JPH06293650A - サイトカイン誘導剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なサイトカイン誘導剤の提供。 【構成】 ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエン
スの培養上清液に塩化亜鉛溶液を加えて生ずる沈澱中に
存在し、第二燐酸ナトリウム溶液によって抽出され、抽
出液に親水性有機溶媒を加えると沈澱する固形分を有機
成分とするサイトカイン誘導剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なサイトカイン誘導
剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来から、種々のサイトカイン誘導物質
が微生物や担子菌類より生産されていることが知られて
いる。その内のいくつかのものは、サイトカイン誘導剤
として実用化されている。特に、微生物由来のサイトカ
イン誘導剤として、ピシバニール、ベスタチン、丸山ワ
クチン、ロムルチド等が、担子菌類由来ではクレスチ
ン、レンチナン、シゾフィラン等が知られており、治療
に応用されている。サイトカイン自体を投与する治療法
が行われているが、骨髄抑制、胃腸障害、心機能障害や
脱毛といった副作用を伴い、ウイルス疾患の患者にとっ
て大きな負担となっている。ところで、製癌剤を使用す
る多くの癌患者においては免疫能が低下し、癌の進行の
促進が見られたり、各種細菌に対する抵抗性が減弱し、
重篤な感染症にかかりやすくなる。このような背景か
ら、近年、臨床サイドから癌の治療法として、クオリテ
ィー・オブ・ライフという概念が検討されるようにな
り、制癌剤の領域についても、より副作用の少ない、か
つ癌患者の免疫能を亢進して癌の治療を試みることが盛
んになってきておりサイトカインの効果が注目されてい
る（特公平４−６９６１０号公報等）。

【０００３】放線菌の１種であるストレプトバーチシリ
ウム・ハチジョウエンス (Streptoverticillium hachijoense) 由来の有効成分と
して、膣トリコモナス症に有効なポリエン系抗生物質ト
リコマイシンの存在が知られている。また、本発明者の
一人である添田はストレプトバーチシリウム・ハチジョ
ウエンスＨ−2609株(IFO 12782) の培養上清液から分子
量1200の抗腫瘍物質を得ている( 特公昭49-42560号公
報、防衛衛生 第14巻、第１号、第１頁、1967) 。ま
た、河野は同じ菌を用いて分子量２万から６万の蛋白質
を主体とした抗腫瘍剤を報告している（特開平2-53729
号) 。また添田らはストレプトバーチシリウム・ハチジ
ョウエンスH-2609株の培養上清液から分子量的660k〜30
0 の抗腫瘍活性と免疫賦活作用を併有する物質を得てい
る（特願平4-102422）。サイトカイン治療の分野におい
ては、特定のサイトカインを投与したり、誘導させる
と、サイトカイン・ネット・ワークのバランスが壊され
るので、多種のサイトカインを同時に誘導する、マルチ
・サイトカイン・インデューサーが望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明はガン、免疫不
全症、感染性疾患等の治療に有用な新規なサイトカイン
誘導剤を提供することを目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明はストレプトバー
チシリウム・ハチジョウエンスの培養上清液に塩化亜鉛
溶液を加えて生ずる沈澱中に存在し、第二燐酸ナトリウ
ム溶液によって抽出され、抽出液に親水性有機溶媒を加
えると沈澱する固形分を有効成分とするサイトカイン誘
導剤に関する。

【０００６】本発明の有効成分は、ストレプトバーチシ
リウム・ハチジョウエンスの培養上清液より得ることが
できる。ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンス
の菌学的性状は、「抗トリコモナス・抗ガン作用を有す
る新抗生物質、トリコマイシンについて」（細谷ら、ジ
ャーナル・オブ・アンチバイオティクス第10巻、第564
頁、1952年) において、ストレプトバーチシリウム・ハ
チジョウエンスのＨ−2609株について述べられており、
また「スタディーズ オン ザ アンチバイオティクス
サブスタンス プロデューシング ストレインズＨ20
75, Ｈ−2609アンドＨ−3030」( ザ ジャーナル オブ
アンチバイオティクス シリーズＡ、第７巻、第１
号、第10頁、1954年) において、ストレプトバーチシリ
ウム・ハチジョウエンスのＨ−2609株及びＨ−2075株に
ついて述べられている。また、Ｈ−2609株はIFO 12782
号として寄託されている。本発明においてはＨ−2609
株、Ｈ−2075株、Ｈ−3030株を具体的菌株として用いる
ことができるが、それらに限らず、ストレプトバーチシ
リウム・ハチジョウエンスに属し、上記有効成分中の活
性本体である有機物成分を生産する能力を有する限り、
他の野性株、またはこれらの野性株の常法による変異処
理( 例えば紫外線照射、変異剤処理、遺伝子工学的処
理) によって得られる変異株も使用可能である。

【０００７】この放線菌ストレプトバーチシリウム・ハ
チジョウエンスの培養は、以下に示すような方法によっ
て行うことができる。栄養源としては、従来放線菌の培
養に利用されている公知のものが使用できる。例えば、
炭素源としてグルコース、糖蜜、澱粉、デキストリン、
スクロース、水飴、動植物油等を使用しうる。また窒素
源として大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、
肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、
硝酸ソーダ、尿素等を使用しうる。その他必要に応じ
て、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオン
を生成することができる無機塩類を添加することは、有
効である。また菌の発育を助け、有効成分の生産を促進
するような有機及び無機物を適当に添加することができ
る。

【０００８】培養法としては、好気的条件での培養法が
適しており、培養に適当な温度は27〜30℃であるが、多
くの場合28℃付近で培養する。また、培養に適当な pH
域は7.0 〜9.0 である。上記条件下に通常３〜７日培養
を行うことにより活性の高い培養液を得ることができ
る。

【０００９】培養液からの有効成分の分離は、大まかに
は細谷らの病原菌の産生する外毒素の精製法（実験医
学、第28巻、第429 頁、1944年) に準じて、例えば以下
に示すような方法により行うことができる。本分離・精
製においては、培養液から菌体を除去し、その上清に50
％(w/v) の塩化亜鉛、硫酸アンモニウム等の電解質無機
塩の水溶液を最終濃度約 2.5％になるように加えて塩析
し、生ずる沈澱を採取し、これに10％(w/v) の第二燐酸
ナトリウム等の燐酸ナトリウムの水溶液を上清に対して
約55％(w/v) 加えて抽出を行い、この抽出液に親水性有
機溶媒であるメタノール、エタノール、プロパノール、
ブタノールなどの低級アルコールや、アセトン、イソブ
チルケトン等のケトン系溶媒等を加えて、沈澱する画分
を採取する。採取した沈澱物を蒸留水に溶解後、適当な
濾過膜を用いて濾過滅菌し、必要により透析したのち、
濾液を凍結乾燥することによって有効成分が得られる。

【００１０】本発明の有効成分は上記のような方法によ
り得られたものであり、通常無機塩を含んでいる。無機
塩は実質的に第二燐酸ソーダであり、これは有効成分自
体ではないが、有効成分である有機物を安定化すると共
に、バッファーとしての作用、有機物の溶解安定作用、
毒素を溶解する作用などを有し、有機物とあいまってサ
イトカイン誘導剤として作用を高めるものと推定され
る。なお無機物の含有量は透析を行うことにより減少さ
せることができる。

【００１１】そして、本発明の有効成分となる物質は次
のような物性を有している。なお下記は無機物が含有さ
れた状態での物性値を示しているが、無機物は含まれな
くとも任意の量を含んでいてもよい。 (1) 外観性状 ：白〜淡黄色粉末 (2) 溶解性 ：水に易溶。酢酸、ピリジンに難溶。メ
タノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタ
ン、アセトンに不溶 (4) 呈色反応 ：ニンヒドリン反応、カルバゾール硫酸
法、フェノール硫酸法及びクマジーブリリアントブル−
色素法に陽性 (5) 元素分析 ：熱伝導度検出方法による炭素、水素、
窒素の含有量はそれぞれ、Ｃ：0.3 〜0.8 ％、Ｈ：0.7
〜1.6 ％、Ｎ：0.01〜0.5 ％、示差屈折計を用いるか熱
伝導度検出方法による酸素含有量はＯ：3.5 〜7.5 ％、
ボンベ燃焼−イオンクロマトグラフ法による硫黄含有量
はＳ：240 〜560ppm、ナトリウム含有量は原子吸光法に
よりナトリウムイオンとして、12.0〜35.0％、リン酸含
有 て56.5〜84.6％を示した。カールフィッシャー法で水分
を測定した結果、4.4 〜6.7 ％の値を示した。 (6) 分子量分布：ゲル濾過法で測定した分子量分布は約
600k〜300 であった。 (7) 紫外部吸収スペクトル：水溶液中で測定したスペク
トルは 254〜259nm に極大吸収を持つ。 (8) 融点 ：220 ℃で収縮し、230 ℃付近から徐々
に着色化し、明確な融点を示さない。 (9) 灰分なしの分子量 ：約660k〜1200 (10)糖分含有量 ：1.5 〜2.4 μg/mg( フェノール硫酸
法、グルコース換算) (11)蛋白の含有量：0.9 〜2.0 μg/mg( クマジーブリリ
アントブル−色素法、牛血清アルブミン換算)

【００１２】上記結果から、本発明の有効成分はタンパ
ク質、糖等の複合体または混合物よりなる有機物から成
るものと推定される。

【００１３】本有効成分の治療への適用については、動
物実験の結果から、注射剤として使用することが好まし
く、特に皮下注射により生体内の網内系を刺激して免疫
系を亢進させるようにするのがよい。また、製剤方法を
選択することにより経口、坐薬等の剤形にして使用する
こともできる。注射剤としては皮下の他、筋肉内、静脈
内注射剤のいずれでもよく、懸濁液、溶液もしくは使用
時溶解させる粉末等の剤形が用いられる。また、注射剤
には局部麻酔剤を含ませる必要はない。

【００１４】本発明の有効成分の投与量は患者の症状に
応じて適宜選択されるが、一般に成人において１〜 100
mg/kg を１日１〜数回に分け投与するのが好ましく、投
与方法としては経口又は皮下、筋肉内、静脈内もしくは
患部への注射によってなされるのが好ましい。

【００１５】

【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明す
る。 実施例１ 1) 有効成分の製造 生産培地として、グルコース0.5 ％、バレイショ澱粉2.
0 ％、ポリペプトン0.5 ％、プロテオース・ペプトン1.
0 ％、肉エキス0.3 ％、塩化ナトリウム0.75％の組成
（％はw/v)からなる培地を用いた。殺菌前のpHはpH7.2
に調整して使用した。調製した培地は500ml 容坂口フラ
スコ60本に100ml ずつ分注後、120 ℃、20分の高圧蒸気
滅菌器を用いて滅菌した。この培地に放線菌保存用寒天
培地にて継代培養したストレプトバーチシリウム・ハチ
ジョウエンス(Streptoverticillium hachijoense)Ｈ2609株を、白金
耳でかき取り接種し、28℃で３日間振盪培養し、前培養
とした。前培養した菌液を同培地に10ml接種し、28℃で
５日間振盪培養し、本培養を行った。

【００１６】培養終了後、培養液約6Lを除菌した後、培
養上清液に50％(w/v) 塩化亜鉛液を1/20量加え、3000回
転・5 分遠心分離して得られる沈澱物に、10％(w/v) 第
二リン酸ナトリウム溶液を培養上清液量の55％(w/v) に
なるように添加し、完全に懸濁して室温で１時間、４℃
で数時間から一夜静置の後、デカンテーションにより上
清を得た。上清液に４倍量の冷メタノールを加え、直ち
に、3000回転・５分間の遠心を行う。得られた沈澱物に
純水を加え、加温溶解し、グラスファイバーフィルター
で濾過し、凍結乾燥を行い、固形物を得た。この様にし
て得られた固形物は、蛋白及び糖の合計含有量1.9 μg/
mgであり、元素分析値はＣ：0.5 ％、Ｈ：1.2 ％、Ｎ：
0.1 ％、Ｏ：6.0 ％、Ｎａ⁺ : 31.0％、ＰＯ₄ ^- : 66.6
％、Ｓ： を持ち、分子量は300 から660kを示した。またこの時の
収量は約60g であった。

【００１７】2) インビトロ・サイトカイン誘導法 Balb/c 系マウス（雄、７週齢）にミネラル・オイルを
0.5ml腹腔投与後６日目の腹腔浸出細胞より非付着性細
胞を除去したものを免疫細胞とし、培養培地２×10⁶/ml
となるよう調製の後、96ウエル・プレートに 200μl ず
つシードする。サイトカイン誘導成分である上記固形物
を最終濃度10〜1000μg/mlとなるように添加し、炭酸ガ
ス濃度５％、37度のインキュベータで24〜72時間培養す
る。培養上清を室温12000rpmで10分間遠心分離し、細胞
片を除去したものを、サイトカイン誘導評価のサンプル
とする。

【００１８】3) インビトロ・サイトカイン誘導法 Balb/c 系マウス（雄、７週齢）より脾臓を摘出しメッ
シュを用い常法に従って脾細胞懸濁液を調製する。培養
培地２×10⁶/mlとした後、96ウエル・プレートに 200μ
l ずつシードする。上記固形物を最終濃度10〜1000μg/
mlとなるように添加し、炭酸ガス濃度５％、37度のイン
キュベータで24〜72時間培養する。ＩＬ−２の誘導には
１μg/mlとなるようにｃｏｎＡを共存させる。培養上清
を室温12000rpmで10分間遠心分離し、細胞片を除去した
ものを、サイトカイン誘導評価のサンプルとする。

【００１９】4) サイトカインのアッセイ法 サイトカインの評価はＥＬＩＳＡ法にて行った。 2)、3)により誘導されたサンプルを4)の方法で評価し、
その結果を表１〜３に示す。すなわち、マウス腹腔マク
ロファージのＩＬ−１誘導能を表１に、マウス腹腔マク
ロファージのＴＮＦ誘導能を表２に、そして脾細胞のｃ
ｏｎＡ添加によるＩＬ−２誘導能を表３に示す。

【００２０】

【表 １】 ＊ (−):検出限界未満

【００２１】

【表 ２】

【００２２】

【表 ３】 単位：Ｕ／ml

【００２３】3) の方法で誘導したサンプルには上記固
形物の濃度2000μg/mlのとき、添加後24hrでIFN-γ8000
pg/ml 、ＧＭ−ＣＳＦ60pg/ml を認めた。また同サンプ
ル中にはＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６の誘
導を認め、その誘導量はそれぞれ10pg/ml 、10pg/ml 、
10pg/ml 、30pg/ml であった。

【００２４】

【発明の効果】本発明のサイトカイン誘導成分は、マウ
スＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ
−γを誘導する。他にヒト・サイトカインＩＬ−１、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、
ＩＬ−５、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、マウス・サイトカイ
ンＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６も誘導し、
新規なサイトカイン誘導剤としての有用性が期待され
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/14 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 1/06 Ｚ 8412−4Ｂ (72)発明者 川島 浩 福岡県北九州市戸畑区境川１丁目７−４− 202 (72)発明者 岡本 智美 福岡県北九州市小倉北区中井２丁目４−６ −405 (72)発明者 岡本 茂 福岡県北九州市小倉北区中井２丁目４−６ −405 (72)発明者 関谷 広勝 福岡県北九州市小倉北区中井４丁目10−３

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ストレプトバーチシリウム・ハチジョウ
   エンスの培養上清液に塩化亜鉛溶液を加えて生ずる沈澱
   中に存在し、第二燐酸ナトリウム溶液によって抽出さ
   れ、抽出液に親水性有機溶媒を加えると沈澱する固形分
   を有効成分とするサイトカイン誘導剤。
2. 【請求項２】 ストレプトバーチシリウム・ハチジョウ
   エンスの培養上清液より得られ、下記の理化学的性質を
   有する物質を有効成分とするサイトカイン誘導剤。 ａ）外観 ：白〜淡黄色粉末 ｂ）溶解性 ：水に易溶、酢酸、ピリジンに難溶、メ
   タノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタ
   ン、アセトンに不溶 ｄ）呈色反応 ：ニンヒドリン反応、カルバゾール硫酸
   法、フェノール硫酸法及びクマジーブリリアントブル−
   色素法に陽性 ｅ）元素分析値：Ｃ 0.3〜0.8 ％ Ｈ 0.7〜1.6 ％ Ｎ 0.01 〜0.5 ％ Ｏ 3.5〜7.5 ％ Ｓ 240〜560ppm Ｎａ 12.0 〜35.0％ ＰＯ₄ 56.5 〜84.6％ ｆ）分子量 ：約660k〜300 ｇ）紫外部吸収スペクトル：λmax(ε)= 254〜259nm(水
   溶液) ｈ）灰分なしの分子量 ：約660k〜1200 ｉ）糖分含有量：1.5 〜2.4 μg/mg( フェノール硫酸
   法、グルコース換算) ｊ）蛋白の含有量：0.9 〜2.0 μg/mg( クマジーブリリ
   アントブル−色素法、牛血清アルブミン換算)
3. 【請求項３】 サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＦ
   Ｎ−γ、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦを誘導する請求項
   １記載のサイトカイン誘導剤。
4. 【請求項４】 サイトカインＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ
   −５及びＩＬ−６を誘導する請求項１記載のサイトカイ
   ン誘導剤。
5. 【請求項５】 ヒトまたはマウスサイトカインを誘導す
   る請求項３または請求項４記載のサイトカイン誘導体。