HUT57236A

HUT57236A - Process for producing new sulfate derivatives of galactan extracted from klebsiella and pharmaceutical compositions comprising such products as active ingredient

Info

Publication number: HUT57236A
Application number: HU908032A
Authority: HU
Inventors: Pierre Smets; Rene Zalisz
Original assignee: Roussel Uclaf
Priority date: 1989-12-04
Filing date: 1990-12-03
Publication date: 1991-11-28
Also published as: JPH04108801A; ZA909385B; AU642933B2; IE904342A1; CA2031320A1; AP281A; CN1062171A; HU908032D0; AU6766490A; AP9000229A0; KR910011878A; EP0433127A3; OA09899A; EP0433127A2; RU2028381C1; PT96060A; US5182378A; FR2655267B1; FR2655267A1

Description

ELJÁRÁS KLEBSIELLÁBÓL EXTRAHÁLT GALAKTÁN UJ SZULFÁTSZÁRMAZÉKAI ÉS HATÓANYAGKÉNT E TERMÉKEKET TARTALMAZÓ

GYÓGYÁSZATI KÉSZÍTMÉNYEK ELŐÁLLÍTÁSÁRA

Roussel Uclaf, Párizs, Franciaország

Feltalálók:

SMETS Pierre, Villennes Sur Seine, Franciaország

ZALISZ René, Menucourt, Franciaország

A bejelentés napja: 1990. 12. 03.

Elsőbbsége: 1989. 12. 04. (89-15972) Franciaország

71407-1748 Sí

-2A találmány tárgya eljárás Klebsiellából extrahált galaktán új szulfátszármazékai és hatóanyagként e termékeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

A 2 574 429 számú francia szabadalmi leírás Kleb-siellából kivont olyan acil-glikánt ismertet, amely megközelítőleg 80% közömbös ózt, 20% lipidet, 2%-nál kevesebb fehérjét tartalmaz, molekulatömege körülbelül 12500, és amelyben a galaktózok 1,3-helyzetben kapcsolódva láncot alakítanak ki. Az ilyen termékek allergia elleni és immunmoduláló sajátságokat mutatnak.

A 89.09305 számú, 1989. július 11-én benyújtott francia szabadalmi bejelentés, valamint a 904019874 számú európai szabadalmi bejelentés kis molekulatömegü, Klebsiellából extrahált galaktánt, annak előállítási eljárását, és gyógyszerként, különösen immunstimuláló gyógyszerként való alkalmazását közli.

A jelen találmány tárgya eljárás Klebsiellából extrahált galaktán új szulfátszármazékának az előállítására, amelyet az előzőleg kapott galaktánból állítunk elő.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás Klebsiellából extrahált galaktán új szulfátszármazékának az előállítására, amelyre jellemző, hogy főként a hidroxilesöpörtök 20-90%-át szulfatált közömbös óz alakjában tartalmazó termékből áll.

A közömbös ózok összetételét Zanetta szerinti [J. Chromat. 69, 291 (1972)] vagy Kamerling módszerével [Biochem.

J. 151. 491 (1975)] végzett metanolizis után gázkromatográfiával határozzuk meg.

Közelebbről a találmány tárgya eljárás olyan galaktán• · ·<·

-3-szulfát-származék előállítására, amelyre jellemző, hogy főként a hidroxilcsoportok 40-80%-át szulfátéit közömbös óz alakjában tartalmazó termékből áll.

A találmány szerinti eljárással előállított termékek közül előnyös az a galaktán-szulfát-származék, amelyre jellemző, hogy a hidroxilcsoportok 50-70%-át szulfátéit közömbös óz alakjában tartalmazza.

A találmány szerinti eljárással kapott galaktán-szulfát-származékra jellemző, hogy abban a galaktóz-egységek

1,3-kötésekkel lineáris láncot képeznek, molekulatömege 5000 és 12000 között van, előnyösen körülbelül 7000.

E poliszacharidok lipidektől és fehérjéktől mentesek.

A galaktóz-összetételt redukció és metanolizis után gázfázisú kromatográfiával határozzuk meg.

A lipideket metanolizis után gázfázisú kromatográfiával határozzuk meg.

A fehérjéket Lowry módszerével [J. B. C. 193. 265 (1951)] határozzuk meg.

A galaktózok láncalakjának szekvenciáját standard metilezési módszerekkel, tömegspektrometriával összekötött gázfázisú kromatográfiás analízissel, perjodát-oxidációval, valamint ÍH-NMR és ¹³C-NMR vizsgálattal állapítjuk meg. Az eredmények azt mutatják, hogy a galaktán 50%-ban a-l,3-kötésekkel és 50%-ban B-l,3-kötésekkel kapcsolódó galaktózmaradékokból lineáris lánc alakjában épül fel, és ebben a láncban 8 galaktopiranózmaradékból és 1 galaktofuranózmaradékból álló szerkezeti egység ismétlődik.

A találmány szerinti eljárással kapott galaktán-szul···

-4fát-származék különböző Klebsiella-fajókból állítható elő. Közelebbről e célra olyan galaktánt alkalmazhatunk, amely Klebsiella pneumoniae-ból, különösen a Pasteur Intézetben (Párizs) vagy a Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) 52145 és 1-163 szám alatt, valamint a National Culture Type Collection intézményben 5055 szám alatt elhelyezett (deponált) törzsből ered.

A találmány szerinti eljárás végrehajtása során egy Klebsiellából extrahált acil-glikánt, amely főként megközelítőleg 80% közömbös ózt, 20% lipidet és 2%-nál kevesebb fehérjét tartalmaz, és molekulatömege körülbelül 12500, előbb enyhe savas hidrolízisnek vetünk alá, majd nagyteljesítményű (túlnyomásos) folyadékkromatográfiát végzünk anioncserélő gyantán, a meg nem kötött (vissza nem tartott) frakciót kinyerjük, gélszürésnek vetjük alá, és utána kinyerjük a 4000 és 10000 közötti molekulatömegü galaktánt tartalmazó frakciót; az eljárásra jellemző, hogy az így kapott galaktánfrakciót szulfatáljuk, majd dialízissel tisztítjuk, és az igy nyert galaktán-szulfát-származékot elkülönítjük.

A kiinduló anyagként alkalmazott, Klebsiellából extrahált acil-glikánt vízben oldható baktériumkivonatból kapjuk, amelyet Klebsiellából készítünk hevítéssel, és ezt követő kromatografálással. Ilyen készítményeket már előzőleg ismertettek a 2 574 429 számú francia és a 3 543 267 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásban.

A Klebsiellából extrahált vizoldható baktériumterméket a 2 490 496 számú francia, valamint a 49 182 számú európai szabadalmi leírásban közölt eljárásokkal állítottuk elő.

• ·

-5A találmány szerinti eljárást előnyösen az alábbi körülmények között valósíthatjuk meg.

- Az acil-glikán enyhe savas hidrolízisét 1%-os ecetsavoldatban végezzük 90 percig 100 °C hőmérsékleten; a képződött csapadékot - amely a lipidfrakciót tartalmazza centrifugálással, például 30 percig 2000 x g sebességű centrifugálással eltávolítjuk, és a felüluszó részt, amely a galaktánt tartalmazza, összegyűjtjük, és liofilizáljuk.

- A felülúszóból a galaktánt kromatográfiás frakcionálással különítjük el; a közömbös ózokat tartalmazó frakciókat összegyűjtjük.

- A frakcionálást végezhetjük anioncserélőn kromatográfia útján, előnyösen túlnyomásos kromatográfiával, például Magnum 9SAX Whatman berendezéssel. Az anioncserélőn végzett túlnyomásos kromatográfia során a galaktánt vízzel eluálva különítjük el. A neutrális ózokból álló frakciót úgy detektáljuk, hogy előbb Dubois módszere szerint [Anal. Chem. 28, 350 (1956)] fenol-kénsavval megfestjük, majd 200 nm és 492 nm hullámhosszon spektrofotometriásán vizsgáljuk.

- A neutrális ózokból álló frakciót ezután gélszürésnek vetjük alá, s így lehetővé válik a 4000 és 10000 közötti molekulatömegü galaktánt tartalmazó frakció kinyerése. A gélszűrést kereskedelmi forgalomban lévő géllel, például Sephadex vagy Biogel-agaróz géllel, előnyösen Biogel A-1,5M segítségével hajtjuk végre.

- A galaktánfrakció szulfatálását valamilyen szulfonsawal, például klór-szulfonsawal végezzük valamilyen aminban, így például piridinben; vagy valamilyen szulfonáttal, ··· • ·

-6például piperidin-N-szulfonáttal hevítve hajtjuk végre.

A dialízist desztillált vízzel szemben végezzük.

A találmány tárgyát képezi továbbá galaktán-szulfát-származék, így a találmány szerinti eljárással kapott galaktán-szulf át-származék is.

A találmány szerinti eljárással előállított galaktán-szulfát-származék igen hasznos farmakológiai sajátságokkal rendelkezik; figyelemre méltó immunstimuláló hatást mutat, és toleranciája (elviselhetősége) kedvező. Közelebbről e termék serkenti az 111 és a TNF termelését a makrofágok szintjén, és főként stimulálja a szabad gyökök képződését; lehetővé teszi továbbá szinergetikus hatások fellépését a GM-CSF (granulomonocita-kolóniát stimuláló faktor) hatásával.

A fenti termék jelentős elasztáz elleni hatást is mutat, mind a szarvasmarha-hasnyálmirigy-elasztázzal, mind az emberi leukocita-elasztázzal szemben. E termékek továbbá antikoaguláns hatással is rendelkeznek.

Ezeket a sajátságokat a kísérleti részben részletesebben bemutatjuk.

Mindezek a sajátságok indokolttá teszik a fentebb definiált galaktán-szulfát-származékok gyógyszerként történő alkalmazását.

E gyógyszerhatóanyagok felhasználhatók például embereken immundepressziv állapotok, baktériumok vagy vírusok, különösen az AIDS vírus által előidézett fertőző betegségek kezelésére vagy megelőzésére, továbbá paraziták, toxikus fertőzések következtében fellépő betegségek kezelésére, kórházi tartózkodás utáni és műtét utáni fertőzések kezelésére, valamint ···· 9 <J · ♦ • ··· · · · « • ······*

4** ·· · · · ♦ 99

-7bármilyen eredetű allergiák kezelésére. E hatóanyagok nagyon előnyösen alkalmazhatók továbbá csontvelő-transzplantátumok kezelésére, valamint kemoterápia utáni velő-apláziák kezelésére.

Az alkalmas dózis e célra - a kezelendő egyéntől és az alkalmazott terméktől, valamint a kóros állapottól függően például naponta 0,5-5 mg lehet, ha a kezelést orális úton végezzük.

A fenti hatóanyagok továbbá a tüdőgyógyászatban is alkalmazhatók tüdőtágulás, pneumónia, bronchitisz és más, nikotin vagy környezeti szennyezés által előidézett tüdőbetegségek kezelésére; alkalmazhatók továbbá a szívgyógyászatban, valamint izületi gyulladások kezelésére; a bőrgyógyászatban pszoriázis, égési sebek kezelésére, valamint a bőr öregedésének a gátlására; az emésztőszervi megbetegedések közül például a heveny hasnyálmirigygyulladás kezelésére, továbbá teljes általánosságban minden olyan kóros állapot kezelésére, amely az elasztáz kóros működése következtében lép fel, valamint tromboembóliás betegségek kezelésére.

Az alkalmazott dózis - az alkalmazott terméktől, a kezelendő egyéntől és az adott betegségtől függően - emberek esetében például napi 1-300 mg lehet, amelyet intravénás úton adagolunk.

A Klebsiellából kivont galaktán fentiekben definiált szulfátszármazékát felhasználhatjuk olyan gyógyászati készítmények előállítására, amelyek egy ilyen szulfátot tartalmaznak hatóanyagként. A galaktán-szulfát-származékot enterális, parenterális vagy helyi adagolásra alkalmazható készítményekké

-8alakíthatjuk. A megfelelő gyógyászati készítmények például szilárdak vagy folyékonyak lehetnek, és az embergyógyászatban általánosan elterjedt gyógyszerformák, például cukorbevonatos tabletták, kapszulák, szemcsék, oldatok, szirupok, végbélkúpok, liofilizált vagy nem liofilizált injekciós készítmények, pesszáriumok, krémek, kenőcsök, öblítő oldatok, cseppek, aeroszolok formájában alakíthatók ki. Mindezek a gyógyszerformák ismert módon állíthatók elő. A hatóanyagot vagy hatóanyagokat a gyógyászati készítményekben általában alkalmazott vivő- és segédanyagokkal, például talkummal, gumiarábikummal, laktózzal, keményítővel, magnézium-sztearáttal, kakaóvajjal, vizes vagy nemvizes vivőanyagokkal, állati vagy növényi eredetű zsirszerü anyagokkal, paraffinszármazékokkal, glikolokkal, különböző nedvesítőszerekkel, diszpergáló- vagy emulgeálószerekkel és tartósítószerekkel keverhetjük.

A találmány szerinti eljárást az alábbi, nem korlátozó jellegű példákkal részletesen ismertetjük.

1. példa

Klebsiellából extrahált qalaktán szulfátszármazékának az előállítása °C-ra hütött, jégben tartott piridinhez 0,4 ml klór-szulfonsavat adunk, a keveréket szobahőmérsékletre melegedni hagyjuk, és 25 mg Klebsiella pneumoniae-ból extrahált gáláktán 24 ml piridinnel ksézült szuszpenzióját adjuk hozzá. Az elegyet 3 órán át 80 °C-on melegítjük, majd szobahőmérsékletre hütjük, 30 ml desztillált vízzel hígítjuk, s utána 5 ml 2,5 mólos szódaoldattal kezeljük. Az igy kapott oldatot vákuumban betöményítjük, desztillált vízzel szemben 3 napig dializáljuk, majd fagyasztjuk, és liofilizáljuk.

így a Klebsiellából extrahált galaktán kívánt szulfátszármazékát kapjuk.

Az így kapott termékben a hidroxilesöpörtök 60%-a szulfátéit állapotban van, a termék molekulatömege jó megközelítésben 7 000.

A Klebsiella pneumoniae-ból extrahált galaktán előállítása

334 mg Klebsiellából származó acil-glikánt (amelyet a

574 429 számú francia szabadalmi leírás 1. példája szerint a Pasteur Intézetben 1-163 szám alatt elhelyezett törzsből nyerünk) 33,4 ml 1%-os ecetsavoldatban oldunk, és az elegyet 90 percig 100 °C-on melegítjük. Lehűtés után a lipidfrakciót tartalmazó csapadékot 2000 x g sebességgel 30 percig centrifugálva elkülönítjük. A felülúszót liofilizáljuk, 200 mg maradékot kapunk, amelyet 4 ml vízben ismét oldunk. Ezután folyadékkromatográfiát végzünk túlnyomásos anioncserélő Whatman Magnum

SAX (9,4 mm x 50 cm) berendezéssel; 1 ml térfogatú frakciókat veszünk, vízzel 30 percig eluálunk, ennek során 2 ml/perc áramlási sebességet alkalmazunk, és 200 nm hullámhosszon detektálunk. A neutrális ózokat tartalmazó (492 nm-nél detektálható) frakciót elkülönítjük (a detektálást fenol-kénsawal történt festés után végezzük). így liofilizálás utján 55 mg neutrális frakciót különíthetünk el.

A galaktán elkülönítése

Az előbbiekben kapott liofilizált terméket víz/ecetsav/piridin 973:7:20 arányú keverékéből álló pufferoldatban oldjuk, majd gélszürésnek vetjük alá úgy, hogy Biogel ···

-10Α-1,5 Μ (2 cm χ 1,5 m) oszlopon kromatografáljuk, amelyet ugyanazzal a pufferoldattal egyensúlyba hoztunk. A fenol-kénsav próbával detektált frakciót összegyűjtjük. Az így kapott terméket 0,22 mikronos membránon szűrve sterilizáljuk, majd liofilizáljuk, s így a várt galaktánt 22 mg hozammal kapjuk.

2. példa

Klebsiellából extrahált galaktán szulfátszármazékának az előállítása °C-ra hütött, jégben tartott piridinhez 4 ml klór-szulfonsavat adunk, majd az elegyet szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni, és 85 mg Klebsiella pneumoniae-ból extrahált galaktán (ennek előállítását az 1. példában megadott módon végezzük) 24 ml piridinnel készült szuszpenzióját tesszük hozzá. Az elegyet 2 órán át 80 °C-on melegítjük, majd szobahőmérsékletre hütjük, és 30 ml desztillált vízzel hígítjuk. A reakcióelegy pH-értékét 2,5 mólos szódaoldat adagolásával 6-ra állítjuk, és az oldatot desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd fagyasztjuk, és liofilizáljuk.

így a Klebsiella pneumoniae-ból extrahált galaktán szulfátszármazékát 32 mg hozammal kapjuk. ’

3. példa

Tablettákat állítunk elő az alábbi összetétellel:

Az 1. példában előállított termék 1 mg

Vivő- és segédanyagok, amennyi szükséges 100 mg tablettatömeghez (Vivő- és segédanyagként laktózt, keményítőt, talkumot és magnézium-sztearátot használunk.)

4. példa

Tablettákat állítunk elő az alábbi összetétellel:

A 2. példában előállított termék 1 mg

Vivő- és segédanyagok, amennyi szükséges 100 mg tablettatömeghez (Vivő- és segédanyagként laktózt, keményítőt, talkumot és magnéz ium-sztearátot használunk.)

5. példa

Aeroszolokat állítunk elő, amelyek kibocsátott dózisa az alábbi összetételű:

Az 1. példában előállított termék 0,5 mg

Emulgeálószer 0,15mg

Hajtószer 50,00mg

6.példa

Krémet állítunk elő az alábbi összetétellel:

A 2. példában előllított termék1 mg

Vivő- és segédanyag: 2-oktil-dodekanol, ketosztearil-alkohol, nátrium-szulfát, 4-hidroxi-benzoesav-metil- és propil-észter, tisztított víz 10 mg

Biokémiai vizsgálatok

A Klebsiellából extrahált galaktán szulfátszármazékának a hatásosságát egyrészt a szincitium gátlásának meghatározásával [Gruters és munkatársai: Natúré 330, 74 (1987)], másrészt egyes sejttenyészetek ellen kifejtett védőhatása alapján határozzuk meg.

A) A vírus előállítása és titrálása

1°) Vírus előállítása (HIV-vel krónikusan fertőzött) H 9 ΙΙΙβ sejtek felülúszóját 10⁵ sejt/ml koncentrációval indulva 48 órán át tenyésztjük;

- a felülúszót centrifugáljuk, 0,45 mikromoláris koncentrációban szűrjük, alikvot részekre osztjuk, és -80 °C hőmérsékleten tároljuk.

2°) A vírus titrálása

- reverz transzkriptáz (RT) a friss felülúszóban 4,0 χ 10⁶ cpm/ml felolvasztás után 4,5 χ 10⁶ cpm/ml

- MT4/MTT próba

Eljárás: a vírus 100 mikroliteres hígításait sorozatban mikrotitráló lemezre helyezzük;

- 100 mikroliter sejtszuszpenziót adunk hozzá, amely χ ΙΟ⁴ MT4 sejtet tartalmaz;

- tenyésztést végzünk 7 napon át 37 °C hőmérsékleten

5% szén-dioxid tartalom mellett;

- MTT-t (az élő sejteket színező tetrazóliumsót) adunk hozzá;

- 4 órán át 37 °C-on inkubáljuk;

- a reakciót izopropanolos sósavoldat hozzáadásával leállítjuk;

- 540 nm hullámhosszon leolvassuk az optikai sűrűséget (OD) a kristályok feloldódása után.

···

-13Eredménvek

A fertőzött sejtek optikai sűrűségének a viszonya (virális citotoxicitást gyenge optikai sűrűség jelez) a fertőzött sejtek optikai sűrűségét meghaladó értékhez (életképesség és maximális optikai sűrűség) a vírus hígításának a függvénye (3 üreg értékének az átlaga). Ezt a függvényt állapítjuk meg. Minél fertőzöttebbek a sejtek, annál kisebb ez a viszonyszám.

B) A Klebsiellából extrahált qalaktán szulfátszármazékának a védőhatása

1°) A szincitium gátlása

Krónikusan fertőzött 10⁵ sejt/ml H 9 III sejt és nem fertőzött 2 χ 10⁵ sejt/ml SUP TI sejt alkalmazásával együttes tenyészetet állítunk elő. így szincitium alakul ki, amelynek mennyiségét mikroszkóppal állapítjuk meg.

Minden egyes sejttípust előzetesen, a vizsgálandó termékkel éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk vagy nem inkubálunk.

Amennyiben előzetes inkubálást nem végzünk, akkor a vizsgálandó terméket a sejtekhez a tenyésztés időpontjában adjuk.

Ha a kezelt sejtekben a kontrolisejtekhez viszonyítva a szincitium kialakulásának gátlását figyeljük meg, akkor a vizsgálandó termék védőhatást fejt ki.

Eredményeinket az alábbi 1. táblázatban foglaljuk össze.

1. Táblázat

Együttes tenyésztés a vizsgált termékkel előzetes inkubálás nélkül

Az 1. példában előállított termék Mg/ml	A gátlás 1. próba	százalékos értéke
2.	próba
1	0		10
10	42		17
100	100		100

2. Táblázat

Előzetes inkubálás a vizsgálandó termékkel éjszakán át 37 °C-on az együttes tenyésztés előtt

Az 1. példában előállított termék Mg/ml	A gátlás százalékos értéke
H 9 III sejtek esetén	Sup TI sejtek esetén
1	17	23
10	23	27
100	100	100

2°) MT4/MTT vizgálat

Az MT4 sejteket 10⁶ sejt/ml koncentrációban alkalmazzuk; ezt felére hígítjuk a különböző koncentrációkban vett vizsgálandó termékkel vagy anélkül. A mikrotitráló lemezre

100 mikroliter HÍV vírust különböző hígításokban és 100 mikoliter előkezelt sejtszuszpenziót viszünk.

Az inkubálást 7 napig végezzük 37 °C-on, majd hozzáadjuk az MTT-t, és spektrofotométerrel leolvassuk a kapott szinértéket.

Meghatározzuk az MT4 sejtek fertőzésének gátlási százalékát.

Eredményeinket a 3. táblázatban foglaljuk össze.

3. Táblázat

Az 1. példában előállított termék A gátlás százalékos értéke uo/ml

74

99

100 84

3°) H9 vizsgálat

Polibrennel kezelt, mosott H9 sejteket alkalmazunk, amelyeket 100 mikroliter közegben veszünk fel különböző koncentrációban hozzáadott vizsgálandó termékkel együtt vagy anélkül.

órán át 37 °C-on végzett inkubálás után az elegyhez

100 mikroliter HÍV vírust adunk 1/10 hígításban, az egész elegyet 1 órán át 37 °C-on tartjuk, majd mossuk.

A sejteket a vizsgálandó terméket tartalmazó vagy nem tartalmazó 1 ml közegben vesszük fel, és 2 üregre osztjuk, ··♦ amelyek mindegyike 500 mikroliter elegyet és üregenként χ 10⁵ sejtet tartalmaz.

A D + 4-en 500 mikroliter tenyésztőközeget adunk a vizsgálandó termékkel vagy anélkül.

A D + 8-on a felülúszó felét új közeggel helyettesítjük.

A D + 11-en a felülúszóban a reverz transzkriptázt mennyiségileg elemezzük, és a sejtek számát immunfluoreszcenciásan meghatározzuk. Eredményeinket a 4. táblázat tartalmazza.

4. Táblázat

Reverz transzkriptáz Immunfluoreszcencia cpm/ml Gátlás % Fluoreszcens Gátlás x IPA__________________sejtek %_______%

Nem fertőzött sej-

tek	1,68	0
Fertőzött sejtek	291		51
Az 1. példában elő-
állított termék
(koncentráció μg/ml)
1 z	6,42	76	3	94
10	1,16	100	0	100
100	1,12	100	0	100

♦ ♦ ··<»« ···· • · · ··· · ·

-17A különböző vizsgálatokban (tesztekben) kapott eredmények azt mutatják, hogy a vizsgált termék nagyon jelentős mértékben gátolja szincitiumok kialakulását, valamint védi a vizsgált sejteket HÍV vírus által előidézett fertőzéstől.

Az elasztáz elleni hatás vizsgálata

Az elasztáz elleni hatást az emberi leukocita-elasztáz gátlásán kvantitatív analízissel, spektrofotometriás úton határoztuk meg. Boudier és munkatársai [Clin. Chim. Acta 132. 309 (1983)] módszeréhez hasonlóan jártunk el.

A terméket leíró példa száma	Emberi leukocita-elasztáz
1.	Ki : 1 x 10^-8 M

···

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás Klebsiellából extrahált galaktán új szulfátszármazékának az előállítására, amely főként a hidroxilcsoportok 20-90 százalékát szulfátéit alakban tartalmazó közömbös ózókból áll, olyan úton, hogy egy Klebsiellából extrahált, mintegy 80 százalék közömbös ózt, 20 százalék lipidet és
2 százaléknál kevesebb fehérjét tartalmazó, körülbelül 12500 molekulatömegü acil-glikánt előbb enyhe savas hidrolízisnek, majd anioncserélőn túlnyomásos folyadékkromatográfiának vetünk alá, a meg nem kötött (vissza nem tartott) frakciót összegyűjtjük, gélszürésnek vetjük alá, és a 4000 és 10000 közötti molekulatömegü galaktánt tartalmazó frakciót összegyűjtjük, azzal jellemezve, hogy az így kapott galaktánfrakciót szulfatáljuk, dialízissel tisztítjuk, és az így nyert szulfátéit galaktánszármazékot elkülönítjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a galaktánfrakció szulfatálását valamilyen szulfonsavval, így klór-szulfonsavval valamilyen aminban, így piridinben, vagy valamilyen szulfonát, így piperidin-N-szulfonát alkalmazásával, a reakcióelegy melegítésével hajtjuk végre, és a dialízist desztillált vizzel szemben végezzük.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidroxilcsoportok 40-80 százalékát szulfatáljuk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidroxilcsoportok 50-70 százalékát szulfatáljuk.

• e · • · · •ve

-194 }
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan módon megválasztott galaktánt szulfatálunk, amelyből galaktán-szulfát-származékot nyerünk.
6. Az 1-5. igényontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiinduló anyagként Klebsiella pneumoniae-ból extrahált acil-glikánt alkalmazunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás az 5. igénypont szerinti galaktán-szulfát-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy kiinduló anyagként olyan acil-glikánt alkalmazunk, amely a Pasteur Intézetben (Párizs) vagy a Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) intézményben 52145 és 1-163 szám alatt, valamint a National Culture Type Collection intézményben 5055 szám alatt elhelyezett (deponált) törzsből ered.
8. Eljárás immunszabályzó hatású, immundepressziv kóros állapotok, baktérium- és vírusfertőzések, valamint parazitás és toxikus fertőzések és bármely eredetű allergiák kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy 1. igénypont szerint előállított galaktán-szulfát-származékot a gyógyszerkészítésben szokásos hígító-, vivő- és segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítunk.