KR102208879B1 - 핵산 구조 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 발현 유닛이 프로모터, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 및 3'UTR을 포함하고, 여기서 프로모터는 E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 3'UTR는 30 개 이하, 바람직하게 20 개 이하의 EEE(Exonic Enhancer Elements)를 포함하고, 여기서 3'UTR은 비-바이러스(non-viral) 3' UTR인, E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하는 핵산 구조(nucleic acid construct)에 관한 것이다.

Description

핵산 구조 및 이의 용도{NUCLEIC ACID CONSTRUCT AND USE OF THE SAME}
본 발명은 E1A의 발현을 위한 발현 유닛 및 E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하는 핵산 구조(nucleic acid construct), 상기 핵산 구조를 포함하는 벡터, 상기 핵산 구조 및/또는 벡터를 포함하는 세포, 상기 핵산 및/또는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 영구 양수세포 세포주(permanent amniocytic cell line)의 제조 방법, 영구 양수세포 세포주(permanent amniocytic cell line), 그 세포의 이용, 유전자 전달 벡터 또는 아데노바이러스 돌연변이의 제조 방법, 및 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
1. 아데노 바이러스 및 아데노 바이러스 감염 주기(infectious cycle)
아데노 바이러스는 아데노 바이러스과(Adenoviridae)에 속하는 비-외피성(non-enveloped) 바이러스이다. 그것들은 약 36 kb(킬로베이스)의 사이즈를 갖는 선형 이중-가닥 DNA 게놈(linear double-stranded DNA genome)을 운반한다. 바이러스 게놈은 양쪽 끝에 복제의 원점으로 역위 말단 반복 시퀀스(ITRs, inverted terminal repeat sequences)를 포함하고, 왼쪽 끝에 패키징 신호(packaging signal)를 포함한다. 아데노 바이러스는 인간 및 침팬지를 포함하는 많은 척추동물로부터 분리되었다. 50 개 이상의 인간 혈청형이 DNA 시퀀스에 기초하여 구별될 수 있다. 감염 주기(infectious cycle) 동안, 바이러스 입자는 수용체 매개 세포내 섭취(receptor-mediated endocytosis)에 의해 세포 내로 들어가고, 바이러스 게놈은 DNA-단백질 복합체(DNA-protein complex)로서 핵에 들어간다. 아데노 바이러스 감염 주기는 초기 및 후기로 나누어지고, 이는 아데노 바이러스 복제의 시작에 의해 분리된다(Shenk, in: Virology, Fields ed., Lippincott-Raven Publishing, Philadelphia, pp. 21 1 1-2148, 1996). 초기에서, 즉 복제 전에, 초기 바이러스 기능 El, E2, E3 및 E4의 발현이 있다. 후기는 바이러스 구조 단백질의 발현 및 새로운 바이러스 입자의 생산을 담당하는 후기 유전자의 전사(transcription)에 의해 특정된다.
E1A는 바이러스 게놈이 핵에 들어간 이후 발현되는 첫 번째 바이러스 유전자이다. E1A 유전자는 E1A RNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 형성되는 12S 및 13S 단백질을 코딩한다. pRB, pi 07, pi 30, p300(CBP), p400, TRAP 등을 포함하는 여러 세포 단백질에 결합함으로써(Berk, 2005), E1A 단백질은 세포의 DNA 합성을 활성화하고, S-기 진입을 촉진하며, 세포의 수많은 유전자를 각각 활성화하고 억제하여, 세포가 바이러스 감염 주기를 허용하도록 지시한다. 또한, E1A는 E1 B, E2, E3, E4 및 MLTU(major late transcription unit)을 포함하는 대부분의 다른 아데노 바이러스 유전자를 활성화시킨다. E1A의 단독 발현은 아폽토시스(apoptosis)를 야기한다.
E1B는 E1A에 의해 활성화되는 초기 바이러스 유전자 중의 하나이다. E1B 유전자는, E1B RNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성되는 잘 알려진 E1B 55 kD 및 E1B 19 kD 단백질을 포함하는 여러 단백질을 코딩한다. E1B 55 kD(E1B 55K라고도 불리는) 단백질은 p53 종양 억제 인자(p53 tumor suppressor)와의 상호작용에 의해 세포 주기의 진행을 조절하고, 감염(infection)의 후기에 세포 mRNA의 수송을 방지하는데 관여하며, 세포의 E1A-유도 아폽토시스를 방지한다. The E1B 19 kD(E1B 19K라고도 불리는) 단백질은 마찬가지로 세포의 E1A-유도 아폽토시스를 방지하는데 중요하다.
로덴트(rodent) 세포는 E1A 및 E1B 단백질의 발현에 의해 세포 배양에서 쉽게 형질전환될 수 있고, 로덴트(rodent) 세포에서 E1A 및 E1B 단백질의 동시발현(co-expression)은 형질 전환 현상이 일어나기에 필요하고 충분한 것으로 간주된다. E1B 55K 및 19 단백질을 코딩하는 전사체(transcripts) 이외에도, 역시 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성되는 세 개의 추가 E1B 전사체(transcripts)가 동정되었으며, (E1B-156R) 중의 하나가 형질 전환을 촉진하는 것으로 나타났다(Sieber et al. 2007). 야생형 아데노 바이러스 게놈의 맥락에서, 모든 E1B 전사체는 pIX 유전자의 5'-비전사된 전사체(5'-untranslated transcript)의 일부(즉, pIX 프로모터 및 pIX의 번역 시작(translational start) 사이)와 겹치는 공통의 하부 스플라이싱 억셉터(downstream splice acceptor)를 사용한다. hAd5 (NCBI Reference Sequence: AC_000008)에서, 이 스플라이싱 억셉터(splice acceptor)는 hAd5 게놈 서열의 3595 뉴클레오티드에 위치한다.
감염 주기 동안 발현되는 다음의 유전자는, 모든 바이러스 게놈의 복제에 관여하는 세 가지 단백질(프리터미널 단백질(pTP, preterminal protein), DNA 중합효소(Pol, DNA Polymerase), DNA-결합 단백질(DBP, DNA-binding protein))을 코딩하는 E2A 및 E2B이다.
E3는 주로 아데노 바이러스 감염에 대한 숙주 방어의 대응에 관여하고, 세포 배양에서 바이러스의 성장을 위해서는 불필요하다.
감염 주기의 초기에 또한 발현되는 E4는 다양한 단백질들을 코딩한다. 다른 기능의 E4 블록(blocks)에 부가하여, E1B 55 단백질과 함께, 세포질에서 세포 mRNA의 축적, 및 동시에 그것은 세포 핵으로부터 세포질로 바이러스 RNA의 운반을 용이하게 한다.
DNA 복제의 개시는 바이러스 캡시드(capsid)의 형성 및 바이러스 DNA 응축(condensation)을 위해 필요한 구조 단백질(structural proteins)의 발현 후에 시작된다. 후기 감염 주기 동안 바이러스 DNA는 바이러스 캡시드(capsid)로 패키징된다. 바이러스 캡시드로의 바이러스 게놈의 패키징의 정확한 메커니즘은 아직도 밝혀져 있지 않으나, 바이러스 게놈의 왼쪽 말단(terminus)에 위치하는 패키징 신호와 여러 바이러스-코딩 단백질(virus-encoded proteins)의 상호작용이 관련되어 있다.
2. 아데노 바이러스 벡터
아데노바이러스에 기반한 상이한 벡터 타입이 개발되어 왔다(McConnell et al. 2004; Imperiale et al. 2004).
아데노 바이러스 벡터는 보통 적어도 E1A 및 E1B 유전자가 결실되어 있어서, 인간 세포에서 복제 불능(replication-deficient)이다. 생산은 E1A 및 E1B 단백질을 발현하고 E1A 및 E1B 유전자가 염색체에 통합되어 있는 인간 상보(complementing) 세포주에서 일어난다.
ΔE1Ad 벡터(E1-결실(deleted) Ad 벡터 또는 제1세대 Ad 벡터(first-generation Ad vector)라고도 불리는)는 유전자 치료 또는 유전자 백신의 전임상 연구개발, 임상 연구 및 제품 개발에서 실험 도구로 광범위하게 사용되는 주요한 벡터 타입이다. 이 벡터 타입은 E1A 및 E1B 단백질을 코딩하는 E1 부위(ΔE1)의 제거에 의한 복제 결함이 있는 일차 세포(primary cell)에서 만들어진다.
또한 많은 ΔE1Ad 벡터는 E3 부위의 부분적 또는 완전 결실을 포함하는데((ΔE1/ΔE3 Ad 벡터), 다른 어떤 것 보다도 바이러스-숙주 상호작용을 조절하고 면역 시스템을 방해하는 기능 때문에, E3는 세포 배양시 벡터의 생산을 위해 제거된다. 아직까지, 대부분의 ΔE1Ad 벡터는 인간 아데노 바이러스 타입 5(hAd5)를 기반으로 한다. 그러나, 다른 인간 아데노 바이러스 타입(예를 들어, hAd6, hAd26, hAd35 등) 및 비-인간 아데노 바이러스 타입(예를 들어, 침팬지로부터 유도된)에 기반한 벡터가 개발되었다(Bangari et al. Vacci2006).
제2세대 벡터는 E2 유전자 및/또는 E4 유전자를 포함하는, 바이러스 게놈의 다른 초기 부위에서 추가적인 돌연변이를 운반하는 ΔE1Ad를 기반으로 한다(Imperiale et al. Curr Top Microbiol Immunol 2004, 273, 335-57). 그것들은 E1A 및 E1B 유전자에 부가하여, 또한 벡터의 게놈에서 돌연변이화된 각각의 아데노 바이러스 유전자 또는 유전자들이 발현된 세포주에서 생산된다. 예를 들어, E2 유전자 중의 하나인 DNA 결합 단백질(DBP)가 결실된 Ad 벡터는 E1A 및 E1B 유전자에 부가하여 DBP가 발현된 세포주에서 생산된다.
HC-Ad(high-capacity Ad) 벡터(헬퍼-의존(helper-dependent) Ad 벡터라고도 불리는)에서, 모든 바이러스 코딩 시퀀스는 관심있는 전이유전자(transgene)(들)에 의해서 대체된다. 대부분의 경우에서 추가적인 스터퍼(stuffer) DNA가 생산 동안 재배열을 방지하기 위해 벡터에 포함된다. 최근의 생산 시스템은 Cre 또는 Flp 재조합효소(recombinase)를 발현하는 세포주의 생산과 함께 모든 비-구조적 및 구조적 바이러스 기능을 트랜스로(in trans) 제공하는 복제 불능(replication-deficient)(ΔE1) 헬퍼 바이러스의 이용에 기반한다(Parks et al., 1996; Umana et al., 2001).
부착 또는 부유 세포 배양에서 Ad 벡터의 생산 및 정제 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고 기술되어 있다(Silva et al., 2010).
3. E1A 및 E1B 유전자를 가진 인간 세포의 형질전환에 의한 세포주의 생산 생성
전통적으로, ΔE1Ad 벡터는 주로 인간 아데노 바이러스 타입 5의 절단된 DNA(sheared DNA)를 가지는 HEK(human embryonic kidney) 세포의 형질주입(transfection)에 의해 생성되는 293 세포에서 생산되었다(Graham et al., 1977). 각 실험마다 사용된 20 개의 HEK 배양물의 평균을 가지는, 8 번의 형질주입(transfection) 실험의 총합에서, 단일 영구화(immortalized) 세포 클론만을 얻었다(Graham et al., 1977). 이러한 세포 클론으로부터 구축된 세포주, HEK 293은 E1A 및 E1B 유전자, 왼쪽 ITR 및 아데노 바이러스 패키징 신호를 포함하는 Ad5 유전자의 염색체에 통합된 1 번 내지 4344 번 뉴클레오티드(nt.)를 포함한다(Louis et al., 1997).
로덴트(rodent) 세포를 아데노 바이러스 E1 기능으로 쉽게 형질전환 할 수 있음에도 불구하고, 일차 인간 세포는 E1A 및 E1B 유전자로 형질전환 하는 것이 어려움이 주지의 사실로서 알려져 있다. Gallimore와 동료들은 Ad 12의 E1 기능으로 일차 HEK 세포를 형질전환 하는 것을 시도하였다(Gallimore et al., 1986). 이러한 실험을 E1A 및 E1B 유전자를 포함하는 Ad 12의 EcoRI cDNA 단편(fragment)의 1 mg 이상을 가지고 3년에 걸쳐 수행하였으나 실패하였다. 수많은 실험이 수행되었음에도 불구하고, 네 개의 Ad 12-E1 HEK 세포주만이 분리되었다(Whittaker et al., 1984). 마찬가지로, 동일한 그룹은 케라틴세포(keratinocytes), 피부 섬유아세포(skin fibroblast), 간세포(hepatocytes) 및 신장세포(urothelial cells)를 포함하는 다른 일차 인간 세포를 E1 기능으로 형질전환하는 것을 실패하였다(Gallimore et al., 1986). 아데노 바이러스 E1 기능으로 반복적으로 형질전환된 하나의 세포 타입은 인간 배아 망막 세포(HER cells, human embryonic retinal cells)이다(Byrd et al., Nature 298, 69-71 , 1982). HER 세포의 형질전환 효율이 일차 랫트(rat) 세포의 그것보다 낮음에도 불구하고, HEK의 그것에 비해서는 100 배 이상 높았다. 이 연구는 Ad 12 E1 돌연변이의 분리를 위한 상보(complementing) 세포주를 생산하기 위하여 시작되었다.
hAd5의 79 번 내지 5789 번의 뉴클레오티드(nt) 단편을 포함하는 구조를 가지는 HER의 형질주입(transfection)은, ΔE1 Ad 벡터의 성장을 지원하고 적어도 293 세포의 생산 수율과 일치하는 911 세포주를 생성했다.(Fallaux et al., 1996). 그러나, AE1Ad 벡터와의 광범위한 중복(overlap) 때문에, 911 및 293 세포 모두 생산하는 동안 벡터 게놈 및 염색체에 통합된 E1 부위 사이에 상동(homologous) 재조합 이벤트로서, 복제 가능 아데노 바이러스(RCA, replication competent adenovirus)가 정기적으로 발생하는 경향이 있다(Lochmuller et al., 1994; Hehir et al., 1996). 중요하게, 특히 벡터의 계대 배양(serial passage) 및 대규모 벡터 생산 동안 제어되지도 않고 피할 수도 없는 이러한 것이 자주 발생한다. 미국 식품의약국(FDA) 가이드라인은 임상적 투여를 위해 3x1010 벡터 입자에 하나 미만의 RCA가 존재하도록 요구한다(Biological Response Modifiers Advisory Committee, 2001).
Ad 벡터 생산 동안 RCA 출현 위험을 회피 및/또는 방지하기 위해, 일반적으로 사용되는 Ad 벡터의 DNA를 가지는 어떤 상동성(homology)이 결여되고 최소화된 E1 DNA 단편을 포함하는 다른 E1-트랜스상보(El-transcomplementing) 세포주가 개발되었다. 특히, HER 세포는 ΔE1Ad 벡터와 중복되는 임의의 동일한 시퀀스가 제거된 구조를 코딩하는 새로운 E1A 및 E1B로 형질전환 되었다. 인간 포스포글리세르산인산화효소(PGK, phosphoglycerate kinase) 프로모터에 의한 E1A 프로모터 및 B형 간염 표면(HbS, hepatitis B virus surface) 항원(인트론을 포함하지 않는)의 mRNA 프로세싱 요소(elements)에 의한 E1B의 3'UTR(3'-untranslated region)의 대체에 의해, hAd5 시퀀스의 459 번 내지 3510 번 뉴클레오티드(nt.)를 유일하게 포함하는 E1-형질전환된 세포주 PER.C6가 생산되었다(Fallaux et al., 1998). 따라서, 이 부위가 결핍된 ΔE1Ad 벡터를 매칭(matching)하는 것은 이러한 세포 내에서 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 발생하는 RCA 없이 효율적으로 번식시킬 수 있다. 그러나, PER.C6 세포에 대한 두 개의 문헌에서 E1 기능을 수행하고 발현하는 벡터 표본(specimen)이 발생하는 특이한 벡터 재조합이 관찰되었다. 첫 번째 문헌에서(Murakami et al., 2002), 벡터는 E1 영역과 통합된 177 뉴클레오티드(nt.)의 중복을 가졌고, 헬퍼-의존 E1-양성 입자(HDEPs, helper-dependent El -positive particles)가 하나의 상동(homologous) 및 하나의 비상동(heterologous) 재조합 이벤트에 의해 생성되었으며, 이는 아데노 바이러스 벡터 백본(backbone)의 일부의 부수 삭제(concomitant deletion)를 야기했다. 그 결과로서 Ad 벡터 제제(preparation)는 두 개의 상이한 입자 종(species)을 포함했다: 원래의 ΔE1 벡터 및 E1 영역-포함 재조합체(E1 region-containing recombinant). 두 번째 문헌(Murakami et al., 2004)에서, E1 영역-양성 재조합체 입자(E1 region-positive recombinant particles)는, 부모 벡터 시퀀스(parental vector sequence)가 통합된 E1 영역과 중복되지 않았음에도 불구하고, 기술되었다. 여러 개의 상이한 독립적인 E1-양성 분리균(E1-positive isolates)의 상세한 분석은 패키징 신호(packaging signal)을 포함하는 아데노 바이러스 왼쪽 ITR에 의해 배치된(flanked) E1 영역의 여러 카피들의 회귀성(palindromic) 구조를 포함하는, 유사한 재조합체(recombinant)의 구조를 보였다. 저자의 해석에 따르면, 재조합체(recombinant)는 대부분 ΔE1Ad 벡터 및 E1-영역에 근접한 염색체 DNA 사이에서 비상동 재조합(heterologous recombination)을 따라 생성되었다. 또한 저자는 E1-양성 재조합체(E1-positive recombinants)의 생성은 PER.C6 세포에 존재하는 10내지 20개의 E1 영역 통합체(integrates)의 (일부의) 관찰된 대접전 이량체(head-to-head dimer) 구조에 의해 용이하게 된다는 것을 추측했다.
hAd35에 기반한 벡터가 되는 실시예인 ΔE1Ad 벡터에 기반한 일부 비-hAd5는, hAd5의 E1A 및 E1B 모두를 발현하기 때문에, 293 세포 또는 PER.C6 세포와 같은 정규의 생산 시스템에서 증식될 수 없는 반면, hAd35 기반의 벡터는 hAd35의 E1B 기능(function)의 생산을 필요로 한다. 따라서, 그와 같은 벡터의 생산을 위해, 부족한 기능은 세포주의 생산에서 제공될 필요가 있다. 예를 들면, hAd35-기반의 벡터의 경우에, hAd35의 E1B 기능은 세포주에 의해 제공되어야만 한다(Vogels et al., 2003, Gao et al., 2003).
더욱 최근에, 인간 양수세포는 E1 기능(Schieder et al., 2000) 및 E1/pIX 유전자(chieder et al., 2008))의 형질전환을 따르는 세포주의 생산을 위한 대안적인 세포 제공원임이 확인되었다. 세포주 N52.E6(Schiedner et al., 2000)에서 E1A 및 E1B를 발현하는 플라스미드 구조의 설계는 PER.C6 세포에서와 같이 유사했으며, 원칙적으로 벡터 DNA와 통합된 E1 영역 사이의 임의의 시퀀스 중복의 부재 때문에, 벡터 생산 동안 RCA의 발생을 배제했다.
ΔE1 벡터를 위한 생산 세포주를 생성시키기 위한 추가적인 시도가 있었다. 상기에서 논의된 세포주와 달리, 원래(origina) 세포주의 문헌에 기록된 저조한 생성때문에, 그것들의 임상 등급의 소재로 적합하지 않은 종양 형성 기원(tumorigenic origin) 및 높은 종양형성 가능성(tumorigenicity)에도 불구하고, 그것들은 모두 HeLa 및 A549 세포와 같은 확립된 세포주를 기반으로 했다(reviewed in Silva et al., 2010).
4. 세포 배양에서 일차 세포의 영구화
동물 또는 인간으로부터 분리된 경우, 세포 배양 접시로 취해지고 적절한 영양이 제공된 포유류 세포는, 제한된 시간 동안에만 계대 배양에 의해 배양될 수 있다. 이 현상은 Hayflick(Hayflick and Moorhead, 1961)에 의해 최초로 설명되었고, 세포 노화로 불린다. 세포 배양에서 노화 세포는 그것들의 형태가 변화하여 크고 평평하게 된다; 그것들은 대사적 활성이 남아있는 동안 분열을 중지한다. 유전자 발현, 단백질 프로세싱(processing) 및 대사에 뚜렷한 변화가 있고, 유용한 마커로서, 세포는 노화-관련 베타-갈락토시다제(SA-β-gal, senescence-associated -β-galactosidase)에 대하여 양성으로 염색된다(Weinberg, R.A., The Biology of Cancer, 2007, Garland Science). 세포 배양 및 노화에서 일차 포유류 세포의 복제 잠재력(replicative potential)의 제한은 주로 세포 배양 조건으로 인한 세포-생리학적 스트레스 요인(cell-physiologic stress factors)(p16/INK4a 및 다른 것들의 빈번한 상향조절(upregulation)과 같은, 특정 신호전달체계(signaling pathways)의 변경에 의해 특정되는(Ben-Porath and Weinberg, 2005)) 및 세포 DNA 복제 동안 발생하는 소위 말단복제 문제(endreplication problem)로 인한 염색체 말단에서 텔로미어 길이의 감소와 모두 관련이 있다(상기 Weinberg, R.A., 2007). 텔로미어는 염색체의 말단에 위치하고, 짧은 헥사뉴클레오티드(hexanucleotide) DNA 반복으로 구성되고, 많은 단백질과 관련이 있으며, 염색체의 무결성을 보호하고, 예를 들어, 다른 염색체 사이의 융합 이벤트를 방지한다. 텔로미어 길이는 촉매소단위(catalytic subunit) hTERT 및 RNA 서브유닛(hTR)으로 구성되는 필수적인 텔로머라제 전효소(telomerase holoenzyme)를 포함하는 여러 단백질의 활성에 의해 유지된다. 일차 세포에서, hTERT의 활성은 텔로미어 길이를 일정하게 유지하기에 너무 낮아서, 세포 DNA의 복제 동안 텔로미어 반복(telomeric repeats)의 점진적인 소실을 야기한다. 인간에서, 일차 세포가 노화에 들어가기 전에 최대로 통과 할 수 있는 복제성 배가(replicative doublings)의 수는 약 50 내지 60의 집단 배가수(PD, population doublings)의 범위에 있고, 세포가 증가된 나이를 가지는 개체로부터 분리될 때 천천히 감소한다 (상기 Weinberg, R.A., 2007). PD의 수는 또한 특정 세포 타입 및 세포 배양 조건에 의존한다. 일부 세포는 단지 극소수의 PD 동안 세포 배양으로 취해질 수 있고, 다른 세포는 더 큰 수의 PD 동안 세포 배양으로 취해질 수 있으나, 상기에서 언급한 한계를 훨씬 넘어설 수는 없다.
적절한 영양을 제공받을 때, 세포 배양에서 무기한으로 유지될 수 있는 세포는 불멸(immortal)이라 하고, 그러한 세포는 또한 세포주 또는 영구 세포주로 지칭될 수 있다. 정상의 인간 일차 세포는 일반적으로 자발적으로 영구화(immortalized)되지 않는다. 그러나, 영구화(immortalization)는, 예를 들어 세포 또는 바이러스 종양 형성 유전자(oncogenes)의 도입 또는 종양 억제 유전자(tumour suppressor genes)에서 돌연변이의 도입에 의해 실험적으로 달성될 수 있다.
위기(crisis)는 대부분의 세포가 세포 사멸을 겪게 될 지점까지의 텔로미어 길이의 감소에 기계적으로 연결된 용어이다. 이것은, 예를 들어 암 세포가 세포 배양에 취해지는 경우, 관찰될 수 있다. 복제성 배가(replicative doublings)의 특정 수 이후에, 대부분의 세포는 텔로미어 길이 단축으로 인한 세포 사멸을 겪을 것이다. 부가적인 돌연변이에 의한 증가된 성장률 및 생존을 위해 일반적으로 선택된 개별 세포만이 드물게 생존할 것이다. 예를 들어, 인간 섬유아세포(fibroblasts) 또는 상피세포(epithelial cells)인 인간 일차 세포가 세포 배양에 취해지는 경우, 세포는 그것들이 노화 표현형를 얻을 때까지 적은 수의 PD를 위한 계대(passaging)에 의해 유지될 수 있다는 것이 빈번하게 관찰된다. 이 노화의 초기 타입은, 예를 들어 SV40의 큰 T 항원(large T Antigen)의 이러한 세포에서의 발현에 의해 지연될 수 있고(상기 Weinberg, R.A., 2007), 이는 종양유전자로 조작되어진 단백질(oncoproteins) pRB 및 p53의 불활성화를 야기한다. 그러나, PD의 특정 수 이후 및 남아있는 길이에 따라, 세포는 텔로미어 붕괴(collapse)로 인한 위기에 들어갈 것이다. 텔로머라제(telomerase)를 활성화하거나 텔로미어를 유지하는 다른 방법을 관여시키는-텔로미어의 대체 연장(ALT, alternate lengthening of telomeres)이라 불리는- 세포만이 생존할 기회를 가진다. 현재의 이해에 따르면, 위기(crisis)는, 핵형(karyotype)의 구조적 이상이 우선적으로 확립된 때, 소위 절단융합가교환(breakage-fusion-bridge(BFB) cycles)에 따른 침식된 (텔로미어가 고갈된) 염색체 말단 사이의 융합으로 인한, 시간이고, 이는 핵형의 카오스(karyotypic chaos)를 야기한다(상기 Weinberg, R.A., 2007). 배양 동안 발생하는 다른 돌연변이와의 조합에서, 이러한 이상(abnormalities)은, 그들로 하여금 위기를 회피하고 영구화될 수 있는, 선택적 성장 이점을 가진 일부 세포를 제공한다.
5. 생물 제제(biologies)의 생산을 위한 인간 세포의 용도
인간 세포는 인간 또는 동물의 치료, 진단 또는 예방 용도를 위한 바이러스 벡터, 단백질, 바이러스 및 백신과 같은 어떤 생물 제제(biologies)의 생산을 위한 산업에서 중요한 관심사이다. 치료 또는 예방적 목적으로 사용될 수 있는 바이러스 벡터를 위한 예는 아데노 바이러스, 레트로 바이러스, 허피스 심플렉스(herpes simplex) 바이러스 또는 파보 바이러스(parvovirus)를 포함하는 상이한 바이러스에 기반한 벡터이다. 오늘날 사용되는 대부분의 바이러스 벡터는 293 세포와 같은 인간 세포에서 생산된다. 그것들은 기능적 연구를 위해, 유전자 치료와 같은 치료목적을 위해, 또는 유전자 백신 접종(genetic vaccination)과 같은 치료 또는 예방 목적을 위해 사용될 수 있다. 박테리아와 같은 단순한 기관에서 생산될 수 없거나, 어떤 번역 후 변형(posttranslational modifications)에 의해 특징지워지는 단백질은 빈번하게 그것들의 생산을 위해 포유류 세포의 사용을 필요로 한다. 인단 세포에서 생산될 수 있는 생물 제제(biologies)의 예는, 치료 또는 진단용 항체(antibodies) 또는 예를 들어 혈액 응고 인자 또는 섬유소용해성(fibrinolytic proteins) 단백질을 포함하는 치료용 당단백질(glycoproteins)이다. 많은 인간 백신은 인간 세포에서 잘 자라는, 불활성화 되거나 약독화된 인간 바이러스에 기반한다. 또한 많은 서브유닛 단백질 백신(subunit protein vaccines) 또는 바이러스-유사-입자(VLPs, virus-like-particles)와 같은 컴플렉스 백신(complex vaccines)이 인간 세포에서 생산될 수 있다.
그러나, 산업적 규모로 생물 제제를 생산하기 위해서는, 일차 세포보다 영구 세포주의 사용이 필수적이다. 일반적으로, 일차 세포는 시장 공급을 위해 충분히 큰 규모로 단백질 또는 바이러스의 생산을 허용할 충분한 양으로 종종 확장될 수 없다. 영구 세포주는 매우 큰 세포수로 성장할 수 있으나, 부작 세포 배양 또는 현탁액에서의 배양은, 예를 들어 영구화(immortalization)의 과정 동안 텔로미어의 단축 또는 돌연변이를 야기하는 세포 배양 동안의 산화적 스트레스(oxidative stress)로 인해, 배양된 세포의 유전적 안정성을 유지하기 어렵다는 것이 잘 알려져 있다. 그러나, 세포주의 유전적 안정성은 높은 질(예를 들어, 당단백질의 일관성 있는 당화(glycosylation)로 특징지워 지는), 활성(예를 들어, 일관성 있는 백신의 면역원성(immunogenicity)에 의해 특징지워 지는) 및 균일성(예를 들어, 상이한 생산 실행(runs) 사이의 산물의 작은 변형)의 잘-특성화된(well-characterized) 제품의 산업적 생산을 위해 매우 중요하다.
따라서, 본 발명의 근본적인 과제는 유전적으로 안정적인 세포주의 생성을 허용하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 근본적인 과제는 유전적으로 안정적인 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 근본적인 과제는, 다른 것들 중에서, 인간 또는 동물을 위한 치료, 진단, 예방용 생물 제제(biologies)의 생산에 사용될 수 있는 영구화(immortalized)되고 유전적으로 안정적인 인간 세포주의 향상된 생성을 위한 방법을 실행하는 것을 허용하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 근본적인 이들 및 다른 과제들은 첨부된 독립 청구항의 내용에 의해 해결된다. 바람직한 구현예는 첨부된 종속 청구항으로부터 얻을 수 있다.
특히, 본 발명의 근본적인 과제는
-발현 유닛은 프로모터, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 및 3'UTR을 포함하고, 여기서 프로모터는 E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 3'UTR는 30 개 이하의 EEE(Exonic Enhancer Elements)를 포함하는, E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하는,
핵산 구조에 의한, 제1 양태의 제 1 구현예이기도 한, 제1 양태에서 해결된다.
제1 양태의 제1 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제2 구현예에서, 핵산 구조는
-발현 유닛은 프로모터, E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 및 3'UTR을 포함하고, 여기서 프로모터는 E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스에 작동가능하게 연결되어 있는, E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 포함한다.
제1 양태의 제1 및 제2 구현예의 구현예이기도 한 제1 양태의 제3 구현예에서, 핵산 구조는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛 및 E1B의 발현을 위한 발현 유닛 모두를 포함하는 한 조각의 핵산 분자(one-piece nucleic acid molecule)이다.
제1 양태의 제3 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제4 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛 및 E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 다음의 한 조각의 핵산 분자 내에 배치된다:
E1B-3'의 발현을 위한 E1A-발현 유닛의 발현을 위한 5'-발현 유닛.
제1 양태의 제1, 제2, 제3 및 제4 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제5 구현예에서, 핵산 구조는 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자를 포함하는 두 조각의 핵산 분자이고, 여기서 제1 핵산 분자는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하고 제2 핵산 분자는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제6 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3'UTR은 20 개 이하의 EEE(Exonic Enhancer Elements)를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6의 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제7 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3'UTR은 5 개 이하의 EEE(Exonic Enhancer Elements)를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7의 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제8 구현예에서, EEE(Exonic Enhancer Elements)는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3'UTR의 뉴클레오티드의 스트레치(stretch) 내에 포함되고, 뉴클레오티드의 이러한 스트레치는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3'UTR의 5' 말단의 200 뉴클레오티드를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 및 제8의 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제9 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 스플라이스 도너 부위(splice donor site), 인트론 및 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)를 포함한다.
제1 양태의 제9 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제10 구현예에서, 스플라이스 도너 부위(splice donor site), 인트론 및 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)는, E1B의 발현을 위한 발현 유닛 내의 E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스와 3'UTR의 사이에 위치한다.
제1 양태의 제9 및 제10 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제11 구현예에서, 인트론의 5' 말단에 스플라이스 도너 부위(splice donor site) 및 인트론의 3' 말단에 인트론 및 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)를 포함하는 인트론은 E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스의 다운스트림(downstream), 바람직하게 E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스의 3' 말단에 위치한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 및 제11 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제12 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3'UTR은 시미안 바이러스 40(SV40, Simian virus 40)의 3' UTR과 상이하다.
제1 양태의 제9, 제10, 제11 및 제12 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제13 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 인트론은 시미안 바이러스 40(SV40, Simian virus 40)의 인트론과 상이하다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 및 제13 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제14 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3' UTR은 비-바이러스(non-viral) 3' UTR, 바람직하게 포유류의 3' UTR이다.
제1 양태의 제9, 제10, 제11, 제12, 제13 및 제14 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제15 구현예에서, 인트론은 구성요소인(constitutive) 인트론이다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14 및 제15 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제16 구현예에서, 핵산 구조는 단백질 E1B84R을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제 16 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제17 구현예에서, 단백질 E1B84R는 핵산 구조의 허용 세포(permissive cell) 내로의 이동 이후에 발현된다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17 및 제18 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제18 구현예에서, 핵산 구조는 pIX RNA 또는 그것의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제18 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제19 구현예에서, pIX RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 핵산 구조의 허용 세포(permissive cell) 내로의 이동 이후에 전사(transcribed) 및/또는 번역(translated)되지 않는다.
제1 양태의 제18 및 제19 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제20 구현예에서, pIX RNA 또는 그것의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 세퀀스는 바람직하게 E1B84R의 C-말단(C-terminus)을 코딩하기 위한 뉴클레오티드 시퀀스를 제공하기 위하여, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드의 3' 말단 또는 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)의 3' 말단에 위치한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19 및 제20 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제21 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터는 구성요소인(constitutive) 프로모터이다.
제1 양태의 제21 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제22 구현예에서, 프로모터는 비-아데노 바이러스(non-adenoviral) 프로모터이다.
제1 양태의 제21 및 제22 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제23 구현예에서, 프로모터는 hPGK(human phosphoglycerate kinase) 프로모터, mPGK(murine phosphoglycerate kinase) 프로모터, hCMV(human Cytomegalovirus) 프로모터 및 mCMV(murine Cytomegalovirus) 프로모터를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제1 양태의 제23 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제24 구현예에서, 프로모터는 mPG(murine phosphoglycerate kinase) 프로모터이다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19 및 제20 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제25 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터는 아데노 바이러스 프로모터 또는 유도성(inducible) 프로모터이다.
제1 양태의 제25 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제26 구현예에서, 유도성(inducible) 프로모터는 금속 이온(metal ion)-유도성 프로모터, IPTG-유도성 프로모터, 스테로이드-유도성 프로모터, 테트라사이클린(tetracycline)-유도성 프로모터 및 미페프리스톤(mifepristone)-유도성 프로모터를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제1 양태의 제26 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제27 구현예에서, 유도성(inducible) 프로모터는 테트라사이클린(tetracycline)-유도성 프로모터이다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26 및 제27 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제28 구현예에서, E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 E1A12S 및 E1A13S를 코딩한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27 및 제28 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제29 구현예에서, E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 2에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22 및 제23 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제30 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터는 아데노 바이러스 프로모터, 바람직하게 E1B 프로모터이다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 및 제30 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제31 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터는 구성요소인(constitutive) 프로모터이다.
제1 양태의 제31 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제32 구현예에서, 프로모터는 hPGK(human phosphoglycerate kinase) 프로모터, mPGK(murine phosphoglycerate kinase) 프로모터, hCMV(human Cytomegalovirus) 프로모터 및 mCMV(murine Cytomegalovirus) 프로모터를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제1 양태의 제32 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제33 구현예에서, 프로모터는 hPGK(human phosphoglycerate kinase) 프로모터이다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32 및 제33 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제34 구현예에서, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드는 단백질 E1B 55K 및 단백질 E1B 19K를 코딩한다.
제1 양태의 제34 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제35 구현예에서, 단백질 E1B 55K 및 단백질 E1B 19K는 핵산 구조의 허용 세포(permissive cell) 내로의 이동 이후에 발현된다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32 및 제33 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제36 구현예에서, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 단백질 E1B 55K, 단백질 E1B 19K 및 단백질 E1B84R을 코딩한다.
제1 양태의 제36 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제37 구현예에서, 단백질 E1B 55K, 단백질 E1B 19K 및 단백질 E1B84R는 핵산 구조의 허용 세포(permissive cell) 내로의 이동 이후에 발현된다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36 및 제37 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제38 구현예에서, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 1에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37 및 제38 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제39 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 SEQ ID NO: 7에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38 및 제39 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제40 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터는 mPGK(murine phosphoglycerate kinase) 프로모터이고, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터는 E1B 프로모터이다.
제1 양태의 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39 및 제40 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제41 구현예에서, 인트론은 아데노 바이러스 인트론 및 SV40 인트론을 포함하는 그룹으로부터 선택된 인트론과 상이하다.
제1 양태의 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40 및 제41 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제42 구현예에서, 인트론은 구성요소적으로 스플라이스된 인트론(constitutively spliced intron)이다.
제1 양태의 제42 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제43 구현예에서, 인트론은 비-바이러스(non-viral) 인트론, 바람직하게 포유류의 인트론이다.
제1 양태의 제42 및 제43 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제44 구현예에서, 인트론은 UBE2I 인트론이다.
제1 양태의 제44 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제45 구현예에서, 인트론은 SEQ ID NO: 10에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44 및 제45 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제46 구현예에서, 스플라이스 도너 부위(splice donor site)는 아데노 바이러스 스플라이스 도너 부위 및 SV40 스플라이스 도너 부위로 이루어진 그룹으로부터 선택된 스플라이스 도너 부위와 상이하다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45 및 제46 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제47 구현예에서, 스플라이스 도너 부위(splice donor site)는 포유류의 스플라이스 도너 부위이다.
제1 양태의 제46 및 제47 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제48 구현예에서, 스플라이스 도너 부위(splice donor site)는 UBE2I 스플라이스 도너 부위이다.
제1 양태의 제46, 제47 및 제48 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제49 구현예에서, 스플라이스 도너 부위(splice donor site)는 SEQ ID NO: 11에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48 및 제49 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제50 구현예에서, 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)는 아데노 바이러스 스플라이스 도너 부위 및 SV40 스플라이스 도너 부위로 이루어진 그룹으로부터 선택된 스플라이스 억셉터 부위와 상이하다.
제1 양태의 제50 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제51 구현예에서, 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)는 포유류의 스플라이스 억셉터 부위이다.
제1 양태의 제50 및 제51 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제52 구현예에서, 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)는 UBE2I 스플라이스 억셉터 부위이다.
제1 양태의 제50, 제51 및 제52 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제53 구현예에서, 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)는 SEQ ID NO: 12에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52 및 제53 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제54 구현예에서, 인트론의 5' 말단에 스플라이스 도너 부위(splice donor site) 및 인트론의 3' 말단에 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)를 포함하는 인트론은 SEQ ID NO: 13에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53 및 제54 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제55 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3' UTR은 mRNA의 전사 후 과정(posttranscriptional processing)을 가능하게 하는 3' UTR이다.
제1 양태의 제55 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제56 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3' UTR은 ARF5, DAXX, HPRT, RING1 및 UBE2I 유전자를 포함하는 그룹으로부터 선택된 3' UTR이다.
제1 양태의 제55 및 제56 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제57 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3' UTR은 UBE2I의 3' UTR이다.
제1 양태의 제55, 제56 및 제57 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제58 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3' UTR은 SEQ ID NO: 14에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57 및 제58 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제59 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛 및 E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 5'->3' 방향으로 다음과 같이 핵산 구조 내에 배치된다: E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터, E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스 및 3'UTR, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 스플라이스 도너 부위(splice donor site), 인트론, 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site) 및 3' UTR.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58 및 제59 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제60 구현예에서, 숙주 세포에서 발현되는 뉴클레오티드 시퀀스의 각각은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58, 제59 및 제60 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제61 구현예에서, 핵산 구조는 E1A, E1B 55K, E1B 19K 및/또는 E1B84R를 코딩하고 발현할 수 있으며, 바람직하게 E1A, E1B 55K 및 E1B 19K를 발현하거나 E1A, E1B 55K, E1B 19K 및 E1B84R을 발현할 수 있다.
제1 양태의 제61 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제62 구현예에서, 숙주 세포에서 E1A 및 E1B가 발현되거나 숙주세포에서 E1A, E1B 및 E1B84R이 발현된다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58, 제59, 제60, 제61 및 제62 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제63 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛 및 E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 조합된 발현 유닛(combined expression unit)을 형성하고, 여기서 조합된 발현 유닛은 SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 6에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58, 제59, 제60, 제61 및 제62 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제64 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛 및 E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 조합된 발현 유닛(combined expression unit)을 형성하고, 여기서 조합된 발현 유닛은 SEQ ID NO: 15에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58, 제59, 제60, 제61, 제62 및 제63 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제65 구현예에서, 핵산 구조는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 22에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58, 제59, 제60, 제61, 제62 및 제64 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제66 구현예에서, 핵산 구조는 SEQ ID NO: 23에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58, 제59, 제60, 제61, 제62, 제63, 제64, 제65 및 제66 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제67 구현예에서, 핵산 구조는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하고, 여기서 핵산 구조는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 최소한의 추가 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
제1 양태의 제67 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제68 구현예에서, 최소한의 추가 뉴클레오티드 시퀀스는 아데노 바이러스 뉴클레오티드 시퀀스 또는 비-아데노 바이러스 뉴클레오티드 시퀀스이다.
제1 양태의 제68 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제69 구현예에서, 아데노 바이러스 뉴클레오티드 시퀀스는 아데노 바이러스 E2A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 아데노 바이러스 E2B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 아데노 바이러스 E4를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 구조적 아데노 바이러스 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 그룹으로부터 선택되고/또는 비-아데노 바이러스 뉴클레오티드 시퀀스는 Cre 또는 Flp 재조합효소(recombinase)를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스이다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58, 제59, 제60, 제61, 제62, 제63, 제64, 제65, 제66, 제67, 제68 및 제69 구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제70 구현예에서, 핵산 구조는 핵산 분자이다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58, 제59, 제60, 제61, 제62, 제63, 제64, 제65, 제66, 제67, 제68, 제69 및 제70구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제71 구현예에서, 핵산 구조는 DNA 분자이다.
제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43, 제44, 제45, 제46, 제47, 제48, 제49, 제50, 제51, 제52, 제53, 제54, 제55, 제56, 제57, 제58, 제59, 제60, 제61, 제62, 제63, 제64, 제65, 제66, 제67, 제68, 제69, 제70 및 제71구현예의 구현예이기도 한, 제1 양태의 제72 구현예에서, 핵산 구조는 RNA 분자이다.
본 발명의 근복적인 과제는 제1 양태에 따른 핵산 구조를 포함하는 벡터에 의해, 제2 양태의 제1 구현예이기도한, 제2 양태에서 해결된다.
제2 양태의 제1 구현예의 구현예이기도 한, 제2 양태의 제2 구현예에서, 벡터는 발현 벡터(expression vector)이다.
제2 양태의 제1 및 제2 구현예의 구현예이기도 한, 제2 양태의 제3 구현예에서, 백터는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제2 양태의 제3 구현예의 구현예이기도 한, 제2 양태의 제4 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 바이러스 벡터는 아데노 바이러스, 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus), 레트로 바이러스(retrovirus) 및 렌티바이러스(lentivirus)를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 근본적인 과제는 제1 양태에 따른 핵산 구조 및/또는 제2 양태에 따른 벡터를 포함하는 세포에 의해, 제3 양태의 제1 구현예이기도한, 제3 양태에서 해결되었다.
제3 양태의 제1 구현예의 구현예이기도 한, 제3 양태의 제2 구현예에서, 핵산 구조는 세포의 염색체 내로 통합된다.
제3 양태의 제1 및 제2 구현예의 구현예이기도 한, 제3 양태의 제3 구현예에서, 세포는 E1A, E1B 55K 및 E1B 19K를 발현한다.
제3 양태의 제1, 제2 및 제3 구현예의 구현예이기도 한, 제3 양태의 제4 구현예에서, 세포는 E1A, E1B 55K, E1B 19K 및 E1B84R을 발현한다.
제3 양태의 제3 및 제4 구현예의 구현예이기도 한, 제3 양태의 제5 구현예에서, E1A, E1B 및 E1B84R은 아데노 바이러스 유래의 아데노 바이러스 E1A, E1B 및 E1B84R이고, 아데노 바이러스는 바람직하게 아데노 바이러스 혈청형 5, 아데노 바이러스 혈청형 2 및 아데노 바이러스 혈청형 35를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 구현예의 구현예이기도 한, 제3 양태의 제6 구현예에서, 세포는 재조합효소(recombinase), 바람직하게 Cre 또는 Flp 재조합효소를 발현한다.
제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 구현예의 구현예이기도 한, 제3 양태의 제7 구현예에서, 세포는 E2A 단백질, E2B 단백질, E4 단백질, 아데노 바이러스의 구조적 단백질 및 그것들의 각각 및 임의의 조합을 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 발현한다.
제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 구현예의 구현예이기도 한, 제3 양태의 제8 구현예에서, 세포는 세포주(cell line)이다.
제3 양태의 제8 구현예의 구현예이기도 한, 제3 양태의 제9 구현예에서, 세포주는 영구 세포주(permanent cell line)이다.
제3 양태의 제8 및 제9 구현예의 구현예이기도 한, 제3 양태의 제10 구현예에서, 세포주는 양수세포주(amniocytic cell line)이다.
제3 양태의 제8, 제9 및 제10 구현예의 구현예이기도 한, 제3 양태의 제11 구현예에서, 세포주는 인간세포주(human cell line)이다.
본 발명의 근본적인 과제는, 제1 양태에 따른 핵산 및/또는 제2 양태에 따른 벡터를 양수세포(amniocytic cell)로 도입하고 바람직하게 핵산구조 및/또는 벡터가 양수세포(amniocytic cell)의 염색체 내로 통합되는 단계를 포함하는, 영구 양수세포 세포주(permanent aminocytic cell line)의 생산 방법에 의해, 제4 양태의 제1 구현예이기도 한, 제4 양태에서 해결된다.
제4 양태의 제1 구현예의 구현예이기도 한, 제4 양태의 제2 구현예에서, 방법은 또한 제1 양태에 따른 핵산 구조 및/또는 제2 양태에 따른 벡터가 도입된 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
제4 양태의 제1 및 제2 구현예의 구현예이기도 한, 제4 양태의 제3 구현예에서, 제1 양태에 따른 핵산 구조 및/또는 제2 양태에 따른 벡터를 도입하는 단계는 형질주입(transfection)이다.
제4 양태의 제1, 제2 및 제3 구현예의 구현예이기도 한, 제4 양태의 제4 구현예에서, 양수세포(amniocytic cell)는 일차 양수세포(primary amniocyte), 바람직하게 일차 양수세포는 인간 일차 양수세포이다.
제4 양태의 제1, 제2, 제3 및 제4 구현예의 구현예이기도 한, 제4 양태의 제5 구현예에서, 세포는 E1A, E1B 및 E1B84R을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아데노 바이러스 단백질을 최소한으로 발현하고, 바람직하게 세포는 아데노 바이러스 단백질 E1A, E1B 및 E1B84R 및 그것들의 각각 및 임의의 조합을 발현한다.
본 발명의 근본적인 과제는, 제4 양태에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 영구 양수세포주(permanent aminocytic cell line)에 의해, 제5 양태의 제1 구현예이기도 한, 제5 양태에서 해결된다.
본 발명의 근본적인 과제는, 영구 양수세포주(permanent aminocytic cell line)에 의해, 제6 양태의 제1 구현예이기도 한, 제6 양태에서 해결되고, 여기서 영구 양수세포주는 SGT11 1T3.1D9 세포주(수탁번호 ACC3134로 DMS에 기탁된) 및 SGT11 1T3.1G3 세포주(수탁번호 ACC3135로 DMS에 기탁된)이다.
본 발명의 근본적인 과제는, 벡터, 바람직하게 유전자 전달 벡터(gene transfer vector), 더욱 바람직하게 바이러스 유전자 전달 벡터(viral gene transfer vector)를 생산하는, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 구현예 중 어느 하나에 따른 세포 및/또는 제3 양태의 제8, 제9, 제10 및 제11 구현예 중 어느 하나에 따른 세포주의 이용에 의해, 제7 양태의 제1 구현예이기도 한, 제7 양태에서 해결된다.
제7 양태의 제1 구현예의 구현예이기도 한, 제7 양태의 제2 구현예에서, 벡터는 바이러스이다.
본 발명의 근본적인 과제는, 단백질을 생산하는, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 구현예 중 어느 하나에 따른 세포 및/또는 제3 양태의 제8, 제8, 제10 및 제11 구현예 중 어느 하나에 따른 세포주의 이용에 의해, 제8 양태의 제1 구현예이기도 한, 제8 양태에서 해결되고, 여기서 세포 또는 세포주는 단백질을 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고, 여기서 추가의 뉴클레오티드 시퀀스는 발현 유닛의 일부이다.
제7 양태의 제1 및 제2 구현예의 구현예이기도 한, 제7 양태의 제3 구현예에서, 벡터 및 바이러스는 아데노 바이러스, AAV(아데노 연관 바이러스), 레트로 바이러스, 렌티 바이러스, 키메릭 아데노 바이러스-AAV(chimeric adenovirus-AAV), 키메릭 아데노 바이러스-레티노 바이러스(chimeric adenovirus-retrovirus) 및 키메릭 아데노 바이러스-렌티 바이러스(chimeric adenovirus-lentivirus)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 각각으로부터 각각 그리고 독립적으로이다.
본 발명의 근본적인 과제는, 아데노 바이러스 돌연변이(adenovirus mutant)를 생산하는, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 구현예 중 어느 하나에 따른 세포 및/또는 제3 양태의 제8, 제8, 제10 및 제11 구현예 중 어느 하나에 따른 세포주의 이용에 의해, 제9 양태의 제1 구현예이기도 한, 제9 양태에서 해결된다.
본 발명의 근본적인 과제는, 상층액(supernatant)을 제공하는 세포 배양 배지에서, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 구현예 중 어느 하나에 따른 세포 및/또는 제3 양태의 제8, 제8, 제10 및 제11 구현예 중 어느 하나에 따른 세포주를 배양하는 단계를 포함하는, 유전자 전달 벡터(gene transfer vector) 또는 아데노 바이러스 돌연변이(adenovirus mutant)를 생산하는 방법에 의해, 제10 양태의 제1 구현예이기도 한, 제10 양태에서 해결되고, 여기서 세포 또는 세포주는 제1 양태에 따르고, 더 나아가 유전자 전달 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이의 핵산 시퀀스(nucleic sequence)인 뉴클레오티드 시퀀스로서 핵산 구조를 포함하고, 여기서 방법은 세포 또는 상층액(supernatant)으로부터 유전자 전달 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이를 회수(harvesting)하는 단계를 포함한다.
본 발명의 근본적인 과제는, 제3 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 및 제7 구현예 중 어느 하나에 따른 세포 및/또는 제3 양태의 제8, 제8, 제10 및 제11 구현예 중 어느 하나에 따른 세포주를 상층액(supernatant)을 제공하는 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 단백질의 생산을 위한 방법에 의해, 제11 양태의 제1 구현예이기도 한, 제11 양태에서 해결되고, 여기서 세포 또는 세포주는 제1 양태에 따른 핵산 구조 및 단배질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고, 여기서 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 상기 세포 또는 세포주에서 발현되며, 여기서 방법은 세포 또는 상층액으로부터 단백질을 회수(harvesting)하는 단계를 포함한다.
어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 본 발명은 다음의 놀랍고 예기치 못한 발견을 기반으로 한다.
양수 검사(amniocentesis)에 의해 얻어진, 일차 양수세포(amniocytes)가 배양보조세포층(feeder layer) 없이 생체 외(in vitro)의 세포 배양 접시에서 배양되는 경우에, 그것들은, 형태(morphology)가 변화하고, 사이즈가 커지며, 노화의 표현형(senescent phenotype)이 나타나고, 증식(proliferation)을 멈추기 이전에, 제한된 수의 계대(passages)를 위해 유지될 수 있다. 노화의 표현형(senescent phenotype)이 나타날 때까지의 계대(passages)의 수는 배양의 시작을 위해 사용된 일차 세포의 수에 따라 달라진다. 표준 조건 하, 즉 1 또는 2 ml의 양수(amniotic fluid)로 시작하는 경우, 위에 상기한 변화와 함께 노화 표현형(senescent phenotype)을 얻을 때까지, 세포는 약 30 내지 35 총 PD에 해당하는, 약 10회의 계대 수를 가질 수 있다.
hAd5의 E1A 및 E1B 유전자를 발현하는 종래 기술의 플라스미드인 pSTK146의 일차 양수세포(amniocytes)로의 형질주입(transfection)은 세포 클론(clones)의 출현 및 이에 뒤따르는, 확장될 수 있는 증식 세포를 구성하는, E1A 및 E1B를 발현하는 DNA의 염색체 통합을 야기함이 예전부터 발견되어 왔고, 그것으로부터 영구 세포주가 확립될 수 있으며, 예를 들어, 그들 중 N52.E6 세포주(Schiedner et al., 2000; EP00979539)를 아데노 바이러스 벡터의 생산을 위해 사용할 수 있다.
플라스미드 pSTK146는 E1A 단백질 및 E1B 55K 및 E1B 21K 단백질(후자는 때때로 E1B 19K 단백질을 나타내기도 한다)을 코딩한다. pSTK146에서, E1B를 코딩하는 시퀀스는 모두 SV40으로부터 유도된 인트론 및 3' UTR을 포함하는, SV40로부터 유래된 DNA 시퀀스 뒤에 이어진다.
계대(passages) 7 및 9 사이에 플라스미드 pSTK146의 일차 양수세포의 형질주입(transfection) 후, 이전에 발표된 결과에 따른, 작고 증식하는 세포를 포함하는 세포 클론의 다수의 출현이 관찰되었다(Schiedner et al., 2000). 분리 및 개별 세포 배양 접시로의 이동 후(개별 세포 배양 접시에 대한 제1 계대를 본 명세서에서 폴리클로날 계대 1(polyclonal passage 1)로 한다), 개별 클론은 더욱 확산되었고, 조심스럽게 성장 및 형태에 대해 분석되었다. 폴리클로날 계대 1 이후, 매우 빨리 생존 가능하고 생존하는 세포 클론의 수가 감소하기 시작함이 관찰되었다. 단지 적은 수의 클론만이, 대략 총 65PD에 대응하는, 그리고 일차 양수세포(amniocytes)의 초기 접종부터 계산하면, 플라스미드 pSTK.146 형질주입(transfection) 후, 대략 30 내지 35 PD에 대응하는, 폴리클로날 계대 10 이후에 생존하였다. 현미경 시험(microscopic examination)은 실패한 세포 클론이 주로 세포 사이즈의 강력한 증가 및 세포 증식의 중단에 의해, 그리고 부분적으로 세포 사멸 및 박리의 징후, 즉 노화 표현형의 획득과의 일치에 의해 특징지워지는 위기(crisis)를 겪었음을 나타낸다.
본 발명은 이러한 단점을 극복했다. 더욱 특별히, 본 발명의 핵산 구조는, 일차 양수세포로 도입되는 경우에, 상당한 정도까지 E1-영구화된(immortalized) 일차 양수세포의 이러한 위기를 방지한다. 본 발명의 핵산 구조의 양수세포로의 형질주입(transfection) 이후에, 염색체에 통합된 E1A 및 E1B 유전자를 포함하는 클론의 훨씬 높은 비율이 위기의 징후를 보이지 않았고, 오히려 영구적으로 계속 증식했다. 본 명세서에 개시된 세포 및 본 발명의 세포들을 포함하는, 이렇게 확립된 세포주의 대부분은 N52.E6 세포보다 접착 세포 배양(adherent cell culture)에서 훨씬 더 높은 밀도로 자란다.
또한, 본 발명의 발명자는 놀랍게도 본 발명의 핵산 구조로 영구화된 세포 및 본 발명의 세포의 핵형(karyotype)은 의외로 몇 가지 구조적 이상이 존재하고, 예상했던 바와 같이 배수체(polyploid)임에도 불구하고, 의외로 몇 가지 구조적 이상이 존재하고, 많은 계대를 거쳐도 매우 안정함을 발견했다. 이것은 인간의 치료 또는 예방 약으로서, 또는 진단법으로서 사용되는 단백질, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLPs), 백신 또는 바이러스 벡터와 같은 생물 제제의 공업적 생산 및 유럽 의약품청(European Medicines Agency, EMA) 또는 FDA와 같은 규제기관의 승인에 대한 사실과 관련하여 유리하고, 이러한 생물 제제의 생산을 위해 사용된 생산 세포 및 생산 세포주는 성장, 안정성 및 안전성에 관하여 잘-특성화되어야만 한다. 장기 유전적 안정성(Long-term genetic stability)은 고품질(예를 들어, 당단백질의 일관된 당화에 의해 특징지워진), 활성(예를 들어, 백신의 일관된 면역원성(immunogenicity)에 의해 특징지워진), 및 균일성(uniformity)의 잘-특성화된 제품의 공업적 생산을 위한 전제 조건이다.
추가로 발견된 본 발명의 근본 과제는 본 발명의 세포 및 세포주의 유전적 안정성이 그것들의 텔로미어(telomeres)의 길이와 관련되어 있다는 것이다: 본 발명의 세포 및 세포주 내의 텔로미어(telomeres)는 N52.E6 세포 내의 그것보다 훨씬 더 긴 것이 발견되었다. 그 범위 내에서, 본 발명은 일차 양수세포의 영구화(immortilization) 및 효율이 강력히 증가된 영구 양수세포(permanent aminocyte)를 생산하는 수단 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 높은 유전적 안정성을 갖는 영구 양수세포주도 제공한다.
본 발명의 주제에 관한 또 다른 놀라운 장점은, ΔE1Ad 벡터 게놈의 pIX 유전자 시퀀스 및 염색체에 통합된 재조합 DNA 사이에 작은 중복(overlap)에도 불구하고, 본 발명의 세포 및 세포주에서 ΔE1Ad 벡터의 생산하는 것이 복제 가능 아데노 바이러스(replication competent adenoviruses) RCA 또는 HDEP를 초래하지 않는다는 것이다.
도 1은 본 발명의 핵산 구조의 네 가지 구현예를 나타낸 도이다. 본 발명의 4 가지 상이한 핵산 구조의 디자인을 보여준다. E1A 단백질의 발현은 P-mpgk(murine PGK promoter)(a, b) 또는 이형 프로모터(heterologous promoter)(c, d)에 의해 제어된다. E1B 단백질의 발현은 P-E1B(E1B 프로모터) 또는 이형 프로모터(heterologous promoter)(P-Y)에 의해 제어된다. E1B 코딩 유전자는 모두 UBE2I 유전자로부터 유래하는 스플라이스 도너 부위(SD), 및 인트론 및 스플라이스 억셉터 부위(SA)에 뒤따른다. a) 및 c)에서 이들은 E1B 84R 단백질의 발현을 허용하며, pIX의 비-코딩(non-coding) 부분의 일부에 뒤따른다. UBE2I 유전자의 3'UTR은 이 도면에서 보여지는 네 가지 구조에 모두 존재한다. 도 1a)는 SEQ ID No 5의 개략도(schematic representation)이고, 도 1b)는 SEQ ID No 6의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 E1A가 유도성(inducible) 프로모터의 제어 하에 있는 핵산 구조의 두 가지 구현예를 나타낸 도이다. 본 발명의 2 가지 상이한 핵산 구조의 디자인을 보여준다. E1A 단백질의 발현은 Tet-유도성 프로모터 PTight에 의해 제어된다. E1B 단백질의 발현은 천연 P-E1B(E1B-프로모터)에 의해 제어된다. E1B 코딩 유전자는 모두 UBE2I 유전자로부터 유래하는 스플라이스 도너 부위(SD), 및 인트론 및 스플라이스 억셉터 부위(SA)에 뒤따른다. a)에서 이것은 E1B 84R 단백질의 발현을 허용하며, pIX의 비-코딩(non-coding) 부분의 일부에 뒤따른다. UBE2I 유전자의 3'UTR은 이 도면에서 보여지는 두 가지 구조에 모두 존재한다. 도 2a)는 SEQ ID No 23 내의 필수 요소의 개략도(플라스미드 백본(backbone)이 없는)이다.
도 3은 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸 도이고, 그것에 의해 E1A(E1A-특이 항체 M73(Calbiochem)에 의해 검출), E1B 55 kD 및 E1B 37 kD(E1B 단백질의 N-발단에 결합하는 2A6 항체(Sarnow et al., 1982)에 의해 검출)의 발현을 형질주입(transfection)을 위해 표시된 핵산 구조를 이용하여 나타내었다.
도 4는 일차 및 E1-영구화(El- immortalized) 양수세포에서 SA β-갈락토시다제(β-galactosidase) 발현 분석을 나타낸 도이다.
도 5는 평균 텔로미어 제한 분획(TRF, telomere restriction fraction)의 서던 블롯 분석을 나타낸 도이다. E1-형질전환되어 구축된 HEK293 세포가 비교를 위해 사용되었다. 왼쪽 (A)에서, 일차 인간 양수세포의 TRF(SGT1 1 P6 및 P9)를 E1-형질전환된 폴리클로날(SGT1 1 1T3 P5 및 P21) 및 모노클로날(1T3.D9 P9 및 P23) 인간 양수세포와 비교하여 나타내었다. 오른쪽 (B)에서, 동일한 세포주 및 N52.E6가 분석되었다.
도 6은 SGT11 1T3.1D9 및 SGT11 1T3.1 G3 세포에서 EGFP(Ad1stGFP)를 발현하는 ΔE1 Ad 벡터의 감염성 입자(infectious particles)의 생산을 나타낸 도이다.
본 발명은
-발현 유닛은 프로모터, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 및 3'UTR을 포함하고, 여기서 프로모터는 E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 3'UTR는 30 개 이하의 EEE(Exonic Enhancer Elements)를 포함하는, E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하는,
핵산 구조에 대한 제1 양태와 관련된다.
바람직하게 본 명세서에서 사용되는 핵산 구조는 핵산 분자이다. 핵산 구조는 핵산 구조를 포함하는 더 큰 핵산 분자의 일부일 수 있다. 구현예에서 핵산 구조는 분리된 핵산 구조이다.
그와 같은 핵산 구조는 단일 가닥(single-stranded) 핵산 분자 또는 이중 가닥(double-stranded) 핵산 분자일 수 있다. 핵산 구조가 이중 가닥 핵산 분자인 경우, 핵산은 바람직하게 필수적으로 서로 상보적인 두 가닥(strand)을 포함한다. 그이한 상보성은 전형적으로 왓슨-크릭 염기 짝짓기 규칙(Watson-Crick base pairing rules)과 같은 염기 짝짓기 규칙(base pairing rules)에 의해 정의된다. 바람직하게 본 명세서에서 사용되는 이중 가닥 핵산 분자는 단일-조각(one-piece) 핵산 분자이다.
본 발명의 구현예에서 본 발명의 핵산 구조는 E1B 발현 유닛의 발현을 위한 발현 유닛에 부가하여 E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 포함한다. 바람직하게, E1A의 발현을 위한 발현 유닛은 프로모터, E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 및 3'UTR을 포함하며, 여기서 프로모터는 E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스에 작동가능하게 연결되어 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 핵산 구조는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛과 E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 모두 포함하며, 그것에 의한 핵산 구조는 단일-조각(one-piece) 핵산 분자를 형성한다. 단일-조각 핵산 분자는 바람직하게 E1A의 발현을 위한 발현 유닛과 같은 발현 유닛의 하나의 5' 말단 뉴클레오티드가 연결되어 있으며, 바람직하게 E1B의 발현을 위한 발현 유닛과 같은 다른 발현 유닛의 하나의 3' 말단 뉴클레오티드에 공유적으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 단일-조각 핵산 분자는 대안적으로 E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 5'말단 뉴클레오티드가 결합된 것일 수 있고, 바람직하게 E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 3' 말단 뉴클레오티드에 공유적으로 연결된 것일 수 있다. 본 발명의 단일-조각 핵산의 또 다른 구현예에서 어떤 뉴클레오티드는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛 및 E1B의 발현을 위한 발현 유닛 모두에 의해 공유된다; 즉, 어떤 뉴클레오티드는 두 발현 유닛에서/유닛을 위해 중복(overlapping) 된다. 예를 들어, E1B의 발현을 위한 발현 유닛이 E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 다운스트림(downstream), 즉, 3' 방향으로 배치되는 경우에, E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 3' UTR의 어떤 뉴클레오티드는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터의 5' 부위의 뉴클레오티드이기도 하다. 대안적인 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛이 E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 다운스트림으로 배치되는 경우, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3' UTR의 어떤 뉴클레오티드는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터의 5' 부위의 뉴클레오티드이기도 하다. 그러한 중복의 정도는 중복는 시퀀스의 독특함(particularities)에 따라 다를 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식된다. 본 발명의 다른 구현예에서 E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 구성하는 일부 뉴클레오티드는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 구성하는 일부 뉴클레오티드와 중복된다. E1B의 발현을 위한 발현 유닛과 E1A의 발현을 위한 발현 유닛 모두를 포함하는 본 발명의 핵산 구조의 추가 구현예에서, 핵산 구조가 단일-조각 핵산 분자를 형성하는 경우, 그러한 핵산 구조와 핵산 분자는 각각 이중 가닥(double-stranded) 핵산 분자이며, 이 때 E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 이중 가닥 핵산 분자의 제1 가닥(first strand)에 위치하고 E1A의 발현을 위한 발현 유닛은 이중 가닥 핵산 분자의 제2 가닥(second strand)에 위치한다. 이 구현예에서, 바람직하게, E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 함유하는 가닥(strand)은 제1 연장 뉴클레오티드 시퀀스에 의해 연장되고, E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 함유하는 가닥(strand)은 제2 연장 뉴클레오티드 시퀀스에 의해 연장되며, 만약 제1 연장 뉴클레오티드 시퀀스가 E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 5' 말단에 부착되면 제2 연장 뉴클레오티드 시퀀스는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3' 말단에 부착되고; 제1 연장 뉴클레오티드 시퀀스가 E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 3' 말단에 부착되면 제2 연장 뉴클레오티드 시퀀스는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 5' 말단에 부착된다; 이러한 구현예에서 제1 연장 뉴클레오티드 시퀀스 및 제2 연장 뉴클레오티드 시퀀스는 필수적으로 서로 상보적이다. 구현예에서, 제1 연장 뉴클레오티드 시퀀스 및 제2 연장 뉴클레오티드 시퀀스는 살아있는 포유류 기관에서 존재하는 조건과 같은 생리적 조건하에서 바람직하게 안정적인 이중 가닥 구조가 형성되는 정도로 염기 짝짓기(base pairing)가 되어 있다. 바람직한 구현예에서 제1 연장 뉴클레오티드 시퀀스는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 뉴클레오티드 시퀀스에 대하여 필수적으로 상보적이고, 제2 연장 뉴클레오티드 시퀀스는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 뉴클레오티드 시퀀스에 필수적으로 상보적이다. 핵산 구조가 E1B의 발현을 위한 발현 유닛과 E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 모두 포함하는 본 발명의 핵산 구조의 구현예에서, 핵산 구조가 단일-조각 핵산 분자를 구성하는 경우, 그러한 핵산 구조와 핵산 분자는 각각 이중 가닥 핵산 분자이며, 여기서 E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 이중 가닥 핵산 분자의 제1 가닥에 위치하고, E1A의 발현을 위한 발현 유닛은 이중 가닥 핵산 분자의 제2 가닥에 위치하며, 따라서 개별 발현 유닛은 단일 가닥 분자이고, 전사(transcription) 유닛을 위해 필요한 것으로서 당 분야에서 간주되는 이중 가닥 구조는 바람직하게 각각 제1 및 제2 연장 뉴클레오티드 시퀀스로 형성된다. E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하는 제1 가닥 및 E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하는 제2 가닥으로 이중 가닥 핵산 분자를 형성하는 본 발명의 핵산 구조의 상기 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛과 E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 동일한 방향 또는 정반대의 방향으로 배치된다는 것이 당업자에게 또한 인식된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 구조는 두-조각 핵산의 제1-조각인 제1 핵산 분자 및 두-조각 핵산의 제2 조각인 제2 핵산 분자를 포함하는 두-조각 핵산 분자이며, 여기서 제1 핵산 분자는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하고, 제2 핵산 분자는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 포함한다. 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자가 각각 그리고 독립적으로 이중 가닥 핵산 또는 단일 가닥 핵산 분자라는 것은 본 발명의 범위 내에 해당한다. 구현예에서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자 모두는 이중 가닥 핵산 분자이다; 대안적 구현예에서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자 모두는 단일 가닥 핵산 분자이다. 핵산 분자가 단일 가닥 RNA 핵산 분자인 본 발명의 핵산 구조의 이러한 구현예에서, 핵산 구조는 레트로 바이러스 벡터 또는 레트로 바이러스 벡터의 일부일 수 있다. 핵산 분자가 이중 가닥 DNA 핵산 분자인 본 발명의 핵산 구조의 이러한 구현예에서, 핵산 구조는 플라스미드 또는 플라스미드의 일부일 수 있다.
본 명세서에서 바람직하게 사용되는, 유전자 및 유전자 산물(product)의 발현을 위한 발현 유닛은 각각 프로모터, 유전자 및 유전자 산물을 각각 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 및 3' UTR을 포함한다. 프로모터는 코딩 뉴클레오티드 시퀀스에 작용하도록 연결되어 있어, 만약 발현 유닛이 허용 세포 또는 체외 번역 시스템(in vitro translation system)과 같은 발현 허용 환경에 존재하는 경우, 코딩 시퀀스가 번역되도록(translated) 한다.
바람직하게 본 명세서에 사용되는 3'UTR은 메신저 RNA(mRNA)의 특정 부분이다. 바람직하게, 그것은 코딩 부위의 종결 코돈(stop codon)이 즉시 뒤따라오는 뉴클레오티드로 시작하고, mRNA 절단 부위(mRNA cleavage site) 직전의 뉴클레오티드로 종결한다. 전형적으로, 여러 조절 시퀀스가 3' UTR에서 발견된다: (a) 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 일반적으로 AAUAAA, 또는 약간의 변종(variant); 이것은 엔도뉴클레아제(endonuclease), 뒤이어 수백개의 아데닌(adenine) 잔기(poly-A tail)의 부가에 의해 약 30 염기쌍을 지나(past) 전사하는 신호의 절단 부위를 마크한다(Proudfoot, 2011); 선택적으로, (b), 종결 코돈으로서 보다는 셀레노시스테인(selenocysteines)으로서 코돈 UGA를 번역하도록 리보솜에 지시할 수 있는 SECIS 요소(elements) 또는 AU-풍부 요소(AREs, AU-rich elements)와 같은, 세포에서 mRNA의 안정성 또는 위치에 영향을 줄 수 있는 단백질에 거의 결합하지 않는 부위, 주로 아데닌(adenine) 및 유라실(uracil) 뉴클레오티드로 구성된 스트레치(stretches)(그것에 결합하는 단백질에 따라 mRNA를 안정화 또는 불안정화시킬 수 있는); 및/또는, 선택적으로, (c) 마이크로RNA(miRNAs)를 위한 결합 부위.
E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 야생형 아데노 바이러스, 바람직하게 아데노 바이러스 혈청형 5(Ad5) 중 하나일 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식된다. 대안적으로, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는, 그러나 유전적 코드(genetic code)의 축중(degeneracy) 때문에, 야생형 아데노 바이러스, 바람직하게 아데노 바이러스 혈청형 5(Ad5)의 아미노산 시퀀스를 가지는 E1B에 대한 코드가 그것으로부터 상이할 수 있다. 바람직한 구현예에서, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 1의 하나이다. 동일한 고려사항(considerations)이 E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스에 동일하게 적용된다. 바람직한 구현예에서, E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO:2의 하나이다. E1A 및/또는 E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 코돈-최적화로 통상 언급되는 전략을 통해, Ad5 E1A 및/또는 E1B의 최상의 가능한 발현 수준을 달성하기 위해 코돈-최적화될 수 있다는 것이 당업자에 의해 또한 인식될 것이다. 이러한 코돈 최적화는 변종 접합(aberrant splicing)에서 감소를 포함하거나 내포할 수 있는데, 이와 같은 변종 접합은 본 발명의 핵산 구조와 관련하여 회피되어야 한다.
엑손 내의 EEE(Exonic Enhancer Elements)는 pre-mRNA 전사(transcripts)의 필수적(constitutive) 및 선택적(alternative) 스플라이싱의 스플라이스-부위 선택의 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)에 기반한 프로토콜에 의한 질병 대립 형질(disease alleles)의 분석은 초기에 퓨린-풍부 시퀀스 뿐만 아니라 AC- 또는 피리미딘-풍부 모티브(Schaal TD and Maniatis T, 1999)에 의해 특징지워졌던 EEE 요소(elements)를 확인했다. 일반적으로, EEEs는 스플라이스 부위에 가깝게 위치하는 것으로 시사되고 있다(Berget SM, 1995). 전사 인핸서(transcriptional enhancers)와는 대조적으로 EEEs는 강하게 위치 의존적이다; 그것들은 (i) 스플라이스 도너(SD) 부위의 업스트림(upstream) 및/또는 스플라이스 억셉터(SA) 부위의 다운스트림(downstream )에 존재하는 경우에 스플라이싱을 촉진할 수 있고, (ii) 인트론 시퀀스(intronic sequences)에서 발견되는 경우에 스플라이싱을 억제할 수 있다. EEE 요소는 엑손에서 비-콘센서스(non-consensus)("weak") 스플라이스 신호를 보상할 수 있는 반면, 콘센서스 스플라이스 부위(consensus splice sites)는 인핸서-의존(enhancer-dependency)의 필요성을 제거한다 (reviewed by Fairbrother et al., 2002).
엑손-인트론 및 스플라이스 부위 조성물(splice site composition)의 통계적 분석에 의해 EEE 활성을 갖는 시퀀스를 예측하는 계산 방법, RESCUE-EEE이 개발되었다(Fairbrother et al., 2002; Fairbrother et al., 2004). 헥사머릭(hexameric) 시퀀스는 두 기준을 만족시켰을때 EEE 활성을 가지는 것으로 간주되었다: (i) 인트론에 비해 인간 엑손 내에서 상당히 풍부하고(enrichment), (ii) 컨센서스 스플라이스 부위(consensus splice sites)를 가지는 엑손에서보다 비-컨센서스(약한) 스플라이스 부위(non-consensus (weak) splice sites)를 가지는 엑손에서 더 높은 빈도로 나타남. 인간 유전자 시퀀스의 많은 데이터 셋을 분석함으로써, 이 방법은 시퀀스 유사도에 기반하여 4,096개의 가능한 헥사머(hexamers)에서 당초 별개의 모티브 클러스터(distinct motif clusters)에서 그룹화되었던 238개의 헥사머 EEE 모티브(hexameric EEE motifs)(6%)의 세트(표 3)를 동정하였다. 선택된 헥사머 EEE 모티브(hexameric EEE motifs)는 생체 외 인핸서 활성을 나타낸(내었던) 반면, 이러한 시퀀스의 점 돌연변이(point mutations)는 급격한 활성의 감소를 초래하였다(Fairbrother et al., 2002). Fairbrother와 동료들에 따르면, EEE 시퀀스는 본질적으로 스플라이스 된 엑손에서 강력하게 선택되어야만 하고, 일반적으로 스플라이스 부위의 부근에서 인트론 시퀀스가 회피되어야만 한다(Fairbrother et al., 2002).
EEE는 표 3에 나타낸 EEE들 중 하나라는 것이 본 발명의 범위에 속한다. 그러나, EEE가 시퀀스이고, 바람직하게 상기에서 정의된 바와 같은 두 조건 (i) 및 (ii)를 만족시키는 헥사머(hexameric) 시퀀스라는 것도 본 발명의 범위에 속한다. 이와 관련하여 핵산 구조가 30개 이하의 EEE를 포함하며, 그러한 30개 이하의 EEE들은 그들의 뉴클레오티드 시퀀스 측면에서 상이하거나 동일한 EEE일 수 있다는 것도 본 발명의 범위에 속한다는 것이 인정되어야 한다. 예를 들어, 만약 EEE의 수가 30인 경우, 30개의 EEE의 각각 및 임의의 것이 같은 뉴클레오티드 시퀀스를 가진다는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 그러나, 30개의 EEE의 각각 및 임의의 것이 다른 29개의 EEE와 상이하다는 것도 또한 본 발명의 범위에 속한다. 마지막으로, 30개의 EEE의 일부의 뉴클레오티드 시퀀스가 동일한 반면, 나머지 EEE의 뉴클레오티드 시퀀스는 그것과 상이하고, 선택적으로 나머지 EEE의 그룹 내에서 또한 상이하다는 것도 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명에서 바람직하게 사용된, 3' UTR이 30개 이하의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함한다는 표현은 3' UTR이 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 1 1 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함한다는 것을 의미한다.
본 발명의 핵산 구조의 구현예에서, 3' UTR은 3' UTR의 200 개의 연속적인(consecutive) 뉴클레오티드의 스트레치(stretch) 내에 30개 이하의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함한다. 본 발명의 핵산 구조의 또 다른 구현예에서, 3' UTR은 30개 이하의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함하며, 여기의 3' UTR은 200개 이하의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 구현예에서 3' UTR은 또한 인공적인(artificial) 3' UTR일 수도 있다. 또 다른 구현예에서, 3' UTR은 적어도 50 또는 적어도 100, 또는 적어도 200 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 그러나 인간에서 3' UTR이 21개 뉴클레오티드 내지 8,555개 뉴클레오티드 사이의 길이를 가지고, 평균 1,028개의 뉴클레오티드의 길이를 가지며(Pesole et al., 2001), 이러한 길이의 임의의 각각 또는 본 발명의 다양한 구현예에서 지시된 값 내에서의 임의의 길이가 본 발명의 핵산 구조 내에 포함된 것과 같은 3' UTR의 길이일 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식된다.
본 발명의 핵산 구조의 또 다른 구현예에서, 3' UTR은 25개 이하의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함한다. 본 발명의 핵산 구조의 또 다른 구현예에서, 3' UTR은 25개 이하의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함하고, 이 3' UTR은 약 150개 내지 199개 미만의 뉴클레오디드를 포함한다. 바람직하게 본 명세서에 사용된, 3' UTR이 25개 이하의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함한다는 표현은 3' UTR이 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 1 1 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함한다는 것을 의미한다.
본 발명의 핵산 구조의 또 다른 구현예에서, 3' UTR은 20개 이하의 Exonic EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함한다. 본 발명의 핵산 구조의 또 다른 구현예에서, 3' UTR은 20개 이하의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함하고, 이 3' UTR은 약 100개 내지 약 149개 미만의 뉴클레오디드를 포함한다. 바람직하게 본 명세서에 사용된, 3' UTR이 25개 이하의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함한다는 표현은 3' UTR이 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 1 1, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 EEE(Exonic Enhander Elements)를 포함한다는 것을 의미한다.
이와 관련하여, 3 ' UTR, 또는 마지막 인트론으로부터 바로 다음의 다운스트림(downstream)에 위치한 주어진 뉴클레오티드 시퀀스 내의 뉴클레오티드들의 임의의 다른 스트레치(stretch)의 처음 200 개의 뉴클레오티드(nt.) 내의 EEE의 숫자를 확인하기 위하여, 관심 시퀀스가 특정 쿼리(query) 시퀀스를 가지는 각 헥사머(hexamer)의 페어-와이즈 뉴클레오티드 서열 정렬(pair-wise nucleotide sequence alignment)에 적합한 소프트웨어 도구에 의해 선택되고 분석된다. 실시예들은 잘 알려진 FASTA 시퀀스 정렬 소프트웨어 패키지 또는 Faribrother et al.에 의해 2004년에 개발되었던 것이다. 대안적으로, EEE 모티브(motif)는 간단한 워드 프로세싱 소프트웨어를 사용함으로써 또한 확인될 수 있다. 선택된 3 'UTR 내에서 헥사머(hexameric) EEE 모티브를 검색하기 위해(대소문자를 구별하거나 또는 구별하지 않는 경우), 첫 번째 헥사머 시퀀스(총 238개)를 표준 검색 대화창에 입력한다. 검색은 항상 최근에 선택된 뉴클레오티드 이후부터 시작되고 문서의 시작으로부터 아래로 수행된다. 모티브가 발견되는 경우, 발생한 첫 번째 사례는 문서 창에 강조되어 표시된다. 첫 번째 헥사머 모티브의 다음 사례를 발견하는 검색을 계속하기 위해, 소프트웨어의 표준 검색 창에서 "Find next" 옵션을 선택한다. "Find" 옵션을 다시 선택하는 경우에, 검색 위치는 문서의 초기로 리셋되고 다른 헥사머 모티브가 현재의 시퀀스 안에서 검색된다. 검색은 238개의 헥사머 모티브 모두가 검색이 되었을 때 완결된다. 전반적인 일치 수(the number of overall matches)는 "total matches"로 지정되고, 개별 헥사머 일치 수(the number of individual hexameric matches)는 "unique matches"로 지정된다. 심지어 시각적 조사에 의해 헥사머의 정렬을 쿼리(query) 시퀀스와 수행하는 것도 가능하다.
본 발명의 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3 'UTR은 SV40(Simian virus 40)의 3 'UTR과 상이하다. 바람직하게, SV40의 3 'UTR은 SEQ ID NO: 3에 따른 뉴클레오티드 시퀀스이다.
바람직한 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 7에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
바람직한 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 8에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
본 발명의 한 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 스플라이스 도너 부위(splice donor site), 인트론 및 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)를 포함한다. 스플라이스 도너 부위(splice donor site), 인트론 및 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)를 포함하는 엔티티(entity)는 때때로 인트론으로도 지칭된다. E1B 전사(transcription) 유닛 내에 인트론을 포함하는 장점은, 스플라이싱(splicing)이 핵으로부터 번역(translation)이 발생하는 세포질까지 mRNA 이동(mRNA export)을 강화시키기 때문에, 그렇게 함으로써 단백질 발현이 강화된다는 것이다. RNA 스플라이싱을 위해 필요한 RNA 요소(elements)는 공지되어 있고 (Lewin B, Genes VIII, Pearson Education International, 2004), 포유류의 스플라이스 도너(splice donor) 및 스플라이스 억셉터(splice acceptor) 부위로부터 컨센서스 시퀀스(consensus sequences)가 유도되었다(Burset et al., 2001). 스플라이스 도너 부위(splice donor site)는 인트론의 5' 말단에서 거의 불변인 시퀀스 GU(almost invariant sequence GU)(RNA 수준에서 GU는 DNA 수준에서 GT에 해당)를 포함하고 이 디뉴클레오티드(dinucleotide)는 더 크고, 덜 고도로 보존된 컨센서스 부위(consensus region)내에 위치한다. 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)는 인트론을 종결하는 거의 불변인 시퀀스 AG(almost invariant sequence AG)를 포함한다. 피리미딘-풍부 부위(pyrimidine-rich region)는 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)의 업스트림(upstream)에 위치해있고, 이 피리미딘-풍부 부위의 추가의 업스트림은 분기점(branch point)이다. 스플라이스 도너(splice donor)를 위해 Burset 등(상기)에 의해 유도된 스플라이스 부위의 GT-AG 그룹을 위한 컨센서스 시퀀스는 M70A60G80｜GTR95A71G81T46이고 피리미딘-풍부 부위를 포함하는 스플라이스 억셉터(splice acceptor)에 대한 컨센서스 시퀀스는 Y73Y75Y78Y79Y80Y79Y78Y81Y86Y86NC71AG|G52이며, 여기서 M은 뉴클레오티드 A 또는 C, R에서 A 또는 G까지, Y에서 C 또는 T까지, 및 S에서 C 또는 G 까지에 해당한다. 스플라이스 부위의 다소 드물게 관찰되는 GC-AG 그룹에 대한 컨센서스 시퀀스가 또한 Burset 등(상기)에서 발견될 수 있다.
원칙적으로 우수한 스플라이싱 특성을 가지는 인트론, 스플라이스 도너(splice donor) 및 스플라이스 억셉터(splice acceptor) 부위를 코딩하는 시퀀스는 시행착오에 의해 선택될 수 있는 반면, 여기에서는 필수 구성요소적인(constitutive) 방식으로 동작하는 것으로 알려져 있고, 또한 대안적 스플라이싱(alternative splicing) 이벤트에 연관되지 않은 것으로 알려진 인트론을 선택하는 것이 제안된다. 인트론에 관하여 여기에서 사용된 용어 "필수 구성요소적인(constitutive)"은 전문가에게 잘 알려진 용어로, 인트론이 많은 세포 타입에서 동작하고 대안적 스플라이싱(alternative splicing)을 초래하는 특정 조절을 받지 않는다는 것을 가리킨다. 용어 "대안적 스플라이싱(alternative splicing)"은 mRNA 전구체(pre-mRNA)에 존재하는 엑손이 다른 mRNA를 발생시키는 스플라이싱 동안 상이한 방식으로 연결될 수 있는 프로세스를 기술한다. 따라서, 본 발명의 범위 안에서 바람직한 것(preference)은 필수 구성요소적으로(constitutively) 스플라이스되는 짧은 인트론에 주어진다. 바람직한 것(preference)은, DNA 바이러스로부터 전사된(tanscribed) RNA가 매우 자주 대안적인 방식으로 스플라이싱되기 때문에, DNA 바이러스로부터 유도된 인트론에 대해 포류류의, 우선적으로 인간의 인트론에 주어진다. 필수 구성요소적인(constitutive) 방식으로 동작하는 인트론은, 예를 들어 Kim과 동료들에 의해 기술된 것과 같은 알고리즘(Kim et al., 2007)을 사용하여 선택될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 인트론은 SV40(Simian virus 40)의 인트론과 상이하다. 바람직하게, SV40의 인트론의 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 4에 따른 뉴클레오티드 시퀀스이다.
스플라이스 도너(splice donor), 인트론, 스플라이스 억셉터(splice acceptor) 및 폴리아데닐화(polyadenylation) 부위를 포함하는 3'UTR의 조합의 선택을 위한 대안적인 전략으로서, 그리고, 척추 동물의 게놈에서 자연적으로 발생하는 개별 요소를 선택하는 대신에, 주형(template)으로서 확립된 컨센서스(consensus) 시퀀스에 따라 인공 스플라이스 도너 및 스플라이스 억셉터 부위를 사용하는 것 또한 가능하다(스플라이스 도너/억셉터 부위 선택은 상기 e.g. Burset et al.; 폴리아데닐화 부위 선택은 상기 Proudfoot).
본 발명의 실시예에서, 핵산 구조는 아데노바이러스 pIX 유전자 또는 그것의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 핵산 구조는 pIX 유전자의 5'-UTR의 일부를 포함하고, 그것은 E1B 84R 단백질의 생산을 허용하기 위해 E1B 전사 유닛(transcription unit)의 대부분의 3' UTR과 중복된다(Sieber et al. 2007).
바람직하게 사용되는, 허용(permissive) 세포는 바람직하게 본 발명의 핵산 구조의 발현을 허용하는 포유류의 세포이다.
본 발명의 구현예에서, 본 발명의 핵산 구조가 필수 구성요소적인(constitutive) 프로모터의 제어하에 있는 경우, E1A 및 E1B을 코딩하는 발현은 차례로 배열된다. 바람직하게 E1A를 코딩하는 시퀀스는 인간(Singer-Sam et al., 1984) 또는 생쥐(Adra et al., 1987) PGK(phosphoglycerate kinase) 프로모터 또는또는 인간 또는 생쥐 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 유래의 초기 프로모터(각각, hCMV 프로모터 또는 mCMV 프로모터)(Boshart et al., 1985, Dorsch-Hasler et al., 1985)와 같은 필수 구성요소적 비상동(constitutive heterologous)(즉, 비-바이러스) 프로모터의 제어 하에 있고, E1B를 코딩하는 시퀀스는 천연 E1B 프로모터의 제어하에 있다. 본 발명에 따른 바람직한 조성물에서, E1A를 코딩하는 시퀀스는 생쥐 PG 프로모터의 제어하에 있고, E1B를 코딩하는 시퀀스는 천연 E1B 프로모터의 제어하에 있다. 그러나, 본 발명의 범위 내에서, PGK 프로모터 또는 다른 필수 구성요소적인(constitutive) 프로모터와 같은 비상동(heterologous) 프로모터의 제어하에 E1B 코딩 시퀀스를 배열하는 것도 또한 가능하다.
다른 구현예에서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터는 아데노 바이러스 프로모터, 조절 가능한 또는 유도성(inducible) 프로모터이다. 이와 관련하여 E1A를 코딩하는 시퀀스는 조절 가능한 프로모터의 제어하에 배열되고, 프로모터 활성은 외부 요인을 추가하거나 제거함으로써 제어될 수 있다(Overdhana S, et al., 2006). 실시예들은 금속 이온(Wurm et al., 1986), 스테로이드(Hynes et al., 1982; No et al., 1996), IPTG (Hu et al., 1987), 테트라사이클린(tetracycline)(Baron et al., 1997; Loew et al., 2010), 또는 미페프리스톤(mifepristone)(Burcin et al., 1998)에 의해 조절될 수 있는 프로모터의 사용을 포함한다. E1A 발현을 제어하기 위해 유도성 프로모터를 사용하는 여러 장점이 있다. 첫 번째로, 영구화된(immortalized) 세포주의 생산과 유지 동안 E1A 발현의 수준이 필수 구성요소적인(constitutive) 프로모터를 사용하는 것보다 미세 조정될 수 있고 더 잘 제어될 수 있으므로, E1A 발현은 영구화(immortalization) 및 유지의 효율을 증가시키기 위해 최적화될 수 있다. 높은 수준에서 E1A의 발현은 E1A의 세포자멸사 유발(pro-apoptotic) 활성으로 인해 세포에 해로울 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 두 번째로, E1A를 유도성 프로모터 제어하에 배열하는 것은, 유도성 물질(agent)(Tet-on 조절 가능 시스템을 사용할 때 독시사이클린(Doxycyclin)과 같은)이 없는 경우 E1A가 발현되지 않기 때문에, 확립된 세포주의 종양형성(tumorigenicity)을 감소시키거나 차단(abolish)할 것이다. 인간의 치료 또는 예방을 위한 생물 제제(biologies)를 생산할 때, 안전상 이유를 위해 생물 제제의 생산을 위해 사용되는 세포주는 심지어 면역-억제된 인간에서 조차 암을 유발하지 않는 것이 유리하다. 실험적으로, 생물 제제의 생산을 위해 사용된 세포 주의 발암성은 통상 면역결핍 쥐와 같은 면역별핍 동물에 세포 현탁액을 피하 주사함으로써 테스트한다.
본 발명의 구현예에서, 아데노 바이러스의 E1A cDNA는 테트라사이클린(Tet)-유도성 프로모터의 제어 하에 위치한다. Tet-On Advanced System(Clontech)을 확립하기 위한 일반적인 전략은 Tet-On Advanced 전사촉진자(transactivator)를 안정적으로 발현시키는 세포주를 만들기 위해 우선 타겟 세포를 pTet-On Advanced로 형질주입(transfect)하는 것이다.
본 발명의 핵산 구조의 구현예에서, 핵산 구조는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하고, 여기서 핵산 구조는 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 최소한의 추가 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. 핵산 구조가 E1A의 발현을 위한 발현 유닛과 E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하는 단일-조각(one-piece) 핵산 분자인 본 발명의 핵산 구조의 구현예에서, 이와 같은 단일-조각 핵산 분자는 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 최소한의 추가 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. 핵산 구조가 제1 핵산 분자와 제2 핵산 분자를 포함하는 두-조각(two-piece) 핵산 분자인 본 발명의 핵산 구조의 구현예에서, 여기서 제1 핵산 분자는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하고 제2 핵산 분자는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하며, 추가의 뉴클레오티드 시퀀스는 (a) 제1 핵산 분자의 5' 말단 및/또는 3' 말단, (b) 제2 핵산 분자의 5' 말단 및/또는 3' 말단, 또는 (c) 제1 핵산 분자의 5' 말단 및/또는 3' 말단, 및 제2 핵산 분자의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 부착된다. 상기에서 열거한 구현예의 각각 및 임의의 것의 구현예에서 추가 뉴클레오티드 시퀀스는 본 명세서에 정의된 것과 같은 추가 뉴클레오티드 시퀀스이다.
구현예에서 E1B 55K 단백질은 SEQ ID NO: 16에 따른 아미노산 시퀀스를 포함하고; 또 다른 구현예에서 E1B 55K 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 17에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
구현예에서 E1B 19K 단백질은 SEQ ID NO: 18에 따른 아미노산 시퀀스를 포함하고; 또 다른 구현예에서 E1B 19K 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 19에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
구현예에서 E1B84R 단백질은 SEQ ID NO: 20에 따른 아미노산 시퀀스를 포함하고; 또 다른 구현예에서 E1B84R 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 21에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다.
본 발명의 구현예에서, 핵산 구조는 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. 구현예에서 추가 뉴클레오티드 시퀀스는 아데노 바이러스 시퀀스이다. 아데노 바이러스 시퀀스는 비-구조적(non-structural) 단백질을 코딩하기 위한 것일 수 있고; 이와 관련하여, 추가 뉴클레오티드 시퀀스는 구현예에서 아데노 바이러스 E2A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 아데노 바이러스 E2B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스 및 아데노 바이러스 E4를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 그룹으로부터 선택된 아데노 바이러스 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. 구현예에서, 추가 뉴클레오티드 시퀀스는 구조적(structural) 아데노 바이러스 단백질을 코딩하는 아데노 바이러스 시퀀스를 포함하고, 이왁 같은 구조적 아데노 바이러스 단백질은 파이버(fiber), pIX 및 펜톤 염기(penton base)를 구성하는 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 추가의 뉴클레오티드 시퀀스는 비-아데노 바이러스(non-adenoviral) 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고; 구현예에서 추가 뉴클레오티드 시퀀스는 Cre 또는 Flp 재조합효소(recombinase)를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. 이러한 단백질과 기능(functions)을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 각각 당업자에게 공지되어 있고, 다른 것들 중에서 NCBI 데이터베이스와 같은 공공 데이터베이스로부터 얻을 수 있다 (e.g. NCBI: AC 000008.1 for the human adenovirus type 5 genome; for Cre from GenBank: X03453.1; for Flp from GenBank: JO 1347.1). 바이러스 및 비-바이러스 단백질을 코딩하는 특정 시퀀스는 천연 시퀀스 또는 포유류 세포에서 향상된 발현을 위해 코돈 최적화된 시퀀스로서 사용될 수 있다.
이러한 종류의 추가의 아데노바이러스 뉴클레오티드 시퀀스는 본 발명의 핵산 구조의 일부이며, 이 핵산 구조는 단일-조각 핵산 분자 또는 두-조각 핵산 분자라는 것은 본 발명의 범위 안에 포함된다. 그러나, 이러한 아데노 바이러스 뉴클레오티드 시퀀스의 하나 또는 여러 개는 추가의 핵산 분자, 바람직하게 플라스미드 혹은 바이러스 벡터와 같은 벡터의 일부라는 것은 본 발명의 범위 안에 포함되고, 그러한 벡터는 본 발명의 핵산 구조가 숙주 세포와 같은 관심 세포로 도입되기 이전, 함께 또는 이후에, 숙주 세포와 같은 관심 세포로 도입된다.
바람직한 구현예에서, 핵산 구조는 pSTK146 UBE2I이다. 이 구조는 SEQ ID NO:9에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. 이 핵산 구조는 E1 mRNA 전사(transcript)의 최적화된 합성 및 프로세스를 위해 인간 UBE2I 유전자의 스플라이스 도너(splice donor), 인트론, 스플라이스 억셉터(splice acceptor) 및 3 ' UTR 시퀀스 요소를 포함하는 것으로 설계되었다: a) 각각 5 ' 또는 3 ' 말단에서 스플라이스 도너(splice donor) 및 스플라이스 억셉터(splice acceptor)를 포함하는 포유류의 짧고 필수 구성요소적인(constitutive) 인트론, 및 b) RNA 절단 및 폴리아데닐화(polyadenylation) 부위. 본 발명에서 발견되었던 것처럼, 변종 스플라이싱(aberrant splicing)으로부터 발생하는, 이전에 사용된 pSTK146 플라스미드 및 37 kDa E1B 단백질과 비교하여 일시적인 형질주입(transient transfection)이 검출되지 않았던 이후에, 이 구조는 E1B 55K 단백질이 적어도 세 배로 강력하게 발현 가능하도록 했다. 또한, pSTK146 UBE2I은 E1B 84R 단백질의 발현을 허용하는 UBE2I 유전자의 스플라이스 억셉터(splice accetor) 이후에 즉시 삽입되는 짧은 pIX 시퀀스를 가진다.
플라스미드 pSTK146 UBE2I에서 다양한 기능적 요소는 다음의 자리에 위치하고, 이에 대한 참조는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 시퀀스로 이루어진다:
생쥐(murine) pgk 프로모터: 뉴클레오티드(nts.) 2230 - 2741
Ad5 E1A: 뉴클레오티드(nts.) 2808 - 3793
Ad5 E1B 프로모터: 뉴클레오티드(nts.) 3885 - 3967
Ad ElB 55K: 뉴클레오티드(nts.) 4267 - 5757
UBE2I 인트론: 뉴클레오티드(nts.) 5767 - 5920
Ad5 E1B 84R C-말단(terminus): 뉴클레오티드(nts.) 5921 - 5936
UBE2I 3' UTR: 뉴클레오티드(nts.) 5937 - 6416
플라스미드 pTL13에서 다양한 기능적 요소는 다음의 자리에 위치하고, 이에 대한 참조는 SEQ ID NO: 23의 뉴클레오티드 시퀀스로 이루어진다:
Ptight 프로모터(TREmod+ minimal PCMV): 뉴클레오티드(nts.). 2 - 318
Ad5 El A: 뉴클레오티드(nts.) 400 - 1385
Ad5 E1B 프로모터: 뉴클레오티드(nts.) 1477 - 1553
Ad E1B 55K: 뉴클레오티드(nts.) 1859 - 3349
UBE2I 인트론: 뉴클레오티드(nts.) 3359 - 3512
Ad5 E1B 84R C-말단(terminus): 뉴클레오티드(nts.) 3513 - 3530
UBE2I 3'UTR: 뉴클레오티드(nts.) 3531 - 4008
구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 구조는 또한 절단(cleavage) 및 폴리아데닐화(polyadenylation)를 포함하는 E1B RNA의 프로세스를 가능하게 하는 3 ' UTR 요소를 포함할 것이다. 이 요소의 특성은 이와 같은 요소가 RNA 프로세스를 허용하기 위해 존재해야 한다는 것을 제외하고는, 본 발명에서 중요하지 않다. 또 다른 바람직한 구현예에서, UBE2I 유전자로부터 다운스트림(downstream) RNA 프로세스 요소가 사용된다.
핵산 구조가 DNA 분자 또는 RNA 분자로서 존재하는 것은 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 세포 및 세포주와 관련하여 그것들의 바람직한 구현예는 양수세포(amniocytic cells 또는 amniocytes)이다. 용어 "양수세포(amniocytes)" 또는 양수세포(aminocytic cells), 두 용어 모두 본 명세서에서 호환적으로 사용되고, 본 명세서에서는 양수(amniotic fluid)에 존재하고 양수 천자(amniocentesis)에 의해 얻어지는 모든 세포를 의미한다. 그것들은 양막(amnion) 또는 예를 들어 태아의 피부 또는 소변(urine)과 같은 양수(amniotic fluid)와 접촉하는 태아 조직(fetal tissue)으로부터 유래한다. 세 가지 주요한 양수세포(amniocytes)의 클래스(class)는 형태학적 기준(morphological criteria), 섬유아세포와 같은 세포(fibroblast-like cells, F cells), 유상피 세포(epitheloid cells, E cells) 및 양수의 세포(amniotic fluid cells, AF cells)(Hoehn et al., Pediat. Res. 8, 746-754, 1974)의 기준(basis)에 따라 구별되나, 부가적인 세포 타입이 존재할 수 있다. 이러한 세 가지 주요한 양수세포(amniocytes)의 클래스의 각각은 본 발명의 핵산 구조가 도입될 수 있는 양수세포(amniocytic cell)이다. 이에 따라, 본 발명의 양수세포(amniocytic cell)는 F cell, E cell 및/또는 AF cell과 같은 양수(amniotic fluid)에 존재하는 임의의 세포 타입이다.
"일차 세포(primary cells)"로 언급되는 세포는 기관(organism)으로부터의 제거에 의해 얻어지는 세포로, 세포 배양 접시에 접종되고 노화에 들어갈 때까지 제한된 수명 동안 세포 계대(cell passaging)에 의해 배양되고 증식될 수 있다.
구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 핵산 구조는 노화에 들어가기 전에 일차 양수세포(amniocytes)로의 형질주입(transfection)에 의해 도입되고, 아데노바이러스 E1A 및 E2B 유전자 산물의 발현을 가능하게 하며, 따라서, 핵산을 코딩하는 E1A 및 E2B의 염색체 통합(chromosomal integration)에 뒤이어, 일차 양수세포(amniocytes)의 영구화(immortalization) 및 영구화된 양수세포 세포주의 확립을 주도한다. 용어 형질주입(transfection)은, 예를 들어 화학적 방법(예를 들어, 리포펙션(lipofection) 또는 폴리에틸아민(PEI)-매개 형질주입에 의해), 물리적 방법 (예를 들어, 전기천공법(electroporation)에 의해), 또는 생물학적 방법(예를 들어, 바이러스 벡터의 사용에 의해)을 사용하는 임의의 방법에 의해 핵산을 세포로 도입하는 것을 나타내기 위해 사용된다.
"하나 이상의 핵산"은, 예를 들어 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스와 같은 천연 통합 벡터(naturally integrating vectors)를 포함하는 박테리아 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터에 존재하는, 하나 또는 여러 개의 DNA 발현 유닛의 형태로 바람직하게 사용된다. 용어 "하나 이상의 핵산"은 상이한 E1 단백질을 코딩하는 발현 유닛이 하나 이상의 벡터에 포함될 수 있다는 사실을 나타낸다.
부가적인 바이러스, 특히 아데노 바이러스, 또는 예를 들어 비-구조적(non-structural) 아데노 바이러스 E2A, E2B 및/또는 E4 단백질과 같은 비-바이러스 기능(non-viral function), 파이버(fiber), pIX, 또는 펜톤 염기(penton base)와 같은 구조적(structural) 아데노 바이러스 단백질, 또는 Cre 또는 Flp 재조합효소(recombinase)와 같은 재조합효소를 코딩하는 추가의 발현 유닛이 본 발명의 핵산 구조의 일부를 형성할 수 있다는 것은, 본 발명의 범위에 속한다. 그러나, 이러한 추가의 발현 유닛이 하나 또는 여러 개의 분리된 벡터에 포함된다는 것도 본 발명의 범위에 속한다. 그러한 하나 또는 여러 개의 벡터는 플라스미드 또는 바이러스일 수 있다.
이러한 기능(function)을 연속적인 방식으로 도입하는 것이 또한 가능하다. 생산과, 적절한 경우, 핵산의 돌연변이유발(mutagenesis) 및 유전자 발현과 단백질 분석을 위한 적합한 기술 및 프로세스가 숙련된 기술자에게 가능하다(예를 들어, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Glover, D. M., DNA cloning: A practical approach, vol. II: Expression Systems, IRL Press (1995); Ausubel et al., Short protocols in molecular biology, John Wiley & Sons (1999); Rees, A. R. et al., Protein engineering: A practical approach, IRL press (1993) 참조).
본 발명의 핵산 구조의 준비를 위한 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 방법은 다른 것들 중에서 클로닝(cloning) 방법, 화학적 합성 방법을 포함한다.
유전자 전달 벡터(gene transfer vector), 바람직하게 아데노 바이러스 유전자 전달 벡터 또는 본 발명의 핵산 구조를 포함하는 본 발명의 세포 및/또는 핵산 구조를 포함하는 본 발명의 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 아데노바이러스 돌연변이의 생산을 위한 방법과 관련된 본 발명의 양태 관련하여, 세포 및 세포주는 각각 추가의 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고, 여기서 추가의 뉴클레오티드 시퀀스는 유전자 전달 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이이다. 바람직하게, 유전자 전달 벡터 또는 아데노바이러스 돌연변이는 숙주세포에서 발현 및/또는 생산된다. 유전자 전달 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이의 핵산 시퀀스를 포함하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스는 E1B 발현을 위한 발현 유닛 및/또는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 일부이거나 이에 포함될 수 있다. 대안적으로, 유전자 전달 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이를 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스는 각각 본 발명의 핵산 구조 및 본 발명의 핵산 구조를 포함하는 벡터와 상이한 벡터의 일부이다. 구현예에서, 유전자 전달 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이를 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 벡터는 각각 본 발명의 핵산 구조 및 본 발명의 핵산 구조를 포함하는 벡터에 공유적으로 결합되어 있지 않다. 또 다른 구현예에서, 벡터는, 특별히 다른 것 중에서 AAV 벡터와 같은 유전자 전달 벡터의 생산의 경우에, 유전자 전달 벡터 또는 아데노바이러스 돌연변이를 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스 포함하는 벡터를 포함하는 이러한 세포만을 각각 선택하고 유지하는 것을 허용하는, 선택 마커(selection marker)를 포함한다.
본 발명의 이 양태의 구현예에서, 방법은 본 발명의 영구화된(immortalized) 세포주에서 ΔE1Ad 벡터의 생산을 위한 것이다. 플라스미드 pSTK146 UBE2I를 이용하는 영구화(immortalization)에 의해 생성된 것들과 같은 E1A 및 E1B를 발현하는 세포는, 바람직하게 세포 당 3 내지 20 개 사이의 감염 유닛(infectious units)을 사용하는 ΔE1Ad로 감염된다(MOI(multiplicity of infection) = 3 to 20). 약 36 내지 72시간 이후에, 세포는 세포 병변 효과(cytopathic effect)를 나타낸다. 세포는 전문가에게 공지되니 표준 프로토콜에 의해 회수된다. 아데노 바이러스 벡터는 CsCl 밀도 구배 원심분리(CsCl density gradient centrifugation) 또는 크로마토그래피(chromatographic processes)에 의해 세포 추출물 또는 상층액으로부터 정제될 수 있다.
또 다른 본 발명의 이 양태의 구현예에서, 방법은 제2-세대(second-generation) Ad 벡터의 생산을 위한 것이다. 제2-세대 아데노 바이러스 벡터를 생산하기 위해, 불활성화(inactivation) 및/또는 삭제(deletion)로 인해 벡터 그 자체가 발현하지 않는 기능(fuction)은, 본 발명에 따른 세포주에 의해 제공된다. 안정적으로 E1A 및 E1B를 발현하는 양수세포 세포주(amniocytic cell lines)는 하나 이상의 다른 아데노바이러스 기능(function)을 코딩하는 유전자 산물을 발현하는 발현 카세트(expression cassettes)의 형질주입(transfection)에 의해 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, E1A 및 E1B 유전자의 삭제에 부가하여,E2A, E2B, 및/또는 E4 유전자도 삭제된 제2-세대 아데노 바이러스 벡터를 생산하기 위해, 적절한 유전자 또는 유전자들이 E1A 및 E1B를 발현하는 양수세포 세포주에 선택 항생제(selection antibiotic)와 함께 형질주입(transfection)에 의해 도입된다. E1A 및 E1B 기능(function)의 발현에 부가하여, E2A, E2B 및/또는 E4 기능(function)도 발현하는 세포 클론은 이 때 특별한 제2-세대 벡터를 생산하기 위해 사용될 수 있다. E2 및/또는 E4 유전자는, 일반적으로 필수 구성요소적으로(constitutively) 활성이 있거나 또는 예를 들어 유도성 유전자 발현 시스템을 이용하여 조절될 수 있는 비상동 프로모터(heterologous promoter)의 전사 제어(transcriptional control) 하에 있다. 이러한 세포에서, Ad 벡터는 세포 당 3 내지 20 개 사이의 감염 유닛(infectious units)을 사용하는 제2-세대 Ad 벡터(MOI(multiplicity of infection) = 3 to 20)로 세포주를 감염시킴으로써 생산된다. 약 36 내지 72시간 이후에, 세포는 세포 병변 효과(cytopathic effect)를 나타낸다. 세포는 전문가에게 공지되니 표준 프로토콜에 의해 회수된다. 아데노 바이러스 벡터는 CsCl 밀도 구배 원심분리(CsCl density gradient centrifugation) 또는 크로마토그래피(chromatographic processes)에 의해 세포 추출물 또는 상층액으로부터 정제될 수 있다.
단백질의 생산을 위해 바람직하게 본 발명의 구조를 포함하는 본 발명의 세포 및/또는 바람직하게 본 발명의 구조를 포함하는 세포주의 용도와 관련된 본 발명의 양태과 관련하여, 세포 및 세포주는 각각 단백질을 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. 바람직하게, 추가의 뉴클레오티드 시퀀스는 숙주 세포에서 발현된다. 단백질을 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛 및/또는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 일부이거나 이에 포함될 수 있다. 대안적으로, 단백질을 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스는 각각 본 발명의 핵산 구조 및 본 발명의 핵산 구조를 포함하는 벡터와 상이한 벡터의 일부이다. 구현예에서, 단백질을 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 벡터는 각각 본 발명의 핵산 구조 및 본 발명의 핵산 구조를 포함하는 벡터에 공유적으로 결합되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 벡터는, 바람직하게 단백질을 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 벡터를 포함하는 이러한 세포들만을 각각 선택하고 유지하는 것을 허용하는, 선택 마커(selection marker)를 포함한다. 단백질을 코딩하는 추가의 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 벡터는 플라스미드 또는 바이러스이다. 동일한 고려가 각각 본 발명의 핵산 구조를 포함하는 본 발명의 세포 또는 본 발병의 세포주의 배양을 포함하는 단백질의 생산을 위한 본 발명의 방법에 동일하게 적용된다.
본 발명의 이러한, 각각, 및 다른 양태와 관련된 단백질은 바람직하게 치료 목적, 백신과 같은 예방 목적, 또는 진단 목적을 위해 사용될 수 있는 하나 또는 여러 개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩타이드이다. 단백질 생산을 위해, 관심 있는 단백질의 코딩을 위한 하나 또는 여러 개의 핵산은, 형질주입(transfection)에 의해 pSTK146 UB2I핵산 구조를 가지는 영구화(immortalization)에 의해 생성된 본 발명의 것과 같은, E1A 및 E1B를 발현하는 영구화 양수세포 세포주로의 발현 유닛으로서 도입된다. 그러한 발현 유닛은 바람직하게, 필수 구성요소적(constitutive) 또는 유도성 프로모터 및 mRNA 프로세싱 기능을 가지는 3'UTR에 작동 가능하도록 결합된 특정 단백질을 코딩하는 핵산을 최소 요소로서 포함한다. 일반적으로, 관심 있는 단백질을 코딩하는 염색체 통합된 핵산을 갖는, 세포 클론의 확인은, 선택 가능한 마커(selectable marker)를 발현하는 제2 플라스미드로 공형질주입(cotransfection) 하거나, 단백질을 포함하는 발현 유닛 및 선택 가능한 마커(selectable marker)를 모두 포함하는 플라스미드를 이용함으로써 용이하게 된다. 선택 가능한 마커(selectable marker)의 전형적인 예는, 아미노글리코사이드 인산전이효소(aminoglycoside phosphotransferase)를 코딩하고 아미노글리코사이드 네오마이신(aminoglycoside neomycin) 또는 항생제 G418에 내성을 부여하는, 네오 유전자(neo gene)이다(Davies et al., 1980). 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 선택 가능한 마커(selectable marker)의 다른 예는 아미노뉴클레오사이 항생제 퓨로마이신(aminonucleoside antibiotic Puromycin)에 내성을 부여하는, 퓨로마이신 N-아세틸-전이효소(puromycin N-acetyl-transferase, PAC)를 코딩하는 유전자이다. 또한 당업자에게 공지된 다른 선택 가능한 마커(selectable marker)도 두 개의 언급된 예 대신에 사용될 수 있다. 그러나, 심지어 대부분의 불필요한 경우에 선택 가능한 마커(selectable marker)를 활용하는 이 특정한 경우에, 또한 다른 방법이 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스 벡터와 같은 통합 벡터 시스템의 사용을 포함하는 본 발명의 양수세포 세포주로, 관심 있는 단백질을 코딩하는 발현 유닛을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 양수세포 세포주에서 생산된 단백질은 이후에 원심분리 기술, 용해도 차이(different solubility), 예를 들어 이온 교환과 같은 크로마토그래피, 친화력 또는 크기 배제 크로마토그래피(affinity or size exclusion chromatography) 및 전문가에게 공지된 다른 절차를 포함하는 표준 방법을 이용하여, 세포 추출물 또는 상층액으로부터 회수된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 생산된 단백질은 암환자의 치료를 위해 사용되는 것들, 염증성 질환과 같은 것을 치료하기 위해 사용되는 것들, 또는 감염성 질환을 치료하기 위해 사용되는 것들을 포함하는 항체; 선천성 또는 후천성 혈우병 환자의 치료를 위해 사용되는 응고인자(coagulation factors)들을 포함하고, 빈혈 환자의 치료를 위해 사용되는 에리스로포이에틴(erythropoietins)을 포함하는 혈액 인자(blood factors); 인터페론(interferons) 및 인터류킨(interleukins), 콜로니 자극 인자(colony stimulating factors) 및 성장 인자(growth factors), 호르몬 및 효소를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 생산된 단백질은 암, 감염성 질환, 퇴행성 질환, 알러지 질환, 유전 질환, 자가 면역 질환, 관절염 또는 건선과 같은 염증성 질환, 심혈관계 질환 및 이식조직 거부반응을 가진 환자의 치료에 사용되는 것들을 초함하는 항체 또는 항체 단편(antibody fragments)을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 예들은 당단백질(glycoprotein) Ilb/IIIa를 표적으로 하는(예: 압식시맙(abciximab)), TNF 알파 시그널링(TNF alpha signalling)을 표적으로 하는(예: 아달리무밥(adalimumab), 서톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 인플릭시맙(infliximab)), CD52를 표적으로 하는(예: 알렘투주맙(alemtuzumab)), CD25를 표적으로 하는(예: 바실릭시맙(basiliximab), 다클리주맙(daclizumab)), B-세포 활성화 인자(B-cell activating factor)를 표적으로 하는(예: 벨리무밥(belimumab)), VEGF를 표적으로 하는(예: 베바시주맙(bevacizumab), 라니비주맙(ranibizumab)), CD30을 표적으로 하는(예: 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin)), IL-1 베타를 표적으로 하는(예: 카나키누맙(canakinumab)), EGFR을 표적으로 하는(예: 세툭시맙(cetuximab), 파니튜무밥(panitumumab)), RANK 리간드 억제제(RANK Ligand inhibitor)를 표적으로 하는(예: 데노수맙(denosumab)), 보체 시스템 단백질(complement system proteins)을 표적으로 하는(예: 에쿨리주맙(eculizumab)), CD11a를 표적으로 하는(예: 에팔리주맙(efalizumab)), CD33을 표적으로 하는(예: 젬투주맙(gemtuzumab)), TNF 알파를 표적으로 하는(예: 골리무맙(golimumab)), CD20을 표적으로 하는(예: 이브리투맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 오파투무밥(ofatumumab), 리룩시맙(riruximab), 토시투모맙(tositumomab)), CTLA-4를 표적으로 하는(예: 이필리무맙(ipilimumab)), CD3을 표적으로 하는(예: 무로모납-CD3(muromonab-CD3)), 인테그린(integrins을 표적으로 하는(예: 나탈리주맙(natalizumab)), IgE를 표적으로 하는(예: 오말리주맙(omalizumab)), 바이러스 단백질(viral proteins)을 표적으로 하는(예: 팔리비주맙(palivizumab)), 인터류킨 수용체(interleukin receptors)를 표적으로 하는(예: 톡실리주맙(toxilizumab), 아틀리주맙(atlizumab)), ErbB2를 표적으로 하는(예: 트라스투주맙(trastuzumab)) 항체(antibody)를 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 생산된 단백질은 바람직하게 유전 질환(종종 소위 저장 장애(storage disorders)에 속하는)에서 부족한 효소(missing enzymes)를 대체하는데 사용되는 효소의 그룹으로부터 선택된다. 예들은 M. Gaucher의 치료를 위한 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 제1형 MPS의 치료를 위한 이듀로니다제(iduronidase), 제2형 MPS의 치료를 위한 이듀로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 제6형 MPS(MPS Typ Vi)의 치료를 위한 갈설파제(galsulfase), M. Pompe의 치료를 위한 알파-글루코시다제(alpha-glukosidase), 파브리병(Fabry disease)의 치료를 위한 아갈시다제 베타(agalsidase beta)이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 생산된 단백질은 에리스로포이에틴(erythropoietin)(현재 주로 빈혈의 치료를 위해 사용되는), 알파-인터페론(alpha-interfero(현재 주로 만성 B형 간염, C형 간염의 치료 또는 항암 치료에서 주로 사용되는), 베타-인터페론(beta-interferon)(현재 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 바이러스 질환의 치료를 위해 주로 사용되는), 감마-인터페론(gamma-interferon)(현재 항암 치료를 위해 주로 사용되는), 콜로니-자극 인자(colony-stimulating factors) G-CSF, M-CSF, GM-CSF 및 MEG-CSF(화학 요법 또는 골수 이식 환자에서 관찰되는 호중구감소증(neutropenia)에서 G-CSF의 사용, 또는 줄기 세포가 이식된 경우에 골수로부터 줄기 세포 동원(mobilisation)에 대한 예; 면역자극(immunostimulation) 및 호중구감소증에 대한 치료에 GM-CSF의 이용에 대한 예)이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 생산된 단백질은 바람직하게 선천성 또는 후천성 혈우병 환자의 치료에 사용되는 응고인자(coagulation factors)를 포함하는 혈액 인자(blood factors)의 그룹으로부터 선택된다. 예들은 혈액 응고 인자 VII, VIII, IX 또는 폰빌레브란트인자(von Willebrand Factor)이고, 이들은 주로 혈우병 A(F VIII 결핍), B(F IX 결핍) 및 폰빌레브란트병(vWF 결핍)을 포함하는 혈액 응고 유전 질환에 각각 사용된다. 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA, tissue plasminogen activator)와 같은 플라스미노겐 활성인자가 이 그룹에 포함된다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 생산된 단백질은 호르몬 및 성장 인자(growth factors)의 그룹으로부터 선택된다. 이 그룹의 예는 성장 지연 및 저신장(short stature)을 가지는 환자를 치료하기 위해 사용되는 인간 성장 호르몬(GH) 및 당뇨병의 치료를 위해 사용되는 인슐린이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 생산된 단백질은 인터류킨(interleukins), 인터페론(interferones) 및 콜로니 자극 인자(colony stimulating factors)를 포함하는 케모카인(chemokines)의 그룹으로부터 선택된다. 이 그룹의 예는 신장암(renal cell carcinoma)의 치료를 위해 사용되는 인터류킨-2(IL-2)이다.
또한, 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 생산된 단백질은 융합 단백질(fusion proteins)의 그룹으로부터 선택된다. 융합 단백질에 대한 예는 인간 RNF 수용체 2(TNFR2/p75)의 세포외 리간드-결합 도메인(extracellular ligand-binding domain) 및 IgG1-항체의 Fc-부분으로 구성되는 에탄세르셉트(etancercept)이다.
다음은 다양한 시퀀스 ID 번호(SEQ ID No)들을 요약한 표이다: 본 명세서에 사용된 바와 같이, 각각의 시퀀스의 기능 및 그것들이 코딩하는 기능의 종류를 각각 나타낸다.
SEQ ID NO: 1: E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 2: E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 3: pSTK 146에 포함된 SV40의 3'UTR
SEQ ID NO: 4: pSTK 146에 포함된 SV40의 인트론
SEQ ID NO: 5: 본 출원의 핵산 구조의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 6: 본 출원의 핵산 구조의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 7: E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 8: E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 9: 본 발명의 핵산 구조의 뉴클레오티드 시퀀스(pSTK146 UBE2I)
SEQ ID NO: 10: UBE2I 인트론의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 11: UBE2I 스플라이스 도너 부위의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 12: UBE2I 스플라이스 억셉터 부위의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 13: 본 발명의 핵산 구조 내에 사용된 스플라이스 도너 부위 및 스플라이스 억셉터 부위를 포함하는 인트론의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 14: E1B의 발현을 위ㅎ나 발현 유닛의 3' UTR의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 15: 본 발명의 핵산 구조의 뉴클레오티드 시퀀스(pTL13)
SEQ ID NO: 16: E1B 55의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 17: E1B 55K를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 18: E1B 19K의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 19: E1B 19K를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 20: E1B84R의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 21: E1B84R을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 22: 플라스미드 pSTK146 UBE ΔE1B 84R/pIX의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 23: 플라스미드 pTL13 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 24: 플라스미드 pSTK146 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 25: 인간 유전자 UBE2I의 3' UTR의 뉴클레오티드 시퀀스
SEQ ID NO: 26: 올리고뉴클레오티드 #73
SEQ ID NO: 27: 올리고뉴클레오티드 #74
SEQ ID NO: 28: 올리고뉴클레오티드 #75
SEQ ID NO: 29: 올리고뉴클레오티드 #76
SEQ ID NO: 30: 올리고뉴클레오티드 #59
SEQ ID NO: 31: 올리고뉴클레오티드 #60
본 발명은 추가적인 특징, 구현예 및 장점이 취해질 수 있는 도면, 실시예 및 서열 목록에 의해 또한 설명된다.
실시예 1: 구조 pSTK146UBE2I을 발현하는 Ad5 E1의 클로닝
클로닝 전략
이전의 결과에 따르면, 인간 일차 양수세포(human primary amniocytes)는 hAd5의 E1 단백질에 의해 형질전환 될 수 있다(Schiedner et al., 2000). 이러한 실험에서 사용된 종래 기술의 E1 발현 구조 pSTK146은 유전자 발현을 향상시키는 많은 전사 카세트(transcription cassettes)에서 종종 발견되는 인트론 및 3 ' UTR을 포함하는 비-코딩(non-coding) SV40 시퀀스 요소(sequence elements)를 포함한다. 스플라이스 억셉터(splice acceptor)를 포함하는 E1B 55K를 코딩하는 시퀀스의 3' 말단에서 인트론은 E1B mRNA의 스플라이싱 및 E1B 55K 단백질의 효율적인 발현을 위해 필요하다. 본 명세서에서 pSTK 146 UBE2I로 언급되는 본 발명의 핵산 구조의 구현예는 짧은 인트론(short intron)에 의해 SV40 인트론 및 3'UTR을 대체하여 생성하였고, 인간 유전자 UBE2I의 스플라이스 도너, 스플ㄹ이스 억셉터 및 3'UTR을 포함한다(NCBI Reference Sequence: NT_010393.16, SEQ IC NO: 25). 또한, 적은 E1B 84R 단백질의 발현을 허용하는 pIX 유전자의 짧은 시퀀스를 삽입하였다. E1B 84R의 발현을 향상시키고 Ad5 시퀀스에 해당하는 상동성(homology)을 감소시키기 위해 E1B 84R 인코딩 시퀀스를 코돈-최적화(codon-optimized) 하였다. 후자의 수단은 본 발명의 핵산 구조를 포함하는 세포주가 ΔE1Ad 벡터의 생산을 위해 사용되는 경우 특히 유용하다. ΔE1Ad 벡터의 전이유전자(transgene) 발현 카세트 및 E1-형질전환된 세포주의 Ad5 시퀀스 사이의 시퀀스 중복을 추가적으로 감소시키기 위해 폴리아데닐화(polyadenylation) 부위를 포함하는 SV40의 3 ' UTR을 UBE2I 유전자의 인간 3'UTR로 대체하였다.
실제 클로닝
E1B 프로모터, E1B 코딩 시퀀스 및 SV40 시퀀스(인트론 및 3'UTR)를 포함하는 플라스미드 pBKSII E1B로부터 시작하여, 위치선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 Ad5의 뉴클레오티드(nt.) 3510에서 스플라이스 도너를 제거하고 플라스미드 내에 NdeI 제한효소 절단위치(restriction site)를 도입하기 위하여 수행하였다. 얻어진 플라스미드 pBKSII E1B QC NdeI는 1 kb 단편(fragment)을 방출(release)하기 위해 BamHI 및 NdeI로 분해되고, 그렇게 함으로써 모든 SV40 시퀀스를 제거한다. 인간 UBE2I 인트론은 낮은 계대(low passage)의 인간 N52.E6 세포(Schiedner et al., 2000) 및 올리고뉴클레오티드 #73 (5'-gttcagCATATGcaggtacggggcctccgcctctg-3'(SEQ ID NO: 26) 및 #74 (5'-TCAAGGTGGGGGAGGGTtctgtgccagagacaaaaacacaagac-3'(SEQ ID NO: 27)으로부터 분리된 게놈의 DNA를 사용한 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 얻었다. "PCR 인트론"이라 불리는 PCR 산물은 NdeI 부위(밑줄) 및 5' 또는 3' 말단에서 E1B 84R의 C-말단(terminal) 부분을 코딩하는 코돈-최적화된 Ad5 시퀀스에 의해 각각 배치된다. UBE2I의 3'UTR을 올리고뉴클레오티드 #75 (5'-gaACCCTCCTCCACCTTGAATTGCCCGTTTCCATACAGGGTC-3'(SEQ ID NO: 28) 및 #76 (5'- ctggatccGCGGTGGGGCTGCAGGTG-3'(SEQ ID NO: 29))을 사용하여 분리하였고, 5' 또는 3' 말단에서 각각 상기 언급된 것과 동일한 Ad5 시퀀스(nt. 3595 내지 nt. 3612) 및 BamHI 제한효소 절단부위(restriction site)(밑줄)에 의해 배치되는 PCR 산물 "PCR 3'UTR"을 얻는다. "PCR intron"의 3' 말단 및 "PCR 3' UTR"의 5' 말단에서 Ad5 시퀀스의 중복은 이이러한 두 PCR 산물이 융합하는 것을 허용하였고, 이 때 올리고뉴클레오티드 #73 및 #76을 사용하였다. NdeI 및 BamHI에 의해 배치되어 얻은 융합 PCR 단편(fragment)을 이후 pBSK E1B QC NdeI의 NdeI 및 BamHI 부위 사이에 삽입하여 pBSK E1B UBE2I를 얻었다. pSTK146 UBE2I를 생성하기 위해, UBE2I 인트론, E1B 84R 의 코돈-최적화된 C-말단 부분 및 UBE2I 3'UTR을 포함하는 pBSK E1B UBE2I 유래 BgIII/BamHI 단편(fragment)을 pSTK146의 BgIII 및 BamHI 부위 사이에서 서브클론(subclone) 하였다. 얻은 플라스미드를 pSTK146UBE2I(Sequence ID NO 9)로 명명하고 도 1a)에서 또한 나타내었다.
실시예 2: E1 단백질의 정상상태 수준(steady-state levels)을 검출하기 위한 웨스턴 블롯 분석
E1B 55K를 발현하는 다양한 핵산 구조를 사용한 일시적인 형질주입(transient transfection) 이후에 E1B 55K 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해, 1x106 Hela 세포를 6 cm 접시에 접종하였다. 다음 날 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 신선한 배지를 추가하였다. 형질주입제(transfection reagent)로 폴리에틸렌이민(PEI)를 사용하여, 3 ㎍의 플라스미드 pSTK146(E1A 및 E1B 모두 발현) 및 플라스미드 pBSKII E1B(천연 E1B 프로모터로부터 E1B만을 발현), pBSKII E1B UBE2I(천연 E1B 프로모터로부터 E1B를 발현하고 UBE2I 요소를 포함) 및 플라스미드 pSTK146 UBE2I로 형질주입하였다. 48시간 이후에, 세포를 PBS로 세척하고, PBS에서 50mM EDTA로 한 후, 원심분리에 의해 펠렛(pellet)화 하였다. 세포 펠렛을 얼음에서 30분간 200 ㎕ RIPA 용해 버퍼(lysis buffer)(40 mM Tris/HCL, pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1%(v/v) Nonidet P-40, 0.1%(w/v) SDS, 0.5%(w/v) 데스옥시콜린산나트륨(sodium desoxycholate))로 용해하였다. 반복된 냉동 및 해동 후에, 세포 파편(cell debris)을 원심분리에 의해 제거하고, 단백질 농도를 측정하였다(Bio-Rad protein assay). 총 세포 추출물의 50 ㎍을 10% SDS-PAGE 및 면역블롯팅(immunoblotting)으로 분석하였다. E1B 55K 단백질을 E1B 55K-특이적 2A6 항체(E1B 55K-specific 2A6 antibody)를 이용하여 검출하였다.
pBSKII E1B UBE2I 및 pSTK146 UBE2I의 형질주입 후 E1B 55K 단백질의 발현은 도 4에 나타낸 바와 같이 pBSKII E1B 및 pSTK146의 형질주입 후보다 약 10 배 높았다. 의외로, pBSKII E1B 및 pSTK146의 형질주입에 이어서 더 빠르게 이동하는 E1B 형태가 pSTK146 UBE2I의 형질주입에서 검출되지 않았던 약 37 kDa(E1B 37K로 표시된)의 분자량으로 검출되었다.
실시예 3: pSTK146-형질주입된 세포에서 E1B mRNA 전사의 변종 스플라이싱의 측정
E1B-특이적 항체 2A6(E1B-specific antibody 2A6)이 결합하는 N-말단(terminal)에 의한 pSTK146-형질주입된 세포의 웨서턴 블롯 분석-E1B 55K에 추가하여- E1B 37K라 명명된 더 빠르게 이동하는 E1B 단백질(faster migrating E1B protein)을 보였다. mRNA 수준에서 테스트하기 위해, E1B 37K 단백질을 E1B 변종 스플라이싱 이벤트(aberrant splicing events)로부터 얻었다면, pSTK146-형질주입된 Hela 세포로부터의 총 RNA를 트리졸 시약(Trizol Reagent)으로 추출하고 Phase Lock Gel tubes(PLG, Eppendorf) 및 제조사의 지시에 따른 DNAse 처리를 포함하는 RNeasy Mini Kit(Qiagen)을 이용하여 추가 정제하였다. 상보적 DNA(cDNA)를 제조자의 프로토콜에 의한 설명과 같이 SuperScript™ III 제1-가닥 합성 시스템(First-Strand Synthesis System)(Invitrogen, Carlsbad, USA)을 사용하여 합성하고, RNA를 올리고-dT 프라이머(oligo-dT primer)를 사용하여 역전사(reverse transcribe)하였다. cDNA의 PCR 증폭을 일반적으로 사용되는 스플라이스 도너(SD)1의 3'에 결합하는 포워드 올리고데옥시뉴틀레오타이드(forward oligodeoxynucleotide) #59(5'-CTGAACTGTATCCAGAACTGAG-3'(SEQ ID NO: 30)) 및 SV40 스플라이스 억셉터(SA)의 3'에 결합하는 리버스 올리고뉴클레오티드(reverse oligonucleotide) #60(5'-ACTGCTCCCATTCATCAGTTC-3'(SEQ ID NO: 31))을 이용하여, Taq-중합효소(NEB)로 수행하였다. 증폭된 cDNA를 젤-정제(gel-purified)하고, 3' 오버행(overhangs)을 T4-DNA 중합효소(NEB)에 의해 제거하였다. 그 다음 cDNA를 클로닝 벡터 pBluescript II SK의 EcoRV 부위에 삽입하고, 시퀀싱하였다(Entelechon GmbH, Regensburg, Germany).
E1B mRNA 전사물(transcripts)의 시퀀스 분석은 SDI의 SD (Ad5의 nt. 2,324 또는 nt. pSTK146의 4,572) 69 뉴클레오티드(nt.) 다운스크림(downstream) 및 SV40 3' UTR (nt. 5,832)의 SA를 이용하여 변종 스플라이싱(aberrant splicing)을 나타냈다. mRNA 전사물(transcripts) 코딩하는 E1B 55K의 스플라이싱을 위해 일반적으로 사용되는 스플라이스 도너 SD2의 사용이 검출되지 않았다. 얻어진 E1B 37K 단백질은 첫 102 아미노산만을 E1B 55K와 공유한다. 그러나 효과적인 형질전환(transformation)을 위해 E1B 55K의 중심 부분(central part) 및 C-말단(terminus)에서 다양한 모티브(motifs)가 필요하다. 인트론 및 UBE2I 유전자로부터의 3'UTR 부위(region)를 도입함으로써, 크립틱 스플라이싱(cryptic splicing)은 형질전환에 기여하는 모든 시퀀스를 보유하는 총 길이(full length) E1B 55K의 발현을 초래하는 것을 억제할 수 있다(Blackford et al., 2009, Endter et al., 2001, Schreiner et al., 2011). 모두 합하여, 플라스미드 pSTK146의 세포 형질주입을 따라, E1B 55K 단백질의 매우 적은 양만이 검출되었고, RT-PCR에 따른 시퀀스 분석에 의해 보여지는 바와 같이 변종 스플라이싱(aberrant splicing)으로부터의 결과로 상당한 변종 "E1B 37K" 단백질이 발견되었다.
실시예 4: 플라스미드 pSTK146 및 pSTK146 UBE2I의 인간 양수세포 형질주입
인간 양수세포의 형질주입은 필수적으로 Schiedner et al., 2000 및 아래에 기술된 일부 변형이 있는 EP00979539에 기술된 절차을 따른다.
양수세포의 배양(Culture of amniocytes)
진단적 양수천자에 의해 얻은 일차 세포를 포함하는 양수의 샘플을 플라스틱 배양 접시의 세포 배양 배지에 추가하였다. 양수의 세포는 일반적으로 접종 후 2 내지 4일 내에 부착 및 증식하기 시작했다. 일차 세포군(cell population)을 플라스틱 세포 배양 접시의, 초기에 10% 우태아 혈청, 4 mM 글루타민(glutamine) 및 2% 울트로저(Ultroser)가 첨가된 Ham's F10에서 배양하였다. 이후에, 세포들을 두 개의 15 cm 세포 배양 접시로 확장하였을 때, 그것들을 제1 단계는 50% OptiPro 배지에서 그리고 제2 단계는 100% OptiPro 배지에서, 두 계대(passaging) 단계 동안 2% 울트로저(Ultroser)(Cytogen) 및 2% 글루타맥스(Glutamax)(Gibco)가 첨가된 OptiPro 배지 (Gibco)에 적응하도록 하였다. 배양 배지를 매 3-4일마다 교환했다. 시각적으로 70 내지 90%의 컨플루언시(confluency)에서, 일차 양수세포를 TrypLE Select(Gibco)로 떼어내고 네 가지 인자(factor of four)에 의해 더 큰 용기(vessels) 또는 스플릿(split)으로 확장하였다. 접종 이후 네 번째 계대(passage)에서 시작히여, 세포의 몇몇 바이알(vials)을 매 계대마다 냉동시켰다(냉동 절차는 아래에 기술하였다). 배양물을 50% 이상의 세포가 억제된 세포 분열 뿐만 아니라 세포의 확장(enlargement) 및 편평률(flattening)에 의해 특징지워지는 노화 표현형(senecent phenotype)을 얻을 때까지 유지하였다. 이러한 변화는 일반적으로 30-38 집단 배가(population doublings)에 해당하는 계대(passage) 7 및 11 사이에서 관찰되었다.
세포 스톡(cell stocks)의 냉동 및 저장
일차 세포의 장기간 저장을 위해, 세포를 TrypLE Select로 떼어내어 모으고, 원심분리에 의해 배양 배지로부터 분리하였다. 그것들을 밀리리터 당 1x106 내지 1x107의 세포 밀도에서, 5% 세포 배양 그레이드(grade) DMSO(dimethylsulfoxid, Sigma)를 포함하는 신선한 배양 배지로 재현탁하였다. 액체 질소(algene) 내에서 보관하기 위하여 현탁액을 바이알에 채웠다. 냉각제로 이소프로판올을 포함하는 Nalgene freezing 장치에 튜브를 넣었다; 장치를 -80℃에서 하룻밤 동안 저장하고 분 당 약 1K의 냉각 속도(cooling rate)를 얻었다. 그 다음 냉동된 바이알을 장기간 저장을 위해 액체 질소 컨테이너의 기체상(gaseous phase)에 넣었다.
동일한 냉동 절차를 일차 양수세포로부터 유도된 세포 클론 및 세포주에 대해서도 사용하였다.
형질주입 컴플렉스의 준비, 양수세포의 형질주입
형질주입을 노화가 시작되기 직전의, PD 30 내지 35에 해당하는 계대(passage) 7 내지 9의 일차 양수세포에 수행하였다.
사용된 재료:
-Tris-EDTA 버퍼 내의 플라스미드 pSTK146 UBE2I DNA, pH 7.5, 이어서 표준 절차에 따른 제한 효소 BspHI에 의한 선형화(linearization). BspHI는 E1A/E1B/ 발현 카세트에 속하지 않는 플라스미드 백본(backbone)에서 절단함(cleave).
-선형 폴리에틸렌이민(PEI) 용액, 7.5 mM(0.32 ㎍/㎕; PEI 질소 몰농도: 43 g/mol), pH 7.0, 멸균 여과 (0.2 ㎛).
-염화나트륨(NaCl) 용액, 150 mM, 멸균 여과 (0.2 ㎛).
형질주입된 각 배양 접시를 위해서, 2 ㎍의 선형화된 플라스미드 DNA 및 36 ㎕의 PEI 용액을 각각 250 ㎕ NaCl 용액으로 희석하였다. 각 PEI 희석물을 DNA 희석물에 첨가하고, 45의 N/P(질소/인) 비율을 얻었다. 조제물(Preparation)을 혼합하고 PEI-DNA 컴플렉스가 형성되도록 15 내지 20 분 동안 실온에서 배양하였다. 시각적으로 50-70%의 밀도에서 전 날 6 cm 배양 접시에 접종된 일차 양수세포를 PBS로 세척하고 신선한 배양 배지를 공급하였다. 각 형질주입 컴플렉스를 준비된 접시에 가하였다.
형질주입 후의 배양
형질주입 24 시간 후에, 세포를 TrypLE Select(Gibco)로 배양 접시로부터 떼어내고 14 cm 접시로 이동시켰다. 3 내지 6 주의 기간 동안 배지를 매 3 내지 4일 마다 교환하거나, 또는 세포의 시각적 컨플루언시(confluency)가 90%에 도달하면, 하나의 배양 접시를 두 개의 배양 접시로 계대접종(passage) 하였다. 이 기간 동안, 접시를 형질전환된 세포의 새로 나타난 초점(emerging foci)을 스크리닝하기 위하여 2.5-배 배율로 매일 관찰하였다.
형질전환된 세포 클론의 회수 및 확장
형질주입 3 내지 6 주 후에, 형질전환된 세포의 초점(foci)이 일차 양수세포 사이에서 보였다. 형질전환된 세포(transformant)는 그것들의 상이한 형태, 작은 세포 크기 및 비-분화 노화 일차 세포에 의해 인식되었다. 둥근 초첨(foci)을 멸균 피펫 팁으로 스크랩핑(scraping) 및 흡입(aspiration)에 의해 배양물 표면으로부터 제거하고 배양 웰(well)에 접종하였다. 회수된 각 클론(clone)을 첫 번째 세포 스톡을 냉동시키기 전에 3 계대(three passages)를 위해 더 큰 배양 용기(vessels)로 확장했다.
명확하게 하기 위해, 용어 "클론(clone)" 또는 "세포 클론(cell clone)" 및 그것의 복수형은 E1 발현하는 플라스미드로 형질주입 이후에 발생하는 분리된 단일 세포 초점(foci)으로부터 유도된 증식(proliferating) 세포를 기술하기 위해 바람직하게 본 명세서에서 사용된다. 상기에 설명된 것과 같이, 이러한 단일 초점(foci)을 흡입(aspiration)에 의해 세포 배양 접시로부터 제거하고 개별 세포 배양 접시에 접종하였다. 이 단계에서, 다중 클론(clone)이 동일한 세포 배양물로부터 유도되고, 이것은 하나 이상의 통합(integration) 및 영구화(immortalization) 이벤트로부터 유도된 세포로 구성된 클론이라는 것을 배제할 수 없으므로, 그것들은 다클론(polyclonal)인 것으로 가정된다. 용어 "세포주(cell line)" 및 그것의 복수형은 단일 세포 클로닝을 따라 얻어져 단일클론(monoclonal)으로서 간주될 수 있는, 영구화되고 영구 증식하는 세포를 기술하기 위해, 바람직하게 본 명세서에서 사용된다.
영구화 세포주의 형질주입 및 생성을 위한 플라스미드 pSTK146 및 pSTK146UBE2I을 발현하는 상이한 Ad5 E1의 용도
기술된 형질주입 절차를 두 개의 상이한 E1-발현 구조인 pSTK146 및 pSTK146 UBE2I를 사용하여 수행하였다. 두 형질주입은 작고 신속하게 증식하는 세포로 구성된 초점(foci)을 성공적으로 생성했다. 그러나, 상당한 차이가 배양물의 클론의 장기간 안정성에서 관찰되었다.
분리(isolation) 이후 계대(passages) 동안, 클론의 일부(portion of clones)는 크기 및 평편화(flattening)의 급격한 증가를 포함하는 형태학적인 변화, 느린 세포 분열 및 최종적인 성장의 중지, 및 일부 세포 사멸의 표시로 특징지워지는 위기를 겪었다. pSTK146으로 형질전환된 클론은 이러한 변화에 훨씬 더 취약했다: 각 클론 배치(batch)의 적어도 60%(모든 실험에 대해 78%)는 배양의 초기 단계 동안 성장이 중지되었다(다클론성 계대(polyclonal passage) 1 내지 4, PD <55). 그 뒤에, 양호한 성장 및 아데노 바이러스 벡터 생산성을 위해 선택된 14 개의 클론 중 7개만이 다클론성 계대(polyclonal passage) 10을 넘어서 계속 증식했고(일차 세포의 접종 이후에 총 약 65 PD에 해당하는), 어떤 것도 다클론성 계대(polyclonal passage) 13을 넘어서 생존하지 못했다(75 PD).
그러나, pSTK146 UBE2I 구조로 형질전환된 클론은 훨씬 더 높은 비율로 초기 계대에서 생존했고(계대 4까지 평균 29%의 손실), 극소수의 클론들만이 후기 지점(later point)에서 위기에 들어갔다. 높은 생산성을 위해 선택된 8개의 클론은 다클론성 계대(polyclonal passage) 23 또는 그 이상(100 PD)까지 배양에서 유지되었고 단일클론성(monoclonal) 세포주의 생성을 위해 고려되었다.
형질전환 실험의 추가의 세부 사항을 다음의 표 1 및 2에 요약하였다.
[표 1] 다클론성 계대(polyclonal passage) 4 까지의 pSTK146의 일차 양수세포로의 형질주입에 따른 결과
Figure 112014118489459-pct00001

[표 2] 다클론성 계대(polyclonal passage) 4 까지의 pSTK146 UBE2I의 일차 양수세포로의 형질주입에 따른 결과
Figure 112014118489459-pct00002

비교가능한 결과가 두 상이한 양수천자(amniocenteses)로부터 유래한 양수세포에서 얻어졌다.
실시예 5: pSTK146 UBE2I로 형질전환 이후 양수세포 세포주의 단일 세포 클로닝
상기에 기술된 기계적인 분리 방법 및 복수개의 다중 클론(multiple clones)이 각 형질주입된 세포 배양 접시로부터 분리되는 사실 때문에, 분리된 세포 클론을 단일클론성(monoclonal), 즉 단일 세포로부터 유도된 것으로 간주할 수 없다. 그것들은 오히려 이 단계에서 다클론성(polyclonal)인 것으로 간주된다. 다음의 절차를 잘 자란 형질전환물(well-growing transformants)로부터 단일클론성(monoclonal) 세포주를 얻기 위해 수행하였다.
안정적으로 성장하는 배양물에서 형질전환된 세포(다클론성 계대(polyclonal passage) P 20, 약 90 PDs)를 떼어내고, 배양 배지에서 재현탁한 후, 혈구계( haemocytometer)에서 수를 세었다. 10, 20 또는 50 생존세포(viable cells)/ml를 포함하는 각 세포 현탁액의 세 가지 희석물을 준비하였다. 이러한 희석물의 각각을 웰 당 이 세포 현탁액의 100 ㎕로 하나의 96웰 플랫 버텀 접시(flat-bottom 96-well dish)에 접종하는데 사용하였고, 접종 밀도가 웰당 1, 2 또는 5 생존 세포(viable cells)가 되도록하였다.
접종 일주일 후, 부착 세포를 스크리닝하기 위해 10-배율로 각 웰을 엄밀하게 관찰하였다. 단일 부착 세포로부터 성장하는 세포의 단일 콜로니를 가진 웰만을 추가의 배양을 위해 선택하였다. 접종 시점으로부터, 각 웰을 분리된 세포주로서 처리하였고, 교차-오염에 대비하여 주의를 기울였다. 세포주를 상기에 기술된 바와 같이 첫 번째 세포 스톡(stock)이 냉동되는 시점에, 9.2 cm 접시까지의 더 큰 배양 용기(vessels)로 확장하였다. 이 스톡(stock)에 기반한 배양물을 ΔE1 Ad 벡터 생산 능력에 대해 테스트하였고, 생산성이 높은 세포주를 추가의 세포 뱅킹(banking)을 위해 확장하였다. 우수한 성장 특성 및 우수한 Ad 벡터 생산 능력을 모두 가진 두 개의 단일클론성(monoclonal) 세포주를 SGT11 1T3.1D9 및 SGT11 1T3.1G3으로 명명하였다. 이러한 세포주를 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁하고 기탁번호 DSMZ ACC3134(세포주 SGT11 1T3.1D9) 및 DSM ACC3135(세포주 SGT11 1T3.1G3)를 받았다.
실시예 6. 노화-관련 베타-갈락토시다제 발현의 조사
세포 형태의 변화 및 계대 10에 접근하는 일차 인간 양수세포의 증식 중단이 세포가 노화로 들어가는 시점임을 의미했다. 노화 세포는 활발하게 분열하는 영구(immortal) 또는 암세포보다 훨씬 더 높은 수준으로 노화-관련(SA, senescence-associated) 베타-갈락토스다제(β-galactosidase)를 발현한다.
SA 베타-갈락토시다제 발현을 일차 양수세포, 플라스미드 pSTK146 UBE2I 형질주입을 따르는 다클론성 단계(polyclonal stage)(클론)에서의 양수세포, 및 영구화된 단일클론성(monoclonal) 양수세포 세포주 및 293 개 세포에서 평가하였다. 다음의 샘플들이 조사되었다:
a) 계대 9(SGT11 P9)에서 도너 번호(donor number) 11의 일차 인간 양수세포; 이 단계에서 세포의 크기는 이미 증가했고 성장률은 감소했다, 즉 세포가 노화 표현형(senescent phenotype)을 보이기 시작했다;
b) 계대 8 및 24(SGT11 1T3 P8 및 SGT11 1T3 P24)에서 pSTK146 UBE2I 형질주입 후 하나의 초점(focus)으로부터 얻은 동일한 도너(donor)의 다클론성(polyclonal) 양수세포 클론; 및
c) 계대 12(1T3.1D9 P12)에서 단일 세포 클로닝 후 상기 다클론성(polyclonal) 세포 클론으로부터 확립된 영구화 양수세포 세포주.
염색 절차를 표준 절차 및 제조사의 권고에 따라 Senescence Cells Histochemical Staining Kit(Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA)를 사용하여 수행하였다. 염색 이후에, 도립 현미경(inverted microscope)으로 위상차(phase contrast)를 이용하여 평가를 수행하였다. 각 샘플로부터 10 개의 영상을 무작위로 취하고, SA 베타-갈락토시다제-양성(SA β-galactosidase-positive) 세포의 수를 세었다.
결과로서 SGT11 P9의 98.5%가 SA 베타-갈락토시다제(SA β-galactosidase) 발현에 대해 양성이었고, SGT11 1T3 P8의 40.41%, SGT11 1T3 P24의 18.73% 및 1T3.1D9 P12의 13.29%가 양성이었다. 이러한 실험의 결과를 도 4에 나타내었다.
이 데이터는 계대 10 부근에서 형태 변화 및 일차 양수세포의 성장 억제가 노화-관련된 것이었고 이 상태는 일차 세포에 플라스미드 pSTK146 UBE2I를 형질주입함으로써 극복되었다는 것을 나타냈다.
실시예 7: 일차 양수세포 및 세포주의 텔로미어 길이 측정
인간 텔로미어 DNA(telomeric DNA)는 일반적으로 일차 세포에서 평균 10 kb의 길이이다. 인간 일차 양수세포가 텔로미어 침식-매개 DNA 손상 반응(telomere erosion-mediated DNA damage response)으로 인해 복제 노화(replicative senescence)에 들어가는지를 조사하기 위해, 일차 양수세포 및 pSTK146 UBE2I 형질주입 이후 확립된 세포주의 텔로미어 DNA(telomeric DNA)의 길이를 측정했다. 플라스미드 pST146(Schiedner et al., 2000)에 의해 확립되었던 N52.E6 세포주를 대조로서 사용하였다.
텔로미어의 길이는 텔로미어 제한분획(TRF, telomere restriction fraction)(Harley et al., 1990)을 측정하는 표준 방법에 의해 편리하게 측정된다. 게놈 DNA는 텔로미어 DNA를 구성하는 반복 헥사뉴클레오티드(repeating hexanucleotide) 5'-TTAGGG-3' 시퀀스 내에서 절단하지 않는 제한효소로 처리된다. 절단된 DNA는 젤 전기영동(gel electrophoresis)에 의해 분리되고 TRF의 길이는 이러한 헥사뉴클레오티드를 인식하는 프로브(probe)를 가지는 하이브리드 형성(hybridization)에 의해 측정된다. 하나의 세포 내에서 텔로미어가 염색체에 따라 상이하고, 쇼트닝(shortening)은 세포마다 다르기 때문에, 각 샘플에서 텔로미어 DNA의 분포는 매우 불균일하다. 상이한 계대의 다음의 일차 세포 및 세포주로부터 유래한 DNA 샘플의 TRF를 분석하였다:
a) 계대 6 및 9에서 도너(donor) SGT11의 일차 인간 양수세포: SGT11 P6 및 SGT11 P9;
b) 다클론성 계대(polyclonal passage) 5 및 21에서 플라스미드 pSTK146 UBE2I 형질 주입 후 동일한 도너(donor)의 다클론성(polyclonal) 세포: SGT11 1T3 P5 및 SGT11 1T3 P21;
c) 단일클론성 계대(monoclonal passages) 9 및 23에서 동일한 도너의 단일클론성(monoclonal) 세포주: 1T3.D9 P9 및 1T3.1D9P23; 및
d) 대조로서, N52.E6 세포(pSKT146으로 형질주입된)가 사용되었다.
SGT11 P6 및 SGT11 P9의 TRF 평균이 각각 10.3 및 9.8로 측정되었다. SGT11 1T3 P5 및 SGT11 1T3 P21의 TRF 평균이 각각 7.8 및 8.4 kb로 측정되었다. 1T3.D9 P9 및 1T3.1D9P23의 TRF 평균이 각각 7.9 및 7.9 kb로 측정되었다. N52.E6 세포의 TRF 평균이 4.6 kb로 측정되었다. N52.E6 세포의 TRF는 SGT11 1T3.1D9P23 세포에 상응하는 세포 계대의 세포로부터 측정하였다. 이들 실험의 결과를 도 5에 나타내었다.
이 실험으로부터, 두 가지 결론이 도출될 수 있다: 첫째, 후기 계대(P11)에서 일차 인간 양수세포의 노화 표현형은 명백한 텔로미어 침식(erosion)에 의해 발생하지 않는다. 오히려, 그것은 배양 세포에서 스트레스의 축적이 원인이 되는 것으로 여겨지는, 소위 스트레스 유도 조기 노화(stress-induced premature senescence, SIPS)에 기인한다(Toussaint et al., 2000; 상기 Weinberg, R.A., 2007). 둘째, pSTK146으로 형질전환되어 생성된 N52.E6세포의 평균 TRF는 pSTK146 UBE2I으로 영구화된 세포에 비해 매우 짧다. 이 데이터는, 일차 양수세포가 pSTK 146 UBE2I로 영구화 되었을 때 위기에 들어가는 것이 아니라 pSTK146으로 형질주입되었을 때 위기에 들어간다는 관찰(observation)과 함께, 복제 노화(replicative senescence)는 플라스미드 pSTK146 UBE2I로 일차 양수세포를 형질전환함으로써 예방된다는 것을 시사한다.
실시예 8: 양수세포-유도 클론 및 세포주에서 ΔE1 아데노 바이러스 벡터의 생산
다음의 스크리닝 프로토콜을 분리되고 확장된 클론의 벡터 생산 능력을 비교하고 정량화하기 위해 사용하였다. 세포 성장의 안정성에 부가하여, 이러한 스크리닝의 결과는 추가의 배양 및 단일-세포 클로닝을 위한 클론의 선택을 위한 기초였다.
표준 절차를 따라, 정의된 밀도에서 접종된 하루 후, 세포를 5 내지 20의 전염성 감염다중도(MOI, multiplicity of infection)에서 GFP 발현 카세트를 운반하는 ΔE1 Ad 벡터(Ad1stGFP)으로 세포를 감염시켰다. 감염 48 시간 후, 세포를 세포 스크레이퍼(scraper)를 사용하여 기계적으로 회수하고, 원심분리에 의해 배양 배지로부터 분리한 후, 버퍼에 재현탁하고, 액체 질소에서의 냉동 및 37 ℃의 워터 배스(water bath)에서의 해동을 3회 반복하여 용해시켰다. 생산된 벡터 입자를 포함하는, 얻은 용해물을 원심분리하여 세포 파편(cell debris)을 제거하였다.
정화된 용해물의 희석물을 A549 세포(ΔE1 Ad 벡터가 복제할 수 없는)를 감염시키는데 사용하였고, 또한 정의된 밀도로 접종하였다. 감염후 추가 48 시간 이후, A549를 회수하고 A549 세포 당 수신된(received) 감염성 벡터 입자의 수에 대한 양으로서 평균 형광 강도(세포내 GFP 발현의 수준에 상응하는)를 이용하여, 유동세포계수법(flow cytometry)에 의해 분석하였다. 감염성 MOI의 어떤 범위에 대해, A549에서 감염에 필요한 용량과 평균 발광 강도 사이의 상관관계는 선형적이다. 그러므로, 표준 커브를 확립하기 위해 정의된 감염성 MOI를 가진 A549의 감염에 의해, 세포 당 생산된 감염된 입자의 평균 수를 계산할 수 있다.
단일클론성(monoclonal) 세포주 SGT11 1T3.1D9 및 SGT11 1T3.1G3는, 도 6으로부터 알 수 있는 것과 같이, SGT11 1T3.1D9 세포에서 세포 당 2,500 개 이상의 감염성 Ad1stGFP 입자 및 SGT11 1T3.1G3 세포에서 세포 당 1,000 개 이상의 감염성 Ad1stGFP 입자의 높은 생산 수준에서 Ad1stGFP의 생산을 허용했다.
실시예 9: 벡터 생산 동안 RCA의 생성
새로운 세포주에서 벡터 생산 동안 RCA 생성의 가능한 위기를 두 개의 상이한 영구적인 양수세포 세포주 SGT11 1T3.1D9 및 SGT11 1T3.1G3에서 ΔE1 Ad 벡터의 계대 배양(serial passage)에 의해 평가하였다. ΔE1Ad 벡터는, HEK293 세포에서 생산되는 경우, 자주 RCA의 생성을 야기하는 것으로 알려져 있으므로, HEK 293 세포fmf 대조로서 사용하였다. RCA는 ΔE1Ad 벡터의 DNA 및 염색체가 통합된 아데노 바이러스 DNA 사이의 시퀀스 중복으로 인한 DNA 재조합에 의해 발생된다. 분석(assays)을 두 가지 상이한 포맷(format)에서 수행하였다.
제1 포맷에서, 각 세포주의 10개의 웰(6-웰 세포 배양 접시에서 1.5 x 106 세포/웰)을 ΔE1Ad 벡터 Ad1stGFP의 세포 당 10 개의 감염성 입자의 MOI로 감염시키고, 48 시간 후에 회수하였다. 세포를 3 회의 냉동 및 해동에 의해 용해하였다. 각 세포 용해물의 10%(높은 감염 포맷)를 48 시간의 다른 사이클을 위한 동일한 세포주의 세포를 감염시키는데 사용하였다. 이 절차를 총 15 계대 동안 반복하였다.
이 분석의 제2 포맷에서, 세포를 이전 계대(낮은 감염 포맷)로부터 0.1% 의 세포 용해물로 감염시키고, 5 내지 8 일 이후에 세포병변효과(CPE, cytopathic effect)가 나타났을 때 회수하였다. 이 절차를 총 15 계대 동안 반복하였다.
RCA 검출을 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Fallaux et al. Hum Gene Ther 1998, 9, 1909-17). 이 분석은 ΔE1 Ad 벡터의 복제를 허용하지 않는 인간 세포주(A549 세포 및 HeLa 세포)에서 수행된다. RCA 생성 및 RCA의 존재시에만, 완전한 감염 주기가 고전적인(classical) CPE의 결과로 발생할 수 있다. 따라서, 최종 용해물을 4 일 동안 HeLa 세포에서 배양하였다. 그 다음, HeLa 세포는 냉동 및 해동에 의해 용해하였고, 용해물을 10일 동안 A549 세포에 첨가하였다. A549에 대한 가시적인 CPE는 제1-세대 벡터가 HeLa 또는 A549에서 복제할 수 없기 때문에, RCA의 존재를 의미했다. 이 분석의 검출 한계를 테스트하기 위해, 대조 HeLa 접시를 매우 낮은 감염다중도(multiplicity of infection)에서 Ad5 야생-타입의 입자로 스파이크된(spiked) 용해물로 감염시켰다. 분석은 감염된 HeLa 접시 당 6개의 RCA 입자를 검출하기에 충분하게 민감한 것으로 발견되었다.
15 바이러스 계대 이후에, 어떤 RCA도 양수세포-기반 세포주의 임의의 용해물(테스트된 40개의 용해물)에서 검출되지 않은 반면, HEK293 세포의 20 개의 최종 용해물에서 세 개는 RCA를 포함하는 것이 발견되었다. 또한, SGT11 1T3.1D9 및 SGT11 1T3.1G3 세포에서 HDEP을 생성을 위한 어떤 증거도 없었다. HDEP는, A549 또는 HeLa 세포가 계대 배양(serial passages)으로부터 얻어진 세포 용해물에 노출되었을 때, CPE로서 명백해졌다.
실시예 10: 핵형 분석
핵형 분석(kryotype analyses)을 세포유전학 실험실에서 일상적으로 사용하는 것과 같은 표준 절차에 따라 중기(metaphases)부터 수행하였다. 중기(metaphases)를 MetaSystems GmbH, Altlussheim, Germany의 METAFER 4 장비(equipment)를 사용하여 수행하였다. 영상을 다음의 카리오그램(karyogramms)을 얻기 위해 IKAROS 소프트웨어로 편집하였다. 일차 양수세포, 2개의 상이한 계대에서 다클론성(polyclonal) 세포 클론(계대 10 및 20) 및 단일클론성(monoclonal) 세포주(계대 14 및 23)을 분석하였다.
다음의 결과를 얻었다:
a) 예측된(estimated) 총 30의 PD에 상응하는, 계대 8의 개별 SGT11(SGT11 P8)로부터 일차 양수세포.
핵형(kryotype): 46, XX (정상적인 여성 핵형)
b) 예측된(estimated) 총 68 내지 70의 PD에 상응하는, 다클론성(polyclonal) 계대 10의 동일한 개별(SGT11 1T3 P10)로부터 확립된 다클론성(polyclonal) 클론.
핵형(kryotype): 71, XXX, +mar(del(8)t(X,8)(q;p)
c) 예측된(estimated) 총 90의 PD에 상응하는, 다클론성(polyclonal) 계대 20의 동일한 개별(SGT11 1T3 P20)로부터 확립된 다클론성(polyclonal) 클론.
핵형(kryotype): 75, +mar(del(8)t(X,8)(q;p) + 1q의 신장(elongation)
d) 예측된(estimated) 총 140의 PD에 상응하는, 단일클론성(monoclonal) 계대 14의 동일한 개별(SGT11 1T3.1D9 P14)로부터 확립된 단일클론성(monoclonal) 세포주.
핵형(kryotype): 55, XX, +mar(del(8)t(X,8)(q;p)
e) 예측된(estimated) 총 160의 PD에 상응하는, 단일클론성(monoclonal) 계대 23의 동일한 개별(SGT11 1T3.1D9 P23)로부터 확립된 단일클론성(monoclonal) 세포주.
핵형(kryotype): 61, XX, +mar(del(8)t(X,8)(q;p) + 1p에 대한 상동 염색 부위(HSR, homologous stained region)
일차 양수세포에서 정상 여성 핵형(46,XX)로부터 시작하여, 배수체 핵형(polyploid karyotype)은 75 및 55 사이의 염색체 수로 관찰되었고, 하나의 일관된 전좌(translocation)(t(X;8(q;p))가 계대 10(총 68 내지 70의 PD)와 계대 20 (총 90의 PD)에서 다클론성(polyclonal) 세포 클론 및 계대 14(총 140의 PD)와 계대 23(총 160의 PD)에서 단일클론성(monoclonal) 세포주에서 관찰되었다. 단지 다클론성(polyclonal) 상태의 계대 20에서 1q의 신장, 및 단일 세포의 계대 23에서 가시적인 1p에 대한 하나의 HSR을 세포주의 상태로 클로닝했다. 장기간 배양에도 불구하고, 어떤 부가적인 구조적 이상(abnormalities)도 검출되지 않았고, 이는 핵형의 주목할만한 안정성을 나타낸다.
실시예 11: Ad5의 E1 부위의 구조적 특성
Ad5와 같은 E1 영역은 여러 개의 E1A 및 E1B 단백질을 코딩하는 중복 해독틀(overlapping reading frames)을 가지는 컴플렉스 구조에 의해 특징지워진다. E1B 시퀀스 안에서 두 개의 SD 및 세 개의 SA 부위가 존재하여 E1B mRNA 전사의 대안적 스플라이싱(alternative splicing)을 가능하게 한다. 컨센서스 스플라이스 부위(consensus splice sites)에 부가하여, 이 영역에서 크립틱 스플라이스(cryptic splice) 부위의 용도는 원하지 않는 E1B 단백질 산물을 야기할 수 있고/있거나 주요한 E1B 단백질 E1B 55K의 더 낮은 발현을 발생시킬 수 있다. 표 3에 나타낸 238 EEE를 사용하여 EEE의 존재를 위한 상이한 게놈의 3'UTR 시퀀스를 분석할 때, 이러한 시퀀스는 pSTK146에 존재하는 SV40 시퀀스와 비교하여 감소된 수의 EEE를 나타낸 것으로 발견되었다.
[표 3] Fairbrother et al., 2002에 의한 예측된 238 후보 EEE의 리스트
Figure 112014118489459-pct00003

pSTK146 및 pSTK146 UBE2I를 위한 이 분석의 비교를 표 4에 나타내었다. 또한 이 표는 ARF5, DAXX, HPRT 및 RING1 위치(locus)로부터 유도된 다른 적절한 3'UTR을 위한 EEE 분석의 결과를 나타내었다.
[표 4] pSTK146, pSTK146BE2I 및 추가 시퀀스에서의 EEE 존재
Figure 112014118489459-pct00004

실시예 12: E1A 유전자가 조절가능한 프로모터의 제어 하에 있는 핵산 구조를 가진 영구화 양수 세포주의 생성
이 실시예에서 사용된 본 발명의 핵산 구조에서, hAd5의 E1A cDNA가 테트라사이클린(Tet)-유도성 프로모터의 제어 하에 놓여졌다.
Tet-On Advanced System(Clontech)을 E1A가 테트라사이클린-유도성인 핵산 구조의 생성을 위해 사용하였다. 이 시스템은 HSV VP 16 단백질로부터 세 개의 최소의 전사 활성 도메인(transcription activation domain)에 결합된 E. coli Tet 리프레서(repressor) 단백질, rTetR의 돌연변이 버전으로부터 유도된 융합 단백질인 Tet-On Advanced transactivator(Tet-On 고급 전사촉진자)의 발현에 기반한다.
독시사이클린(Dox)의 존재 시, Tet-On Advanced는 선택된 코딩 시퀀스의 앞에 위치하여 PTight에서 테트라사이클린 반응 요소(TREMod, tetracycline response element)에 결합하고, 이는 유전자 발현의 활성을 야기한다. 핵산 구조를 전사촉진자(transactivator) 및 플라스미드 pTL13으로 명명된 하나의 핵산 분자에 대한 전이유전자(transgene) 시퀀스(도 2 및 SEQ ID NO:23) 모두를 포함하도록 생성하였다. 이 DNA 구조는 다음의 요소를 포함했다:
a) Tet-On Advanced transactivator(rTET M2-VP16)를 코딩하는 발현 카세트,
b) Tet-유도성 프로모터(PTight)의 제어 하에 있는 E1A cDNA, 및
c) 천연 E1B 프로모터에 작동가능하도록 연결되고 pIX5'UTR의 일부인 UBE2I 인트론(E1B84R 단백질의 발현을 허용하기 위한) 및 UBE2I 3'UTR를 뒤따르는 E1B cDNA.
pTL13의 구조를 위해, 플라스미드 pSTK146 UBE2I은 천연 E1B 프로모터에 작동가능하도록 연결되고 UB2I 인트론, E1B 84R의 C-말단 및 UBE2I 3'UTR을 뒤따르는 Ad5 E1A cDNA인, Ad5 E1A 코딩 시퀀스를 포함는 3.7 kb 단편을 방출하기 위해 EcoRV 및 NotI로 소화되었다. 그 다음 이 단편을 pTL12이라 명명된 구조를 얻기 위해 Tet-유도상 프로모터 Ptight의 다운스트림(downstream)에 위치한 pTRE-Tight(Clontech) 벡터의 다중 클로닝 부위(SmaI, NotI)로 클로닝하였다. pTL13을 생성하기 위해, 그 다음 플라스미드 pTet-On- Advanced (Clontech)로부터 얻은 4.4. kb BamHI 단편-전사촉진자(transactivator) 시퀀스를 포함하는-을 pTL12의 BamHI 부위로 서브클로닝 하였다.
영구화된 양수세포 세포주의 생성을 위해, 제조사의 권고를 따르고 일반적으로 0.01 내지 2 ㎕/ml 사이의 영역에서 존재하는 농도로 세포 배양 배지에 추가된 독시사이클린(doxycycline)을 가지는 pSTK146 UBE2I 플라스미드를 위해, 상기에서 기술된 바와 같이, 플라스미드 pTL13을 일차 양수세포로 형질주입 하였다.
실시예 13: E1A 및 E1B를 독립적으로 발현하는 두 개의 플라스미드에 의해 형질주입된 일차 인간 양수세포의 영구화(Immortalization of primary human amniocytes by transfection with two plasmids expressing E1A and EIB independently)
이 실시예는 본 발명의 핵산 구조를 설명하고, 이 핵산 구조는 두-조각(two-piece) 핵산 구조이다. 이 두-단계 형질주입 절차는 약간의 변형이 가해진 상기에 기술된 실시예 4의 1-단계 형질주입을 필수적으로 따른다. E1A 및 E1B를 발현하는 두 핵산 구조를 동시에(예를 들어, 두 플라스미드 DNA의 혼합에 의해) 또는 연속적인 두 형질주입으로 일차 인간 양수 세포로 형질주입 하였다. 뒤의 절차(두 번의 형질주입)는 상이한 염색체 부위에서 두 핵산 구조의 통합의 기회를 증가시키고, 얻은 세포주를 ΔE1 Ad 벡터의 생산을 위해 사용하는 경우 RCA 발생의 위험을 더욱 감소시킬 수 있다. 형질주입 시약으로서 PEI의 양은 세포 독성(cytotoxic) 효과를 최소화하기 위해 분리된 형질주입의 단계에서 감소된다.
사용된 재료:
-제한 효소 BspHI로 선형화된 Tris-EDTA 버퍼 내의 플라스미드 DNA, pH 7.5.
-pBSK E1B UBE2I
-생쥐 PGK 프로모터로부터 E1A를 발현하는 pmPGK E1A
-7.5mM, pH 7.0, 멸균 여과된 선형 PEI의 용액
-150mM, 멸균 여과된 NaCl 용액
플라스미드 pBSK E1B UBE2I에 포함된 기능적 시퀀스 요소의 시퀀스는 SEQ ID NO 7로서 제공된다: 그것은 E1B 프로모터, E1B 19K 및 55K 코딩 영역, UBE21 인트론 및 pIX 유전자의 5'-UTR의 구성 부분(comprising part), 및 UBE2I 3'UTR을 포함한다. 따라서, 이 실시예에서 플라스미드 pBSK E1B UBE2I는 그것의 천연 프로모터의 제어하에 E1B를 발현한다. 3' UTR 영역은 상기에 설명된 pSTK146 UBE2I 플라스미드의 영역과 동일하다. 일차 양수세포의 영구화를 위해 필요한 제2 핵산 구조는 E1A 기능을 코딩하는 발현 유닛을 포함한다. E1A를 코딩하는 발현 유닛의 시퀀스는 SEQ ID NO 8에서 제공된다. 그것은 필수 구성요소적인(constitutive) UBE2I 유전자로부터 유래한 프로모터로서 생쥐 pgk 프로모터, E1A 코딩 영역 및 3'UTR을 포함한다.
두 플라스미드의 형질주입이 동시에 수행되는 경우에, 두 플라스미드 DNA를 혼합할 수 있고, 형질주입은 E1A 및 E1B 기능을 모두 발현하는 플라스미드를 위해 상기에서 기술된 바와 같이 수행한다.
두 플라스미드의 형질주입이 연속적으로 수행되는 경우, 그 절차는 다음과 같이 수행된다:
형질주입되어야 하는 각 배양 접시에, E1A를 발현하는 2 ㎍의 선형화된 pmPGK E1A 및 18 ㎕의 PEI 용액을 250 ㎕의 NaCl 용액을 가하여 각각 희석한다. 각 PEI 희석물을 하나의 DNA 희석물에 추가한다. 조제물(preparations)을 혼합하고 15 내지 20 분 동안 실온에서 배양한다. 전날 6 cm 배양 배지에서 접종된 일차 인간 양수세포를 PBS로 세척하고, 신선한 배양 배지를 공급한다. 각 형질주입 컴플렉스를 하나의 준비되어진 접시에 가한다. 2 일 후에, 동일 절차를 플라스미드 pBSK E1B UBE2I를 발현하는 E1B에 대해 수행한다. 두 번째 형질주입 이후의 날에, 세포를 14cm 배양 접시로 계대하고(passaged), 계속해서 단일-플라스미드 형질주입된 배양물로서 동일한 프로토콜에 따라 처리한다.
절차는 반대로 수행될 수도 있다. 즉, E1B를 발현하는 플라스미드를 먼저 형질주입하고, 이어서 E1A를 발현하는 플라스미드를 형질주입할 수 있다. 절차는 또한 PEI 이외의 다른 형질주입 시약을 사용하여 수행하거나 각각 E1A 및 E1B를 코딩하는 두 핵산 구조를 일차 인간 양수세포로 전달하기 위한 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스 벡터를 사용함으로써 수행할 수 있다.
참고 문헌
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명세서에 개시된 본 발명의 특징, 청구항 및/또는 도면은 개별적으로 그리고 그것들의 임의의 조합으로 본 발명을 그것들의 다양한 형태로 실현하기 위한 재료일 수 있다.
독일미생물자원센터(DSMZ) DSMACC3134 20110830 독일미생물자원센터(DSMZ) DSMACC3135 20110830
SEQUENCE LISTING <110> KOCHANEK, Stefan <120> Nucleic acid construct and use of the same <130> K 10010 PCT <150> EP 12 003 564.7 <151> 2012-05-07 <150> US 61/645,154 <151> 2012-05-10 <160> 31 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1899 <212> DNA <213> Adenovirus serotype 5 <400> 1 atggaggctt gggagtgttt ggaagatttt tctgctgtgc gtaacttgct ggaacagagc 60 tctaacagta cctcttggtt ttggaggttt ctgtggggct catcccaggc aaagttagtc 120 tgcagaatta aggaggatta caagtgggaa tttgaagagc ttttgaaatc ctgtggtgag 180 ctgtttgatt ctttgaatct gggtcaccag gcgcttttcc aagagaaggt catcaagact 240 ttggattttt ccacaccggg gcgcgctgcg gctgctgttg cttttttgag ttttataaag 300 gataaatgga gcgaagaaac ccatctgagc ggggggtacc tgctggattt tctggccatg 360 catctgtgga gagcggttgt gagacacaag aatcgcctgc tactgttgtc ttccgtccgc 420 ccggcgataa taccgacgga ggagcagcag cagcagcagg aggaagccag gcggcggcgg 480 caggagcaga gcccatggaa cccgagagcc ggcctggacc ctcgggaatg aatgttgtac 540 aggtggctga actgtatcca gaactgagac gcattttgac aattacagag gatgggcagg 600 ggctaaaggg 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agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 10680 cgtatcacga ggccctttcg tcttca 10706 <210> 24 <211> 7229 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 24 gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60 caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120 ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180 gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240 tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300 ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360 tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 420 atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480 gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 540 caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 600 ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 660 ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 720 ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 780 ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840 gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900 ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960 taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020 agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080 atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140 aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200 caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260 ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320 cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380 tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500 ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560 gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620 caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680 ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 1740 tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 1800 ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 1860 agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 1920 aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 1980 gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 2040 tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 2100 tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg 2160 ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct gggtaccggg ccccccctcg 2220 aggtcatcga attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct ggagcatgcg 2280 ctttagcagc cccgctggca cttggcgcta cacaagtggc ctctggcctc gcacacattc 2340 cacatccacc ggtaggcgcc aaccggctcc gttctttggt ggccccttcg cgccaccttc 2400 tactcctccc ctagtcagga agttcccccc cgccccgcag ctcgcgtcgt gcaggacgtg 2460 acaaatggaa gtagcacgtc tcactagtct cgtgcagatg gacagcaccg ctgagcaatg 2520 gaagcgggta ggcctttggg gcagcggcca atagcagctt tgctccttcg ctttctgggc 2580 tcagaggctg ggaaggggtg ggtccggggg cgggctcagg ggcgggctca ggggcggggc 2640 gggcgcccga aggtcctccg gaggcccggc attctcgcac gcttcaaaag cgcacgtctg 2700 ccgcgctgtt ctcctcttcc tcatctccgg gcctttcgac cagcttgata tcgagtgcca 2760 gcgagtagag ttttctcctc cgagccgctc cgacaccggg actgaaaatg agacatatta 2820 tctgccacgg aggtgttatt accgaagaaa tggccgccag tcttttggac cagctgatcg 2880 aagaggtact ggctgataat cttccacctc ctagccattt tgaaccacct acccttcacg 2940 aactgtatga tttagacgtg acggcccccg aagatcccaa cgaggaggcg gtttcgcaga 3000 tttttcccga ctctgtaatg ttggcggtgc aggaagggat tgacttactc acttttccgc 3060 cggcgcccgg ttctccggag ccgcctcacc tttcccggca gcccgagcag ccggagcaga 3120 gagccttggg tccggtttct atgccaaacc ttgtaccgga ggtgatcgat cttacctgcc 3180 acgaggctgg ctttccaccc agtgacgacg aggatgaaga gggtgaggag tttgtgttag 3240 attatgtgga gcaccccggg cacggttgca ggtcttgtca ttatcaccgg aggaatacgg 3300 gggacccaga tattatgtgt tcgctttgct atatgaggac ctgtggcatg tttgtctaca 3360 gtaagtgaaa attatgggca gtgggtgata gagtggtggg tttggtgtgg taattttttt 3420 tttaattttt acagttttgt ggtttaaaga attttgtatt gtgatttttt taaaaggtcc 3480 tgtgtctgaa cctgagcctg agcccgagcc agaaccggag cctgcaagac ctacccgccg 3540 tcctaaaatg gcgcctgcta tcctgagacg cccgacatca cctgtgtcta gagaatgcaa 3600 tagtagtacg gatagctgtg actccggtcc ttctaacaca cctcctgaga tacacccggt 3660 ggtcccgctg tgccccatta aaccagttgc cgtgagagtt ggtgggcgtc gccaggctgt 3720 ggaatgtatc gaggacttgc ttaacgagcc tgggcaacct ttggacttga gctgtaaacg 3780 ccccaggcca taaggtgtaa acctgtgatt gcgtgtgtgg ttaacgcctt tgtttgctga 3840 atgagttgat gtaagtttaa taaagggtga gataatgttt aacttgcatg gcgtgttaaa 3900 tggggcgggg cttaaagggt atataatgcg ccgtgggcta atcttggtta catctgacct 3960 catggaggct tgggagtgtt tggaagattt ttctgctgtg cgtaacttgc tggaacagag 4020 ctctaacagt acctcttggt tttggaggtt tctgtggggc tcatcccagg caaagttagt 4080 ctgcagaatt aaggaggatt acaagtggga atttgaagag cttttgaaat cctgtggtga 4140 gctgtttgat tctttgaatc tgggtcacca ggcgcttttc caagagaagg tcatcaagac 4200 tttggatttt tccacaccgg ggcgcgctgc ggctgctgtt gcttttttga gttttataaa 4260 ggataaatgg agcgaagaaa cccatctgag cggggggtac ctgctggatt ttctggccat 4320 gcatctgtgg agagcggttg tgagacacaa gaatcgcctg ctactgttgt cttccgtccg 4380 cccggcgata ataccgacgg aggagcagca gcagcagcag gaggaagcca ggcggcggcg 4440 gcaggagcag agcccatgga acccgagagc cggcctggac cctcgggaat gaatgttgta 4500 caggtggctg aactgtatcc agaactgaga cgcattttga caattacaga ggatgggcag 4560 gggctaaagg gggtaaagag ggagcggggg gcttgtgagg ctacagagga ggctaggaat 4620 ctagctttta gcttaatgac cagacaccgt cctgagtgta ttacttttca acagatcaag 4680 gataattgcg ctaatgagct tgatctgctg gcgcagaagt attccataga gcagctgacc 4740 acttactggc tgcagccagg ggatgatttt gaggaggcta ttagggtata tgcaaaggtg 4800 gcacttaggc cagattgcaa gtacaagatc agcaaacttg taaatatcag gaattgttgc 4860 tacatttctg ggaacggggc cgaggtggag atagatacgg aggatagggt ggcctttaga 4920 tgtagcatga taaatatgtg gccgggggtg cttggcatgg acggggtggt tattatgaat 4980 gtaaggttta ctggccccaa ttttagcggt acggttttcc tggccaatac caaccttatc 5040 ctacacggtg taagcttcta tgggtttaac aatacctgtg tggaagcctg gaccgatgta 5100 agggttcggg gctgtgcctt ttactgctgc tggaaggggg tggtgtgtcg ccccaaaagc 5160 agggcttcaa ttaagaaatg cctctttgaa aggtgtacct tgggtatcct gtctgagggt 5220 aactccaggg tgcgccacaa tgtggcctcc gactgtggtt gcttcatgct agtgaaaagc 5280 gtggctgtga ttaagcataa catggtatgt ggcaactgcg aggacagggc ctctcagatg 5340 ctgacctgct cggacggcaa ctgtcacctg ctgaagacca ttcacgtagc cagccactct 5400 cgcaaggcct ggccagtgtt tgagcataac atactgaccc gctgttcctt gcatttgggt 5460 aacaggaggg gggtgttcct accttaccaa tgcaatttga gtcacactaa gatattgctt 5520 gagcccgaga gcatgtccaa ggtgaacctg aacggggtgt ttgacatgac catgaagatc 5580 tggaaggtgc tgaggtacga tgagacccgc accaggtgca gaccctgcga gtgtggcggt 5640 aaacatatta ggaaccagcc tgtgatgctg gatgtgaccg aggagctgag gcccgatcac 5700 ttggtgctgg cctgcacccg cgctgagttt ggctctagcg atgaagatac agattgaggt 5760 actgaaatgg aattcaattt ttaagtgtat aatgtgttaa actactgatt ctaattgttt 5820 gtgtatttta gattccaacc tatggaactg atgaatggga gcagtggtgg aatgccttta 5880 atgaggaaaa cctgttttgc tcagaagaaa tgccatctag tgatgatgag gctactgctg 5940 actctcaaca ttctactcct ccaaaaaaga agagaaaggt agaagacccc aaggactttc 6000 cttcagaatt gctaagtttt ttgagtcatg ctgtgtttag taatagaact cttgcttgct 6060 ttgctattta caccacaaag gaaaaagctg cactgctata caagaaaatt atggaaaaat 6120 attctgtaac ctttataagt aggcataaca gttataatca taacatactg ttttttctta 6180 ctccacacag gcatagagtg tctgctatta ataactatgc tcaaaaattg tgtaccttta 6240 gctttttaat ttgtaaaggg gttaataagg aatatttgat gtatagtgcc ttgactagag 6300 atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac 6360 ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca 6420 gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 6480 tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc 6540 cactagttct agagcggccg ccaccgcggt ggagctccaa ttcgccctat agtgagtcgt 6600 attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 6660 cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 6720 cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct 6780 gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 6840 ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 6900 gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 6960 ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 7020 gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 7080 tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 7140 tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 7200 ttaacaaaat attaacgctt acaatttag 7229 <210> 25 <211> 481 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tgaattgccc gtttccatac agggtctctt ccttcggtct tttgtatttt tgattgttat 60 gtaaaactcg cttttatttt aatattgatg tcagtatttc aactgctgta aaattataaa 120 cttttatact tgggtaagtc ccccaggggc gagttcctcg ctctgggatg caggcatgct 180 tctcaccgtg cagagctgca cttggcctca gctggctgta tggaaatgca ccctccctcc 240 tgccgctcct ctctagaacc ttctagaacc tgggctgtgc tgcttttgag cctcagaccc 300 cagggcagca tctcggttct gcgccacttc ctttgtgttt atatggcgtt ttgtctgtgt 360 tgctgtttag agtaaataaa ctgtttatat aaaggttttg gttgcattat tatcattgaa 420 agtgagagga ggcggcctcc cagtgcccgg ccctccccac ccacctgcag ccccaccgcg 480 g 481 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 26 gttcagcata tgcaggtacg gggcctccgc ctccg 35 <210> 27 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 27 tcaaggtggg ggagggttct gtgccagaga caaaaacaca agac 44 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 28 gaaccctccc ccaccttgaa ttgcccgttt ccatacaggg tc 42 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 29 ctggatccgc ggtggggctg caggtg 26 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 30 ctgaactgta tccagaactg ag 22 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <400> 31 actgctccca ttcatcagtt c 21

Claims (27)

  1. E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하는 핵산 구조(nucleic acid construct)로서, 상기 발현 유닛은 프로모터, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 및 3'UTR을 포함하고, 여기서 상기 프로모터는 E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서 상기 3'UTR은 30 개 이하의 EEE(Exonic Enhancer Elements)를 포함하고, 여기서 상기 3'UTR은 비-바이러스(non-viral) 3' UTR이며, E1B의 발현을 위한 발현 유닛은 E1A의 발현을 위한 발현 유닛과 조합된 발현 유닛(combined expression unit)을 형성하고, 여기서 조합된 발현 유닛은 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 15에 따른 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 것인, 핵산 구조.
  2. 제1항에 있어서, 상기 3'UTR은 20개 이하의 EEE(Exonic Enhancer Elements)를 포함하는 것인, 핵산 구조.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산구조는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하고,
    상기 발현 유닛은 프로모터, E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 및 3'UTR을 포함하고, 여기서 상기 프로모터는 E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스에 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 핵산 구조.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 구조는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛 및 E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하는 한 조각의 핵산 분자(one-piece nucleic acid molecule) 또는 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자를 포함하는 두 조각의 핵산 분자(two-piece nucleic acid molecule)이며, 여기서 제1 핵산 분자는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하고, 제2 핵산 분자는 E1A의 발현을 위한 발현 유닛을 포함하는 것인, 핵산 구조.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 구조는 EEE(Exonic Enhancer Elements)가 E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3'UTR의 뉴클레오티드의 스트레치(stretch) 내에 포함되고, 뉴클레오티드의 이러한 스트레치는 E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3'UTR의 5' 말단의 200 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 핵산 구조.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 3' UTR은 포유류(mammalian)의 3' UTR인 것인, 핵산 구조.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, E1A의 발현을 위한 발현 유닛 및 E1B의 발현을 위한 발현 유닛이 5'->3' 방향으로 다음과 같이 핵산 구조 내에 배치되는 것인, 핵산 구조: E1A의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터, E1A를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스 및 3'UTR, E1B의 발현을 위한 발현 유닛의 프로모터, E1B를 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스, 스플라이스 도너 부위(splice donor site), 인트론, 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site) 및 3' UTR.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 구조는 E1A, E1B 55K, E1B 19K 또는 E1B84R를 코딩하고 발현할 수 있는 것인, 핵산 구조.
  9. 제8항에 있어서, 상기 핵산 구조는 E1A, E1B 55K 및 E1B 19K를 발현할 수 있는 것인, 핵산 구조.
  10. 제8항에 있어서, 상기 핵산 구조는 E1A, E1B 55K, E1B 19K 및 E1B84R을 발현할 수 있는 것인, 핵산 구조.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조를 포함하는 벡터.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조 또는 상기 핵산 구조를 포함하는 벡터를 포함하는 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포는 양수세포 세포주(amniocytic cell line)인 것인, 세포.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조 또는 상기 핵산 구조를 포함하는 벡터를 양수세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 영구 양수세포 세포주(permanent aminocytic cell line)의 생산 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 핵산 구조 또는 벡터를 양수세포 내로 도입하는 단계는 핵산 구조 또는 벡터가 양수세포의 염색체 내로 통합되도록 하는 것인, 영구 양수세포 세포주(permanent aminocytic cell line)의 생산 방법.
  16. 영구 양수세포 세포주는 SGT11 1T3.1D9 세포주(수탁번호 ACC3134로 DMS에 기탁된) 또는 SGT11 1T3.1G3 세포주(수탁번호 ACC3135로 DMS에 기탁된)인 것인, 영구 양수세포 세포주.
  17. 제12항에 있어서, 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이(adenovirus mutant)를 생산하거나 단백질을 생산하기 위한, 세포.
  18. 제13항에 있어서, 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이(adenovirus mutant)를 생산하거나 단백질을 생산하기 위한, 세포.
  19. 제16항에 있어서, 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이(adenovirus mutant) 또는 단백질을 생산하기 위한, 세포주.
  20. 제17항에 있어서, 상기 벡터는 유전자 전달 벡터인, 세포.
  21. 제17항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 유전자 전달 벡터인, 세포.
  22. 제18항에 있어서, 상기 벡터는 유전자 전달 벡터인, 세포.
  23. 제18항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 유전자 전달 벡터인, 세포.
  24. 제19항에 있어서, 상기 벡터는 유전자 전달 벡터인, 세포주.
  25. 제19항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 유전자 전달 벡터인, 세포주.
  26. 상층액(supernatant)을 제공하는 세포 배양 배지에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 구조 또는 상기 핵산 구조를 포함하는 벡터를 포함하는 세포 또는 양수 세포주; 또는 제16항의 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 유전자 전달 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이의 생산 방법으로서,
    여기서 상기 세포 또는 세포주는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조, 및 유전자 전달 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이인 추가의 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고, 여기서 방법은 세포 또는 상층액(supernatant)으로부터 유전자 전달 벡터 또는 아데노 바이러스 돌연변이를 회수(harvesting)하는 단계를 포함하는 것인, 생산 방법.
  27. 상층액(supernatant)을 제공하는 세포 배양 배지에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 핵산 구조 또는 상기 핵산 구조를 포함하는 벡터를 포함하는 세포 또는 양수 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 단백질의 생산 방법으로서,
    여기서 상기 세포 또는 세포주는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조 및 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하고, 여기서 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스는 상기 세포 또는 세포주에서 발현되며, 여기서 방법은 세포 또는 상층액(supernatant)으로부터 단백질을 회수(harvesting)하는 단계를 포함하는 것인, 생산 방법.
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