HU227440B1 - Permanent amniocyte cell line, the production thereof and its use for producing gene transfer vectors - Google Patents

Permanent amniocyte cell line, the production thereof and its use for producing gene transfer vectors Download PDF

Info

Publication number
HU227440B1
HU227440B1 HU0203387A HUP0203387A HU227440B1 HU 227440 B1 HU227440 B1 HU 227440B1 HU 0203387 A HU0203387 A HU 0203387A HU P0203387 A HUP0203387 A HU P0203387A HU 227440 B1 HU227440 B1 HU 227440B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
vectors
adenovirus
cell line
gene
cells
Prior art date
Application number
HU0203387A
Other languages
English (en)
Inventor
Stefan Kochanek
Original Assignee
Cevec Pharmaceuticals Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cevec Pharmaceuticals Gmbh filed Critical Cevec Pharmaceuticals Gmbh
Publication of HUP0203387A2 publication Critical patent/HUP0203387A2/hu
Publication of HUP0203387A3 publication Critical patent/HUP0203387A3/hu
Publication of HU227440B1 publication Critical patent/HU227440B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
    • C12N2810/405—Vectors comprising RGD peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
    • C12N2810/6018—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacturing Of Steel Electrode Plates (AREA)

Description

Permanens asaniocita eredetű sejtvonal, előállítása és alkalmazása géntranszfer vektorok előállítására
A találmány tárgyát penaanens amniocita eredetű sejtvonalak képezik, melyek legalább egy olyan nukleinsavat tartalmaznak, amely az E.1A és SIS adenovírus-régíök gén terme ke1nek expresssiöját biztos i tj a.
A találmány tárgyát képezik eljárások is permanens amniocita eredetű sejtvonalak előállítására., valamint a találmány szerinti amniocita eredetű sejfcvonalak alkalmazása géntranszfer vektorok és/vagy adenovírns mutánsok előállítására. A találmány tárgyát képezi továbbá amniociták és az £IA valamint E1B régiók adenovírális géntermékeínek alkalmazása permanens amniocita eredetű sejtvonalak előállítására .
Adenovirusok:
Az adenovirusok. egy viszonylag homogén v írus csooo rtot
a 1 ko -.ns k, amelyre jellemző az Ikozabec irálís kspszid, -amely
nagyrészt a vi rus által kó< áolt hexon, ponton és szálas fe-
hérjékből áll és 1 ineáris ís :efctős-szálá DKS genommal rende1-
késik, aa se Ívnek .n sere te ke >rülbelül 31 6 kilobázis (kb). A
vírusgénem a végeken a fordított, terminális ismétlődő- szekvenciákat (ITB.) tartalmazza, amelyek a replikáció virális kezdőpontját alkotják. Továbbá megtalálható a genom baiolAkfc&szárnunk: 96785-2754/PÁ *♦.* * * * * ♦♦» X
X * * * * 9 * * 4>
dali végén a pakoló szignál, amely a vírus genomnak a vírus kapsz.idő kba történő pakolásához szükséges a fertőzési ciklus során. Adenovírusokat már sok fajból izoláltak. Több, mint 40 különböze humán szeretipus ismert a különböző szerotípusok közötti különbségekért felelős paraméterek a lapján r mint például hemagglutínácíö, tumor keltő: képesség és DNS szekvencia homológia [Wigand és mtsai·.: in: Adenovírus DNA, szerk.: Doerfler, Martinas Níjoff Pübiishíng, Boston, 408-441. oldal, Π986Π- A napjainkig ismert adenovírus vektorok általában a 2. s z-e.ro típusból (Ad2) és az 5, szerotípusbóí (Ad5> származnak. Az Ad2 és Ad5 okozta fertőzések emberekben endemikusak. Az Ad2 és az Ad5 nem onkogén emberekben és jó biztonsági dokumentáció áll rendelkezésre ezekről, mert sikeres és komplikációmentes vakcinálásokat végeztek katonai személyeken az Egyesült Államokban (Pierce és mtsai.: Am. J. Spidemiol. 87 237 (1968)3. Az adenovírusok biológiáját viszonylag jól ismerjük, mert az adenovírusok lényeges szerepet játszottak a 'molekuláris· biológiában mint kísérleti eszközök különböző alapvető biológiai elvek tisztázásában, mint például a DNS replikáció, transzkripció, RNS hasítás („spiícing} és sejt transzformáció. Az adenovirális részecskék a sejtbe fertőzés során jutnak be receptor-közvetített endocítőzís útján, amelyben - jelen ismereteink szerint - a szálas fehérje „knob dóménjének kölcsönhatása a coxsackíe· adenovírus receptorral fCAR> működik közre a vírusrészecske sejtfelszínhez történő adhézíójában [Bergelson és mtsai.: Science 275 1320 (1997)]. Sgy a vírusrészecske bekebelezése, második lépésben történik * * *»-φ* ♦ » φ * φ *
Α « ♦ *«V φ * Φ Φ Φ
ΦΦ *Φφφ amelyben a pánton bázis kölcsönhatása az integrinekkel játszik lényeges szerepet l-Sfickhaxa és mtsai.: Cell 73 303 (1333)1, Miután a részecske belépett a sejtbe# a vírusgénen· mint DNS-fehérje komplex kerül be a sejtmagba. Az adenovirus fertőzési ciklus egy korai és egy késői, fázisra oszlik# amelyeket az adenovirális replikáció megindulása választja el egymástól (Shenk# in: Virology# szerk.: Fields, bippincott-Raven Publishing# Philadelphia# 2111-2148. oldalak# <1996) j . A korai fázisban az El# £2# S3 és E4 korai vírusfunkciók expressziója történik meg. A késői fázisra jellemző a késői gének transzkripciója# amelyek a vírus strukturális fehérjék expresszíójáért és az űj vírusrészecskék termeléséért felelősek.
Az E1A az első vírusgén# amelyet a vírus kromoszóma expresszi a sejtmag elérése után. Az E-ÍA gén a 12S és a 13S fehérjéket kódolja# amelyek az E1A RNS alternatív hasítása („splícíng') révén keletkeznek. Az S1A fehérjék aktiválják számos sejt eredetű és vírusgén transzkripcióját a transzkripciós faktorokkal létrejövő kölcsönhatás révén. Az S1A fő funkciói a következők: (a) az E1S# E2# E3 és E4 további korai vírusfunkciók aktiválása; és (h) a nyugvó sejtek indukálása# hogy azok belépjenek a sejtciklus S-fázisába. Az EX& expressziója önmagában programozott sejthalálhoz (apoptó zi s) ve zet.
Az E1B egyike a korai vírusgéneknek# amelyeket az E1A aktivál. Az £18 gén az £18 SS kDa fehérjét és az E1B 19 kDa. fehérjét kódolja# ami az £18 RH8 alternatív hasításának az eredménye. Az 55 kDa fehérje módosítja a sejtciklus prog*99 9 χ» »0*9 99 * * * » ♦ * 9 * ♦ ♦* 9 99 * * 9 * 9 9 9 9
resszióját a p53 tumor-
csönhatás révén, szerepe
jának megafcadályo zásában
megakadályozza a sejtek E
kDa fehérje hason ló módos
E1 A- i adu k á 11 ap opi tózisána
í ί es
LB 19
As összes humán adenovírus képes rágcsálósejtek transzformálására sejttenyészetben. Törvényszerűen az E1A és E1B együttes expressziója szükséges az onkogén transzformációhoz ,
A fehérje IX gén - amely a vírus kapszid egy strukturális- komponensét kódolja - az E1B transzkripciós egységbe beágyazottan található.
Az E2A és E2B gének különböző fehérjéket kódolnak, amelyek létfontosságúak a vírus genom replikációj-ához. Ezek magukba foglalják a terminális fehérje (pTE) prekurzor fehérjéjét, a DNS polimerázt (Pol) és az egyeslánc-kötő fehérjét ÍSSBP). Replikádé esetén a pTP kötődik a vírusgénem 1TR szekvenciákhoz. Itt mint fehérje primer szerepel a DNS replikádéban, amit a Pol inicíál sejt eredetű faktorokkal együtt. A Pol, SSB? és a sejt eredetű N'FII faktor - és feltételezhetően további faktorok - szükségesek a DNS lánc ex t en z i ó ho z.
Az E4 különböző fehérjéket kódol. Többek között kódolja as E4 34 kDa fehérje blokkokat, az E1B 5ö kDa fehérjével együtt, biztosítja a sejt mRNS-ek akkumulációját a citoplasmában és ugyanakkor elősegíti a vírus BNS-ek transzportját a sejtmagból a citoplazmáfoa.
**** XX ΦΦ ♦ * * X Φ X φ * * Φ Φ Φ * * ♦ φ ♦ *'» ♦ »» »»*.♦
A vírusgéné® replikácíó-jának kezdete után vírus szerkezeti fehérjék expressziója jön létre, ami szükséges a vírus kapszid létrehozásához és a vírus DNS· komplex kialakításához. a vírus által, kódolt DNS-kötő fehérjékkel. Ténylegesen először is egy üres kapasíd alakul ki, amelybe ezután a vírusgénem belep. A vírus genomon egy cls elemre van szükség ehhez a folyamathoz, ez az úgynevezett pakoló szignál, amely a vírus genom baloldali végén helyezkedik el és az Ad5 esetében a 260. bázispártéi a 460. bázispáríg terjedő régiót foglalja el. [Hearing és mtsai.: J. Virol. 62 2555 {1987); Graeble és· Hearing: J. Virol - 64 2-047 (19-90)] . A pakoló szignál átfedésben van az E1A enhanszerrei, amely létfontosságú az EIA promoter aktivitásához. A vírusgenom vírus kapszidokb-a történő pakolásának a pontos mechanizmusa nem világos, de feltételezhető, hogy a sejtes és/vagy a vírusfehérjék kölcsönhatása a pakoló szignállal szükséges éhhé z.
Adenovírus vektorok:
Az adenovírus vektorok különösen fontosak mint expreszsziös vektorok, közelebbről meghatározva génterápia céljaira. Ennek, számos oka van: az aöenovirusok biológiáját alaposan megismerték. A vírusrészecskék stabilak és viszonylag egyszerűen és magas titerek mellett termelhetek, Az adenovírus genom genetikai manipulálása könnyű. Az adenovírus vektorok hatékonyan képesek replikálödó és nem ropiikálódó sejtek transzdukálására in vitro és in vivő.
XX Φφ
ΦΦΦ'Φ
Φ «Φφφ » φ
Φ X Φ Φ Φ φ φ φ * X * X Φ Φ Φ φφ * ** χ»φ χφφφ
(a ) Első denovírus v aktorok:
AZ első generációs « ideno vírus vektorokra fGilardi és
latsai. : FEBS Lettérs 267 60 (1990) ; Stratford-Pe.rricau.< let
és mts a .i.; Hí un. Gén. Ther . 1 241 (1990)] jellemző az E1A és
ElB gének deléciója. Az S1A és ElB transzformáló és transzaktiváló tulajdonságokkal rendelkezik. Továbbá az E1.A szükséges a vírusgének aktiválására és az SIS szükséges a vírus fcranszkriptumok felhalmozásához. Néhány vektorban ezek mellett még az E3 is delécióra került annak érdekében# hogy .megnövelje a kapacitást, idegen DNS felvételére. Az £3 nélkülözhető adénovirusok termeléséhez sej t tenyészetben.. Az idegen DNS felvételi kapacitás körülbelül S kb. Az első generációs adenovírus vektorokat napjainkig főleg 293 sejtekben termelték {lásd alább) amelyek kompiementálják a vektorok E1A és E.l.B hiányát.
(b) Második generációs adenovírus vektorok:
A második generációs adenovírus vektorokra jellemző az £2 és/vagy E4 deléciója az E1A és ElB deléciók mellett (Engelhardt és mtsai.: Proc. Natl, Acad. Sci. USA 91 6196 (1994); Yang és mtsai.: Natúré Génét. 7 ^62 (1994); Gorziglía és mtsai.; J. Virol. 70 4173 (1996); Krouglíak és Öraham: Hűm. Gene Ther. _6 1575 (1935); Zhon és mtsai.: G. Virol. 70 7030 (1996)]. Néhány vektorban a fentiek mellett még az E3 is delécióra került annak érdekében, hogy megnöveljük az idegen DNS felvétel kapacitását. A második generációs adenovírus vektorokat annak érdekében fejlesztették ki# hogy tovább csökkentsék a vírusgének transzkripcióját és a vírusfehérjék expressziéját és így ezáltal tovább * * X * 9 * *
Φ φ Φ Φ Φ X X φ *♦'*.♦*· Φ «
X* ♦ Φ* «ΦΦ ΦΦ*φ
Ther csökkentsék .az antiviráiis immunválaszt. As Idegen ÖRS felvétel kapacitása elhanyagolható mértékben növekedett az első generációs adenovírus vektorokhoz képest, A második, generációs adenovírus vektorokat olyan sejtvonalakban termeljük, amelyek as EIA és az E1B mellett az adott hiányt (E2 és/vagy E4) is komplementélni képesek.
(c) Nagy DNS kapacitással rendelkező adenovírus vektorok:
A nagy DNS kapacitással rendelkező adenovírus vektorokra jellemző, hogy nem tartalmaznak vírus eredetű kódoló DNS szekvenciákat ÍKochanek és mtsai,: Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93 5731 11996); Fisher és mtsai,: Virology 217 11 (1996); Kutaar-Singh és Chamberlain; Hűm, Mól. Ge.net. 5 913 (1996)]. Ezek a vektorok csak a vírus eredetű végeket tartalmazzák az ezekben elhelyezkedő 17R szakaszokkal és a pakoló szignállal együtt. Az idegen DNS felvételi kapacitás körülbelül 37 kb, mert az adenovírus genomnak messze a legnagyobb részét kivágták, Különböző, nagy DNS kapacitással rendelkező adenovírus vektorok termelésére alkalmas rendszereket írtak le ÍKochanek és mtsai,, lásd fent; Rarks és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. VSA 93 13565 (1996); Hardy és mtsai.: J. Vírol. 71 1842 (1997)]. Ezen nagy DNS kapacitással rendelkező adenovírus vektoroknak az első és második generációs adenovírus vektorokkal szemben előnye a nagyobb kapacitás az idegen DNS felvételére és az alacsonyabb toxicitásuk illetve immunogenitásuk [Schiedner és mtsai.; Natúré Génét, 18 180 (1998); Mórral és mtsai.: Kúra. Gene . 9 2709 (199-:8)].. Jelenleg nagy kapacitású adenovírus **♦* ♦♦ Φ»*Λί ♦ ♦ * ♦ * 4 « * * *« <♦* 4 * * * » » 4 * *♦ * *Φ **« »««χ vektorokat Ε1Α- és EíS-deiéciős helper vírusok segítségével állítanak elő, amelyek biztosítják a szükséges vírus funkciókat egy produktív fertőzési ciklushoz trams-ban. Napjainkig nagy DNS kapacitással rendelkező adenovírus vektorokat 293-sejbekben termeltek vagy a 293-sejtekhői származó sejtvonalakban termeltek.. Az. egyik előállítási módszer szerint [Parks és mtsai., lásd fent; Bardy és mtsai., lásd fent] adenovírus vektorokat módosított 293-sejtekhen állítottak elő, amelyek az SlA és E1B mellett expresszálják a Pl-bakteriofág Cre-rekombinázt, Ebben a rendszerben a helper vírus pakoló szignálját a Pl-bakteriofág IoxP felismerési szekvenciái határolják,. A Cre-expresszáló 293-sejtek fertőzése esetén a helper vírus és a nagy DNS kapacitású adenovírus jelenlétében a helper vírus pakoló szignálja kivágásra kerül. 'Ezen ok miatt pakolás főleg azon vektorok esetében jön létre, amelyek normál pakoló szignált tartalmaznak és nem jön létre a. helper vírus esetében.
(d) Deléciót hordozó adenovírus vektorok:
Ezeket a vektorokat mint első generációs vektorokat írták le, amelyek rendelkeznek. a Pl-bakteriofág ioxP felismerési szekvenciáival a vírus genomban olyan módon elhelyezkedve, hogy a Cre-expresszáló 293-sejbekkel történő fertőzés esetén a vírus eredetű kódoló szekvenciák legnagyobb része vagy az össze vírus eredetű szekvencia delécióra kerül a IoxP felismerési szekvenciák közötti rekombináció következtében. Ezen vektorok genomjának mérete körülbelül 9 kb. Hasonlóképpen az idegen DNS felvevő kapacitás körülbelül 9 kb [Lieber és mtsai.; J. Virol. 70 :8944 {1996)1.
>.«·*♦ ** φφφ*· φ*
X * « Φ .0 X Φ
X Φ Φφ ΦΧ* X » Φ * « » * * ·¥·*· * *♦ -ΦΦΦ ΦΦΦφ
Adeno-asszcciált vírus (AAV;:
Az AAV a parvovírusok családjába, a dependovirus nemzetségbe tartozik és két különböző létformája van, előfordulhat mint lítikus vírus vagy mint provirus, Egy iitíkus fertőzés létrejöttéhez a vírusnak helper vírussal (adenovírus, vacc.in.ia vírus, herpesz szimplex vírus) történő együttes fertőzésre van szüksége, Helper vírus hiányában az AAV nem képes replikáiddal, a genomba integrálódik és ott mint inaktív provirus létezik. Amikor integrált provírusként AAV-t tartalmazó sejteket fertőzünk - például adenovírussal - a provirus ismét képes Iitíkus fertőzési ciklusba lépni (Samuiski; Curr. Opin, Génét, Dev. 3 74 (1993)].
Az AAV kapszidok egyláncú, lineáris DNS genomot tartalmaznak akár pozitív, akár negatív polaritással. Számos AAV szerotípus létezik. A legnagyobb mértékben vizsgáit szerotípus az AAV-2. Az AAV-2 genomja 4 680 nukleotidből áll, A genom a végein megfordított terminális ismétlődő szekvenciákat tartalmaz (ITR) amelyek hossza 145 bázispár. Az első 125 bázispár egy T-alakú hajtű struktúrát formál, amely két belső paiindrombél áll.
Az AAV genom nem-strukturális replikációs (Rep) fehérjéket és strukturális kapszid (Cap) fehérjéket kódol, A különböző replikációs fehérjék (Rep78, P.ep68, Rep 5.2, Rep40) létrejöttéhez eltérő prcmoterekre (p5 és p!9) valamint alternatív hasításra („spiicing) van szükség. A különböző kapszid fehérjék (VP1, VP2, VP3) alternatív hasítás segítségével jönnek létre a p40 promőter alkalmazásával.
* »-'·*♦ ♦*** »φ φφφφ φφ * * φ φ * * ·» * φ φφ «»φ φ * Φ ♦ « Φ XX
ΦΦ * *♦ ΦΦΦ ΦΦΦ*
AAV vektorok:
Az AAV vektorok csupán az ITR szekvenciákat tartalmazzák az AAV-bol és néhány szomszédos, a kódolásban részt nem vevő AAV szekvenciát. Szén oknál fogva az idegen DMS felvevő- kapacitás körülbelül 4,5 kb, Különböző rendszereket írtak le rekombináns AAV vektorok előállítására [Skul.imowskí és Samuiski, in: Methods in Moleeular Genetics, 71 kötet, 3-12. old., szerk.: Adoph, Academic Press]. A replikádéihoz, expressziőhoz és a rekombináns vektor pakolásához szükséges komponenseket ezekben a rendszerekben biztosítjuk. Közelebbről meghatározva, ezek olyan expressziós kazetták, amelyek az AAV Rep és Cap fehérjéit kódolják, továbbá kódolják az adenovírus eredetű helper funkciókat. Az AAV termeléshez szükséges adenovírus eredetű helper funkciók közelebbről meghatározva a. következők: El A, KIS, E2, E4 és VA. Az Σ.1.Α és £18 funkciókat, a 293-sejtek biztosítják, -amelyeket napjainkig- a termelésben alkalmaztak. A napjainkig leírásra került termelési folyamatokban az S2, £4 és- VA. funkciókat jelenleg rendszerint adenovirussal történő együttes fertőzéssel biztosítják vagy S2-, E4- illetve VAexpresszáló piazmiöokkal történő együttes fertőzéssel (Samulskí és mtsai.: J. Virol, 63 3822 (1939); Alién és mtsai.: J. Virol. 71 6316 (1997); Tamayose és mtsai.: Hűm. Gene Ther, 7 507 (1.996); Flotté és mtsai.: Gene Ther. 2 29 (1995); Conway és mtsai.: J. Virol. 71 8730 (1997);
Chioriní és mtsai,: Bum. Gene Ther. 6 1531 (1995); Ferrari és mtsai,: J, Virol. 70 3227 (1996); Salvetti és mtsai.:
Bum. Gene Ther, 9 69S (1998); Xiao és mtsai.: J. Viroi, 72
ί. ί φφ »φ φ φφφφ « φ
Φ Φ «X »ΦΦ φ * φ φ φ φ φ φ
ΦΦ φ Φφ ΦΧ* Χ*φφ
Hűm.
2224 (199S); Grimm és mtsai.: Hűm. Gene Ther. 9 2745 (1398); 2haug és mtsai.: Hűm. Gene Ther. 10 2527 (1999)). Alternatív módon eljárva olyan stratégiákat fejlesztettek ki# amelyekben .adenovlrus/AAV vagy herpesz szimplex virus/AAV hibrid vektorokat alkalmaztak AAV vektorok előállítására (Conway és mtsai.# lásd fent; Johnston és mtsai.: Hűm. Gene Ther. 8 359 (1997); Thrasher és mtsai.: Gene Ther. 2 481. (1995); Fisher ás mtsai.: Hűm. Gene Ther. 7
2079 (1996); Johnston és mtsai.: Hűm.. Gene Ther. 8 359 (1997)] . Ezekben az eljárásokban mindben közös# hogy jelenleg El A- és ElB-expresszáló 293-sejteket alkalmaznak a termelésben ,
Termelő sej tvonaiak:
Biztonsági okokból az emberekben történő alkalmazásra szánt ádehovirus vektorokból az EÍA és E1B géneket kivágjuk. A termelést komplementéi© sejtvonaiakban végezzük, •amelyek biztosítják az El funkciókat trans-ban.. Napjainkig a legtöbb adenovírus vektort a 293 sejtvonalban állították elő·. Az utóbbi években további sejtvonalakat hoztak létre, amelyek alkalmazhatók El-deléciós adenovirus vektorok előállítására.
(a) HEK 293 sejtek;
Hosszú ideig a HEK 293 sejtek voltak az egyetlen olyan sejtek# amelyek alkalmazhatók El-de.léciós adenovírus vektorok előállítására. A HEK 293 sejteket 1977-ben állították elő oly módon# hogy összevágott adenovirus DNS-t transzfektáltak humán embrió eredetű vesesejtekbe („Humán Embryonic Kidney # HEK. sejtek)', -összesen nyolc transzfekcíó-s kísérΦ* *χ*φ *φφ« φφ φφφφ ♦ * X Φ * V φ φ * «φ ί** φ * « ♦ Φ X « »
XX ♦ ♦* ΧΦΦ ΦΦΦφ latban, mindegyikben átlagban 20 KEK tenyészetet véve, lehetőség volt egyetlen halhatatlan sejtklón kinyerésére (Graham és mtsai.: J. Gén. Virol. 36 59 (197?)]. Az ezen sejtklónból létrehozott sejtvonal (HEK 293 sejtek) tartalmazzák az adenovírus genom teljes baloldali 11 százalékát (az 1-4344. bázispárak az .AdS genomból), magába foglalva az E1A és S.1B géneket és a baloldali ITR szekvenciát valamint az adenovírus eredetű pakoló szignált (Louis és mtsai.: Virology 233 423 (199?)]. Az adenovírus vektorok termelésében jelentős probléma a szekvencia homolégia az El-deléciós adenovírus vektorok és a 293 sejtekben integrált adenovírus DNS rész között. A. vektor genom és a 293 sejtekbe integrált adenovírus DNS közötti homológ rekombináció felelős a replikáé lé-kompetens adenovirusok (ACA) létrejöttéért ([Loehrnüller és mtsai.: 8m. Gene Ther. 5 1485 (1994); Hehir és mtsai.: J. Virol. 70 8459 (1996)]. Ezen oknál fogva a HEK 293 sejtek nem alkalmasak gyógyszerészeti minőségű adenovírus vektorok előállítására, mert .a termelési egységek gyakran szennyeződnek elfogadhatatlan mennyiségű RCA vírussal. Az RCA elfogadhatatlan a klinikai alkalmazásokra előállított termékekben, mert a replikáció-kompetems adenovírusok jelentősen magasabb toxicítással rendelkeznek mint a replikáciő-híbás adenovirusok, képesek. szabályozhatatlan replikádéra emberi szövetekben és továbbá alkalmasak a rep1ikác1ő-hibá s adenovi rusok komp1ementáláséra is (Lochmüller és mtsai., lásd fent; Imler és mtsai.: Hűm. Gene Ther. 6 711 (1995); Hehir és mtsai., lásd fent].
* ♦ A ♦ 9 Jfr «.
♦ * ** *w* * * * * * ·* * * ** ♦ ** ««»« (b) Humán embrió eredetű retinasejtek (HER sejtek) és megalapozott sej tvonalak:
Bár a rágcsáló sejtek könnyen transzformálhatok adenovírus El funkciókkal, a primer humán sejtek viszonylag ellenállóképesnek mutatkoztak az E1.A és E1B transzformációval szemben. Ahogyan ezt fentebb említettük, Graham és munkatársai képesek voltak egyetlen sejt .klőnt izolálni olyan HEK sejtekből, amelyeket szétvágott AdS DNS-sel trans-zfektáltak. Gallimore és munkatársai hosszú ideig eredménytelenül próbálkoztak a primer BEK sejtek transzformálásával az Adl2 El funkcióival (Gallimora és mtsai.; Anticancer Rés, 6
499 {1986}]. Ezeket a kísérleteket három, éven keresztül eredménytelenül végezték az Ad.12 több mint. 1 mg mennyiségű £coRI cDHS fragmensével, amely fragmens tartalmazta az E1A és £18 géneket. A. kivitelezett nagyszámú kísérlet ellenére, sok próbálkozás után csupán négy Adl2-El HEK sejtvonal izolálása volt lehetséges (Whittaker és mtsai.: Hol. Cell, δόάοη Gallimore és munkatársai további primer humán sejtek lkai, beleértve keratinocitáepatocitákat és urotheiiális
3.Í.: Anticancer Re-s. 6 499 ;len humán sejttípus, amelyet mostanáig reprodukálhatőan sikerült transzformálni ade.no vírus El funkciókkal, a humán embrió eredetű retina sejtek CHER sejtek) . A HSR sejtek a fehér neurálís retinából származó sejtek keveréke. Ezen sejtek kinyeréséhez a szemet kiemeljük egy humán magzat szeműregéből - általában a terhesség lő.
.. 5 Λ O.i. . Λ· 110 (198411. P lasonl·
kertel en kísérletet tett
•anszformáiására El funkc
tt, bő r fibroblaszt okát,
titeket (Gallímore és m
.986) ] . Az egyetlen hatná.
Κ X- *»«♦ ΦΦ ♦**»! φφ Φ Φ V ♦ * Φ ί φ. ΦΦΦ φ
Φ Φ » Φ » Φ
Κ Φ ΦΦ Φ*Φ ΦΦΦ és 20. hete között. Az szemet horizontális metszéssel felnyitjuk és a fehér neuráiis retinát csipesz segítségével eltávolítjuk, majd sejttenyészetbe visszük.
Azon korábbi megfigyelések alapján, hogy (a) az Adl2índukáit tumorok elsődlegesen primitív neuráiis epíthéliumból származnak (Mukai és mtsai.: Prog. Neuropathol.
(1976) 1 és (b) az. AdX2 retinális tumorokat indukál patkányokban és páviánokban íntraokuiáris beoltás után [Mukai és mtsai., lásd fent; Mukai és mtsai.: Science 210 1023 (1980)], Byrd és munkatársai azt találták, hogy a humán embrió eredetű retinoblasztok (HER sejtek) transzformálhátúk az Adl2 SÍ génjeivel [Byrd és mtsai.: Natúré 298 69 (1982)]. Bár a HER sejtek transzformációs hatékonysága kisebb volt, mint a primer patkány sejtek esetében, a transzformáció hatékonysága több, mint százszor magasabb volt, mint a KEK sejtek esetében. A vizsgálatokat annak érdekében indítottuk, hogy kompiementáiö sejtvonalakat állítsunk elő, amelyek alkalmazhatók izolált Ad 12 El mutánsok esetében.
Ezen kutatócsoport további vizsgálatai során [Galiímore és mtsai.; Cancer Cells 4 339 (1986)] kimutatták, hogy a HER sejtek hatékonyan transzformálhatók olyan plazmid DNSsel, amely expresszálja az Ad5 EIA és E1B génjeit, A transzformáció hatékonysága és az EIA- és ElB-expresszáló sejtvonalak létrehozása körülbelül 20x magasabb volt az Ad5 El génjeivel, mint az Adl2 El génjeivel.
Ezen adatok alapján Eailaux és munkatársai [Eallaux ás mtsai.: Hűm, Gene Ther. 7 215 (1996); Eallaux és mtsai,: Hűm, Gene Ther. 9 1909 (1998)] EIA- és ElB-expresszáló « χ »? *vf *
S .- * » » « * ♦ ♦ — ** * ** *»» »**» sej ^vonalakat hoztak. létre HER. sejteket olyan plazmidokkai transzformálva,· amely plazmidok az AdS S1A és SIS- génjeit expresszálták. A 911 sejtvonalat olyan plazmiddal transzformálva hozták létre, amely tartalmazza az AdS E1A és E1B génjeit (az AdS genom 79-5789. nukleotidjai} és E1A gént expresszál a természetes eredetű E1A promoter szabályozása alatt [Fallaux és mtsai., lásd fent; WO97/0Ö326 azonosítószámú. szabadalmi bejelentés]. Lehetőség volt további E1Aés E1B- expresszáló HER sejtvonalak létrehozására olyan plazmid transzfektálásávai, amely tartalmazza az Ad.5 genom 459-3510. nukleotidjait, és amelyben az E1A gén a humán foszfoglicerát kínáz (PGK! promófcer szabályozása alatt áll, és amelyben a természetes eredetű £18 políadenilációs szignált a hépatitis2-S vírus <HBV) felületi antigénjének polí (A) szekvenciája, helyettesíti [Fallaux és mtsai., lásd fent; WO97/Ö0326 azonosítószámú szabadalmi bejelentés]. Ezekre a HER. sejtvonalakra korábban mint PER sejtvonalak hivatkoztak. Ezen újabb PER. sejtvonalak előnye a 293 sejtekkel vagy a 911 sejtvonailal összehasonlítva a szekvencia homológia hiánya az első generációs adenovírus vektor DNS és a beépült Ad5 DNS között. Ezen ok miatt jelentős mértékű csökkenés tapasztalható az RCA létrejöttének valószínűségében. Ezek az E.1A- ás EXE-transzf ormait HER sejtvonalak <911 sejtek és PER sejtek] képesek voltak komplementálni az első generációs adenovírus vektorok El hiányát és így alkalmazhatók voltak ezen vektorok előállítására.
Hasonló módon olyan sejfcvonalról tesznek említést. Xmler és munkatársai közleményükben, amelyet a pTG6S59 plazmiddal *999 999« 99 *»99 99
9 9 « 9 «9
X 99 99« 9 «XX 99 9 * * -XX »99 9999 transzformált HER sejtekből állítottak elő {Imler és mtsai.., lásd fent; valamint a WO 94/28152 azonosítószámú szabadalmi bejelentési. A pTG6559 plazmid tartalmazza az E1A és E1B gének kódoló szekvenciáit továbbá tartalmazza a protein-IX gén kódoló szekvenciáját (.az AdS génemből az 5-05-4034. nukleotidok), ahol az E1A gén az egér foszfoglicerát kináz (PGK) promóter szabályozása alatt áll és az E1B és protein-IX gének együttes pol.iadenilácíós- szignálját a nyúl β-globin gén poliadenilá-c.iós szignálja helyettesíti.
Ellentétben az Ad5 E1A és E1B génjeivel történő transzformáció útján megkísérelt, primer humán sejtek előállításává 1# néhány esetben kísérletet tettek különböző szerotip-usú EIA és E1B gének stabil expressziójára korábban létrehozott sejtvonalakban [Grodzícker és mtsai.; Cell. 21 45-3 (1980); Babiss és mtsai. : 1- Virol. 48 454 (1983); Shíroki és mtsai.-; J. Virol. 45 1074 (1983); Imler és mtsai., lásd fent; lásd még; WO 94/28152 azonosítószámú szabadalmi bejelentés] . Ezen sejtvonalak hátrányai annak szükségessége, hogy szelekciós markerrel együtt kell expresszálni és az El A illetve SIS expressziók stabilitása gyakran hibás. Mivel ezek a sej tvona lak eredetüknél fogva halhatatlan .sejtvonalak, az E1A és E1B expressz lója nem szükséges- a sejtvonalak túléléséhez, így az E1A és E1B alapján történő természetes szelekció szükségtelen ebben az esetben a primer sejtek alkalmazásával ellentétes módon.
A múltban az adenovírus vektorok vagy az AAV vektorok termeléséhez szükséges sejtvonalak előállítása különös nehézségekkel járt. Humán embrió eredetű vesesejtek (HEK seí17
44** *»44 44 ** * * * 4 4 4 4 » 4 *44 4 * 4 4 4 4 4 4
4* 4 4* *»4 <ΗΨ tek) előállíthatok humán magzatok veséjéből. Ennek megvalósításához egy magzatból eltávolítjuk a vesét ás a vesesejteket tenyészetbe visszük, A HfSK sejtek transzfek-ciója összevágott AdS DNS-sel és az AdS DNS baloldali végének integrálódása, majd az EIA és EiB gének expresszié ja. egyetlen publikált esetben vezetett a sejtek transz formál ásáho-z. Lehetőség volt egyetlen sejt vonal létrehozására (293 sejtek) ezen az úton [Graham és mtsaí., lásd fent; továbbá lásd még fentebb a „Termelő sejtvonalak fejezetben, (a) bekezdés], 293 sejteket használtak fel adenovírus vektorok és .AAV vektorok előállítására,
Humán embrió eredetű retina sejtek (HE'R sejtek) kinyerhetők humán magzatok szeragolyöjáböi . Ehhez eltávolítunk egy szemet a magzatból és a retinából származó sejteket tenyészetbe visszük. Lehetőség volt HER sejtek transzfekfcálására az adenovírus eredetű E.1A. és EIB gének segítségével és így a KÉR sejtek transzformálására [lásd fentebb a „Termelő sejtvonalak fejezetben,· (b) bekezdés], Az El A és EIB génekkel transzformáit sejtek felhasználhatók adenovírus vektorok termeltetésére,.
Mindkét esetben szükség van szerv eltávolításra humán magzatból, amelyek akár spontán, akár terápiás célú abortuszból származnak, vagy szociális alapon végzett terhesség megszakításból származnak és ebből a szervből sejttenyészetet kell létrehoznunk. Primer tenyészet létrehozása után ezeket a sejteket transzformálhatjuk az adenovírus eredetű EIA és EIB génekkel végzett transzfakcióval. Az ily módon létrehozott és EIA illetve EIB géneket expresszáló sejtvo»*·».*. ** «-«»« «Λ * * Φ * « Φ β < ·*φ 'φ * φ « » * φ *
Λ* * ** ΦΧΦ «*<» nalakat ezután alkalmazhatjuk adenovírus vektorok vagy AAV vektorok termelésére.
Nyilvánvaló, hogy bonyolult primer sejteket kinyerni magzati szervekből. Mivel primer tenyészetet csak friss szövetből lehet létrehozni,· speciális logisztikai szervezés szükséges ahhoz, hogy megfelelő szövethez jussunk. Továbbá a magzati szövet felhasználása, akár spontán abortuszból, terápiás célú abortuszból vagy szociális alapon végzett terhesség megszakításból származik, speciális etikai megfontolásokat igényel és nagy gondosságot igényel, hogy primer tenyészetet hozzunk létre. Bár a feltalálók laboratóriuma egy nőgyógyászati klinikán található ahol gyakran végeznek terhesség megszakításokat, nem volt lehetséges megfelelő- szövet kinyerése több mint egyéves időszakon belül. Ά magzati szövet eltávolításához az abortusz után a terhes nő írásos beleegyezése szükséges a megfelelő tájékoztatás után. Gyakran lehetetlen volt a. terhes nő beleegyezését megszerezni a szerv eltávolítás! beavatkozáshoz, miután a nő részletes információt kapott a projektről, azaz egy szem eltávolításához a magzatból tudományos orvosi kísérletek céljára.
Egy permanens amníocita eredetű sejtvonal alkalmazása géntranszfer vektorok előállításhoz korábban még nem került leírásra. Csak olyan beszámoló található humán amniocitákkal kapcsolatban, amelyeket az SV40 simian vírussal transzformáltak és/vagy a Kírsten szarkóma vírussal transzformáltak l'Sack; In Vitro 17 1 (1981); Walen és mtsai.: In Vitro Cell Dev. Bioi. 22 57 (1386)]. Az SV40 vírussal önmagában
ΦΦΦΦ φ* «««» «» * φ φ « φ φ φ φ « ΦΦ ΦΦΦ φ * « Φ Φ φ φ φ
ΦΦ Φ φφ φΦΦ φφφ« végzett fertőzés meghos-szabbodott élettartamot eredményezett (ezt nevezzük halhatatlanná válásnak) f mig a Kirsten srarköma vírussal önmagában végzett fertőzés nem hosszabbította meg az élettartamot. Mindkét vírussal végzett fertőzés végül malignns tumor-sejthez vezetett (W-alen és Arnstein, lásd fent]. Ebben az összefüggésben meg kell jegyeznünk, hogy az SW0~ transz formált amnioeita eredetű sejtvonaiak nem alkalmasak géntranszfer vektorok, előállítására, mert ezek a sejtek önmaguk is képesek SV40 vírust termelni, amelyről ismert, hogy onkogén vírus [Graffney és mtsai.: Cancer- Rés 30 871 (1970)]. A humán sejtek transzformálhatósága SV40 vírussal továbbá nem biztosít információt az adenovirus SÍ funkcióival való transzformálhatóságról és azok alkalmazhatóságáról a géntrans-zfer vektorok előállítása során. így például a keratinociták transzformálható k az SV40 vírussal (lásd például: Sack, fentebb], de a keratinociták végül - a bor fibroblasztokhoz és a hepatocitákhoz hasonló módon - nem transzformálhatók A.dl2-vel (Gallimore és mtsai., 1986, lásd fentebb]. A vírusvektorok termelésével kapcsolatban azonban - különösen az adenovirusok esetében, halhatatlan sejtekben - nem csak az adott halhatatlanná tevő funkciókkal megvalósítható halhatatlanná tétel lehetősége a fontos, épp igy fontos a jő fertőzhetőség és a fertőzés- jó produktív folyamata. Ezek a tulajdonságok nem jeleztetok előre; annak kérdése, hogy egy adott sejttípus alkalmazhatő-e géntranszfer vekt-o.rok termelésére, minden egyes sejttípus esetében újra meghatározandó.
A találmány tárgyát képezi tehát egy új eljárás amniocita eredetű sejtvonal hatékony, egyszerű és könnyen reprodukálható előállítására és ennek alkalmazása többek között adenovlrus vektorok, AAV vektorok és retrovírus vagy lentivírus vektorok előállítására.
Teljes mértékben meglepő módon azt találtuk, hogy az amníotikus folyadék se j tjeinek (amniociták) transzíekelőj a - amelyet diagnosztikai célokra rutinszerűen nyernek ki az amníotikus folyadék foiopsziája tamnlocentézis) során szülés előtti diagnózis céljaira ~ az adenovlrus eredetű E1A és SIS génekkel nagyszámú olyan permanens sejtvonalhoz vezetett, amelyek az E1A és E1S géneket funkcionálisan aktív módon expresszárták és amelyek alkalmasak géntranszfer vektorok előállítására,
A találmány tárgyát képezi tehát legalább egy olyan nukleinsavat tartalmazó permanens amniocita eredetű se j ivónál f amelyben a nukleinsav az adenovlrus E1A és E1B régiók géntermékeinek expresszióját hozza létre. A leírás során a „permanens sejtvonal kifejezés alatt azt értjük, hogy a megfelelő sejteket valamilyen mértékben genetikailag módosítottuk úgy, hogy ezek képesek permanens módon növekedni sejttenyészetben. Ezzel ellentétesen a „primer sejt kifejezés alatt olyan sejteket értünk, amelyeket egy élő szervezetből eltávolítva és szubkultúrába helyezve nyertünk és amelyek élettartama korlátozott. A találmány szerinti permanens amniocita eredetű sejtvonal kinyerhető az itt leírtak szerinti folyamat segítségével, amelynek során primer amniocitákat transzfektálunk az adenovlrus El funkcióival.
«V ♦*»* ** » φ. ♦ * * β φ φ X*V J
A legalább egy nukleinsav, amely az adenovirus El géntermékek expresszi-óját hozza létre, bármely megfelelő nukleinsav lehet, amely ezen géntermékek stabil expressziéjához vezet, Ez(esek) integrálható(kj a sejt genomjába, azaz például a kromoszómába, vagy megtalálható .lehet a kromoszómán kívül, például egy episzómális szinten replikáiddá plazmidban vagy mínikromoszőmában. A különböző géntermékek expressziója továbbá. megvalósítható egy és ugyanazon nukleinsav molekula alkalmazásával vagy például különböző nukleinsav molekulák segítségével, A technika állása szerint az. „expresszió kifejezés alatt egy specifikus fehérje géntermék termelésének folyamatát értjük amely specifikus jelleget vagy specifikus tulajdonságot hoz létre, illetve RNS formák termelését értjük, amelyek nem kerülnek fehérjébe történő transzlációra Cmint például az antiszensz RNS~ek, tRNS-ek} . A szakember számára a leírás alapján egyértelműek a kívánt expresszié eléréséhez szükséges megfelelő alkalmazási lehetőségekj közelebbről meghatározva a javasolt eljárás alapján. Az új amniocita eredetű sejtvonal nem csak általánosságban a géntranszfer vektorok előállításában alkalmazható, hanem közelebbről meghatározva alkalmazható első generációs adenovírus- vektorok előállításában, is, amelyekre jellemző az eia és E1B gének deléciója, amelyeket a sejtvonal komplementéi.
A legalább egy nukleinsav ugyanakkor előnyösen az adenovírus S2A, S2B és/vagy E4 régiók és/vagy a Cre rekombináz géntermékeinek expresszioját is létrehozza. Ez a sejtvonaiat különösen alkalmassá teszi második, generációs adenoví< előállítására, amelyekre jellemzők az £2 rus vekto.ro!
amelyekre jellemzők *« **
Φ < « * * * ♦
Φ * ΦΑ X** Φ , ν Φ Φ * * * φφ X ΦΦ Φ** ***Φ és/vagy Ε4 gének dsiéciőja az E1A és E1B gének deiécíója mellett. A Pl-bakteriofág Cre rekombinázának expressziéja különösen előnyös nagykapacitású adenovirus vektorok termelésére egy E1A- és ElB-deléciós helper vírus segítségével (lásd továbbá: Parks és mtsai., fentebb; Hardy és mtsai., fentebb], Az EiA régió géntérmékeinek expresszióját előnyösen egy konstitutív promőter szabályozása alatt, előnyösen a foszfoglicerát kináz (PGK) promoter irányítása alatt végezzük. Az E1B régió géntermékeinek expresszioja szempontjából előnyös, ha egy adenovirus eredetű promót-er irányítása alatt áll, előnyösen az adenovirus EiS promőter irányítása alatt, Ennek egy lehetséges alternatívája az, hogy például egy citomegalovíms (CMV) promötert alkalmazunk. Az összes adenovirus géntermék előnyösen egy, ugyanazon a1nemzetségbe tartozó adenoví rusból. származik, például az 5. típusú humán adenovirusfeöl (AdS). A permanens amniooita eredetű sejtvonal általánosságban egy humán sejtvonal, mert sz különösen jól alkalmazható humán vírusokból származó gén transzfer vektorok előállítására, mint például egy humán adenovírusból vagy egy humán AAV-bői.
Ennek egy .lehetséges alternatívája egy főemlősökből vagy egyéb emlősökből - mint például marhából - származó ssitvonal, amely különösen alkalmas az adott fajban előforduló és endemikus vírusokból származó géntranszfer vektorok előállítására. így például egy marha adenovirus ElA és E1B génjeivel amniooifákat transzformálva olyan permanens am~ nio-c.it a eredetű sejt von alakat kapunk, amelyek alkalmasak marha adenovírusbői származó vektorok előállítására.
»··*
A találmány tárgyát, .képezi továbbá egy eljárás permanens amniocita eredetű -sejtvonal előállítására, közelebbről meghatározva a fentebb leírt amniocita. sejtvonal előállítására, amelynek során aaníocitákat transzferálunk legalább egy olyan nukleinsawal, amely az El A. régió és az E18 régió adenovírus géntermékeinek expresszióját hozza létre. Az eredményül kapott sejtklőnok ezután - amennyiben, szükséges - izolálhatők és kívánt esetben klőnozhatók, hogy egyetlen sejt vonalakat hozzunk létre. A leírás során a „transzfékeid kifejezés alatt bármely olyan eljárást értünk, amely alkalmas a nukleinsav(savak) bejuttatására a sejtekbe. Ezekre példaként említhetők az alábbi módszerek: elektroporáció, bármely típusú iíposzómálís rendszer valamint ezen eljárások kombinációi. A leírás során, az „amniocíták kifejezés alatt széleskörűen értelmezve az Összes olyan sejtet értjük,· amely az amniotíkus folyadékban megtalálható és az amniotíkus folyadék biopsziájával kinyerhető. Ezek származhatnak az amniónból vagy magzati szövetből, amely érintkezésbe kerül az amniotíkus folyadékkal. Az amniocíták három fő osztályát írták le, és ezek morfológiai kritériumok alapján különböztethetők meg egymástól: fibroblaszt-szsrü sejtek (F-sejtek) , epithél-szerű sejtek (E~.sejtek) és amnlotikus folyadék sejtek (AF-sejtek) (Hohn és mtsai.: Pedíat. Rés. 8 746 (1974)}. Az AT-sejtek képezik a fő sejttípust. Szőkébb értelemben, ezért tehát a leírás során az „amniocita elnevezés alatt az AF típusú amniocítákat értjük. Előnyösen primer amniocítákat alkalmazunk. A leírás során a „primer sejtek alatt azokat értjük, amelyek előálláthatók egy élő szervezetből történő eltávolítás- és az ezt követő tenyésztés során és továbbá csak korlátozott élettartammal rendelkeznek; Míg az úgynevezett „permanens sejt vonalak képesek korlátozás nélkül szaporodni. Ebben az értelmezésben különösen előnyös az olyan humán primer amniociták alkalmazása, amely humán sejtvonalak termeléséhez vezet (lásd fentebb), Azonban lehetőség nyílik arra is, hogy főemlősökből és más további, emlőst aj okból - mint például marhából - -származó primer amniocitá-kat alkalmazzunk. A szakember számára a leírás alapján, az is egyértelmű, hogy lehetőség van analóg módon olyan sejtek alkalmazására, amelyeket az amniotikus membránokból nyerhetünk ki, például tripszinizálás útján vagy chorionic villás biopszia útján, égy ezekből megfelelő permanens sejtvonalakat állítsunk
A legalább egy nukleinsav - amely az adenovirus El gén termékek expresszióját .hozza létre - egyaránt lehet gen-omi DNS, cDNS, szintetikus DNS, RNS és mRNS, A nukleinsavat előnyösen egy DNS expressziős vektor formájában alkalmazzuk. Ezekre például szolgálhatnak a beépülő vektorok, bakteriális plazmidok, epíszórnálisan replíkálödó plazmidok vagy mini kromoszómák. Előnyösen alkalmazhatók, azon expreszsziós plazmidok, amelyek beépülését a befogadó sejt genomjába transzfekció útján hozzuk létre. A leírás során a „legalább egy nukleinsav kifejezés alatt azt a tényt értjük, hogy az expresszi ót létrehozó -elemek elhelyezkedhetnek egy és ugyanazon nukleinsavban vagy elhelyezkedhetnek különböző nukleinsavakon. fgv például külön nukleinsavak biztosíthat25 φφφφ φ*** **** ** φ « φ φ * φ * φ φ φφ. *** φ .χ χ. Φ Φ » Φ Φ
4φ X φφ φφ'* ΧΦΦΦ ják az EIA, Ε1Β, E2A, S2B és/vagy az E4 régiók géntermékeinek és/vagy a Cre re-kombináz expresszióját♦ Az is elképzelhető, hogy a transz fekt.álásr a kerülő amniociták már expresszálják ezen géntermékek bármelyikét, így tehát csak a másik géntermék (további géntermékek) expresssióját keli megvalósítani, illetve csupán ezen géntermékek közül egy vagy több expresszióját kell bekapcsolni megfelelő szabályozó elemek bejuttatásával. A szakember számára rendelkezésre állnak a megfelelő technikák és eljárások a nukleinsavak. termelésére· és - amennyiben szükséges - a nukleinsavak mutagenezisére - továbbá a génexpresszióra és a fehérje analízisre [.lásd például: Sambrook és mtsai,: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) ; Glover: DMA Cloning: A Practical Approach, XI. kötet: Expression Systems, IH.L Press, (1965) ; Ausubel és mtsai.: Short Protocols in Molecular Biology, .John Wiley & Sons, (1999); Rees és mtsai.: Protein Engineeríng: A Practical Approach, IRL Press, (1993)). Előnyösen az EIA. régió géntermékét vagy géntermékeit egy konstitutív promóter szabályozása alatt expresszáljuk, közelebbről meghatározva a foszfoglícerát kináz (PGK) promoter szabályozása alatt és az E1B régió gén-termékeinek esetében egy adenovírus promoter szabályozása alatt, közelebbről meghatározva az E1B adenovlrus promoter szabályozása alatt. Az adenovírus promoter helyett alkalmazhatunk például e-gy citomegalovírus (CMV) promótert.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint eljárva az amniociták transzfekciőja és/vagy az eredményül *Χ#« ΦΦ ΦΦΧ» ΧΦ » Φ ·> φ * X *
V ♦ *Α ΧΦΦ X
ΦΦΦ Φ ♦ Φ Φ φφ Φ φφ φΧ* ♦Φφφ >tt sejtvonal továbbá biztosítja a.z E2A és/vagy az E2B és/vagy az Ε4 adenovírus régiók eredményül kapott géntermékeinek. és/vagy a Cre rekomblnáz expresszióját. Az összes korábban tárgyalt lehetőség vagy a technika állása szerint ismertnek feltételezhető lehetőség a szakember számára hozzáférhető ebben az összefüggésben. Az egyes génekre vonatkozóan az alábbi információkra, hivatkozunk.; Ε2Ά - M73260 Genbank azonos!tőszám; Kruiyer és mtsai.; Nucl. Acids Rés. 9 4439 (1981); Kruiyer ás mtsai.: Nucl. Acids Rés. IQ 4493 (1982). E2B - 14732 60 Genbank azonos!tószám.; Dekker és mtsai. : Gene 27 115 (1984); Shu és mtsai.; Virology 165 348 (1988) . E3 -·- M73620 Genbank azonosítószám; Cladaras és mtsai.: Virology 140 28 (1985). E4 - M73620 és D12587 Genbank azonosítőszámok; Vi.rtanén és mtsai.; J. Virol. 51 822 (1984); Dix és mtsai.; J. Gén. Virol. 73 2975 (1992). A leolvasási fázisok néhány esetben csak az Ad2 vonatkozásában ismertek és általánosságban hozzárendelhetők szekvencia összehasonlítások alapján, mint például az Ad5 esetében. Cre rekomblnáz - X83453 Genbank azonos!tószám; Sternberg és mtsai.; J. Mól. Siói. 187 137 (1986)]
Az adenovírus géntermékeket előnyösen mind egy adott adenovírus szerotipnsból állítottuk elő, közelebbről meghatározva az 5. típusú humán adenovírusból (Ad5) . Az aamíociták transzformálására alkalmazott E1A és ElB. gének eredetét képező adott adenovírus szerotípus a találmány megvalósítása szempontjából nem kritikus. A találmány megvalósítása során alkalmazható adenovírus szerotípusok a technika állása szerint ismertnek tételőzhetők fel és több mint 40 humán « **
Μ * Κ * * * *
X ? fifi 9 * * * « φ « ♦ * * *
Α« ♦ X» •szerotípust foglalnak magukba, mint például a következőket: Adl2 (A alnemzetségj; Adó és Ad 7 (δ alnemzetség); Ad2 és Ad5 (C alnemzetség) ; AdÖ (D alnemzetség); Ad4 {E ainemzetség); Ad4ú <F alnemzetség) (Wígand és mtsai.: .in: Adenovirus DNA, 408-441. old., szerk.: Doerfler, Martinas Mijhoff Publishing, Boston, (1986)]. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint eljárva a C ainemzafeségből származó adenovírus vektorokat állítunk elő amniocítákat
E1A és E1B génekkel transzformálva, amely gének egy ugyanazon alnemzetségbe tartozó adenovirnsból származnak. így például 2. vagy 5. szerotipusú adenovírus vektorokat, álli-
tu nk elő 2. vagy 5. szere típusból j származó EIA és E.1B gé~
ne kkel amniocítákat transzformálva. Adl2 alapú ad enovírus
ve ktorokat állíthatunk elő például az Adi2 E1A és E1B gé-
ne kkel amniocítákat transzformálva, és így tova bb. Nem-hu-
ma n adenovírus vektorok előállításához - beleér tve a szar-
vasmsrháböi, birkából, sertésekből és más emlősökből származó jól ismert adenovirnsokat - amnlocíta sejtvonalakat állítunk elő az adott faj amniocitáinak transzformálásával. Erre általában azért van szükség., mert az adenovirális funkciók rendszerint n« komplementéIhatok eredményesen a fajok közötti határvonalakon keresztül.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint eljárva olyan anniocítákat transzferáltunk az Adó E.1A és E1B génjeit expresszáló expressziós plazmáddal, amely amniocitákat prenatális diagnózis keretén belül diagnosztikai célokra nyertünk ki amnioeita folyadék biopszia útján és már nem kerültek felhasználásra diagnosztikai célokra. Ezt a ♦ * Χ·Χ· φ X φ φ Φ * * ♦ φ Φ φ * ♦ * * « φ * φ φ * ♦
ΦΦ φ Φφ ΦΧΧ ·*♦♦ konstrukciót úgy tervestük meg, hogy az E1A gén az egér foszfoglioerát kinéz pronóter szabályozása alatt volt és az EIB gén a természetes eredetű adenovirus E1S promoter szabályozása alatt volt. A természetes eredetű EIB splice ak™ ceptor helyet és az SIS poliadenílációs szekvenciát az SV40 vírus megfelelő szekvenciáival helyettesítettük. Néhány héttel a plazmid DNS-sel végzett transzfekció után nagyszámú sejtklónt tudtunk megfigyelni és ezeket izoláltuk, klónoztuk, mint halhatatlanná tett sejtvonalak hoztuk létre és analizáltuk. Az összes analizált sejtklón expresszálta az B1A és EIB fehérjéket. Egy El-deléciós, β-galt expreszszáló adenovirus vektorral végzett fertőzés és ezt követő festés segítségévei kimutattuk, hogy az összes ilyen sejt fertőzhető. El-deiéciós első generációs adenovirus vektorokkal végzett fertőzési kísérletekből kiderült, hogy a sejtvo.nal.ak képesek adenovirus vektorok termelésére. Ezekben a kísérletekben a sejtvonaiakat először egy β-galt expresszáló első generációs adenovirus vektorral fertőztük. 48-72 óra elteltével, amikor a sejtek citopátiás hatást mutattak (CPE), a sejteket begyűjtöttük és az adenovirus vektort a sejtekből felszabadítottuk a sejteket három alkalommal lefagyasztva és felengedve. A sejt .lizátum egy részét használtuk fel 293-sejte.k fertőzésére és a β-gal expreszsziőt hisztokémiai úton mutattuk ki körülbelül 24 órával a gén transzfer után. Lehetőség volt arra, hogy közvetlenül kiszámítsuk a β-gal pozitív sejtek számából a vektor .kitermelést az egyes sejtvonalakban történő termelés során. Ezen az úton nehézség nélkül és reprodukálható módon, állíthatók
ΦΦβ* «Φ
2.9 » Φ Φ * * ♦ *·» ΦΦΦ * * Φ Φ ♦ * » Φ* *Κ« *ΦΦΦ elő ajEsnio-cita sejtvonalak é-s- ezek nagyon jól alkalmazhatók gén transzfer vektorok termelésére. Az izolált sejtvonalak közül néhány lehetőséget nyújtott adenovírus vektorok termelésére legalább olyan jól vagy jobban, mint a 293 sejtek. Ahogyan ez várható volt, a sejtvonalak eltéréseket mutattak a rekombináns adenovírus vektor termelésében, (lásd a 4. ábrát).- As N52.S6 és E52.F4 sejtvonalak megkülönböztethetők voltak gyors növekedésük és as adenovírus vektorok különösen jő termelése alapján, amelyek előnyös tulajdonságok ezen. sejtvonalak, alkalmazása szempontjából gén. transzfer vektorok termelésére.
Az amnio-citák transzformálásában alkalmazott. El A- és ElB-expresszáló expressziós plazmidok megtervezése kizárja a replíkáció kompetens adenovírusok (RCA) létrejöttét egy adenovírus vektorral történő homológ rekombináció útján vagy egy adenovírus eredetű helper vírussal, mivel a DBS beépül a transzformált amníocirákba a 293 sejtekkel ellentétes módon. Ennek egy alternatívájaként az egyes El funkciók bevihetők a transzfektálandő sejtekbe különböző expressziós plazmidókon. Természetesen az is lehetséges például a 293 sejtvonal esetében - hogy végrehajtjuk az amniocíták transzformációját és- a gén transzfer vektorok termelése során létrehozott s.ar z sokat megvizsgáljuk az RCA tartalomra, például PCB-t vagy fertőzése® vizsgálati eljárást alkalmazva. Az RCA-t tartalmazó sarzsokat ezután ahol szükséges eldobhatjuk,
A találmány egy további aspektusa szerint igy a találmány tárgyát képezi továbbá egy permanens amníocita sejtvo*» **** ** « * * * * * * « * ♦·♦· *** ♦
X 3f * * * * *
X ♦ «* **** nal, amely előállítható a leírás szerinti módszer segítségével. A találmány egy specifikus megvalósítási módja szerint eljárva az NS2.E6 permanens amniocita sejtvonalafc alkalmazzuk, amelyet 1999. október 26-án helyeztek letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen SmbH-nál (DSMZ) a Budapesti Egyezménynek megfelelően; a letét a DSM ACC2416 katalógusszámot kapta.
A találmány egy további aspektusa szerint a találmány tárgyát amniociták alkalmazása képezi adenovlrus-transzformált permanens amniocita sejtvonalak előállításában. A leírás során az „adenovírus-transzformált kifejezés alatt egy vagy több transzformáló adenovlrus génnel végzett transz .formációt értünk. A leírás során a ,, transzformáció kifejezés alatt egy növekedési kontroll alatt lévő eukarióta sejt átalakítását értjük olyan úgynevezett permanens sejtvonallá, amely korlátozások nélkül növekedni képes. A 'találíaány egy további aspektusa szerint a találmány tárgyát képezi az E1A és SIS régiók adenovlrus eredetű géntermekeinek alkalmazása permanens amniocita sejtvonalak előállításában..
A találmány tárgyát képezi továbbá permanens amniocita sejtvona.1 alkalmazása gén. transzfer vektorok előállításában. A leírás szerint a „gén transzfer vektorok kifejezés •alatt általánosságban értjük mindazokat a vektorokat, amelyekkel egy vagy több terápiás gént vihetünk át vagy juttathatunk be a kívánt target sejtekbe és ~ közelebbről meghatározva - olyan Vírus vektorokat értünk, amelyek ezzel a tulajdonsággal rendelkeznek. Továbbá a permanens amniocita «(««φ *♦ ***♦ ♦ * φ Λ, 9 * Φ ® ♦
X Φ ** ♦*♦ sejtvonalak alkalmazhatók adenovírus mutánsok előállítására. A leírás során az „adenovírus mutáns kifejezés alatt olyan adenovitusokat értünk, amelyek legalább egy mutációval rendelkeznek a.z EIA és/vagy E1B génekben. A. találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint eljárva azonban olyan adenovírus mutánsokat alkalmazunk, amelyek - ellentétben az adenovírus gén transzfer vektorokkal - nem tartalmaznak semmiféle terápiás gént. Ezekre egy tipikus például szolgálhatnak olyan adenovírus mutánsok, amelyekben az E1B SS kDa fehérje nem kerül expresszióra, mint például a dl.1520 adenovírus mutáns {Barker és mtsai.: Virology 156 107 (1987)}. Az olyan, adenovirus mutánsok, amelyekben az E1B 55 kDa fehérje nem kerül expresszlóra nagy jelentőséggel bírnak as onkózísok terápiájában, mert a vírus mutáns kizárólag tumorsajtekben replíkálódik és nem replíkálődík, vagy elhanyagolható mértékben replíkálódik primer normál sejtekben [Bisohoff és mtsai.: Science 274 373 (1996); Kirn és mtsai.: Natúré Med. 4 1341 {1998)j.
A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint eljárva permanens amniocita sejtvonaiat alkalmasunk adenovírus vektorok, AAV-vek tor σ-k (adeno-asssoeiált vírus), retrovírus vektorok, lentivírus vektorok, kiméra adenovírus-AAV vektorok, kiméra adenovírus-retrovírus vektorok és/vagy kiírére adenovlrus-lentlvírus vektorok előállítására. A permanens amniocita sejtvonalak, alkalmazhatók továbbá herpesz vektorok előállítására is.
Az. AAV vektorok normál esetben csak az AAV ITR régióit tartalmazzák és néhány szomszédos, a kódolásban részt nem >4« X »4
444 4 *44* *♦ * - w · * 4 4 4 * *
4 4 4 *'** *
4 * 4 4 * * AX 4 «4 »«M 4 4 44 vevő AAV szekvenciát. Ezek idegen DNS-t felvételi kapacitása körülbelül 4,5 kb. Ahogyan ezt fentebb leírtuk, különböző rendszerek léteznek a rekombináns AAV vektorok előállítására. Az összes ilyen rendszerben közös, hogy a rekombináns vektor rep.liká-ci óhoz, expresszióhoz és pakoláshoz szükséges komponensek rendelkezésre állnak. Specifikusan ezek expressziós kazettákat tartalmaznak, amelyek kódolják az AAV rep ás cap fehérjéket és az adenovírus eredetű helper funkciókat. Az AAV termeléshez szükséges adenovírus eredetű helper funkciók az SlA, EIB, Ez, .E.4 és VA gének. Az EIA és EIB funkciókat az EIA- és ElB-expresszáló amniocita sejtvonalak, biztosítják és ezért alkalmazhatók AAV vektorok •előállítására. Az E2, E4 és VA funkciókat adenovírussai történő együttes fertőzéssel biztosíthatjuk vagy E2~, E4és VA-expresszáló plazmídokkal végzett együttes transzfekeié útján biztosíthatjuk., illetve adenovírus./AAV vagy herpesz szimplex vírus/AAV hibrid vektorok alkalmazásával biztosíthatjuk [Samulskí és 'latsai.., lásd fentebb; Allén és mtsai,, lásd fentebb; Tamayose és mtsaí., lásd fentebb; Flotté és mtsaí., lásd fentebb; Conway és mtsai., lásd fentebb; Chiorlni és mtsai., lásd fentebb; Ferrari és mtsai., lásd fentebb; Salvettí és mtsai., lásd fentebb; Xiao és mtsaí., lásd fentebb; Grimm és mtsai., lásd fentebb; Zhang é s mi. s a i., 1 á s d f ént ebfa ] .
Retrovírus vektorok, azaz retrovírusokből származó vektorok hasonlóképpen nagy jelentőséggel bírnak mint transzfekciős hordozok a gén terápiás eljárások keretén beiül, mint például a központi idegrendszer gén terápiájában [Suhr «ΦΧ* «:♦<* ** .·*♦ φ * « * * * * « XX *ΧΧ *
Α « X X * * * χ# χ *« ΧΧΧ βΦΧΦ hatók a és mtsai.: Arch. Neurol. 56 2S7 (1999)3. Retrovírus vektorok eiőállíthatők stabil vektor-termelő sejtvonalakban vagy tranziens transzfekció segítségével. A retrovírus. vektorok előállításában alkalmazott egyes komponensek normál, esetben egy vagy több olyan plazmidot foglalnak magukba, amelyek a struktúrfehérjéket és a replikáció-s valamint az integrációs fehérjéket expresszálják és hasonlóképpen olyan plazmidot is tartalmaznak, amely a vektort önmagát tartalmazza. (Miller : In: Retrovíruses, szerk.: Coffin, Hughes és Varmus, 437-473. oldalak, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1997)3 ♦ Amennyiben ezeket a plazmidokat alkalmazzuk - amelyek replikációs origót tartalmaznak, mint például az SV40 replikációs origót - az amniocita sejtvonalakat úgy módosítjuk, hogy a plazmid repiíkácíöját elősegítő fehérjéket stabil módon e-xpresszáiják. így például azon plazmldok esetében, amelyek tartalmazzák az SV40 replikációs origót egy olyan amnío-cita sejt vonalat alkalmazunk, .amely expresszál ja az SV-4Ö T-antígénjét.
A lentivírus vektorok olyan vektorok, amelyek lentivírusokból származnak (Naldini és mtsai.: Science 272 263 (1996); Dűli és mtsai.: J, Virol. 72 8463 (1993)3. A lentivírus eredetű vektorok előállíthatók stabil vektor-termelő sejtvonalakban vagy tranziens transzfekció útján.
A leírás során a „kiméra vektorok' kifejezés alatt olyan vektorokat értünk, amelyek két vagy több különböző vírus vektorból származó nukleinsav fúziójának a termékei. A leírás szerint permanens a-mniocita sejtvonalak alkalmazkiméra vektorok előállítására.
Ebben a rendszerben
Α * φ Λ Φ ♦
«. * *« <»* «
Κ- > Φ Φ * Φ Φ «φ > ♦·*: ♦** **»* például egy adenovírus vektor, előnyösen egy nagy kapacitású adenovírus vektor tartalmazza azt a DNS fragmenst, amely hordozza a szekvencia információt egy integrálódó vírusról, amely például származhat retrovírusból vagy AAV-ből. Egy targe-t sejt transzkripciója után a terápiás gént hordozó integráló vírus felszabadul az adenovirális háttérből (mint például egy retrovirális inszerció esetében, amely fertőző .re-tro-virális részecskéket termel, amelyek a szomszédos sejteket transzdukálják és stabilan beépülnek a DNS-be). Az elmúlt időkben leírásra kerültek 293-sej tekben termelt kiméra vektorok, mint például kiméra adenovírus-retrovírus vektorok [Peng és mtsai.: Natúré Biotech.. 15 366 (1997}] és kiméra adenovírus-AAV vektorok [Recohia és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sc.i. USA 96 2615 (1999)1 , Előnyősén El A- és
ElB-expresszáló amniocita sejtvonaiakban végezzük a termeltetést, mert - a 293-sej.tekke.l ellentétben - replikációkompetens vektorok nem hozhatok létre homológ rekombináció útján.
Adenovírus vektorok ·-- azaz az vektorok - nagy jelentőséggel rend* transzfekciős hordozok a gén terápi lúl. Az adenovírus vektorok lé adenovírus vektorok, .második genes rek, nagy DNS-kapacitással rendel) és/vagy delécios adenovírus vektorok, amely* nens amniocita sejtvonal segítségével állítunk elő.
enovirusokb ól származó
eznek, külc ünö-sen, mint
módszerek keretén foe-
tnek első generáciős
:íős adeno v írus vekto-
;ő adenovírus vektorok
. amelyeket egy perma-
* Φ Φ φ ♦ « *, „ * * ♦ Φ X
ΦΦ * * φ « χ ** φφ* azokat (a) Első generációs: adenovírus vektorok, előállítása:
Az első generációs adenovirus vektorokra általánosságban jellemző az El A és E1B gének deléciója. Egyes első generációs adenovirus vektorokban az E1A és EI.B gének eleiédója mellett az E3 régió deléció ja is megtörtént. Az £3 funkciók nélkülözhetők az adenovirus vektorok sejttenyészetben történő előállításához.
Első generációs adenovirus vektorok előállíthatok E1Aés ElB-expresszáló amniocita sejtvonalakban. Ennek megvalósításához az. E3.A- és ElB-expresszáió sejteket előnyösen sejtenként 3-5 fertőző egységgel (3-5 Mól) fertőzzük. Körülbelül 36-72 óra elteltével a sejtek citopátiás hatást mutatnak. A sejteket standard protokollok alkalmazásával gyűjtjük be. A begyűjtött sejtekből adenovirus vektorokat tisztíthatunk CsCl sűrűség gradiens centrifugálás segítségével vagy kromatográfiás módszerek útján.
(bj Második generációs adenovirus vektorok előállítása:
A második generációs adenovirus vektorokra általánosságban jellemző az E1A és E1.B gének deléció ja.. Egyes második generációs adenovirus vektorokban az E3 régió deléciója is megtörtént. Az EiA és E1B gének deléciója mellett a második generációs adenovirus vektorokra jellemző legalább egy további létfontosságú adenovirus gén inaktívációja és előnyösen deléciója is, mint például egy E2A gén, egy E2B gén és/vagy egy E4 gén deléciója vagy például az E2. funkciók deléciója az E4 funkciók deléciójavai kombinációban.
A második generációs adenovirus vektorok előállításához funkciókat, amelyeket a amelyeket vektor önmaga nem expresszál az ínakti vációnak. és/vagy delécíónak köszönhetően az. amníocíta sejtvonal útján keli biztosítani. Erre a célra azon amníocíta sejtvonalak esetében, amelyek stabil módon expresszálják az E1A és E1B géneket, lehetőség van stabil módosításra olyan expressziós kazetták transzfekciója segítségével., amelyek egy vagy több adenovírus .funkciót kódoló génfcermékeket expresszálnak. így például, egy olyan második generációs adenovírus vektor előállítására, amelyben az E1A és Ε1Β gének delécióján tűi egy E2A, £28 és/vagy £4 gén deléoiöja. is megtörtént, a megfelelő gént vagy géneket transzfekció segítségével juttatjuk be egy szelekciós markerrel együtt az £IA~ és ElB-expresszálő· amniocifca sejtvonalba. Azok a sejtklónok, amelyek az EiA és £18 funkciók expresszálása mellett egyúttal E2A, E2B és/vagy £4 funkciókat is expre-sszálnak, felhasználhatók tehát az adott második generációs vektor termelésére. Az E2 és/vagy E4 gének rendszerint egy heterológ promóter transzkripciós kontrollja alatt vannak, amely lehet konstitutív módon aktív vagy szabályozható.
{c} Nagy DNS kapacitással rendelkező adenovírus vektorok előállítása;
A nagy DNS kapacitással rendelkező adenovírus vektorokra jellemző, hogy a vírus eredetű kódoló szekvenciák legtöbbjét vagy az Összest kivágták. Ezek a vektorok előnyösen csupán a vírus eredetű 1TR szekvenciákat és a vírus eredetű pakoló szignált tartalmazzák. Az adeno-vírus funkciókat egy helper vírus biztosítja trans-ban. Különböző rendszereket Írtak már le nagy DNS kapacitással rendelkező adenovírus »9 9 99 9 9«9 vektorok előállítására. Az összes napjainkig- leírt és helper vírust felhasználó rendszer esetében közös, hogy a helper vírus megfelel egy replikáció deficiens, EXA és £18deléciós adeno-vír-usnak. A helper vírus tartalmazhat egy teljes pakoló szignált (Mitaní és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 3854 (1995); Fisher és mtsai.: ViroXogy 217 XI (1996); Kumar-Singh és Chamberlain: Hűm. Möl. Génét, 5 913 (1996)1 vagy egy mutálhatott pakoló szignált (Kochanek és mtsai .; Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93 5731 (1996)]. Ez utóbbi esetben a vektor előnyösen virális kapsz!dókba pakólód! k, mert a helper vírus egy legyengített pakoló szignált tartalmaz és ezért kevésbé hatékonyan pakoiődí'k.. Alternatív módon eljárva a helper vírus pakoló szignálját kivághatjuk a termelő sejtvonal fertőzése után rekombináz alkalmazásával [Parks és mtsai.) Proc, Natl, Acad. Sci. USA 93 13565 (1996); Hardy és mtsai.: J. Virol. 7_1 1842 (1997}}. így például a helper vírus pakoló szignálját közrefoghatjuk a FX-bakteriofág loxP felismerő szekvenciáival. A Pl bakteriofág Cre rekombínázának expressziója a helper vírus pakoló szignáljának a kivágását eredményezi. Azonban a pakoló szignál hiánya következtében nem történik meg a helper vírusok kapszidba történő pakolása.. A Pl-bakteriofág Cre rekombináz génjét transzfekció segítségévei juttatjuk be egy szelekciós markerrei együtt az- El A- é-s ElB-expresszáló amniocita sejtvonalba- Azok a sejt kiónok, amelyek az E1A é-s E1B funkciók expressziója mellett a Pl-bakteriofág Cre funkcióját is expresssáljak, ezután alkalmazhatók az adott, nagy DNS kapacitással rendelkező kívánt vektor előállításér e nde1ke ző kívén í * * 4. Φ ♦'*' **«·» ra.
id) „Deléciós adenovírus vektorok előállítása:
A „delécíós adenovírus vektorokat olyan első generációs vektorokként írtak le, amelyek a ál-bakteriofág loxP felismerő szekvenciáit tartalmazzák a vírus genomfean oly Módon elhelyezkedve, hogy a Cre-expresszáló 293-sejtek fertőzése során a vírus eredetű kódoló szekvenciák többsége, vagy az összes vírus eredetű kódoló szekvencia delécióra kerül a lox'P felismerő szekvenciák közötti rekombináció következtében, Ezen vektorok genom mérete körülbelül 9 kb. Az idegen DNS-t felvevő kapacitás ezért hasonlóképpen körülbelül 9 kb (Lieber és mtsai.: J. Víro-1. 70 8944 (1996}}, A delécíós adenovírus vektorok termeléséhez a Pl bakteriofág Cre rekombináz génjét transzfekció segítségével juttatjuk be egy szelekciós markerrei együtt az S1A- és ElB-expreszszáló amníocita sejtvonalba. Azok a sejt klőnok, amelyek az El A és E1B funkciók expresszálása mellett ugyanakkor expresszálják a Pl-feakteriofág Cre funkcióját ezután alkalmazhatók az adott tíeléeiős Ad vektor előállítására.
(e) Tropizmus-aódositott géntranszfer vektorok -előállítása :
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint eljárva a permanens aisn.íooíta sejtvonalat alkalmazzuk tropízmus-módosított -gén transz fér vektorok előállítására. Egy vírus és az ezen vírusból származó vírusvektor tropizausa határozza meg, hogy egy adott sejttípus sikeresen transzdukálható egy vektorral vagy sem. Egy -géntranszfer vektor felvétele a sejtbe az első lépés a sikeres géntranszferhez ebbe a sejtbe. így egy vírus vektor tropízmusa létfontosságú faktor a hatékony In vitro vagy in vivő géntranszferhez egy adott sejtbe vagy egy adott szövetbe. Egy vírus vektor felületének kölcsönhatása (a kapsziddal az adenovírus vagy AAV vektorok esetében, a vírus burokkal a retrovirus vagy lentivírus vektorok esetében) a target sejt sejtmembránjával szükséges a .felvételhez egy adott sejtbe. Bár a vírus vektor target sejtbe történő felvételének pontos mechanizmusa egyes esetekben változik a különböző vektorok között, az összes esetben a vírus vektor felületi struktúráinak kölcsönhatása {rendszerint fehérje ligandok) a target sejten található struktúrákkal (általában receptorok vagy adhéziós molekulák) lényeges szerepet játszik. Az adenovírus vektorok felvétele például receptor-közvetített endocitózis útján jön létre. Ez magába foglalja az adenovírus kapsziö részeinek kötődését sejtes receptorokhoz. Az A.d2 vagy Ad5 vírusokból származó adenovírus vektorok esetében - a jelen ismereteink szerint - rendszerint a szálas fehérjék, „knob dóménjének egy része kötődik a coxsackie adenovírus receptorhoz (CÁR) és a ponton bázis egy része kötődik az ανβ3 vagy ανβό integrinekhez. A „knob dómén kötődése a CÁR felületén - a jelen ismereteink szerint - szükséges a vektor a.dhéziójához a sejt. membránhoz a target sejt felületén, míg a pentán bázis kötődése az integrinekhez szükséges a vektor internálizácíójához a target sejtbe.
Amniocita sejtvonalak, alkalmazhatók tropízmus-módosított vektorok előállítására. Ez alkalmazható például az első és második generációs adenovírus vektorok termelésére, a ♦ * ** ► « φ *-Χ 8 * φ » * * X X ** ΦΦΦ ΦΦΦ* nagy DNS kapacitással rendelkező adenovirus vektorok előállítására, deléciós adenovirus vektorok, kiméra adenovirus vektorok, MV vektorok, retrovírus és/vagy lentivírus vektorok előállítására. Különböző stratégiákat alkalmazhatunk tropizmus-módosított vektorok előállítására amnioeita sejtvonalakban. Az adott tropizmus módosításban alkalmazott stratégia változhat a különböző vektorok esetében (mint például adenovirus vektor, AAV vektor, retrovírus vektor), A különböző stratégiákban közös az, hogy az adott vektor felületét {vírus fcapszid az adenovirus és AAV vektorok esetében, vírus burok a retrovírus és lentivírus vektorok esetében) megváltoztatjuk oly módon, hogy a vektor kötődése a target -sejthez megváltozik. Az adenovirus vektorok módosításaira a következő példákat mutatjuk be:
(a) Szálás fehérjék cseréje a különböző szerotípusok között: ennek eredményeképpen olyan adenovirus vektorok jönnek létre, amelyek kaps-zidja eltérő szerotípusba tartozó szálas fehérjét hordoz. Ezekre, például szolgálhat a 2. szerotípusból származó adenovirus vektorok természetes szálas fehérjéjének kicserélése a 17. szérótlpusbó-1 származó •szálas fehérjével (Zafoner és mtsai.: J. Virol. 73 8689 (1999)) vagy a 9. szérótapusból származó fehérjével (Roelvink és mtsai.: J. Virol. 70 7614 (1996)] . További például szolgálhat az S-. ssorotípusbói származó adenovirusvektorok természetes szálas fehérjéjének kicserélése a 7a. .szerotípusból származó szálas, fehérjével (Gall és mtsai.: J. Virol. 70 2116 (1996)) vagy a 3. szerotípusból származó fehérjével (Stevenson és mtsai.: J. Virol. 71 4782 (1997);
*<*Χ >· * * * * * * « * *«« ψ * * * * ** χ»ί»
Krasnykh és mtsai.: J. Vlrol - Q 6839 (1996); Dougias és mtsai.: Neuromuscul ·. Dísord, 7 284 (1997).
(b) A szálas fehérje eltávolítása: a szálas fehérje eltávolítható a genetikai manipuláció eszközeivel, úgy, hogy a vektor felvétele egyedül a penton bázis vagy a hexán fehérje kölcsönhatása htján történik [Falgout és mtsai.: J. Virol. 62 622 (1988); Legrand és mtsai.: -J. Virol. 73 907 (1999) 1 , (c) A szálas fehérje C-terminálisának módosítása egy peptíddel: erre például szolgálhat a C-terminális módosítása egy polilizin peptíddel {Yoshida és mtsai.: Hűm. Gene Ther. 9 2503 (1998); Wickham és mtsai.: Nat. Biotechnoi. 14 1570 (1996); Wickham és mtsai.: J. Virol. 71 8221 (1997)}, egy polihísztidin peptíddel [Douglas és mtsai.: Nat. Biotechnol. 17 470 (1999)] vagy egy gasztrínt felszabadító peptíddel [Michael és mtsai..: Gene Ther, 2 660 (1995)}.
Cd) A. szálas fehérje ,,'knofo doménje részeinek módosítása peptid beillesztésével: ezekre például szolgálhat egy
FLAG epi tóp beillesztése ( Krasnykh és mtsai.: J. Virol. 72
1844 (1998)) vagy egy RGB peptid beillesztése (Dmitriev és
mtsai . ; J. \ ötről. 72 9706 (1998); Kasono és mtsai.: Clin.
Cance r Rés. 5 2571 (1999)1
(e) A penton bázis módosítása: erre egy például szolgálhat egy B.GD részegység helyettesítése a penton bázison belül egy LDV részegységgel azzal a céllal, hogy a vektor ®4β1 inte-grinekhez történő kötődését közvetítsük (Wíckham és mtsai.: Gene Ther. 2 750 (1995)}.
♦ * ♦ φ ♦ φ** (f) A h.exon fehérje módosítása: erre egy példával szolgálhat a 3. típusú pol í ovi rusból származó epitóp beillesztése fCrompton és mtsai.; J. Gén. Virol, 75 133 (1994)1,
Egy alternatív stratégia - amely alkalmazható az amntocita seútvonalakban előállított vektorok tropizmusának megváltoztatására - olyan íigandok alkalmazásán alapul, amelyek közvetítik a vektor kötődését a sejtmembrán struktúrákhoz, mint például a sejt. receptorokhoz vagy adhéziós molekulákhoz, Ezek a Íigandok lehetnek peptidek, fehérjék vagy más antitestek, A Íigandok különböző módokon kapcsolódhatnak a vektorok felületéhez. A lígandoknak a vektorok felületéhez (az adenovirus vagy AAV vektorok esetében a kap sz.ídokhozj történő kötődését megvalósíthatjuk antitestek alkalmazásával vagy kémiai keresztkötéseket létrehozó reakció útján. Az antitestek alkalmazása esetén lehetőség van olyan antitestek felhasználására, amelyek specifitása a vektor kapszid ellen irányul (például a szálas fehérje ,/knofo'' doménje ellen) . Alternatív módon eljárva lehetőség van olyan antitestek alkalmazására, amelyek specifitása olyan epitóp ellen irányul, amelyet mint neoepitopot juttattunk be (mint például egy FLAG epitóp vagy egy myc epitóp) a vektor kapsz idjáb-a. Ezek példái a szakember számára jói ismertnek tekinthetők. A. bispecifikus antitestek alkalmazására például szolgálhatnak az alábbi publikációkbán leközölt módszerek: Wickham és mtsai.
virol. 70
Gene
6831 (1996) (anti-FÚAG/anti-a-integrin); Wickham és >t.sai.: Cancer Immunoi. Immunther. 45 149 (1997); Harari és mtsai,:
Ther. 6 801 (1999) (antí-FLAG/antí-E-select in) az * * * * * « * . * * X* «-^Μ β
\. * * * -χ $ φ ** * ♦* **♦ *♦♦♦
endothel1á115 se j tek transzdukciójára; Miller és r rtsaí.
Cancer Rés. 58 5738 (1.998); Blackwell és mtsai.: Arch
01ο1a ryngoi. Head Ne ck Surgery 125 ? 356 (1( 199) fant 1
Ad/anti-E-GFR) a tumor sejtek transzdufceiójára; Wickham és mtsai.: a. Virol. 71 766.3 (1997) {anti-FLAG/ant-i-CDD) a Tsejtek transzdukciőjára; Ti Ilmán és mtsai..: J. Immunoi.. 162 6378 (1999) (anfci-CD40/anti-Ad) a dendrites sejtek transzdukcíójára. Egy ligáidhoz kapcsolt vírus kapszíd determinánsra specifikus, egyetlen, .láncból álló antitestek alkalmazására például szolgálhatnak az alábbi publikációkban leközöltek: Watkíns és mtsai.: Gene Ther. 4 1004 (1997);
Goldman és mtsai.: Cancer Rés. 57 1447 (1997); Rancourt és mtsai.: Clin. Cancer Rés. 4 £455 (1998); Gu és mtsai.:
Cancer Rés. 59 2608 (1999); Rogers és mtsai.: Gene Ther. 4 (antí-Ad/FGF2) FGF2-xeceptort expres szá1ó transzdukálására; Douglas és mtsai.: Nat. 14 IS? 4 (1996); Douglas és mtsai.:
Neuromuscular Disord. 7 284 (1997) (anti-Ad/folát) azon tumo-rsejtek transzdukálására, amelyek express-zál ják a fölsav receptort a sejt felületén.
A géntranszfer vektorok esetében, amelyekben a természetes trop izmust megszüntettük és egy másik tr.opizmussal helyettesítettük - például egy ligandot beépítve az Ad5 szálas fehérjéjének ,,knob dóménjéfoe - szükségessé válhat egy permanens amnioclta sejtvonal módosítása egy receptor előnyösen stabil expresszi-ójával, amely receptor ezt az új ligandot felismerni képes [Douglas és- mtsai.: Nat. Siotechnol. I? 478 (1999)]. Hasonlóképpen a permanens
1387 (1997) tumorsejtek
Biotechnoi.
amníocita sejtvonal esetében lehetőség nyílik alkalmazására olyan géntranszfer vektorok előállítása során amelyekben egy vagy több struktúrfehérje termelése hibás. Ezt megvalósíthatjuk a géntranszfer vektor adott hibájának komplementé fásával a permanens amníocita sej tvonalban.. így például egy olyan adenovírus vektor, amely mutációt hordoz a szálas fehérjét kódoló génben előállítható egy olyan amníocita sejt vonalban, amely komplamentálja a hibát a .szálas fehérjében. Ez megvalósítható oly módon, hogy egy szálas fehérjét expresszáló kazettát juttatunk be az amníocita sejtvonalba és a szálas fehérje stabil vagy indukálható expresszióját hozzuk létre ebben az amníocita sejtvonalban (Von Seggem és mtsai.·: J- Gén. Virol. 79 1461 (1998)]. Az amníocita sejtvonalban expresszált szálas fehérje lehet egy természetes, módosítás nélküli szálas fehérje, vagy lehet egy megváltoztatott - például tropizmus-módosított. - szálas fehérje (Von Seggem és mtsai., lásd fentebb]. Az is elképzelhető, hogy a permanens amníocita sejtvonalban olyan adenovírus vektorokat állítunk elő, amelyek teljes egészük-
ben nélí külozik a szálas fehérj
Virol, 7 (3 907 ( 1999)· Von Segge
16Ό1 (19 99) ] .
Az E.1A- és EiS-expresszáló
nyösen a ilkaimaz) ka tök, mert ···· a
nem kerülhet sor replikáció kompetens vektorok létrejöttére homológ rekombináció útján. A találmány egy speciális megvalósítási módja szerint eljárva amníocita sejtvonalat alkalmazva géntranszfer vektorok előállítására ilyen sejtve*♦** ΦΦΧφ φ* * φ φ « φ * * ** * * χ
Φ Φ β Φ »
ΧΦ Φ φφ * φ n-alként a találmány szerinti sejtvonalat alkalmazzuk.
Terápiás gének;
A gének terméke, közelebbről meghatározva a terápiás gének terméke, amelyek kódolhatók és expresszálhatók a transzformált amniocíta sejtekben előállított vektorokkal, azaz egy permanens amniocita sejtvonalban, lehet például bármely izom fehérje, koagulációs faktor, membrán fehérje vagy sejtciklus fehérje. A transzformált amniocitákban termelt vektorok által expresszálható fehérjékre például szolgálhatnak a következők: dísztrofin (Hoffman és mtsai,: Cell 51 919 (1987)]; faktor Vili [Wion és mtsai.; Natúré 317 726 (1985)]; a cisztikus fibrózis transzmembráh szabályozó fehérjéje (CFTR) {. Andersen és mtsai..: Science 2_51 679 (1.991)]; ornítin transzkarbamí láz (OTC) (Murakami és mtsai.: J. Bioi. Chem. 2 63 1.8437 (1988)]; alfal-a.ntitr.ip~ szán [Fagerhol és mtsai., in: Ham, Génét. 11. kötet, 1. oldal, szerk.: Rarris, Plenum Press, New York, (1981)]. A fehérjéket kódoló gének ismertek és klónozhatók. genomi vagy cDNS klóntárakból. Az ilyen génekre például szolgálhatnak a következők: a dísztrofin gén [Lee és mtsai.: Natúré 349 334 (1991)]; a faktor Vili gén {Toole és mtsai.: Natúré 312 342 (1984)); a CFTR gén (Rommens és mtsai.: Science 245 1059 (1989); Riordan és mtsai.: Science 245 1066 (1989)]; az OTC gén [Horwich és mtsai.: Science 224 1066 (1984)]; valamint az alfal-antitripszin gén [Lemarchand és· mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 39 6482 (1992)}.
A transzformált amniocitákban termelhető vektorok áital expresszált további génekre például szolgálhatnak a követΦ*Φ* Φ«χ« φφ . . ΦΦΦχ φ « ♦ * φ Φ « φ > κ* χ*χ * * * * Φ
Φφ ΦΦφ Φφφφ ksző gének: a ρ53 gén az onkőzisok kezelésére (Wills és mtsai.: Hűm. Gene Ther. 5 1079 (1994); Clayman és mtsai.: Cancer Rés. 55 1 (1995)} ; az Rb gén vaszkuláris proliferáió rendellenességek kezelésére [Chang és mtsai..: Science 267 518 (1995)] vagy az I. típusú herpesz szimplex vírus (HSV) timidin kináz génje az onkőzisok kezelésére. A transzformált amniociiákban termelt vektorok által expresszált gén nem szükségszerűen kódol fehérjét. így például lehetőség van funkcionális RNS-ek expresszálására. Az ilyen RNS-ekre például szolgálhatnak az antiszensz RNS-ek (Magrath: Ann.
önco1. 5 (1. kiegészítő ke 67 (1994); ; Mílligán és
mtsai.; Ann. NY Acad. Sci. 7X6 22S (1994); Schreirer:
Pharma. Acta Helv. 63 145 ( 1994) ) valamint a katalitikus
RNS-ek (C ech: Biochem. S o c. Tran s. 21 229 (1 993}; Cech:
Gene I3 5 33 (1993); Löng és mtsai .: FASEB J. 7 ' 25 (1993);
Rosi és mtsa i.: Pharm. Therag 50 245 (199.1) } ,
A transzformált amni.oc.itákban termelt vektorok a terápiás gén mellett tartalmazhatnak bármely reporter gént annak érdekében, hogy jobban követni tudjuk a vektor expresz-
szíóját. A report er génekre példa
dalomban és maguk. ha foglalják pél
iFowler és mtsai .Proc. Natl.
(1977)} .
Azok a vektor •ok, amelyeket t:
termelni tudunk, t a r t a Ima zha tna.k
Az ilyen vektorokban előáliítha
;ügg az adott vektor felvevő kapacitásától és a gének méretétől .
xxjí φ>
* Φ φ* ΦΦ» ,w * Φ φ
S Φ «Φφ Φφφ φ
A. transzformált amniocitákban előállított vektorok terápiás génjeinek expresszíőját szabályozó promóterek kiválasztása nem. kritikus. Vírus eredetű vagy nem vírus eredetű promóterek ~ amelyek konstitutív, szövet specifikus vagy szabályozható aktivitást mutatnak - egyaránt alkalmazhatók egy fehérje vagy funkci-onáli-s RNS expresszíőjóra. Az SV40 vagy a citomegalovlrus- promoter lAnderss-on és mtsai.: J. Bioi. Chem. 264 8222 (1964)] alkalmazható például egy gén konstitutív -expressz lójára. Az izom krestin kínáz IMCK) promóter alkalmazása lehetővé teszi egy fehérje vagy egy funkcionális RNS szövet specifikus expressziőját vázizomban vagy a szívizomban. A génexpressziö kontrollálható kvantitatív vagy kvalitatív módon egy szabályozható rendszer segítségévei [Furth és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 9302 (1994}],
Lehetőség van arra, hogy genetikai elemeket illesszünk be azokba a vektorokba, amelyeket transz-formáit smnioeiiákban állítunk elő, amely genetikai elemek befolyásolják a vektor viselkedését a befogadó sejten belül. Az ilyen elemekre példaként szolgálhatnak azok az elemek, amelyek elősegítik a vektor DNS sejtmagba történő bejuttatását [Hodgson: Biote-chnology 13 222 {1395}
Az ily módon előállított vektorok alkalmazhatók in vitro vagy in vivő. Egy in vitro gén transzfer az élő szervezeten kívül jön .létre, például úgy, hogy a vektort tenyészetbe vont. .sejtekhez adjuk hozzá vagy p-rimar sejtekhez adjuk hozzá, amelyeket a szervezetből a gén transzfer céljaira -eltávolítottunk. Az in vívó gén transzfer esetében »' ♦ * » ♦''» » β .* ” *·♦ « ** * *» *·$# ***# a vektor részecskéket különböző módokon alkalmazhatjuk a transzdukálásra kerülő szövettől függő módon.. Erre például szolgálhatnak injekciók az artériás vagy a vénás érrendszerbe, közvetlen injekciók a megfelelő szövetbe {isint például máj, agy, izom}, becsepegtetés a megfelelő szervbe (például a tüdőbe vagy a gyomor- és bélrendszerbe) vagy közvetlen alkalmazás a. felületen (például a bőrön, vagy a hólyagban).
Az alább következő ábrák és példák nem korlátozó jelleggel a találmány részletes ismertetését és jobb megértését szolgálják.
Az 1. ábra a klónozások összefoglalást mutatja be.. Az 1A. ábra diagram formájában mutatja be a STK146 plazmid esetében a klónozás lépéseit. Az 18. ábra az 5. típusú adenovlrus genomjának a körülbelül 15% bal terminálisát mutatja. be, magába foglalva az E.1 RNS-eket, a kódoló régiókat, az E1A és E1B transzkripciók, kezdőpont ját és a splice donor valamint a splice akceptor helyeket és a poiiadenilácíős szekvenciákat., amelyek fontosak, a klónozás szempontjából. Fontos, hogy a splice donor hely az AdS 3511. bázíspárjánál megmaradt az STK146 plazmid klónozása során, de a splice akceptor helyet és a poliadenilációs szignált kicseréltük az SV40 megfelelő- funkcióira. Továbbá, az AdS EÍA promoterét a EGK. promóterrei helyettesítettük. így az STK146 tartalmazza az Adó szekvenciákat az 505-5322. bázispárok között és az ezen plazmiddal transzformált sejtvonaiafc nem tartalmaznak olyan Ad5 szekvenciákat, amelyek megtalálhatók az első és második generációs adenovlrus vektoφφ
Χ»Φ «φ • ♦ X φ Φ X * * * ** ΦΧ* φ
Φ * ♦ * φ ♦ >* «· «Φ ΦΦφ ♦ ♦*.» rokban vagy a loxB helper vírusokban.
A 2. ábra mutatja be az araníoeítákböl adenovirus El funkciókkal transzformált kapott, szigetkéket formáló sejteket (2A. és 2B. ábrák) és az egyetlen sejtből klónozott N52.S6 (DSM2 ACC2416; 2C. ábra) és H52.F4 (2D. ábra) sejtvonalakat. Ezzel együtt meg kell említenünk, hogy a sejt-vonalak és az egyetlen sejtből kapott kiónok morfológiailag különböznek az amniocitáktól abban, hogy ezek rendszerint kisebbek és nem mutatnak kontakt gátlást a növekedéssel szemben.
A 3. ábra mutatja be az STK146 integrációs állapotát nyolc különböző El-tra.nszformait amniocita sejtvonal esetében Southern-folott segítségévei.
A. 4. ábra mutatja be - táblázatban felsorolva - egy első generációs adenovirus vektor termelését különböző klónozott se jtvonalakban sejtenként mért bfu G,blue forming uníts, kék festődést mutató egységek) alapján és a megfelelő- sejtvonalak transzfekciós hatékonyságát a plakkok kialakulása alapj án.
Az 5. ábra mutatja be sz Ad5 E1A és az El8 fehérjék expressziéját tizenegy klónozott amniocita sejtvonal esetében (Western-blott).
A 6. ábra mutatja be a rekombináns adenovirus vektorok szintézisének idófűggését két klónozott sejtvonalban (NS2.E6 és N52.E4). A 6A. ábra mutatja be egy első generációs adenovirus vektor szintézisét és a 6B. ábra mutatja be egy nagy DNS kapacitással, rendelkező adenovirus vektor szintézisét.
2. példa
Klónozások
Az 1. ábrán mutatjuk be a klónozások összefoglalását.
(a) STE136 plazmid.:
Az STK135 plazmid az egér foszfoglicerát kinéz promotert tartalmazza (1. azonosítási szám szerinti szekvencia; Adra és mtsai.: Gene 53 65 (19-87) ) pBluascript KSH plazmidbán (Stratagene? és a következők szerint állítottuk elő:
3,5 pg PGK-hAAT plazmidot [Kay és mtsai.: Hep.ato-l.ogy 21 815 {1995;} emésztettünk KcoRV segítségével és méret szerint frakcionáltuk 1,5% agaróz gélben. A keresett, PGK promóter fragmenst tartalmazó 0,5 kb nagyságú sávot etidium bromidós festést követően, kivágtuk és a DNS-t elektro-elűcíóvai kinyertük. Ezzel egy időben a pBluescript KSH plazrnidot AcoRV és HibcII segítségével emésztettük és a szabad DNS végeket öefoszforíláltuk. Az ezt követő fenol/kicroform exfcra.kció és etanol p.recipitáció után ezen DNS fragmensek ekvimoláris mennyiségét iigáltuk és ultrakompetens XL-2 BIus baktériumba transzformáltuk (Stratagene). A plazmád kiónokat restrikciós emésztés- segítségével jellemeztük és az ete-dményül kapott plazmid az STK136 elnevezést kapta (£6 isolátum).
(b) STK137 plazmid:
Az STK137 plazmád tartalmazza az AdS teljes El expreszsziós- kazettáját beleértve az SVlO-ből származó 3' spliceés políadenilációs szignálokat és előállítása az alábbiak szerint történt:
«**« «:««» 4« 44*4 44 * ♦ < 4 » 4 4 * '* «* «*« Λ, * 4 * 4 * g g ·* '♦ ♦* *44 X»««
Az AdS szekvencia 505-841. bázispárok közötti szakaszának PCR amplifikációja (PCR-I; 2. azonosítási szá® szerinti szekvencia):
A pXCl piazmidbói (Mícrobix) 10 ng mennyiséget ampiifiké ltunk 400-400 ng 27759. oligonukleo-tíddal (3. azonosítási szám szerinti szekvencia) és 27634. olígonukleotiddal (4. azonosítási szám szerinti szekvencia); a reakcióélégy még a következőket tartalmazta: 0,2 mM dNTP és 1,25 egység Pfu polimeráz 10 mM KCi, 10 mM (NH«)2SO4., 20 mM Trisz/HCl
8,75) , 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100,
ben, a következő ke > rüImények szerint:
I 1 0 perc 94 cC -on
11 1 perc 94 °ü-cn
2 perc 50 wC~on
3 perc 72 “C-on
III 10 perc 72 °C~on
A II. lépést 15 ciklusban ismételtük meg, A DNS-t a QIAquick PCR tisztítási reagenskészlet (Qiagen) segítségével tisztítottuk meg a gyártó utasításait követve és etanol lal precipltáltuk.
A PCR fragmens klónozásához 2,5 pg pBluescript KSH plazmidot EcoRV segítségével emésztettünk és a szabad DNS végeket defoszforiIáitok, ekvimoláris mennyiségben ligáltuk a PCR fragmenssel és XL-2 Síue sejtekbe transzformáltuk. Az eredményül kapott plazmidra a továbbiakban mint #1 hivatkozunk.
Az AdS szekvencia 3328-3522. .bázispárok közötti szakaszának PCR amplifikációja (POR-II? 5» azonosítási az ám sze52
ΦΦΦΦ
φ.
» φ φφ φφ «φφφ * « * * φ φφ φφφ φ * * φ φ *« Φ«« Φ««φ r inti szekvencia):
A pXCl plazmidból (Mícrobix) 10 ng 'mennyiséget smplifikáltunk 400-400 ng 27635. oligonukleotiddsi (6, azonosítási szám szerinti szekvencia) és 27636. oligonukleotiddal (7. azonosítási szám szerinti, szekvencia) a fentebb leírt körülmények között. A. PCR után a DNS-t. fenol/kloroform segítségével extraháltuk, etanollal precípitáltuk, emésztettük KcoRI alkalmazásával, ismét extraháltak fenol/kloroform segítségévei, precípitáltuk és feloldottuk 30 μΐ TE pufferben.
Az SV'40~böi származó 3* splice és poliadenllációs szignál PCR ampái fikálasa a pG12-Basíc plazmid 1978-2749. bp szakasza segítségévei (PCB-III; 8. azonosítási szám szerinti szekvencia):
A pGL2~Basic plazmád 20 ng mennyiségét (Promegs, GenBank/EMBL .katalógusszám: X6-5323) amplifikáltuk· a következők jelenlétében; 800-800 ng 2.7 637, oligonukleotid (3, azonosítási szám szerinti szekvencia) és 27638. oiigonukleotid (lOn azonosítási szám szerinti szekvencia), 0,4 sói dNTP és 2,5 egység Pfu polímeráz, a fentebb leírt körülmények között. A PCR után a WS-t fenol/kloroform, segítségével extraháltuk, etanollal precipltáituk, EcoRI felhasználásával emésztettük, Ismételten fenol/kloroform, segítségével extraháltuk és etanollal precípitáltuk, majd 30 μΐ TE puffőrben feloldottuk. Ezt követően a PCR-Il és a PCR-IXl reakciókból 10-10 μ! BNS-t Iígáltunk 50 μΐ térfogatban, fenol/ kloroform segítségével extraháltuk, etanollal precipítáltuk és Bambi hozzáadásával emésztettük 100 pl térfogat93 ♦ ♦♦ ♦♦φ φ bán. Egy újabb fenő 1./kloroform extrakció és etanolos predpifcáciö után a DNS-t ekvimolárís mennyiségű pBluescript KSIX DNS-sei ligálfcuk, amelyet ezt megelőzően 5'amHX alkalmazásával emésztettünk és defoszforiláltuk. Az így kapott plazmidra a továbbiakban a #29 jelzéssel hivatkozunk. További klónozáshoz a #2.9 plazmid DNS-bői 3,5 pg mennyiséget emésztettünk SacII. és jSgl.Il segítségével, defoszforiláltuk, fenol/kloroform alkalmazásával extraháltul: és etanolban precipitáltuk. Ezzel egyidoben a pXCl plazmádból 3,5 pg mennyiséget emésztettünk DglII és SacII alkalmazásával és a 2,9 bp nagyságú fragmenst elektroforézissel frakcíonáltuk majd. elektro-elúcióval kinyertük. A két DNS ekvimolárís mennyiségét ligái tűk és· XL~2 Biu sejtekbe transzformáltuk. Az így kapott plazmidra a továbbiakban a #5 jelöléssel hivatkozunk. Az 3TK.137 végső klónozására a #1 plazmidot BíncI és BspEl alkalmazásával emésztettük és elektroforézissel frakcíonáltuk, majd egy körülbelül 350 bp nagyságú fragmenst nyertünk ki elektro-elúcióval. Vektor DNS-ként a #5 plazmidot emésztettük Kspl Cizcszkizomér a Sacl.1 enzimmel) segítségével, a végeket T4 polimeráz segítségévei feltölt-öttük, majd fenol/klororóna extrakciót és etanolos precipítáoiőt végeztünk. A DNS-t ezt kővetően SspEI segítségévei emésztettük, a végeket defoszforiIáitűk, majd ismételten fenol/kloroform extrakciót és etanolos precipitációt hajtottunk végre. A két DNS-t ligáitűk és XL-2 Blue sejtekbe transzformáltuk. Az igy kapott plazmid az STK1.37 elnevezést kapta (#34 izolátum.) .
(c) STK146 plazmid. (18, azonosítási szám szerinti szekvencia) ;
Az STK146 plazmid tartalmazza a egér PGK promótert, az Ad5 teljes El régióját (505-3522, bázispárok) és az SV40 3' splíce és poiíadeniláclós szignálját.
A klónozáshoz 4 pg 5TK137 plazmidot emésztettünk EcóRV és BamHI segítségével és elektroforézissel frakcionáltuk majd a '3,7 kb nagyságú fragmenst elektro-elűcióval kinyertük. Kellette 3,3 pg STK1.36 plazmidot emésztettünk EcoRV és BamHI segítségévei, defoszforiláltűk, fenol/kloroform segítségével extraháltük és etanollal precipitáltük. A két plazmid ekvimoláris mennyiségét ligáltuk és XL-2 Hlue sejtekbe. transzformáltuk. Az így kapott plazmidot az STK13-9 jelöléssel .láttuk el. Az STK139 végső szekvencia analízise egy mutációt tárt fel a 2613. bázispárnál (a számozás ezzel kapcsolatosan az Ad5 DNS szekvenciára hivatkozik), amely mutáció egy tirozin-aszparagin aminosav cserét eredményezett (26X3 TAC -> GAC), Ezen okból a mutációt tartalmazó fragmenst az STK139 plazmádban helyettesítettük az BstEII (1915. bp) - Bgx.Il (3328. bp) fragmenssel a. pXCl plazmidbői. Ezt az STK.I39 BstS-íi és BglII emésztésével hajtottuk végre, majd defoszforiláituk, fenoi/kloroform alkalmazásával extraháltuk,· etanollal precipitáltük, eiektroforézis segítségével frakcionáltuk és az 5,8 kb nagyságé fragmenst elektro-elűcióval kinyertük. A pXCl plazmidot hasonlóképpen BstEII és Bgll.I alkalmazásával. emésztettük és elektroforézis segítségével frakcionáltuk, majd az 1,4 kh nagyságú fragmenst elektro-elűcióval izoláltuk. Ligáiás és transz9Χ 99 «χ *<· 99 *9 * ♦ * # X «
formáció után 4 plazmid kiónböi származó DNS-t sz-ekvenáltunk; ezek közül kettő tartalmazta a megfelelő szekvenciát a 2613. bázispárttá!. A 2. számú ízolátumot teljes egészében megszekvenáltuk és a továbbiakban erre mint STK146 hivatkozunk.
izoiátumot (d) As STK.146 szekvencia analízise: 500 ng STK146 #2 szekvencia prímerekből szekvenáltunk as
0-10 pmol jelenlétében standard rüimények között: primer
301--920.
1301-1320.
1701-1720.
2100-2119.
2500-2519.
2853-2872.
3249-3268..
szekvencia
11. azonosítási szám szerinti szekvencia
12. azonosítási szám szer int i s zekvéneia
13. azonosítási szám szerinti szekvencia
14. azonosítási szám szerinti szekvencia
15. azonosítási szám s zerinti s ze kvéne1a
IS. azonosítási szám szerinti szekvencia
17, a zcnos1tás i szám szerinti szekvencia alábbi köszönés ító
28231 Ad5 nt.
23232 AdS nt.
28233 Ad5 nt.
28234 Adő nt.
28235 AdS nt.
23236 Ad5 nt.
28237 AdS nt.
56' φφ Χ»*« φφ φχχ ΧΧΦΧ
Primer amníociták és sejtvonalak :ese
Az összes sejttenyésztési reagenst, táptalajt és szérumot a GIBCO Life Technologies cégtől szereztük be, A 293 sejtvonalat - amelyet egyes kísérletekben mint kontrollt alkalmaztunk - módosított Eagle-féle táptalajban tenyésztettük (MÉM) amely 10% totális borjú szérumot (FCS), ix penicillin/streptomicint UOOx, katalógusszám: .10378-016) tartalmazott, 37 °C-o.n, 95% relatív páratartalom mellett és 5% CC·;: jelenlétében., As új El-transzformált sejtvonalakat primer fötális sejtek alkalmazásával állítottuk elő, ahol a sejteket amniocentézis útján kapott amniotikus folyadékból nyertünk ki prenatális diagnózis során. .A biopszia után a sejtekkel rutin, módszerek alkalmazásával műanyag tenyésztő edényeket oltottunk he, és Ham-féle Flö táptalajban tenyésztettük (Ham-féle F10 tápanyag keverék L-glutaminnal, katalógusszám: 31.550-023} amely még a következőket tartalmazta: 10% FCS, 2% Ultroser® G, Ix antibiotikum/antimíkotikum oldat (lOQx, katalógusszám: 15254-012) f 2, 5 μσ/κ.1 Füngizione®- (amfotericin S, katalógusszám: 1529-0-018). A sejtek egy része letapadt a sejttenyésztő edény fenekére és pro'líferáit. Kromoszóma analízishez szükséges mennyiségű sejt állt rendelkezésre körülbelül 2 hét elteltével. A kariotípus megállapítása után a szám. szerint és struktúráit san normái kromoszómákkal rendelkező amniocita tenyészeteket. használtuk fel a sejtvonal előállításához. Három különböző forrásból származó sejteket - amelyeket amniocen.téz.is segítségével nyertünk ki ezt megelőzően 3, 6 vagy 7
XX57 ♦ φφ *** héttel - használtunk fal. különböző kísérletekben. Sz alkalmazott táptalaj Ham-féle FÍO táptalaj volt amely még a következőket tartalmazta: 10% FCS, 2% Ultroser® Cr, lx antibiotikum/antimikotikum oldat, 2,5 pg/xal Fungizione®. a tenyésztési körülmények a következők voltak: 37 *'C, 95% relatív páratartalom és 5% CO2.
A, transzfekció után hét nappal az amniocitákat tovább tenyésztettük Ham-féle FI δ táptalajban, amely még a következőket tartalmazta: 10% FCS, Ix penicillin/streptomicin. Az egyetlen sejtből származó kiónok előállítása után ezeket áj edényekbe vittük át és tovább tenyésztettük alfa-MSM táptalajban 10% FCS és Ix penicillin/s-treptomicín jelenlétében .
3, példa
Amhíociták transzfekciója és trans-z forrnációja
A transzfekcióhoz az amnioeitákkal sejttenyésztő petri csészéket oltottunk be (60 m átmérő, .22,1 cm2 felület) petri csészénként 2-5 x lü5 sejt sűrűséggel és a rákövetkező napon transzfektáltuk. A transzfekcióhoz 20 $ig STK146 plazmidot emésztettünk Seal enzimmel, fenol/kloroform eleggyel extraháltul?, etanollal precipitáltuk és 20 pl TE pufferben vettük fel, ami 0,5 pg/μΙ DNS koncentrációt eredményezett. A kezdeti kísérletekben az amniocitákat az eltávolításukat követően 3 vagy 7 héttel transz.fektáltuk egyenként 5 petri csészében az Effectene transzfekciős vegyszerkészlet alkalmazásával a gyártó utasításait követve az alábbiak szerint:
**** »'**·* φφφ* «χ * ♦ # « φ Φ „ * *- -».« ♦** Φ '♦ Φ * *- ♦ Φ Φ ** * Φ* *-Μ» **χχ pl Seal emésztett STK146 plazmidot kevertünk össze 146 pl EC pufferrel, 6 pl e-nhanszer hozzáadása után. az oldatot rövid ideig vortexeztük és szobahőmérsékleten inkubáltuk 5 percig. Ezt követően 25 pl Effectene-t adtunk hozzá. és 10 másodperc vortexezés után további 10 percig inkubáltuk. szobahőmérsékleten. Ez alatt a táptalajt óvatosan leszívtuk a sejtekről és 4 ml friss táptalajjal helyettesítettük (lásd fentebb a 2. példát). Miután az infcubálást befejeztük a transzfekciós keveréket 1 ml friss táptalajjal kevertük össze és óvatosan cseppenként adagoltuk a sejtekhez. A sejteket a fentebb leírtak szerint tovább tenyésztettük. Hét nappal a transzfekció után a sejteket az egyes petri csészékből egy nagyobb petri csészébe vittük át (150 mm átmérő, 147,8 cmz felület). Ennek végrehajtásához a táptalajt óvatosan leszívtuk és a sejteket PBS-sel mostuk, tripsz.inn.el leválasztottuk és egy új petri csészébe vittük át majd a 2. példában leírt módon tovább tenyésztettük, 1822 nappal a transzfekció után tisztán láthatóak voltak a klónozott sejtcsoportok és ezeket morfológiai alapon egyértelműen meg tudtuk különböztetni az amníocita sejtektől I2A. és 2B. ábrák). A fő része egy transzformálatlan amníocita tenyészetben nagyobb méretű sejtekből áll, amelyek a növekedésük során kontakt gátlást mutatnak. A transzformált egyetlen sejtből származó telepekben, sokkal kisebbek, sokkal gyorsabban növekednek és nem mutatnak kontakt gátlást a növekedésük során. Ezek sejt-csoportok formájában növekednek, amelyek egymással szorosan összekapcsolódó kisebb méretű sejtekből állnak, a fénymikroszkóp alatt egyértelműen **** «*φ* φφ φφφφ φφ * * φ » φ φ * * »♦ ♦** * * ·' * * X X « *·* ♦- φφ «φφ «φφφ láthatók és nehézség nélkül azonosíthatók.. Ezeket a sejtcsoportokat kiemeltük és egy új petri csészébe vittük át (60 n átmérő) amely a fentebb leirt táptalajt tartalmazta. További növesztés után a sejtvonalakat 147,8 cm2 sejtbenyésztő petri csészékbe vittük át és a 2. példa szerint tovább tenyésztettük. A 147,8 -cm2 méretű sejttenyésztő petrí csészékbe történő első transzfer után számoltuk a sejt passzálásokat. Kezdetben az eltávolítás után 3 és 7 héttel transzfektált sejtekből kapott körülbelül 40 sejtklónt tenyésztettük tovább. Ezt kővetően ~ azaz a meghosszabbított tenyésztés után - drasztikus változást tapasztaltunk a sejt klónok közül egyesek morfológiájában és ezek instabilitást mutattak a növekedési jellemzőikben. A további kísérleteket nyolc morfológiailag stabil, sejtvonal további tenyésztésére és analízisére korlátoztuk. Ezekre a következő jelölésekkel hivatkozunk: GS.A55 (az eltávolítás után 3 héttel transzfektéit amn-iocifcákhól állítottuk elő), GS.Nil, G3.N24, GS.N27, GS.N49, GS.N5.1, GS.H52 és GS.M53 (az eltávolítás után 7 héttel transzfektált amniocitákból állítottuk elő).
Az első passzálások során az összes sejtkiőn összevethető morfológiát mutatott, de ez megváltozott az ezt követő passzálások során. így például egyes sejtvonaiak megváltoztak és erősen kikerekedett formát vettek fel, és a további passzálások során már nem. tapadtak le. Más sejtkXónofc kiterjed vakuöiizáciőt mutattak, de ez láthatólag nem volt semmiféle hatással a növekedésükre. Az egyetlen sejtből kiinduló klónozás után az összes sejtvonal egyforma morfológiát mutatott és például az N52.EG és NS2.F4 sejtvonalak «ΧΦΦ
ΧΦΦ* Φ« ♦ ΦΦφφ * φ φ 9 X» ΦΦΦ Φ
Φ Φ « * φ Φ Φ
ΦΦ Φ φφ «χ* χφφφ epithéi megjelenést mutattak. Ezek összevethetők' voltak a 233 sejtekkel a növekedési sebességükben és a sejtkoncentrációban.
4. példa
A transzformáció hatékonyáéga
Annak érdekében, hogy pontosabban méghatárózzuk a transzformáció hatékonyságát az El funkciók alapján egyenként 2-5 χ 10“ sejtet tartalmazó hét. új petri csészét transz fektéi tünk. a 3. példában leírt, módon. A sejteket csak 24 órával a transzfakció után vittük át 147,8 cm3 méretű pe.tri csészékbe és Haxa-féle Elő táptalajban tenyésztettük tovább, amely még a következőket tartalmazta: 10% főtális borjú szérum, 2% Ultroserá G, Ix antibiotikum/an t írni kotr kum oldat, 2,5 gg/ml Eungízlone, 5 napon keresztül, majd további 25 napon keresztül Ham-féle táptalajban, amely még a következőket tartalmazta: 10% fötálís borjú szérum, 1.x penicillin/streptoiaicin oldat. Egy transzfektáiás nélküli sejteket tartalmazó petri csészét is tenyésztettünk azonos körülmények között kontroliként. Ezen idő alatt megszámoltuk az egyetlen transzformációs eseményből keletkezett morfológiailag egyértelműen megkülönböztethető- telepeket (lásd például a 2A., és 2B. ábrákat) . Egyetlen sejtből származó kiének találhatók az összes sejttenyésztéses petri csészében, a transzfektálás nélküli kontroll petri csésze kivételével. Általánosságban lemezenként 4 sejtklónt találtunk, amely 1 : 0,-5-1 x 10“ sejt transzformációs hatékonyságnak felel meg.
♦ V 0 « X » ψ ♦ * *♦ ♦ »* » * y * χ ♦ * * ♦ ♦ « tv ««« *»«:«.
5. ρ&ΐ da
Egyetlen sejtes klónozás
Ahogyan ezt már említettük, egyes sejtvonalak eltérő morfológiai jellemzőket mutattak, ezért fel. egészen tízig terjedő s2ámá egyetlen sejtből származó sejtvonalat állítottunk fel mindegyik sejtvonalból. Az egyes sej tvonalak passz-álása ezekben az esetekben eltérő volt: GS.A55; P17, GS.N21:. P24, GS.N24: P2G, GS.N27: Pl.9, GS.N49: B21, GS..NS1: P39, GS.NS2; P2.2, GS.N53: P20. Erre a célra a sejteket a sejttenyésztő petri csészékről leválasztottuk, és 5 x lő'·' sejt/ml koncentráció mellett 1:1000, 1:50.000 és 1:500.000 arányban hígítottuk táptalajban, Az összes hígításból 100100 μΐ. sejtet oltottunk 96-lyukas .lemezekre és azokat a sejtklónokat, amelyek egyértelműen egyetlen sejtből származtak, tovább tenyésztettük. A 2G. ábra mutatja be a GS.NS2.ES sejtvonalat (DSM2 azonosító) és a 2D. ábra mutatja be a GS.N52.F4 sejtvonalat; .mindkét sejtklön a GS.N52 eredeti, sejt vonalból származik.
6. példa
Az El sejtvonaiak je 1 lemzése.
(a) Southern-blott analízisek:
Southern-blott analíziseket végeztünk annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az El régió integrációs állapotát a sejtvonalakban. Ennek megvalósításához genomi DNS-t izoláltunk mind a nyolc El amniocita k.Iónból (lásd az 5. példát) és mindegyikből 5 μρ mennyiséget emésztettünk EcoRV enzimmel, eiektroforézissel frakcionáituk és nylon membránra átvittük. Az EcoRV egyszer hasit as El expressziós kazettaφφ φφ **** Φφφφ φφ Φ·φφ * * * Φ Φ * Φ ♦ * XX ΧΦφ φ * * * X ·*φ φφφ Φφφ« bán. A radioaktív módon jelölt STK146 DNS-sel végzett hibridizáció megerősítette az STK146 1-2 kópiájának beépülését az összes kiónba. A 3. ábra mutatja be a.s integrációs mintázatot az El sejtfclónokban. Többnyire két nagy molekulatömegű sáv látható az összes klón esetében, ami egyetlen kópia integrálódását jelzi. A GS.N24 és GS.N52 sejtkiönok mindegyike egy további sávot mutatott, viszonylag nagy intenzitás mellett, ami az STK146 tandem kópiáinak az integrálódását jelezheti. Egyetlen sejtkiőn esetében sem találtunk olyan sávot, amely kisebb lett volna, mint a Seal és .EcoRV emésztett STK146, amely arra utal, hogy az összes beépülő rész teljes mértékben jelen volt és nem: történt delécíö, (hí Rekombináns adenovlrusok előállítása:
Az egyetlen sejt klónozás után a sejtkiónokat megvizsgáltuk rekombináns adenovírus termelő képességükre. Ennek megvalósítására egyrészről mindegyik sejtvcnaiból 3-5 egyetlen sejt kiónt fertőztünk körülbelül 70%· mértékben összeérő 24-lyukas lemezekben körülbelül 5 Möl („muitiplíeity of infection, a fertőzés többszörözése) Adpgal (rekombináns első generációs adenovirus vektor) hozzáadásával . 48 órával a fertőzés után a sejteket három ciklusban végzett lefagyasztással és felengedéssel iízáltnk, és a termelt Adpgal mennyiségét analizáltuk 293 sejteket fertőzve és ezt követően a sejteket megfestve [MacGregor és mtsai., In: Gene Transfer and Expression Protocols, szerk.: Murray, 7. kötet, 217-2.3S. oidalak, Humana, Ciífton, NJ, (1991)1 a β-galaktozidáz termelést kimutatva (4. ábra). Ez
ΦΦ»* Αφφφ ΦΦ
ΦΦΦ X » φ ♦ Φ X φφ »*φ φ φ φ * χ φφ φφφ φφφ» a módszer csak egy közelítő rekombináns adenovirus termelést tesz lehetővé, mert a sejtek száma és ezért tehát az alkalmazott virusmennyiség különbözhet a különböző sejt kiónokban a méretűk és a növekedési sebességük miatt. Azokat a sejt kiónokat, amelyek a legnagyobb kitermelést mutatták ebben az első vizsgálatban, agy további kísérletben pontosabban analizáltuk. Ennek megvalósítására körülbelül 3 χ XO7 sejtet oltottunk 3 petri csészére {100 .mm átmérő, 60 erő felület). A sejteket a rákövetkező napon megszámoltuk és pontosan 5 Möl Adpgal menny is éggel fertőztük a. talált· sejtek .száma alapján. 48 órával a fertőzés után a sejteket begyűjtöttük és a sejteket három ciklusban végzett lefagyasztással és felengedéssel· lisáltuk, majd a termelt Adpgal mennyiségét analizáltuk 293 sejteket fertőzve és ezt követően a sejteket megfestve. Az eredményt a 4. ábrán mutatjuk be.
(c) Transzfekciós hatékonyság:
Egyes klónozott sejtvonalakat megvizsgáltunk plakk kialakulásra. Ennek megvalósításra körülbelül 70% mértékben összeérő sejttenyésztő petri csészéket (60 ram átmérő: transzé©kiáltunk 2 pg G8 66 fertőző plazmiddal a kalciumfószfátos módszer szerint. A GS66 plazmid tartalmazza a teljes adenovirus genomot egy delécióval az El régióban a
440.. nukieotidtői a 3523. nukleotidig terjedő tartományban. Ebben a plazmidhan az adenovirus terminális ismétlődő szekvenciákat (XTR-ek) Swal restrikciós hasitóhelyek határolják, így tehát fertőző vírus és plakkok állíthatók elő az Swal-emésztett plazmid transzfekciója után. Körülbelül 24 *Φβ * *ΧΦΦ φ« «, * * φ φ *' φ φ * * φφ φφ* «.
> Φ φ -X- φ Α φ
Φ* * *Φ *Χφ «φφφ órával a transzfekció után a sejteket körülbelül 10 ml MÉM táptalajjal fedtük le, amely még a következőket tartalmazta: 1% agaróz, 0,5x penicíllin/streptomicin, 0,05¾ élesztő kivonat. A plakkok 37 °C~on, 95% relatív páratartalom, 5% CCS atmoszférában történő körülbelül egy hetes Inkubáció után váltak láthatóvá. A. 4. ábrán tüntetjük, fel a megszámolt plakkok számét, amelyek átlagát vettük két független transz -fékeidből mindegyik esetben.
(d> Az AdS E1A és E1B funkcióinak expressziója;
Az AdS-ElA és az E1B 21 kDa fehérjék expresssióját a klónozott sejtvonalakban Nestern-blott analízissel mutattuk ki monoklonális antitesteket alkalmazva.
A. sejteket óvatosan leválasztottuk se j t tenyész tő petri csészéről (átmérő 10 cm) PBS/1 mM EDTA oldatban, ülepítettük és ISO μΐ 50 mM Trisz/BCl. pufferben (pB 8) vettük fel, amely még a kővetkezőket tartalmazta: 140 mM NaCI, 0,5% MP4G, 4 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,5 mM PMSF, 5% glicerin. A sejteket további Dounce homogenizálás segítségévei lizáltuk és lecentrifugáltuk (13.000 ford/perc, 10 percig) majd a felülűszó fehérje koncentrációját fehérje .meghatározó vegyszerkészlet (BIOEAD, mikróméretű vizsgálati eljárás) segítségével meghatároztuk. 10 pg fehérjét f.rakcionáltunk 12% S'DS-poliakrilamid gélen, nitrocellulóz membránra átvittük (Byfoond ECL, Amersham Pharmacia Biotech) és anti-ÉlA vagy ant.i-.ElB 21 kDa antitesttel inkubáltuk (Calhíochem, 1:300 hígítás). A következő napon a biottot mostuk és egy második egér elleni antitesttel (EiA) vagy patkány elleni antitesttel (E1B) hibridizáltuk, amelyhez, torma peroxidást kapcsol65 **«« »*«« Φφ »Φχ» Φ« * Φ χ Φ » φ φ * «- φφ Χ»Φ φ » * * « ♦ Φ # «* * φφ '♦*'« «*'«« tünk. A torma peroxidás reakciót az 1 és 2 enhansser oldatok (ECL, Amersham Pharmacia Biote-ch) egyenlő térfogatával inkubálva indítottuk meg és a fotokémiai reakciót - amely •ezekből létrejött - rövid ideig tartó, röntgen filmre történő exponálás segítségével tettük láthatóvá. Az .5. ábra mutatja be a Western-folott analízis eredményeit.
(e'í Nagy DNS kapacitással rendelkező adenovirus vektorok és rekombináns első generációs adenovirus vektorok s zíntézis ének időgörbéje.
Két klónozott sejtvonal - N52.E6 és H52.E4 - mutatta a legmagasabb kitermelést a rekombináns első generációs adenovirus vektorokkal a fentebb leírt kísérletek során. Az időfüggésről fontos többet tudnunk az adenovirus vektorok optimális termelése érdekében, különösen akkor, ha ezeket a sejteket szuszpenziós tenyészetekhez adaptáljuk és a fertőzés sikere nem követhető citopátiás hatás alapján. Ehhez az analízishez számos pefcri csészét (6 cm átmérő) - amelyek mindegyike 3 χ 10Λ sejtet tartalmazott - fertőztünk meg 5 HÓI AdPgal mennyiséggel és a fertőzés után a jelzett időpontokban begyűjtöttük. A rekombináns adenovirus kitermelését ismét 293 sejtek fertőzésével határoztuk meg, a fertőzött sejteket festve és a kék sejteket megszámolva (6A. ábra) .
A jövőben szándékaink szerint az új sej útvonalakat nagy DNS kapacitással rendelkező adenovirus vektorok előállítására ís fel kívánjuk használni (lásd fentebb). Ezeknek az adenovirus vektoroknak az előállítása olyan helper vírusokat igényel, amelyek biztosítják az eltávolított funkciókat * * « ♦ Λ ft «r * « *««* * * * · * < » '* *» * ** *$* és fehérjéket egy lítíkus fertőzési ciklushoz trans-ban. Ezeknek a helper vírusoknak a pakoló szignálját loxP felismerő szekvenciák és Cre rekombináz segítségével távolítjuk el, amelyeket a sejtvonal expresszéi a fertőzés hatására. Ezért tehát szándékaink szerint a jövőben folytatott kísérletekben az. új El-transzformált sejtvonalakat egy Creexpresszáló plazmiddal fogjuk transzfektálni és a rekombinázt stabil módon expresszáljuk.
Előzetes kísérletekben megvizsgáltuk, hogy az új El amniociták szintén képesek-e nagy DNS kapacitással rendelkező adenovlrus vektorokat termelni és vajon a termelés kinetikája és a termelt vektorok mennyisége megfelei-e a jelenleg rendelkezésre álló Cre-expre.sszáló 293 sejtekkel elért eredményeknek. Ennek megvalósítására számos petrí csészét - amelyek mindegyike 3 x lö6 sejtet tartalmazott az N52.E6 és az NS2.F4 sejtvonalakból - fertőztünk meg 5 MOI loxP helper vírus mennyiséggel és 10 KOI AdGS46 (β-galt expresszáló· adenovlrus vektor, amely nagy DNS kapacitással rendelkezik·} mennyiséggel és a fertőzés után a jelzett időpontokban begyűjtöttük. A nagy DNS kapacitással rendelkező β-galt expresszáló adenovlrus vektor kitermelését ismét. 293 sejtek fertőzésével határoztuk meg, a fertőzött sejteket festve és a kék sejteket megszámolva (6B. ábra). Az amniocihákban szintetizált nagy DNS kapacitással rendelkező adenovlrus vektorok mennyisége megfelel a Cre-expresszáló
293 sejtekben termelt vektoroknak (az adatok nem kerültek bemutatásra) <7
SZEKVENCIÁD!S7A <210> 1 <211> 513 <212> DNS <213-> Egér, foszfogllcarát-kinás-promóter <400> 1
GAATTCTACC GGGTAGGGGA GGCGCTTTTC CCAAGGCAGT CTGGAGCATG
CGCTTTAGCA GCCCCGCTGG CACTTGGCGC TACACAAGTG GCCTCTGGCC
TCGCACACAT TCCACATCCA CCGGTAGGCG CCAACCGGCT CCGTTCTTTG
GTGGCCCCTT CGCGCCACCT TCTACTCCTC CCCTAGTCAG GAAGTTCCCC
CCCGCCCCGC ACCTCGCGTC GTGCAGGACG TGACAAATGG AAGTAGCACG
TCTCA.CTAGT CTCGTGCAGA TGGACAGCAC CGCTGAGCAA T GGAAgCGGG
TAGGCCTTTG GGGCAGCGGC CAATAGCAGC TTTGCTCCTT CGCTTTCTGG
GCTCAGAGGC TGGGAAGGGG TGGGTCCGGG GGCGGGCTCA GGGGCGGGCT
GAGGöGCGGG GCGGGCGCCC GAAGGTCCTC CGGAGGCCGG GCATTCTCGC
ACGCTTCAAA AGCGCA.GGTC Λ \3v· V- i --7 TTCTCCTCTT CCTCATCTCC
GGGCCTTTCG AGC
<210> 2
<211> 336
<212> DNS
<213-> Adö
<400> 2
GAGTG! IXAGi
GAGTGCCAGC GAGTAGAGTT TTCTCCTCCG AGCCGCTCCG AGACCGGGAC
- 68 ~ »„ * ·«. ♦*·*
TGAAAATGAG ACATATTATC TGCCACGGAG GTGTTATTAC CGAAGAAATG
GCOGCCAGTC TTTTGGACCA GCTGATCGAA GAGGTACTGG CTGATAATCT
TCCACCTCCT AGCCATTTTG AACCACCTAC CCTTCACGAA CTGTATGATT
TAGACGTGAC GGCCCCCGAA GATCCCA&CG AGGAGGCGGT TTCGCAGATT
TTTCCCGACT CTGTAATGTT GGCGGTGCAG GAAGGGATTG ACTTACTCAC
TTTTCCGCCG GCGCCCGGTT CTCCGGAGCC
<210> 3 <211> 29 <212> DNS <213> Mesterséges <400> 3 zekveneia
ATCGACTGCC AGCGAGTAGA GTTTTCTCC <210 4 <211> 22 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <40ö> 4
GTGAGGCGGC TCCGGAGAAC CG
<21.Ö> 5
<211> 216
<212> DNS
<2.13> AdS
<400 5
* * * * «9
CTCGCGGATC
GGTGCAGACC
ATGCTGGATG
CACCCGCGC?
AAATGGAATT
CAGATCTGGA
CTGCCAGTGT
TGACCGAGGA
SAGTTTGGCT
CCGGTC
AGGTGCTGAG
GGCGGTAAAC
GCTGAGGCCC
CTAGCGATGA
GTACGATGAG
ATATTAGGAA
GATCAGTTGG
AGATACAGAT
ACCCGCACCA
CCAGCCTGTG
TGCTGGCGTG
TGAGGTACTG
<210.> 6
<211> 32
<212 > .DNS
<213> Mesterséges ssekv enc.
<400> 6
GACGCCAATT CCATTTGAGT ACCTCAATCT GT
<2X0> 7
<21.'i> 32
<212> DNS
<213> Mesterséges
<400> 1
sz ekvencia
CTCcO GGATC CAGATCTGGA
<2.1.Ö> 8
<2Ii> 782
<212> DNS
ο χ ϊ 3Í SV40 (pGL2basic)
<4Q0> 8
f
Genfeank X 65 3 2 3 *9
- 70 - 9 ♦ 9 ♦ · Λ „ <r **
CGACTGAATT CAATT'ITTAA GTGTA7AATG TG'TTAAACTA CTGATTCTAA
TTGTTTGTGT ATTTTAGATT CCAACCTA'TG GAACTGATGA ATGGGAGCAG
TGGTGGAATG CGTTTAATGA GGAAAACCTG TTTTGCTCAG AAGAAATGCC
ATCTAGTGAT GATGAGGCTA GTGCTGACTC TCAACATTCT ACTCCTCCAA
AM.GAAGAG AAAGGTAGAA GACCCCAAGG ACTTTCCTTC AGAATTGCTA
AGTTTTTTGA GTCATGCTGT GTTTAGTAAT AGAACTCTTG CTTGCTTTGC
TATTTACACC ACAAAGGAAA AAGCTGCACT GCTATACAAG AAAATTATGG
AAAAATATTC TGTAACCTTT ATAAGTAGGC ATAACAGTTA TAATCATAAC
ATACTGTTTT TTüTTACTCC ACACAGGCAT AGA.GTGTCTG CTATTAATAA
CTATGCTCAA AAATTGTGTA CCTTTAGCTT TTTAATTTGT AAAGGGGTTA
ATAAGGAATA TTTGATGTAT AGTGCCTTGA CTAGAGATCA TAA7CAGCCA
TACCACATTT GTAGAGGTTT TACT7GCTTT AAAAAACCTC CCAGACCTCC
CCCTGAACCT GAAACATAAA ATGAATGCAA TTGTTGTTGT TAACTTGTTT
ATTGCAGCTT ATAATGÖTTA CAAAT.&&AGC AATAGCATCA CAAATTTCAC
AAAT.AAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCTAG TTGTGGTTTG TCCAAACTCA
TCAATGTATC TTATCATGTC TGGATCCGTC GA.
<210> 9
<211> 32
<212> DNS
<213> Mesterséges szék <100> 9 véneia
CGACTGAATT CAATTTTTAA GTGTATAATG TG 32
<2.10 > 10 <211> 27 <212> DNS ♦ * » X φφ *»♦ *
«« Φ«Χ <213> Mesterséges szekvencia <400» 10
TCGACGGATC CAGACATGAT AAGATAG <210> 11 <211» 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <400> 11
CCTTG2ACCG GAGGTGATCG
·.«$ A il U <21Ö> 12 <211» 20 <212.» DNS <213.» Mesterséges szekvencia iöö>
TGGCGCCTGC TATCCTGAGA <210> 13 <211» 20 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <400» 13
TACATCTGAC :atggagg «φ«ν ♦*** ** ***♦ **
χ. Φ * » ♦ ♦ ·* χ φ M ♦** * « φ * Φ ♦ * « φ* φ x* ♦ ♦♦ ♦
<210> 14
<211> 20
<2I2> DNS
<213> Mas
<400> 14
erséges ekvencia
CAAGAATCGC
CTGCTACTGT
<210> X 5
<211> 20
<212> DNS
<213> Mesterségés· szekvene1a
<4ö0> 15
GGCTGí 3AGCC AGGGGATGAT
<210> 16
<211> 20
<212> DNS
<213> Mesterséges szekveneia
<40Ö> 16
AGGGT* ÜCGGG GCTGTGCCTT
<210> .ί. f
<211> 20
<212> DNS
<213> Mes·társéges ssekvéne 1 a
*·χ φφΧΧ' X··* <400> 17
CCTGAACGGG GTGTTTCACA
<210> 18
<211> 7090
<212> DNS
<213> STK14 6-plamid
<'400> 18
GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGüAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC
TAAATACATT GAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGAT&AAT
GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG
TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT Z'f X. £ £ A \RKz X
CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT TGGGTGCACG
AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT
1 1 C V ίχΑ. AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA
TGTGCCCCGG TAT 7ATC CC G TATTGACGGC GGGCAAGAGC AACTCGGTGG
CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGT TGA67ACTCA CCAGTCACAG
AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGA.CAGTAA GAGAATTATG C-2Í.G .1 Lr L- TíyC C
ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA CAACGATCGG
AGGACGGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATG7AA
CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC
GAGCGTGACA CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGGGCAAACT
ATTAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT
GGATGGA.GGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG
m /-· ζ~· ζ~· rr· ζ** n> JL bte-V £ VStjy 1 TCATTGCTGA TAAATCTGGA GC C GGT GA UC GTGGGTCTCG
·—> f< m ?T5 z·^ 7» i-pcn GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG
♦♦ * Φ X * » * *
χ. φ ΛΤ« *** *
- 7 4 ~ *..* ί G-,
TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG
ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA
AGTTTACTCA TATATACTTT AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA
AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA. ATCTCATGAC CAAAATCCCT
TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA
AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA
CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA
CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA
TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG
TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT
GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT
ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC
CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG
CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC
GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG
GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT
GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC TATGGAAAAA
CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG
CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT
ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG •CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC
CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT
CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTAGCT
CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCGTATGT
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC
CATGATTACG CCAAGCGCGC AATTAACCCT CACTAAAGGG AACAAAAGCT
GGGTACCGGG CCCCCCCTCG AGGTCATCGA ATTCTACCGG GTAGGGGAGG
CGCTTTTCCC AAGGCAGTCT GGAGCATGCG CTTTAGCAGC CCCGCTGGCA «»φφ φφ** ** φ * « φ * * » * »» »♦« ,* ♦ » ; ♦ * ...
CTTGGCGCTA CACAAGTGGC CTCTGGCCTC GCACACATTC CACATCCACC
GGTAGGCGCC AACCGGCTCC GTTCTTTGGT GGCCCCTTCG CGCCACCTTC
TACTCCTCCC CTAGTCAGGA AGTTCCCCCC CGCCCCGCAG CTCGGGTCGT
GCAGGACGTG ACAAATGGAA GTAGCACGTC rrt z^7\ Τ' >-' <{> 1 iXn-vü X X CGTGCAGATG
GACAGCACCG CTGAGCAATG GAAGCGGGTA GGCCTTTGGG GCAGCGGCCA
ATAGCAGCTT TGCTCCTTCG CTTTCTGGGC TCAGAGGCTG GGAAGGGGTG
GGTCCGGGGG CGGGCTCAGG GGCGGGCTCA GGGGCGGGGC GGGCGCCCGA
AGGTCCTCCG GAGGCCCGGC ATTCTCGCAC GCTTCAAAA.G CGCACGTCTG
CCGCGCTGTT CTCCTCTTCC TCATCTCCGG GCCTTTCGAC GAGCTTGATA
TCGAGTGCCA GCGAGTAGAG TTTTCTCCTC CGAGCCGCTC CGACACCGGG
ACTGAAAATG AGACATATTA TCTGCCACGG AGGTGTTATT ACCGAAGAAA.
TGGCCGCCAG TCTTTTGOAC CAGCTGATCG AAGAGGTACT GGCTGATAAT
CTTCCACCTC CTAGCCATTT TGAACCACCT ACCCTTCACG AACTGTATGA
TTTAGACGTG ACGGCCCCCG AAGATCCCAA CGAGGAGGCG GTTTCGÜAGA
TTTTTCCCGA CTCTGTAATG /*·» Z*-' <*> •'Tí z'» ?-' X Λ X bv AGGAAGGGAT TGACTTACTC
ACTTTTCCGC CGGCGCCCGG TTCTCCGGAG CCGCCTCACC jy«p z-»z~· A a i 1
GCCCGAGCAG CCGGAGCAGA GAGCCTTGGG TCGGGTTTCT ATGCCAAACC
TTGTACCGGA GGTGATCGAT CTTACCTGCC ACGAGGCTGG CTTTCCACCC
AGTGACGACG AGGATGAAGA GGGTGAGGAG i Aíüiül Uto ATTATGTGGA
GCACCCGGGG CACGGTTGCA GGTCTTGTCA TTATCACCGG AGGAATACGG
GGGACCCAGA ;rt·. i.jhiV Ibi X X ía'JV.!. ATATGAGGAC CTGT'GGCATG
TTTGTCTACA GTAAGTGAAA ATTATGGGCA GTGGGTGATA gAG tggtggg
TTTGGTGTGG TAATTTTTTT TTTAATTTTT ACAGTTTTGT GGTTTAAAGA
ATTTTGTATT GTGATTTTTT TAAAAGGTCC TGTGTCTGAA CCTGAGCCTG
AGCCCGAGCC AGAACCGGAG CCTGCAAGAC CTACCCGCCG TCCTA&AATG
GCGCCTGCTA TCCTGAGACG CCCGAGATCA CCTGTGTCTA GAGAATGCAA
TAGTAGTA.CG GATAGCTGTG ACTCCGGTCC TTCTAACACA CCTCCTGAGA
TACACCCGGT GGTCCOGCTG TGCCCCATTA AACCAGTTGC CGTGAGAGTT
**·♦'» »»
Φ* φ ♦ φ * * φφ. ·*♦♦ W
φ. * ♦ *
ΦΦ φ*Φ ΦΦΦ*
GGTGGGCGTC GCCAGGCTGT GGAATGTATC GAGGACTTGC TTAACGAGCC
TGGGCAACCT TTGGACTTGA GCTG7AAACG CCCCAGGCCA TAAGGTGTAA
ACCTGTGATT ÜUul \3 i. '<3 A TTAACGGCTT ír’./-’ rr: >·*>?·*/\ w/·* *f\ A <3 ΐ X ATGAGTTSAT
GTAAGTTTAA TAAAGGGTGA GATAATGTTT AACTTGCATG GCGTGTTAAA
TGGGGCGGGG CTTAAAGGGT ATATAATGCG CCGTGGGCTA ATCTTGGTTA
CATCTGACCT CATÖGAGGCT TGGGAGTGTT TGGAAGATTT TTGTGCTGTG
CGTAACTTGC T G CAACAGAG CTCTAACAGT ACCTCITGG'T TTTGGAGGTT
rnΓ' ff* TCATCCCAGG CAAAGTTAG'T CTGCAGAATT AAGSAGGATT
ACAAGTGGGA ATTTGAAGAG CTTTTGAAAT •CCTGTGGT6A GCTGTTTGAT
TCTTTGAATC TGGGTCACCA GGCGCTTTTC <.AAG/AüAAG<'; TCATCAAGAC
TTTGGATTTT TCCACACCGG GGCGCGCTGC GGCTGCTGTT GCTTTTTTGA
GT77TATAAA GGATAAATGG AGCGAAGAAA CCCATCTGAG CGGGGGGTAC
CTGCTGGAT7 TTCTGGCCAT GCATCTGTGG AGAÖCGGTTG TÖAGACACAA
•xxrkKx χ o /*>m-x -r AA'i'., iwi A v?A. CTTCCGTCCG CCCGGCGATA ATACCGACGG
AGGAGCAGCA GCAGCAGCAS GAGG^aAGCcA GGCGGCGGCG GCAGGAGCAG
AGCCCATGGA ACCCGAGAGC CGGCCTGGAC CCTCGGGAAT GAATGTTGTA
CAGGTGGCTG AACTGTATCC AGAACTGAGA CGCATTTTGA CAATTACAGA
GGATGGGCAG GGGCTAAAGG GGGTAAAGAG GgAGCGGGGG GCTTGTGAGG
C7ACAGAGGA GGC7AGGAAT CTAGCTTTTA GCTTAATGAC CASACACCGT
CCTGAGTGTA TTACTTTTCA ACAGATCAAG GATAATTGCG CTAATGAGCT
TGATÜTGCTG GCGCAGAAGT ATTCCATAGA GCAGCTGA.CC AC7TACTGGC
TGCAGCCAGG GGATGATTTT GAGGAGGCTA TTAGGGTATA TGCAAAGGTG
GCACTTAGGC CAÖATTGCAA GTACAAGATC AGCAAACTTG 7AAA7ATCAG
GAATTGTTGC TACATITCTG GGAACGGGGC CGAGGTGGAG ATAGATACGG
GGATAGGGT GGCCTTTA.GA TGTAGCATGA TAAATATGTG GCCGGGGGTG
CTTGGCATGG .ACGGGGTGGT TATTATGAAT GTAAGGTTTA CTGGCGCCAA
TTTTAGCGGT ACGGTTTTCC TGGCCAATAC CAACCTTATC CTACACGGTG
TAAGCTTCTA TGGGTTTAAC AATAGCTGTG TGGAAGCCTG GACCGATGTA
ΦΦΧ» χ»φφ *»' *♦♦· »♦ * ψ φ φ * ^φ φ*Φ ΧΦΦ*
AGGGTTCGGG GCTGTGCCTT TTACTGCTGC TGGAAGGGGG TGGTGTGTCG
CCCCAAAAGC AGGGCTTCAA TTAAGAAATG CC7CTTTGAA AGG7GTACCT
TGGGTATCCT GTCTGAGGGT AACTCCAGGG TGCGCCACAA TGTGGCCTCC
GACTGTGGTT GCTTCATGCT AGTGAAAAGC GTGGCTGTGA TTAAGCATAA
CATGGTATGT GGCAACTGCG AGGAGAGGGC CTCTCAGATG CTGACCTGCT
CGGACGGCAA CTGTCACCTG CTGAAGACCA TTCACGTAGC CAGCCACTCT
CGCAAGGCCT C' C'f'* Ti f WC rp V? 'G? i'sj <4» ·μ> * X TG AGG AT AAC ATACTGACCe GCTGTTCCTT
GCATTTGGGT AACAGGAGGG GGGTG77CCT ACCTTACCAA TGCAATTTGA
GTCA.CACTAA GATATTGCTT G&GCCCGAGA GCATGTCCA& GSTGAACCTG
AACGGGGTGT TTGACATGAC CATGAAGATC TGGAAGGTGC TGAGGTACGA
TGAGACCCGC ACCAGGTGCA GAG G G i G v Gjí-í GTGTGGCGGT AAACATATTA
GGAACCAGCC TGTGATCCTG GATG T GAC C G AGGAGCTGAG GCCCGATCAC
TTGGTGCTGG CCTGCACCCG CGCTGAGTTT GGCTCTAGCG ATGAAGATAC
AGATTGAGGT ACTGAAATGG AATTCCTCTA GTGATGATGA λ-» f>.-*}rys t\ xx-xV i i-
GACTCTCAAC ATTCTACTCÜ TCCAAAAAAG AAGAGAAAGG TAGAAGACCC
CAAGGACTTT CCTTCAGAAT TGCTAAGTTT 7TTGA0TCAT GCTGTGTTTA
GTAA7AGAAC X i a. v.tL. 1 ΓνΧ.» TT7GC7ATTT ACACCACAAA GGAAAAAGCT
GCACTGCTAT ACAAGAAAAT TATGGAAAAA TATTCTGTAA CCTTTATAAG
TAGGCATAAC AGTTATAATC ATAACATACT GTTTTTTCTT ACTCCACACA
GGCATAGAGT GTCTGCTATT AATAACTATG CTCAAAAATT GTGTACCTTT
AGCTTTTTAA TTTGTAAAGG GGTTAATAAG GAATATTTGA TGTATAGTGC
CTTGACTAGA GATCAT.AA.TC AGCCATACCA CATTTGTAGA GGTTTTACTT
GCTTTAAAAA ACCTCCCACA CCTCCCCCTG AACCTGAAAC ATAAAATGAA
TGCAATTGTT GT7STTA&C7 TGTTTATTGC AGCTTATAAT GGTTACAAAT
AAAGCAATAG CATCACAAAT TTCACAAATA AAGCATTTTT TTCACTGCAT
TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATCAAT GTATCTTATC ATGTCTGGAT
CCACTAGTTC TAGAGCGGCC GCCACCGCGG TGGAGCTCCA ATTCGCCCTA
TAGTGAGTCG TATTACGCGC GCTCACTGGC CGTCGTTTTA CAACGTCGTG
X» X* φφ* *
ΦΦ χ * ΦΦ
ACTGGGAAAA CCCTGGCGTT ACCCAACTTA ATCGCCTTGC AGCACATCCC
CCTTTCGCCA GCTGGCGTAA TAGCGAAGAG GCCCgCACCG ATCGCCÜ7TC
CCAACAGTTG CGCAGCCTGA ATGGCGAATG GGACGCGCCC TGTAGCGGCG
CA7TAAGCGC GGCGGGTGTG GTGGTTACGC GCAGCGTGAC CGCTACACTT
GCCAGCGCCC TAGCGCCCGC TCCT'TTCGCT C T T C o,rN ψ φ CCTTTCTCGC
CACGTTCGCC GGCTTTCCCC GTCAAGCTCT AAATCGGGGG CTCCCTTTAG
GGTTCCGATT TAGTGCTITÁ CGGCACCTCG ACCCCAAAAA ACTTGATTAG
GGTGATGGTT CACGTAGTGG GCCATCGCCC TGATAGACGG TTTTTCGCCC
TTTGACGTTG GAGTCCACGT TCTTTAATAG φ ^*.···* TV .^^,^7:·.-^.·. AyjrX. IVI AG TTCCAAACTG
GAACAACACT CAACCCTATC TCGGTCTATT CTTTTGATTT ATAAGGGA77
TTGCCGATTT CGGCCTATTG GTTAAAAAÁT GAGCTGATTT ACCAAAAATT
TAACGCGAAT TTTAACAAAA TATTAACGC7 TACAATTTAG

Claims (21)

  1. SZABADAM IGÉNYPONTOK
    1. Permanens amnioeita sejt vonal, 'amely legalább egy olyan nukleinsavak tartalmaz, amely az adenovirus E1A és SIS régiói géntermékeínek expresszióját biztosítja.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti sejtvonal, amelyben a legalább egy nukleinsav az adenovirus E2A, E2B és/vagy as E4 régiók és/vagy a Cre rekombináz géntermékeínek az expresszióját is biztosítja.
  3. 3. Az. 1. vagy 2. igénypont szerinti sejt vonal, amelyben az E1A régió géntermékének az expressziója egy konstitutív promóter szabályozása alatt áll, előnyösen a foszfoglicerát kinéz (PGK; promöter szabályozása alatt.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti sejtvonal, amelyben, az E1B régió géntermékének (géntermékeínek) az expresszlőja egy adenovirus eredetű promóter szabályozása alatt áll, előnyösen az adenovirus .E1B promöter szabályé zása alatt.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti sejtvonal, amelyben az adenovirus eredetű géntermékek az 5. típusú humán adenovírusból származnak.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti sejtvonal, amely sejtvonal humán eredetű.
  7. 7. Eljárás permanens amnioeita sejtvonal előállításra, azzal, jellemezve, hogy amniocitákat transzfektáiunk legalább egy olyan nukleinsawal, amely az adenovirus E1A és E1B. régiói géntermékeínek expressziéját biztosítja.
    •
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy primer amniocitákat, előnyösen humán primer amníocítá80
    ΧΦΦ-Χ ΦΧΦ* ** **** >*** * * * * L. * » φ *φ **·* * * '* * * . * «««Α
    ».· * ** *** ’** kát alkalmazunk,
  9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleinsavat egy expressziós vektor formáj ában a 1 ka ima 2 zuk,
  10. 10. A 7—9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E1A. régió géntermékének az expreszszióját egy konstitutív promóter szabályozása alatt valósítjuk meg, előnyösen a foszfoglicerát kináz <PGK> promoter szabályozása alatt, és az E1S régió . gént érmé kének ígéntermékeinek) az expresszióját egy adenovírus eredetű promoter szabályozása alatt valósítjuk meg, előnyösen az adenovírus E1B promóter szabályozása alatt.
  11. 11. A 7-10. igénypontok, bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amníociták transzfekciójavai és/~ vagy az eredményül kapott sejtvonal segítségével az adenovírus E2A és/vagy E2B és/vagy £4 régiók és/vagy a Cre rekombináz géntermékeinek az expresszió.ját is megvalósítjuk.
  12. 12. A 7-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adenovírus géntermékként humán 5, típusú adenovíru-sból származó· adenovírus géntermék expreszszí óját valósítjuk meg.
  13. 13. Permanens amniöci.ta sejtvonal, amely a 7-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazásával állítható elő.
  14. 14. Az N5-2.S6· (DSM ACC2416) jelzésű permanens .amnio-cita sejtvonal.
  15. 15. Amníociták alkalmazása adenovírus-transzformált permanens amniocita sejtvonalak előállítására.
  16. 16. Az E1A és az SIS régiók adenovírus géntermékeinek alkalmazása permanens amniocita sejtvonaiak előállítására.
  17. 17. Permanens amniocita sejtvonal alkalmazása géntranszfer vektorok és/vagy adeno vírus· mutánsok előállítására .
    IS. A 17. igénypont szerinti alkalmazás adenovírus vektorok, AAV .{adeno-asszociáít vírus) vektorok, retrovirus vektorok, ientivírus vektorok, kiméra adenovírus-A&V vektorok, kiméra adehovirus-retrovírus vektorok és/vagy kiméra adenovírus-ientivírus vektorok előállítására.
  18. 19. A 18. igénypont szerinti alkalmazás, első generációs adenovírus vektorok, második generációs adenovírus vektorok, nagy DNS kapacitással rendelkező· adenovírus vektorok és/vagy deléciós adenovírus vektorok előállítására.
  19. 20. A 17-19, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás tropizíttus-módosítött géntranszfer vektorok és/vagy tropizmus-módosított adenovírus mutánsok előállítására.
  20. 21. A 17-2C. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint .amniocita sej t vonal ként .az 1-6., 13. vagy 14. igénypontok bármelyike szerinti sejtvonaiat alkalmazzuk.
  21. 22. Eljárás géntranszfer vektorok és/vagy adenovírus mutánsok előállítására., azzal, jellemezve, hogy az eljárás végrehajtása során permanens amniocita. sejtvonaiat alkalmazunk .
HU0203387A 1999-11-18 2000-11-07 Permanent amniocyte cell line, the production thereof and its use for producing gene transfer vectors HU227440B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19955558A DE19955558C2 (de) 1999-11-18 1999-11-18 Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren
PCT/EP2000/010992 WO2001036615A2 (de) 1999-11-18 2000-11-07 Permanente amniozyten-zelllinie, ihre herstellung und verwendung zur herstellung von gentransfervektoren

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0203387A2 HUP0203387A2 (hu) 2002-12-28
HUP0203387A3 HUP0203387A3 (en) 2005-07-28
HU227440B1 true HU227440B1 (en) 2011-06-28

Family

ID=7929523

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0203387A HU227440B1 (en) 1999-11-18 2000-11-07 Permanent amniocyte cell line, the production thereof and its use for producing gene transfer vectors

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP1230354B1 (hu)
JP (1) JP4456790B2 (hu)
CN (1) CN100412201C (hu)
AT (1) ATE257512T1 (hu)
AU (1) AU784003B2 (hu)
CA (1) CA2391591C (hu)
CZ (1) CZ300124B6 (hu)
DE (2) DE19955558C2 (hu)
DK (1) DK1230354T3 (hu)
ES (1) ES2211647T3 (hu)
HU (1) HU227440B1 (hu)
IL (2) IL149291A0 (hu)
PL (1) PL205966B1 (hu)
PT (1) PT1230354E (hu)
TR (1) TR200400402T4 (hu)
WO (1) WO2001036615A2 (hu)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1528101A1 (en) * 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
EP1718738A2 (en) 2004-02-23 2006-11-08 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
CA2602944C (en) 2005-04-11 2015-08-11 Crucell Holland B.V. Virus purification using ultrafiltration
DE102005054628A1 (de) 2005-11-16 2007-05-24 Cevec Pharmaceuticals Gmbh Verfahren zur Herstellung von permanenten humanen Zelllinien
FI2061803T4 (fi) 2006-08-28 2023-03-14 Process for the purification of fc-containing proteins
CA2742474C (en) 2008-11-03 2016-05-31 Crucell Holland B.V. Method for the production of adenoviral vectors
DE102009003439A1 (de) 2009-02-05 2010-08-26 Cevec Pharmaceuticals Gmbh Neue permanente humane Zelllinie
CA2776461C (en) 2009-10-15 2020-08-25 Crucell Holland B.V. Method for the purification of adenovirus particles.
JP5465331B2 (ja) 2009-10-15 2014-04-09 クルセル ホランド ベー ヴェー 高細胞密度の培養物からのアデノウイルスの精製方法
DK2536829T3 (en) 2010-02-15 2016-07-04 Crucell Holland Bv A process for the production of Ad26-adenovirus vectors
MX337687B (es) 2010-08-16 2016-03-15 Cevec Pharmaceuticals Gmbh Linea celular de amniocitos humanos permanente para la produccion de virus de influenza.
KR101427200B1 (ko) * 2011-11-24 2014-08-07 주식회사 바이로메드 아데노바이러스 생산 신규 세포주 및 그의 용도
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
SI2825640T1 (sl) 2012-03-12 2016-08-31 Crucell Holland B.V. Šarže rekombinantnega adenovirusa s spremenjenimi konci
KR102050616B1 (ko) 2012-03-22 2019-12-03 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Rsv에 대한 백신
EP2662451A1 (en) 2012-05-07 2013-11-13 Stefan Kochanek Nucleic acid construct and use of the same
US20150259387A1 (en) * 2012-10-19 2015-09-17 Cevec Pharmaceuticals Gmbh Production of a hcmv based vaccine in human amniocyte cell lines
EP2722337A1 (en) * 2012-10-19 2014-04-23 CEVEC Pharmaceuticals GmbH Production of a HCMV based vaccine in human amniocyte cell lines
KR102236497B1 (ko) 2013-04-25 2021-04-06 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 가용성 예비융합 ｒｓｖ ｆ 폴리펩타이드
AP2015008893A0 (en) 2013-06-17 2015-12-31 Crucell Holland Bv Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
WO2015000856A1 (de) 2013-07-01 2015-01-08 Charité - Universitätsmedizin Berlin Immortalisierte humane chorionzelllinie sowie verfahren zur immortalisierung humaner chorionzellen
MX2017005788A (es) 2014-11-04 2017-08-02 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vacunas terapeuticas contra el vph16.
EP3042952A1 (en) 2015-01-07 2016-07-13 CEVEC Pharmaceuticals GmbH O-glycan sialylated recombinant glycoproteins and cell lines for producing the same
EP3283634B1 (en) 2015-04-14 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
CN107847581B (zh) 2015-07-07 2022-03-22 扬森疫苗与预防公司 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽
US10456462B2 (en) 2015-07-07 2019-10-29 Janssen Vaccines & Preventions B.V. Vaccine against RSV
CN107921110B (zh) 2015-08-20 2021-10-15 扬森疫苗与预防公司 治疗性hpv18疫苗
PT3439672T (pt) 2016-04-05 2021-02-24 Janssen Vaccines & Prevention Bv Proteína f do rsv pré-fusão solúvel e estabilizada para uso na profilaxia de infeção por rsv
WO2017174564A1 (en) 2016-04-05 2017-10-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
CA3021341A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Janssen Vaccine & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations
BR112018072865A2 (pt) 2016-05-12 2019-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. promotor bidirecional potente e equilibrado
PL3464331T3 (pl) 2016-05-30 2021-04-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilizowane przedfuzyjne białka F RSV
MX2018015540A (es) 2016-06-20 2019-04-11 Janssen Vaccines & Prevention Bv Promotor bidireccional potente y equilibrado.
WO2018011196A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Hpv vaccines
CA3053212C (en) 2017-02-09 2021-04-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
EP3382014A1 (en) 2017-03-29 2018-10-03 CEVEC Pharmaceuticals GmbH Recombinant glycoproteins with reduced antennary fucosylation
CA3061278A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
BR112020004143A2 (pt) 2017-09-15 2020-09-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. método para a indução segura de imunidade contra vírus sincicial respiratório (rsv)
SG11202003399TA (en) 2017-10-31 2020-05-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus and uses thereof
BR112020008435A2 (pt) 2017-10-31 2020-11-17 Janssen Vaccines & Prevention B.V. vetores de adenovírus e seus usos
MA50502A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adénovirus et utilisations associées
KR20200083510A (ko) 2017-10-31 2020-07-08 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 아데노바이러스 및 이의 용도
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
EP3736286A1 (en) 2019-05-09 2020-11-11 Biotest AG Single chain factor viii molecule
AU2020275910A1 (en) 2019-05-15 2021-11-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Prophylactic treatment of respiratory syncytial virus infection with an adenovirus based vaccine
WO2020229577A1 (en) 2019-05-15 2020-11-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine
EP3785726A1 (en) 2019-09-02 2021-03-03 Biotest AG Factor viii protein with increased half-life
WO2021043757A1 (en) 2019-09-02 2021-03-11 Biotest Ag Factor viii protein with increased half-life
US20220372515A1 (en) 2019-10-03 2022-11-24 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
WO2021099906A1 (en) 2019-11-18 2021-05-27 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant calr and jak2 and their uses
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
US20230190881A1 (en) 2020-02-17 2023-06-22 Biotest Ag Subcutaneous administration of factor viii
US20230024133A1 (en) 2020-07-06 2023-01-26 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
US20230029453A1 (en) 2020-07-06 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
US20230035403A1 (en) 2020-07-06 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Method For Determining Responsiveness To Prostate Cancer Treatment
IL302046A (en) 2020-10-15 2023-06-01 Hoffmann La Roche Nucleic acid structures for va RNA transcription
KR20230085170A (ko) 2020-10-15 2023-06-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 동시 유전자 활성화를 위한 핵산 구조체
WO2023198685A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for determining aav genomes
WO2023227438A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Raman-based method for the differentiation of aav particle serotype and aav particle loading status
WO2023232922A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing recombinant aav particles
WO2024013239A1 (en) 2022-07-14 2024-01-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing recombinant aav particles
WO2024056561A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for separating full and empty aav particles

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI0833934T2 (sl) * 1995-06-15 2013-04-30 Crucell Holland B.V. Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji

Also Published As

Publication number Publication date
CA2391591C (en) 2008-12-30
PL357495A1 (en) 2004-07-26
DE19955558A1 (de) 2001-06-07
ES2211647T3 (es) 2004-07-16
IL149291A (en) 2008-11-26
PT1230354E (pt) 2004-04-30
JP2003514526A (ja) 2003-04-22
CN100412201C (zh) 2008-08-20
IL149291A0 (en) 2002-11-10
JP4456790B2 (ja) 2010-04-28
WO2001036615A2 (de) 2001-05-25
PL205966B1 (pl) 2010-06-30
HUP0203387A2 (hu) 2002-12-28
EP1230354A2 (de) 2002-08-14
EP1230354B1 (de) 2004-01-07
CA2391591A1 (en) 2001-05-25
DE19955558C2 (de) 2003-03-20
HUP0203387A3 (en) 2005-07-28
DE50004995D1 (de) 2004-02-12
CN1433476A (zh) 2003-07-30
CZ300124B6 (cs) 2009-02-18
WO2001036615A3 (de) 2002-01-10
AU784003B2 (en) 2006-01-12
ATE257512T1 (de) 2004-01-15
CZ20021709A3 (cs) 2002-08-14
AU1699001A (en) 2001-05-30
DK1230354T3 (da) 2004-03-22
TR200400402T4 (tr) 2004-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU227440B1 (en) Permanent amniocyte cell line, the production thereof and its use for producing gene transfer vectors
US6558948B1 (en) Permanent amniocytic cell line, its production and use for the production of gene transfer vectors
ES2966692T3 (es) Vectores de virus adenoasociados poliploides y métodos de fabricación y uso de los mismos
KR102610715B1 (ko) 입양 t 세포 요법을 위한 중앙 기억 ｔ 세포
US5820868A (en) Recombinant protein production in bovine adenovirus expression vector system
KR101307880B1 (ko) 폴리진을 사용한 멀티단백질 복합체의 재조합 발현
CN110856724B (zh) 包含核酸及car修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用
KR20200032174A (ko) 강화된 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
JP2023036921A (ja) 蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための物質および方法
KR20190118163A (ko) 가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 유전자 요법
CN113950526A (zh) 通过靶向体内表观遗传阻遏实现的持久镇痛
KR20180113990A (ko) 가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 유전자 요법
Lucas et al. Hexon modification to improve the activity of oncolytic adenovirus vectors against neoplastic and stromal cells in pancreatic cancer
CN112135640A (zh) 基因疗法的方法
CA2513226A1 (en) Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
CN115298307A (zh) 核酸调节元件的新组合及其方法和用途
CN114008209A (zh) Aav介导的枫糖尿症(msud)基因疗法
JP2023065516A (ja) 結節性硬化症の遺伝子治療
CN114846141B (zh) 一种分离的核酸分子及其应用
KR102208879B1 (ko) 핵산 구조 및 이의 용도
CN108949690B (zh) 一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法
CN113462657A (zh) 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用
CN113462658A (zh) 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用
CN117677630A (zh) 用于治疗神经退行性疾病的颗粒体蛋白/上皮素模块及其组合
CN115197949A (zh) 一种重组新城疫病毒rNDV-OX40L、其基因组、制备方法及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees