HUT58805A - Process for producing non-a, non-b hepatitis virus antigen peptide - Google Patents

Description

A találmány tárgya antigén előállítására, eljárás olyan előállítására, mutat vagy levő betegből hepatitiszben találmány eljárás nem-A, nem-B hepatitisz vírus Pontosabban, a jelen nem-B hepatitisz vírus antigén-antitest reakció nem-A, nem-B származó szérummal nem-A, amely akut hepatitiszből vagy krónikus származó szérummal.

találmány tárgya antigén peptid specificitást felgyógyulóban nem-A, A nem-B szenvedő betegből szerinti antigén peptid használható nem-A, jelen nem-B hepatitisz diagnosztizálására, és transzfúzióra használt vér vizsgálatára. Továbbá, a jelen találmány szerinti antigén peptidet használhatjuk nem-A, nem-B hepatitisz elleni vakcina hatóanyagaként..

A nem-A. nem-B hepatitisz vírus definíciója:

vírus vírusos hepatitisz egy fertőzés okoz. Idáig májbetegség hepatitisz A amelyet hepatitisz vírust, hepatitisz B vírust és hepatitisz D azonosítottak.

(delta) vírust izoláltak és

A hepatitisz

D vírus (delta-hepatitisz vírus) egy deficiens szaporodásához szüksége. Tehát vírus, amely helper vírusként a hepatitisz a hepatitisz D vírus csak nem képes egyedül ; B szaporodni, vírusra van olyan betegben van akinek jelen, jelentették, hogy amelyet mind hepatitisz B vírusa számos betegnek van hepatitisz B-töl, mind is van. 1974-ben olyan hepatitisze, hepatitisz A-tól eltérő vírus okoz. Ezt a hepatitiszt nem-A, nem-B hepatitisz-nek nevezték el, és a nem-A nem-B hepatitisz vírus kutatása nagy erőkkel, intenzíven megindult az egész világon. A kutatások során azt tapasztalták, hogy sokféle típusú nem-A, nem-B hepatitisz vírus létezik. Az eddig • · · végzett kutatások eredményei azt mutatják, hogy a fertőzés útja alapján a nem-A, nem-B hepatitisz vírust két csoportba lehet osztani, azaz van egy epidémiás hepatitisz vírus, nevezetesen egy enterikusan átvitt nem-A, nem-B hepatitisz vírus amely az ivóvíz és az étel útján terjed, és van egy vérrel átvitt nem-A, nem-B hepatitisz vírus, amely vérrel terjed például transzfúzióval, stb.

A nem-A, nem-B vírusok közül csak egy enterikus úton terjedő NANBV-t azonosítottak virológiailag, amely Afrikában,

Indiában és Délkelet-Azsában terjedt el, de a vérrel átvitt nem-A, nem-B hepatitisz vírust még nem azonosították.

•.λ jg

Az alábbiakban a vérrel átvitt nem-A, nem-B.'hepatitiszt gyakran csak egyszerűen NANB hepatitisz néven említjük, és a vérrel átvitt nem-A, nem-B hepatitisz vírust egyszerűen csak NANBV néven említjük.

A NANB hepatitisz vizsgálatának jelenlegi helyzete és problémái:

A NANB hepatitisz krízisének mechanizmusára és a NANB hepatitisz kezelésére vonatkozóan virológiái tanulmányokat Ősre.folytattak a világban a NANBV-t más vírusokkal kombinálva, a hisztopatológiáról és hasonlókról No. 3220, 3-10 (1987)].

a kővetkezőket találták:

[Japan

Ami a NANB diagnosztizálásról

Medical Journal, hepatitiszt illeti, (1) Epidemológia: Japánban az Egésszégügyi Minisztérium becslése szerint a krónikus és Népjóléti hepatitiszes körülbelül 60 betegeknek (azaz körülbelül 720 ezer betegnek) százaléka, a hepatocirrózis betegeknek (azaz körülbelül 100 ezer betegnek) a 40 százaléka, a májrákos betegeknek (azaz körülbelül hétezer betegnek) 40 százaléka NANB hepatíszes beteg. Továbbá, az előbb említett NANB hepatitisz halálozási aránya eléri a 16 ezer per év szintet. Az Amerikai Egyesült Államokban a poszt-transzfúziós páciensek száma 150-300 ezer per év szenvedő körül van, és a poszt-transzfúziós hepatitiszben betegek 90 százaléka NANB hepatitiszben szenved.

Továbbá hordozó.

úgy vélik, hogy a véradók 1-6 Továbbá, a becslések szerint a százaléka

NANBV többi országban is a

NANB hepatitisz előfordulása és a

NANBV hordozók aránya azonos vagy magasabb mint az Amerikai

Egyesült

Államokban és

Japánban. Ennélfogva a NANB hepatitisz korai diagnózisa és korai kezelése nagyon fontos.

(2) Virológia: Az alábbiakban leírt NANBV egy burkot tartalmaz, valamint egy szférikus, körülbelül 50 nm átmérőjű vírusrészecskét. A taxonómiai megfigyelés azt sugallja, hogy az ismert NANBV hasonló a togavírushoz vagy flavivlrushoz, vagy egy új típusú, a togavírustól vagy flavivírustól eltérő vírus. Továbbá egy NANBV hepatítiszes beteg vérszérumával injekciózott majmok hepatocitái citoplazmájának patológiai megfigyelése azt mutatja, hogy tubuláris szerkezet alakul ki néhány majom hepatocitáinak citoplazmájában, de tubuláris szerkezet nem figyelhető meg más citoplazmájában, és néhány citoplazmájában egy intranukleáris

Ezek az eredmények, az epidemológiai valamint a kloroform-érzékenység hogy számos Science, hepatocitáinak hepatocitáinak jön létre, megfigyelések meglétének különböző ez nem az az majmok majom részecske azt sugallja, [lásd például Infectious

Disease,

2Ώ5,

14S, eredményei, megléte vagy hiánya típusú NANBV létezik

197-200 (1979) és Journal of

254-265 (1983)]. A NANB hepatitiszben szenvedő beteg vérében

-5levő NANBV mennyisége sokkal kisebb mint a hepatitisz A-ban szenvedő beteg székletében levő hepatitisz A vírus, vagy a hepatitisz B-ben szenvedö beteg vérében levő hepatitisz B vírus. Például beteg vérében levő hepatitisz B vírus mennyisége 10⁸-10⁹ per csimpánz fertőzési dózisban (CID) kifejezve [Bradley,

D.W. :

Research perspectives iri post-transfusion non-A, non-B hepatitis;

Immunity and

Infection,

Blood Transfusion, 81-97. oldal, szerkesztők:

Dodd,

R.Y, és

Barker,

L.F., kiadja Alán R.Liss, Inc., New

York (1985)].

Továbbá ismert, hogy az olyan állat, kivéve a csimpánzt, amely érzékeny a

NANBV-re, és hepatocita citoplazmájában

NANBV fertőzés alkalmanként tubuláris szerkezetet hoz létre.

Mivel a NANBV fertőzéssel végzett kísérletekben csak csimpánz használható kísérleti állatként, ezért számos csimpánzra van szükség a

NANBV vizsgálatához.

Azonban a csimpánz nehezen beszerezhető és drága. Ennélfogva

NANBV vizsgálata például kísérletes

NANBV fertőzéssel,

NANBV azonosítása és hasznosítható NANBV marker keresése szükségszerűen gátolt és megkésett.

(3) Klinikai megfigyelések: a

NANB hepatitisz lappangási iodeje 2-26 hét. A korai fázisban

NANB hepatitisz tünetei a hepatitisz

B-hez viszonyítva gyengék. Például a NANB hepatitiszben szenvedő beteg csak lázas és bágyadtságról panaszkodik.

Ezután betegeknek sárgaság nélküli szimptómájuk van. Ennélfogva a NANB hepatitiszt gyakran nem veszik észre. Azonban a NANB hepatitisz nagyon veszélyes, mivel könnyen krónikussá válik, és májcirrőzissá fejlődik.

Azaz

NANB hepatitiszben szenvedő betegek 40-50

százalékában, akiknek a vérszérumában megnövekedett az aminotranszferáz aktivitás, krónikus hepatitisz fejlődik ki. A krónikus hepatítiszes esetek 10-20 százaléka májcirrózis.

Emellett az évente vért kapók

0.5-1 százaléka szubjektív tünetek nélküli májcirrózisos beteggé válik.

Tehát vértranszfúzió és vérzés éi iirfretárjei biológiai veszélyeztetettségének megszüntetése nagyon fontos közegészségügy szempontjából.

(4) Diagnózis: Amint az előzőkben említettük, a NANBV-t (vérrel átvitt típus) még nem azonosították, és nem ismert vírus-marker, például NANBV antigén, amelyet a NANB hepatitisz diagnosztizálásában fel lehetne használni. Ennélfogva a NANB hepatitisz diagnosztizálását úgy végzik, hogy a beteg szérumának antitest titerét vizsgálják, amely specifikus az ismert phlogogenikus vírusokra, úgymint a hepatitisz A vírusra, a . hepatitisz B vírusra, citomegalovírusra, EB vírusra, varicella vírusra és herpesz szimplex vírusra, és azt a beteget, akinek a széruma negatív vírusokra az előzőkben felsorolt hepatitiszben szenvedőnek másik diagnózis-módszert is módszert használják, amelyben szérumban, például a GPT-t ismert még ALT specifikus antitestre, NANB diagnosztizálják. Ugyanakkor, használnak. Például azt a nézik egy enzim aktivitását [glutamát-piruvát transzamináz, )], GOT-ot (alanin-amino-transzamináz [(glutamát-oxálecetsav-transzamináz), másik neve AST (aszpartát-amino-transzamináz)], és a guanin dezaminázt (másik neve guanáz) [Kan-tun-sui (Liver, Gallbladder, Pancreas), ±4, 519-522 (1987)]; másik használt módszer szerint a guanáz aktivitást a minta abszorbanciája alapján

-Ίhatározzák meg ( 60-176600 számon közzétett japán szabadalmi bejelentés); valamint az a módszer, amelyben a reverz transzkriptáz aktivitását határozzák meg vérben (Amerikai

Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás,

4,707,439). Ami a

GPT-t vagy GOT-ot illeti az előzőkben említett szérumban, Japánban olyan standardot használnak a NANB hepatitisz diagnosztizálására, amelyben a GPT és a GOT tartós, abnormálisán magas aktivitása a kritérium a NANB hepatitisz diagnózisának [Journal of Blood Transfusion Society in hepatitisz a NANB

Japan, 31(4) , 316-320 (1985)]. Ami

diagnosztikai	ágensét	illeti,	ismert a	NANB	hepatitisz
szimptőmáit	mutató	beteg vérében keletkező	antigénnel
specifikusan	reagáló	antitest.	Például	egy	poliklonális
antitestet (	58-735	számon	közzétett	japán	szabadalmi
bejelentés),	egy monoklonális	antitestet	(	58-183629,

62-181798 sorszámokon közzétett j apán

61-561968 es szabadalmi bejelentések), egy monoklonális antitestet, amelyet egy ejtvonal termel (

61-25484 sorszámon közzétett japán szabadalmi bejelentés), egy avidinnel jelzett antitestet

60-195454 sorszámon közzétett japán szabadalmi bejelentés), és egy NANB hepatitiszben szenvedő beteg ürülékének extraktumával fertőzött majom szérumából preparált antitestet (62-249999 sorszámon közzétett japán szabadalmi bejelentés) is leírtak. Továbbá leírtak egy NANB hepatítiszes beteg anatomizált májából izolált és tisztított

NANB hepatitiszhez kapcsolt antigént (57-198867 sorszámon

Azonban egyik fenti módszerrel, antigénnel, antitesttel sem lehet pontosan diagnosztizálni a NANB hepatitiszt, mivel a NANB hepatitisz ···· « · · · ··«· diagnosztizálásában kritériumként használt enzimaktivitás nem specifikus a

NANB hepatitiszre, és az említett antitestek, antigén nem specifikus a NANBV-re. Ennélfogva kívánatos egy, a NANBV-re specifikus markert találni.

(5) Terápia és megelőzés: A szakterületen újabban a fi-interferon használatának a krónikus NANB hepatitiszre gyakorolt terápiás hátasa keltette fel a figyelmet [Hepatology, fi, 117 (1986) (kivonat)]. Ami a fi-interferon dózisát és az adagolás periódusát illeti, a kutatások folynak. A β-interferon hatékonyságát azonban még nem erősítették meg

Másrészről azonban számos vakcinát és diagnosztikai ágenst írtak le. Például megemlíthető egy adjuváns vakcina, amely egy sárgasági szimptómás NANB hepatítiszes beteg szérumából származó antigént tartalmaz, amely szérum magas GPT aktivitást mutat (59-42455 sorszámú japán szabadalmi bejelentés egy NANBV antigén, amely specifikusan reagál egy NANB hepatitiszben szenvedő betegből nyert limfocita által termelt antigénnel^ olymódon, hogy a limfocitát NANB hepatítiszes csimpánzból izolált és tisztított EB vírussal transzformáltuk (61-176856 sorszámon közzétett japán szabadalmi bejelentés); egy glikoprotein, amely egy NANB hepatítiszes beteg vérszérumából származik (62-30965 sorszámon közzétett japán szabadalmi bejelentés); affinitás-kromatográfiával NANB hepatitiszben szenvedő beteg vérszérumából izolált DNS vírus (W084/01107 nemzetközi közzétételi számú szabadalmi bejelentés 59-501774 számon közzétett japán fordítása); egy, a vérplazma fibronektin frakciójából izolált NANBV antigén ( W084/04326 nemzetközi közzétételi számú szabadalmi bejelentés 60-501241 számon közzétett japán fordítása);

NANB hepatítiszes beteg szérumából és vizeletéből sorszámú

Amerikai Egyesült izolált togavírus

Allamok-beli szabadalmi leírás);

(4,464,474 aktív adalékanyagként NANB hepatítiszes beteg szérumából vagy plazmájából tisztított

NANBV felületi antigént vagy gamma globulint tartalmazó vakcina (4,452,016 sorszámú

Amerikai Egyesült

Allamok-beli szabadalmi leírás);

egy NANB hepatítiszes beteg szérumából izolált NANBV, és egy antigénje (4,673,634 és 4,702,909 sorszámú Amerikai Egyesült

Allamok-beli közzétett szabadalmi leírás valamint a 128,995 európai szabadalmi bejelentés) és sorszámon egy NANB hepatítiszes beteg székletének extrákturnéból izolált enterovírus-szerü vírus (71,640 számú európai szabadalmi bejelentés). Mivel azonban a NANBV-t még nem izolálták, semmiképpen nem erősíthető még meg, hogy az előzőkben említett vakcinák használhatók-e diagnosztikai NANB anyagok valóban hepatitisz specifikus diagnosztizálására és kezelésére. Továbbá, ami a NANBV vérkészítmények útján való terjedésének megelőzési módszerét illeti, ismert például az a módszer, amely szerint a szérumot vagy vérplazmát hőkezelésnek vetik alá (10 perc

60°C-on) (4,438,098 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás);

az a módszer, amely szerint a fagyasztva-száritott vérkészítményeket kezelik hővel (59-110627 számon közzétett japán szabadalmi bejelentés); az a módszer, amely szerint egy szerves oldószerből, például kloroformból kicsapódó plazmafehérje frakciót összegyűjtjük, és a hepatitisz vírust tartalmazó oldószer-oldékony frakciót elöntjük; és az a módszer, amely szerint a NANBV-t formaiinnal inaktiváljuk (4,291,020 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás). Azonban, amint azt az előzőkben említettük, a NANBV-t még nem izolálták és azonosították, ennélfogva nem bizonyítható, hogy az előzőkben említett módszerekkel kezelt vér valóban mentes-é a NANBV-töl. Ennélfogva az előzőkben említett módszerekkel nyert biológiai készítmények biztonságossága és hatékonysága nem biztosított. Emiatt egyik említett módszert sem vezették be a gyakorlatba.

A találmány összefoglalása

A feltalálók kiterjedt és intenzív végeztek az előzőkben említett NANBV antigén kidolgozására . NANB vizsgálatokat problémák megoldására és egy Ennek eredményeként hepatítiszes beteg klónozni egy NANBV antigén biztonságos faktorokkal feltalálóknak sikerült egy reszektált májából és plazmából peptidet kódoló cDNS-t, amely nagyon megbízható, és hatékony, anélkül, hogy a NANBV-t ismeretlen rendelkező csimpánzokban kellene

NANBV izolálását, nehézzé teszi a ami nagyon mennyisége igen alacsony a hepatitisz A vagy része. Ezzel plazmában hepatitisz először vált vagy a

B előállítása nagy tisztaságban veszély nélkül a NANBV expresszálva

Továbbá azt találták, hogy vagy plazmában jelenlevő RNS-röl rekombináns szaporítani, míg a NANBV reszektált májban, azaz a vírus mennyiségének 1/10 000 lehetővé a NANBV antigén peptid és nagy mennyiségben biológiai antigén peptidet kódoló cDNS-t DNS technika alkalmazásával.

a humán eredetű reszektált májban készült cDNS génkönyvtárból

-11izolált próba specifikusan hibridizálődik az 1. példában részletesen leírt Northern biot technikával NANB hepatítiszes beteg plazmájában vagy reszektált májában levő RNS-sel. Továbbá azt találták, hogy az így nyert, jelen találmány szerinti NANBV antigén peptid antigén-antitest reakciót mutat egy lábadozó akut NANB hepatítiszes betegnek legalább egy szérumával és egy krónikus NANB hepatítiszes beteg szérumával. Az előzőkben a jelen találmány.

A találmány tárgya eljárás peptid előállítására, amely adalékanyag egy diagnosztikai hepatitisz vakcinában.

A találmány tárgya továbbá antigén peptidet tartalmazó előállítására.

említett eredményekkel teljes

NANB hepatitisz vírus jól használható készítményben és egy eljárás legalább két kevert antigén antigén aktív

NANB

NANBV peptid

A találmány peptidet kódoló NANB hepatitisz diagnosztizáló szereként.

tárgya továbbá eljárás cDNS előállítására, amely antigén jól használható

NANBV

A találmány tárgya továbbá hatékony módszer a NANB hepatitisz diagnosztizálására.

A találmány tárgya továbbá hatékony módszer a transzfúzióhoz használt vér átvizsgálására, hogy a NANBV mentes vért ki lehessen választani.

Az ábrák rövid leírása:

Az ábrák:

Az 1. ábra egy autoradiogram illusztrációja, amelyet úgy kapunk, jelölve hogy a jelen találmány szerinti cDNS-t ³²P-vel próbának használjuk szérumok dót hibridizációjához, amelynél az 1-5.

minták

NANB származó szérumok, a 6-7.

minta hepatítiszes betegekből hepatitisz B-ben szenvedő' betegekből származó szérum, minta egészséges emberből származó szérum, akit hepatitisz mentesnek diagnosztizáltak;

és a 2(a), 2(b), 2(c), 2(d), 2(e) és 2(f) ábrák külön-külön mutatják a jelen találmány szerinti különböző cDNS-ek nukleotid szekvenciáját.

A találmány részletes leírása

A találmány tárgya lényegében eljárás vírus antigén előállítására, <

reakciót ad akut nem-A, nem-B beteg szérumával és/vagy krónikus hepatítiszes beteg szérumával, valamint nem

-antitest reakciót sem klinikailag diagnosztizált ember szérumával, hepatitisztől eltérő hepatitiszben zált beteg szérumával.

A jelen találmány tárgya továbbá hepatitisz

-antitest lábadozó ember nem-A, nem-B antigénamely > hepatitiszből nem-A, nem-B ad hepatitisz nem-A, antigénmentesnek sem nem-B szenvedőnek diagnosztinem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptidet kódoló cDNS előállítására, amely antigén peptid antigén-antitest reakciót ad akut nem-A, nem-B hepatitiszből lábadozó beteg szérumával és/vagy krónikus nem-A, nem-B hepatítiszes beteg szérumával, valamint nem ad antigén-antitest reakciót sem klinikailag »«*

hepatítisz mentesnek diagnosztizált ember szérumával, sem nem-A, nem-B hepatitisztől eltérő hepatitiszben szenvedőnek diagnosztizált beteg szérumával.

A jelen találmány szerinti antigén reakcióképes az akut NANB hepatitiszből lábadozó beteg széruma és a krónikus NANB hepatitiszben szenvedő beteg széruma közül legalább az egyikkel. Azaz, a jelen találmány szerinti NANBV antigén peptid az akut NANB hepatitiszből lábadozó beteg széruma és a krónikus hepatítiszes beteg széruma közül vagy csak az egyikkel reakcióképes, vagy bármelyik szérummal képes reagálni.. Azonban a jelen találmány szerinti antigén peptid nem mutat antigén-antitest reakciót sem klinikailag hepatitisz-mentesnek diagnosztizált ember szérumával, sem NANB hepatitisztől eltérő hepatítiszesnek diagnosztizált beteg szérumával. NANB hepatitisztől eltérő hepatitiszként a hepatitisz A, hepatitisz B, egy citomegalovírus által okozott hepatitisz és egy Epstein-Barr vírus által okozott hepatitisz említhető. Egy akut vagy krónikus NANB hepatítiszes beteget úgy definiálunk, mint egy olyan embert, aki a diagnózis alapján pozitív a NANB hepatitiszre, kizárva az ismert hepatitisz vírusokkal való fertőzést, beleértve a hepatitisz A vírust, hepatitisz B vírust, citomegalovírust és Epstein-Barr vírust, Dienstag, J.L. módszerei szerint [Non-A, non-B hepatitisz II. Experimental transmission, putatíve vírus agents and markers, and prevention, Gastroenterology, 35, 741 (1983)]. Hogy a NANB hepatitisz akut vagy krónikus, az meghatározható a biopsziával nyert máj szövet vizsgálatával a Sheila Sherlock által leírt kritériumok alapján [Diseases Of The Liver And Biliary

-14System,326-333, eighth edition, Blackwell Scientific

Publications, London (1989)].

Másrészről, ami a hepatitisz A-ban szenvedő beteget, a hepatitisz B-ben szenvedő beteget, a citomegalovírus által okozott hepatitiszben szenvedő beteget, az Epstein-Barr vírus által okozott hepatitiszben szenvedő beteget és egy egészséges embert illeti, a diagnózist az előzőkben említett Dienstag módszerrel állíthatjuk fel.

A jelen találmány szerinti NANBV pe p t i d e t>f ú gy)_fcaJi>é***· állíthatjuk elő például, hogy a (I) - (VI) szekvenciák közül legalább egyet tartalmazó DNS-t expresszálunk, ♦ · · · · 5· ♦ · ν ·*♦· * · · · · · · ···· *f*e ·* ·«««·

-15GAATTCCAAAAAGAGCAAAACAAACCGCCGAAGAAAAAACTAATAAGAGAAGAAAAGGCG AAGAGACACAGGAAAAAAAAAACAGAGACGAAGGTCAGATAGAAAAAAAGCAAGGAATTC ...d);

GAATTCCGAGAACAAGACCAGATAAAAACCAAAGACAGAACACAACAGAGAAAGACGAAA AGAAGCACCAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAAAAAAAAAAAAAAAGGAATTC ...di);

GAATTCCAAGAAAAAAAGGGAGAAGCCAGCAATGGAGAAGCCGAAAACGACACACACAAG AAACAAAGGAGGTACAAAGAAAAAGAAAAAACGGCAACAAATAACCCAGGAAAGAACAAA AAGCCAAGAGTGGGCAGAATAAAAAACTGGAACCGGGAGGGAAGGAAGGACGCATATCAG ATTAGAAAAAGGAGGGAATTC...(III)

GAATTCCTAAGAAATGGCTAGCCCTAGGAGAGGCAGTCTTTCCCCAGTCAGTTAGCCCGC

AAATGCCAGAGCATCAAGAATTCAGAAAAGGAGAAAATATAGTTAATATCAAAGTGGTCG

AAGCCTAAGATAGAGAGGTAGAGAGTATGAAGAGTAAGACGAATACAAACCAAAATTCTG

CAATGATCATTAAAAACATTATTGATAGGTACTTAGAAGGGCAAGAGAGGAAGAAGAAAG TAATGAGAAATGCTTATGGAAGCCAAAGGAGCTTTCCAGGAGAAGAAAGGGAATTC

...(IV);

GAATTCCCAACGCGTCGGCTTGGCCCGCGCCTTGGCCGCCGACCCGCGCTGATGGCCGTG

GAATTC...(V);

GAATTCCGGGGTATTTGCCTCGATCTGCCTGCTCAGCGCTTCGGCCCTCGGCTTGGGCGC CCTGCTGCTGGCTTCCGAGCAGCTATTCAGCGCCTTGAAAGTGGTTGGCGCGGCGTACGT GTCCGGGAATTC...(VI);

·· ···· ··«· ···· • · ♦ · · • · ··· « • · · · 4 · ···· ·· ··· «· ·· • ·

-16vagy olyan nukleotid szekvenciákat expresszálunk, amelyeket külön-külön úgy kapunk, hogy a genetikai kód degeneráltságának megfelelően legalább egy nukleotidot ^helyettesítünk az (I) - (VI) szekvenciák bármelyikében,

A fenti képletekben A jelentése dezoxiadenilcsoport, G jelentése dezoxiguanilcsoport, C jelentése dezoxicitidilcso-port és T jelentésé dezoxitimidilcsoport, a (I) - (VI) képletek mindegyikében a bal- illetve jobboldali vég jelentése az 5'-hidroxilcsoportnak megfelelő vég, illetve a

3-hidroxilcsoportnak megfelelő vég. Az előzőkben említett (I) (VI) képletü nukleotid-szekvenciák közül bármelyikben nukleotidnak egy módszereivel végezhetjük helyettesítését [Saiki et al., például

Science, 230. 1350Saiki

-1354 (1985), és

Saiki et al., Science, 239.

487-491 (1988)].

Az előzőkben említett antigén peptidek közül a (I) képletü nukleotid szekvencia expressziójával kapott antigén peptid antigén-antitest reakciót mutat akut

NANB szérumával. Másrészről, a (II) hepatitiszből lábadozó beteg vagy (III) képletü nukleotid szekvenciák expressziójával kapott antigén peptidek antigén-antitest reakciót adnak krónikus NANB hepatitiszben szenvedő betegek szérumával. Továbbá, a (IV), (V) vagy (VI) nukleotid szekvenciák expressziójával kapott antigén peptidek antigén-antitest reakciót adnak akut NANB hepatitiszből lábadozó beteg szérumával vagy krónikus hepatítiszes beteg szérumával.

Amint az az előzőkből nyilvánvaló, a jelen találmány szerinti NANBV antigén peptid, amely reagál vagy az akut

NANB hepatitiszből felgyógyuló beteg szérumával vagy *

μΤτ

-17krónikus NANB előállítható a tartalmazó DNS azt a ·· ·· ···· ·«·· ·«»« • · · · · · · • · · ··· · • · · · · · a ···· ···· ·· ··· ·· könnyen képletű szekvenciákat módszer szerint szérumával, hepatítiszes beteg (IV), (V) vagy (VI) expressziójával. Egy másik antigén peptidet, amely állíthatjuk és peptidet említett szérummal, úgy szekvenciát a (II) eggyel összeligáljuk.

NANBV antigén peptid vagy több különböző antigén találmány szerinti NANBV DNS-ben levő előzőleg képletű legalább szerinti

NANBV

Ebben reagál mindegyik elő, hogy a (I) szekvenciák közül találmány amely két A (III) az esetben a fúziós peptid, tartalmaz.

egy peptidet antigén peptid előállítására szekvenciák kombinációja kombinációkra, (I) - (VI) képletű szekvencia közül kombinációja lehet.

a jelen találmánynak ismét újabb tárgya két nem-A, nem-B hepatitisz antigén kevert antigén előállítására.

Az említett különböző nukleotid korlátozódik bármelyik kettőnek a

Tehát legalább tartalmazó az előbb említett antigén peptidek akut nem-A, nem-B és/vagy krónikus valamint nem antigén-antitest reakciót ad lábadozó beteg szérumával hepatítiszes beteg szérumával,

-antitest reakciót sem klinikailag diagnosztizált ember szérumával, hepatitisztől eltérő hepatitiszben zált beteg szérumával.

A jelen azt kódoló ember találmány szerinti NANBV cDNS-t módon lehet jelen képes nem hanem legalább kőaül·· (mindegyik hepatitiszből nem-A, nem-B antigénmentesnek ad hepatitisz nem-A, szenvedőnek diagnosztisem nem-B antigén peptidet és az az alábbiakban az (1)-(8) lépésekben leírt előállítani és azonosítani.

-18(1) lépés: Anyag gyűjtése és szelektálása NANBV RNS extrahálásához.

A NANBV

RNS extrahálására alkalmas anyagként használhatjuk egy NANBV hordozó, vagy NAB hepatitiszben szenvedő ember vagy majom vérét, nyirokmirigyét, aszciteszét és hepatocitáját. Mivel a majomból származó anyagok az emberből származóhoz viszonyítva kevés NANBV-t tartalmaznak, ezért az emberből származó anyagok használata preferált.

vér, nyirokmirigy,aszcitesz és hepatocita közül a vér férhető hozzá nagyobb mennyiségben. Például vérbankokban nagymennyiségben hozzáférhető olyan vér, amely transzfúzióhoz nem használható. Az ilyen vért előnyösen használhatjuk NANBV RNS kivonásához nyersanyagként. Ha kiindulási anyagként vért használunk, akkor a vért plazmára és eritrocitákra választjuk szét. Az így kapott plazmát megvizsgáljuk, hogy a plazma negatív-e a hepatitisz B vírus felületi antigénjére [WHO expert committee on viral hepatitis: Advances in viral hepatitis, WHO Technical Report Series, 602. 28-33 (1977)] és negatív-e a hepatitisz B vírus DNS-ére [Brechot,C., Hadchouel, Μ., Scotto, J., Degos, F., Charnay, P., Trepo, C., Tiollais, P.,: Detection of hepatitis B vírus DNA in liver and serum: a direct appraisal of the chronic carrier state. Láncét 2, 765-768 (1981)]. A plazmában megvizsgáljuk továbbá különböző enzimek aktivitási szintjét, például a GPT szintjét [Wrablewski, F.

& LaDue,

J.S.:

Serum glutamic-pyruvic transaminase in cardiac and hepatic disease, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., Hl,

569 (1956)], a GOT, guanáz és hasonló enzimek szintjét, amelyet a NANB hepatitisz diagnosztizálásában kritériumként

-19alkalmaznak. Az említett eljárást, a vérnek plazmára és eritrocitákra való szeparálását és a plazma vizsgálatát különböző eredetü véreken végezzük.

Azokat a véreket egyesítjük, amelyek a hepatitisz B vírusnak mind a felületi antigénjére, mind a

DNS-ére negatív, és az említett enzimek magas aktivitását mutatja, például

GPT aktivitás meghaladja a 100

Karmen egységet.

Karmen egység definíciója megtalálható: Wrablewski,

F.

& LaDue, J.S.:

Serum glutamic-pyruvic transaminase in cardiac and hepatic disease, Proc. Soc. Exp.

Bioi. Med., Hl,

569 (1956).

A NANB hepatitisz vírusok száma a vérben sokkal kisebb, mint az előzőkben említett . hepatitisz

B vírusé. A fertőzési kísérletek eredményei alapján a

NANB hepatitisz vírusok számát a vérben a hepatitisz B vírusok számának 1/10 000-ére becsülik.

[Bradley, D.W.: Research perspectives in post-transfusion non-A, non-B hepatitis, in Infection, Immunity and Blood Transfusion,

81-97. old, szerkesztő Dodd, R.Y &

Barkér, L.F, kiadja Alán

R. Liss, Inc.,

New York (1985) ].

Tehát az RNS extrakciójához előnyös, ha nagymennyiségű plazmát használunk, például 30-100 liter mennyiségben. Ha kiindulási anyagként hepatocitát használunk, akkor előnyösen amely olyan betegből származik, akinek hepatómája van, és komplikációként krónikus NANB hepatitisze is van.

(2) lépés: A NANBV

RNS készítése

Az 1.

lépésben kapott anyagból az

RNS-t ismert módszerekkel vonjuk ki és tisztítjuk. Például, ha plazmát használunk a

NANBV RNS extrahálására, akkor a plazmát

10-150

-20mmólos végtérfogat az hígított tisztítására.

szokványos pufferrel meghigítjuk eredeti térfogat 1.5-5-szöröse használjuk plazmát az RNS úgy, hogy a legyen Ezután kivonására és

Másrészről, ha használunk kiindulási anyagként a

5-30-szoros higítópuffért használó hepatocitát

RNS kivonására, akkor a i térfogatú,' ribonukleáz inhibitort adunk. Ezután, a homogenizátort és szokásos módszer szerint a máj szövetet kapjunk.A összegyűjtjük. Az használjuk a NANBV RNS kivonásához oldatként. Az RNS kivonását és

NANBV máj szövethez tartalmazó hasonlókat hogy hepatocita homogenizátumot ezután lecentrifugáljuk és a felülúszót összegyűjtött felülúszót és tisztításához eredeti feltárjuk, homogenizátumot tisztítását végezhetjük olyan extrakciős módszerrel, inhibitorok, például heparin, guanidin-tiocianát, felületaktív anyagok, vagy redukálószerek keverékét szokványos módszerekkel, például amely szerint ribonukleáz dietil-pirokarbonát anyagok, denaturálását és szerint fehérje használjuk; azzal frakcionálást szacharózt, kelátképzö elősegítő módszerrel sürüséggradiens cézium-kloridőt,

Fine Chemicals AB Sweden), vagy hasonlót a módszerrel amely 3'-terminális poli A oszlopon végezzük;

azon alapul, hogy az ki specifikusan amely centrifugálással Ficollt (Pharmacia használunk gradiensképzö anyagként; azzal szerint a szeparálást a mRNS specifikus végét kihasználó affinitáskromatográfiás olyan elválasztási módszerrel, amely RNS-hez kötött poliszomat nyerjük poliszőma által szintetizált fehérje elleni antitesttel végzett immunprecipitációval; kétfázisú szeparáláson alapuló fenol-extrakciós módszerrel; polietilén-glikolt, dextrán-szulfátot, valamilyen alkoholt vagy hasonlót használó kicsapási módszerrel. Az említett módszereket használhatjuk egyedül vagy kombinációban. Az említett eljárást a NANBV RNS kivonására és tisztítására előnyösen pH=3 és pH=5 között végezzük, hogy megelőzzük az RNS irreverzibilis denaturálását.

(3) lépés: Kétszálú cDNS készítése a NANBV

RNS-böl

A fentemlített

NANBV RNS-t templátként használva cDNS-t állíthatunk elő az ismert módszerrel.

Azaz primerként oligodezoxitimidint és egy hexanukleotidot használunk, enzimként reverz transzkriptázt használunk, így szintetizálhatunk a

NANBV RNS-sel komplementer cDNS-t a

NANBV RNS-t használva templátként, ezzel egy kétszálú nukleinsavat kapunk, amely a cDNS-böl és hozzá komplementer módon kötődő

NANBV RNS-bÖl áll. Ezután kapott kétszálú nukleinsavat ribonukleáz H-val reagáltatva

NANBV

RNS lebomlik, ezzel eltávolítjuk a cDNS-röl. így egyszálú cDNS-t kapunk.

kapott egyszálú cDNS-t templátként használva

DNS szintetáz enzimmel kétszálú cDNS-t szintetizálunk.

A kétszálú cDNS szintézisét egyszerűen végezhetjük a kereskedelmi forgalomban levő cDNS szintézis kitek egyikével, például a cDNA Synthesis

System Plus<^R>

kittel (gyártja és árulja az Amersham

International,

Anglia) a cDNS

System Kit^(R>-tel (gyártja és árulja a

Pharmacia

LKB, Svédország), a cDNS

Synthesis Kit<^R>-tel (gyártja és árulja a Boehringer

Mannheim GmbH, Nyugat-Németország), és a hasonlókkal.

(4) lépés: A szintetizált cDNS NANBV RNS specificitásának megerősítése

Hogy megerősítsük a szintetizált cDNS NANBV RNS specifitását, ezért megvizsgáltuk a cDNS-nek NANB hepatítiszes beteg szérumával való reakcióképességét. A vizsgálatot általában · különböző hibridizálási technikák kombinálásával végezhetjük. Például a (2) lépésben leírt módszerrel NANB hepatítiszes beteg plazmájából kivont RNS-t nitrocellulóz vagy nylon (3) lépésben készített cDNS-t jelölt cDNS-t használjuk próbájaként. A szintetizált hibridizálás szürölapra csöppentjük. Ezután a 32p_vel jelöljük, és a ³²P-vel a szürölapra csöppentett RNS-ek cDNS NANBV RNS specifitását a pont hibridizálás pozitív arányával határozzuk meg, azaz a jelzett cDNS-sel hibridizálódó RNS-pöttyök számát az összes kicsöppentett RNS-ek számához viszonyítva.

A ³²P-vel jelzett DNS-t a következőképpen állítjuk elő.

A (3) lépésben készített kétszálú cDNS-t hővel denaturáljuk egyszálú cDNS előállítására. Ezután az egyszálú cDNS-hez ³²P-dCTP-t ( ³²P-vel jelzett dezoxicitidin-5'-trifoszfátot), dNTP-t (dezoxiribonukleotid-trifoszfátot) és a DNS polimeráz Klenow fragmentjét adjuk. A kapott elegyet inkubálva kapjuk a ³²P-vel jelzett kétszálú cDNS-t.

Az egészséges ember plazmájából származó RNS-ek pozitív aránya és a hepatitisz B paciensek plazmájából származó RNS-ek pozitív aránya 0% illetve 0-3%. másrészről, egy NANB hepatítiszes beteg plazmájából származó RNS-ek pozitív aránya körülbelül 30% vagy több, ami azt jelenti, hogy a szintetizált cDNS a specifikus a NANBV RNS-re. Ez azt mutatja, hogy a (3) lépésben kapott kétszálú cDNS nukleotid szekvenciája megfelel a NANBV RNS nukleotid szekvenciájának.

(5) lépés: cDNS könyvtár készítése

A (3) lépésben készített cDNS felhasználásával ismert módszerrel cDNS könyvtárat készítünk. Azaz, a (3) lépésben készített cDNS-t különböző hosszúságú darabokra hasítjuk, és a kapott különböző cDNS fragmenteket Önállóan replikálódó klónozó vektorokba klónozzuk, így kapjuk a cDNS könyvtárat. Önállóan replikálódó klónozó vektorként bármely ismert, vagy kereskedelmi forgalomban fág géneket, kozmidokat, levő vektort használhatunk, például plazmidokat és állati vírusokat. Ha vektorként fág gént vagy kozmidot használunk, akkor abbó1 a célból hogy a cDNS fragmentek beépítése után a vektor megfelelően stabil és jó transzformáló képességű legyen, ismert módszerekkel in vitro pakoljuk mindegyik cDNS inszertet tartalmazó vektort.

így a cDNS inszertet tartalmazó vektorokat rekombináns fágrészecskék formájában kapjuk meg. A kapott fágrészecskéket használjuk cDNS könyvtárként cDNS klónozás céljára. Másrészről, ha vektorként plazmidot használunk, akkor az említett cDNS fragmenteket beépítjük a plazmid vektorba, és a kapott cDNS inszertet tartalmazó vektorokat ismert módszerrel egyenként bejuttatjuk egy gazdaszervezetbe, például Escherichia coli, Bacillus subtilis, élesztő vagy hasonló sejtekbe. Az így kapott transzformánsokat használjuk cDNS könyvtárként cDNS klónozáshoz. Továbbá, ha a vektor állati vírusgén, akkor mindegyik említett cDNS fragmentet egyenként beépítjük a vírusgén-vektorba, és a kapott rekombináns vírusokat ismert módszerekkel egyenként transzfektáljuk érzékeny állati sejtekbe, majd elszaporítjuk az állati sejtekben. A rekombináns vírus esetében a kapott rekombináns vírusok önmagukban cDNS könyvtárként használhatók.

A cDNS könyvtárat könnyen előállíthatjuk valamely, a kereskedelmi forgalomban levő kittel, például a lambda gtlO és lambda gtll cDNS klónozó rendszerrel (készíti és árusítja az Amersham International, Anglia; BRL Inc., USA; Stratagene Inc,, USA), in vitro pakoló rendszerrel (készíti és árusítja Amersham International, Anglia, és BRL Inc., USA) és hasonlókkal.

(6) lépés : NANBV gént tartalmazó cDNS klónozása cDNS könyvtárból

Ebben a lépésben egy NANBV gént tartalmazó cDNS kiönt állítunk elÖ. Ha a cDNS könyvtár transzformánsokból áll, akkor a transzformánsokat normál agar-táptalajon tenyésztjük, amíg telepek keletkeznek. Másrészről, ha a cDNS könyvtár rekombináns fágrészecskékböl vagy rekombináns vírusrészecskékböl áll, akkor ezekkel a fágrészecskékkel vagy rekombináns vírusokkal ismert érzékeny gazdaszervezetet fertőzünk, például Escherichia coli-t, Bacillus sübtilis-t, élesztőt, állati sejttenyészetet és hasonlót, majd addig tenyésztjük, amíg tarfoltok keletkeznek, vagy szaporodnak a fertőzött sejtek. Az említett transzformáns telepeket, tarfoltokat vagy fertőzött sejteket immunesszével vizsgáljuk, ismert módszert használva, azaz akut NANB hepatitiszből lábadozó beteg szérumát és krónikus NANB hepatítiszes beteg szérumát használjuk, úgy hogy azokat a • V

-25telepeket, tarfoltokat vagy fertőzött sejteket szelektáljuk és izoláljuk, amelyek az említett szérumok közül legalább az egyikkel specifikusan reagáló NANBV antigént termelnek. A telepek, tarfoltok és fertőzött sejtek szigorú szelektálására előnyös, ha az említett eljárást megismételjük. Mindegyik így szelektált és izolált telepből, tarfoltból vagy fertőzött sejtből egy NANBV gént tartalmazó cDNS kiónt izolálunk ismert módszerekkel, amelyek leírása a következő szakkönyvben: T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 309-433. old. kiadó a Cold

Spring Harbor Laboratory, USA (1982).

Az immunesszét végezhetjük enzim-jelölt antitest technikával, amelyben egy enzimmel, például peroxidázzal és alkalikus foszfatázzal jelölt antitestet használunk; és fluoreszcens antitest technikát, amelyben fluoreszcein-izocianáttal, európiummal vagy hasonlókkal jelzett antitestet használunk.

Kívánatos, hogy az előzőkben említett technikájú immunesszét indirekt módszerrel végezzük, mivel az indirekt módszerrel nagy érzékenysége lesz az immunesszének, még akkor is, ha végletesen kis mennyiségű, betegből származó szérumot használunk.

Az indirekt módszernél első antitestként előnyösen olyan szérumot használunk, amely NANB hepatítiszes betegből, vagy NANB hepatítiszes csimpánzból származik, mivel ezek a szérumok viszonylag nagy mennyiségben tartalmaznak NANBV antigén elleni antitestet. Az indirekt módszernél második antitestként enzimmel, fluoreszkáló anyaggal vagy hasonlókkal jelzett, kereskedelmi forgalomban levő anti-humán lg antitestet használhatunk.

Az immunesszéval vizsgálandó mintát szokásos * 4

-26mődszerekkel készíthetjük elő, például blott módszerrel, amely során a telepek, tarfoltok és fertőzött sejtek nukleinsavait és fehérjéit szürőmembránra adszorbeáltatjuk, vagy olyan módszerrel, amelyben mikrotiter lemezt vagy mikroszkóp fedölemezt használunk, vagy hasonló módszerekkel. Ha a blott módszert kombinációban használjuk indirekt, enzim-jelzett antitest’ technikával, akkor a keresett telepeket, tarfoltokat vagy fertőzött sejteket igen nagy számú eredeti telep, eredeti tarfolt vagy eredeti fertőzött sejt közül szelektálhatjuk könnyen és gyorsan. Ebben az esetben a biottot úgy csináljuk, hogy kereskedelmi forgalomban levő nitrocellulóz, cellulózacetát, nylon vagy hasonló szürölapot hozunk a telepekkel, tarfoltokkal vagy a fertőzött sejtekkel érintkezésbe.

Ebben a lépésben előnyös, ha mindegyik kapott cDNS klón nukleotid-szekvenciáját meghatározzuk. A cDNS klón nukleotid-szekvenciájának meghatározását általában ismert módszerrel végezhetjük, például a Maxam-Gilbert módszerrel, a didezoxi láncterminációs módszerrel CAnalitical Biochemistry, 152. 232-238 (1986)], vagy hasonló módszerrel.

A cDNS kiónokat előnyösen csoportokba osztjuk a cDNS kiónok által kódolt NANBV antigén peptidek tulajdonságainak megfelelően, hogy meg tudjuk különböztetni az egyik klónt a másiktól. Ebben az összefüggésben azt találták, hogy néhány NANBV-nek megvan az a tulajdonsága, hogy csimpánz hepatocita citoplazmájában tubuláris struktúrát hozzon létre, míg néhány NANBV erre nem képes [Science, 205. 197-200 (1979)]. Ennélfogva a cDNS kiónokat azonos!thatjuk és csoportosíthatjuk azon az alapon, hogy vizsgáljuk minden ·· ·* ·»·« ···· • · * a · · • · · ··· ···* ···· ·· ··· egyes cDNS klón szerológiai reakcióképességét olyan NANBV-vel fertőzött csimpánzból származó szérummal, amely a csimpánz hepatocitájának citoplazmájában tubuláris struktúra képződését okozza, és olyan NANBV-vel fertőzött csimpánzból származó szérummal, amely a csimpánz hepatocitájának citoplazmájában nem okozza tubuláris struktúra képződését. Ennek a szerológiai reaktivitásnak a vizsgálatát az előzőkben említett immunesszével végezzük.

(7) lépés: Egy NANBV gént tartalmazó cDNS klón expressziója és egy NANBV antigén peptid nagymennyiségben való elöálítása

Abból a célból, hogy kereskedelmi mennyiségű NANBV antigén peptid előállítására expresszáljuk a NANBV antigén génjét tartalmazó klónozott cDNS-t, a cDNS kiónban levő klónozott gént vagy annak egy részét kivesszük a klónozó vektorból és egy expressziós vektorba építjük be. Pontosabban szólva., minden egyes cDNS-t vagy annak egy részét restrikciós enzimmel kihasítjuk a cDNS kiónból, így kapunk egy DNS fragmentet amely egy NANBV antigén gént tartalmaz (a továbbiakben csak mint NANBV DNS fragmentet) említjük. A NANBV DNS fragmentet ezután ezután ismert módszerrel beillesztjük egy önállóan replikálódó expressziós vektorba. Ha egy DNS fragmentet építünk be egy expressziós vektorba, akkor gén-expresszióval egy típusú antigén peptidet tudunk előállítani. Ha kettő vagy több különböző DNS-fragmentet illesztünk be egymás után egy expressziós vektorba, akkor a géneket expresszálva fúziós peptid

formájában kapunk antigén peptidet, amely a beépített DNS fragmentek által kódolt peptideket tartalmazza.

Az ebben a lépésben használt Önállóan replikálódó expressziós vektorként bármely ismert vagy kereskedelmi forgalomban levő expressziős vektort használhatunk. Az expressziós vektorok közé tartozik például enterobaktériumok esetében a pSN508 plazmidvektor (4,703,005 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás), az élesztők esetében a pBH103 vektor és teljes sorozata (63-22098 számon közzétett japán szabadalmi bejelentés), a pJM105 plazmid (62-286930 számon közzétett japán szabadalmi bejelentés), egy legyengített csirkehimlö vírus (53-41202 számon közzétett japán szabadalmi bejelentés), egy legyengített Marék vírus [The Journal of Japanese Society of Veterinary, 27. 20-24 (1974) és Gan Monograph on Cancer Research, 10. 91-107 (1971)], a pTTQ sorozatba tartozó plazmidok (készíti és árulja az Amersham International, Anglia), a pSLV sorozatba tartozó plazmidok (készíti és árulja a Pharmacia LKB, Svédország), valamint a hasonló vektorok.

A beépített NANB DNS-t tartalmazó expressziós vektorokat ismert módszerekkel egyenként bejuttatjuk vagy transzfektáljuk az adott vektorra érzékeny gazdasejtekbe, transzformánsok előállítása céljából. Ezután a transzformánsokból azokat a transzformánsokat (vagy azt a transzformánst) szelektáljuk, amely termel egy NANBV antigén peptidet. Egy NANBV antigén peptid termelődését a (6) lépésben említett immunesszé módszerrel lehet detektálni. Ha expressziós vektorként egy állati vírust használunk, akkor olyan rekombináns vírust kapunk, amely egy NANBV antigén peptidet tartalmaz a felszínén. Egy ilyen rekombináns vírust előnyösen használhatunk egy múltifunkciós vakcina előállításának kiindulási anyagaként, amely nemcsak a vírusban eredetileg bennelevö antigenicitást tartalmazza, hanem a NANBV egyik antigenicitását is.

A fentiek szerint kapott transzformánsokat vagy rekombináns vírust ismert módszerekkel szaporítva a transzformáns vagy a rekombináns vírus tenyészetében kereskedelmi mennyiségben állíthatunk elő NANBV antigén pepiidet.

(8) lépés: Egy NANBV antigén peptid tisztítása

A transzformáns vagy rekombináns vírus tenyészetében előállított NANBV antigén pepiidet ismert módszerek deszorpció kicsapás kombinálásával tisztíthatjuk, a technikákat a közül választva például: kisózás; adszorpció és aktivált szénen és hasonlókon; frakcionálás szilikagélen, szervetlen oldószerrel; ultracentrifugálással; ioncserélő kromatográfia; elektroforézis nagynyomású és hasonlók.

kromatográfia; affinitásfő lyadékkromat ográf ia ;

Ha a NANBV egy E.coli transzformáns vagy élesztő abból a szempontból, származó allergének a NANBV csökkentik előnyős ha adszorpció eltávolítása antigén peptidet transzformáns tenyészetéből tisztítjuk, akkor élesztőből hogy az E.coli-ból és eltávolítására, amelyek antigén peptid végtermék a tisztítást jelentősen minőségét, a következő lépésekben végezzük:

és elúció szilikagélen, a szennyezések aktivált szénen való adszorpcióval, majd sűrűség-gradiens centrifugálás (ebben a sorrendben)

-30(63-297 számon közzétett japán szabadalmi bejelentés). Ha a NANBV antigén peptidet rekombináns vírus tenyészetéből tisztítjuk, azaz egy rekombináns vírussal fertőzött sejt tenyészetéből, akkor nagytisztaságú NANBV antigén peptidet kaphatunk, ha az antigén peptidet tartalmazó nyers oldatot ismételten ultracentrifugálással és sürüséggradiens centrifügálással tisztítjuk.

így kaphatunk a találmány szerinti tisztított NANBV antigén peptidet tartalmazó oldatot. Ha szükséges, akkor az oldatot liofilezhetjük, hogy a tisztított NANBV antigént száraz por formájában kapjuk meg.

A jelen találmány szerinti kevert peptid antigént úgy kaphatjuk meg, hogy legalább két különböző típusú NANBV antigén peptidet összekeverünk, amelyeket legalább két különböző típusú, különböző nukleotid szekvenciájú cDNS expressziójával állítunk elő.

A jelen találmány szerinti tisztított NANBV antigén peptid NANB hepatitisz diagnosztizáló anyagaként használható. Ennek megfelelően a találmány további tárgya eljárás nem-A, nem-B hepatitisz diagnosztizálására, ami abban áll, hogy:

egy ismeretlen betegből származó szérumot érintkezésbe hozunk nem-A,, nem-B hepatitisz vírus antigén pepiiddel, amely peptiaYantigén-antitest reakciót mutat a következő csoportnak legalább egy tagjával, amely csoport tagjai; akut nem-A, nem-B hepatitiszből felgyógyuló betegből származó szérum, és krónikus nem-A, nem-B hepatitiszben szenvedő betegből származó szérum; valamint nem ad antigén-antitest reakciót sem klinikailag hepatitisz negatívnak * · to* ···« »* · · ««·· • · · · · « · • * · ··♦ · • · · » · · ♦ ··«···♦· ·· «·· t*

-31diagnosztizált beteg szérumával, sem olyan beteg szérumával, akit nem nem-A, nem-B hepatitiszben szenvedőnek diagnosztizáltak;

meghatározzuk, hogy az említett szérum reagál-e az említett nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén pepiiddel; és az említett szérumot nem-A, nem-B hepatitiszre pozitívnak vagy negatívnak minősítjük, az említett reakció eredménye alapján.

A jelen találmány szerinti NANBV antigén peptid és egy betegből származó szérum reagáltatását lényegében úgy végezhetjük amint azt az előzőkben a (6) lépésben leírtuk, azzal a különbséggel, hogy.a használt szérum olyan betegből származik, akiről még nincs meghatározva, hogy NANB hepatitiszes-e, és nem NANB hepatítiszesnek diagnosztizált betegből származó szérummal.

A jelen találmány szerinti antigén peptidet az előzőkben említett módszerekben való felhasználás céljára a következők szerint állítjuk elő. A (8) lépésben előállított tisztított NANBV antigén peptid oldatot valamely tartóedénybe, például csőbe vagy ampullába helyezzük és lezárjuk. Az edénybe helyezett antigén peptid oldatot lezárás előtt az előzök szerint liofilezhetjük is. Az egy edénybe helyezett NANBV antigén peptid mennyisége általában lúg és 10 mg között van. Egy másik módszer szerint a NANBV antigén peptidet egy általánosan használt hordozó, például mikrotiter lemez, polietilén gyöngyök, szűrőpapír vagy membrán felszínére adszorbeáltatjuk.

A szérumnak a NANBV antigén pepiiddel való reagálóképességét lényegében az előzőleg említett (6) ♦ · ·♦ ···· ··*· ·«·· • · · · * · · * » · ·♦· · • · ♦ » 9 9 9 ··** ···* ·* *·· ·· lépésben leírtak szerint határozhatjuk meg. Azaz, a reagálóképesség meghatározását ismert módszerekkel végezhetjük, például immunesszé módszerrel, úgymint radioimmunesszével (RIA), enzimhez kötött immunoszorbens esszével (ELISA), fluoreszcens antitest technikával (FA), passzív hemagglutinációval (PHA), fordított passzív hemagglutinációval (rPHA) és hasonlókkal. A fenti immunesszében használt NANBV antigén peptid mennyisége általában 0.1 körülbelül 100 mg/ml szérumra számítva. Részletesebben, a RIA-hoz, ELISA-hoz, FA-hoz, PHA-hoz és rPHA-hoz használt NANBV antigén peptid mennyisége általában 0.1 1 mg/ml-re, 0.1 1 mg/ml-re, 1 100 mg/ml-re, 1 50 mg/ml-re illetve 1 50 mg/ml-re.

A jelen találmány szerinti antigén peptidet transzfúzióhoz használt vér átvizsgálására is használhatjuk. Tehát a találmány további tárgya eljárás transzfúzióhoz használt vér átvizsgálására, ami abban áll hogy:

a) szérumot izolálunk a teljes vérből;

b) az ismeretlen vérből szérumot izolálunk és reagáltatjuk nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptiddel, amely pepticfrantigén-antftest reakciót mutat a következő csoportnak legalább egy tagjával, amely csoport tagjai; akut nem-A, nem-B hepatitiszből felgyógyuló betegből származó szérum, és krónikus nem-A, nem-B hepatitiszben szenvedő betegből származó szérum; valamint nem ad antigén-antitest reakciót sem klinikailag hepatitisz negatívnak diagnosztizált beteg szérumával, sem olyan beteg szérumával, akit nem nem-A, nem-B hepatitiszben szenvedőnek diagnosztizáltak;

*· *· ···· 4*«4 »»«« • · · 4 4 ** ' · * ♦·* ♦ * * 4 ·«44 ···· .<·. 99 ««·44

c) meghatározzuk, hogy az említett szérum reagál-e az említett nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén pepiiddel; és

d) az említett szérumot nem-A, nem-B hepatitiszre pozitívnak vagy negatívnak minősítjük, az említett reakció eredménye alapján; és

e) az említett azonosítás alapján elvégezzük a vér szeparálását.

Az ismeretlen vér szérumának és a jelen találmány szerinti NANBV antigén peptidnek a reagáltatását, valamint a vérszérumnak a NANBX.^ antigén peptiddel való reakcióképességének meghatározását ugyanúgy végezhetjük mint ahogy az előzőkben leírtuk a NANBV antigén peptid diagnosztizálási módszerével kapcsolatban. A jelen találmány szerinti módszerrel NANBV mentes vért választhatunk ki transzfúziós célra.

A jelen találmány szerinti antigén peptidet a továbbiakban előnyösen alkalmazhatjuk NANB hepatitisz elleni vakcina aktív adalékanyagaként. A NANB hepatitisz elleni vakcinát a következőképpen állíthatjuk elő. A NANBV antigén peptidet kódoló cDNS-t hordozó plazmidot vagy rekombináns fagot tartalmazó transzformáns, vagy a NANBV antigén peptidet kódoló cDNS-t hordozó rekombináns vírussal fertőzött sejt tenyésztését ugyanúgy végezzük, mint amit az előzőkben leírtunk a NANBV antigén peptid tenyészetben való előállítására. Az antigén peptid biztonsága érdekében a tenyészetben levő antigén peptid detoxifikálására, valamint az antigén peptid rögzítésére az immunogenitás és antigenitás stabilizálása érdekében, előnyös ha szokványos inaktiváló szert adunk a transzformáns vagy a rekombinás ·· ·· «··· ··«· ·*·· • V · · · · · • · » ·♦♦ · • · · · · · · ···· ···· ♦· ··· ·· vírussal fertőzött sejt tenyészetéhez, vagy a transzformáns sejtek illetve rekombináns vírussal fertőzött sejtek eltávolításával kapott tenyészléhez. Például egy inaktiváló szert, úgymint formaiint 0.0001-0.001 tf%-ban adhatunk a tenyészethez vagy tenyészléhez, majd 5-90 napig 4-37°C-on inkubáljuk. Ezután a kapott tenyészetet vagy tenyészlevet az előzőkben említett módon tisztítjuk. így kapjuk a tisztított NANBV antigén peptidet tartalmazó eredeti NANB hepatitisz vakcina oldatot.

Az eredeti NANBV hepatitisz vakcina oldatot az oldat sterilizálása céljából ismert módszerrel mikroszürön átszűrjük. A szürletet fiziológiás sóoldattal hígítjuk, annyira, hogy a fehérjekoncentráció 1-500 ug/rnl legyen a Lowry módszerrel meghatározva. A kapott oldathoz ezután alumínium-hidroxid gélt adunk adjuvánsként, annyit, hogy a hozzáadott gél koncentrációja 0.1-1.0 mg/ml legyen. Adjuvánsként használhatók még kicsapódó depóképzö adjuvánsok, például kalcium-foszfát gél, alumínium-foszfát gél, alumínium-szulfát, alumina és bentonit, valamint antigén termelődést indukáló adjuvánsok, például muramil-peptid származékok, polinukleotidok, Krestin (előállítja és árulja a Kureha Chemical Industry Co., Ltd., Japán), valamint a picibanil (mind a kettő antineoplasztikus ágens). Az elegyhez továbbá legalább egy stabilizáló anyagot adhatunk. Stabilizáló anyagként bármely kereskedelmi forgalomban levő stabilizáló anyagot használhatunk. A stabilizáló anyag lehet zselatin és annak hidrolizátuma, albumin, cukrok, például glükóz, fruktóz, galaktóz, ··*· ··<· ···· ♦ φ · szacharőz és laktóz, valamint aminosavak, úgymint glicin, alanin, lizin, arginin és glutamin.

Ezután az így kapott, gélre adszorbeált NANBV antigén peptidet tartalmazó NANB hepatitisz vakcina oldatot kis tartóedényekbe, úgymint ampullába vagy csőbe töltjük és lezárjuk. így kapunk tehát adszorbeált NANBV antigén peptidet tartalmazó tisztított adszorbeált NANB hepatitisz vakcinát.

Az így kapott NANB hepatitisz vakcina oldatot liofilezhetjük, így kapjuk a NANB hepatitisz vakcinát száraz formában, ezáltal a termék szállítható, és szélsőséges atmoszférában levő helyen is tárolható, például a trópusokon. A liofilezést általában standard módszerekkel végezhetjük, miután a folyékony adszorbeált NANB hepatitisz vakcinát tárolóedénybe, például csőbe vagy ampullába helyeztük. A liofilezés után nitrogén-gázt engedünk a szárított vakcinát tartalmazó edénybe,majd lezárjuk. Egyidejűleg az előállított vakcina minőségét is megvizsgáljuk az Adsorbed Hepatitis B vaccine, Dried Japanes Encephalitis Vaccine, és Adsorbed Pertussis Vaccine leírások szerint, amelyek a Japán Ministry of Health and Welfare 159. sorszámú értesítőjében találhatók, Minimum Requirements fór Biological Products.

A NANB hepatitisz vakcinát kevert vakcina formájában is előállíthatjuk, amely egy előzőkben említett adszorbeált NANBV antigén peptidet tartalmaz, és legalább egy a jelen NANBV antigén pepiidtől eltérő antigént. A jelen NANBV antigén peptidtöl eltérő antigénként bármely olyan antigént használhatunk, amelyet szokás szerint a megfelelő vakcinában ·«·· ·*0· OH • · · • β ·· V • · · · · «· ··· ··

-36aktiv adalékanyagként használnak, ha az ilyen antigének és a NANBV antigén peptid által okozott mellékhatások és káros reakciók nem növekednek additíven vagy szinergisztikusan a NANBV antigén peptidet és az ilyen antigént kombinációban használva, valamint a NANBV antigén peptid és az ilyen egyéb antigének antigenitása és immunogenitása nem csökken a NANBV antigén peptid és más antigének közötti interferencia következtében. A NANBV antigén peptiddel keverhető antigének száma és típusa eleddig nem limitált, mivel a mellékhatások és káros reakciók nem nőnek additíven vagy szinergisztikusan és egyik NANBV antigén peptid valamint az ilyen antigének antigenitása és immunogenitása nem csökken a fentiek szerint. Általában kettö-hat típusú antigént keverhetünk el a NANBV antigén peptiddel. A jelen NANBV antigén peptiddel keverhető antigének közé tartoznak például a detoxifikált antigének, inaktivált antigének vagy toxoidok, amelyek a japán enkefalítisz vírusból származnak, a HFRS (hemorrágiás láz vese tünetekkel) vírus, influenza-vírus, parainfluenza-vírus, hepatitisz B vírus, dengue-láz vírus, AIDS vírus, a Bordetella pertussis, a diftéria bacillus, tetanusz bacillus, a meningokokkusz, pneumokokkusz és hasonlók.

A jelen találmány szerinti NANBV antigén peptidet tartalmazó vakcinát valamilyen ampullába vagy üvegedénybe helyezhetjük és lezárhatjuk. A jelen találmány szerinti vakcinát általában folyadék vagy szuszpenzió formájában adagolhatjuk. Abban az esetben, ha a vakcina szárított formában van, akkor a vakcinát beadás előtt steril desztillált vízben oldjuk vagy szuszpendáljuk, a dfesztillált víz mennyiségének annyinak kell lennie, hogy az össztéfogat elérje a liofilizálás előtti eredeti térfogatot. A vakcinát általában bőr alá szokták adni. A vakcina dózisa személyenként körülbelöl 0.5 ml szokott lenni. A vakcina dózisa gyerekenként általában a felnőtt dózis fele. A vakcinát általában egy héten vagy egy hónapon belül kétszer szokták beadni, majd körülbelül egy fél évvel később mégegyszer beadják.

A NANBV antigén peptidet fel lehet használni továbbá antitest előállítására, úgymint a NANBV antigén peptidre specifikus poliklonális vagy monoklonális antitest előállítására. A NANBV antigén peptidre specifikus poliklonális antitestet például az alábbi, ismert módszerrel állíthatjuk elő. A jelen találmány szerinti tisztított NANBV antigén peptidet valamely állatnak, például egérnek, aranyhörcsőgnek vagy nyúlnak adjuk be bőr alá, intramuszku lárisan vagy intravénásán. A NANBV antigén peptid beadását általában 1-4 hetes intervallumokban többször megismételjük, ezzel teljesen immunizáljuk az állatot. Az immunizáló hatás fokozása céljából ismert és kereskedelmi forgalomban levő adjuvánst használhatunk. Ezután a vérszérumot összegyűjtjük az immunizált állatokból és ismert módszerrel egy anti-NANBV antigén peptid poliklonális antitestet izolálunk és tisztítunk a vérszérumból.

Másrészt, a NANBV antigén peptidre specifikus monoklonális antitestet állíthatunk elő ismert módszerrel [Cell Technology, 1, 23-29 (1982)]. Például a tisztított NANBV antigén pepiiddel immunizált egérből nyert lépsejteket hibridómák előállítása céljából kereskedelmi forgalomban levő egér mielőma sejtekkel fúzionáltatjuk. A hibridómákat átvizsgáljuk, hogy olyan hibridómát kapjunk, amely a NANBV antigén pepiiddel reagálni képes antitestet termel. A kapott hibridómát standard módszerekkel tenyésztjük. A tenyészet felülúszójából egy anti-NANBV antigén peptid monoklonális antitestet izilálunk és tisztítunk standard módszerekkel.

Az említett poliklonális és monoklonális antitestet NANB hepatitisz diagnosztizálására is használhatjuk diagnosztikai reagensként. A NANB hepatitisz diagnosztizálását az antitest felhasználásával immunesszével végezhetjük, lényegében az előzőkben említett, a NANBV hepatitiszt a NANBV antigén peptid felhasználásával diagnosztizáló módon. A poliklonális vagy monoklonális antitest használatával a májszövetben vagy vérben jelenlevő NANBV antigén peptidet mutathatjuk ki és mérhetjük meg a mennyiségét.

A jelen találmány szerinti, a NANBV antigén peptidet kódoló cDNS is használható a NANB hepatitisz diagnosztizálására hibridizációs technikával. Azaz, a NANBV antigén peptidet kódoló kódoló cDNS-t például biotinnal, alkalikus foszfatázzal, ³²P radioizotóppal és hasonlókkal jelöljük, és a hibridizálásnál próbaként használjuk. A diagnózishoz használt cDNS-t standard módszerekkel állíthatjuk elő, például az alábbiak szerint. Az említett, (6) lépésben kapott NANBV cDNS-t tartalmazó rekombináns fágot megfelelő restrikciós enzimmel emésztjük a NANBV cDNS-t tartalmazó fragment kivágása céljából. A kapott DNS fragmentet kereskedelmi forgalomban levő klónozó vektorba klónozzuk, így kapjuk a DNS fragmentet tartalmazó rekombináns plazmidot. A rekombináns plazmidot bejuttatjuk egy gazdaszervezetbe, az így kapott transzformánst

-39tenyésztjük a rekombináns plazmid elszaporítása céljából. A megsokszorozott rekombináns plazmidot izoláljuk a transzformánsból és restrikciós enzimmel emésztjük. A kapott emésztményt alacsony olvadáspontú agarőz gélen elektroforetizáljuk, majd izoláljuk és tisztítjuk a NANBV antigén peptidet kódoló cDNS-t. Az így kapott cDNS-t biotinnal, alkalikus foszfátázzál ³²P radioizodóppal vagy hasonlókkal jelöljük. A cDNS jelölését kereskedelmi forgalomban levő nick transzlációs kittel vagy multiprime kittel végezhetjük (gyártja és árulja például az Amersham International, Anglia; Nippon Gene Co., Ltd., Japán; stb.). A jelzett cDNS-t tartóedénybe, például ampullába vagy üvegbe tesszük, majd lezárjuk. Az edénybe helyezett jelzett cDNS mennyisége általában 1-100 ug per edény. A jelzett cDNS-t oldat formájában tarthatjuk az edényben. Másik módszer szerint a jelzett cDNS-t liofilezett állapotban tárolhatjuk az edényben. A NANB hepatitisz diagnosztizálását a jelzett cDNS-sel standard hibridizációs módszerrel végezhetjük. Azaz a betegből nyert plazmát, szérumot vagy leukocitákat érintkezésbe hozzuk a jelzett cDNS-sel, és a jelzett cDNS-hez hibridizálódó RNS-t detektáljuk. A jelzett cDNS-hez hibridizálódó RNS detektálását standard módszerekkel végezhetjük. Ha a cDNS-t enzimmel jelöltük, akkor a detektálást enzim-immunesszével végezzük. Ha radioizotóppal jeleztük, akkor a detektálást tillációs számlálással végezhetjük.

A jelen találmány szerinti NANBV specifikusan reagál a NANBV-vel. Tehát, ha a peptidet használjuk diagnoszizáló például antigén

NANBV cDNS-t szcinpeptid antigén ágensként, akkor a NANB hepatitisz diagnosztizálását könnyen és nagy megbízhatósággal végezhetjük. Továbbá, ha a jelen találmány szerinti NANBV antigén peptidet használjuk transzfúzióra szánt vér átvizsgálására, akkor a NANBV-vel fertőzött vért könnyen és nagy megbízhatósággal kiválaszthatjuk és eltávolíthatjuk a NANBV-vel nem fertőzött vérek közül. Tehát a poszt-transzfúziós NANB hepatitisz megelőzhető.

A találmány szerinti NANBV antigén peptidet előnyösen használhatjuk továbbá NANBV hepatitisz megelőzésére használt vakcina aktív adalékanyagaként.

A jelen találmány szerinti NANBV antigén peptid felhasználásával továbbá könnyen állíthatunk elő NANBV-re specifikus antitestet, pontosabban monoklpnális antitestet. A NANBV-re specifikus antitestet nemcsak NANB hepatitisz diagnosztizálásában használhatjuk előnyösen diagnosztizáló ágensként, hanem NANB hepatitisz kezelésére használt vakcina aktív adalékanyagaként is.

Továbbá, a jelen találmány szerinti NANBV antigén peptidet nem egy állat vírusfertőzése útján állítjuk elő, hanem a jelen antigén peptidet kódoló DNS megfelelő gazdaszervezetben való expresszálásával. Ezáltal az a lehetőség eliminálódik, hogy a jelen antigén előállítása során megfertözödjön. Emellett a termelés költségei is csökkenthetők. Továbbá, mivel a termelési eljárásban használt összes anyag, . például az inkubáló rendszer táptalaja jól ismert összetételű és ismert módon állítható elő, ezért a tisztítás egyszerű, és nagytisztaságú antigén peptid könnyen előállítható.

A jelen találmányt a kővetkező példákban részletesen megmagyarázzuk, de a példák nem tekinthetők a jelen találmány oltalmi köre korlátozásának.

1.. Példa

1. lépés (Plazma RNS extrahálása cDNS előállítása céljából) liter 100 Karmen/1 vagy magasabb GPT aktivitású (mérés Wrablewski,F. és LaDue, J.S módszerével [Serum glutamic pyruvic transaminase in cardiac and hepatic disease, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., Hl, 569, (1965)] plazmához, amely negatív a hepatitisz B vírus felületi antigénjére és DNS-ére (mérés Brechot, C. , Hadchouel,M., Scotto, J., Degos, F., Charnay,P., Trepo.C., Tiollais, P. módszerével [Detection of hepatitis B vírus DNA in liver and serum: a direct appraisal of the chronic carrier state, Láncét, 2, 765-768 (1981)] azonos mennyiségű hígító oldatot adunk, amelynek összetétele 50 mM TRIS-HC1 és 1 mM EDTA (pH=8.0). A kapott elegyet 300 ml/perc áramlási sebességgel folyamatosan centrifugálva (7400 x g, 4°C) kapunk egy felülúszót. A felülúszót zónális centrifugában (gyártja ás árulja az Electro Nucleonics, USA) 100 ml/óra sebességgel szacharóz sürüség-gradiens centrifugálásnak vetjük alá 0-60 v% szacharóz gradiensen 90000 x g-vel 4’C-on, így végezzük el a felülúszó frakcionálását. így kapunk egy csapadékfrakciót, egy első frakciót, amely 1.17-1.29 g/cm³ sűrűségű anyagokat tartalmaz, egy második frakciót, amely 1.12-1.17 g/cm³ sűrűségű anyagokat tartalmaz, és a legfelső, zsírtartalmú réteget harmadik frakcióként.

A szacharóz eltávolítására mindegyik frakciót dializáljuk mmól

-42TRIS-HC1 (pH-8.0) és 0.5 mmól TE összetételű pufferrel szemben. Mindegyik dializált frakciót liofilezzük, majd mindegyik frakciót 20 ml 4 mól guanidin-tiocianát, 20 mmól nátrium-citrát (pH=7.0), 0.5 % szarkozin és 0.1 M 2-merkapto-etanol összetételű oldatban ( A RNS oldat) oldjuk.

Az RNS extrahálása céljából az említett A RNS oldathoz 1/10 térfogatú 2 mólos ecetsav puffért (pH=4.1) adunk, majd még 300 pg poli C-t (gyártja és árulja a P-L Biochemicals Co., Ltd., Svédország) adunk hozzá karrier RNS-ként. Az elegyhez kloroformot és izoamil-alkoholt tartalmazó fenolt adunk a nukleisavnak egy vizes fázisba való kiextrahálása céljából. Az így kapott vizes fázishoz azonos térfogatú izopropanolt adunk a nukleinsav kicsapása céljából. A kapott csapadékot 2 mólos ecetsav pufferben oldjuk (pH=4.1), amely 0.2 ml 4 mólos guanidin-tiocianátot tartalmaz. A kapott pufferoldathoz azonos mennyiségű izopropanolt adunk a nukleinsav kicsapására. A kapott csapadékot -70°C-on tároljuk 75 tf%-os etanolban.

Továbbá, hogy eltávolitsuk a nukleinsavval együtt kicsapódott DNS-t, a nukleinsavat dezoxiribonuleázzal (DN-áz) kezeljük (gyártja és árulja a Promega Biotex, USA), amelyet affinitás-kromatográfiának vetünk alá előzőleg, 5'-(4-aminofenil-foszforil)-uridin-2'(3')-foszfát agarózzal töltött oszlopot használva erre a célra, hogy teljesen eltávolitsuk az enzimkészítményböl a ribonukleázt (RN-áz). A jelenlevő DNS-t így megemésztjük és eltávolítjuk. Továbbá a karruierként a nukleinsavhoz adott poli C eltávolítására a nukleinsavat affinitás-kromatográfiának vetjük alá, oligo

-43(dG) cellulóz oszlopot használva erre a célra (gyártja és árulja a Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország, 7-es típusú, 2 g). A kapott frakciót ezután NENSORB-bal töltött oszlopra visszük (gyártja és árulja az E.I. DuPont De Nemours and Company, USA), majd liofilezzük, így kapjuk a tisztított RNS-t.

(2) lépés: kétszálú cDNS előállítása

Az előzőleg előállított RNS-böl kétszálú cDNS-t állítunk elő egy kereskedelmi forgalomban levő cDNS szintézis kittel (gyártja és árulja az Amersham International, Anglia). A példa kedvéért, 1 ug, az 1.. példa 1. lépésében előállított tisztított RNS-t és 8 μΐ, a-.kithez adott standard oldatot teszünk egy reakciócsőbe. Az elegyhez ezután egy oligo dT prímért, 20 uCi (a-³²P)dCTP-t és 20 egység reverz transzkriptázt adunk. Ezután az említett standard oldatot adjuk az elegyhez olyan mennyiségben, hogy a kapott elegy térfogata 20 μΐ legyen. Az elegyet ezután 40 percig 42°C-on inkubáljuk. Az elegyet tartalmazó reakcióedényt ezután jeges vízben lehűtjük. A második DNS-szál szintéziséhez a jeges vízbe tett reakciőedényben levő elegyhez 37.5 μΐ kétszálú cDNS szintézis kitben levő puffért adunk, valamint 20 μθί (a-³²P)dCTP-t, 0.8 egység Escherichia coli ribonukleáz H-t és 23 egység Escherichia coli DNS polimeráz I-et. Ezután annyi desztillált vizet adunk az elegyhez, hogy végtérfogata 100 μΐ legyen. Az így kapott elegyet 12°C-on inkubáljuk 60 percig, majd 22°C-on 60 percig, majd 70°C-on 10 percig. A kapott elegyhez 2 egység T4 DNS polimerázt adunk és az elegyet 10 percig 37°C-on inkubáljuk. A kapott elegyhez ezután 4 μΐ 0.25 mólos vizes EDTA-t adunk, a reakció leállítása céljából.

A fentiekben kapott reakció-elegy 104 μΐ-éhez azonos térfogatú fenol-kloroform elegyet adunk (1:1 v/v), majd alaposan összekeverjük. Az elegyet ezután 1 percig 10000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk, és a vizes fázist elválasztjuk. Az előzők szerint kapott vizes fázishoz fenol-kloroform elegyet adunk és az említett módon centrifugáljuk a vizes fázis kinyerése céljából. Ezután azonos térfogatú kloroformot adunk a vizes fázishoz és alaposan összekeverjük, majd néhány másodpercig centrifugáljuk a vizes fázis elválasztása céljából. A kapott vizes fázishoz azonos térfogatú 4 mólos ammónium-acetátot, majd kétszeres térfogatú hideg etanolt (-20*0) a cDNS csapadék létrehozásához. A keveréket ezután 10 percig 15000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk a csapadék kinyerése céljából. Az így kapott csapadékot 50 μΐ 2 mólos vizes ammónium-acetátban oldjuk. Az oldathoz 100 μΐ hideg etanolt adunk a cDNS kicsapásához, majd a kapott csapadékot centrifugálással összegyűjtjük. Az összegyűjtött csapadékot megszárítjuk és 20 μΐ TE pufferben oldjuk, [összetétele 10 mmól TRIS-HC1 (pH=8.0) és 0.1 mmól EDTA], majd -20°C-on tároljuk. A csapadék az 1. példa 1. lépésében előállított RNS különböző részeivel komplementer számos különböző cDNS-t tartalmaz.

3. lépés (³²P-vel jelzett cDNS próbák előállítása)

Az 1. példa 2. lépésében előállított cDNS csapadékból 25 ng-ot 5 percig 100°C-ra melegítve tartunk, majd azonnal • ···· ···· • · » • · • · • ··* ·♦♦· ·· lehütjük, így állítunk elő egyszálú DNS-t. Az egyszálú DNS-hez 20 pg borjú szérumalbumint adunk, majd 50 pCi ³²P-dCTP-t (3000 Ci/mmól), 1 mmól dNTP-t (nem tartalmaz dCTP-t), 5 ug random hexanukleotidőt és 2 egység DNS polimeráz I Klenow fragmentet, és a kapott elegy össztérfogatát 50 ul-re állítjuk TE puffer hozzáadásával. A kapott elegyet 20 percig 42’C-on inkubáljuk, majd azonnal Sephadex G-vel töltött oszlopra visszük (gyártja és árulja a Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország) a reagálatlan ³²P-dCTP eltávolítására. így kapjuk a ³²P-vel Jelzett cDNS próbát.

4. lépés (A NANBV nukleinsav kimutatása ponthibridizációval )

Egészséges felnőtt emberekből származó szérumot (10 minta), hepatitisz B-ben szenvedő betegekből származó szérumot (20 minta) és NANB hepatítiszes betegekből származó szérumot (60 minta), függetlenül attól, hogy az 1. példa 3. lépésében előállított ³²P-vel jelzett cDNS próbával a NANBV nukleinsav kimutatható-e a szérumban, a következők szerint vizsgáljuk meg ponthibridizációval.

Minden egyes szérumból 10 ml-t adunk azonos térfogatú higítószerhez, amely 50 mmól TRIS-HCl-t (pH=8.0) és 0.1 mmól EDTA-t tartalmaz, majd 100 000 x g-vel hat órán át centrifugáljuk, így csapadékot kapunk. A kapott csapadékot

0.2 ml, az 1. példa 1. lépésében említett oldatban oldjuk, amely 4 mól guanidin-tiocianátot tartalmaz. A kapott oldathoz 8 ug poliC-t és 20 μΐ 2 mólos vizes nátrium-acetátot adunk (pH=4.1), majd fenollal extraháljuk és izopropanollal kicsapjuk, így csapadékot kapunk. A kapott csapadékot az említett, 4 mól guanidin-tiocianátot tartalmazó oldatban oldjuk, majd izopropil-alkoholt hozzáadva csapadékot kapunk. A kapott csapadékot 0.2 ml TE pufferben oldjuk, amely 10 mmól TRIS-HCl-t (pH=8.0) és 0.1 mmól EDTA-t tartalmaz. A kapott oldatot ezután az említett oligo(dG), majd NENSORB oszlopon bocsátjuk át és a kapott eluátumhoz annyi formamidot adunk, hogy a formamid koncentrációja 15 s% legyen, majd ezután azonos térfogatú 20 x SSC oldatot adunk hozzá (3 mól nátrium-klorid és 0.3 mól nátrium-citrát). Az így kapott elegyet 50°C-ra melegítjük 15 percre, majd azonnal jégbehütjük. A kapott elegyet BIODAIN nylon szürölapra cseppentjük (gyártja és előállítja Pali Co., USA). A nylon szűrőt ezután 2 órán át 80°C-on sütjük. A kapott szűrőt ezután elöhibridizáljuk 50 s% formamidot, 5 x SSC-t, 5 x Denhardt oldatot, 50 mmól foszfát-citrát puffért (pH=6.5), 1 s% glicint és 100 ug/ml lazacsperma DNS-t tartalmazó oldattal 6 órán át 42°C-on kezelve, majd az oldatot elöntjük. Emellett az 1. példa 3. lépésében előállított ³²P-vel jelzett cDNS próbákat az előzőkben említett prehibridizáló oldathoz adjuk. Az előzőleg említett szűrőt ezután az említett prehibridizációs oldatba tesszük, amely a ³²P-vel jelzett cDNS próbát tartalmazza, majd a hibridizálás kivitelezésére 22 órán át 42’C-on inkubáljuk. A kapott szűrőt ezután négyszer mossuk 2 x SSC oldattal, amely 0.1% SDS-t tartalmaz, majd még kétszer mossuk 0.1 x SSC-vel, amely 0.1% SDS-t tartalmaz. A mosott szűrőt megszárítjuk, majd autoradiografáljuk, hogy meghatározzuk, van-e jelen a ³²—P—vei jelzett cDNS próbával hibridizálódó nukleinsav

-47(pozitív) vagy nincs (negatív). Az eredmények az 1. táblázatban találhatók. A kapott eredmények azt mutatják, hogy cDNS próbák felhasználásával, azaz az 1. példa 1. lépésében tisztított RNS-röl készített ³²P-vel jelzett cDNS próbákkal a NANBV nukleinsav specifikusan, nagy pozitív arányban azonosítható (a pozitív minták aránya a vizsgált mintákhoz viszonyítva).

1. Táblázat

	A vizsgált minták száma	A pozitív minták száma	Pozitív arány (%)
Egészséges felnőtt ember	10	0	0
Hepatitisz B-s betegek	20	1	5
NANB hepatítiszes	60	24	40

betegek

5. lépés (cDNS könyvtár előállítása lambda gtll fág használatával)

Kereskedelmi forgalomban levő cDNS klónozó kit felhasználásával (gyártja és árulja az Amersham International, ANglia), a cDNS könyvtárat az alábbiak szerint állítjuk elő.

(i) EcoRI linkerrel farkazott cDNS előállítása

200 pg, az 1. példa 2. lépésében előállított cDNS csapadékhoz 4 pl mól/1 puffért adunk, majd 2 i_il 1 x^SAM oldatot, mindkettőt az említett kittel szállítják. Ezután a kapott oldathoz annyi desztillált vizet adunk, hogy a kapott oldat végtérfogata 20 pl legyen. A kapott oldathoz 4 egység EcoRI metilázt adunk, majd 60 percig 37°C-on inkubáljuk. A keletkező reakcióelegyet 10 percig 70°C-on tartjuk, így keletkezik a metilezett cDNS. A metilezett cDNS végeihez EcoRI linker csatolása céljából 3 pl L-puffert és 2 ni EcoRI linkért adunk (mindegyiket a kittel szállítják) a metilezett cDNS-t tartalmazó oldathoz. Ezután az oldathoz annyi desztillált vizet adunk, hogy a keletkező oldat össztérfogata 30 pl legyen. Az oldathoz 5 egység T4 DNS ligázt adunk, majd a reakcióelegyet 18 órán át 15°C-on inkubáljuk. A kapott oldatot 10 percig 70°C-on tartjuk a ligáz inaktiválására. Ezután 10 pl, a kithez adott E puffért adunk az oldathoz, valamint annyi desztillált vizet, hogy a keletkező oldat össztérfogata 100 pl legyen. Az oldathoz 100 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk, és az elegyet 5 óra hosszat 37⁰C-on inkubáljuk. A reakcióelegyet ezután 10 percig 70°C-on tartjuk a reakció leállítására. A feleslegben levő reagálatlan EcoRI linker eltávolítására a kapott oldatot a kithez adott oszlopon bocsátjuk át, és a cDNS-t tartalmazó frakciót elválasztjuk. A frakcióhoz 1/10 térfogatnyi 3 mólos nátrium-acetátot és 2.5 térfogatnyi hideg etanolt adunk, majd a kapott elegyet -20’C-ra hütjük az EcoRI-farkazott cDNS kicsapására. A kicsapott cDNS-t Összegyűjtjük, majd a kithez adott STE pufferben 50 ng/μΐ cDNS koncentrációban feloldjuk.

(ii) Az EcoRI linkért tartalmazó é·., lambda gtll fágba

Az EcoRI linkerrel farkazott cDNS lambda gtll-kar DNS-t és 1 μΐ L-puffert cDNS beépítése ng-jához 2 μΐ adunk, mindegyik megtalálható a kitben. Ezután annyi desztillált vizet adunk az elegyhez, hogy a kapott oldat össztérfogata 10 μΐ legyen. Ezután az elegyhez 2.5 egység T4 DNS ligázt adunk, majd 18 órán át 15°C-on inkubáljuk, így állítjuk elő a rekombináns lambda gtll DNS-t (iii) A rekombináns lambda gtll DNS in vitro pakolása

A fentiek szerint előállított rekombináns lambda gtll DNS-eket tartalmazó oldathoz 10 μΐ (A) oldatot és 15 μΐ (B) oldatot adunk, mindegyik megtalálható a kitben, majd az elegyet 2 óra hosszat 20°C-on inkubáljuk a rekombináns fágok előállítása céljából. A kapott elegyhez 0.5 ml, a kittel szállított SM puffért adunk, majd 10 μΐ kloroformot. Az így kapott elegyet mint cDNS könyvtárat tároljuk 4’C-on.

«· «« ·*·· ···* ···· • 444 · ·· • · · ·Λ·· • · 4 4 · 44

4V44 «··« ♦· ·4·44

6. lépés (A cDNS könyvtárból származó, a NANBV nukleinsavat tartalmazó cDNS klónozása)

Az 1. példa 4. lépésében használt kithez adott Escherichia coli Y1090 törzset 37°C-on tenyésztjük 50 ml LEM táptalajban, amelynek összetétele 1 v% tripton, 0.5 v% élesztökivonat, 1 v% nátrium-klorid és 50 ug/ml ampicillin. Amikor a tenyészet sejtjei elérik a logaritmikus növekedési fázist és a sejtkoncentráció a 2.5 x 10⁸/ml értéket, a sejteket centrifugálással összegyűjtjük (3000/perc, 5 perc) és 4 ml jégbehütött 10 mmólos magnézium-szulfát oldatban szuszpendáljuk. Az 1. példa 5. lépésében kapott rekombináns lambda- gtll fágokat tartalmazó keveréket SM pufferben szuszpendáljuk, ennek összetétele: 0.1 mól nátrium-klorid, 8 mmól magnézium-szulfát, 50 mmól TRIS-HC1 és 0.01% zselatin. A kapott hígított fágoldatból 0.1 ml-t és a fentiekben kapott sejtszuszpenzióből 0.1 ml-t összekeverünk, majd a kapott keveréket 15 percig 37°C-on inkubáljuk, hogy a rekombináns fágokat bejuttassuk az Escherichia coli sejtjeibe. Ezután a keverékhez 3 ml 45°C-ra melegített lágyagar táptalajt adunk (összetétele: 1 v% tripton, 0.5v% élesztökivonat, 0.5v% nátrium-klorid, 0.25v% magnézium-szulfát, 0.7v% agar, pH=7.0). A kapott keveréket ötven L agarlemezre rétegezzük (összetétele 1 v% tripton, 0.5v% élesztökivonat, 1 v% nátrium-klorid, 1.5 v% agar, 100 Ug/ml ampicillin, pH=7.0). A rétegzöagart szobahőmérsékleten hagyjuk megszilárdulni, majd 3 óra hosszat 42°C-on inkubáljuk. Ezután 10 mmól IPTG-t (izopropil-13-D-tio-galaktopiranozid) diffundáltatunk a kapott agarlemezbe. Az említett eljárást 60-szor megismételve 3000 agarlemezt ···· ·· ·♦·· ···· ··<*♦ • · « · · • · ··· « • · · · · · ·«·· ·· ··· ·« kapunk. Ezután száraz nitrocellulóz szürölapot teszünk mindegyik agarlemezre, és 3 óra hosszat 37°C-on inkubáljuk. A kapott szűrőket leválasztjuk a lemezekről, majd háromszor mossuk TBS pufferrel (összetétele 10 mmól TRIS-HC1, 150 mmól nátrium-klorid pH=7.4), majd 2 v%-os borjú szérumalbumin oldatba merítjük, ezután szobahőmérsékleten egy óra hosszat inkubáljuk, hogy minden egyes szűrő felszínén blokkoljuk a reagálatlan részt.

Másképpen, egy Escherichia coli lizáló oldat 1/20 térfogatát, amelyet egy kereskedelmi forgalomban levő immunoscreening kittel adnak (gyártja és árulja Amersham International, Anglia), akut NANB hepatitiszből felgyógyuló beteg összegyűjtött szérumához adjuk, majd a keveréket 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk.

A kapott keveréket

0.2% borjú szérum-albumint tartalmazó

TBS pufferrel hígítjuk. így primer antitestet tartalmazó oldatot kapunk (primer antitest oldat A). Lényegében ugyanezt az eljárást megismételve, azzal a kivétellel, hogy szérumként krónikus hepatítiszes betegtől származó szérumot használunk, kapunk egy másik primer antitestet tartalmazó oldatot (primer antitest oldat B).

Mindegyik említett szürölapot szobahőmérsékleten egy órára az A primer antitest oldatba merítjük. Mindegyik kapott szürölapot négyszer mossuk 0.05 % Tween 20-at (felületaktív anyag) tartalmazó TBST pufferrel. Mindegyik mosott szürölapot belemerítjük egy második antitest oldatba, amit úgy kapunk, hogy egy peroxidázzal jelzett humán IgG antitestet (gyártja és árulja a Cappel Co., Ltd., Nyugat-Németország) 1000-szeresre hígítunk 0.2v% zselatint

·· ··	9999	9999	9999
• · · ·	9	9	9
9 ·	9	999	9
• ·	9 9	9	9 9
9999 9999	99	999	99

tartalmazó TBS pufferrel. A kapott szürölapot egy óra hosszat hagyjuk szobahőmérsékleten állni, majd alaposan mossuk TBST pufferrel, majd a szín előhívására szobahőmérsékleten 20 percre 50 ml olyan TBS pufferbe merítjük, amely 0.4 ml DAB-ot (3,3'-diamino-benzidin-tetrahidroklorid) és 15 ul vizes hidrogénperoxidot tartalmaz. A kapott szürölapokat teljesen mossuk desztillált vízzel, majd a színhivási reakciót leállítjuk. Lényegében az előzőleg leírt eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az A primer antitest oldat helyett a B primer antitest oldatot használjuk. A szűrön kifejlődött színes foltok (pozitív foltok) megfelelnek azoknak a tarfoltoknak (pozitív tarfoltok), amelyek a NANBV cDNS-t tartalmazó rekombináns vírusokkal fertőzött Escherichia coli-bői keletkeztek. Azokat a tarfoltokat választjuk ki, amelyek megfelelnek a színes foltoknak.

Ezzel a módszerrel 22 pozitív tarfoltot választunk ki körülbelül 2 000 000 tarfoltból. A 22 pozitív tarfoltnak megfelelő transzformáns kiónt izoláljuk, majd az említett tarfolt-hibridizálási eljárásnak vetjük alá. 5 pozitív kiónt izolálunk ezzel e módszerrel a 22 pozitív klónból. Az így kapott pozitív kiónokat N-l, N-2, N-3, N-4 és N-5 jelzéssel látjuk el. Az N-l és N-2 kiónokat FERM BP-2416 illetve FERM BP-2431 sorszám alatt helyeztük letétbe a Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Sciencs and Technology-ná1, (Japán).

Továbbá, az 1. példa 3. lépésében izolált cDNS-t lambda gtll-be építjük be, lényegében az 1. példa 6. és 7. lépése szerint, így kapunk egy másik cDNS könyvtárat. Ezt a cDNS könyvtárat használva, az immunoscreeninget ugyanúgy végezve mint ahogy az előzőkben leírtuk, pozitív kiónokat kapunk körülbelül 2 500 000 tarfoltból. Az így kapott pozitív klónokből egy kiónt választunk ki, ennek jele N-18.

Az N-18 kiónt FERM BP-2418 sorszám alatt helyeztük letétbe a Fermentation Research Institute-nál.

Ezután minden egyes klón expressziós termékének a a 2. táblázatban szereplő szérummal való reaktivitását az 1. példa 4. pontja szerint vizsgáljuk, az eredmények a 2. táblázatban láthatók. Ezeknek a kiónoknak az expressziós termékeit reagáltatjuk akut NANB hepatitiszből felgyógyuló .beteg illetve vagy NANB hepatítiszes beteg szérumával, vagy mindkettővel. A kapott kiónok expressziós termékei nem reagálnak egészséges felnőtt emberből, valamint hepatitisz B-ben szenvedő betegből származó szérummal.

• · · * · • · *

-542.Táblásat

A klón egészséges	hepatitisz	akut NANB	krónikus
sorszáma felnőtt	B-s beteg	hepatítiszes	NANB
ember	széruma	beteg	hepatítiszes
széruma		széruma	beteg
			széruma

N-l	-	-	+	-
N-2	‘.i-	— ,		+
	X ,v
N-3	-	-	+	+
N-4		-	-	+
N-5	- '	-	-	+
N-18	—	—	+	+

Reaktivitás: + jelentése pozitív jelentése negatív

Amint az a 2. táblázatból nyilvánvaló, az N-3 és N-18 klón expressziós terméke antigén-antitest reakciót adott mind akut NANB hepatitiszből felgyógyuló beteg szérumával, mind krónikus NANB hepatítiszes beteg szérumával. Másrészről, az N-l klón expressziós terméke antigén-antitest reakciót ad akut NANB hepatítiszes beteg szérumával, az N-2,

-55N-4 és Ν-5 klón expressziós terméke csak krónikus NANB hepatítiszes beteg szérumával ad antigén-antitest reakciót. Ez azt sugallja, hogy az N-3 és N-18 klón expressziós termékét mind akut NANB hepatitisz, mind krónikus hepatitisz diagnosztizálására fel lehet használni, az N-l klón expressziós termékét akut NANB hepatitisz diagnosztizálására lehet használni, az N-2, N-4 vagy N-5 klón expressziós termékét krónikus NANB hepatitisz diagnosztizálására lehet használni.

7. lépés (NANBV cDNS klón expressziója nagy mennyiségben)

Az 1. példa 6. lépésében kapott N-l E.coli transzformánst tenyésztjük. A tenyészetből fág DNS-t izolálunk és fenolos extrakciőnak vetjük alá, majd etanollal kicsapva kapjuk a tisztított fág DNS-t. Az igy tisztított fág DNS-t EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd alacsony olvadáspontú agaróz gélen elektroforetizáljuk, és a gél NANBV cDNS-t tartalmazó részét kivágjuk. A kivágott agaróz gélhez 0.5 ml TEN puffért adunk (összetétele 10 mmól TRIS-HC1, 1 mmól EDTA és 10 mmól NaCl, pH=7.5), majd a keveréket 65°C-ra melegítjük, fenollal extraháljuk, majd etanollal kicsapva kapjuk a NANBV cDNS fragmentet.Az így kapott NANBV cDNS fragmentet lyan vektorba építjük be, amely magasszintü génexpressziót tesz lehetővé Escherichia coli sejtekben. Azaz a pSN518 plazmid DNS-t [Amemura, Μ., Shinagawa, Η., Makino, K., Otsuji, N. & Nakata.A., J.Bacteriol. 152., 692-701 (1982); 4,703,005 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás], amely

-56Escherichia coli-bői származó foszfátkötö fehérjét (phoS) kódoló gént tartalmaz, Hpal restrikciós enzimmel emésztjük. Az emésztménybÖl egy 6.3 kb méretű fragmentet izolálunk elektroforézissel, az előzőek szerint. A kapott

DNS-fragmentet kalcium-kloridőt, nátrium-kloridot,

EDTA-t tartalmaz, oldathoz 0.5 egység

100 ni

Bal31 mmól mmól pufferben oldjuk, amely 12 magnézium-kloridőt TRIS-HCl-t mmól

0.2 mmól majd percig 30°C-on

Bal31 nukleázt (pH=8.0) tartjuk, adunk és mmól kapott (gyártja és árusítja a Takara Shuzo Co., Ltd., Japan), és a reakciót hat percig 30°C-on hagyjuk lejátszódni. A reakcióelegyhez 20. mmól EDTA-t adunk a reakció leállítása céljából. A _l ; reakcióelegyet fenollal extraháljuk, majd etanollal kicsapva kapjuk a DNS fragmentet. Ezután a DNS fragment mindkét végére EcoRI linkért kötünk az 1. példa 5. lépésében leírtak szerint, majd a kapott DNS fragmentet az említett NANBV cDNS fragmenthez ligáijuk. A kapott rekombináns plazmiddal

Escherichia coli DH1 sejteket [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Ώ0, 160 (1968)] transzformálunk. Ami az így kapott transzformánsokat illeti, a NANBV cDNS-ből nick transzlációs kittel (gyártja és árulja az Amersham International, Anglia) ³²P-dCTP-vel jelzett próbával kimutatjuk azokat a transzformánsokat, amelyek a NANBV cDNS-t tartalmazó rekombináns plazmidot hordozzák. Ezzel a módszerrel 32 transzformánsról sikerült kimutatni, hogy a NANBV cDNS-t tartalmazó rekombináns plazmidot hordozzák. Mindegyik transzformánsból fenolos extrakcióval izoláljuk a plazmid DNS-t, majd a fentiek szerint etanollal kicsapjuk. A plazmid DNS-t részlegesen emésztjük EcoRI restrikciós enzimmel, majd fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A kapott DNS fragmentet a kővetkező Összetételű pufferben oldjuk :70 mmól TRIS-HC1 (pH=7.5), 10 mmól magnézium-klorid, 5 mmól ditiotreitol és 200 úrnői dNTP (dATP, dCTP, dGTP és dTTP keveréke). Az oldathoz T4 DNS-polimerázt adunk (gyártja és árulja a Takara Shuzo Co., Ltd., Japán), és az elegyet 30 percig 37⁰C-on tartjuk. A kapott oldatot fenollal extraháljuk, majd a DNS-t etanollal kicsapjuk. Az így kapott DNS-t és egy univerzális terminátort (gyártja és árulja a Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország), amelyben transzlációs terminációs kodon található, felhasználva, az 1. példa 4. lépésében leírt módon plazmidot állítunk elő. Ezután az így kapott plazmiddal Escherichia coli DH1 törzset transzformálunk transzformáns klón előállítása céljából. Az előzőkben említett eljárást mind a 32, az előzőkben kapott transzformánssal megismételjük. így 32 transzformáns kiónt kapunk. Mindegyik transzformánsból telepet izolálunk és 37°C-on éjszakán át növesztjük TRIS-HC1 (pH=7.2) puffer-táptalajban, amely 0.2 v% glükózt és 0.64 mmól kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz, majd a tenyésztett sejteket összegyűjtjük. A tenyésztett sejteket azonos térfogatú, az előzőkben említett puffer-táptalajban szuszpendáljuk, azzal a különbséggel, hogy a kálium primer foszfát mennyiségét 0.064 mmól-ra változtatjuk, és a szuszpenziőt rázatás közben 6 órán át 37°C-on rázatjuk. A kapott tenyészetből a sejteket kinyerjük és 0.15 mól NaCl-t tartalmazó 50 mmólos foszfát pufferben szuszpendáljuk, majd a szuszpendált sejteket üveggyöngyökkel feltárva sejthomogenizátumot kapunk. Ezután a sejthomogenizátumban levő NANBV antigén peptid mennyiségét

-58enzim-kapcsolt immunadszorpciós vizsgálattal (ELISA) határozzuk meg, NANB hepatítiszes betegből származó szérumot használva, az alábbiak szerint. Egy NANB hepatítiszes betegből származó szérumot komplett Freund adjuvánssal fixálunk. Az eleggyel nyulat hiperimmunizálunk. Ezután a hiperimmunizált nyúlból nyert hiperimmun szérumot ammónium-szulfáttal kicsapjuk, majd a kapott csapadékot IgG frakcióként használjuk. A kapott csapadékot gélkromatográfiának vetjük alá Sephacryl S200-at használva (gyártja és árulja Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország), így kapunk tisztított anti-NANBV IgG-t. Ezután a tisztított anti-NANBV IgG-t 50 mmólos karbonát pufferben oldjuk (pH=9.6). Az oldatból 100 μΐ-t DYNATECH MICROELISA lemez lukaiba teszünk (gyártja és árulja a Greiner, Co., Ltd., Nyugat-Németország), majd 18 órán át 4°C-on hagyjuk állni, ezzel immobilizáljuk az anti-NANBV IgG-t az egyes lukak felületére. Mindegyik lukat háromszor mossuk 0.05 v% Tween 20-at tartalmazó foszfát-pufferrel (PBS-T). A sejtkivonat mintában levő NANBV antigén peptid mennyiségét az alábbiak szerint határozzuk meg. A mintából 5 ml-t PBS-T pufferrel meghigítunk úgy, hogy a kapott oldat térfogata az eredeti kétszerese legyen. Az elegyet lecentrifugáljuk (100 000 x g, 4°C. 4 óra), így kapunk csapadékot. Az így kapott csapadékot 0.2 ml olyan PBS-T pufferben oldjuk, amely 0.1 v% Triton Χ-100-at tartalmaz, majd PBS-T pufferrel kétszerező hígítást végzünk 2^lo-szeres hígításig. Mindegyik hígított oldatból 0.1-0.1 ml-t adunk az antitestet immobilizált lukakhoz, majd a reakciót egy óra hosszat 37°C-on hagyjuk lejátszódni. Mindegyik lukat háromszor mossuk PBS-T pufferrel.

-59Másrészröl, az előbb említettel azonos módon kapott anti-NANBV IgG-t torma peroxidázzal (HRPO) jelöljük Wilson, M.B.& Nakane, P. módszerével [Immunofluorescence and related techniques (W.W. Knapp, H. Holubar & G.Wick szerkesztők), 215. old., Elsevier/North-Holland, Amsterdam (1978)], így kapunk HRPO-val jelzett anti-NANBV IgG oldatot. Az oldatot tízszeresre hígítjuk 10 tf% borjúmagzat szérumot tartalmazó PBS-T pufferrel.

A hígított HRPO-val jelzett anti-NANBV IgG oldatot adjuk minden egyes lukhoz, majd egy órán át 37°C-on inkubáljuk, A lukakat háromszor mossuk PBS-T-vel. 0.1 ml, színező anyagként 0.5 mg/ml o-fenilén-diamint, szubsztrátként 2 pl/ml peroxidot tartalmazó 0.05 mólos citrát-foszfát puffért (pH=5.0) adunk minden egyes lukhoz, majd 40 percig fény kizárásával inkubáljuk. A reakció leállítására 0.1 ml 4 normál kénsavat adunk minden egyes lukhoz. A lukakban levő reakcióelegy ELISA titerét 490 nm mért optikai sűrűség alapján határozzuk meg (OD490). Az ELISA titerben mért NANBV antigén peptid mennyisége alapján öt, magas ELISA titert mutató klónt kaptunk (OA-18, 0A-101, 0A-118, 0A-190 és 0A-270). Ezek közül a magas ELISA titert mutató OA-101 és OA-118 kiónokat választottuk ki. Az eredmények a 3(a) táblázatban láthatók.

Lényegében az előzőkben említett eljárást hajtjuk végre, azzal a különbséggel, hogy az N-l klón helyett az N-18 klónt használjuk. így öt magas ELISA titert mutató klónt kapunk (0C-11, OC-25, 0C-27, OE-8 és OB-13). Ezek közül a magasabb ELISA titert mutató 0E-8 klónt választjuk ki. Az eredmények a 3(b) táblázatban láthatók.

···· *··· ···* • · · • ♦ ·♦ · ···

-60Az eredmények azt mutatják, hogy a kiválasztott 0A-101, OA-118 és OE-8 kiónok nagy mennyiségben termelik a NANBV antigént.

3(a) Táblázat

Klón	A sejtkivonat hígításának mértéke	ELISA OD490
OA-18	1:80	0.074
0A-101	1:80	1.416
OA-118	1:80	0.770
0A-190	1:80	0.125
OB-270	1:80	0.068
Escherichia	1:80	0.009
coli (normál)

• « • · «·

-613(b) Táblásat

Klón	A sejtkivonat hígításának mértéke	ELISA 0D4SO
0C-11	1:80	0.080
0C-25	1:80	0.014
0C-27	1:80	1.397
0E- 8	1:80	1.890
0B-13	1:80	0.096

8. lépés (A NANBV antigén tisztítása

Az 1. példa 7. lépésében tisztított 0A-101 Escherichia coli kiónt tenyésztjük, majd a NANBV antigén peptidet tartalmazó sejtkivonatot kinyerjük a tenyészetből. A kapott sejt-extraktumot szacharóz sűrűség gradiensnek vetjük alá 30000/perc fordulátszámmal 18 órán át centrifugálva 10-50 s%-os szacharóz gradiensen Model RPZ-35T centrifugában, zonális rotorral (gyártja és árulja a Hitachi Koki Co., Ltd., Japan), így kapunk egy NANBV antigén peptid frakciót. Ezt a frakciót dializáljuk 0.15 mól NaCl-t tartalmazó 50 mmólos foszfát pufferrel szemben (pH=7.2) 24 órán át a szacharóz eltávolítására. A kapott dializátumot 1/200 mólos foszfát pufferrel szemben dializáljuk (pH= 7.2). Ezután ehhez a dializátumhoz 40 ml 40 s% kálium-bromidot tartalmazó

1/200 mólos foszfát puffért adunk, majd 48 órán át egyensúlyi gradiens centrifugálásnak vetjük alá 45000/perc fordulatszámmal (a centrifugát gyártja és árulja a Hitachi Koki Co., Ltd., Japán, a rotor száma RP-50T-2), így kapunk egy NANBV antigén peptid frakciót. A kapott frakciót 5 mmólos foszfát pufferrel szemben dializáljuk(pH=7.2) 24 órán át a kálium-bromid eltávolítása céljából. A dializátumot kálium-bromid egyensúlyi sürüség-gradiens centrifugálásnak és dialízisnek vetjük alá az említettel azonos módon. így NANBV antigén peptidet tartalmazó dializátumot kapunk. A dializátumból ezután 2 ml-t gélszürés-kromatográfiának vetünk alá Sephacryl 200 oszlopot használva erre a célra (gyártja és árulja a Pharmacia Fine Chemicals AB, Svédország), amelyet fiziológiás sóoldattal hozunk egyensúlyba. A NANBV antigén peptidet tartalmazó frakciókat egyesítjük. így. egy olyan oldatot kapunk, amely az 0A-101 klőnból származó tisztított NANBV antigén peptidet tartalmaz (A-OOla sarzs).

Lényegében a fentemlített eljárást alkalmazzuk azzal a kivétellel, hogy az OE-101 klón helyett az OE-8 klőnt használjuk, így kapunk az OE-8 klőnból származó tisztított NANBV antigén peptidet tartalmazó oldatot (E-OOla sarzs).

9. lépés (Az Ν-1Θ klón által termelt NANBV antigén peptid reaktivitása egy panel szérummal)

Az N-8 klón által termelt antigén pepiidnek egy panel szérummal való reaktivitását az 1. példa 6. lépésében leírt immunoscreening módszerrel határozzuk meg, az A és B panel

• * szérumokkal. Az A panel szérum NANB hepatitiszből lábadozó nyolc beteg szérumát, tizenhárom krónikus NANB hepatítiszes beteg szérumát, öt krónikus hepatitisz B-s beteg szérumát és nyolc egészséges, hepatitisz B negatívnak diagnosztizált ember szérumát tartalmazza. A B panel szérum öt krónikus NANB hepatítiszes beteg szérumát, egy akut NANB hepatítiszes beteg szérumát, két alkoholos krónikus hepatítiszes beteg szérumát és öt egészséges, hepatitisz negatívnak diagnosztizált ember szérumát tartalmazza. Az eredmények a

4. és 5. táblázatban láthatók. A 4. és 5. táblázatban a pozitív arányt (az Ν-1Θ klón által termelt NANBV antigén pepiiddel reagáló szérumok száma a vizsgált szérumok számához viszonyítva) mutatjuk be az egyes szérumcsoportokban.

Az eredmények azt mutatják, hogy a NANBV antigén peptid nem reagált egészséges emberekből származó szérumokkal valamint krónikus hepatitisz B-ben szenvedő beteg szérumával, de specifikusan reagált, nagy reakcióképességgel, krónikus NANB hepatítiszes betegekből származó szérummal. Azaz a pozitív arány 12/12 illetve 5/5 volt (92.3-100 %), amint az a 4. és 5. táblázatban látható.

Azonban a NANB hepatitiszből lábadozó betegekből származó szérummal a NANBV antigén peptid reaktivitása viszonylag alacsony, azaz a pozitív arány 4/8 (50 %), amint az a 4. táblázatban látható. Továbbá, a NANB antigén peptid nem reagált egy akut NANB hepatítiszes betegből származó szérummal, amint az az 5. táblázatban látható. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a krónikus hepatitiszből felgyógyuló beteg szérumában és az akut NANB hepatítiszes

-64beteg szérumában a NANBV antigén elleni antitest nem termelődik elegendő mennyiségben ahhoz, hogy a NANBV antigén peptiddel kimutatható legyen.

4. Táblázat

Panel szérum A	Pozitív arány %
NANB hepatitiszből lábadozó· betegekből származó szérum	4/8	(50)
Krónikus NANB hepatítiszes betegekből származó szérum	12/13	(92.3)
Krónikus hepatitisz B-ben szenvedő betegekből származó szérum	0/5	(0)
Egészséges emberekből származó szérum	0/5	(0)

5. Táblázat

Panel szérum B	Pozitív arány	(%)
Krónikus NANB hepatítiszes betegkböl származó szérum	5/5	(100)
Akut NANB hepatítiszes betegekből származó szérum	0/1	(0)
Alkoholos krónikus hepatítiszes betegből származó szérum	0/2	(0)
Egészséges emberekből származó szérum	0/5	(0)

10. lépés (Az N-l, N-2 és N-18 kiónban levő NANBV cDNS nukleotid szekvenciájának meghatározása)

Az 1. példa 6.lépésében kapott Escherichia coli N-l törzset elszaporítjuk és a rekombináns fág DNS-t izoláljuk a tenyésztett N-l sejtekből, ugyanúgy mint az 1. példa 7. lépésében. A rekombináns fág DNS-t EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a NANBV cDNS fragmentet ugynúgy izoláljuk ahogy az 1. példa 7. lépésében leírtuk. A kapott fragmentet pUC19, Escherichia coli-ban szaporodó vektor plazmidba építjük be (gyártja és árulja a Takara Shuzo Co., ·· 99 9999 9999 9999

9 9 9 9 99

9 9 999* • · · * · 99

9999 9999 99 99999

-66Ltd., Japán). Azaz 1 ug pUC19 vektor plazmidot 30 μΐ puffér oldatban oldunk, amelynek összetétele 100 mmól TRIS-HC1 (pH=7.5), 7 mmól MgC12 és 100 mmól NaCl. A kapott oldathoz 1 μΐ EcoRI restrikciós enzimet adunk (gyártja és árusítja a Takara Shuzo Co., Ltd., Japán). Az elegyet 60 percig 37°C-on inkubáljuk. Ezután a kapott reakcióelegyhez 10 μΐ alkalikus foszfatáz puffért adunk, amelynek összetétele 100 mmól TRIS-HC1 (pH=8.0), 1 mól KC1 és 10 mmól MgSCU, majd 59 μΐ desztillált vizet és 1 μΐ alkalikus foszfatázt (gyártja és árulja a Takara Shuzo Co., Ltd., Japán), majd az elegyet 2 órán átv 60°C-on inkubáljuk. A reakcióelegyet kétszer extraháljuk. fenollal, majd a kapott vizes fázisokat egyesítjük A vizes fázishoz 1/10 térfogatú 3 mólos acetát puffért adunk (pH=4.8), majd kétszeres térfogatú etanolt, és a kapott elegyet a DNS kicsapására -20°C-ra hütjük, majd 12000)perc fordulatszámmal 5 percig centrifugáljuk a DNS csapadék kinyerésére. A kapott csapadékot megszárítjuk, így kapjuk a vektor DNS-t. A vektor plazmid DNS 5'. végén levő foszfátcsoportot a leírt alkalikus foszfatázos kezeléssel eltávolítjuk. Ezután 0.1 μg vektor plazmid DNS-t és 0.1 ug az előzőkben említett NANBV cDNS fragmentet pufferoldatban oldjuk, melynek összetétele: 66mmól TRIS-HC1 (pH=7.6), 66 mmól MgC12, 10 mmól ditiotreitol és 0.1 mmól adenozin-5'-trifoszfát. A kapott oldathoz 1 μΐ ligáz enzimet adunk (gyártja és árulja a Takara Shuzo Co., Ltd., Japán). Az elegyet 3 óra hosszat 16°C-on inkubáljuk, majd fenollal extraháljuk és a DNS kinyerésére etanollal kicsapjuk. Ezután a kinyert DNS-sel Escherichia coli JM109 törzset transzformálunk (gyártja és árulja a Takara Shuzo Co., Ltd., ·· ··· ·· •· ·· « · · · • · • · ···· ····

-67Japán) a kalcium-rubídium módszerrel, majd tenyésztjük. így kapjuk a NANBV cDNS inszertet tartalmazó rekombináns plazmidot hordozó transzformánst. A rekombináns plazmidot izoláljuk az említett transzformáns kiónból, majd EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük. Az emésztéssel kapott fragmentnek meghatározzuk a nukleotid szekvenciáját a 7-DEAZA kit segítségével (gyártja és árulja a Takara Shuzo Co., Ltd., Japán), a Mizusawa és munkatársai által leírt módszerrel [Mizusawa, S., Nishimura, S. and Seela, F.: Nucleic Acids Rés., 14, 1319-1324 (1986)].

Lényegében a leírt módszert hajtjuk végre ismét, azzal a különbséggel, hogy az N-2 illetve N-18 kiónt használjuk az

N-l klón helyett.

Ennek eredményeként azt kapjuk, hogy az N-l transzformáns klón a 2(a) ábrán látható nukleotid szekvenciával rendelkező NANBV cDNS-t tartalmazza; az N-2 transzformáns klón a 2(e) illetve 2(f) ábrán látható nukleotid szekvenciával rendelkező NANBV cDNS-t tartalmazza;

és az N-18 transzformáns klón a 2(a), 2(b), 2(c) és 2(d) ábrákon látható nukleotid szekvenciával rendelkező NANBV cDNS-t tartalmazza.

2. példa (Májszövetből származó hírvivő RNS extrahálása cDNS előállítása céljából) lg, NANB hepatítiszes beteg májából hepatektómiával eltávolított májszövetet apró darabokra vágjuk. 10 ml, az 1. példa 1. lépésében használt, 4 mól guanidin tiocianátot tartalmazó oldatot adunk a májszövet darabokhoz, majd a máj szövet darabokat homogenizáljuk. Ezután az RNS-t ugyanúgy • · · · · · · « extraháljuk a homogenizátumból és tisztítjuk, mint ahogy azt az 1. példa 1. lépésében leírtuk, így állítunk elő RNS tartalmú oldatot. Ezután az oldatból a máj szövetből származó RNS-t izolálunk oligo (dT) oszloppal (0.5 ml).

Az így kapott RNS-t használhatjuk az 1. példa 1. lépésében előállított RNS helyett NANBV cDNS előállítására, lényegében ugyanúgy, ahogy azt az 1. példa 2-8. lépésében leírtuk.

3. példa (Diagnosztikai reagens előállítása az enzim-jelzett immunszorbens vizsgálathoz (ELISA))

Az 1. példa 8. lépésében előállított A-OOla sarzs NANBV antigén peptid felhasználásával egy anti-NANBV antigén peptid IgG-t állítunk elő (A-l sarzs), majd HRPO-val jelöljük lényegében ugyanúgy, ahogy azt az 1. példa 7. lépésében leírtuk, így kapunk egy HRPO-val jelzett anti-NANBV antigén peptid IgG-l-et diagnosztikai reagensként.

Lényegében a fentemlített módszert ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy az E-OOla sarzs NANBV antigén peptidet használjuk az A-OOla sarzs NANBV antigén peptid helyett, így állítunk elő egy másik anti-NANBV antigén peptid IgG-t (E-3 sarzs), majd az IgG-t HRPO-val jelezzük. így egy HRPO-val jelzett anti-NANBV antigén peptid IgG Ε-3-mat kapunk diagnosztikai reagensként.

Az említett HRPO-val jelzett A-l és E-3 IgG-k alkalmazásával az A, B és C,

NANB hepatítiszes betegből származó szérum-mintákban és egy egészséges emberből származó szérumban ELISA módszerrel meghatározzuk a NANBV antigén mennyiségét, ugyanúgy, ahogy az 1. példa 7.

lépésében leírtuk. Az eredmények a 6. táblázatban láthatók.

6. Táblázat

Szérum minta	NANB antigén a szérumban (ELISA titer, OD490)
fixált antitest: A-l	E-3
A	0.171	0.250
B	0.302	0.390
C	0.205	0.310
Szérum egészséges emberből	0.023	0.018

-702. lépés (Diagnosztikai reagens készítése passzív hemagglutinin (PHA) módszerrel, vagy reverz passzív hemagglutinin (rPHA) módszerrel)

Egy birka vérét összegyűjtjük és gyapotruhán átszűrjük. Ezután a szűrön maradó hemocitákat ötször mossuk 13 mmól foszfát pufferrel, amely 0.15 mól NaCl-t tartalmaz (PBS). A kapott hemocitákból 0.4 ml-t 10 ml PBS-ben szuszpendálunk. Ezután a NANBV antigén peptidet az említett szuszpenzióban levő hemocitákra adszorbeáljuk és rögzítjük Avramea és munkatársai módszerével [Immunochemistry, β, 67 (1969)]. Azaz a fentiek szerint kapott, a fixált hemocitákat tartalmazó szuszpenzióhoz 1 ml olyan oldatot adunk, amely az 1. példában kapott tisztított NANBV antigén peptidet (A-OOla sarzs) tartalmazza 25 mg/ml koncentrációban, majd kevertetjük. Ezután, a kapott keverékben levő sejteket centrifugálással kinyerjük, és PBS-sel ötször mossuk. A mosott sejteket 1 ml 1.0 mólos glicin pufferben szuszpendáljuk (pH=7.2), majd a szuszpenziőt 1 órán át hagyjuk állni. A kapott szuszpenzióból a sejteket centrifugálással kinyerjük, majd PBS-sel ötször mossuk. A sejteket 1 tf% normál birka-szérumot tartalmazó PBS-ben szuszpendáljuk 1 s% sejtkoncentrációban. A szuszpenziót használva, a NANBV antigén pepiidnek NANB hepatítiszes betegből származó D-H szérum mintákkal való reaktivitását, valamint egészséges felnőtt, hepatitisz negatívnak diagnosztizált emberből származó szérummal való rektivitását PHA módszerrel meghatározzuk. Lényegében az említett módszert ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy az E-OOla sarzs NANBV antigén peptidet tartalmazó oldatot használjuk.

-71Az eredmények a 7. táblázatban láthatók.

Lényegében a fentemlített eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 3. példa 1. lépésében kapott A-l és E-3 sarzs NANBV antigén peptidet külön-külön használjuk a NANBV antigén peptid helyett, igy kapunk egy antitestet tartalmazó szuszpenziót. A szuszpenzió használatával meghatározzuk az anti-NÁNBV antigén peptid IgG reaktivitását az A-C, NANB hepatítiszes betegekből származó szérum-mintákkal valamint egészséges felnőtt emberekből származó szérummal, az rPHA módszert használva. Az eredmények a 8. táblázatban láthatók.

7. Táblázat

Szérum minta	anti-NANBV antitest a (PHA érték,	szérumban 2n)
fixált	antigén: A-OOla sarzs	E-OOla sarzs
D		n=6	n=7
E *'		8	8
F		5	5
G		11	>11
H		6	8
egészséges	felnőtt
széruma		<1	<1

8. Táblázat

Szérum minta	NANBV antigén a szérumban
(PHA érték,	2n)
fixált	antitest: A-l	E-l
A	4	5
B	6	5
C	6	7
G	11	>11
egészséges felnőtt széruma	<1	<1

3. lépés (Diagnosztikai reagens készítése a radioimmunesszéhez (RIA) (1) NANBV elleni antitest kimutatása a szérumban

A 3. példa 1 lépésében készített tisztított anti-NANBV IgG A-l-et ¹²⁵I-dal jelezzük a klóramin T módszerrel [Greenwood et al., Biochemical Journal,fid,114 (1963)].

Részletesen: 4 ml tisztított IgG-t (5 mg/ml), jeges vízbe hütünk, majd 1 mCi/10 ni ^12SI-ot adunk az TgG-hez enyhe kevertetés közben. Az elegyhez ezután 1 ml 200 ug/ml t

koncentrációjú vizes klóramin T-t adunk, majd 5 percig kevertetjük. A kapott elegyhez ezután 1 ml 200 ug/ml koncentrációjú vizes nátrium-metabiszulfitot adunk a reakció leállítására. A kapott elegyet a reagálatlan ¹²⁵I eltávolítására dializáljuk, így kapunk ^12eI-vel jelzett anti-NANBV antigén peptid IgG A-l-et.

Másrészről, NANBV antigén peptid-fixált gyöngyöket a következőképpen állítunk elő. Az 1. példa 8. lépésében kapott A-OOla sarzs NANB antigén pepiidhez glutáraldehiddel kezelt polisztirol gyöngyöket adunk. Az elegyet éjszakán át 4°C-on hagyjuk állni, hogy a gyöngyök felszínén rögzítsük az antigén peptidet. Hogy megakadályozzuk azt, hogy a NANBV ellenes antitesttől eltérő anyagok aspecifikusan reagáljanak az antigén peptidhez kapcsolt gyöngyökkel, szarvasmarha szérum albumint adunk az antigén peptidhez, majd az elegyet éjszakán át hagyjuk állni. Ezután a gyöngyökhöz kötött NANBV antigén peptidet (A-OOla sarzs) használjuk diagnosztikai reagensként.

Az előzőkben előállított ¹²⁵I-vel jelzett anti-NANBV antigén peptid IgG A-l-et és a gyöngyökhöz rögzített NANBV antigén peptidet használva NANB hepatítiszes betegből származó, egy egészséges felnőttből származó és egy NANBV antigén peptidre hiperimmunizált nyúlból származó D-F szérum mintákban egy NANB antigén peptid ellenes antitestet mutattak ki RIA-val. Azaz, a ^12SI-dal jelzett antitestből 0.1 ml-t teszünk a RIA lemez minden egyes lukéba, majd minden lukba 0.1 ml szérumot adunk. Ezután minden egyes lukba gyöngyhöz rögzített antigén peptidet adunk, majd éjszakán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni. A kapott

-75gyöngyöket megfelelő mértékben mossuk desztillált vízzel. Az egyes lukakban levő gyöngyök radioaktivitását (cpm) auto-gamma számlálóban határozzuk meg.' Ezután a radioaktivitásból meghatározzuk a ^12BI-vel jelzett anti-NANBV antigén peptid IgG és a gyöngyökhöz rögzített

NANBV antigén peptid közötti reakció százalékos gátlását a

kővetkező képlettel, azzal a feltételezéssel,	hogy az
egészséges emberből származó szérum gátló hatása	0 %, a
NANBV antigén peptidre hiperimmunizált nyúlból	származó

szérum gátló hatása 100 %:

(a-b)-c

-------- _{x 1O}o (%), a-b ahol a jelentése az egészséges emberből származó szérumnak megfelelő radioaktivitás (cpm), b jelentése a NANBV antigén peptidre hiperimmunizált nyúlból származó szérumnak megfelelő radioaktivitás (cpm), c jelentése egy NANB hepatítiszes betegből származó szérumnak megfelelő radioaktivitás.

Az eredmények a 9. táblázatban láthatók.

Lényegében az említett eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az IgG A-l sarzs helyett az IgG E-3 sarzs anti-NANBV antigén peptidet használjuk másik i2S__vel jelzett IgG E-3 anti-NANBV antigén peptid előállítására. Továbbá lényegében a fenti eljárást ismételjük meg, azzal a

-76különbséggel, hogy az A-OOla sarzs helyett az E-OOla antigén peptid sarzsot használjuk egy újabb, gyöngyökre rögzített NANBV antigén peptid (E-OOla sarzs) előállítására diagnosztikai reagensként. A ¹²⁵I-vel jelzett E-3 anti-NANBV antigén peptidet és a gyöngyökre rögzített E-3 antigén peptidet (E-OOla sarzs) használva a szérum minták vizsgálatát az előzőkben említett módon hajtjuk végre. Az eredmények a 9. táblázatban láthatók.

Ha a szérum minta NANBV ellenes antitestet tartalmaz, (D-F minták), akkor a gyöngyökre rögzített NANBV antigén peptid és a ^12eI-vel jelzett anti NANBV antigén peptid IgG közötti reakció gátlódik a gyöngyökre rögzített antigén peptid és a szérumban levő anti-NANBV antitest közötti reakció miatt. Tehát a gyöngyök radioaktivitása,ami a gyöngyökhöz kötött jelzett antitestek miatt keletkezik, viszonylag alacsony, és a jelzett anti-NANBV antigén peptid valamint a gyöngyökhöz rögzített antingén peptid közötti gátlás értéke a 74-100%-ot is eléri.

9. Táblásat

Szérum minta	Rögzített antigén
A-OOla sarzs	E-OOla sarzs
cpm,	gátlás (%)	cpm,	gátlás (%)
F	1433	(89)	1004	(93)
G	155	(99)	162	(100)
H	3387	(74)	3260	(77)
Egészséges humán
szérum	13025	(0)	13630	(0)
Hiperimmunizált nyúl szérum	145	(100)	160	(100)

(2) NANBV antigén kimutatása szérumban

Gyöngyökre rögzített anti-NANBV antigén peptid IgG-t lényegében az előzőleg említett módszerekkel állítunk elő, azzal a különbséggel, hogy az A-OOla sarzs NANBV antigén peptid helyett az A-l sarzs anti-NANBV antigén peptid IgG-t használjuk.

-78A fentiek szerint előállított ^12eI-vel jelzett anti-NANBV antigén peptid IgG A-l és a gyöngyökhöz rögzített anti-NANBV antigén peptid IgG (A-l sarzs) felhasználásával két NANB hepatítiszes beteg és egy egészséges ember szérumában mutattunk ki NANBV antigént a fentiekkel azonos módszerrel. Az eredmények a 10. táblázatban láthatók.

Továbbá a NANBV antigén kimutatását a szérum mintákban egy másik, a fentiekben előállított IgG E-3 jelű, ¹²⁵I-jelzett anti-NANBV antigén peptidet, valamint a fentiekben említett módon, az E-3 jelű anti-NANBV antigén peptid IgG sarzsból előállított, gyöngyökhöz rögzített anti-NANBV antigén peptid E-3 sarzs IgG-t használva, az előzőkben említett módon végezhetjük. Az eredmények a 10. táblázatban találhatók.

	1 0 .	Táblázat
	Rögzített	antitest
szérum	A-l sarzs	E-3 sarzs
minta	cpm	cpm
A	790	1253
B	3507	5620
C	1194	2004
szérum egészséges emberből	188	195

Az eredmények azt mutatják, hogy a NANBV hepatítiszes betegekből származó szérum minták specifikusan kimutathatók ¹²⁵I-vel jelzett anti-NANBV antigén peptid IgG-vel és a gyöngyökhöz rögzített anti-NANBV antigénnel.

4. Példa (A NANBV RNS kimutatása ponthibridizációval és

Northern biot módszerrel)

A rekombináns fágot az 1. példa 6. lépésében előállított

N-l transzformáns kiónból izoláljuk, restrikciós enzimmel emésztjük, így kapjuk tartalmazó cDNS fragmentet. Emellett a majd az EcoRI a NANBV cDNS-t

PÜC19 plazmidot (gyártja és árulja a Takara Shuzo Co., Ltd., Japán) is EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk, majd alkalikus foszfatázzal

-80kezeljük. Az említett cDNS fragmentböl 0.1 ug-ot, a hasított vektor DNS fragmentböl 0.1 jjg-ot, valamint 5 ul 10 x ligáz oldatot (öszetétele 1.1 mmól ATP, 60 mmól TRIS-HC1 (pH=7.6), 66 mmól magnézium-klorid és 100 mmól ditiotreitol) és 0.2 egység T4 DNS ligázt összekeverünk, majd az elegy térfogatát desztillált víz hozzáadásával 50 uil-re állítjuk. A kapott elegyet 16 órán át 4°C-on inkubáljuk, majd fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Az így kapott csapadékot 10 μΐ TE pufferben oldjuk, és a kapott eleggyel Escherichia coli JM109 sejteket (gyárja és árulja a Takara Shuzo Co., Ltd. , Japán) transzformálunk az elözökb^.. említett kalcium-rubídium módszerrel·. Egy, a NANBV cDNS-£ /tartalmazó transzformáns kiónt kiválasztunk és izolálunk, 50 ug/ml ampicillint tartalmazó agarlemezen.

A hibridizáláshoz a ³²P-vel jelzett cDNS-t az alábbiak szerint állítjuk elÖ. A fentiekben említett transzformáns kiónból izoláljuk a plazmid DNS-t és EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük. A plazmid DNS-böl a NANBV cDNS-t elektroforézissel izoláljuk és tisztítjuk alacsony olvadáspontú agaróz gél felhasználásával, ugyanazzal a módszerrel, mint amit az 1. példa 7. lépésében leírtunk. [_a-³²]dCTP (3000 Ci/mmól) és egy Amersham nick transzlációs kit (gyártja és árulja az Amersham International, Anglia) alkalmazásával előállítjuk a ³²P-vel jelzett NANBV cDNS-t. Hogy megvizsgáljuk a ³²P-vel jelzett cDNS-nek a NANB hepatítiszes beteg szérumával való reaktivitását, pont hibridizálást alkalmazunk NANB hepatítiszes betegekből származó öt szérumot használva, két olyan szérumot, amely hepatitisz B-ben szenvedő betegekből származik, és ellenörzésként egy egészséges emberből származó mintát, valamint próbaként a jelzett NANBV cDNS-t, az 1. példa 4. lépésében leírt módszerrel. Az eredmények az 1. ábrán láthatók. Az 1. ábrán az 1-5. pontban NANB hepatítiszes betegből származó szérum eredményei láthatók, a 6-7. pontban hepatitisz B-ben szenvedő betegből származó szérum eredményei láthatók, és a 8. pontban hepatitisz negatívnak diagnosztizált egészséges emberből származó szérum eredményei. Amint az az 1. ábrán látható, a jelzett NANBV cDNS specifikusan hibridizálódik a NANB hepatítiszes betegek szérumához, de nem hibridizálódik a hepatitisz B-s betegek illetve az egészséges ember·szérumához.

Másik módszer szerint, a NANBV RNS kimutatását Northern biot módszerrel végezzük, az alábbi módszer szerint. Azaz RNS-t készítünk mindegyik szérumból ugyanazzal a módszerrel, mint az 1. példa 4. lépésében, és 6%-os formaldehid-agaróz-gél elektroforézisnek vetjük alá. Az RNS-t kinyerjük a gélből, oldjuk 10 x SSC-ben (1.5 mól NaCl és 0.15 mól nátrium-citrát), majd az átvitelhez kialakított berendezésben (gyártja és árulja a Bio-Rad

Laboratories, át. A nitrocellulóz membránt 2 órán át 80°C-on sütjük, majd a kapott membránt elöhibridizáló oldatba tesszük (50%-os formaldehid, 5 x SSC (0.75 mól NaCl és 0.075 mól nátrium-citrát), 5 x

Denhardt, mmól foszfát-citrát puffer (pH=6.5), 1% glicin, 100 ug/ml lazac sperma DNS), majd 4 órán át 42°C-on inkubáljuk. A membránt ezután kivesszük az elöhibridizáló oldatból. A membránhoz adjuk az egyszálú DNS-t, amelyet úgy kapunk, hogy a fentiekben előállított ³²P-vel jelzett cDNS próbát « 1 * ··· · • * · « · ♦ · ·«·» ·«·· « -·* megmelegítjük, majd a hibridizálás kivitelezésére 22 órán át 42°C-on inkubáljuk. A hibridizáció teljes lejátszódása után a kapott nitrocellulóz membránt 50°C-on háromszor mossuk 2 x SSC-vel (0.3 mól NaCl és 0.03 mól nátrium-citrát), amely 0.1% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) és 0.1% pirofoszforsavat tartalmaz. A kapott membránt megszárítjuk, majd majd a NANBV RNS kimutatására autoradiográfiát végzünk. A kapott eredmények lényegében megegyeznek azzal, amit az előzőkben említett pont hibridizációval kaptunk.

1. Alkalmazási példa (Tisztított NANB hepatitisz vakcina előállítása)

Az A-OOla sarzs tisztított NANBV antigén peptid oldathoz, amelyet az 1. példa 8. lépésében állítottunk elő, 0.02% formaiint adunk, majd 5 napig 4°C-on hagyjuk állni. Ezután a kapott, formaiinnal kezelt NANBV antigén peptid oldatot fiziológiás sóoldattal annyira hígítjuk, hogy a NANBV antigén peptid koncentrációja 40 ug/ml legyen. A kapott oldatot olyan fiziológiás sóoldattal keverjük el 1:1 arányban, amely 0.4 mg/ml koncentrációban alumínium-hidroxidot tartalmaz. A keveréket 30 percig kevertetjük, majd 20 percig 3000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk, a csapadék kinyerésére. A kapott csapadékot 13 mmólos foszfát pufferben szuszpendáljuk (pH=7.2), amely 0.15 mól MaCl-t tartalmaz, így állítjuk elő az alumínium-hidroxidra adszorbeált NANB hepatitisz vakcinát.

Lényegében a fentemlített eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az A-OOla sarzs antigén peptid helyett az E-OOla sarzs NANBV antigén peptidet használjuk, így

-83állítunk elő alumínium-hidroxidra adszorbeált NANB hepatitisz vakcinát.

A kapott vakcina immunogenitásának vizsgálatát azoknak a szabványoknak az alapján végezzük, amelyeket rekombináns hepatitisz B vakcina (élesztő eredetű) vizsgálatára léptettek életbe, leírásuk megtalálható az előzőkben említett Minimum Requirements fór Biological Products című leírásban közölnek. Azaz, az említett vakcinából 1-1 ml-t szubkután beadunk öthetes egerek hátába. A beadás után öt héttel az egerekből vérmintát veszünk, majd passzív hemagglutinációs tesztnek vetjük alá, hogy meghatározzuk az antitest titert a vérmintákban. Az eredmények a 11. táblázatban láthatók.

”•5 . · · ··· • · < · · ···· ···· ·· ···

-8411. Táblásat

Antigén		A vakcina	Átlagos	antitest
sarzsszám		hígítása	titer	(2n)
		1:2		n=9.8
		1:4		8.9
A-OOla		1:8		5.6
		1:16		4.4
		1:2		>10
		1:4		9.7
E-OOla		1:8		8.5
		1:16		6.9
Fiziológiás sőoldat			< 1.0
2. Alkalmazási	példa	(NANBV antigén	peptidre	specifikus
monoklonális	antitest	készítése,	és a NANBV antigén

kimutatása a monoklonális antitesttel)

Az 1. példa 8. lépésében kapott E-OOla sarzs tisztított NANBV antigén peptidböl 20 ug-ot, és 20 ng Freund komplett adjuvánst összekeverünk. A keveréket intraperitonálisan adjuk be 8 hetes BALB/c egereknek, az egerek immmunizálása céljából. 3 vagy 5 hét elteltével a második illetve harmadik immunizálást az előzővel azonos módon végezzük. Három nappal a harmadik immunizálás után az egér lépét kivesszük. A lépet négyfelé vágjuk, és egy csipesszel megnyomkodjuk. Ezután a • · • •W «WW· WWW· • · · • · · ·*· • · < · · · · ···· ···· ·· ··· ·· négy lépdarabot rozsdamentes acél szűrön szűrjük át (200 mesh Tyler), így kapunk lépsejteket. A sejteket mossuk, majd NS-1 táptalajban szuszpendáljuk (ez egy RPMI táptalaj (gyártja és árulja a Gibco Co.,USA), amely 15 tf% borjúmagzat szérumot tartalmaz), 6 x 10⁷ sejt/ml koncentrációban. A kapott lépsejt szuszpenzióból 1 ml-t és 2 x 10⁷ SP-2/0-Ag 14' mielóma sejtet (ATCC CTRL 1581) összekeverünk és a kapott keveréket sejtfúziónak vetjük alá polietilén-glikol (PEG 6000) jelenlétében a Tatsuo Iwasaki és munkatársai által leírt módszer szerint [Monoclonal Antibody, 30. old. (1982), kiadó a Kodansha Scientific, Japán], így kapunk három olyan hibridóma kiónt, amely képes a NANBV antigén peptidre specifikus monoklonális antitestet termelni. A kapott kiónok jele 2-1B-3, 36-7H-5, 38-1C-14. Mindegyik kiónt külön szaporítjuk, így állítunk elő a NANBV antigén peptidre specifikus monoklonális antitesteket.

Azt, hogy egy NANBV hepatítiszes beteg májában levő NANBV antigént ki lehet-e specifikusan mutatni az egyes monoklonális antitestekkel, azt a kővetkezőképpen vizsgáljuk. A két NANBV hepatítiszes beteg és egy hepatitisz B-ben szenvedő beteg májából hepatektómiával nyert máj szövetet lefagyasztjuk és szöveti metszetet készítünk az egyes lefagyasztott májszövetekből. Az egyes metszeteket acetonnal fixáljuk, majd külön-külön reagáltatjuk az említett monoklonális antitestekkel 37°C-on 1 óráig az Introduction of Experimental Virology-ban leírt módszer szerint [szerkeszti Gakuyuaki of National Institute of Health, Japán, 297. oldal (1975), kiadja a Maruzen K.K., Japán]. A kapott mintákat megfelelő mértékben mossuk PBS-sel ···· ···· · · · · ·

-86(0.005 mól foszfát puffer (pH=7.0), amely 0.1 mól NaCl-t tartalmaz). A mintát ezután FITC fluorokrómmal jelzett anti-egér IgG-vel reagáltatjuk (gyártja és árulja a Cappel Co., USA) 37°C-on 1 órán át.

A kapott mintát elegendő mértékben mossuk PBS-sel, majd fluoreszcencia mikroszkópon vizsgáljuk, hogy a minta fluoreszkál-e vagy sem. A fluoreszkáló mintát NANBV antigén pozitívként határozzuk meg. Az eredmények a 12. táblázatban láthatók.

♦ ♦♦

-8712. Táblázat

A használt monoklonális antitestet

	Minta	termelő klón	sorszáma
		2-1B-3	36-7H-5	38-1C-14
	NANBV hepatítiszes betegből nyert máj szövet (No. 1)	+	+	+
	NANBV hepatítiszes betegből nyert máj szövet (No. 2)	+	+	+
	Hepatitisz B-ben szenvedő betegből nyert

májszövet

Megjegyzés: (+) jelentése fluoreszcencia pozitív (-) jelentése fluoreszcencia negatív

Amint az a 10. táblázatból nyilvánvaló, ha a NANBV antigén peptidre specifikus antitestet használjuk egy beteg máj szövet mintájában a NANBV antigén peptid kimutatására, akkor a NANB hepatitiszt nagy biztonsággal lehet diagnosztizálni.

Claims (13)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Lényegében véve tiszta nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptid, azzal jellemezve, hogy antigén-antitest reakciót ad egy akut nem-A, nem-B hepatitiszből lábadozó beteg szérumával és/vagy egy krónikus nem-A, nem-B hepatítiszes beteg szérumával, és nem ad antigén-antitest reakciót egy klinikailag hepatitisz-negatívnak diagnosztizált ember szérumával és/vagy egy nem-A, nem-B hepatitisztől eltérő hepatitiszesnek diagnosztizált beteg szérumával.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptid, azzal jellemezve, hogy az alábbi (I)-(VI) képletű nukleotid-szekvenciák, illetve az (I)-(VI) képletű nukleotid-szekvenciák legalább egy nukleotidjának a genetikai kód degenerációja alapján történő helyettesítésével kapott nukleotid-szekvenciák közül legalább egyet tartalmazó DNS által kódolt aminosav-szekvenciának legalább egy részét tartalmazza:

   GAATTCCAAAAAGAGCAAAACAAACCGCCGAAGAAAAAACTAATAAGAGAAGAAAAGGCG

   AAGAGACACAGGAAAAAAAAAACAGAGACGAAGGTCAGATAGAAAAAAAGCAAGGAATTC • · · (i) ;

   GAATTCCGAGAACAAGACCAGATAAAAACCAAAGACAGAACACAACAGAGAAAGACGAAA AGAAGCACCAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAAAAAAAAAAAAAAAGGAATTC ...(II);

   GAATTCCAAGAAAAAAAGGGAGAAGCCAGCAATGGAGAAGCCGAAAACGACACACACAAG AAACAAAGGAGGTACAAAGAAAAAGAAAAAACGGCAACAAATAACCCAGGAAAGAACAAA AAGCCAAGAGTGGGCAGAATAAAAAACTGGAACCGGGAGGGAAGGAAGGACGCATATCAG ATTAGAAAAAGGAGGGAATTC...(III);

   GAATTCCTAAGAAATGGCTAGCCCTAGGAGAGGCAGTCTTTCCCCAGTCAGTTAGCCCGC

   AAATGCCAGAGCATCAAGAATTCAGAAAAGGAGAAAATATAGTTAATATCAAAGTGGTCG

   AAGCCTAAGATAGAGAGGTAGAGAGTATGAAGAGTAAGACGAATACAAACCAAAATTCTG GAATGATCATTAAAAACATTATTGATAGGTACTTAGAAGGGCAAGAGAGGAAGAAGAAAG TAATGAGAAATGCTTATGGAAGCCAAAGGACCTTTCCAGGAGAAGAAAGGGAATTC

   ...(IV);

   GAATTCCCAACGCGTCGGCTTGGCCCGCGCCTTGGCCGCCGACCCGCGCTGATGGCCGTG

   GAATTC...(V);

   GAATTCCGGGGTATTTGCCTCGATCTGCCTGCTCAGCGCTTCGGCCCTCGGCTTGGGCGC CCTGCTGCTGGCTTCCGAGCAGCTATTCAGCGCCTTGAAAGTGGTTGGCGCGGCGTACGT GTCCGGGAATTC...(VI);

   ahol a nukleotid-szekvenciák bal, illetve jobb oldali vége az 5'-véget, illetve a 3·-véget képviseli, amely aminosavszekvencia-rész reaktív a nem-A, nem-B hepatitisz vírus antitesttel.
3. 3. Kevert antigén, azzal jellemezve, hogy legalább két különböző nem-A, nem-B hepatitisz antigén peptidet tartalmaz, amelyek mindegyike lényegében véve tiszta, és antigén-antitest reakciót ad egy akut nem-A, nem-B hepatitiszből lábadozó beteg szérumával és/vagy egy krónikus nem-A, nem-B hepatítiszes beteg szérumával, és nem ad antigén-antitest reakciót egy klinikailag hepatitisz-negatívnak diagnosztizált ember szérumával és/vagy egy nem-A, nem-B hepatitisztől eltérő hepatitiszesnek diagnosztizált beteg szérumával.
4. 4. A 3. igénypont szerinti kevert antigén, azzal jellemezve, hogy a különböző antigén peptidek mindegyike az alábbi (I)—(VI) képletű nukleotid-szekvenciák, illetve az (I)-(VI) képletű nukleotid-szekvenciák legalább egy nukleotidjának a genetikai kód degenerációja alapján történő helyettesítésével kapott nukleotid-szekvenciák közül legalább egyet tartalmazó DNS által kódolt aminosav-szekvenciának legalább egy részét tartalmazza:

   GAATTCCAAAAAGAGCAAAACAAACCGCCGAAGAAAAAACTAATAAGAGAAGAAAAGGCG

   AAGAGACACAGGAAAAAAAAAACAGAGACGAAGGTCAGATAGAAAAAAAGCAAGGAATTC ...(I);

   GAATTCCGAGAACAAGACCAGATAAAAACCAAAGACAGAACACAACAGAGAAAGACGAAA

   AGAAGCACCAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAAAAAAAAAAAAAAAGGAATTC ...(II);

   GAATTCCAAGAAAAAAAGGGAGAAGCCAGCAATGGAGAAGCCGAAAACGACACACACAAG

   AAACAAAGGAGGTACAAAGAAAAAGAAAAAACGGCAACAAATAACCCAGGAAAGAACAAA

   AAGCCAAGAGTGGGCAGAATAAAAAACTGGAACCGGGAGGGAAGGAAGGACGCATATCAG ATTAGAAAAAGGAGGGAATTC...(III);

   GAATTCCTAAGAAATGGCTAGCCCTAGGAGAGGCAGTCTTTCCCCAGTCAGTTAGCCCGC

   AAATGCCAGAGCATCAAGAATTCAGAAAAGGAGAAAATATAGTTAATATCAAAGTGGTCG

   AAGCCTAAGATAGAGAGGTAGAGAGTATGAAGAGTAAGACGAATACAAACCAAAATTCTG

   GAATGATCATTAAAAACATTATTGATAGGTACTTAGAAGGGCAAGAGAGGAAGAAGAAAG

   TAATGAGAAATGCTTATGGAAGCCAAAGGACCTTTCCAGGAGAAGAAAGGGAATTC ·-(IV);

   GAATTCCCAACGCGTCGGCTTGGCCCGCGCCTTGGCCGCCGACCCGCGCTGATGGCCGTG GAATTC...(V);

   GAATTCCGGGGTATTTGCCTCGATCTGCCTGCTCAGCGCTTCGGCCCTCGGCTTGGGCGC

   CCTGCTGCTGGCTTCCGAGCAGCTATTCAGCGCCTTGAAAGTGGTTGGCGCGGCGTACGT

   GTCCGGGAATTC...(VI);

   ahol a nukleotid-szekvenciák bal, illetve jobb oldali vége az 5'-véget, illetve a 3 *-véget képviseli, amely aminosavszekvencia-rész reaktív a nem-A, nem-B hepatitisz vírus antitesttel.
5. 5. Nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptidet kódoló cDNS, azzal jellemezve, hogy az antigén peptid antigén-antitest reakciót ad egy akut nem-A, nem-B hepatitiszből lábadozó beteg szérumával és/vagy egy krónikus nem-A, nem-B hepatitiszes beteg szérumával, és nem ad antigén-antitest reakciót egy klinikailag hepatitisz-negatívnak diagnosztizált ember szérumával és/vagy egy nem-A, nem-B hepatitisztől eltérő hepatitiszesnek diagnosztizált beteg szérumával.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy az alábbi (I)-(VI) képletű nukleotid-szekvenciák, illetve az (I)-(VI) képletű nukleotid-szekvenciák legalább egy nukleotid j ának a genetikai kód degenerációja alapján történő helyettesítésével kapott nukleotid-szekvenciák közül legalább egyet tartalmaz:

   • <· · · » · · • » · « * · ·· · ···«·

   - 93 GAATTCCAAAAAGAGCAAAACAAACCGCCGAAGAAAAAACTAATAAGAGAAGAAAAGGCG

   AAGAGACACAGGAAAAAAAAAACAGAGACGAAGGTCAGATAGAAAAAAAGCAAGGAATTC ...(I);

   GAATTCCGAGAACAAGACCAGATAAAAACCAAAGACAGAACACAACAGAGAAAGACGAAA

   AGAAGCACCAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAAAAAAAAAAAAAAAGGAATTC ...(ii);

   GAATTCCAAGAAAAAAAGGGAGAAGCCAGCAATGGAGAAGCCGAAAACGACACACACAAG

   AAACAAAGGAGGTACAAAGAAAAAGAAAAAACGGCAACAAATAACCCAGGAAAGAACAAA

   AAGCCAAGAGTGGGCAGAATAAAAAACTGGAACCGGGAGGGAAGGAAGGACGCATATCAG ATTAGAAAAAGGAGGGAATTC...(III);

   GAATTCCTAAGAAATGGCTAGCCCTAGGAGAGGCAGTCTTTCCCCAGTCAGTTAGCCCGC

   AAATGCCAGAGCATCAAGAATTCAGAAAAGGAGAAAATATAGTTAATATCAAAGTGGTCG

   AAGCCTAAGATAGAGAGGTAGAGAGTATGAAGAGTAAGACGAATACAAACCAAAATTCTG

   GAATGATCATTAAAAACATTATTGATAGGTACTTAGAAGGGCAAGAGAGGAAGAAGAAAG

   TAATGAGAAATGCTTATGGAAGCCAAAGGACCTTTCCAGGAGAAGAAAGGGAATTC

   ...(IV);

   GAATTCCCAACGCGTCGGCTTGGCCCGCGCCTTGGCCGCCGACCCGCGCTGATGGCCGTG GAATTC...(V);

   GAATTCCGGGGTATTTGCCTCGATCTGCCTGCTCAGCGCTTCGGCCCTCGGCTTGGGCGC

   CCTGCTGCTGGCTTCCGAGCAGCTATTCAGCGCCTTGAAAGTGGTTGGCGCGGCGTACGT

   GTCCGGGAATTC...(VI);

   ahol a nukleotid-szekvenciák bal, illetve jobb oldali vége az 5’-véget, illetve a 3'-véget képviseli, amely nukleotidszekvencia-rész olyan peptidet kódol, amely reaktív a nem-A, nem-B hepatitisz vírus antitesttel.
7. 7. Eljárás nem-A, nem-B hepatitisz diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy egy beteg szérumát olyan, lényegében véve tiszta nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptiddel érintkeztetjük, amely antigén-antitest reakciót ad egy akut nem-A, nem-B hepatitiszből lábadozó beteg szérumával és/vagy egy krónikus nem-A, nem-B hepatítiszes beteg szérumával, és nem ad antigén-antitest reakciót egy klinikailag hepatitisz-negatívnak diagnosztizált ember szérumával és/vagy egy nem-A, nem-B hepatitisztől eltérő hepatitiszesnek diagnosztizált beteg szérumával, megállapítjuk, hogy a szérum reagált-e a nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptiddel, és meghatározzuk, hogy a szérum a reaktivitás alapján nem-A, nem-B hepatitiszre nézve pozitív vagy negatív.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptidet használunk, amely az alábbi (I)-(VI) képletű nukleotid-szekvenciák, illetve az (I)-(VI)i képletű nukleotid-szekvenciák legalább egy nukleotiájának a genetikai kód degenerációja alapján történő helyettesítésével kapott nukleotid-szekvenciák közül legalább egyet tartalmazó DNS által kódolt aminosav-szekvenciának legalább egy részét tartalmazza:

   < «V · 4 A ·4·*·» ··· *·4 <» • · A Λ ··

   - 95 GAATTCCAAAAAGAGCAAAACAAACCGCCGAAGAAAAAACTAATAAGAGAAGAAAAGGCG

   AAGAGACACAGGAAAAAAAAAACAGAGACGAAGGTCAGATAGAAAAAAAGCAAGGAATTC • · (i) ;

   GAATTCCGAGAACAAGACCAGATAAAAACCAAAGACAGAACACAACAGAGAAAGACGAAA

   AGAAGCACCAATCGCAGGCGAAGCAAAAACGAAAAAAAAAAAAAAAAGGAATTC •••(ll);

   GAATTCCAAGAAAAAAAGGGAGAAGCCAGCAATGGAGAAGCCGAAAACGACACACACAAG

   AAACAAAGGAGGTACAAAGAAAAAGAAAAAACGGCAACAAATAACCCAGGAAAGAACAAA

   AAGCCAAGAGTGGGCAGAATAAAAAACTGGAACCGGGAGGGAAGGAAGGACGCATATCAG

   ATTAGAAAAAGGAGGGAATTC...(III);

   GAATTCCTAAGAAATGGCTAGCCCTAGGAGAGGCAGTCTTTCCCCAGTCAGTTAGCCCGC

   AAATGCCAGAGCATCAAGAATTCAGAAAAGGAGAAAATATAGTTAATATCAAAGTGGTCG

   AAGCCTAAGATAGAGAGGTAGAGAGTATGAAGAGTAAGACGAATACAAACCAAAATTCTG

   GAATGATCATTAAAAACATTATTGATAGGTACTTAGAAGGGCAAGAGAGGAAGAAGAAAG

   TAATGAGAAATGCTTATGGAAGCCAAAGGACCTTTCCAGGAGAAGAAAGGGAATTC •••(ÍV);

   GAATTCCCAACGCGTCGGCTTGGCCCGCGCCTTGGCCGCCGACCCGCGCTGATGGCCGTG

   GAATTC...(V);

   GAATTCCGGGGTATTTGCCTCGATCTGCCTGCTCAGCGCTTCGGCCCTCGGCTTGGGCGC

   CCTGCTGCTGGCTTCCGAGCAGCTATTCAGCGCCTTGAAAGTGGTTGGCGCGGCGTACGT

   GTCCGGGAATTC...(VI);

   «··« « * ·«··«·· « ·« V · · <ϊ • · · · ♦· «· « · ♦ · ♦· ahol a nukleotid-szekvenciák bal, illetve jobb oldali vége az 5'-véget, illetve a 3'-véget képviseli, amely aminosavszekvencia-rész reaktív a nem-A, nem-B hepatitisz vírus antitesttel.
9. 9. Eljárás transzfúziós vér átvizsgálására, azzal jellemezve, hogy

   a) teljes vérből szérumot izolálunk,

   b) a szérumot olyan, lényegében véve tiszta nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptiddel érintkeztetjük, amely antigén-antitest reakciót ad egy akut nem-A, nem-B hepatitiszből lábadozó beteg szérumával és/vagy egy krónikus nem-A, nem-B hepatitiszes beteg szérumával, és nem ad antigén-antitest reakciót egy klinikailag hepatitisz-negatívnak diagnosztizált ember szérumával és/vagy egy nem-A, nem-B hepatitisztől eltérő hepatitiszesnek diagnosztizált beteg szérumával,

   c) megállapítjuk, hogy a szérum reagált-e a nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptiddel,

   d) meghatározzuk, hogy a szérum a reaktivitás alapján nem-A, nem-B hepatitiszre nézve pozitív vagy negatív, és

   e) a meghatározás alapján különválasztjuk a vért.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptidet használunk, amely az alábbi (I)-(VI) képletű nukleotid-szekvenciák, illetve az (I)-(VI) képletű nukleotid-szekvenciák legalább egy nukleotidjának a genetikai kód degenerációja alapján történő helyettesítésével kapott nukleotid-szekvenciák közül legalább egyet tartalmazó DNS által kódolt aminosav-szekvenciának legalább egy részét tartalmazza:

    GAATTCCAAAAAGAGCAAAACAAACCGCCGAAGAAAAAACTAATAAGAGAAGAAAAGGCG

    AAGAGACACAGGAAAAAAAAAACAGAGACGAAGGTCAGATAGAAAAAAAGCAAGGAATTC •••(I);

    GAATTCCGAGAACAAGACCAGATAAAAACCAAAGACAGAACACAACAGAGAAAGACGAAA agaagcaccaatcgcaggcgaagcaaaaacgaaaaaaaaaaaaaaaaggaattc

    ...(II);

    GAATTCCAAGAAAAAAAGGGAGAAGCCAGCAATGGAGAAGCCGAAAACGACACACACAAG AAACAAAGGAGGTACAAAGAAAAAGAAAAAACGGCAACAAATAACCCAGGAAAGAACAAA AAGCCAAGAGTGGGCAGAATAAAAAACTGGAACCGGGAGGGAAGGAAGGACGCATATCAG ATTAGAAAAAGGAGGGAATTC...(III);

    GAATTCCTAAGAAATGGCTAGCCCTAGGAGAGGCAGTCTTTCCCCAGTCAGTTAGCCCGC AAATGCCAGAGCATCAAGAATTCAGAAAAGGAGAAAATATAGTTAATATCAAAGTGGTCG AAGCCTAAGATAGAGAGGTAGAGAGTATGAAGAGTAAGACGAATACAAACCAAAATTCTG GAATGATCATTAAAAACATTATTGATAGGTACTTAGAAGGGCAAGAGAGGAAGAAGAAAG TAATGAGAAATGCTTATGGAAGCCAAAGGAGCTTTCCAGGAGAAGAAAGGGAATTC ···(IV);

    GAATTCCCAACGCGTCGGCTTGGCCCGCGCCTTGGCCGCCGACCCGCGCTGATGGCCGTG

    GAATTC...(V);

    GAATTCCGGGGTATTTGCCTCGATCTGCCTGCTCAGCGCTTCGGCCCTCGGCTTGGGCGC

    CCTGCTGCTGGCTTCCGAGCAGCTATTCAGCGCCTTGAAAGTGGTTGGCGCGGCGTACGT

    GTCCGGGAATTC...(VI);

    ···« ahol a nukleotid-szekvenciák bal, illetve jobb oldali vége az 5'-véget, illetve a 3'-véget képviseli, amely aminosavszekvencia-rész reaktív a nem-A, nem-B hepatitisz vírus antitesttel.
11. 11. Escherichia coli N-l törzs, azzal jellemezve, hogy nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptidet kódoló cDNS-t tartalmaz, és a Fermentation Research Institute, Japán intézetnél FERM BP—2416 számon van letétbe helyezve.
12. 12. Escherichia coli N-2 törzs, azzal jellemezve, hogy nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptidet kódoló cDNS-t tartalmaz, és a Fermentation Research Institute, Japán intézetnél FERM BP-2431 számon van letétbe helyezve.
13. 13. Escherichia coli N-18 törzs, azzal jellemezve, hogy nem-A, nem-B hepatitisz vírus antigén peptidet kódoló cDNS-t tartalmaz, és a Fermentation Research Institute, Japán intézetnél FERM BP—2418 számon van letétbe helyezve.