CZ300124B6 - Permanentní bunecná linie amniocytu, zpusob její prípravy a její použití k produkci vektoru pro prenos genu - Google Patents
Permanentní bunecná linie amniocytu, zpusob její prípravy a její použití k produkci vektoru pro prenos genu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ300124B6 CZ300124B6 CZ20021709A CZ20021709A CZ300124B6 CZ 300124 B6 CZ300124 B6 CZ 300124B6 CZ 20021709 A CZ20021709 A CZ 20021709A CZ 20021709 A CZ20021709 A CZ 20021709A CZ 300124 B6 CZ300124 B6 CZ 300124B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- vectors
- adenoviral
- cell line
- cells
- adenovirus
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 319
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 237
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 148
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 89
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 63
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 88
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 48
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 45
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 claims description 37
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 26
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 26
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 claims description 17
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 11
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 claims description 9
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 claims description 6
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 108010087905 Adenovirus E1B Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 50
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 34
- 230000006870 function Effects 0.000 description 32
- KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N phosphono 2,3-dihydroxypropanoate Chemical compound OCC(O)C(=O)OP(O)(O)=O KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 20
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 19
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 9
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 9
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 8
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 8
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 7
- 102000034272 protein filaments Human genes 0.000 description 7
- 108091005974 protein filaments Proteins 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 6
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 5
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 5
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 5
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 5
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010035601 Coxsackie and Adenovirus Receptor Like Membrane Protein Proteins 0.000 description 4
- 102000008198 Coxsackie and Adenovirus Receptor Like Membrane Protein Human genes 0.000 description 4
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100038313 Transcription factor E2-alpha Human genes 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 244000084296 Hernandia moerenhoutiana Species 0.000 description 3
- 235000010044 Hernandia moerenhoutiana Nutrition 0.000 description 3
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- QUIQKYAAGXIAFF-UHFFFAOYSA-N 2-(phosphonoamino)acetic acid Chemical compound OC(=O)CNP(O)(O)=O QUIQKYAAGXIAFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- 101150066038 E4 gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 2
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 2
- 108010059343 MM Form Creatine Kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101100342487 Oryza sativa subsp. indica KSL11 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000005157 neural retina Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 232Th Chemical compound [232Th] ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101100524317 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524321 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep68 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100022712 Alpha-1-antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 208000023514 Barrett esophagus Diseases 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 101100297345 Caenorhabditis elegans pgl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000020897 Formins Human genes 0.000 description 1
- 108091022623 Formins Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101710094396 Hexon protein Proteins 0.000 description 1
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000008934 Muscle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074084 Muscle Proteins Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101150057876 OTC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101710173835 Penton protein Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000016624 Retinal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 229910052776 Thorium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 244000309743 astrovirus Species 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012578 cell culture reagent Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002390 cell membrane structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002089 crippling effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003237 epithelioid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940047135 glycate Drugs 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000009527 percussion Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006552 photochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N sodium;5-ethyl-5-pentan-2-yl-1,3-diazinane-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 244000057424 walen Species 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
- C12N2810/405—Vectors comprising RGD peptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
- C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
- C12N2810/6018—Adenoviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
- C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
- C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Manufacturing Of Steel Electrode Plates (AREA)
Abstract
Rešení se týká permanentní bunecné linie amniocytu, které obsahují alespon jednu nukleovou kyselinu, která exprimuje genové produkty adenovirových úseku E1A a E1B. Dále se týká zpusobu prípravy permanentní bunecná linie amniocytu a použití této linie k produkci vektoru pro prenos genu a/nebo adenovirových mutant. Dalším aspektem je použití amniocytu a adenovirových genových produktu úseku E1A a E1B pro prípravu permanentní bunecné linie amniocytu.
Description
Permanentní buněčná linie amniocytů, způsob její přípravy a její použití k produkci vektorů pro přenos genů
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká permanentní buněčné linie amniocytů obsahující alespoň jednu nukleovou kyselinu, která exprimuje genové produkty adenovirových úseků El A a El B, Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy permanentní bunččné linie amniocytů a použití to této linie k produkci vektorů pro přenos genů a/nebo adenovirových mutant. K dalším aspektům vynálezu patří použití amniocytů a produktů úseků El A a E1B adenovirových genů k produkci permanentní bunččné linie amniocytů.
i? Dosavadní stav techniky
Adenoviry
Adenoviry představují relativně homogenní skupinu virů, charakterizovanou ikosahedríekou
2o kapsidou, sestávající hlavně z virem kódovaných hexonových, pcntonových a vláknitých proteinů. a genomem, tvořeným lineární dvojřetězcovou DNA velikosti přibližné 36 kilobází (kb). Virový genom obsahuje na svých koncích sekvence invertovaných term ináln ích repetic (ITR), které obsahují virový počátek replikace. Dále je v levé straně genomu sbalovact signál, který je nezbytný pro sbalení virového genomu do virové kapsidy v průběhu infekčního cyklu. Adenoviry byly izolovány z mnoha biologických druhů. Existuje více než 40 různých humánních serotypň. které se rozlišují na základě takových vlastností, jako je hemaglutinace. tumorigenicita a DNA sekvenční homologie (Wigand etal,, in: Adenovirus DNA, Doerfler ed., Martinus Nijoff Publishing. Boston, pp. 408-441. 1986), Současné adenovirové vektory obvykle pocházejí ze sérolypů 2 (Ad2) a 5 (Ad5). Infekce Ad2 a Ad5 jsou u lidí endemické. Ad2 a Ad5 nejsou pro lidi onkogenní a jejích bezpečnost je dobře zdokumentována, neboť byla úspěšně a bez jakýchkoliv komplikací provedena vakcinace v armádě USA (Pierce etal., Ant. J. Epidemiol. 87, 237-246, 1968). Biologie adenovirů je relativně dobře známa, jelikož adenoviry hrály významnou roli jako výzkumný nástroj molekulární biologii při objevení některých základních biologických principů jako je např. replikace a transkripce DNA. sestřih RNA a transformace buněk. Adenovirové ěás35 tice vstupují do buňky při infekci prostřednictvím receptorem zprostředkované endocytózy, kdv podle dnešních poznatků, interakce ..knoflíkové“ („knob“) domény vláknitého proteinu s coxsackie adenovirovým receptorem (CAR) zprostředkovává adhezi virové částice na k buněčnému povrchu (Bergelson et al., Science 275, 1320-1323, 1997). Ve druhém kroku dojde k intemal izaei virové částice, přičemž hraje klíčovou roli interakce pentonové báze s integriny (Wickham etal.. Cell 73. 309-319, 1993). Poté, co virová částice vstoupila do buňky, virový genom se dostává do jádra buňky jako DNA-proteinový komplex. Adcnovirový infekční cyklus se dělí na časnou a pozdní fázi, které jsou odděleny replikací adenoviru (Shenk, in: Virology, Pields ed.. Lippincott-Ravcn Publishing, Philadelphia. pp. 2111 2148, 1996). Včasné fázi dochází k expresi časných virových funkcí El, E2, E3 E4. Pozdní fáze je charakterizována trans45 kripcí pozdních genů, které jsou zodpovědné za expresi virových strukturních proteinů a za produkci nových virových částic.
El A je první virový gen, který se exprimuje z virového chromozómu, jakmile se dostane do jádra. El A gen kóduje proteiny 12S a 13S. které se vytvářejí alternativním sestřihem El A RNA.
5d El A proteiny aktivují transkripci řady buněčných a virových genů tím, že interagují stranskripčními faktory. Hlavní funkce El A jsou a) aktivace dalších časných virových funkcí jako je
E1B, E2, E3 a E4, a b) indukce klidových buněk ke vstupu do s fáze buněčného cyklu. Exprese
El A samotného vede k programované buněčné smrti (apoptóze).
CZ 300124 Bó
EIB je jedním z časných virových genů aktivovaných El A. E1B gen kóduje protein E1B velikosti 55 kD a protein EIB velikosti 19 kD, které jsou výsledkem alternativního se střihu E1B
RNA. 55 kD protein moduluje postup buněčného cyklu interakcí s nádorovým supresorový genem p53. podílí se na prevenci transportu buněčné mRNA v pozdních fázích infekce, a zabra5 ňuje El A-indukované apoptózy buněk. EIB 19 kD protein ke podobně důležitý pro prevenci El A-indukované apoptózy buněk.
Všechny humánní adenoviry jsou schopné transformovat buňky hlodavců v buněčné kultuře. Zpravidla je však pro onkogenní transformaci nutná koexprese El A a El B.
io
Protein genu IX. který kóduje strukturní složku virové kapsidy, je vložen do transkripění jednoty EIB.
Gen> E2A a E2B kódují různé proteiny, které jsou nezbytné pro replikaci virového genomu. Patří i? sem prekurzorový protein terminálního proteinu (pTP), DNA polymeráza (Pol) a protein vázající jednořetězec (SSBP). V průběhu replikace se pTr váže na obe ί i i< virového genomu. Působí zde jako proteinový primer pro DNA replikaci, která je iniciována Pol společně s buněčnými faktory.
Pol, SSBP a buněčný faktor NF1I, a zřejmě ještě další faktory, jsou nezbytné k prodlužování řetězce DNA.
E4 kóduje různé proteiny. Kromě jiného E4 protein velikosti 34 kD, který blokuje, společně EIB 55 kD proteinem, akumulaci buněčné mRNA v cytoplazmě. a současně umožňuje transport virové RNA z buněčného jádra do cytoplazmy.
Po zahájení replikace virového genomu dochází k expresi virových strukturních proteinů, které jsou nutné pro sestavení virové kapsidy a pro vytvoření komplexu virové DNA s virem kódovanými DNA-vazebnými proteiny. Zcela jistě se nejdříve vytvoří prázdná kapsida. do které následně vstoupí virový genom. K tomuto procesuje nutný cis element virového genomu. tzv. sbalovací signál, který je lokalizován v levé části virového genomu a, v případě Ad5, zaujímá úsek zauto jímá úsek od páru bází 260 do páru bází 460 (Hearing etal.. J. Virol. 62. 2555-2558. 1987; Graeble a Hearing, J. Virol. 64, 2047-2056, 1990). Sbalovací signál se překrývá s El A enhancerem (zesilovačem), který je nutný pro aktivitu El A promotoru. Přesný mechanismus sbalení vírového genomu do virové kapsidy není dosud jasný, ale je pravděpodobné, že je k tomu nutná interakce buněčných a/nebo virových proteinů se sbal ovacím signálem.
Adenovirové vektory
Adenovirové vektory jsou zvláště důležité jakožto expresní vektory, zejména pro účely genové terapie. Je proto celá řada důvodů; biologie adenovirů byla důkladně prozkoumána, virové částice
4o jsou stabilní a lze je relativně snadno produkovat s vysokým titrein. genetické úpravy (manipulace) adenovirového genomu jsou snadné a adenovirové vektory jsou schopné účinně transdukovat replikující i nereplikující se buňky, a to jak in vitro, tak in vivo.
a) Adenovirové vektory první generace
Adenovirové vektory první generace (Gilardi etal., FEBS Letters 267, 60-62, 1990; StratfordPerricaudel et al.. Hum. Gen Thcr. 1, 241-256, 1990) jsou charakteristické delecemi genů El A a EIB. El A a EIB mají transformující a transaktivující vlastnosti. Navíc El A je nezbytný pro funkci nebo aktivaci virových genů a EIB je nezbytný pro akumulaci virových transkriptu. so V některých vektorech byla navíc de letována oblast E3. aby se zvýšila kapacita pro příjem cizorodé DNA. E3 je postrádáte lna pro produkci adenovirů v buněčné kultuře. Kapacita pro příjem cizorodé DNA jc přibližně 8 kb. Adenovirové vektory první generace se dosud produkovaly zejména v buňkách 293 buňky (viz níže), které komplementují funkce El A a EIB chybějící ve vektorech.
CZ 300124 Bó
b) Adenovirové vektory druhé generace
Adenovirové vektory druhé generace jsou charakteristické delecemi E2 a/nebo E4 kromě původních delecíEIA a EIB (Engelhardt etal,. Proč. Nati. Acad. Sci., USA 91, 6196-6200, 1994; Yang etal. Nátuře Gent., 7. 362-367, 1994; Gorziglia etal., J. Virol. 70, 4173-4178. 1996; Krougliak a Graham, Huni. Gen Ther. 6, 1575-1586, 1995; Zhou et al.. J. Virol. 70. 7030-7038, 1996). V některých vektorech byla navíc de letována oblast E3. aby se zvýšila kapacita pro příjem cizorodé DNA. Adenovirové vektory druhé generace byly vyvinuty proto, aby se dále redukovala transkripce virových genů a exprese virových proteinů, a aby se tak dále zmenšila antivirová imunitní reakce. Kapacita pro příjem cizorodé DNA byla nepatrně zvýšena ve srovnání s adenovirovými vektory první generace. Adenovirové vektory druhé generace jsou produkovány v buněčných liniích, které kromě El A a EIB komplementují navíc konkrétní další deficit (E2 a/nebo E4),
e) Adenovirové vektory s velkou kapacitou DNA
Adenovirové vektory s velkou kapacitou DNA jsou charakteristické tím. že neobsahují žádné virové kódující DNA sekvence (Kochanck et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93, 573 1-5736, 1996; Fisher et al.. Virology 21 7, 11-22, 1996; Kumar-Singh a Chamberlain. Huni. Mol. Gent. 5. 913-921. 1996). Tyto vektory obsahují jen virové konce včetně úseků ITR a sbalovacího signálu. Kapacita pro příjem cizorodé DNA je přibližně 37 kb, protože větší část adenovirovového genomu byla de letována. Byly popsány různé systémy pro produkci adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA (Kochanck et al., supra; Parks et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 13 565-1.3 570. 1996; Hardy etal., J. Virol. 71, 1842-1849, 1997). Výhodou těchto adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA ve srovnání s adenov i rovými vektory první a druhé generace je větší kapacita pro příjem cizorodé DNA a nižší toxicita a imunogenieita (Schiedner etal.. Nátuře Gent. 18, 180-183. 1998; Morral etal., Hum. Gen Ther. 9. 2709 2716, 1998). V současnosti jsou adenovirové vektory s velkou kapacitou produkovány pomocí El A- a E1Bdeletovaných pomocných virů (pomocný-virus). které poskytují v trans virové funkce nezbytné pro produktivní infekční cyklus. Dodnes se adenovirové vektory s velkou kapacitou pro DNA produkují v buňkách 293 nebo v buněčných liniích odvozených z buněk 293. V jednom způsobu produkce (Parks etal.. supra; Hardy etal., supra), jsou adenovirové vektory produkovány v modifikovaných buňkách 293. které navíc k EIA a EIB, exprimují rekombinázu Ure z bakteriů fága PI V tomto systému je sbalovací signál pomocného viru obklopen rozpoznávací sekvenci loxP z bakteriů fága Pl. Po infekci Cre-exprimuj ících buněk 293 pomocný virem a adenovirový vektorem s velkou kapacitou pro DNA je sbalovací signál pomocného viru vystřižen, /tohoto důvodu d oli ází především ke sba lová ní vektoru obsahujícího normální sbalovací signál, ale nikoliv pomocného viru.
d) Deletované adenovirové vektory
Tyto vektory by ly popsány jako vektory první generace, které mají rozpoznávací sekvenci loxP bakteriofága Pl umístěnou ve virovém genomu takový způsobem, že po infekci Cre cxprimujících buněk 293 většina nebo dokonce všechny virové kódující sekvence jsou deletovány rekombinací mezi rozpoznávací sekvencí loxP. Velikost genomu těchto vektorů je přibližně 9 kb. Kapacita pro příjem cizorodé DNA je podobná, přibližně také 9 kb (Lieber etal., J. Virol. 70. 8944-8960, 1996).
Adeno-asociovanc viry (AAV)
AAV patří do „čeledi“ parvovirů, rodu dependovirů, a mají dvě odlišné životní formy, a sice vyskytují se buďto jako lytický virus, nebo provirus. Aby došlo k lytické infekci, virus vyžaduje ko infekci pomocný virem (adenovirus, virus vakcinie, virus herpes simplex). V nepřítomnosti pomocného viru není AAV schopen se replikovat, integruje se do genomu a existuje zde jako inaktivní provirus. Když dojde k infekci buněk nesoucích AAV jako integrovaný provirus. např.
Ql 300124 Bó adenovirem. provirus je schopen znovu vstoupit do cyklu lytické infekce (Samulski. Curr, Opin.
Gent, Dev. 3, 74-80, 1993).
AAV kapsidy obsahují genom z jednořctčzcovc lineární DNA. buďto pozitivní, nebo negativní polarity. Existuje několik sérolypů AAV. Nejdůkladněji prozkoumaný scrotyp AAV-2. Genom AAV-2 sestává z 4680 nukleotidů. Genom obsahuje na svých koncích sekvence invertovaných terminálních repetic (1TR) o délce 145 párů bází. Prvních 125 párů bází vytváří vlásenkovou strukturu tvaru T sestávající ze dvou vnitřních palindromů, io AAV genom kóduje nestrukturní replikační proteiny (Rep) a strukturní kapsidovc proteiny (Cap). Různé replikační proteiny (Rep78, Rep68, Rep52, Rep40) se vytvářejí z různých promotorů (p5 a pl9) a pomocí alternativního sestřihu. Různé kapsidové proteiny (VP1, VP2. VP3) sc vytvářejí alternativním sestřihem z p40 promotoru.
i? AAV vektory
AAV vektory obsahují pouze úseky ITR z AAV a určité sousední nekódující AAV sekvence, /tohoto důvodu je kapacita pro příjem cizorodé DNA přibližně 4.5 kb. Pro produkci rekombinantních AAV vektoru byty popsány různé systémy (Skulimovvski a Samulski, in: Methods in
2o Molecular Genlies, Vol. 7, Adoph ed.. Academie Press, pp. 3-12). Tyto systémy poskytují všechny složky nezbytné pro replikaci, expresi a sbalení rekombinantního vektoru. Specificky jde o expresní kazety, které kódují Rep a Cap proteiny z AAV, a adenovirové pomocné funkce. Adenovirové pomocné funkce nezbytné pro produkci AAV jsou specificky PIA, ΓΊΒ. E2, E4 a VA. Funkce El A a E1B poskytují buňky 293. které se až dosud k produkci užívaly. Ve způsobech dnešních jsou funkce E2, E4 a V A poskytnuty buďto ko infekcí adenovirem, nebo kot rans lekcí F2-. Γ.4- a VA-exprimujícími plazmidy (Samulski et al., J. V i rol. 63, 3 822-3 828, 1989: Allen et al.. J. Virol. 71, 6816 6822, 1997; Tamayose et al., Hum. Gen Ther. 7, 507- 513, 1996; Flotte etal.. Gen Ther. 2, 29-37, 1995; Conway etal., J. Virol. 71, 8780-8789, 1997; Chiorini etal., Hum. Gen Ther. 6, 1531-1541. 1995; Ferrari et al., J. Virol. 70. 3227 3 234, 1996; Salvetti el al..
3a Hum. Gen Ther. 9. 695-706. 1998: Xiao etal., J. Virol. 72. 2224-2232, 1998, Grimm etal., Hum. Gen Ther. 9, 2745-2760, 1998; Zhang etal., Hum. Gen Ther. 10. 2527-2537, 1999). Alternativně byly vyvinuty strategie, které užily hybridní vektory adenovirus/AAV nebo herpes simplex vírus/AAV k produkci AAV vektorů (Conway etal.. supra·, John ston etal., lkim. Gen Ther. 8, 359-370, 1997, Thrasher etal.. Gen Ther. 2. 481-485, 1995; Fisher etal., Hum. Gen
Ther. 7. 2079-2087. 1996; Johnston etal., Hum. Gen Ther. 8. 359-370, 1997). Všechny tyto způsoby produkce mají společné to, že se k produkci užívají El A- a El B-ex prim ujíeí buňky 293.
Producentské buněčné linie
Z důvodů bezpečnosti adenovirové vektory určené pro humánní použití mají obvykle delece genů FIA a F1B, Produkce probíhá v komplementačních buněčné linii, která poskytuje v trans funkci El. Většina adenovirovýeh vektorů byla dodnes produkována v buněčné linií 293. V nedávných letech však byly připraveny další buněčné linie, které mohou být užity k produkci
El -deletovanýeh adenovirovýeh vektorů.
a) Buňky HEK 293
Buňky HEK 293 byly po dlouhou dobu jediné buňky, které se mohly užívat k produkci El-dele5o tovanýeh adenovirovýeh vektorů. HEK 293 buňky byly připraveny v roce 1977 transfekci „rozstříhané adenovirové DNA do humánních embryonálních ledvinnýeh buněk (11EK buňky). Z celkového počtu osmi transfekčních experimentů, každý v průměru z 20 HEK kulturami, byla získán jediný imortalizovaný buněčný klon (Graham etal., J. Gen. Virol. 36. 59-74, 1977). Buněčná linie (buňky HEK 293) založená z tohoto klonu obsahuje úplnou levou ěást 11 % ade55 novirovového genomu (páry bází 1 až 4344 z genomu Ad5), včetně genů E1A a E1B a levého
-4Q7. 300124 B6 úseku ITR a také adenovirového sbalovacího signálu (Louis et al., Virology 233, 423-429. 1997).
Značným problémem pro produkci adenovirových vektoru je sekvenční homologie mezi Eldeletovanými adenovirovými vektory' a částí adenovirové DNA integrované v buňkách 293.
Homologní rekombinace mezi vektorem a adenovirovou DNA integrovanou v buňkách 293 je zodpovědná za vznik replíkačně-kompetentních adenovirů (RCA) (Lochmuller el al., Huni. Gen lher. 5, 1485-1491. 1994; Hehir et al.. J. Virol, 70, 8459-8467, 1996). HEK 293 buňky jsou /tohoto důvodu nevhodné pro produkci adenovirových vektorů farmaceutické kvality, protože takové produkční jednotky jsou často kontaminované nepřijatelným množstvím RCA. Výskyt RCA je naprosto nepřijatelný při produkci vektorů pro klinické použití, neboť replikačně koniio petentní adenoviry' mají výrazně vyšší toxicitu než replikačně-defektní adenoviry. jsou schopné nekontrolované replikace v humánních tkáních a navíc jsou schopné komplcmcntovat replikačně-defektní adenoviry' (Eochmiiller etal.. supra: Imler etal.. Huni. Gen lher. 6. 711-721.
1995; 1 lehir et al., supra}.
i? b) Humánní embryonální retinové buňky (HER buňky) a buněčné linie
Ačkoliv buňky hlodavců sc mohou snadno transformovat adenovirovou El funkcí, primární humánní buňky se ukázaly jako relativně rezistentní k transformaci El A a EIB. Jak jíž bylo zmíněno výše. Graham a spolupracovníci byli schopni izolovat pouze jediný buněčný klon z HEK
2d buněk, které byly transfekovány „rozstříhanou DNA z Ad5. Gal li more a spolupracovníci zkoušeli po dlouhou dobu neúspěšně transformovat primární HEK buňky funkcí El z Ad 12 (Gallimore etal., Anticancer Res., 6, 499-508, 1986). Tyto experimenty byly prováděny neúspěšné po dobu 3 let svíce než 1 mg EcoRl fragmentu cDNA z Ad 12 obsahujícího geny El A a EIB. Po mnoha pokusech sc podařilo izolovat jen čtyři HEK buněčné linie Ad 12—E1 (Whittakcr ct al..
Mol. Cello Biol.. 4, 110-116. 1984). Podobně Gallimore a spolupracovníci zkoušeli neúspěšně transformovat i jiné primární humánní buňky funkcí El, včetně lakových buněk, jako jsou keratinocyty, kožní fibroblasty, hepatocytv a urotheliální buňky (Gallimore etal., Anticancer Res.. 6, 499-508. 1986). Jediný typ humánních buněk, který bylo možné dosud reprodukovatelné transformovat adenovirovou funkci El jsou humánní embryonální retinové buňky (HER buňky).
HER buňky představuji směs buněk získanou z bílé neurální retiny. Pro získání těchto buněk je nezbytné vyjmout oko z orbitální dutiny humánního fétu, zpravidla mezi 16. a 20. týdnem gestace. Oko se otevře horizontální incizí a bílá neurální retina se vyjme pinzetou a vloží do buněčné kultury.
Na základě dřívějších pozorování, a sice že a) Adl2-indukované nádory primárně pocházejí z primitivního neurálního epitelu (Mukai el al., Prog. Neuropathol. 3, 89-128, 1976), a že b)Adl2 po intraokulámí inokulaci indukuje nádory retiny li laboratorních potkanu a paviánů (Mukai et al., supra: Mukai ct al.. Science 210, 1023- 1025, 1980), Byrd a spolupracovníci zjistili, že humánní embryonální retinoblasty (HER buňky) se mohou transformovat El geny z Ad 12
4(i (Byrd etal.. Nátuře 298, 69 71, 1982). Ačkoliv účinnost transformace buněk HER byla menší než u primárních potkaních buněk, účinnost transformace byla více než 100 x vyšší než pro HEK buňky. Byly zahájeny výzkumy s cílem vytvořit komplementární buněčné linie, které by se mohly využít k izolaci Ad 12 El mutant.
V dalších výzkumech této skupiny (Gallimore etal., Cancer cells 4. 339-348. 1986) bylo ukázáno. že HER buňky se mohou transformovat účinné plazmidovou DNA. která exprimuje geny El A a EIB z Ad5, Účinnost transformace a vznik El A- a El B-exprimující buněčné linie byly asi 20 x vyšší s El geny z Ad5 než s El geny z Ad 12.
5c Na základě těchto údajů. Fallaux a spolupracovníci (Fallaux et al., Hum. Gen l her. 7, 215-222, 1996; Fallaux etal., Hum. Gen Ther. 9. 1909 1917, 1998) založil El A- a EIB exprimující buněčné linie tak, že transformoval HER buňky plazmidy, které exprimovaly geny Et A a EIB zAd5. Buněčná linie 911, která byla připravena transformací plazmidem. který obsahoval geny El A a E1B z Ad5 (nukleotidy 79 až 5789 z genomu Ad5), exprimuje El A pod kontrolou přiroze55 ného El A promotoru (Fallaux et al„ supra: patentová přihláška W097/00326). Bylo tak možné
CZ 300124 Bó založit další El A- a El B-exprtmující HER buněčné linie transfekci plazmidu. který obsahoval nukleotidy 459 až 3 510 zgenomu Ad5, a ve kterém je ElAgcn pod kontrolou promotoru humánní fosfoglyccrátkinázy (PGK). a ve kterém je dále přirozený E1B polyadcnylační signál nahrazen poty(A) sekvencí povrchového antigenu z viru hepatitidy B (HBV) (Eallaux etal..
supra; patentová přihláška W097/00326). Tyto HER buněčné linie bývají označovány jako PER buněčné linie. Výhodou těchto novějších buněčných linií PER vc srovnání s buněčnými liniemi 293 nebo 911 je chybějící sekvenční homologie s DNA adenovirových vektoru první generace a integrovanou Ad5 DNA. Z tohoto důvodu dochází k významné redukci možnosti vytvářet RCA. Tyto El A- a ElB-transformovanc HER buněčné linie (911 buňky a PER buňky) io byly schopny komplementovat chybějící El v adenovirových vektorech první generace a tak byly užívány k produkci těchto vektorů,
Podobně byly připraveny buněčná linie transformací HER buněk plazmidem pTG6559, jak je uvedeno v publikaci Imler a spolupracovníci (Imler etal., supra; viz také WO 94/28152). Plazíš mid pTG6559 obsahuje sekvenci kódující geny EIA a E1B a gen proteinu IX (nukleotidy 505 až
4034 zgenomu Ad5), přičemž EiAgen je pod kontrolou promotoru myší fosfogiyeerátkiná/y (PGK), a sdílený polyadcnylační signál proteinů genů El B a IX geny byl nahrazen polyadenylačním signálem králičího genu pro [3-globin,
Na rozdíl od popsaných pokusů získat primární humánní buňky transformací geny EIA a E1B z Ad5. byly učiněno několik málo pokusů exprimovat EIA a E1B různých sérotypů trvale v již dříve dobře zavedených buněčných liniích (Grodzieker etal.. Cell, 21, 453—463, 1980; Babiss etal.. J. Virol. 46, 454-465, 1983; Shiroki etal., .1. Virol. 45, 1074-1082, 1983; Imler etal., supra; viz také WO 94/28152). Nevýhodami těchto buněčných linií byla potřeba koexprese selekčního markéru a často nedostatečná stálost exprese EIA a EIB. Jelikož tyto buněčné linie jsou od počátku imortaliz.ované buněčné linie, exprese EIA a EIB není nezbytná pro přežilí buněčné linie, takže přírodní selekce EIA a ElB není v tomto případě nutná, na rozdíl od použití primárních bunčk.
to V minulosti byla příprava buněčné linie pro produkci adenovirovčho vektoru nebo pro produkci AAV vektoru spojena se zvláštními obtížemi. Humánní embryonální ledvinné buňky (HEK buňky) lze získat z buněk humánních fetů. To se provádí tak. že se vyjmou ledviny z fétu a ledvinné buňky se vloží do buněčné kultury. Transfekce bunčk HEK „rozstříhanou“ Ad5 DNA a následná integrace levého konce Ad5 DNA. a poté exprese genů EIA a EIB vedly k transformaci bunčk v jediném publikovaném případě. Tak byla tímto způsobem založena jediná buněčná linie (tj. 293 buňky) (Graham etal., supra; viz také část „Producentské buněčné linie“, sekce a). 293 buňky sc užívají k produkci adenovirových vektorů a AAV vektorů.
Humánní embryonální ret ino vc buňky (HER buňky) lze získat zoční bulvy humánních fétú. To io se provádí tak. že se vyjme oko z letu a buňky z retiny se vloží do buněčné kultury. Bylo možné transfekci HER bunčk adenovirovými geny EIA a EIB transformovat HER buňky (viz také část „Producentské buněčné linie, sekce b). Buňky transformované El A a EIB se mohou užívat k produkci adenovirových vektorů.
V obou uvedených případech je nezbytné vyjmout orgán z humánního fétu, který je získán bud'lo ze spontánního nebo terapeutického abortu, nebo z přerušení těhotenství ze sociálních důvodů, a pak z těchto orgánů založit buněčnou kulturu. Po zavedení primární kultury se mohou takové buňky transformovat metodou transfekce adenovirovými geny El A a EIB. Buněčné linie takto připravené a exprimujíeí EIA a EIB pak mohou být využity k produkci adenovirových vektorů nebo AAV vektorů.
Je jasné, že získání primární buněk z orgánů velmi obtížné. Jelikož primární kultury mohou být pouze z čerstvých tkání, pro získání vhodné tkáně fetů je založeny je třeba vynaložit značné logistické úsilí. Kromě toho, použití fetální tkáně získané buďto ze spontánních nebo terapeutíe55 kých abortů nebo z přerušení těhotenství ze sociálních důvodů přináší zvláštní etické požadavky
-6CZ 300124 Bó a nutnou péči při zakládání takových primárních kultur. Ačkoliv je laboratoř původců součástí gynekologické kliniky; kde se často provádí přerušení těhotenství, nebylo možné získat vhodnou tkáň po dobu delší než jeden rok. Odebrání tkáně z fétu po abortu vyžaduje prohlášení informovaného souhlasu těhotné ženy. Často bylo nemožné získat takový souhlas těhotné ženy pro odehrání orgánů poté, co byla detailně informována o výzkumném projektu, tj. o odebrání oka z létu pro vědecký lékařský výzkum.
Použití permanentní buněčné linie amniocytů pro produkci vektorů pro přenos genů neby lo dosud popsáno. Byly zmíněny pouze humánní amnioeyty, které byly transformovány opičím virem (SV40) a/nebo virem Kirstenova sarkomu (Sack, In Vitro 17 pp. 1-19. 1981; Walen, etal., In Vitro Cell Dcv. Biol. 22, 57-65, 1986). Infekce samotným SV40 vedla k prodloužené době života (tj. tzv. imortalizaci), zatímco infekce virem Kirstenova sarkomu nikoliv. Infekce oběma viry současně nakonec vedla ke vzniku buněk maligního nádoru (Walen a Arnstein, supra). V této souvislosti je třeba zmínil. SV40 transformovaná amnioeytová buněčná linie není vhodná pro produkci vektorů pro přenos genů. protože tyto buňky samy produkují SV40. který je znám jako onkogenní virus ((iraffney etal.. Cancer Res. 30. 871-879. 1970). Transforinovatelnost humánních buněk SV40 však neposkytuje žádnou informaci o transforniovatelnosti adenovirové El funkce a jejích použitelnosti pro produkci vektorů pro přenos genu. l ak např. keratinocyty se mohou transformovat SV40 (viz Sack, supra), avšak evidentně se nemohou, stejné jako kožní fibroblasty a hepatocyty. transformovat Ad 12 (Gallimore et al., 1986. supra). 7. hlediska produkce virových vektorů, zvláště adenovirových vektorů, v iniortalizovaných buňkách, to není jen imortalizovatelnost sama. co je důležité; jde také o dobrou možnost infekce a pak produktivní průběh této infekce. Tyto vlastnosti nelze předvídat, a otázka, zda konkrétní buněčný typ může být užit k produkci vektorů pro přenos genů musí být vždy nově vyřešena pro konkrétní buňky.
Podstata vynálezu
Cílem předkládaného vynálezu je proto poskytnout nový způsob účinné, jednoduché a snadno reprodukovatelné přípravy amniocytovc buněčné linie, a její použití, kromě jiného, pro produkci adenovirových vektorů. AAV vektorů, a retro víro vých nebo len ti víro vých vektorů.
Bylo zjištěno, a to zcela překvapivé, že transfekce buněk z amníotické tekutiny (amniocytů), která se rutinním způsobem získává při diagnostické biopsii (amnioeentéze) pro účely prenatální diagnostiky; adenovirovými geny EtA a EIB vedla k velkému počtu permanentních buněčných linií, které exprimovaly geny El A a EIB funkčně aktivním způsobem, a které byly vhodné pro produkci vektorů pro přenos genů.
Jeden aspekt předkládaného vynálezu je proto permanentní buněčná linie amniocytů obsahující alespoň jednu nukleovou kyselinu, která exprimuje genové produkty adenovirových úseků El A a EIB. Termín „permanentní buněčná linie znamená podle vynálezu, že odpovídající buňky byly nějak geneticky modifikovány, aby byly schopné růst permanentně v buněčné kultuře. Naproti tomu „primární buňky jsou buňky, které byly získány vyjmutím z organizmu a následně kultivovány a mají jen omezenou dobu života. Permanentní buněčná linie amniocytů pro potřeby předkládaného vynálezu mohou být připraveny způsobem popsaný zde, který obsahuje krok transfekce primárních amniocytů funkcí El adenovirus. Alespoň jedna nukleová kyselina, která vede k expresi produktu adenoviroveho genu El. může být jakákoliv vhodná nukleová kyselina nebo nukleová kyselina, která vede k trvalé expresi těchto genových produktů. Může být integrovaná v genomu buňky, tj. chromozomálně. neboje přítomna vně chromozómu, např. jako cpizomálně se replikující plazmid nebo mmichromozóm. Exprese různých genových produktů však může být způsobena jednou a toutéž molekulou nukleové kyseliny; nebo např. různými molekulami nukleové kyseliny. Termín „exprese“ znamená ve stavu techniky způsob produkce genového produktu, kterým je specifický protein, který způsobuje specifický znak nebo specifickou vlastnost, nebo produkce forem RNA, které nejsou translatovány do proteinů (jakoje např. antisense RNA nebo tRNA). Vhodné možnosti, jak dosáhnout požadované exprese, budou odboru í-7CZ 300124 B6 kovi jasné na základě předkládaného popisu, a zejména na základě navrženého postupu. Nová arnniocytová buněčná linie je vhodná nejen k produkci vektorů pro přenos genů v obec něm smyslu, ale také konkrétně pro produkci adenovirovýeh vektorů první generace, které jsou charakteristické delecemi genů E1A a E1B, které jsou komplcmentovány buněčnou linií.
Alespoň jedna nukleová kyselina také výhodně způsobuje expresi genových produktů adenov i rových E2A, E2B a/nebo E4 úseků a/nebo Cre rekombinázy. To činí buněčnou linii zvláště vhodnou pro produkci adenovirovýeh vektorů druhé generace, které jsou charakteristické delecemi E2 a/nebo E4gcnů kromě deleci genů El A a E1B. Exprese Cre rekombinázy bakteriofága Pl je zvláště výhodná v produkci adenovirovýeh vektorů s velkou kapacitou pomocí El A- a E1Bdeletovaného pomocného viru (viz také Parks etal., supra; Hardy etal., supra). Exprese genových produktů úseku El A je výhodné pod kontrolou konstitutivního promotoru, výhodně promotoru fosfoglyccrátkinázy (PGK). Výhodné je pro expresi genových produktů úseku El B, jestliže je pod kontrolou adenovirového promotoru, výhodně adenovirového E1B promotoru. Možnou alternativou je využit, například eytomegalovírový(CMV) promotor. Všechny adenovirové genové produkty např. výhodně humánního pocházejí z adenoviru stejného subrodu, adenoviru typu 5 (Ad5). Permanentní buněčná linie amniocytů je normálně humánní buněčná linie, protože je pak zvláště vhodná pro produkci vektorů pro přenos genů pocházejících z humánních virů, jak jc například humánní adenovirus nebo humánní AAV.
Možnou alternativou je také buněčná linie z primátů nebo jiných savců, například krávy, která je zvláště vhodná pro produkci vektorů pro přenos genů pocházejících z virů vyskytujících sc endemieky u daného živočišného druhu. Například permanentní buněčná linie amniocytů získaná transformací amniocytů geny El A a E1B hovězího (bovinního) adenoviru jsou vhodné pro produkci vektorů odvozených z bovinního adenoviru.
Další aspekt předkládaného vynálezu jc způsob přípravy permanentní buněčné linie amniocytů konkrétně amnioeytové buněčná linie jak byla definována výše, přičemž tento způsob zahrnuje transfekci amniocytů alespoň jednou nukleovou kyselinou, která způsobuje expresi adenovirových genových produktů úseku El A a úseku El B. Výsledné buněčné klony se dále izolují, a je-li to třeba, klonují se dále pro získání jediné buněčné linie. Termín „transfekce znamená v tomto popisu jakýkoliv způsob vhodný k vnesení nukleové kyseliny (nukleových kyselin) do buňky. K příkladům, které lze zmínit, patří elektroporace. lipozomové systémy a jakákoliv kombinace těchto způsobů. Termín „amniocyty znamená v tomto popisu v širším smyslu všechny buňky, které jsou přítomně v amniotické tekutině a mohou být tedy získány biopsii amniotické tekutiny. Pocházejí buďto zamnionu, nebo fatálních tkání, které jsou v kontaktu s amniotiekou tekutinou. Byly popsány tři hlavní třídy amniocytů, které se rozlišují na základe morfologie kých kritérií: fibroblastům podobné buňky (F buňky), epiteloidní buňky (E buňky) a buňky amniotické tekutiny (AE buňky) (Ilohn et al., Pediat. Rcs. 8, 746-754, 1974). AF buňky představují hlavní buněčný typ. V úzkém smyslu proto zde termín „amniocyty označuje amniocyty typu AE. Výhodně se užívají primární amniocyty. Buňky označované jako „primární“ buňky jsou takové buňky, které mohou být získány odebráním z organizmu a kultivovány v buněčné kultuře, avšak mají jen omezenou dobu života, zatímco tzv. „permanentní buněčné linie jsou schopné pokračovat v růstu neomezeně. Je zvláště výhodné v této souvislosti použít humánní primární amniocyty, které vedou k vytvoření humánní buněčné linie (viz výše). Avšak je také možné užít primární amniocyty z primátů a dalších druhů savců, např. krav. Na základě předloženého popisu je odborníkovi jasné, že pro vytvoření vhodné permanentní buněčné linii je možné analogicky užít buňky, které se mohou získat z amniotické membrány, např. trypsinizací, nebo biopsii thoriových klků.
Alespoň jedna nukleová kyselina, která způsobuje expresi adenovirovýeh produktů El genu je genomieká DNA. cDNA, syntetická DNA, RNA a nebo mRNA. Nukleová kyselina se výhodně užívá ve formě DNA expresního vektoru. K příkladům patří integrativní vektory, bakteriální plazmidy, epizomálně se replikující plazmidy nebo íninichromozómy. Výhodná je exprese plazmidu, jejíchž integrace do genomu recipientní (příjemcovské) buňky se provede transfekci, Termín „alespoň jedna nukleová kyselina vyjadřuje skutečnost, že elementy, které způsobují expreC.7. 300124 Bó si, mohou být přítomny na jedné a téže nukíeové kyselině nebo na několika různých nukleových kyselinách. Například se mohou připravit separátní nukíeové kyseliny pro expresi genových produktů ΓΙΑ, E1B. E2A. E2B a/nebo E4 úseků a/nebo Cre rekombinázy. laké si lze představit, že amniocyty. které mají být transfekovány. již exprimují jeden z těchto genových produktů, takže je třeba vyvolat jen expresi dalšího (dalších) genového produktu (produktů), nebo že exprese jednoho nebo více těchto genových produktů je spuštěna pouhým vnesením vhodných regulačních elementů. Vhodné metody a způsoby přípravy a mutageneze nukleových kyselin, genové exprese a proteinových analýz jsou odborníků snadno k dispozici (viz například Sambrook. J. etal., Molecular Cloning: A Laboratory' Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989): io Glover, D. M., DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. II: Exprese Systems, 1RL Press (1995): Ausubel etal.. Short Protocoís in Molecular Biology. John Wiley & Sons (1999); Rees, A. R. etal.. Protein Engineering: A Practical Approach, 1RL Press (1993)). Je výhodné pro genový produkt nebo genové produkty úseku Ll A, aby byly exprimovaný pod kontrolou konstitutivního promotoru, konkrétně promotoru fosfoglyeerátkinázy (PGK), a pro genové produkty úseku LIB, abv byly exprimovaný pod kontrolou adenovirového promotoru, konkrétně adenovirového EIB promotoru. Namísto adenovirového promotoru je laké možné užít například eytomegalovirový (CMV) promotor.
Ve zvláštním provedení transfekce amniocytů a/nebo výsledné buněčné linie navíc způsobuje expresi genových produktů adenovirovových úseků Γ2Α a/nebo Γ2Β a/nebo E4 a/nebo Cre rekombinázy. Všechny tyto možnosti již byly dříve diskutovány nebo popsány ve stavu techniky a jsou tedy odborníkovi dostupné. Pokud jde o jednotlivé geny, odkazujeme na další dostupné informace, a sice: L2A: Gen bank přírůst, číslo M 73260; Kruiyer et aI., Nucl. Acids Res. 9. 44394457. 1981; Kruiyer etal., Nucl. Acids Res. 10, 4493^1500, 1982. E2B: Genbank přírůst.
číslo M73260; Dekker etal.. Gen 27, 115-120, 1984; Shu et al.. Virology 165. 348-356. 1988. E3: Genbank přírůst, číslo M73620; Cladaras etal., Virology 140. 28 43. 1985. E4; Genbank přírůst, číslo M73620 a D12587; Virtanen etal., J. Virol. 51^822-831, 1984; Dix etal.. J.Gen. Virol. 73, 2975-2976, 1992. Čtecí rámce jsou v některých případech známé jen pro Ad2 a mohou být obvykle přiřazeny na základě srovnání sekvencí, např. V případě Ad5. Cre rckombináza:
so Genbank přírůst, cisto X034 5.3; Sternberget ak. J. Mol. Biol. 187. 197-212, 1986.
A děno v i rove genové produkty výhodné všechny pocházejí / jednoho konkrétního adenovirového sérotypu. konkrétně z humánního adenovirů typu 5 (Ad5). Konkrétní adenovirovový sérotyp, ze kterého pocházejí geny El A a EIB použité pro transformaci amniocytů. není kritickým faktorem předkládaného vynálezu. K příkladům adcnovirových sérotypu, které se mohou užít v předkládaném vynálezu ajsou známy ze stavu techniky, patří více než 40 humánních sérotypu. například Ad 12 (podrod. ..subgenus“ A), Ad.3 a Ad7 (podrod B). Ad2 a Ad5 (podrod C), Ad8 (podrod D), Ad4 (podrod E), Ad40 (podrod E)(Wigand etal., in: Adenovirus DNA. Doerfler, ed., Martinus Nijhoff Publishing, Boston, pp. 408—441, 1986). Ve výhodném provedení předkládaného vynále40 zu adenovirové vektory pocházející z podrodu C jsou produkovány transformací amniocytů geny ΕΙΛ a EIB, které pocházejí / adenovirů stejného podrodu. Například adenovirové vektory sérotypu 2 nebo 5 jsou produkovány transformaci geny Ε1Λ a EIB sérotypu 2 nebo 5. Adenovirové vektory založené na Ad 12 jsou produkovány transformací geny LI A a Ll B z Ad 12 etc. K produkci non-humánních adenovirových vektorů, kam patří známé adenoviry pocházející z hovězího dobytka, ovcí. prasat a dalších savců, se amniocytové buněčné linie připravují transformací buněk konkrétního biologického druhu. To jc obvykle nutné, protože adenovirové funkce zpravidla nemohou být mezidruhově účinně komplementovány.
Vc zvláštním provedení předkládaného vynálezu, amniocyty získané pro diagnostické účely so v rámci prenatální diagnostiky biopsii amniotické tekutiny a již více nepotřebné pro diagnostické účely byly transfekovány expresním plazmidem. který exprimoval geny El A a Ll B z Ad5. Tento konstrukt byl připraven tak, aby gen El A byl pod kontrolou myšího fosforglycerátkinázového promotoru, a gen LIB byl pod kontrolou přirozeného adenovirového LIB promotoru. Přirozené sestřihové akceptorové místo EIB a LIB polyadenylační sekvence byly nahrazeny odpovídající55 mi sekvencemi viru SV40. Několik týdnů po transfekci plazmidovou DNA byl pozorován velký
-9CZ 300124 B6 počet buněčných klonů, a ty byly izolovány, klonovány, byly z nich založeny imortalizované buněčné linie a nakonec byly analyzovány. Všechny analyzované buněčné klony exprimovaly proteiny EIA a E1B. Bylo ukázáno, pomocí infekce El-deletovaný β-gal-exprimujícím adenovirovým vektorem a následný obarvením, že všechny tyto buňky mohou být infikovány. Infekční experimenty s El-deletovanými adenovirovými vektory první generace vedly k odhalení toho. že buněčné linie jsou vhodné pro produkci adenovirových vektorů. V těchto experimentech byly nejdříve buněčné linie infikovány β-gal-exprimu jícím adenovirový vektorem první generace. Po 48 až 72 hodinách, když se na buňkách projevil cytopatický účinek (CPE), byly buňky sklizeny a adenovirový vektor byl uvolněn z buněk třikrát opakovaný zamražením a roztát ím buněk. Část io buněčného lyzátu byla užita buněk 293 a pak byla exprese β-gal detekován histochcmicky přibližně 24 hodin po přenosu genu. Bylo tak možné určit přímo z počtu β-gal požit i vních buněk výtěžek produkce vektoru v jednotlivých buněčných liniích. Amniocytové buněčné linie se mohou takto získat bez. obtíží a reprodukovatelnč a jsou velmi vhodné pro produkci vektorů pro přenos genů. Některé z takto izolovaných buněčných linii dovolují, adenovirové vektory byly produkovány stejné dobře nebo lépe než v buňkách 293. Podle očekávání buněčné linie vykazovaly rozdíly v produkci rekombinantního adenoviroveho vektoru (viz Obr. 4). Buněčné linie N52. E6 a N52. F4 se odlišovaly rychlým růstem a zvláště dobrou produkcí adenovirových vektorů, což jsou výhodné vlastnosti pro použití těchto buněčných linií pro produkci vektorů pro přenos genů.
Konstrukce EIA- a ElB-exprimuj ících expresních plazmidu použitých pro transformaci amniocytů vylučuje vytvoření replikačně-kompetentních adenoviru (RCA) homologní rekombinací adenoviroveho vektoru nebo adeno virového pomocného viru s DNA integrovanou do transformovaných amniocytů. na rozdíl od buněk 293. Alternativně mohou být jednotlivé El funkce vneseny různými expresními plazmidy, které se transformují do buňky, která má být transfekována. Je samozřejmě také možné, stejně jako u buněčné linie 293, provést transformaci amniocytů a testovat jednotlivé várky produkovaných vektorů pro přenos genů na obsah RCA, např. pomocí PCR nebo testem infekčnosti. Várky obsahující RCA se pak likvidují, je-li to třeba.
in Další aspekt předkládaného vynálezu se týká permanentní buněčné linie amniocytů, která sc může připravit způsobem podle předkládaného vynálezu. Ve specifickém provedení se vynález týká permanentní buněčné linie amniocytů N52.E6. která byla uložena 26. října 1999 v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur (Deutsche Sammlung von Mikroorganismcn und Zelikulturen GmbH (DSM/)) v souladu s Budapešťskou smlouvou pod přírůstkový číslem DSM
ACC24I6.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká použití amniocytů pro produkci adenovirem-transformo váných permanentních buněčných linií amniocytů. Termín ..adeno v i rem-trans formovaná znamená v tomto popisu transformaci jedním nebo více transformujícími adenovirovými geny, „Transformace se v této souvislosti týká přeměny linie eukaryotických buněk, která podléhá kontrole růstu, na tzv. permanentní buněčnou linii, která roste neomezené. A dalším aspektem předkládaného vynálezu je použití adenovirových genových produktů EIA a E1B úseků pro produkci permanentní buněčná linie amniocytů.
Předkládaný vynález se dále týká použití permanentní buněčné linie amniocytů pro produkci vektorů pro přenos genů. „Vektor pro přenos genu zde označuje obecné všechny vektory, s jejichž pomocí se jeden nebo více terapeutických genů může přenést nebo vnést do požadované cílové buňky, a konkrétně virové vektory mající tyto vlastnosti. Navíc permanentní buněčná linie amniocytů může být užita k produkci adenovirových mutanl. „Adenovirové mutanty označují adenoviry, které mají alespoň jednu mutaci v genu EIA a/nebo El B. Ve výhodném provedení, na rozdíl od adenovirových vektorů pro přenos genů, nenesou žádné terapeutické geny. Typickým příkladem je adenovirová mutanta, ve které El B protein velikosti 35 kD není exprimován (např, adenovirová mutanta <7/1520, viz Barker etal.. Virology 156. 107-121. 1987). Adenovirová mutanta, ve které E1B protein velikosti 55 kD není exprimován je velice zajímavá pro terapii ?5 onkologických onemocnění, protože virová mutanta sc replikuje výlučně v nádorových buňkách
- 10C7. 300124 Bó a vůbec ne a nebo v zanedbatelné míře v primárních normálních buňkách (Bischoff et al..
Science 274, 373-376, 1996; Kirn et al.. Nátuře Med. 4, 1341-1342. 1998).
Výhodný provedením vynálezu je použití permanentní buněčné linie amniocytu pro produkci adenovirových vektorů, AAV (adeno-asociované viry) vektorů, retrovirových vektoru, lent i virových vektorů, chimérických vektorů adenovirus-AAV, chimérických vektorů adenovirus-retrovirus a/nebo chimérických vektorů adenovirus-lenti virus. Použití pro produkci vektorů z herpetiekých v irů je také možné.
ío AAV vektory normálně obsahují pouze úseky ITR z AAV a nějaké sousedící nekódující AAV sekvence. Jejich kapacita pro příjem cizorodé DNA je asi 4,5 kb. Jak bylo již zmíněno výše, pro produkci rekombinantních AAV vektorů existují různé systémy. Všem těmto systémům je společné to, že poskytují všechny složky nezbytné pro replikaci, expresi a sbalení rekombinantního vektoru. Specificky obsahují expresní kazety, které kódují AAV proteiny rep a cap, a ad en οι 5 virové pomocné funkce. Adenovirové pomocné funkce nezbytné pro produkci AAV jsou geny El A. El B, E2, E4 a VA. Funkce El A a E1B poskytují El A- a El B—exprimující amniocytové buněčné linie a mohou tudíž byl použity k produkci AAV vektorů, f unkce E2. E4 a VA lze poskytnout koinfekcí adenovíreni nebo kotransfekcí E2-, E4- a VA -exprimujícími plazmidy nebo užitím hybridních vektorů adenovirus/AAV nebo herpes simplex virus/AAV (Samulski et al., supra: Allen et al., supra: Tamavose et al.. supra: Flotte et al.. supra: Conway et al.. supra: Chiorini et al., supra: Ferrari et al., supra: Salvetti et al.. supra: Xíao et al.. supra: Grimin et al., supra: Zhang et al.. supra).
Retrovirové vektory, čili vektory odvozené z retrovirů, mají obdobně velký význam jako nosiče pro transfekci v rámci genové terapie, např. pro genovou terapii centrálního nervového systému (Suhr etal., Arch. Neurol. 56, 287-292, 1999). Retrovirové vektory' mohou být produkovány ve stabilních vektor-produkuj íeích buněčných liniích nebo využitím přechodné (trans ientní) transfekce. Jednotlivé složky užité k produkci retrovirových vektorů normálně zahrnují jeden nebo více plazmidu, které exprimují strukturní proteiny a replikační a integrační proteiny, a také plaz30 mid. který obsahuje vektor samotný (Miller. in:. Retroviruses. Coffin, Hughes. Varmus ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1997. pp, 437-473). Jestliže jsou užily tyto plazmidy, které obsahují replikační počátek, jako je např. replikační počátek SV40, amníoeytové buněčné linie jsou módili kovány tak. aby proteiny, které podporují replikaci plazmidu, byly trvale exprimo vány. Například v případě piazrnidů, které obsahují replikační počátek SV40. se užívá amniocytová buněčná linie, která exprimuje T antigen SV40.
Eentivirové vektory jsou vektory odvozené z lentivirů (Naldini etal., Science 272, 263-267, 1996; Duli etal.. J. Virol. 72, 8463-8471. 1998). Eentivirové vektory mohou být produkovány v trvalých vektor-produkuj íeích buněčných liniích nebo pomocí přechodné transfekce.
..Chimérické vektory jsou vektory, které jsou výsledkem fúze nukleové kyseliny ze dvou nebo více různých virových vektorů. Permanentní buněčná linie amniocytu může být užita podle předkládaného vynálezu také pro produkci chimérických vektorů. V takovém systému například adenovirový' vektor, výhodně adenovirový vektor s velkou kapacitou, nese DNA fragment, který má také sekvenční informaci integrujícího viru. která pochází například / retroviru nebo AAV. Po transkripci v cílové buňce je integrující se virus nesoucí terapeutický gen uvolněn z adenovirovčho základu {např. v případě rctrovirovcho inzertu vytvořením infekčních retrovirových částic, které transdukují sousední buňky a integrují se trvale ve formě DNA). Příklady chimérických vektorů produkovaných v buňkách 293 byly popsány již dříve, např. jako chimérický) vektor adenovirus-retrovirus (Feng etal.. Nátuře Biotecli. 15, 866-870, 1997) a chimérický vektor adenovirus-AAV (Reechia et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96, 2615-2620, 1999). Produkce v El A a E1B exprimující amnioeytovc buněčné linii je však výhodná, neboť zde, na rozdíl od buněk 293. nemohou vznikat replikaěně-kompetentní vektory homologní rekombinací.
Q1 300124 B6
Adenovirové vektory; tj. vektory odvozené z adenovirů, jsou velmi důležité, a to konkrétně jako nosiče pro transfekci pro genové terapie. Adenovirové vektory mohou být adenovirové vektory první generace, adenovirové vektory' druhé generace, adenovirové vektory s velkou kapacitou pro
DNA a/nebo de letované adenovirové vektory, které jsou produkovány pomocí permanentní buněčné linie amnioeytů.
a) Produkce adenovirových vektorů první generace
Adenovirové vektory první generace jsou obvykle charakterizovány deleeemi genů El A a E1B, io Některé adenovirové vektory první generace obsahují, kromě deleeí genů El A a E1R, obsahují navíe delece úseku E3. E3 funkce je postradatelná pro růst adcnovirových vektorů v buněčné kultuře.
Adenovirové vektory první generace mohou být produkovány v El A a El B exprimující amnio15 eytové buněčné linii. To se provádí infikováním El A- a El B-cxprimujících buněk výhodně infekcí o síle 3 až 5 infekčních jednotek na jednu buňku (3 až 5 MOI)· Po době přibližně 36 až 72 hodin se na buňkách projeví eytopalický účinek. Buňky se pak sklidí standardními postupy. Adenovirovové vektory pak mohou být purifikovány na hustotním gradientu CsCl centrifugací nebo chromatografíckými metodami.
b) Produkce adcnovirových vektorů druhé generace
Adenovirové vektory druhé generace jsou charakteristické deleeemi genů El A a ΙΊΒ. Některé adenovirové vektory druhé generace také obsahují deleci úseku E3. Kromě deleci genů El A a
El B, adenovirové vektory' druhé generace jsou eharakteristieké inaktivací a výhodně deleeí alespoň jednoho dalšího esenciálního adenovirového genu, např. genu E2A, genu E2B a/nebo genu E4. nebo například deleeemi funkce E2v kombinaci s deleeemi funkce E4.
K produkci adenovirových vektorů druhé generace je třeba, aby funkce, kterou vektor sám neexso primuje. buďto v důsledku inaktivace a/nebo delece, byla poskytnula amniocytovou buněčnou linií. Pro tento účel mohou být amniocytové buněčné linie, které trvale exprimují lil A a E1B stabilně modifikovány transfekci expresní kazety, která exprimuje genové produkty kód ujíeí jednu nebo více dalších adenovirových funkcí. Například k produkci druhé generace adeno virových vektorů, které mají, navíc k deleci genů El A a E1B, také deleci E2A, E2B a/nebo E4 genu.
se vhodný gen nebo geny vnesou transfekci společně se selekčním markérem do El A a EI Bexprimujteí amniocytové buněčné linie. Buněčné klony, které navíe k expresi funkcí El A a E1B také exprimují Ε2Λ, E2B a/nebo E4 funkce, pak mohou být užity k produkci vektorů druhé generace. Oeny E2 a/nebo E4 jsou obvykle pod transkripčni kontrolou heterologniho promotoru, které je buďto konstitutivně aktivní, nebo může být regulován.
e) Produkce adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA
Adenovirové vektory s velkou kapacitou pro DNA jsou charakteristické deleci většiny nebo do konce všech virových kódujících sekvencí. Tyto vektory výhodně obsahují jen virové úseky ITR a virový sbal o vac i signál. Adenovirové funkce poskytuje pomocný virus v trans. Byly popsány různé systémy pro produkci adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA. Společným rysem všech těchto systémů dosud popsaných a užívajících pomocný virus jc to, že pomocný virus odpovídá replikacnč defektnímu El A- a ElB-deletovanému adenoviru. Pomocný virus obsahuje buďto úplný sbalovací signál (Mitani etaf, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 3 85450 3 858, 1995; Fisher el al.. Virology 217. 11 22. 1996; Kumar-Singh a Chamberlain, Hum. Mol.
Gent. 5. 913-921. 1996) nebo mutovaný sbalovací signál (Kochanek et al.. Proč. Nati. Acad. Sci.
U.S.A. 93. 5731-5736, 1996). Ve druhém z uvedených příkladů je vektor výhodně sbalován do virových kapsid, protože pomocný virus obsahuje zeslabený sbalovací signál a tudíž je sbalován í méně účinné. Alternativně je sbalovací signál pomocného viru „vystřižen“ pomocí rekombinázv po infekci producentské buněčné linie (Parks etal.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 13 565
C.Z 300124 Bó
570. 1996; Hardy et al , J. Virol. 71, 1842-1849, 1997). Například sbalovací signál pomocného viru může sousedit s loxP rozpoznávací sekvencí bakteriofága Pl. Exprese Cre rekombinázy bakteriofága Pl pak vede k vystřižení sbalovacího signálu pomocného viru. Avšak / důvodu absence sbalovacího signálu pak nedochází ke sbalování pomocného viru do kapsidy. Cíen pro
Cre rekombinázu z bakteriofága Pl se vnese transfekcí společně se selekčním markérem do El A- a El B-exprimující amniocytové buněčné linie. Buněčné klony, které navíc k expresi funkcí El A a E1B také exprimují funkci Cre bakteriofága Pl mohou býl využity k produkci vektorů s velkou kapacitou pro DNA,
d) Produkce „deletovaných adenovirových vektorů „Del eto vane adenovirové vektory byly popsány jako vektory první generace, které mají loxP rozpoznávací sekvenci bakteriofága Pl umístěnou ve virovém genomu takovým způsobem, že po infekci Cre-exprimující 293 buňky, většina virových kódujících sekvencí nebo do konce všechny virové kódující sekvence jsou deletovány rekombinací mezi loxP rozpoznávacími sekvencemi. Velikost genomu těchto vektorů je přibližně 9 kb. Kapacita pro příjem cizorodé DNA je obdobně přibližné 9 kb (Lieber et al.. J. Virol. 70, 8944 -8960, 1996). Pro použití k produkci dclctovaných adenovirových vektorů se gen (Ve rekombinázy z bakteriofága Pl vnese transfekcí společně se selekčním markérem do El A- a El B-exprimujíci amniocytové buněčné linie. Buněčné klony.
které navíc k expresi funkcí El A a El B také exprimují funkci Cre bakteriofága Pl se pak využiji k produkci dclctovaných Ad vektorů.
e) Produkce vektorů pro přenos genů s modifikovaným trop ismem
Ve výhodném provedení vynálezu permanentní buněčná linie amnioeytů se užívá k produkci vektorů pro přenos genů, přičemž tyto vektory mají modifikovaný tropi sinus. Trop i sinus viru a z něho odvozeného virového vektoru rozhoduje o tom, zda buňka určitého typu může býl vektorem transdukována nebo nikoliv. Příjem (vstup) vektoru pro přenos genů do buňky je prvním krokem pro úspěšný genový přenos do buňky, krop ismus virového vektoru je tak esenciálním so faktorem pro účinný in vitro nebo in vivo genový přenos do konkrétních buněk nebo tkání. Interakce povrchu virového vektoru (kapsidy v případě adenovirovového nebo AAV vektoru, virové „obálky v případě relrovirového nebo lentivirovového vektoru) s buněčnou membránou cílové buňky je nezbytná pro vstup do buňky. Ačkoliv přesný mechanismus vstupu virového vektoru do cílové buňky se někdy liší pro různé vektory, ve všech případech hraje nezbytnou úlohu interakce povrchových struktur virového vektoru (obvykle proteinové ligandy) se strukturami na povrchu cílové buňky (obvykle receptory nebo adhezní molekuly). K příjmu adenovirových vektorů dochází například endoeytózou zprostředkovanou receptorem. To znamená, že část adenovirové kapsidy se váže na buněčné receptory. V případě adenovirových vektorů odvozených z Ad2 nebo Ad5, podle znalosti stavu techniky, jde obvykle o vazbu „kulovité“ {„knob) domény vláknitého proteinu na receptor coxsackie adenoviru (CAR) a část pentonové báze na integriny ανβ3 nebo (ζνβ5. Vazba „knob domény na CAR je podle znalostí stavu techniky nezbytná pro adhezi vektoru k buněčné membráně cílové buňky, zatímco vazba pentonové báze k integrinům je nezbytná pro internalizaei vektoru do cílové buňky.
Amniocytové buněčné linie mohou být využity k produkci vektorů s modifikovaný trop ismem. To platí například pro produkci adenovirových vektorů první a druhé generace, adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA, de letovaných adenovirových vektorů, chimérických adenov i rových vektorů, AAV vektorů, retro v i rových a/nebo lentiv i rových vektorů. K produkci vektorů s modifikovaný Iropismem v amniocytové buněčné linii mohou být užity různé strategie.
5o Přitom strategie pro konkrétní modifikaci trop i sinu se mohou lišit pro různé vektory (např. adenovirovové vektory', AAV vektory, retrovirovové vektory). Společným rysem těchto strategií je to. že povrch konkrétního vektoru (virové kapsidy v případě adenovirových a AAV vektorů, virové obálky v případě retro v irovo vých a ientivirových vektorů) jc změněn tak. že takc vazba vektoru k cílové buňce je změněna. K příkladům modifikací adenovirových vektorů patří;
.1 CZ 300124 B6
a) Výměna vláknitých proteinů mezi různými sérotypy: tak vznikají adenovirové vektory, jejíchž kapsida nese vláknitý protein odlišného sérolypů. K příkladům patří záměna přirozeného vláknitého proteinu adenovirových vektorů odvozených ze sérotypu 2 vláknitým proteinem pocházejícím ze sérolypů 17 (Zabner et ak, J. Virol, 73, 8689 8695, 1999) nebo ze sérotypu 9 (Roelvink et al., J. Virol, 70, 7 614-7 621, 1996), K dalším příkladům patří záměna přirozeného vláknitého proteinu adenovirových vektorů odvozených ze sérotypu 5 vláknitým proteinem pocházejícím ze sérotypu 7a (Gall etal., .1. Virol, 70, 2116-2123. 1996) nebo ze sérotypu 3 (Stcvenson et al., J. Virol. 71. 4782-4790, 1997; Krasnykh et al.. J. Virol. 70. 68396846, 1996; Douglas el al., Neuromuscul. Disord. 7, 284-298, 1997).
io
b) Odstranění vláknitého proteinu: vláknitý protein může být odstraněn metodami genového inženýrství, takže pak k příjmu vektoru do buňky dochází výlučně prostřednictvím interakce pentonové báze nebo hexonového proteinu (Ealgout etal.. J. Virol. 62. 622-625. 1988; Legrand et al., J, Virol. 73. 907 919, 1999).
c) Modifikace C konce vláknitého proteinu peptidem: k příkladům patří modifikace C konce polylysinovým peptidem (Yoshida etal., Hum. Gen Ther. 9. 2503-2515. 1998: Wickham etaLNat. Biotechnol. 14, 1570-1573. 1996; Wickham et al., J. Virol. 71. 8221-8229. 1997), polyhistidinový peptidem (Douglas et ak. Nat. Biotechnol, 17, 470-475. 1999) nebo gastrin20 uvolňujícím peptidem (Michael et ak. Gen Ther. 2, 660-668. 1995).
d) Modifikace částí „knob“ domény vláknitého proteinu inzercí (vložením) peptidu: k příkladům patří inzerce epitopu FLAG (Krasnykh etal., J. Virol. 72, 1844-1852. 1998) nebo inzerce peptidu RGD (Dmilriev etal.. J. Virol. 72. 9706-9713. 1998; Kasono etal., Clin Cancer
Res. 5,2571-2579, 1999).
c) Modifikace pentonové báze; jedním příkladem jc nahrazení motivu RGD v pentonové bázi motivem kDV s cílem zprostředkovat navázání vektoru na integriny α4βΙ (Wickham etal.. Gen Ther. 2. 750 756. 1995).
f) Modifikace hexonového proteinu: jedním příkladem je inzerce epitopu pocházejícího z polioviru typu 3 (Crompton et ak, J, Gen. Virol. 75. 133 139, 1994).
Alternativní strategie, která může být užita ke změnění trop i sinu vektorů produkovaných 55 v amniocytovc bunččné linii je založena na použití Iigandu, kleré zprostředkovávají vazbu vektoru na struktury buněčné membrány, jako jsou například buněčné receptory nebo adhezní molekuly. Tyto ligandy jsou peptidy, proteiny nebo protilátky. Ligandy mohou být navázány na povrchu vektorů různými způsoby. Navázání Iigandu na povrch vektorů (kapsidy v případě adenovirovovcho nebo AAV vektoru) lze provést užitím protilátek nebo chemickým zesítěním („crosslinking). Při použití protilátek je možné užít takové protilátky, jejíchž spéci fícita je namířena proti kapsidě vektoru (např. proti „knob“ doméně vláknitého proteinu). Alternativně, je možné užít protilátky, jejíchž specificita je namířena proti epitopu, který byl vložen jako ncocpitop (např. epitop FLAG nebo epitop tnyc) do kapsidy vektoru. Příklady jsou odborníkům dobře známy. Tak v publikaci Wickham et ak, J. Virol. 70, 6831-6838, 1996 (anti-FLAG/anti45 a-integrin); in Wickham etal., Cancer Immunol. Immunther. 45, 149-151, 1997; Harari etal..
Gen I her. 6, 801 807, 1999 (anti-FLAG/anti-E-selectin) byly popsány příklady použití bispecifickč protilátky pro transdukci endotelových buněk, v publikacích Miller etal.. Cancer Res. 58, 5738-5748, 1998; Blackwell etal,. Arch. Otolaryngol. liead Neck Surg. 125. 856-863, 1999 (anti-Ad/anti-EGFR) pro transdukci nádorových buněk; v publikaci Wickham et ak, J. Virol. 71,
7 663-7 669, 1997 (antí-FLAG/anti-CD3) pro transdukci T lymfocytů; v publikaci Tillman etal., J. Immunol. 162, 6378-6383, 1999 (anti-CD40/anti-Ad) pro transdukci dendritiekýeh buněk. Příklady použití jednořetězcové protilátky se speeifieitou k jedné determinantě virové kapsidy. která je navázána k Iigandu, byly popsány v publikacích Watkins et ak, Gen Ther. 4,
1004 1012, 1997; in Goldman etal., Cancer Res. 57, 1447-1451, 1997; Rancourt etal., Clin.
Cancer Res. 4. 2455 2461, 1998; Gu et ak. Cancer Res. 59, 2608-2614, 1999; Rogers el ak. Gen
- 14 C'Z 300124 B6
Ther. 4, 1387-1392. 1997 (anti-Ad/FGE2) popisujících transdukci nádorových buněk exprimujících FGF2-receptor; v publikacích Douglas etal.. Nat. Biotechnol. 14. 1574-1578, 1996; Douglas et al.. Ncuroniuscular Disord. 7. 284-298, 1997 (anti Ad/Folat) popisujících transdukci nádorových buněk, které exprimovaly reeeptor kyseliny listové na buněčném povrchu.
V případě vektorů pro přenos genů. u kterých byl zrušen původní přirozený trop ismus a byl nahrazen jiným tropismem, např. vložením ligandu do ..knob domény vláknitého proteinu zAd5. je nutné modifikovat permanentní buněčnou linii amnioeytů výhodně tak. aby trvale cxprimovaía reeeptor, který rozpoznává tento nový íigand (Douglas el al., Nal. Biotechnol. 17. io 470-475, 1999). Je obdobně možné, aby sc permanentní buněčná linie amnioeytů užila k produkci vektorů pro přenos genů. které mají defekt v produkci jednoho nebo více strukturních proteinů. K lomu se užije komplementace konkrétních defektů vektoru pro genový přenos permanentní buněčnou linií amnioeytů. Například adenovirové vektory, které mají mutaci v genu kódujícím vláknitý protein, mohou být produkovány v amniocytová buněčné linii, která komple1? mentu je defekt vláknitého proteinu. Toho je dosaženo vnesením expresní kazety pro vláknitý protein do amniocytové buněčné linie a trvalou nebo indii kováte lnou expresí vláknitého proteinu v amnioeyíové buněčné linii (Von Seggern ct al., J. Gen. Virol. 79, 1461 1468. 1998). Vláknitý protein exprimovaný v amniocytové buněčné linii je přirozený, nemodifikovaný vláknitý protein nebo změněný protein, např. vláknitý protein s modifikovaným tropismem (Von Seggern etal.,
2«) supra). V permanentní buněčné linii amnioeytů je také možné produkovat adenovirové vektory zcela postrádající vláknitý protein (Legrand etal.. J. Virol.. 73. 907-919, 1999; Von Seggern etal.. J. Virol/73, 1601-1608, 1999).
Použití El A- a E1B—exprimující amniocytové buněčné linie je výhodné, protože na rozdíl od buněk 293, nedochází k vytváření replikačně-kompetentních vektorů homologní rekombinaci. Ve zvláštním provedení vynálezu je pro produkci vektorů pro přenos genů použita amniocytová buněčná linie přičemž je to buněčná linie podle předkládaného vynálezu.
Terapeutické geny
51)
Produkty genu. konkrétně produkty terapeutických genů. které mohou být kódovány a exprimovány pomocí vektorů, produkovaných v transformovaných amniotických buňkách, čili v permanentní amniotické buněčné linii, jsou např. jakékoliv protein svalů, koagulaéní faktory, membránové proteiny nebo proteiny buněčného cyklu. K příkladům proteinů, které mohou být exprimo55 vány vektory produkovanými v transformovaných amniocytech patří dystrofin (Hoffman etal.. Cell 51.919, 1987). faktor Vlil (Wion et al.. Nátuře 3! 7, 726 1985). transmembránový regulátorový protein cystické fíbrózy (CFTR) (Anderson etal., Science 251, 679, 1991). ornitintranskarbamyláza (OTC) (Murakami etal,, ,1. Biol, Chem.. 263, 18 437, 1988), alfa 1 - antitrypsin (Eagerhol et al.. in; Hum. Gent.. vol. 11. I larris ed.. Plenům, New York. ρ. 1. 1981). Geny kódu40 jící tyto proteiny jsou známé a mohou být klonovány z gcnomickýcli nebo cDNA knihoven (bank). K příkladům dalších genů patří gen pro dystrofin (Lee et ak. Nátuře 349, 334, 1991), gen faktoru VIII (Toole et ak, Nátuře 312, 342 1984), CETR gen (Rommens et ak, Science 245. 1059, 1989, Riordan etal., Science 245, 1066. 1989). OTC gen (Horwich et ak. Science 224, 1066, 1984), a gen pro alfa 1—antitrypsin (Eemarchand et ak, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 6482,
1992).
K příkladům dalších genů, které mohou být exprimovány vektory, které mohou být produkovány v transformovaných amniocytech, patří gen p53 užitečný pro léčení nádorových onemocnění (Wills et ak, Hum. Gen Ther. 5. 1079, 1994. Clayman ct al.. Cancer Res. 55. I, 1995). gen Rb pro léčení cévních proliferativních nemocí (Chang etal.. Science 267, 518. 1995). nebo gen pro thymidinkinázu z viru herpes simplex (HSV) typu 1 užitečný pro terapii nádorových onemocnění. (ieny exprimované vektory produkovanými v transformovaných amniocytech nemusí vždy jen kódoval protein. Tak například mohou exprimovat funkční RNAs. K příkladům vhodných RNA patří antisense RNA (Magrath, Ann. Oncok 5, Suppl 1), 67-70 1994. Milligan ct ak. A1111.
NY Acad. Sci. 716. 228-241. 1994, Schreier, Pharma. Acta. Helv., 68, 145-159 1994), a takc
- 15 CZ 300124 B6 katalytická RNA (Cech, Biochem. Soc. Trans. 21, 229-234. 1993; Cech. Gen 135. 33-36. i993;
Long etal., TASEBJ, 7,25-30. 1993; Ros! et al., Pharm. Thcrap. 50, 245-254, 1991).
Vektory produkované v transformovaných amnioeytech mohou, navíc k terapeutickým genům.
obsahovat jakýkoliv reportérový gen, aby bylo možné lépe sledovat expresi vektoru. Příklady reportérových genů jsou známy ve stavu techniky a patří k nim například gen pro [3-galaktosidázu (Fowler et al.. Proč. Nati. Acad. Sei. USA 74, 1507, 1977).
Vektory, které mohou být produkovány v transformovaných amnioeytech, mohou obsahovat více io než jeden gen. Maximální počet genů. které mohou být vloženy v takových vektorech, závisí na kapacitě konkrétního vektoru a na velikosti genů.
Výběr promotorů, které řídí expresi terapeutických genů ve vektorech produkovaných v transformovaných amnioeytech není kritický. Virové nebo nevirové promotory, které vykazují konstitub tivní, tkáňově-specifickou nebo regulovatelnou aktivitu, mohou být užity pro expresi proteinů nebo funkční RNA. SV40 nebo eytomegalovirový promotor (Andersson etal.. J. Biol. Chem.
264, 8222-8229, 1964) může být užit například pro konstitutivní expresi genu. Použití promotoru svalové kreatinkinázy (MCK) dovoluje tkáňově-specifickou expresi proteinu nebo funkční RNA v kosterním svalstvu a srdečním svalu. Genová exprese může být řízena kvantitativné a také kvalitativně použitím regulovatelných systémů (Eurth etal.. Proe. Nati. Acad. Sci. USA 91. 9302-9306, 1994).
Do vektorů, které mohou být produkovány v transformovaných amnioeytech, je možné vložit genetické elementy, které ovlivňují chování vektoru uvnitř recipientuí (příjemeovské) buňky.
K příkladům takových elementů patří elementy, které umožňují jaderné nasměrování vektorové DNA (Hodgson, Biotechnology 13, 222-225, 1995).
Vektory' produkované takovým způsobem mohou být užity in vitro nebo in vivo. Genový přenos in vitro se uskutečňuje mimo tělo, např. přidáním vektoru k buňkám v buněčné kultuře nebo k primárním buňkám, které byly odebrány z těla pro účel genového přenosu. V případě genového přenosu in vivo může být vektor podáván různými způsoby, v závislosti na tkáni, která má být transdukována. Příkladem je injekce do arteriálního nebo žilního cévního systému, přímá injekce do relevantní tkáně (např. jater, mozku, svalu), i listí láce do relevantního orgánu (např. plic nebo gastrointestinálního traktu) nebo přímé podání na povrch (např. kůže, močový měchýř).
Cílem následujících obrázků a příkladů jc podrobné ilustrovat vynález, aniž by jakkoliv omezily jeho rozsah.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje schéma klonování: Obr. IA znázorňuje formou diagramu jednotlivé kroky klonování plazmidu STKI46. Obr. IB znázorňuje levý konec genomu, představující asi 15% genomu, adenoviru typu 5. zahrnující El RNA, kódující úseky, výchozí body
EIA a EIB transkripce, a sestřihové akceptorové a sestřihové donorové místo, a polyadeny lační sekvenci, které jsou důležité pro klonování. Důležité je, že sestřihové donorové místo v poloze páru bází 3511 z Ad5 bylo zachováno při klonování plazmidu STK146, ale sestřihové akceptorové místo a polyadenylační signál byly nahrazeny odpovídajícími funkcemi zSV40. Navíc EIA promotor z Ad5 byl nahrazen promolo5D rem PGK. Takže STK146 obsahuje sekvenci Ad5from od páru bází 505 do 5322 a buněčné linie transformované tímto plazmidem neobsahují žádné sekvence Ad5, které jsou přítomny v adenovirových vektorech první nebo druhé generace nebo v pomocném viru loxP.
- 16 CZ 300124 B6
Obr. 2 ukazuje ostrůvky buněk (Obr. 2B a Obr. 2B) získané zamniocytů transformací adenovirovou funkcí El, a the buněčné linie N52.E6 (DSMZ ACC2416; Obr. 2C) a N52.E4 (Obr. 2D) klonované z jediné buňky. Je třeba si všimnout, že buněčné linie a jednobuněčné klony sc liší morfologicky od amnioeytů tím, že jsou obvykle menší a nedochází ke kontaktní ínhibici při jejich růstu.
Obr. 3 ukazuje stav integrace STK 146 v osmi různých El-transformovaných amniocytových buněčných liniích užitím Southernova přenosu („Southern blot).
Obr, 4 ukazuje ve formě tabulky produkci adenovirových vektorů první generace v různých klonovaných buněčných liniích na základě bfu („blité for min g ttnils“. jednotek vytvářejících modré zabarvení..) na jednu buňku a účinnost transfekce příslušné buněčné linie na základě vytváření plaků.
i? Obr. 5 ukazuje expresi EIA a EIB proteinů z Ad5 u jedenácti klonovaných amniocytových buněčných linií (Western přenos. „Western biol).
Ob r. 6 u ka zuj c ča so vý pru běh sy n t czy re kom b i n an lnic h ad e no v i ro v ý e h vek tor ů ve dvou k I o n ovaných buněčných liniích N52.E6 a N52.F4. Obr. 6A ukazuje syntézu adenovirového vektoru první generace, a Obr. 6B ukazuje syntézu adenovirového vektoru s velkou kapacitou pro DNA.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Klonování
Na obr, 1 je přehledně znázorněn celý postup klonování.
a) Plazmid STK 136
Plazmid STK 136 obsahuje myší fosforglyccrátkinázový promotor (sekvence id. č. I; Adra et al.. Gen 60, 65-74, 1987) v plazmidu pBlueseript KsII (Stratagen) a byla připravena následujícím postupem:
3.5 pg plazmidu PGK-bAAT (Kay ct al.. Hepatology 21, 815- 819, 1995) bylo naštěpeno EeoRV a rozděleno podle velikosti na 1,5% agarózovém gelu. Pás velikosti 0,5 kb obsahující Fragment promotoru PGK. který byl hledán, byl po obarvení ethidiumbromidem vyříznut a DNA byla elektroeluována. Současně pBlueseript KS11 byl štěpen EeoRV a Hindi, a volné konce DNA byly defosforylovány. Po následné feno 1/ehloro formové extrakci a ethanol o vé precipitaei. ekvimolární množství těchto fragmentů DNA bylo ligováno a transformováno do ultrakompetentních baktérií XL 2 Blue (Stratagen). Plazmidové klony byly charakterizovány štěpením restriktázami, a výsledný plazmid byl označen STK 136 (izolát #6).
b) Plazmid STK137 so Plazmid STK 137 obsahuje úplnou expresní kazetu El z Ad5 zahrnující 3' sestřihový signál a polyadenylační signál z SV40 a byl připraven následujícím postupem:
PCR amplifikace Ad5 sekvence bp 505-841 (PCR h (Sekvence id. č. 2/
- 17 C7. 300124 B6 lOng plazmidu pXCl (Mierobix) bylo amplifikováno společně se 400 ng každého z oligonukleotidů 27 759 (Sekvence id. č. 3) a 27 634 (Sekvence id. č. 4), 0,2 mm dNTPs a 1.25 U Pfu polymerázy v pufru obsahujícím: 10 mm KG, 10 mm (NH4)2SO4, 20 mm Tris/HCI. pH 8.75.
mm MgSO4, 0.1% Triton X 100. 100 pg/ml BSA. v následujících podmínkách cyklování:
? 1: 10 minut při 94 °C,
II: 1 minuta při 94 °C.
minuty při 50 °C.
minuty při 72 °C,
III: 10 minut při 72 °C', io
Krok 11 byl opakován v 15 cyklech. DNA byla purifikována pomocí purifikační soupravy QIAquick PCR puritlcation kit (Qiagen) podle pokynů výrobce a byla precipitována ethanolem.
Pro klonování PCR fragmentu. 2.5 pg pBlueseript KS11 bylo naštěpeno EeoRV. a volné konce
DNA byly dc Fos fóry lo vány, ligovány v ekv i molární m množství s PCR fragmentem a transformováno do buněk XI-2 Blue. Takto získaný plazmid je označován dále jako #1.
PCR amplifikace Ad5 sekvence bp 3328 -3522 (PCR II) Sekvence id. ě. 5):
2i) 10 ng plazmidu pXCl (Mierobix) bylo amplifikováno společně s 400 ng každého zoligonukleotidu 27 635 (Sekvence id. č, 6) a 27 636 (Sekvence id, č. 7) za podmínek popsaných již výše. Po provedení PCR byla DNA extrahována fenol/chloroformem, precipitována ethanolem, našlěpena EcoRI, opět extrahována fenol/chloroformem, precipitována a rozpuštěna ve 30 μΙ TE.
PCR amplifikace 3' sesfřihového a polyadenylačního signálu z SV40 pomocí plazmidu pGL2fiasic, b/t /978 2749 (PCR Ul) (sekvence id. e. 8);
ng plazmidu pGl,2-Basic (promega, GenBank/EMBL Aee. No.: X65323) bylo ampl i f kováno společně s 800 ng každého z olígonukleotídú 27 637 (sekvence id. é. 9) a 27 638 (sek5D venee id. č. 10), 0.4 mm dNTPS a 2.5 U Pfu polymarázy za podmínek popsaných výše. Po provedení PCR DNA byla extrahována fenol/chloroformem. precipitována ethanolem, naštěpena EcoRI, opět extrahována fenol/chloroformem. precipitována v ethanolu a rozpuštěna ve TE. Pak bylo 10 μΙ každé z DNA z PCR 11 a 111 ligováno v objemu 50 μΐ, extrahováno fenol/chloroformem, preeipitováno ethanolem a naštěpeno BamHI v objemu 100 μΙ. Po opakované fenol/ehloro55 formové extrakci a ethanolové precipitaci, by la DNA ligována s ekvimolárním množstvím DNA pBlueseript KS 11, která byla předtím naštěpena BamHI a defosforylována. Takto získaný plazmid je označován dále jako #29. Pro další klonování, 3.5 pg plazmidu DNA #29 bylo naštěpeno Saell a Bglll. defosforylováno. extrahováno fenol/chloroformem a preeipitováno v ethanolu. Současně 3.5 gig pXCl bylo naštěpeno Bglll a Sacil. a fragment 2,9 kb byl frakeionován elektroforézou a pak elektroeluován. Ekvimolární množství obou DNA bylo ligováno a transformováno do buněk XI,-2 Blue. Takto získaný plazmid je označován dále jako #5. Pro konečné klonování STK 137, plazmid #1 byl štěpen IlinclI a BspEl a frakeionován elektroforézou, a fragment velikosti přibližně 350 bp byl elektroeluován. Jako vektorová DNA. plazmid #5 byl štěpen KspI (isoseh izomer Sací 1), konce byly doplněny pomocí T4 polymerázy, a pak byly provedeny fenol/ehloroformová extrakce a ethanolová precipitaee, DNA pak byla naštěpena BspEl, konce byly defosforylovány. a opět byly provedeny fenol/ehloroformová extrakce a ethanolová precipitaee. Obě DNA byly ligovány a ligační směs pak transformována do buněk XE-2 Blue. Výsledný plazmid byl označen STK137 (izolát #34).
51) c) Plazmid S TK146 (Sekvence id. č. 18)
Plazmid STK 146 obsahuje myší PGK promotor, úplný úsek Bl z Ad5 (bp 505-3 522) a 3' sestřihový a polyadenylační signál SV40.
- IX C7. 300124 B6
Pro klonování, 4 pg STK 137 bylo naštěpeno EeoRV a BamHI a rozděleno elektroforczou, a fragment velikosti 3,7 kb byl elektrocluován. Navíc 3,3 pg STK 136 bylo naštěpeno EeoRV a BamHI.
defosforylováno, extrahováno fenol/chloroformem a precipitováno ethanolem. Ekvimolární množství obou plazmidu bylo ligo ván o a transformováno do buněk XL-2 Blue. Výsledný plazmid byl označen STK 139. Závěrečná sekvenční analýza STK 139 odhalila mutaci v poloze bp 613 (číslování se vztahuje k sekvenci Ad5 DNA), která vedla k aminokyselinové záměně tyrosinu na asparagin (2613 TAC -»GAC). Z tohoto důvodu fragment obsahující mutaci v STK 139 byl nahrazen BstEII (bp 1915) Bglll (bp 3 328) fragmentem zpXCE To bylo provedeno io štěpením STK 139 BstEII a Bglll, de fosfory lácí, fenol/ehloro formo vou extrakcí, ethanolovou preeipitaeí, rozdělením elektroforézou a elektroelucí fragmentu velikosti 5,8 kb, pXCl byl podobně naštěpen BstEII a Bglll a rozdělen elektroforézou, a byl elektroeluován fragment velikosti 1.4 kb. Po ligaci a transformaci byla DNA ze 4 plazmidovýeh klonů sckveneována: dva z nich obsahovaly správnou sekvenci v pozici bp 2613. Izolát č. 2 byl zcela sekvencován a byl i? označen jako STK 146.
d) Sekvencování STK 146
500 ng STK 146 #2 bylo sekvcneováno užitím lOpmol následujících sekvcnačních primerů ve standardních podmínkách:
Primer
| 28231 | Ad5 nt. 901-920 | (Sekvence id. č. 11) |
| 28232 | Ad5 nt. 1301-1320 | (Sekvence id. č. 12) |
| 28233 | Ad5 nt. 1701-1720 | (Sekvence id. č. 13) |
| 28234 | Ad5 nt.2100-2119 | (Sekvence id. č. 14) |
| 28235 | Ad5 nt. 2500-2519 | (Sekvence id. č. 15) |
| 28236 | Ad5 nt. 2853-2872 | (Sekvence id. č. 16) |
| 28237 | Ad5 nt. 3249-3268 | (Sekvence id. č. 17) |
'0
Příklad 2
Kultivace primární amniocytové buněčné linie
Všechny reageneie pro buněčné kultury, média a séra byla zakoupena od GIBCO Life Technologies. Buněčná linie 293. která by la užita jako kontrola v některých experimentech byla kultivována v modifikovaném médium podle Eagleho (MEM) sl0%fetálním telecím šerem (FCS), lx penicilin/streptomyein při 37 °C (1 OOx. katalog, č. 10 378-016), 95% vlhkosti a 5% C()2. Nové El-transformované buněčné linie byly připraveny pomocí primárních fetálních to buněk, které byly získány z amniolieké tekutiny při amniocentéze prováděné při prenatální diagnostice. Po biopsii byly buňky přeneseny rutinními metodami do plastických kultivačních lahví a kultivovány v Hamovč médiu F10 (živná směs podle Hama ΓΙ0 s E-glutaminem, katalog, č. 31550-023). 10% FCS, 2% Cltroser® Ci, lx roztok antibiotika/antimycotika (lOOx, katalog, č. 15 254-012), 2,5 pg/ml Fungizione* (amfotericin B, katalog, č. 15 290 018). Některé buňky i? adherovaly ke dnu kultivační láhve a proliferovaly. Dostatečné množství buněk pro chromozómovou analýzu bylo k dispozici po 2 týdnech. Po stanovení karyolypu byly kultury amniocytů se správným počtem a normální strukturou chromozómů použity k přípravě buněčná linie. Buňky ze tří různých zdrojů, odebrané při amniocentéze před 3. 6 nebo 7 týdny, byly použity v různých experimentech. Jako živné médium bylo užito Hamovo médium F10 médium, s 10%
FCS, 2% Ultroser^Cr, lx roztok antibiotika/antimykolika. 2.5 pg/ml Fungizionc^. Kultivační podmínky byly 37 °C, 95% vlhkost a 5% CO2. Sedm dní po transfekci byly amniocyty dále kultivovány v Hamovč médiu F10 s 10% FCS, lx penicilin/streptomyein. Po vzniku buněčných
- IQ C7. 300124 B6 klonů z jedné buňky, byly klony přeneseny na nové misky a kultivovány dále v médiu alfa-MF.M s 10% FCS, lx penieilín/streptomyein.
Příklad 3
Transfekce a transformace amniocytů
Pro transfekci byly amnioeyty vysety na misky pro buněčné kultury (průměr 60 mm, povrchová plocha 22.1 cm2) v hustotě 2 - 5 x 10' na jednu misku a transfekovány následující den. Pro transfekci bylo 20 pg plazmidu STK146 naštěpeno Seal, extrahováno fenol/chloroformem. precipitováno ethanolem a rozpuštěno ve 20 μΐ TT. takže DNA koncentrace byla 0.5 pg/μΐ. V počátečních experimentech byly amnioeyty transfekovány 3 nebo 7 týdnů po odebrání, vždy v 5 miskách, pomocí soupravy pro transfekci Effeetene transfcction kit podle pokynů výrobce (Qiagen) násl ed uj íe ím post u pem:
μΙ STK146 naštěpené Seal bylo smícháno se 146 μΙ pufru EC. Po přidání 8 μΙ enhanceru byl roztok krátce vortexován a inkubován při teplotě místnosti 5 minut. Pak bylo přidáno 25 μΐ Effeetene a po lOvleřinovém vortexování pokračovala inkubace dalších 10 minut při teplotě místnosti. Přitom bylo médium opatrně odsáto z buněk a nahrazeno 4 ml čerstvého živného média (viz sekce 2 výše). Po ukončení inkubace byl k transfekční směsi přidán 1 ml čerstvého živného média a směs byla opatrně po kapkách přidána k buňkám. Buňky byly kultivován) dále jak bylo popsáno výše. Sedm dní po transfekci byly buňky z každé misky přeneseny na větší misky (průměr 150 mm, povrch 147.8 cm). To bylo provedeno opatrným odsátím média, buňky byly opláchnuty PBS. uvolněny pomocí trypsinu a přeneseny na nové misky a pak dále kultivovány jak bylo popsáno v sekci 2. 18 až 22 dnů po transfekci byly jasně patrné klonální ostrůvky buněk mor fo logicky odlišitelné od amniot ických buněk (Obr. 2 A, 2B). Hlavní složku netransformované amnioeytové kultury tvořily velké buňky, které projevovaly při růstu kontaktní inh i bicí. Buňky v transformovaných koloniích z jedné buňky byly mnohem menší, rostly mnohem rychleji a neprojevovaly při růstu žádnou kontaktní inhibici. Rostly jako buněčné ostrůvky sestávající z menších buněk, které byly těsně nahloučeny, a pod světelným mikroskopem mohly být jednoznačně bez potíží identifikovány. Tylo ostrůvky byly odebrány a přeneseny na nové misky (průměr 60 mm) obsahující výše popsané médium. Po dalším růstu byly buněčné linie přeneseny na kultivační misky s plochou 147,8 cm a dále kultivovány jak bylo popsáno v části 2. Od prvního přenosu na misky s plochou 147,8 cm' byly přenosy (pasáže) buněk počítány. Zpočátku pokračovala kultivace přibližně 40 buněčných klonů z buněk, které byly transfekovány 3 a 7 týdnů po odebrání. Následně, tedy po prodloužené kultivaci, došlo k výrazné /.měně v morfologii některých buněčných klonů, a tyto klony jevily nestabilitu růstových charakteristik. Další experimenty byly omezeny na další kultivaci a analýzu osmi mor fo logicky stabilních buněčných linií. Tyto linie byly označeny následovně: GS.A55 (připraveny z amniocytů transfekovaných 3 týdny po odebrání), GS.N21. GS.N24, GS.N27, GS.N49. GS.N5UGS.N52, GS.N53 (připraveny z amniocytů trans feko váných 7 týdnů po odebrání).
V průběhu prvních pasáží všechny buněčné klony vykazovaly srovnatelnou morfologii, ale to se v následujících pasážích změnilo. Tak například některé buněčné klony změnily tvar na velmi kulatý a po dalších pasážích do konce již. nebyly adherentní (přisedlé). Jiné buněčné klony jevily výraznou vakuolizaei, ale to nemělo žádný účinek na jejích růst. Po nakloňování z jedné buňky („single-cell klonování) jevily všechny buněčné linie uniformní morfologii a například N52.EG a N52. Γ4 měly epiteiiální vzhled. Byly srovnatelné s buňkami 293, pokud jde o rychlost růstu a buněčnou hustotu.
Příklad 4
Účinnost transformace
-20CZ 300124 B6
Aby bylo možné přesněji stanovit účinnost transformace funkcí El, byla provedena transtekce sedmi nových misek, z nichž každá obsahovala 2-5 x 10' buněk, postupem popsaným v části 3.
Buňky byly přeneseny již 24 hodin po transfekci na misky velikosti 147,8 crn‘ a dále byly 5 dnů kultivovány v Hamově médiu F-10 s 10% fetálním telecím sérem, 2% UltroserÍSJG. roztokem lx antibiotíkum/antimykotikum. 2.5 pg/ml Eungizione a dalších 25 dnů v Hamově médiu s 10% fetálním telecím sérem, roztokem lx penicilm/streptomycin. Miska s netransfekovanými buňkami byla jakožto kontrola kultivována za stejných podmínek. V průběhu byly počítány morfologicky jasně rozlišitelné (viz Obr. 2A, B) kolonie vzniklé v důsledku jedině transfromační událo losti. Klony vzniklé z jediné buňky byly patrné na všech kultivačních miskách kromě netransfekované kontrolní misky. V průměru byly 4 buněčné klony na jedné misce, což odpovídalo transformační účinnosti 1 /0,5-1 x 10'buněk.
i? Příklad 5
Klonování z jedné buňky
Jak již bylo uvedeno, některé buněčné linie jevily odlišné morfologické charakteristiky, což byl 2o důvod, proč bylo až 10 linií založeno z každé buněčné linie. Pasáže jednotlivých buněčných linií hyly odlišné v těchto případech: GS.A55: P17, GS.N2I: P24. GS.N24; P20, GS.N27: P19,
GS.N49: P21, GS.N5I: P39, GS.N52: P22, GS.N53: P20. Pro tento účel byly buňky uvolněny z kultivačních misek, v koncentraci 5x I06 bunčk/ml, a naředěny 1:1000, 1:50 000 a 1:500 000 živným médiem. 100 μΐ buněk z každého ředění pak vyseto na 96-jamkové destičky, a buněčné klony, které jednoznačně vznikly z jediné buňky byly dále kultivovány. Obr. 2C ukazuje buněčnou linii GS.N52.E6 (DSMZ No.), a obr. 2D ukazuje buněčnou linii GS.N52.P4: přičemž oba buněčné klony pocházejí z původní buněčné linie GS.N52,
Příklad 6
Charakterizace buněčné linie El
a) Analýza metodou Southernova přenosu (Southern blot)
Analýzy metodou Southern blot byly provedeny, aby byl vyšetřen integrační stav úseku El v buněčné linii, Pro tento účel byla izolována genomieká DNA zc všech osmi El amniotickýeh klonů (viz část 5.), a 5 pg každé DNA bylo našíěpěno EeoRV. rozděleno elektroforézou a přeneseno na nylonovou membránu. EeoRV štěpí jedenkrát v expresní kazetě El. Hybridizace s radioto aktivně značenou STK146 DNA potvrdila integraci 1 až 2 kopií STK146 ve všech klonech.
Obr. 3 ukazuje integrační profil v El buněčných klonech. Jsou zde vidět dva hlavní pásy s vysokou molekulovou hmotností, evidentní pro všechny klony, které ukazují na integraci jediné kopie. Buněčné klony GS.N24 a GS.N52 ukázaly další pás s relativně silnou intenzitou, který' by mohl ukazovat na integraci tandemu kopií STK146. Pro žádný buněčný klon se nevyskytl pás menší než S1KI46 naštěpený Seal a EeoRV, což ukazuje, že všechny integrované kopie byly úplné a neby ly deletované.
b) Příprava rekombinantních adenovirů
Po nakloňování z jedné buňky byly buněčné klony testovány na schopnost produkovat rekombi50 nantní adenovirus. To se provádělo infikováním 3 až 5 „jednobuněčných klonů pro každou linii při asi 70% konfluenci ve 24-jamkových destičkách Adpgal (rekombinantní adenovirovový vektor první generace) s infekci 5 MOI (multíplícíta infekce). 48 hodin po infekci byly buňky lyžovány třikrát opakovaným zmrazením a táním, a množství produkovaného Ad[3gal bylo pak analyzováno infikováním buněk 293 a následným obarvením (MacGregor et al„ in: Gen Transfer
CZ 300124 Bó and Expression Protocols, Murray cd. Humana, Clifton, NJ. vol. 7, pp. 217-235, (1991)) pro detekci tvorby β—galaktosidázy (Obr. 4). Tato metoda dovoluje jen přibližné určení produkce rekombínantního adenoviru. protože počet buněk a tudíž množství viru použité pro různé klony se může lišit v důsledku rozdílů ve velikosti a rychlosti růstu. Buněčné klony, které poskytly nejvyšší výtěžek v prvním testu byly analyzovány přesněji v dalším experimentu. Ten byl proveden tak, že se vyselo přibližně 3x 10'buněk na 3 misky (průměr 100 mm, plocha 60 cm“). Buňky byly spočteny následující den a byly infikovány přesně 5 MOI Adpga! na základě počtu nalezených buněk. 48 hodin po infekci byly buňky sklizeny a lyžovány třikrát opakovaným zmrazením a táním, a množství produkovaného Adfgal bylo pak analyzováno infikováním buněk 293 io a následným obarvením. Výsledky jsou shrnuty na obr. 4.
c) Transfekční účinnost
Některé klonované buněčné linie byly testovány na tvorbu plaků. fo se provádělo transfekci buněk při asi 70% konlluenei na kultivačních miskách (průměr 60 mm) užitím 2 pg infekčního plazmidu GS66 metodou s kalciumfosfátem. Plazmid GS66 obsahuje úplný adenovirový genome i? s deleci v úseku El od nukleotidu 440 do nukleotidu 3 523. Sekvence adenovirovové terminální repetice (ITR) jsou v tomto plazmidu ohraničeny restrikčními místy Swal, takže infekční virus a plaky mohou vznikat po transfekci plazmidem naštěpeným Swal. 24 hodin po transfekci byly buňky převrstveny 10 ml média MEM s l%agarózou, 0,5x penicilin/slrcptomycin. 0.05% kvasinkovým extraktem. Plaky byly viditelné po inkubaci ve 37 °C, 95% vlhkosti, 5% CO asi po jednom týdnu. Obr. 4 ukazuje počet plaků jako průměrnou hodnotu ze dvou nezávislých transíekcí v každém případě.
d) Exprese funkcí El A a El B z Ad5
Exprese proteinů Ad5 El A a E1B 2lkD v klonované buněčné linii by la detekována analýzou Western blot pomocí monoklonální protilátky.
Buňky byly opatrně odděleny od kultivačních misek (průměr 10 cm) do PBS/lmM EDTA, poletovány a přeneseny do 150 μΐ pufru obsahujícího 50 mm tris/HCI PII 8. 140 mm NaCl, 0,5% NP40, 4 mm EDTA, 2 mm EGTA, 0.5 mm PMSF a 5% glyeerol. Buňky byl· lyžovány rozdrcením (homogenizátor Dounce) a eentrifugovány při 13 000 rpm 10 minut, a koncentrace protei3(i nu v supematantu byla stanovena pomocí soupravy pro stanovení proteinu (BIORAD, Microassay Proceduře). 10 pg proteinu bylo rozděleno na 12% SDS polyakrylauiidovcítí gelu a přeneseno na nitrocelulózovou membránu (llybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech) a inkubováno s protilátkou anti El A nebo anti E1B 21 kD (Ca 1 biochem. ředění 1:300). Následující den byla membrána (blot) opláchnuta a hybridizována s druhou anti-myší protilátkou (El A) nebo anti pol k a η í prot i 1 á t ko u (E1B), k te ré by I y konj u go vány s křenovou perox i d á zo u, Reakce křenové peroxidázy byla zahájena inkubací ve stejných objemech zesilovacího roztoku I a 2 (souprava ECL. Amersham Pharmacia Biotech), a vznikající fotochemická reakce byla vizualizována krátkou expozicí na rentgenovém filmu. Obr. 5 ukazuje výsledky Western blot analýzy.
e) Časový průběh syntézy rekombinantních adenovirovýeh vektorů první generace a adenoviro4o vých vektorů s velkou kapacitou pro DNA
Dvě klonované buněčné linie N52.E6 a N52.F4 ukázaly nejvyšší výtěžky rekombínantního adenovirového vektoru první generace ve výše popsaném experimentu. Další znalosti o průběhu jsou důležité pro optimalizaci produkce adenovirovýeh vektorů, zvláště když jsou buňky adaptované pro suspenzní kultury a úspěšnost infekce nelze sledovat na základě eytopatickébo účinku. Pro tuto analýzu bylo infikováno několik misek (průměr 6 ent), každá s3x KČ buňkami, 5 MOI Ad[3gaI a sklizeny v uvedených časových bodech po infekci. Výtěžek rekombínantního adenoviru byl stanoven infikováním buněk 293. obarvením a spočítáním modrých buněk (Obr. 6A).
Do budoucna lze také počítat s užitím nových buněčných linií pro produkci adenovirovýeh vekto50 rů s velkou kapacitou DNA (viz výše). Produkce takových adenovirovýeh vektorů vyžaduje pomocný virus, který' v trans poskytuje deletované funkce a proteiny nutné pro lytický infekční cyklus. S bálo vac í signál v takových pomocných virech je de letován pomocí loxP rozpoznávací
sekvence Cre rekombinázy, která je exprimována buněčnou linií po infekci. V dalších experimentech budou nové El-transformované buněčné linie transfekovány Cre- exprimujícím plazmidem, takže budou trvale exprimovat rekombinázu.
V předběžných experimentech bylo testováno, zda nové El amniocyty jsou také vhodné k produkci adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA, a zda produkční k i netiká a množství produkovaného vektoru odpovídá výsledkům dosahovaným se současnými existujícími Cre-exprimujícími buňkami 293. Pro tento účel bylo několik misek, každá s3 x IOft buňkami, buněčných linií N52.E6 a N52.F4 infikováno 5 MOI pomocného viru loxP a 10 MOI AdGS46 io (β-gal-exprimující adenovirovový vektor s velkou kapacitou DNA) a byly sklizeny v uvedených časech po infekci. Výtěžky β-gal-exprimujícího adenovirového vektoru s velkou kapacitou DNA byly stanoveny infikováním buněk 293, obarvením a spočtením modrých buněk (Obr. 6B). Množství adenovirového vektoru s velkou kapacitou DNA syntetizované v amnioeyteeh odpovídalo množství, které je produkováno v Cre-exprimujících buňkách 293 buňky (data nejsou uve15 děna).
SEZNAM SEKVENCÍ <2Ι0> 1 <211 > 513
2n <212>DNA <213> Myš, fosfoglycerátkinázový promotor <400> 1
| 1 | GAATTCTACC | GGGTAGGGGA | GGCGCTTTTC | CCAAGGCAGT | CTGGAGCATG |
| 51 | CGCTTTAGCA | GCCCCGCTGG | CACTTGGCGC | TACACAAGTG | GCCTCTGGCC |
| 101 | TCGCACACAT | TCCACATCCA | CCGGTAGGCG | CCAACCGGCT | CCGTTCTTTG |
| 151 | GTGGCCCCTT | CGCGCCACCT | TCTACTCCTC | CCCTAGTCAG | GAAGTTCCCC |
| 201 | CCCGCCCCGC | AGCTCGCGTC | GTGCAGGACG | TGACAAATGG | AAGTAGCACG |
| 251 | TCTCACTAGT | CTCGTGCAGA | TGGACAGCAC | CGCTGAGCAA | TGGAAGCGGG |
| 301 | TAGGCCTTTG | GGGCAGCGGC | CAATAGCAGC | TTTGCTCCTT | CGCTTTCTGG |
| 351 | GCTCAGAGGC | TGGGAAGGGG | TGGGTCCGGG | GGCGGGCTCA | GGGGCGGGCT |
| 401 | CAGGGGCGGG | GCGGGCGCCC | GAAGGTCCTC | CGGAGGCCCG | GCATTCTCGC |
| 451 | ACGCTTCAAA | AGCGCACGTC | TGCCGCGCTG | TTCTCCTCTT | CCTCATCTCC |
| 501 | GGGCCTTTCG | ACC |
<210> 2 <211> 336 <212> DNA <213> Ad5 <400>2
- ?3 C7 300124 B6
| 1 51 101 | GAGTGCCAGC GAGTAGAGTT TTCTCCTCCG AGCCGCTCCG ACACCGGGAC TGAAAATGAG ACATATTATC TGCCACGGAG GTGTTATTAC CGAAGAAATG | ||
| GCCGCCAGTC | TTTTGGACCA GCTGATCGAA GAGGTACTGG | CTGATAATCT | |
| 151 | TCCACCTCCT | AGCCATTTTG AACCACCTAC CCTTCACGAA | CTGTATGATT |
| 201 | TAGACGTGAC | GGCCCCCGAA GATCCCAACG AGGAGGCGGT | TTCGCAGATT |
| 251 | TTTCCCGACT | CTGTAATGTT GGCGGTGCAG GAAGGGATTG | ACTTACTCAC |
| 301 | TTTTCCGCCG | GCGCCCGGTT CTCCGGAGCC GCCTCAC |
<210>3 5 <21I> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 3
ATCGAGTGCC AGCGAGTAGA GTTTTCTCC 29 io <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence !5 <400> 4
GTGAGGCGGC TCCGGAGAAC CG 22
| <2: | IO> | 5 |
| <2' | 11> | 216 |
| <2 i | I2> | DNA |
| <2! | I3> | Ad5 |
| <400 > | 5 |
CTCGCGGATC CAGATCTGGA AGGTGCTGAG GTACGATGAG ACCCGCACCA
GGTGCAGACC CTGCGAGTGT GGCGGTAAAC ATATTAGGAA CCAGCCTGTG 101
ATGCTGGATG TGACCGAGGA GCTGAGGCCC GATCACTTGG TGCTGGCCTG 151 CACCCGCGCT GAGTTTGGCT CTAGCGATGA AGATACAGAT TGAGGTACTG 201 AAATGGAATT CCGGTC <2 í0> Ó <211> 32 <2I2.> DNA <213> Umělá sekvence <400>6
GACGCCAATT CCATTTCAGT ACCTCAATCT GT 32 <210> 7 <2I1>32
- 24 CZ 300124 B6 <212>DNA <213> Umělá sekvence <400> 7
CTCGCGGATC CAGATCTGGA AGGTGCTGA GG 32 <210> 8 <211> 782 <212> DNA <213> SV40 (pGL2basie), Genbank X65323 o <400>8
| 1 | CGACTGAATT | CAATTTTTAA | GTGTATAATG | TGTTAAACTA | CTGATTCTAA |
| 51 | TTGTTTGTGT | ATTTTAGATT | CCAACCTATG | GAACTGATGA | ATGGGAGCAG |
| 101 | TGGTGGAATG | CCTTTAATGA | GGAAAACCTG | TTTTGCTCAG | AAGAAATGCC |
| 151 | ATCTAGTGAT | GATGAGGCTA | CTGCTGACTC | TCAACATTCT | ACTCCTCCAA |
| 201 | AAAAGAAGAG | AAAGGTAGAA | GACCCCAAGG | ACTTTCCTTC | AGAATTGCTA |
| 251 | AGTTTTTTGA | GTCATGCTGT | GTTTAGTAAT | AGAACTCTTG | CTTGCTTTGC |
| 301 | TATTTACACC | ACAAAGGAAA | AAGCTGCACT | GCTATACAAG | AAAATTATGG |
| 351 | AAAAATATTC | TGTAACCTTT | ATAAGTAGGC | ATAACAGTTA | TAATCATAAC |
| 401 | ATACTGTTTT | TTCTTACTCC | ACACAGGCAT | AGAGTGTCTG | CTATTAATAA |
| 451 | CTATGCTCAA | AAATTGTGTA | CCTTTAGCTT | TTTAATTTGT | AAAGGGGTTA |
| 501 | ATAAGGAATA | TTTGATGTAT | AGTGCCTTGA | CTAGAGATCA | TAATCAGCCA |
| 551 | TACCACATTT | GTAGAGGTTT | TACTTGCTTT | AAAAAACCTC | CCACACCTCC |
| 601 | CCCTGAACCT | GAAACATAAA | ATGAATGCAA | TTGTTGTTGT | TAACTTGTTT |
| 651 | ATTGCAGCTT | ATAATGGTTA | CAAATAAAGC | AATAGCATCA | CAAATTTCAC |
| 701 | AAATAAAGCA | TTTTTTTCAC | TGCATTCTAG | TTGTGGTTTG | TCCAAACTCA |
| 751 | TCAATGTATC | TTATCATGTC | TGGATCCGTC | GA |
<21O> 9 5 <211>32 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 9
CGACTGAATT CAATTTTTAA GTGTATAATG TG u
<2IO> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Umělá sekvence
-25 CZ 300124 B6 <400> 10
TCGACGGATC CAGACATGAT AAGATAC <210> 11 <211>20 <212> PNA <213> Umělá sekvence <400> 11
CCTTGTACCG GAGGTGATCG <210> 12 <21 l>20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400:. 12
TGGCGCCTGC TATCCTGAGA <210;> 13 <211> 20 <2I2>DNA <213:> Umělá sekvence <400> 13
TACATCTGAC CTCATGGAGG <21O> 14 <211> 20 <212> DNA <213 > Umělá sekvence <400?> 14
CAAGAATCGC CTGCTACTGT <2IO> 15 <211 > 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 15
GGCTGCAGCC AGGGGATGAT <210> 16 <21 b©0 <212>DNA <213> Umělá sekvence <400> 16
AGGGTTCGGG GCTGTGCCTT <210> 17 <211 >20
-26CZ 300124 B6 <212> DNA <2I3> Umělá sekvence <400> 17
CCTGAACGGG GTGTTTGACA 20 <210> 18 <21 U> 7090 <212> DNA <213> Plazmid STK 146
-27C'Z 300124 B6 <400> 18
| 1 | GTGGCACTTT | TCGGGGAAAT | GTGCGCGGAA | CCCCTATTTG | TTTATTTTTC |
| 51 | TAAATACATT | CAAATATGTA | TCCGCTCATG | AGACAATAAC | CCTGATAAAT |
| 101 | GCTTCAATAA | TATTGAAAAA | GGAAGAGTAT | GAGTATTCAA | CATTTCCGTG |
| 151 | TCGCCCTTAT | TCCCTTTTTT | GCGGCATTTT | GCCTTCCTGT | TTTTGCTCAC |
| 201 | CCAGAAACGC | TGGTGAAAGT | AAAAGATGCT | GAAGATCAGT | TGGGTGCACG |
| 251 | AGTGGGTTAC | ATCGAACTGG | ATCTCAACAG | CGGTAAGATC | CTTGAGAGTT |
| 301 | TTCGCCCCGA | AGAACGTTTT | CCAATGATGA | GCACTTTTAA | AGTTCTGCTA |
| 351 | TGTGGCGCGG | TATTATCCCG | TATTGACGCC | GGGCAAGAGC | AACTCGGTCG |
| 401 | CCGCATACAC | TATTCTCAGA | ATGACTTGGT | TGAGTACTCA | CCAGTCACAG |
| 451 | AAAAGCATCT | TACGGATGGC | ATGACAGTAA | GAGAATTATG | CAGTGCTGCC |
| 501 | ATAACCATGA | GTGATAACAC | TGCGGCCAAC | TTACTTCTGA | CAACGATCGG |
| 551 | AGGACCGAAG | GAGCTAACCG | CTTTTTTGCA | CAACATGGGG | GATCATGTAA |
| 601 | CTCGCCTTGA | TCGTTGGGAA | CCGGAGCTGA | ATGAAGCCAT | ACCAAACGAC |
| 651 | GAGCGTGACA | CCACGATGCC | TGTAGCAATG | GCAACAACGT | TGCGCAAACT |
| 701 | ATTAACTGGC | GAACTACTTA | CTCTAGCTTC | CCGGCAACAA | TTAATAGACT |
| 751 | GGATGGAGGC | GGATAAAGTT | GCAGGACCAC | TTCTGCGCTC | GGCCCTTCCG |
| 801 | GCTGGCTGGT | TTATTGCTGA | TAAATCTGGA | GCCGGTGAGC | GTGGGTCTCG |
| 851 | CGGTATCATT | GCAGCACTGG | GGCCAGATGG | TAAGCCCTCC | CGTATCGTAG |
| 901 | TTATCTACAC | GACGGGGAGT | CAGGCAACTA | TGGATGAACG | AAATAGACAG |
| 951 | ATCGCTGAGA | TAGGTGCCTC | ACTGATTAAG | CATTGGTAAC | TGTCAGACCA |
| 1001 | AGTTTACTCA | TATATACTTT | AGATTGATTT | AAAACTTCAT | TTTTAATTTA |
| 1051 | AAAGGATCTA | GGTGAAGATC | CTTTTTGATA | ATCTCATGAC | CAAAATCCCT |
| 1101 | TAACGTGAGT | TTTCGTTCCA | CTGAGCGTCA | GACCCCGTAG | AAAAGATCAA |
| 1151 | AGGATCTTCT | TGAGATCCTT | TTTTTCTGCG | CGTAATCTGC | TGCTTGCAAA |
| 1201 | CAAAAAAACC | ACCGCTACCA | GCGGTGGTTT | GTTTGCCGGA | TCAAGAGCTA |
| 1251 | CCAACTCTTT | TTCCGAAGGT | AACTGGCTTC | AGCAGAGCGC | AGATACCAAA |
1301 TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG
CZ 300124 Bó
| 1351 | TAGCACCGCC | TACATACCTC | GCTCTGCTAA | TCCTGTTACC | AGTGGCTGCT |
| 1401 | GCCAGTGGCG | ATAAGTCGTG | TCTTACCGGG | TTGGACTCAA | GACGATAGTT |
| 1451 | ACCGGATAAG | GCGCAGCGGT | CGGGCTGAAC | GGGGGGTTCG | TGCACACAGC |
| 1501 | CCAGCTTGGA | GCGAACGACC | TACACCGAAC | TGAGATACCT | ACAGCGTGAG |
| 1551 | CTATGAGAAA | GCGCCACGCT | TCCCGAAGGG | AGAAAGGCGG | ACAGGTATCC |
| 1601 | GGTAAGCGGC | AGGGTCGGAA | CAGGAGAGCG | CACGAGGGAG | CTTCCAGGGG |
| 1651 | GAAACGCCTG | GTATCTTTAT | AGTCCTGTCG | GGTTTCGCCA | CCTCTGACTT |
| 1701 | GAGCGTCGAT | TTTTGTGATG | CTCGTCAGGG | GGGCGGAGCC | TATGGAAAAA |
| 1751 | CGCCAGCAAC | GCGGCCTTTT | TACGGTTCCT | GGCCTTTTGC | TGGCCTTTTG |
| 1801 | CTCACATGTT | CTTTCCTGCG | TTATCCCCTG | ATTCTGTGGA | TAACCGTATT |
| 1851 | ACCGCCTTTG | AGTGAGCTGA | TACCGCTCGC | CGCAGCCGAA | CGACCGAGCG |
| 1901 | CAGCGAGTCA | GTGAGCGAGG | AAGCGGAAGA | GCGCCCAATA | CGCAAACCGC |
| 1951 | CTCTCCCCGC | GCGTTGGCCG | ATTCATTAAT | GCAGCTGGCA | CGACAGGTTT |
| 2001 | CCCGACTGGA | AAGCGGGCAG | TGAGCGCAAC | GCAATTAATG | TGAGTTAGCT |
| 2051 | CACTCATTAG | GCACCCCAGG | CTTTACACTT | TATGCTTCCG | GCTCGTATGT |
| 2101 | TGTGTGGAAT | TGTGAGCGGA | TAACAATTTC | ACACAGGAAA | CAGCTATGAC |
| 2151 | CATGATTACG | CCAAGCGCGC | AATTAACCCT | CACTAAAGGG | AACAAAAGCT |
| 2201 | GGGTACCGGG | CCCCCCCTCG | AGGTCATCGA | ATTCTACCGG | GTAGGGGAGG |
| 2251 | CGCTTTTCCC | AAGGCAGTCT | GGAGCATGCG | CTTTAGCAGC | CCCGCTGGCA |
| 2301 | CTTGGCGCTA | CACAAGTGGC | CTCTGGCCTC | GCACACATTC | CACATCCACC |
| 2351 | GGTAGGCGCC | AACCGGCTCC | GTTCTTTGGT | GGCCCCTTCG | CGCCACCTTC |
| 2401 | TACTCCTCCC | CTAGTCAGGA | AGTTCCCCCC | CGCCCCGCAG | CTCGCGTCGT |
| 2451 | GCAGGACGTG | ACAAATGGAA | GTAGCACGTC | TCACTAGTCT | CGTGCAGATG |
| 2501 | GACAGCACCG | CTGAGCAATG | GAAGCGGGTA | GGCCTTTGGG | GCAGCGGCCA |
| 2551 | ATAGCAGCTT | TGCTCCTTCG | CTTTCTGGGC | TCAGAGGCTG | GGAAGGGGTG |
| 2601 | GGTCCGGGGG | CGGGCTCAGG | GGCGGGCTCA | GGGGCGGGGC | GGGCGCCCGA |
| 2651 | AGGTCCTCCG | GAGGCCCGGC | ATTCTCGCAC | GCTTCAAAAG | CGCACGTCTG |
| 2701 | CCGCGCTGTT | CTCCTCTTCC | TCATCTCCGG | GCCTTTCGAC | CAGCTTGATA |
- 7Q .
CZ 300124 136
| 2751 | TCGAGTGCCA | GCGAGTAGAG | TTTTCTCCTC | CGAGCCGCTC | CGACACCGGG |
| 2801 | ACTGAAAATG | AGACATATTA | TCTGCCACGG | AGGTGTTATT | ACCGAAGAAA |
| 2851 | TGGCCGCCAG | TCTTTTGGAC | CAGCTGATCG | AAGAGGTACT | GGCTGATAAT |
| 2901 | CTTCCACCTC | CTAGCCATTT | TGAACCACCT | ACCCTTCACG | AACTGTATGA |
| 2951 | TTTAGACGTG | ACGGCCCCCG | AAGATCCCAA | CGAGGAGGCG | GTTTCGCAGA |
| 3001 | TTTTTCCCGA | CTCTGTAATG | TTGGCGGTGC | AGGAAGGGAT | TGACTTACTC |
| 3051 | ACTTTTCCGC | CGGCGCCCGG | TTCTCCGGAG | CCGCCTCACC | TTTCCCGGCA |
| 3101 | GCCCGAGCAG | CCGGAGCAGA | GAGCCTTGGG | TCCGGTTTCT | ATGCCAAACC |
| 3151 | TTGTACCGGA | GGTGATCGAT | CTTACCTGCC | ACGAGGCTGG | CTTTCCACCC |
| 3201 | AGTGACGACG | AGGATGAAGA | GGGTGAGGAG | TTTGTGTTAG | ATTATGTGGA |
| 3251 | GCACCCCGGG | CACGGTTGCA | GGTCTTGTCA | TTATCACCGG | AGGAATACGG |
| 3301 | GGGACCCAGA | TATTATGTGT | TCGCTTTGCT | ATATGAGGAC | CTGTGGCATG |
| 3351 | TTTGTCTACA | GTAAGTGAAA | ATTATGGGCA | GTGGGTGATA | GAGTGGTGGG |
| 3401 | TTTGGTGTGG | TAATTTTTTT | TTTAATTTTT | ACAGTTTTGT | GGTTTAAAGA |
| 3451 | attttgtatt | GTGATTTTTT | TAAAAGGTCC | TGTGTCTGAA | CCTGAGCCTG |
| 3501 | AGCCCGAGCC | AGAACCGGAG | CCTGCAAGAC | CTACCCGCCG | TCCTAAAATG |
| 3551 | GCGCCTGCTA | TCCTGAGACG | CCCGACATCA | CCTGTGTCTA | GAGAATGCAA |
| 3601 | TAGTAGTACG | GATAGCTGTG | ACTCCGGTCC | TTCTAACACA | CCTCCTGAGA |
| 3651 | TACACCCGGT | GGTCCCGCTG | TGCCCCATTA | AACCAGTTGC | CGTGAGAGTT |
| 3701 | GGTGGGCGTC | GCCAGGCTGT | GGAATGTATC | GAGGACTTGC | TTAACGAGCC |
| 3751 | TGGGCAACCT | TTGGACTTGA | GCTGTAAACG | CCCCAGGCCA | TAAGGTGTAA |
| 3801 | ACCTGTGATT | GCGTGTGTGG | TTAACGCCTT | TGTTTGCTGA | ATGAGTTGAT |
| 3851 | GTAAGTTTAA | TAAAGGGTGA | GATAATGTTT | AACTTGCATG | GCGTGTTAAA |
| 3901 | TGGGGCGGGG | CTTAAAGGGT | ATATAATGCG | CCGTGGGCTA | ATCTTGGTTA |
| 3951 | CATCTGACCT | CATGGAGGCT | TGGGAGTGTT | TGGAAGATTT | TTCTGCTGTG |
| 4001 | CGTAACTTGC | TGGAACAGAG | CTCTAACAGT | ACCTCTTGGT | TTTGGAGGTT |
| 4051 | TCTGTGGGGC | TCATCCCAGG | CAAAGTTAGT | CTGCAGAATT | AAGGAGGATT |
| 4101 | ACAAGTGGGA | ATTTGAAGAG | CTTTTGAAAT | CCTGTGGTGA | GCTGTTTGAT |
-30C7. 300124 Bó
| 4151 | TCTTTGAATC | TGGGTCACCA | ggcgcttttc | CAAGAGAAGG | TCATCAAGAC |
| 4201 | TTTGGATTTT | TCCACACCGG | GGCGCGCTGC | GGCTGCTGTT | GCTTTTTTGA |
| 4251 | GTTTTATAAA | GGATAAATGG | AGCGAAGAAA | CCCATCTGAG | CGGGGGGTAC |
| 4301 | CTGCTGGATT | TTCTGGCCAT | GCATCTGTGG | AGAGCGGTTG | TGAGACACAA |
| 4351 | GAATCGCCTG | CTACTGTTGT | CTTCCGTCCG | CCCGGCGATA | ATACCGACGG |
| 4401 | AGGAGCAGCA | GCAGCAGCAG | GAGGAAGCCA | GGCGGCGGCG | GCAGGAGCAG |
| 4451 | AGCCCATGGA | ACCCGAGAGC | CGGCCTGGAC | CCTCGGGAAT | GAATGTTGTA |
| 4501 | CAGGTGGCTG | AACTGTATCC | AGAACTGAGA | CGCATTTTGA | CAATTACAGA |
| 4551 | GGATGGGCAG | GGGCTAAAGG | GGGTAAAGAG | GGAGCGGGGG | GCTTGTGAGG |
| 4601 | CTACAGAGGA | GGCTAGGAAT | CTAGCTTTTA | GCTTAATGAC | CAGACACCGT |
| 4651 | CCTGAGTGTA | TTACTTTTCA | ACAGATCAAG | GATAATTGCG | CTAATGAGCT |
| 4701 | TGATCTGCTG | GCGCAGAAGT | ATTCCATAGA | GCAGCTGACC | ACTTACTGGC |
| 4751 | TGCAGCCAGG | GGATGATTTT | GAGGAGGCTA | TTAGGGTATA | TGCAAAGGTG |
| 4801 | GCACTTAGGC | CAGATTGCAA | GTACAAGATC | AGCAAACTTG | TAAATATCAG |
| 4851 | GAATTGTTGC | TACATTTCTG | GGAACGGGGC | CGAGGTGGAG | ATAGATACGG |
| 4901 | AGGATAGGGT | GGCCTTTAGA | TGTAGCATGA | TAAATATGTG | GCCGGGGGTG |
| 4951 | CTTGGCATGG | ACGGGGTGGT | TATTATGAAT | GTAAGGTTTA | CTGGCCCCAA |
| 5001 | TTTTAGCGGT | ACGGTTTTCC | TGGCCAATAC | CAACCTTATC | CTACACGGTG |
| 5051 | TAAGCTTCTA | TGGGTTTAAC | AATACCTGTG | TGGAAGCCTG | GACCGATGTA |
| 5101 | AGGGTTCGGG | GCTGTGCCTT | TTACTGCTGC | TGGAAGGGGG | TGGTGTGTCG |
| 5151 | CCCCAAAAGC | AGGGCTTCAA | TTAAGAAATG | CCTCTTTGAA | AGGTGTACCT |
| 5201 | TGGGTATCCT | GTCTGAGGGT | AACTCCAGGG | TGCGCCACAA | TGTGGCCTCC |
| 5251 | GACTGTGGTT | GCTTCATGCT | AGTGAAAAGC | GTGGCTGTGA | TTAAGCATAA |
| 5301 | CATGGTATGT | GGCAACTGCG | AGGACAGGGC | CTCTCAGATG | CTGACCTGCT |
| 5351 | CGGACGGCAA | CTGTCACCTG | CTGAAGACCA | TTCACGTAGC | CAGCCACTCT |
| 5401 | CGCAAGGCCT | GGCCAGTGTT | TGAGCATAAC | ATACTGACCC | GCTGTTCCTT |
| 5451 | GCATTTGGGT | AACAGGAGGG | GGGTGTTCCT | ACCTTACCAA | TGCAATTTGA |
| 5501 | GTCACACTAA | GATATTGCTT | GAGCCCGAGA | GCATGTCCAA | GGTGAACCTG |
| 5551 | AACGGGGTGT | TTGACATGAC | CATGAAGATC | TGGAAGGTGC | TGAGGTACGA |
| 5601 | TGAGACCCGC | ACCAGGTGCA | GACCCTGCGA | GTGTGGCGGT | AAACATATTA |
| 5651 | GGAACCAGCC | TGTGATGCTG | GATGTGACCG | AGGAGCTGAG | GCCCGATCAC |
| 5701 | TTGGTGCTGG | CCTGCACCCG | CGCTGAGTTT | GGCTCTAGCG | ATGAAGATAC |
| 5751 | AGATTGAGGT | ACTGAAATGG | AATTCCTCTA | GTGATGATGA | GGCTACTGCT |
| 5801 | GACTCTCAAC | ATTCTACTCC | TCCAAAAAAG | AAGAGAAAGG | TAGAAGACCC |
| 5851 | CAAGGACTTT | CCTTCAGAAT | TGCTAAGTTT | TTTGAGTCAT | GCTGTGTTTA |
| 5901 | GTAATAGAAC | TCTTGCTTGC | TTTGCTATTT | ACACCACAAA | GGAAAAAGCT |
| 5951 | GCACTGCTAT | ACAAGAAAAT | TATGGAAAAA | TATTCTGTAA | CCTTTATAAG |
| 6001 | TAGGCATAAC | AGTTATAATC | ATAACATACT | GTTTTTTCTT | ACTCCACACA |
| 6051 | GGCATAGAGT | GTCTGCTATT | AATAACTATG | CTCAAAAATT | GTGTACCTTT |
| 6101 | AGCTTTTTAA | TTTGTAAAGG | GGTTAATAAG | GAATATTTGA | TGTATAGTGC |
| 6151 | CTTGACTAGA | GATCATAATC | AGCCATACCA | CATTTGTAGA | GGTTTTACTT |
| 6201 | GCTTTAAAAA | ACCTCCCACA | CCTCCCCCTG | AACCTGAAAC | ATAAAATGAA |
| 6251 | TGCAATTGTT | GTTGTTAACT | TGTTTATTGC | AGCTTATAAT | GGTTACAAAT |
| 6301 | AAAGCAATAG | CATCACAAAT | TTCACAAATA | AAGCATTTTT | TTCACTGCAT |
| 6351 | TCTAGTTGTG | GTTTGTCCAA | ACTCATCAAT | GTATCTTATC | ATGTCTGGAT |
| 6401 | CCACTAGTTC | TAGAGCGGCC | GCCACCGCGG | TGGAGCTCCA | ATTCGCCCTA |
| 6451 | TAGTGAGTCG | TATTACGCGC | GCTCACTGGC | CGTCGTTTTA | CAACGTCGTG |
| 6501 | ACTGGGAAAA | CCCTGGCGTT | ACCCAACTTA | ATCGCCTTGC | AGCACATCCC |
| 6551 | CCTTTCGCCA | GCTGGCGTAA | TAGCGAAGAG | GCCCGCACCG | ATCGCCCTTC |
| 6601 | CCAACAGTTG | CGCAGCCTGA | ATGGCGAATG | GGACGCGCCC | TGTAGCGGCG |
| 6651 | CATTAAGCGC | GGCGGGTGTG | GTGGTTACGC | GCAGCGTGAC | CGCTACACTT |
| 6701 | GCCAGCGCCC | TAGCGCCCGC | TCCTTTCGCT | TTCTTCCCTT | CCTTTCTCGC |
| 6751 | CACGTTCGCC | GGCTTTCCCC | GTCAAGCTCT | AAATCGGGGG | CTCCCTTTAG |
| 6801 | GGTTCCGATT | TAGTGCTTTA | CGGCACCTCG | ACCCCAAAAA | ACTTGATTAG |
| 6851 | GGTGATGGTT | CACGTAGTGG | GCCATCGCCC | TGATAGACGG | TTTTTCGCCC |
| 6901 | TTTGACGTTG | GAGTCCACGT | TCTTTAATAG | TGGACTCTTG | TTCCAAACTG |
- 3? .
| 6951 | GAACAACACT | CAACCCTATC | TCGGTCTATT | CTTTTGATTT | ATAAGGGATT |
| 7001 | TTGCCGATTT | CGGCCTATTG | GTTAAAAAAT | GAGCTGATTT | AACAAAAATT |
| 7051 | TAACGCGAAT | TTTAACAAAA | TATTAACGCT | TACAATTTAG |
Claims (22)
1. Permanentní buněčná linie amniocytů, které obsahují alespoň jednu nukleovou kyselinu, io která exprimuje genové produkty adenovirových ůseků ΕIA a EIB.
2. Buněčná linie podle nároku 1. kde alespoň jedna nukleová kyselina dále způsobuje expresi genových produktů adenovirových ůseků Ε2Λ. E2B a/nebo E4 a/nebo Cre rekombinázy.
15
3. Buněčná linie podle nároku 1 nebo 2, kde exprese genového produktu useku El A je pod kontrolou konstitutivního promotoru, výhodné promotoru fosfoglyccrátkinázy (PGK).
4. Buněčná linie podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3. kde exprese genového produktu/genovyeh produktů úseku EIB je pod kontrolou adenoviroveho promotoru, výhodně adenoviroveho EIB promotoru.
5. Buněčná linie podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde adenovirové genové produkty pocházejí z humánního adenoviru typu 5.
25
6. Buněčná linie podle kteréhokoli v z nároků 1 až 5. která je humánní buněčná linie.
7. Způsob přípravy permanentní buněčné linie amniocytů. vyznačující se t í m . že zahrnuje krok transfekce amniocytů alespoň jednou nukleovou kyselinou, která způsobuje e x pre s i aden ov i ro v v e h ge n o vých p rod u k t ů úseku Ε1A a ů se ku EIB.
8. Způsob podle nároku 7, vy z n a č u j í e í se t í ni, že sc užijí primární amnioeyty, konkrétně humánní primární amnioeyty.
9. Způsob podle nároku 7 nebo 8, v y z n a č u j í e í se t í m , že nukleová kyselina se užije 55 ve formě expresního vektoru.
10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9, v y z n a č u j í c í sc t í m , že exprese genového produktu úseku El A je pod kontrolou konstitutivního promotoru, výhodně promotoru fosfoglyeerátkinázy, PGK, a exprese genového produktu/genovýeh produktů, úseku EIB je pod
40 kontrolou adenoviroveho promotoru, výhodně adenoviroveho Ε1B promotoru.
11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 10, v y z n a č u j í c í se t í m , že transfekce amniocytů a/nebo výsledné buněčné linie navíc způsobuje expresi genových produktů adenovirových úseků E2A a/nebo E2B a/nebo E4 a/nebo Crc rekombinázy.
12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 1 !, v y z n a Č u j í c í se t ί iti, že adenovirové genové produkty pocházejí z humánního adenoviru typu 5.
13. Permanentní buněčná linie amniocytů. kterou lze připravit způsobem podle kteréhokoliv 50 z nároků 7 až 12.
14. Permanentní buněčná linie amniocytů N52.E6 DSM ACC2416.
15. Použití amniocytů pro přípravu adeno v i rem-trans formované permanentní buněčné linie 5 amniocytů.
16. Použití adenovirových genových produktů úseků EIA a E1B pro přípravu permanentní buněčné linie amniocytů.
io
17. Použití permanentní buněčné linie amniocytů pro produkci vektorů pro přenos genů a/nebo adenovirových mulanl.
18. Použití podle nároku 17 pro produkci adenovirových vektorů, vektorů AAV. adeno-asociované viry, ret rov i ro vých vektorů, len ti virových vektorů, chimérických vektorů adeno virus-A A V.
η chimérických vektorů adenovirus-retrovirus a/nebo chimérických vektorů adenovirus-lentivirus.
19. Použití podle nároku 18. kdy adenovirové vektory jsou adenovirové vektory první generace, adenovirové vektory druhé generace, adenovirové vektory s velkou kapacitou pro DNA a/nebo deletované adenovirové vektory.
2(1
20. Použití podle kteréhokoliv z nároku 17 až 19 pro produkci vektorů pro přenos genů s modifikovaným tropismem a/nebo adenovirových mutant s modifikovaným iropismem.
21. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 20, kdy buněčná linie amniocytů je definována 25 v kterémkoliv z nároků I až 6, 13 nebo 14.
22. Způsob produkce vektorů pro přenos genů a/nebo adenovirových mutant. vyznačující s c tím. že se užije permanentní buněčná linie amniocytů.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19955558A DE19955558C2 (de) | 1999-11-18 | 1999-11-18 | Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021709A3 CZ20021709A3 (cs) | 2002-08-14 |
| CZ300124B6 true CZ300124B6 (cs) | 2009-02-18 |
Family
ID=7929523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021709A CZ300124B6 (cs) | 1999-11-18 | 2000-11-07 | Permanentní bunecná linie amniocytu, zpusob její prípravy a její použití k produkci vektoru pro prenos genu |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1230354B1 (cs) |
| JP (1) | JP4456790B2 (cs) |
| CN (1) | CN100412201C (cs) |
| AT (1) | ATE257512T1 (cs) |
| AU (1) | AU784003B2 (cs) |
| CA (1) | CA2391591C (cs) |
| CZ (1) | CZ300124B6 (cs) |
| DE (2) | DE19955558C2 (cs) |
| DK (1) | DK1230354T3 (cs) |
| ES (1) | ES2211647T3 (cs) |
| HU (1) | HU227440B1 (cs) |
| IL (2) | IL149291A0 (cs) |
| PL (1) | PL205966B1 (cs) |
| PT (1) | PT1230354E (cs) |
| TR (1) | TR200400402T4 (cs) |
| WO (1) | WO2001036615A2 (cs) |
Families Citing this family (70)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1528101A1 (en) * | 2003-11-03 | 2005-05-04 | ProBioGen AG | Immortalized avian cell lines for virus production |
| WO2005080556A2 (en) | 2004-02-23 | 2005-09-01 | Crucell Holland B.V. | Virus purification methods |
| ATE412737T1 (de) | 2005-04-11 | 2008-11-15 | Crucell Holland Bv | Virusreinigung mit ultrafiltration |
| DE102005054628A1 (de) * | 2005-11-16 | 2007-05-24 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Verfahren zur Herstellung von permanenten humanen Zelllinien |
| CA2661748C (en) | 2006-08-28 | 2016-02-09 | Alex Eon-Duval | Process for the purification of fc-containing proteins |
| NZ593235A (en) | 2008-11-03 | 2013-02-22 | Crucell Holland Bv | Method for the production of recombinant adenovirus serotype 35 |
| DE102009003439A1 (de) | 2009-02-05 | 2010-08-26 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Neue permanente humane Zelllinie |
| ES2445713T3 (es) | 2009-10-15 | 2014-03-04 | Crucell Holland B.V. | Proceso para la purificación de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular |
| EP2488636B1 (en) | 2009-10-15 | 2014-03-12 | Crucell Holland B.V. | Method for the purification of adenovirus particles from high cell density cultures |
| CN102762721B (zh) | 2010-02-15 | 2015-03-11 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 用于生产Ad26腺病毒载体的方法 |
| AU2011307655B2 (en) | 2010-08-16 | 2015-12-17 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Permanent human amniocyte cell lines for producing influenza viruses |
| JP5969044B2 (ja) * | 2011-11-24 | 2016-08-10 | バイロメッド カンパニー リミテッド | アデノウイルス生産新規細胞株及びその用途 |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| PL2825640T3 (pl) | 2012-03-12 | 2016-10-31 | Partie rekombinowanych adenowirusów o zmienionych końcach | |
| WO2013139911A1 (en) | 2012-03-22 | 2013-09-26 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against rsv |
| EP2662451A1 (en) * | 2012-05-07 | 2013-11-13 | Stefan Kochanek | Nucleic acid construct and use of the same |
| US20150259387A1 (en) * | 2012-10-19 | 2015-09-17 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Production of a hcmv based vaccine in human amniocyte cell lines |
| EP2722337A1 (en) * | 2012-10-19 | 2014-04-23 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | Production of a HCMV based vaccine in human amniocyte cell lines |
| PT2988780T (pt) | 2013-04-25 | 2019-03-25 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Polipeptídeos f de pré-fusão do rsv solúveis estabilizados |
| CN105408348B (zh) | 2013-06-17 | 2021-07-06 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| WO2015000856A1 (de) | 2013-07-01 | 2015-01-08 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | Immortalisierte humane chorionzelllinie sowie verfahren zur immortalisierung humaner chorionzellen |
| CA2965562C (en) | 2014-11-04 | 2023-11-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Therapeutic hpv16 vaccines |
| EP3042952A1 (en) | 2015-01-07 | 2016-07-13 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | O-glycan sialylated recombinant glycoproteins and cell lines for producing the same |
| US10570417B2 (en) | 2015-04-14 | 2020-02-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter |
| EA035909B1 (ru) | 2015-07-07 | 2020-08-31 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv до слияния |
| EP3821906A1 (en) | 2015-07-07 | 2021-05-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against rsv comprising modified f polypeptide |
| EA037295B1 (ru) | 2015-08-20 | 2021-03-05 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Терапевтические вакцины против hpv18 |
| KR102500970B1 (ko) | 2016-04-05 | 2023-02-17 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Rsv에 대한 백신 |
| PH12022552125A1 (en) | 2016-04-05 | 2023-04-12 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble pre-fusion rsv f proteins |
| SG11201808809PA (en) | 2016-05-02 | 2018-11-29 | Janssen Vaccine & Prevention B V | Therapeutic hpv vaccine combinations |
| CN109154000B (zh) | 2016-05-12 | 2022-07-05 | 扬森疫苗与预防公司 | 有效和平衡的双向启动子 |
| WO2017207480A1 (en) | 2016-05-30 | 2017-12-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion rsv f proteins |
| US11001858B2 (en) | 2016-06-20 | 2021-05-11 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
| US10744196B2 (en) | 2016-07-14 | 2020-08-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HPV vaccines |
| MX2019009316A (es) | 2017-02-09 | 2019-09-19 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Promotor corto y potente para la expresion de genes heterologos. |
| EP3382014A1 (en) | 2017-03-29 | 2018-10-03 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | Recombinant glycoproteins with reduced antennary fucosylation |
| US11229692B2 (en) | 2017-05-17 | 2022-01-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection |
| EA202090738A1 (ru) | 2017-09-15 | 2020-06-10 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Способ безопасного индуцирования иммунитета против rsv |
| WO2019086466A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus and uses thereof |
| AU2018357912B2 (en) | 2017-10-31 | 2023-11-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus and uses thereof |
| AU2018359492B2 (en) | 2017-10-31 | 2023-12-14 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus and uses thereof |
| SG11202003398SA (en) | 2017-10-31 | 2020-05-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Adenovirus vectors and uses thereof |
| PE20211469A1 (es) | 2018-11-13 | 2021-08-05 | Janssen Vaccines And Prevention B V | Proteinas f de prefusion del vrs estabilizadas |
| TWI852977B (zh) | 2019-01-10 | 2024-08-21 | 美商健生生物科技公司 | 前列腺新抗原及其用途 |
| EP3736286A1 (en) | 2019-05-09 | 2020-11-11 | Biotest AG | Single chain factor viii molecule |
| WO2020229579A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Prophylactic treatment of respiratory syncytial virus infection with an adenovirus based vaccine |
| AU2020275455A1 (en) | 2019-05-15 | 2021-12-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine |
| EP3785726A1 (en) | 2019-09-02 | 2021-03-03 | Biotest AG | Factor viii protein with increased half-life |
| AU2020342349A1 (en) | 2019-09-02 | 2022-03-03 | Biotest Ag | Factor VIII protein with increased half-life |
| BR112022005268A2 (pt) | 2019-10-03 | 2022-08-16 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Vetores adenovirais e usos dos mesmos |
| AU2020385683A1 (en) | 2019-11-18 | 2022-06-30 | Janssen Biotech, Inc. | Vaccines based on mutant CALR and JAK2 and their uses |
| TW202144388A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途 |
| TW202144389A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途 |
| WO2021165226A1 (en) | 2020-02-17 | 2021-08-26 | Biotest Ag | Subcutaneous administration of factor viii |
| EP4176087A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-05-10 | Janssen Biotech, Inc. | A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment |
| US12295997B2 (en) | 2020-07-06 | 2025-05-13 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate neoantigens and their uses |
| WO2022009049A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-13 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate neoantigens and their uses |
| HRP20250766T1 (hr) | 2020-10-15 | 2025-08-15 | F. Hoffmann - La Roche Ag | Konstrukti nukleinske kiseline za transkripciju va rna |
| MX2023004178A (es) | 2020-10-15 | 2023-05-03 | Hoffmann La Roche | Construcciones de acido nucleico para la activacion simultanea de genes. |
| KR20240099288A (ko) | 2021-10-18 | 2024-06-28 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 아데노바이러스-연관 바이러스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 진핵세포 |
| EP4508241A1 (en) | 2022-04-13 | 2025-02-19 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for determining aav genomes |
| WO2023227438A1 (en) | 2022-05-23 | 2023-11-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Raman-based method for the differentiation of aav particle serotype and aav particle loading status |
| CN119301260A (zh) | 2022-06-03 | 2025-01-10 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于生产重组aav颗粒的方法 |
| AR129895A1 (es) | 2022-07-14 | 2024-10-09 | Hoffmann La Roche | Método para producir partículas de aav recombinantes |
| WO2024056561A1 (en) | 2022-09-12 | 2024-03-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for separating full and empty aav particles |
| CN120641755A (zh) | 2023-02-07 | 2025-09-12 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测抗aav颗粒抗体的方法 |
| WO2024194280A1 (en) | 2023-03-21 | 2024-09-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of recombinant aav particle preparations |
| CN117487761A (zh) * | 2023-09-25 | 2024-02-02 | 南京农业大学 | 表达Cre基因猪骨髓巨噬细胞系的构建方法及其应用 |
| WO2025158316A1 (en) | 2024-01-26 | 2025-07-31 | Janssen Biotech, Inc. | Ovarian neoantigens and use thereof |
| WO2025168663A1 (en) | 2024-02-09 | 2025-08-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing recombinant adeno-associated viral particles |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997000326A1 (en) * | 1995-06-15 | 1997-01-03 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
-
1999
- 1999-11-18 DE DE19955558A patent/DE19955558C2/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-11-07 PT PT00979539T patent/PT1230354E/pt unknown
- 2000-11-07 CN CNB008159017A patent/CN100412201C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 EP EP00979539A patent/EP1230354B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 HU HU0203387A patent/HU227440B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-11-07 JP JP2001538494A patent/JP4456790B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 PL PL357495A patent/PL205966B1/pl unknown
- 2000-11-07 AT AT00979539T patent/ATE257512T1/de active
- 2000-11-07 IL IL14929100A patent/IL149291A0/xx active IP Right Grant
- 2000-11-07 WO PCT/EP2000/010992 patent/WO2001036615A2/de active IP Right Grant
- 2000-11-07 CA CA002391591A patent/CA2391591C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 TR TR2004/00402T patent/TR200400402T4/xx unknown
- 2000-11-07 AU AU16990/01A patent/AU784003B2/en not_active Expired
- 2000-11-07 CZ CZ20021709A patent/CZ300124B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-11-07 ES ES00979539T patent/ES2211647T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 DE DE50004995T patent/DE50004995D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 DK DK00979539T patent/DK1230354T3/da active
-
2002
- 2002-04-23 IL IL149291A patent/IL149291A/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997000326A1 (en) * | 1995-06-15 | 1997-01-03 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Plouzek C.A. et al.: Isolation and characterization of a human amnion epithelial cell line that expresses the pregnancy-specific beta-1 glykoprotein gene", Endocrinology, 129(2): 950-958, 1991 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19955558A1 (de) | 2001-06-07 |
| CA2391591A1 (en) | 2001-05-25 |
| DE19955558C2 (de) | 2003-03-20 |
| CN100412201C (zh) | 2008-08-20 |
| CZ20021709A3 (cs) | 2002-08-14 |
| WO2001036615A2 (de) | 2001-05-25 |
| AU784003B2 (en) | 2006-01-12 |
| PL357495A1 (en) | 2004-07-26 |
| PL205966B1 (pl) | 2010-06-30 |
| HUP0203387A3 (en) | 2005-07-28 |
| WO2001036615A3 (de) | 2002-01-10 |
| CA2391591C (en) | 2008-12-30 |
| PT1230354E (pt) | 2004-04-30 |
| JP2003514526A (ja) | 2003-04-22 |
| CN1433476A (zh) | 2003-07-30 |
| IL149291A (en) | 2008-11-26 |
| DK1230354T3 (da) | 2004-03-22 |
| HUP0203387A2 (hu) | 2002-12-28 |
| ES2211647T3 (es) | 2004-07-16 |
| ATE257512T1 (de) | 2004-01-15 |
| AU1699001A (en) | 2001-05-30 |
| EP1230354A2 (de) | 2002-08-14 |
| EP1230354B1 (de) | 2004-01-07 |
| TR200400402T4 (tr) | 2004-03-22 |
| JP4456790B2 (ja) | 2010-04-28 |
| HU227440B1 (en) | 2011-06-28 |
| DE50004995D1 (de) | 2004-02-12 |
| IL149291A0 (en) | 2002-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU784003B2 (en) | Permanent amniocyte cell line, the production thereof and its use for producing gene transfer vectors | |
| US6558948B1 (en) | Permanent amniocytic cell line, its production and use for the production of gene transfer vectors | |
| ES2966692T3 (es) | Vectores de virus adenoasociados poliploides y métodos de fabricación y uso de los mismos | |
| US20090098599A1 (en) | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use | |
| Wu et al. | A 50-kDa membrane protein mediates sialic acid-independent binding and infection of conjunctival cells by adenovirus type 37 | |
| KR20010034487A (ko) | 섬유 혹의 ｈｉ 루프내에 이종성 펩타이드 에피토프를함유하는 아데노바이러스 벡터 | |
| US7456008B2 (en) | Modified virus comprising one or more non-native polypeptides | |
| CN113950526A (zh) | 通过靶向体内表观遗传阻遏实现的持久镇痛 | |
| AU2001270879A1 (en) | Modified virus having altered tropism | |
| WO2000042208A1 (en) | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use | |
| CN114008209A (zh) | Aav介导的枫糖尿症(msud)基因疗法 | |
| AU2001263689B2 (en) | Modified bovine adenovirus having altered tropism | |
| CN114846141B (zh) | 一种分离的核酸分子及其应用 | |
| Murakami et al. | Chimeric adenoviral vectors incorporating a fiber of human adenovirus 3 efficiently mediate gene transfer into prostate cancer cells | |
| KR102208879B1 (ko) | 핵산 구조 및 이의 용도 | |
| DE29924144U1 (de) | Permanente Amniozyten-Zelllinie | |
| FR2860004A1 (fr) | Nouveau vecteur adenoviral pour l'infection de cellules deficientes ou depourvues en recepteurs car | |
| CN113462658A (zh) | 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用 | |
| CN109082443A (zh) | 一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法 | |
| HK40061867A (en) | Recombinant newcastle disease virus, preparation method, recombinant plasmid and application thereof | |
| HK40061868A (en) | Recombinant newcastle disease virus, preparation method, recombinant plasmid and application of recombinant newcastle disease virus | |
| CN113462657A (zh) | 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用 | |
| Class et al. | Patent application title: NUCLEIC ACID CONSTRUCT AND USE OF THE SAME Inventors: Stefan Kochanek (Ulm, DE) Stefan Kochanek Tanja Lucas (Regensburg, DE) Claudia Kueppers (Weil Am Rhein, DE) | |
| CN116768983A (zh) | 一种用于慢性乙型肝炎预防和/或治疗的蛋白、编码基因、重组腺相关病毒及其应用 | |
| Coughlan | Transductional retargeting of human adenovirus type 5 to ανβ6 integrin for cancer gene therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20181107 |