/мл) в качестве индикатора. В результате полученный титр антител антисыворотки составляет х 27.
(1) Физиологический раствор (негативный контроль)
(2) Кератансульфаттетрасахарид (I) 1 мг/кг
(3) Кератансульфаттетрасахарид (I) 3 мг/кг
(4) Кератансульфаттетрасахарид (I) 10 мг/кг
(II) Введение за 30 мин до индуцирования воспаления
(5) Индометацин (положительный контроль) 5 мг/кг
(III) Введение за три часа до индуцирования воспаления
(6) Кератансульфаттетрасахарид (I) 1 мг/кг
(7) Кератансульфаттетрасахарид (I) 3 мг/кг
(8) Кератансульфаттетрасахарид (I) 10 мг/кг
(9) Дексаметазон (положительный контроль) 1 мг/кг
(Индукция воспаления)
Каждой из крыс, описанных выше, вводят подкожно в подошвы стоп кроличью антиовальбуминную сыворотку, а затем посредством инъекции в каудальную вену вводят овальбумин, чтобы вызвать воспалительный отек стоп. Применяемую антисыворотку получают следующим образом. Кроликам в участки на спине инъецируют интрадермально 1 мл смешанных в равных частях раствора (эмульсии) физиологического раствора, содержащего 2% овальбумина (10 мг на животное, яичный альбумин 5 х Cryst, серия Р93601; Seikagaku Corporation) и полного адъюванта Фрейнда (FCA) один раз в неделю всего три раза для их сенсибилизации. Через 34 дня после последней сенсибилизации отбирают кровь и получают антисыворотку. Титр антител полученной антисыворотки определяют методом двойного слоя. А именно определение осуществляют с использованием реакции "белой" преципитации и антисыворотки, разбавленной физиологическим раствором, и физиологического раствора, содержащего 0,1% овальбумина (1 мг/мл) в качестве индикатора. В результате полученный титр антител антисыворотки составляет х 27.
Через промежуток времени, который устанавливают для каждой группы, крысам, которым вводили каждое из испытуемых веществ, вводят в подошвы левых задних стоп по 0,1 мл разбавленной в шесть раз антисыворотки. Затем в каудальную вену для индуцирования воспаления вводят физиологический раствор, содержащий 0,5% овальбумина (25 мг/5 мл/кг). В каждой группе с помощью устройства для определения объема стопы (TK-101, Unicom) определяют объем обработанной стопы перед тем, как вызвать воспаление и через один, два, три и четыре часа после индуцирования воспаления, и по отличию от объема до индуцирования отека получают степень развития отека стопы, и вычисляют степень ингибирования развития отека в группах, которым вводили испытываемые вещества, относительно контрольной группы. При каждой полученной степени развития отека различие между средними величинами проверяют с помощью критерия минимальном значимом различии. Степень развития отека стопы и степень ингибирования развития отека в каждой обработанной группе показаны в табл. 9, и степень развития отека стопы в обработанных группах, которым вещество вводили за пять минут и за три часа до индуцирования воспаления, показаны на фиг. 6 и на фиг. 7 соответственно. На этих фигурах * и ** показывают, что имеется значимое различие с р<0,05 и р<0,001 соответственно.
Результаты показывают, что степень развития отека через час в группе, обработанной физиологическим раствором, которая является негативным контролем, составляет 40,9%, в то время как в группах, обработанных кератансульфаттетрасахаридом (I), при его введении за пять минут до индуцирования воспаления, этот показатель составляет от 29,1 до 34,4%, и наблюдают значимое различие от группы, которой вводили 1 мг/кг и группы, обработанной 10 мг/кг. Хотя зависимой от дозы реакции не наблюдают при и через час после индуцирования воспаления, степень развития отека стопы в группе, обработанной 3 мг/кг, и в группе, обработанной 10 мг/кг, составляет 37,2 и 35,4% соответственно, что достаточно мало даже через четыре часа. В группах, обработанных кератансульфаттетрасахаридом (I) за три часа до индуцирования воспаления, хотя значимого различия не наблюдают через час после индуцирования воспаления, существенно низкие значения наблюдают в группе, обработанной 3 мг/кг, через два часа, в группе, обработанной 10 мг/кг, через три часа и в группе, обработанной 1 мг/кг, через четыре часа, и эти величины составляют 35,3, 41,5 и 38% соответственно. В группе, обработанной индометацином, существенно низкие величины наблюдают через два часа и через четыре часа. В группе, обработанной дексаметазоном, существенно низкие величины наблюдают в любой точке определения между одним и четырьмя часами после индуцирования воспаления.
Степень ингибирования развития отека в группе, обработанной индометацином, составляет от 9 до 17,5% через один час и через четыре часа, в то время как вычислено, что в группах, обработанных кератансульфаттетрасахаридом (I) при введении с опережением на пять минут, эти показатели составляют от 8,6 до 36,5%. В группах, обработанных кератансульфаттетрасахаридом (I) при введении с опережением на три часа, степень ингибирования составляет от -8,1 до 24,4%. С другой стороны, в группе, обработанной дексаметазоном, степень ингибирования развития отека стопы достигает 31,7-58,1%.
(3) Противовоспалительный тест на модели с плевритом, вызванным у крыс каррагинином
Действие кератансульфатолигосахаридов проверяют на крысиной модели каррагининового плеврита, которую обычно используют для оценки противовоспалительных средств.
Действие кератансульфатолигосахаридов проверяют на крысиной модели каррагининового плеврита, которую обычно используют для оценки противовоспалительных средств.
При этом испытании используют самок крыс S.D. (n=37) maccol 150-170 г. Растворяют λ каррагинин (Sigma) в физиологическом растворе до концентрации 2%, и раствор фильтруют через 0,8 мкм фильтр. Полученный раствор каррагинина вводят интраторакально в количестве 100 мкл/животное, и получают модель плеврита.
Крысам - моделям плеврита (n=19), описанным выше, вводят подкожно (s.c.) кератансульфаттетрасахарид (I), растворенный в ЗФР, при дозах 20 или 10 мг/кг. В качестве позитивного контроля восьми крысам, описанным выше, вводят подкожно стероид (дексаметазонацетат; Banyu Pharmaceutical) в количестве 150 мкг/кг, что составляет клиническую дозу. В качестве негативного контроля 10 крысам вводят подкожно ЗФР.
Каждое введение осуществляют сразу после введения каррагинина. Обработанные группы указываются в табл. 10.
Каждую крысу вскрывают через шесть часов после введения λ -каррагинина. Вскрывают полость грудной клетки у крыс и собирают сохранившийся плевральный выпот, используя 2-миллилитровый шприц с зондом. После этого внутреннюю часть полости грудной клетки обрабатывают 1 мл физиологического раствора и извлекают промывающий раствор. Определяют объем плеврального выпота, извлеченного шприцем, и с помощью автоматизированного цитометра определяют число лейкоцитов (число клеток) в плевральном выпоте. Результаты приводятся на фиг. 8 и фиг. 9 соответственно. На фигурах * и ** представляют, что имеется значимое различие с р<0,05 и р<0,01 соответственно (где "р" означает уровень значимости по критерию Дункана).
Как показано на фиг. 8, объем плеврального выпота в группе, обработанной 10 мг/кг кератансульфаттетрасахарида (I), значительно меньше, чем в группе негативного контроля, но почти такой же, как в группе, обработанной 20 мг/кг кератансульфаттетрасахарида (I) и, следовательно, не наблюдается зависимости от дозы. Количество плеврального выпота в группе, обработанной дексаметазонацетатом, значительно ниже количества в группе негативного контроля. Число лейкоцитов в плевральном выпоте в каждой из групп, обработанных 10 мг/кг и 20 мг/кг кератансульфаттетрасахарида (I), значительно меньше числа лейкоцитов в группе негативного контроля и наблюдается зависимое от дозы снижение числа лейкоцитов (см. фиг. 9). Число лейкоцитов в группе, обработанной дексаметазонацетатом, значительно ниже числа лейкоцитов в контрольной группе (см. фиг. 9).
Из описанных выше результатов следует, что подтверждается противовоспалительное действие кератансульфаттетрасахарида (I) в случае крысиной модели плеврита, вызванного каррагинином.
(4) Ингибирующее действие на генерацию активного кислорода (O2 -) в нейтрофилах морской свинки
Самкам морских свинок Hartley в возрасте пяти недель (приобретены у Japan SLC) вводят интраперитонеально 20 мл 0,2% водного раствора гликогена (тип II; Oyster; Sigma), растворенного в физиологическом растворе, который предварительно стерилизуют в автоклаве. Морских свинок умерщвляют посредством кровоизвлечения через 16 часов после обработки и впрыскивают в брюшную полость 20 мл физиологического раствора, содержащего гепарин при концентрации 10 Е/мл, чтобы извлечь перитонеальный эксудат. Все дальнейшие операции осуществляют при охлаждении смесью воды со льдом, за исключением инкубации. Извлеченный эксудат центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, полученный осадок гемолизуют очищенной водой в течение 30 с и возвращают в изотоническое состояние раствором Хэнкса при двойной концентрации (не содержит фенолового красного Nissui Seiyaku), а затем центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок суспендируют в растворе Хэнкса и центрифугируют, и операции повторяют еще раз, чтобы получить нейтрофилы. Собранные нейтрофилы морских свинок суспендируют в растворе Хэнкса, определяют число лейкоцитов в суспензии с помощью цитометра (система К-2000; Toa lyo Denshi Co. ) и суспензию, разбавленную раствором Хэнкса до концентрации 2 х 106 клеток/мл, используют при определении в качестве суспензии клеток. После смешивания 1 мл суспензии клеток и 10 мкл очищенного кератансульфатолигосахарида (кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) или кератансульфатдисахарида (III)), полученного в описанном выше примере 1, смесь предварительно инкубируют при 37oC в течение часа. После этого к смеси добавляют 50 мкл 1,6 мМ цитохрома с (тип III; Horse Heart; Sigma) и 10 мкл 100 мкМ N-формил-Met-Leu-Phe (далее здесь иногда называемого "FMLP", Sigma) в указанном порядке и перемешивают. Затем смесь инкубируют при 37oC в течение 10 мин, охлаждают на льду, чтобы остановить реакцию, и центрифугируют при 3000 об/мин в течение пяти минут.
Самкам морских свинок Hartley в возрасте пяти недель (приобретены у Japan SLC) вводят интраперитонеально 20 мл 0,2% водного раствора гликогена (тип II; Oyster; Sigma), растворенного в физиологическом растворе, который предварительно стерилизуют в автоклаве. Морских свинок умерщвляют посредством кровоизвлечения через 16 часов после обработки и впрыскивают в брюшную полость 20 мл физиологического раствора, содержащего гепарин при концентрации 10 Е/мл, чтобы извлечь перитонеальный эксудат. Все дальнейшие операции осуществляют при охлаждении смесью воды со льдом, за исключением инкубации. Извлеченный эксудат центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, полученный осадок гемолизуют очищенной водой в течение 30 с и возвращают в изотоническое состояние раствором Хэнкса при двойной концентрации (не содержит фенолового красного Nissui Seiyaku), а затем центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок суспендируют в растворе Хэнкса и центрифугируют, и операции повторяют еще раз, чтобы получить нейтрофилы. Собранные нейтрофилы морских свинок суспендируют в растворе Хэнкса, определяют число лейкоцитов в суспензии с помощью цитометра (система К-2000; Toa lyo Denshi Co. ) и суспензию, разбавленную раствором Хэнкса до концентрации 2 х 106 клеток/мл, используют при определении в качестве суспензии клеток. После смешивания 1 мл суспензии клеток и 10 мкл очищенного кератансульфатолигосахарида (кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) или кератансульфатдисахарида (III)), полученного в описанном выше примере 1, смесь предварительно инкубируют при 37oC в течение часа. После этого к смеси добавляют 50 мкл 1,6 мМ цитохрома с (тип III; Horse Heart; Sigma) и 10 мкл 100 мкМ N-формил-Met-Leu-Phe (далее здесь иногда называемого "FMLP", Sigma) в указанном порядке и перемешивают. Затем смесь инкубируют при 37oC в течение 10 мин, охлаждают на льду, чтобы остановить реакцию, и центрифугируют при 3000 об/мин в течение пяти минут.
Супернатант, полученный при центрифугировании, отделяют и определяют его поглощение при 550 нм, и оценивают количество восстанавливающего цитохрома C на 2 х 106 клеток после инкубации в течение 10 мин. Количество восстанавливающего цитохрома C возрастает при генерации активного кислорода (O ). При определении образец с добавлением рекомбинантной человеческой SOD (супероксидисмутаза) до конечной концентрации 20 мкг/мл используют в качестве контроля. При эксперименте используют независимо шесть морских свинок. Долю количества восстанавливающего цитохрома C в каждой группе, получившей кератансульфатолигосахарид, вычисляют, принимая количество восстанавливающего цитохрома C при контроле (без обработки кератансульфатолигосахаридом) за 100% и вычисляют разницу от количества в контрольной группе как степень ингибирования (%) генерации активного кислорода (O ) и, кроме того, получают средние значения в каждом эксперименте. Результаты представлены на фиг. 10. Концентрация кератансульфатолигосахарида на этой фигуре означает конечную концентрацию.
Результаты показывают, что кератансульфаттетрасахарид (I) при концентрации 0,01, 0,1 и 1,0 мг/мл заметно ингибирует генерацию активного кислорода (O ) в зависимости от концентрации и это обстоятельство подтверждает наличие у кератансульфаттетрасахарида (I) противовоспалительной функции. Также в небольшой степени наблюдали функцию ингибирования генерации активного кислорода (O ) у кератансульфатпентасахарида (II) или кератансульфатдисахарида (III). Эти результаты навели на мысль, что кератансульфатолигосахариды проявляют противовоспалительную функцию посредством ингибирования генерации активного кислорода (O ) в нейтрофилах.
(Противоаллергическая функция)
Различные кератансульфатолигосахариды закапывают в глаза морским свинкам, у которых вызван аллергический конъюнктивит, чтобы проверить их действие.
Различные кератансульфатолигосахариды закапывают в глаза морским свинкам, у которых вызван аллергический конъюнктивит, чтобы проверить их действие.
(1) Действие кератансульфаттетрасахарида (I) на аллергический конъюнктивит
Толуолдиизоцианат (называемый здесь далее TDI) растворяют в этилацетате до концентрации 10%. В билатеральные преддверия носа 10 самкам морских свинок Hartley, массой порядка 900-1000 г, подают один раз в сутки в течение пяти суток 10% TDI (10 мкл/животное), полученный как описано выше, и получают модели, сенсибилизированные TDI. Раствор в ЗФР кератансульфаттетрасахарида (I), полученного в примере 1 (100 мг/мл), закапывают сенсибилизированным TDI моделям в левый глаз, а в правый глаз закапывают ЗФР в качестве контроля. Доза закапывания составляет одну каплю (48±4,6 мкл (ст. откл., S. D.)) при каждом закапывании в глаза. Через 10 мин в оба глаза закапывают 6,5 мкл 10% TDI, чтобы вызвать конъюнктивит. После выдержки в течение пяти минут в левый глаз снова закапывают раствор в ЗФР кератансульфаттетрасахарида (I) (100 мг/мл), а в правый глаз закапывают ЗФР. Через 15 мин проверяют оба глаза. Оценивают степень развития конъюнктивита по трем показателям: гиперемия, отек и слезоотделение, четырьмя оценками - 0, +1, +2 и +3. В результате этой проверки получают средние оценки и стандартные отклонения, приведенные на фиг. 11. На этой фигуре * означает, что имеется значимое различие с р<0,05 (где "р" означает уровень значимости по критерию χ2).
Толуолдиизоцианат (называемый здесь далее TDI) растворяют в этилацетате до концентрации 10%. В билатеральные преддверия носа 10 самкам морских свинок Hartley, массой порядка 900-1000 г, подают один раз в сутки в течение пяти суток 10% TDI (10 мкл/животное), полученный как описано выше, и получают модели, сенсибилизированные TDI. Раствор в ЗФР кератансульфаттетрасахарида (I), полученного в примере 1 (100 мг/мл), закапывают сенсибилизированным TDI моделям в левый глаз, а в правый глаз закапывают ЗФР в качестве контроля. Доза закапывания составляет одну каплю (48±4,6 мкл (ст. откл., S. D.)) при каждом закапывании в глаза. Через 10 мин в оба глаза закапывают 6,5 мкл 10% TDI, чтобы вызвать конъюнктивит. После выдержки в течение пяти минут в левый глаз снова закапывают раствор в ЗФР кератансульфаттетрасахарида (I) (100 мг/мл), а в правый глаз закапывают ЗФР. Через 15 мин проверяют оба глаза. Оценивают степень развития конъюнктивита по трем показателям: гиперемия, отек и слезоотделение, четырьмя оценками - 0, +1, +2 и +3. В результате этой проверки получают средние оценки и стандартные отклонения, приведенные на фиг. 11. На этой фигуре * означает, что имеется значимое различие с р<0,05 (где "р" означает уровень значимости по критерию χ2).
Из результатов следует, что кератансульфаттетрасахарид (I) имеет свойство демонстрировать ингибирование всех трех явлений: гиперемии, отека и слезоотделения и в особенности существенно уменьшается отек по сравнению с контрольными животными.
(2) Действие различных кератансульфатолигосахаридов на аллергический конъюнктивит
Растворы в ЗФР, полученных в описанном выше примере 1, очищенных кератансульфатдисахарида (III), кератансульфаттетрасахарида (I) и кератансульфатпентасахарида (II) (6,0 мг/мл соответственно) как испытываемых веществ соответственно закапывают в левый глаз сенсибилизированных TDI моделей (по 10 животных в каждой группе), которые получают тем же способом, как описано выше в (1), а в правый глаз в качестве контроля закапывают ЗФР. Развитие конъюнктивита оценивают так же, как описано выше в (1). В результате этой проверки получают средние значения для точек и стандартные отклонения, показанные на фиг. 12. На этой фигуре * означает, что имеется значимое различие с р<0,05 (где "р" означает уровень значимости по критерию χ2).
Растворы в ЗФР, полученных в описанном выше примере 1, очищенных кератансульфатдисахарида (III), кератансульфаттетрасахарида (I) и кератансульфатпентасахарида (II) (6,0 мг/мл соответственно) как испытываемых веществ соответственно закапывают в левый глаз сенсибилизированных TDI моделей (по 10 животных в каждой группе), которые получают тем же способом, как описано выше в (1), а в правый глаз в качестве контроля закапывают ЗФР. Развитие конъюнктивита оценивают так же, как описано выше в (1). В результате этой проверки получают средние значения для точек и стандартные отклонения, показанные на фиг. 12. На этой фигуре * означает, что имеется значимое различие с р<0,05 (где "р" означает уровень значимости по критерию χ2).
В результате обнаруживается, что любое вещество из числа кератансульфатдисахарида (III), кератансульфаттетрасахарида (I) и кератансульфатпентасахарида (II) имеет свойство показывать ослабление всех проявлений гиперемии, отека и слезоотделения и в особенности подтверждено, что кератансульфаттетрасахарид (I) обнаруживает значительное ингибирующее действие на отек.
(3) Действие кератансульфаттетрасахарида (I) в различных концентрациях на аллергический конъюнктивит
Раствор в ЗФР, содержащий очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), полученный в описанном выше примере 1, при различных концентрациях (6, 3, 1,5 или 0,75 мг/мл) закапывают сенсибилизированным TDI моделям по 10 животных в каждой группе, которых подготавливают таким же способом, как описано выше в (1) соответственно в левый глаз, а в правый глаз закапывают ЗФР в качестве контроля. Развитие конъюнктивита оценивают так же, как описано выше в (1). В результате этой проверки получают средние значения для точек и стандартные отклонения, показанные на фиг. 13. На этой фигуре * означает, что имеется значимое различие с р<0,05 (где "р" означает уровень значимости по критерию χ2).
Раствор в ЗФР, содержащий очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), полученный в описанном выше примере 1, при различных концентрациях (6, 3, 1,5 или 0,75 мг/мл) закапывают сенсибилизированным TDI моделям по 10 животных в каждой группе, которых подготавливают таким же способом, как описано выше в (1) соответственно в левый глаз, а в правый глаз закапывают ЗФР в качестве контроля. Развитие конъюнктивита оценивают так же, как описано выше в (1). В результате этой проверки получают средние значения для точек и стандартные отклонения, показанные на фиг. 13. На этой фигуре * означает, что имеется значимое различие с р<0,05 (где "р" означает уровень значимости по критерию χ2).
В результате обнаруживается, что растворы кератансульфаттетрасахарида (I) в ЗФР при всех концентрациях имеют свойство обнаруживать ингибирование всех проявлений гиперемии, отека и слезоотделения и в особенности эти растворы при концентрации 6, 3 и 1,5 мг/мл обнаруживают ингибирующее действие на отек.
"Иммуномодулирующая функция, функция индуцирования клеточной дифференцировки и функция индуцирования апоптоза"
Действие кератансульфатолигосахаридов проверяют на мышах MRL, которые представляют мышиную модель аутоиммунного заболевания.
Действие кератансульфатолигосахаридов проверяют на мышах MRL, которые представляют мышиную модель аутоиммунного заболевания.
(1) Подавляющее действие на массу лимфоузлов
(1-1) Испытания при повторном внутримышечном введении кератансульфаттетрасахарида (I) мышам MRL в течение четырех недель
Раствор в ЗФР очищенного кератансульфаттетрасахарида (I) (100 мг/шт), который получен в описанном выше примере 1, при дозе 10 мг/кг массы (это называется здесь далее обработанной группой) и ЗФР в качестве контроля инъецируют внутримышечно, соответственно в область бедра мышам MRL-lpr/lpr пять раз в неделю в течение четырех недель. После этого мышей вскрывают и определяют массу селезенки и мезентериальных лимфатических узлов, и получают среднее значение массы. Результаты и стандартные отклонения приводятся в табл. 11. В этой таблице "n" показывает число использованных мышей.
(1-1) Испытания при повторном внутримышечном введении кератансульфаттетрасахарида (I) мышам MRL в течение четырех недель
Раствор в ЗФР очищенного кератансульфаттетрасахарида (I) (100 мг/шт), который получен в описанном выше примере 1, при дозе 10 мг/кг массы (это называется здесь далее обработанной группой) и ЗФР в качестве контроля инъецируют внутримышечно, соответственно в область бедра мышам MRL-lpr/lpr пять раз в неделю в течение четырех недель. После этого мышей вскрывают и определяют массу селезенки и мезентериальных лимфатических узлов, и получают среднее значение массы. Результаты и стандартные отклонения приводятся в табл. 11. В этой таблице "n" показывает число использованных мышей.
В результате получают, что в группе, которой инъецировали кератансульфаттетрасахарид (I), наблюдается тенденция подавления возрастания селезенки и мезентериальных лимфатических узлов и, следовательно, это обстоятельство подтверждает иммуномодулирующую функцию кератансульфаттетрасахарида (I).
(1-2) Испытания при повторном внутримышечном введении кератансульфатдисахарида (III) мышам MRL в течение 28 сут.
Раствор в ЗФР очищенного кератансульфатдисахарида (III), который получен в описанном выше примере 1, при дозе 1, 5 или 25 мг/кг массы (что называется здесь далее группой, обработанной 1 мг/кг, группой, обработанной 5 мг/кг, и группой, обработанной 25 мг/кг соответственно) и ЗФР в качестве контроля инъецируют внутримышечно, соответственно в область бедра мышам MRL-lpr/lpr семь раз в неделю в течение четырех недель. После этого мышей вскрывают и определяют массу подчелюстных лимфатических узлов, и получают среднее значение массы. Результаты и стандартные отклонения приводятся на фиг. 14. В каждой группе используют по шесть мышей. Кроме того, на этой фигуре * показывает, что есть значимое различие с р<0,05 (где "р" означает уровень значимости по множественному сравнительному критерию Bonferroni).
В результате получают, что в группах, обработанных кератансульфатдисахаридом (III), наблюдается при сравнении с контрольной группой эффект подавления возрастания массы подчелюстных лимфатических узлов при любой дозе, особенно при вводимой дозе 5 мг/кг и, следовательно, это обстоятельство подтверждает иммуномодулирующую функцию кератансульфатдисахарида (III).
(1-3) Испытания при повторном внутримышечном введении кератансульфатдисахарида (III) мышам MRL в течение 56 сут.
Раствор в ЗФР очищенного кератансульфатдисахарида (III), который получен в описанном выше примере 1, при дозе 2,5, 5 или 10 мг/кг массы (что называется здесь далее группой, обработанной 2,5 мг/кг, группой, обработанной 5 мг/кг, и группой, обработанной 10 мг/кг соответственно) и ЗФР в качестве контроля (что иногда называется здесь контрольной группой) инъецируют внутримышечно, соответственно в область бедра мышам MRL-lpr/lpr семь раз в неделю в течение восьми недель. После этого мышей вскрывают и определяют массу мезентериальных лимфатических узлов и подчелюстных лимфатических узлов, и получают средние значения массы соответственно. Результаты, относящиеся к мезентериальным лимфатическим узлам и подчелюстным лимфатическим узлам, приводятся на фиг. 15 и 16 соответственно, вместе со стандартными отклонениями. В каждой группе используют по семь мышей.
В результате в группе, обработанной 2,5 мг/мл кератансульфатдисахарида (III), наблюдают эффект подавления возрастания массы мезентериальных лимфатических узлов, а в группе, обработанной 10 мг/кг, наблюдают подавление возрастания массы мезентериальных и подчелюстных лимфатических узлов и, следовательно, эти обстоятельства подтверждают иммуномодулирующую функцию кератансульфатдисахарида (III).
(2) Функция индуцирования клеточной дифференцировки
(2-1) Анализ индукции клеточной дифференцировки с использованием в качестве индикатора концентрации окрашивания клеток
Раствор в ЗФР очищенного кератансульфатдисахарида (III), который получен в описанном выше примере 1, при дозе 1, 5 или 25 мг/кг массы (что называется здесь далее группой, обработанной 1 мг/кг, группой, обработанной 5 мг/кг, и группой, обработанной 25 мг/кг соответственно) и ЗФР в качестве контроля (что иногда называется здесь контрольной группой) инъецируют внутримышечно, соответственно в область бедра мышам MRL-lpr/lpr семь раз в неделю в течение четырех недель. После этого мышей вскрывают и готовят образцы срезов (Не - окрашивание) мезентериальных лимфатических узлов и подчелюстных лимфатических узлов. Анализируют концентрации окрашивания на единицу площади образцов с помощью анализатора изображения (PIAS). В случае недифференцированных клеток концентрация окрашивания на единицу площади мала из-за высокой доли цитоплазмы и ядра окрашены плохо. В случае дифференцированных клеток концентрация на единицу площади высокая вследствие высокой доли ядер и окрашивание плотное.
(2-1) Анализ индукции клеточной дифференцировки с использованием в качестве индикатора концентрации окрашивания клеток
Раствор в ЗФР очищенного кератансульфатдисахарида (III), который получен в описанном выше примере 1, при дозе 1, 5 или 25 мг/кг массы (что называется здесь далее группой, обработанной 1 мг/кг, группой, обработанной 5 мг/кг, и группой, обработанной 25 мг/кг соответственно) и ЗФР в качестве контроля (что иногда называется здесь контрольной группой) инъецируют внутримышечно, соответственно в область бедра мышам MRL-lpr/lpr семь раз в неделю в течение четырех недель. После этого мышей вскрывают и готовят образцы срезов (Не - окрашивание) мезентериальных лимфатических узлов и подчелюстных лимфатических узлов. Анализируют концентрации окрашивания на единицу площади образцов с помощью анализатора изображения (PIAS). В случае недифференцированных клеток концентрация окрашивания на единицу площади мала из-за высокой доли цитоплазмы и ядра окрашены плохо. В случае дифференцированных клеток концентрация на единицу площади высокая вследствие высокой доли ядер и окрашивание плотное.
Результаты анализа мезентериальных лимфатических узлов и подчелюстных лимфатических узлов приводятся на фиг. 17 и 18 соответственно. На этих фигурах ** означает, что имеется значимое различие с р<0,01 (где "р" означает уровень значимости по множественному сравнительному критерию Bonferroni). В каждой группе использовали шесть мышей.
В результате в группе, обработанной кератансульфатдисахаридом (III), наблюдают возрастание концентрации окрашивания на единицу площади (уменьшение относительной освещенности) при любой дозе, а в особенности в группе, обработанной 5 мг/кг, и в группе, обработанной 25 мг/кг, концентрации окрашивания существенно возрастают при сравнении с контрольной группой. Это обстоятельство указывает на увеличение количества дифференцированных клеток благодаря кератансульфатдисахариду (III), и предполагают у кератансульфатдисахарида (III) функцию индуцирования клеточной дифференцировки.
(2-2) Анализ индукции клеточной дифференцировки с использованием в качестве индикатора лимфоцитных поверхностных антигенов лимфатических узлов
Раствор в ЗФР очищенного кератансульфатдисахарида (III), который получен в описанном выше примере 1, при дозе 2,5, 5 или 10 мг/кг массы (что называется здесь далее группой, обработанной 2,5 мг/кг, группой, обработанной 5 мг/кг, и группой, обработанной 10 мг/кг соответственно) и ЗФР в качестве контроля (что иногда называется здесь контрольной группой) инъецируют внутримышечно, соответственно в область бедра мышам MRL-lpr/lpr семь раз в неделю в течение восьми недель. После этого мышей вскрывают и лимфатические узлы измельчают на клеточном фильтре (Falcon 2350), чтобы получить лимфоциты. Лимфоциты, полученные от каждой группы, подвергают двойной окраске иммунным методом антителом против CD3 (Seikagaku Corporation) и антителом против CD4 (Pharminjen), антителом против CD3 и антителом против CD8a (Pharminjen), и антителом против CD3 и антителом против В220 (Pharminjen) соответственно. Поверхностные антигены клеток CD3, CD4 и CD8a являются клеточными поверхностными антигенами, которые экспрессируются на Т-клетках, а В220 экспрессируются на В-клетках. Известно, что никакой экспрессии этих клеточных поверхностных антигенов не наблюдается на нуль-лимфоцитах.
Раствор в ЗФР очищенного кератансульфатдисахарида (III), который получен в описанном выше примере 1, при дозе 2,5, 5 или 10 мг/кг массы (что называется здесь далее группой, обработанной 2,5 мг/кг, группой, обработанной 5 мг/кг, и группой, обработанной 10 мг/кг соответственно) и ЗФР в качестве контроля (что иногда называется здесь контрольной группой) инъецируют внутримышечно, соответственно в область бедра мышам MRL-lpr/lpr семь раз в неделю в течение восьми недель. После этого мышей вскрывают и лимфатические узлы измельчают на клеточном фильтре (Falcon 2350), чтобы получить лимфоциты. Лимфоциты, полученные от каждой группы, подвергают двойной окраске иммунным методом антителом против CD3 (Seikagaku Corporation) и антителом против CD4 (Pharminjen), антителом против CD3 и антителом против CD8a (Pharminjen), и антителом против CD3 и антителом против В220 (Pharminjen) соответственно. Поверхностные антигены клеток CD3, CD4 и CD8a являются клеточными поверхностными антигенами, которые экспрессируются на Т-клетках, а В220 экспрессируются на В-клетках. Известно, что никакой экспрессии этих клеточных поверхностных антигенов не наблюдается на нуль-лимфоцитах.
Доля (%) позитивных клеток CD3 и CD4 (далее иногда обозначаемых как "CD3+CD4+клетки"; главным образом, хелперные Т-клетки) от всех лимфоцитов и стандартные отклонения показаны на фиг. 19, доля позитивных клеток CD3 и CD8a (далее иногда обозначаемых как "CD3+CD8a+клетки"; главным образом, супрессорные Т-клетки и цитотоксические Т-клетки) и стандартные отклонения показаны на фиг. 20, и доля позитивных клеток CD3 и В220 (далее иногда обозначаемых как "CD3+В220+клетки"; аномальные Т-клетки, имеющие поверхностные антигены В-клеток) и стандартные отклонения показаны на фиг. 21. На этих фигурах * показывает, что имеется значимое различие с р<0,05 (где "р" означает уровень значимости по множественному сравнительному критерию Ryan).
Как видно из фиг. 19, доля CD3+CD4+клеток в группе, обработанной 10 мг/кг кератансульфатдисахарид (III), существенно возрастает по отношению к контрольной группе, группе, обработанной 2,5 мг/кг и группе, обработанной 5 мг/кг. Это указывает на дифференцировку нуль-лимфоцитов в CD3+CD4+клетках при введении адекватного количества кератансульфатдисахарида (III).
Как видно из фиг. 20, доля CD3+CD8а+клеток в группе, обработанной 10 мг/кг кератансульфатдисахарида (III), возрастает по отношению к контрольной группе, группе, обработанной 2,5 мг/кг, и группе, обработанной 5 мг/кг. Это указывает на дифференцировку нуль-лимфоцитов в CD3+CD8a+клетках при введении адекватного количества кератансульфатдисахарида (III).
Как видно из фиг. 21, доля CD3+В220+клеток в группе, обработанной 10 мг/кг кератансульфатдисахарида (III), уменьшается по отношению к контрольной группе, группе, обработанной 2,5 мг/кг, и группе, обработанной 5 мг/кг. Это указывает на исчезновение CD3+В220+клеток, которые являются аномальными, при введении адекватного количества кератансульфатдисахарида (III) и подтверждает индукцию дифференцировки в нормальных лимфоцитах. Эти результаты предполагают функцию индуцирования клеточной дифференцировки у количества кератансульфатдисахарида (III).
(3) Функция индуцирования апоптоза
Раствор в ЗФР очищенного кератансульфатдисахарида (III), который получен в описанном выше примере 1, при дозе 1 мг/кг, 5 мг/кг или 25 мг/кг массы (что называется здесь далее группой, обработанной 1 мг/кг, группой, обработанной 5 мг/кг, и группой, обработанной 25 мг/кг соответственно) и ЗФР в качестве контроля (что иногда называется здесь контрольной группой) инъецируют внутримышечно, соответственно в область бедра мышам MRL-lpr/lpr семь раз в неделю в течение четырех недель. После этого мышей вскрывают и готовят образцы срезов подчелюстных лимфатических узлов, окрашенных по методу Gavrieli et al.,; Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) - mediated nick end labeling method; (J. Cell Biol., 119, 493-501 (1992)). При этом методе окрашивания клетки с индуцированным апоптозом можно определить с помощью обнаружения концов фрагментированной ДНК. Полученные образцы наблюдают с помощью светового микроскопа и определяют число окрашенных клеток (клетки с клетки с индуцированным апоптозом; далее иногда называются здесь апоптозными клетками) на единицу площади. Результаты и стандартные отклонения приводятся на фиг. 22. На этих фигурах * и ** означают, что имеется значимое различие с р<0,05 и р<0,01 соответственно (где "р" означает уровень значимости по множественному сравнительному критерию Bonferroni). В каждой группе используют по шесть мышей.
Раствор в ЗФР очищенного кератансульфатдисахарида (III), который получен в описанном выше примере 1, при дозе 1 мг/кг, 5 мг/кг или 25 мг/кг массы (что называется здесь далее группой, обработанной 1 мг/кг, группой, обработанной 5 мг/кг, и группой, обработанной 25 мг/кг соответственно) и ЗФР в качестве контроля (что иногда называется здесь контрольной группой) инъецируют внутримышечно, соответственно в область бедра мышам MRL-lpr/lpr семь раз в неделю в течение четырех недель. После этого мышей вскрывают и готовят образцы срезов подчелюстных лимфатических узлов, окрашенных по методу Gavrieli et al.,; Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) - mediated nick end labeling method; (J. Cell Biol., 119, 493-501 (1992)). При этом методе окрашивания клетки с индуцированным апоптозом можно определить с помощью обнаружения концов фрагментированной ДНК. Полученные образцы наблюдают с помощью светового микроскопа и определяют число окрашенных клеток (клетки с клетки с индуцированным апоптозом; далее иногда называются здесь апоптозными клетками) на единицу площади. Результаты и стандартные отклонения приводятся на фиг. 22. На этих фигурах * и ** означают, что имеется значимое различие с р<0,05 и р<0,01 соответственно (где "р" означает уровень значимости по множественному сравнительному критерию Bonferroni). В каждой группе используют по шесть мышей.
В результате наблюдают возрастание числа апоптозных клеток в группах, обработанных кератансульфатдисахаридом (III), при любой дозе и в группе, обработанной 5 мг/кг, в особенности число апоптозных клеток возрастает существенно по сравнению с контрольной группой.
Кроме того, готовят образцы срезов (Не - окрашивание) подчелюстных лимфатических узлов мышей каждой группы и в световом микроскопе наблюдают наличие апоптозных тел в группах, обработанных кератансульфатдисахаридом (III), при любой дозе.
Эти результаты предполагают функцию индуцирования апоптоза у кератансульфатдисахарида (III).
Описанные выше результаты подтверждают иммуномодулирующую функцию, функцию индуцирования клеточной дифференцировки и функцию индуцирования апоптоза кератансульфатолигосахаридов.
Пример 3. Мази
Следуя традиционному методу, очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), полученный в примере 1, растворяют в гидрофильной мази, фармакопея Японии, при концентрации 10 мг/мл и получают мазь. Эту мазь можно применять как в качестве противовоспалительного средства, так и в качестве противоаллергического средства.
Следуя традиционному методу, очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), полученный в примере 1, растворяют в гидрофильной мази, фармакопея Японии, при концентрации 10 мг/мл и получают мазь. Эту мазь можно применять как в качестве противовоспалительного средства, так и в качестве противоаллергического средства.
Пример 4. Глазные капли
Следуя традиционному методу, очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), полученный в примере 1, и гиалуронат натрия растворяют в физиологическом растворе с pH 6,8-7,6, установленным фосфатом при концентрациях 10 и 2 мг/мл соответственно, и получают глазные капли. Эти глазные капли можно применять в качестве противовоспалительного средства и противоаллергического средства.
Следуя традиционному методу, очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), полученный в примере 1, и гиалуронат натрия растворяют в физиологическом растворе с pH 6,8-7,6, установленным фосфатом при концентрациях 10 и 2 мг/мл соответственно, и получают глазные капли. Эти глазные капли можно применять в качестве противовоспалительного средства и противоаллергического средства.
Пример 5. Препарат с липосомным включением
Очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), полученный в примере, растворяют при концентрации 10 мг/мл в липосомном включении (Aquasome LA; Nikko Chemicals), содержащем лецитин, и подвергают воздействию ультразвука, чтобы получить клатрат. Это липосомное включение можно применять в качестве любого средства из числа противовоспалительного средства, противоаллергического средства, иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки и индуктора апоптоза.
Очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), полученный в примере, растворяют при концентрации 10 мг/мл в липосомном включении (Aquasome LA; Nikko Chemicals), содержащем лецитин, и подвергают воздействию ультразвука, чтобы получить клатрат. Это липосомное включение можно применять в качестве любого средства из числа противовоспалительного средства, противоаллергического средства, иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки и индуктора апоптоза.
Пример 6
Инъекции
Следуя традиционному методу, очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), полученный в примере 1, растворяют в физиологическом растворе с pH 6,8-7,6, установленным фосфатом, при концентрации 10 мг/мл и раствор фильтруют в асептических условиях через 0,22 мкм фильтр и получают раствор для инъекции. Этот раствор для инъекции можно применять в качестве любого из числа противовоспалительного средства, противоаллергического средства, иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки и индуктора апоптоза.
Инъекции
Следуя традиционному методу, очищенный кератансульфаттетрасахарид (I), полученный в примере 1, растворяют в физиологическом растворе с pH 6,8-7,6, установленным фосфатом, при концентрации 10 мг/мл и раствор фильтруют в асептических условиях через 0,22 мкм фильтр и получают раствор для инъекции. Этот раствор для инъекции можно применять в качестве любого из числа противовоспалительного средства, противоаллергического средства, иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки и индуктора апоптоза.
Промышленная применимость
Фракции очищенных высокосульфатированных кератансульфатолигосахаридов настоящего изобретения имеют высокую степень очистки и не содержат по существу эндотоксинов, нуклеиновых кислот, белка протеазы и других гликозаминогликанов, за исключением описанных выше олигосахаридов и, следовательно, могут использоваться в качестве фармацевтических препаратов, например, нового противовоспалительного средства.
Фракции очищенных высокосульфатированных кератансульфатолигосахаридов настоящего изобретения имеют высокую степень очистки и не содержат по существу эндотоксинов, нуклеиновых кислот, белка протеазы и других гликозаминогликанов, за исключением описанных выше олигосахаридов и, следовательно, могут использоваться в качестве фармацевтических препаратов, например, нового противовоспалительного средства.
Claims (21)
1. Фармацевтическая композиция, обладающая противовоспалительным, противоаллергическим, иммуномодулирующим, индуцирующим апоптоз и клеточную дифференцировку действием, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и в качестве активного ингредиента - эффективное количество кератансульфатолигосахарида с двумя-пятью сахаридными звеньями, сульфатированным N-ацетилглюкозамином на своем редуцирующем конце, с сульфатированным N-ацетиллактозаминным звеном, необязательно содержащим сиаловую кислоту и/или фукозу, имеющего, по меньшей мере, две сульфатированных гидроксильных группы в молекуле, и/или его фармацевтически приемлемой соли.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, обладающая противовоспалительным действием.
3. Фармацевтическая композиция по п. 1 или 2, где указанный кератансульфатолигосахарид содержит в качестве составного ингредиента, по меньшей мере, дисахарид формулы
Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ac представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ac представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
4. Фармацевтическая композиция по п.3, где указанный кератансульфатолигосахарид выбран из группы, включающей тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой I трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой II, и дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой III
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)βl-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)βl-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)βl-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)βl-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
5. Фармацевтическая композиция по п.1, обладающая противоаллергическим действием.
6. Фармацевтическая композиция по п.5, где указанный кератансульфатолигосахарид содержит в качестве составного ингредиента, по меньшей мере, дисахарид формулы
Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ас представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ас представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
7. Фармацевтическая композиция по п.6, где указанный кератансульфатолигосахарид выбран из группы, включающей тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой I, трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой II, и дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой III
Gal(6S)β1-4GlcNAс(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
Gal(6S)β1-4GlcNAс(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
8. Фармацевтическая композиция по п.1, обладающая иммуномодулирующим действием.
9. Фармацевтическая композиция по п.8, где указанный кератансульфатолигосахарид содержит в качестве составного ингредиента, по меньшей мере, дисахарид формулы
Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ас представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ас представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
10. Фармацевтическая композиция по п.9, где указанный кератансульфатолигосахарид выбран из группы, включающей тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой I, трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой II, и дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой III
Gal(6S)β1-4GlcNAс(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
Gal(6S)β1-4GlcNAс(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
11. Фармацевтическая композиция по п.1, обладающая индуцирующим клеточную дифференцировку действием.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, где указанный кератансульфатолигосахарид содержит в качестве составного ингредиента, по меньшей мере, дисахарид формулы
Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ас представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ас представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
13. Фармацевтическая композиция по п.12, где указанный кератансульфатолигосахарид выбран из группы, включающей тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой I, трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой II, и дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой III
Gal(6S)β1-4GlcNAс(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
Gal(6S)β1-4GlcNAс(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
14. Фармацевтическая композиция по п.1, обладающая индуцирующим апоптоз действием.
15. Фармацевтическая композиция по п.14, где указанный кератансульфатолигосахарид содержит в качестве составного ингредиента, по меньшей мере, дисахарид формулы
Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ас представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ас представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
16. Фармацевтическая композиция по п.15, где указанный кератансульфатолигосахарид выбран из группы, включающей тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой I, трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой II, и дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой III
Gal(6S)β1-4GlcNAс(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
Gal(6S)β1-4GlcNAс(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
17. Кератансульфатолигосахаридная фракция, содержащая не менее 99% кератансульфатолигосахарида с двумя - пятью сахаридными звеньями, сульфатированным N-ацетилглюкозамином на своем редуцирующем конце, с сульфатированным N-ацетиллактозаминным звеном, необязательно содержащим сиаловую кислоту и/или фукозу, имеющего, по меньшей мере, две сульфатированных гидроксильных группы в молекуле, при этом кератансульфатолигосахаридная фракция является, по существу, свободной от эндотоксина, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, гепарансульфата и кератансульфата, а содержание нуклеиновых кислот, белка и протеазы во фракции, соответственно, меньше пределов их обнаружения.
18. Кератансульфатолигосахаридная фракция по п.17, где указанный кератансульфатолигосахарид содержит в качестве составного ингредиента, по меньшей мере, дисахарид формулы Gal(6S)-GlcNAc(6S),
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ас представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
где Gal представляет галактозу;
GlcN представляет глюкозамин;
Ас представляет ацетильную группу;
6S представляет 6-О-сульфатный эфир.
19. Кератансульфатолигосахаридная фракция по п.17 или 18, где указанный кератансульфатолигосахарид выбран из группы, включающей тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой I, трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой II, и дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой III
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
20. Способ получения кератансульфатолигосахаридной фракции, охарактеризованной в любом из пп.17 - 19, включающий стадию расщепления кератансульфата расщепляющим ферментом, которую проводят в буферном растворе, содержащем кератансульфат в концентрации 1,0 - 100 мг/мл, при pH 6,0 - 7,0, температуре реакции 25 - 40oC в течение 1 - 72 ч, и где указанный фермент воздействует на кератансульфат, представляющий собой кератансульфат I, кератансульфат II или кератанполисульфат, и гидролизует его гликозидную связь N-ацетилглюкозамина с образованием сульфатированных кератансульфатдисахарида, кератансульфаттетрасахарида и кератансульфатпентасахарида в качестве основных продуктов расщепления, при этом указанный расщепляющий фермент обладает следующими физическими и химическими свойствами: имеет оптимальную активность при pH 4,5 - 6,0 в 0,1М ацетатном буфере или в 10 мМ трис-ацетатном буфере при 37oC; обладает pH стабильностью в интервале 6 - 7, когда остается в 0,1М ацетатном буфере или в 10 мМ трис-ацетатном буфере при 37oC в течение часа; имеет оптимальную активность при 50 - 60oC, когда реагирует в 0,1М ацетатном буфере при pH 6,0 в течение 10 мин; сохраняет термостабильность при 45oC или ниже, когда остается в 0,1М ацетатном буфере при pH 6,0 в течение часа; и стадию фракционирования очищенной кератансульфатолигосахаридной фракции из продуктов расщепления, содержащей не менее 99% кератансульфатолигосахарида.
21. Способ получения кератансульфатолигосахаридной фракции по п.20, где указанный кератансульфат является кератансульфатом, а кератансульфатолигосахарид выбран из группы, включающей тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой I, трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой II, и дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой III
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (I)
NeuAc~Galβ1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (II)
Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S) (III),
где Gal представляет галактозу,
GlcN представляет глюкозамин,
Neu представляет нейраминовую кислоту,
Ас представляет ацетильную группу,
6S представляет 6-О-сульфатный эфир,
~ обозначает связь α2, 3 или связь α2,6.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6/298298 | 1994-12-01 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU97111163A RU97111163A (ru) | 1999-06-10 |
RU2173154C2 true RU2173154C2 (ru) | 2001-09-10 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
МАШКОВСКИЙ М.Д. Лекарственные средства. - М.: МЕДИЦИНА, 1986, ч.2, с.157. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5001989B2 (ja) | ケラタン硫酸オリゴ糖画分の製造法 | |
US5733892A (en) | Metastasis inhibitor composition comprising a phospholipid-linked glycosaminoglycan and method for inhibiting metastasis employing the same | |
FI84074C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara gangliosidderivat. | |
CA2067211C (en) | Phospholipid- or lipid-linked glycosaminoglycan, process for producing the same and metastasis inhibitor | |
Previato et al. | Primary structure of the oligosaccharide chain of lipopeptidophosphoglycan of epimastigote forms of Trypanosoma cruzi. | |
US5470578A (en) | Antirheumatic composition | |
Wessels et al. | Structure and immunochemistry of an oligosaccharide repeating unit of the capsular polysaccharide of type III group B Streptococcus. A revised structure for the type III group B streptococcal polysaccharide antigen. | |
Calatroni et al. | The glycosaminoglycans of human plasma | |
US7601488B2 (en) | Hyaluronic acid oligosaccharide fractions and drugs containing the same | |
AU623965B2 (en) | Adhesion of mycoplasma pneumoniae and mycoplasma hominus to sulfatide | |
Gorman et al. | Lipopolysaccharide structure and the phenomenon of low endotoxin recovery | |
US20190002596A1 (en) | Sulfated heparin oligosaccharide and preparation method and application thereof | |
Vinogradov et al. | Structure of Proteus mirabilis 027 O‐specific polysaccharide containing amino acids and phosphoethanolamine | |
Kumada et al. | Biological properties of the native and synthetic lipid A of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide | |
Nader et al. | Selective distribution of the heparin in mammals conspicuous presence of heparin in lymphoid tissues | |
RU2173154C2 (ru) | Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат | |
BR112013027389B1 (pt) | Processo para o preparo de sal sódico de sulfato de condroitina | |
JPH0480202A (ja) | 燐脂質結合グリコサミノグリカン | |
Schiller et al. | Action of hypochlorous acid on polymeric components of cartilage. Use of 13C NMR spectroscopy | |
Berra et al. | Presence of glycoproteins containing the polylactosamine structure in brain and liver of G M1 gangliosidosis patients: Comparative study between clinical types I and II, using endo-β-galactosidase enzyme | |
US6562954B1 (en) | Method for producing oligosaccharide, and novel oligosaccharide and pharmaceutical composition containing the same | |
JPH05178876A (ja) | 抗炎症・抗アレルギー作用を有するオリゴ糖誘導体 | |
CN116685608A (zh) | 来自蜗牛粘液(非洲大蜗牛)的肝素样物质的分离、纯化和表征的新方法及其用途 | |
Nagatsuka et al. | A method of screening test for excretion pattern of urinary glycosaminoglycans and its application to normal human urine | |
Muir | Chemistry and Metabolism |