CZ20021709A3 - Permanentní buněčná linie amniocytů, způsob její přípravy a její pouľití k produkci vektorů pro přenos genů - Google Patents
Permanentní buněčná linie amniocytů, způsob její přípravy a její pouľití k produkci vektorů pro přenos genů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20021709A3 CZ20021709A3 CZ20021709A CZ20021709A CZ20021709A3 CZ 20021709 A3 CZ20021709 A3 CZ 20021709A3 CZ 20021709 A CZ20021709 A CZ 20021709A CZ 20021709 A CZ20021709 A CZ 20021709A CZ 20021709 A3 CZ20021709 A3 CZ 20021709A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- vectors
- adenoviral
- cell line
- cells
- cell
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 307
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 241
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 131
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 title claims description 105
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 52
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 38
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 claims description 91
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 63
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 48
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 27
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 claims description 16
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 16
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 13
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 claims description 9
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 92
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 52
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 38
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 34
- 230000006870 function Effects 0.000 description 31
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 21
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 18
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000034272 protein filaments Human genes 0.000 description 14
- 108091005974 protein filaments Proteins 0.000 description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 14
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 9
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 8
- 102100038313 Transcription factor E2-alpha Human genes 0.000 description 7
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 7
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 5
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 5
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 5
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 3
- 101150066038 E4 gene Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical class NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000587455 Homo sapiens Single-stranded DNA-binding protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 108010059343 MM Form Creatine Kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101710198224 Ornithine carbamoyltransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 102100029719 Single-stranded DNA-binding protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005157 neural retina Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 101100524317 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524321 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep68 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 1
- 108010087905 Adenovirus E1B Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 101150029409 CFTR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 101710199711 Early E1A protein Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004862 Gastrin releasing peptide Human genes 0.000 description 1
- 108090001053 Gastrin releasing peptide Proteins 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101710094396 Hexon protein Proteins 0.000 description 1
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 101710192606 Latent membrane protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000542980 Mimidae Species 0.000 description 1
- 102000008934 Muscle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074084 Muscle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101150057876 OTC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 101710173835 Penton protein Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000016624 Retinal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710109576 Terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 241000906446 Theraps Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012578 cell culture reagent Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002390 cell membrane structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003237 epithelioid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 description 1
- PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N gastrin-releasingpeptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000006552 photochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 244000057424 walen Species 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
- C12N2810/405—Vectors comprising RGD peptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
- C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
- C12N2810/6018—Adenoviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
- C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
- C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Manufacturing Of Steel Electrode Plates (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká permanentní buněčné linie amniocytů obsahující alespoň jednu nukleovou kyselinu, která exprimuje genové produkty adenovirových úseků EIA a E1B. Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy permanentní buněčné linie amniocytů a použití této linie k produkci vektorů pro přenos genů a/nebo adenovirových mutant. K dalším aspektům vynálezu patří použití amniocytů a produktů úseků EIA a E1B adenovirových genů k produkci permanentní buněčné linie amniocytů.
Dosavadní stav techniky
Adenoviry
Adenoviry představují relativně homogenní skupinu virů, charakterizovanou ikosahedrickou kapsidou, sestávající hlavně z virem kódovaných hexonových, pentonových a vláknitých proteinů, a genomem, tvořeným lineární dvoj řetězcovou DNA velikosti přibližně 36 kilobazí (kb). Virový genom obsahuje na svých koncích sekvence invertovaných terminálních repetic (ITR), které obsahují virový počátek replikace. Dále je v levé straně genomu sbalovací signál, který je nezbytný pro sbalení vírového genomu do virové kapsidy v průběhu infekčního cyklu. Adenoviry byly izolovány z mnoha biologických druhů. Existuje více než 40 různých humánních sérotypů, které se rozlišují na • · • · ·
-2základě takových vlastností, jako je hemaglutinace, tumorigenicita a DNA sekvenční homologie (Wigand et al., in: Adenovirus DNA, Doerfler ed., Martinus Nijoff Publishing, Boston, pp. 408-441, 1986). Současné adenovirové vektory obvykle pocházejí ze sérotypů 2 (Ad2) a 5 (Ad5). Infekce Ad2 a Ad5 jsou u lidí endemické. Ad2 a Ad5 nejsou pro lidi onkogenní a jejich bezpečnost je dobře zdokumentována, neboť byla úspěšně a bez jakýchkoliv komplikací provedena vakcinace v armádě USA (Pierce et al., Am. J. Epidemiol. 87, 237-246, 1968). Biologie adenovirů je relativně dobře známa, jelikož adenoviry hrály významnou roli jako výzkumný nástroj molekulární biologii při objevení některých základních biologických principů jako je např. replikace a transkripce DNA, sestřih RNA a transformace buněk. Adenovirové částice vstupují do buňky při infekci prostřednictvím receptorem zprostředkované endocytózy, kdy podle dnešních poznatků, interakce „knoflíkové („knob) domény vláknitého proteinu s coxsackie adenovirovým receptorem (CAR) zprostředkovává adhezi virové částice na k buněčnému povrchu (Bergelson et al., Science 275, 1320-1323, 1997). Ve druhém kroku dojde k internalizaci virové částice, přičemž hraje klíčovou roli interakce pentonové báze s integriny (Wickham et al., Cell 73, 309-319, 1993). Po té, co virová částice vstoupila do buňky, virový genom se dostává do jádra buňky jako DNA-proteinový komplex. Adenovirový infekční cyklus se dělí na časnou a pozdní fázi, které jsou odděleny replikací adenovirů (Shenk, in: Virology, Fields ed., Lippincott-Raven Publishing, Philadelphia, pp. 2111-2148, 1996). V časné fázi dochází k expresi časných virových funkcí El, E2, E3 E4. Pozdní fáze je charakterizována transkripcí pozdních genů, které jsou zodpovědné za expresi virových strukturních proteinů a za produkci nových virových částic.
• · · ·
-3E1A je první virový gen, který se exprimuje z virového chromozómu, jakmile se dostane do jádra. E1A gen kóduje proteiny 12S a 13S, které se vytvářejí alternativním sestřihem E1A RNA. E1A proteiny aktivují transkripci řady buněčných a virových genů tím, že interagují s transkripčními faktory. Hlavní funkce E1A jsou a) aktivace dalších časných virových funkcí jako je E1B, E2, E3 a E4, a b) indukce klidových buněk ke vstupu do S fáze buněčného cyklu. Exprese E1A samotného vede k programované buněčné smrti (apoptóze).
E1B je jedním z časných virových genů aktivovaných E1A. E1B gen kóduje protein E1B velikosti 55 kD a protein E1B velikosti 19 kD, které jsou výsledkem alternativního sestřihu E1B RNA. 55 kD protein moduluje postup buněčného cyklu interakcí s nádorovým supresorovým genem p53, podílí se na prevenci transportu buněčné mRNA v pozdních fázích infekce, a zabraňuje ElA-indukované apoptózy buněk. E1B 19 kD protein ke podobně důležitý pro prevenci ElA-indukované apoptózy buněk.
Všechny humánní adenoviry jsou schopné transformovat buňky hlodavců v buněčné kultuře. Zpravidla je však pro onkogenní transformaci nutná koexprese E1A a E1B.
Protein genu IX, který kóduje strukturní složku virové kapsidy, je vložen do transkripční jednoty E1B.
Geny E2A a E2B kódují různé proteiny, které jsou nezbytné pro replikaci virového genomu. Patří sem prekurzorový protein terminálního proteinu (pTP), DNA polymeráza (Pol) a protein vázající jednořetězec (SSBP). V průběhu replikace se pTP váže na obě ITR virového genomu. Působí zde jako proteinový primer pro DNA replikaci, která je iniciována Pol společně s buněčnými faktory. Pol, SSBP a buněčný faktor NFII, a zřejmě ještě další faktory, jsou nezbytné k prodlužování řetězce DNA.
• · · · · · ► · · ft · · · ·
-4E4 kóduje různé proteiny. Kromě jiného E4 protein velikosti 34 kD, který blokuje, společně E1B 55 kD proteinem, akumulaci buněčné mRNA v cytoplasmě, a současně umožňuje transport virové RNA z buněčného jádra do cytoplasmy.
Po zahájeni replikace virového genomu dochází k expresi virových strukturních proteinů, které jsou nutné pro sestavení virové kapsidy a pro vytvoření komplexu virové DNA s virem kódovanými DNA-vazebnými proteiny. Zcela jistě se nejdříve vytvoří prázdná kapsida, do které následně vstoupí virový genom. K tomuto procesu je nutný cis element virového genomu, tzv. sbalovací signál, který ke lokalizován v lev části virového genomu a, v případě Ad5, zaujímá úsek zaujímá úsek od páru baží 260 do páru baží 460 (Hearing et al., J. Virol. 62, 2555-2558, 1987; Graeble a Hearing, J. Virol. 64, 2047-2056, 1990). Sbalovací signál se překrývá s E1A enhancerem (zesilovačem), který je nutný pro aktivitu E1A promotoru. Přesný mechanismus sbalení virového genomu do virové kapsidy není dosud jasný, ale je pravděpodobné, že je k tomu nutná interakce buněčných a/nebo virových proteinů se sbalovacím signálem.
Adenovirové vektory
Adenovirové vektory jsou zvláště důležité jakožto expresní vektory, zejména pro účely genové terapie. Je proto celá řada důvodů: biologie adenovirů byla důkladně prozkoumána, virové částice jsou stabilní a lze je relativně snadno produkovat s vysokým titrem, genetické úpravy (manipulace) adenovirového genomu jsou snadné a adenovirové vektory jsou schopné účinně transdukovat replikující i nereplikující se buňky, a to jak in vitro tak in vivo.
• ·· «· ···· · · ··· ··· ·· ···· · ···· · · ·· ··· · ··· · ··· ·· · ·· ··· ·· ·· ··· ··
-5a) Adenovirové vektory první generace
Adenovirové vektory první generace (Gilardi et al., FEBS Letters 267, 60-62, 1990; Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gen Ther. 1, 241-256, 1990) jsou charakteristické delecemi genů E1A a E1B. E1A a E1B mají transformující a transaktivující vlastnosti. Navíc E1A je nezbytný pro funkci nebo aktivaci virových genů a E1B je nezbytný pro akumulaci virových transkriptů. V některých vektorech byla navíc deletována oblast E3, aby se zvýšila kapacita pro příjem cizorodé DNA. E3 je postradatelná pro produkci adenovirů v buněčné kultuře. Kapacita pro příjem cizorodé DNA je přibližně 8 kb. Adenovirové vektory první generace se dosud produkovaly zejména v buňkách 293 buňky (viz níže), které komplementuji funkce E1A a E1B chybějící ve vektorech.
b) Adenovirové vektory druhé generace
Adenovirové vektory druhé generace jsou charakteristické delecemi E2 a/nebo E4 kromě původních delecí E1A a E1B (Engelhardt et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 91, 6196-6200, 1994; Yang et al., Nátuře Gent., 7, 362-367, 1994; Gorziglia et al., J. Virol. 70, 4173-4178, 1996; Krougliak a Graham, Hum. Gen Ther. 6, 1575-1586, 1995; Zhou et al., J. Virol. 70, 7030-7038, 1996). V některých vektoterch byla navíc deletována oblast E3, aby se zvýšila kapacita pro příjem cizorodé DNA. Adenovirové vektory druhé generace byly vyvinuty proto, aby se dále redukovala transkripce virových genů a exprese virových proteinů, a aby se tak dále zmenšila antivirová imunitní reakce. Kapacita pro příjem cizorodé DNA byla nepatrně zvýšena ve srovnání s adenovirovými vektory první generace.
• ·
-6Adenovirové vektory druhé generace jsou produkovány v buněčných liniích, které kromě E1A a E1B komplementuji navíc konkrétní další deficit (E2 a/nebo E4).
c) Adenovirové vektory s velkou kapacitou DNA
Adenovirové vektory s velkou kapacitou DNA jsou charakteristické tím, že neobsahují žádné virové kódující DNA sekvence (Kochanek et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5731-5736, 1996; Fisher et al., Virology 217, 11-22, 1996; Kumar-Singh a Chamberlain, Hum. Mol. Gent. 5, 913-921, 1996). Tyto vektory obsahují jen virové konce včetně úseků ITR a sbalovacího signálu. Kapacita pro příjem cizorodé DNA je přibližně 37 kb, protože větší část adenovirovového genomu byla deletována. Byly popsány různé systémy pro produkci adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA (Kochanek et al., supra; Parks et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 13565-13570, 1996; Hardy et al., J. Virol. 71, 1842-1849,
1997) . Výhodou těchto adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA ve srovnání s adenovirovými vektory první a druhé generace je větší kapacita pro příjem cizorodé DNA a nižší toxicita a imunogenicita (Schiedner et al., Nátuře Gent. 18, 180-183, 1998; Morral et al., Hum. Gen Ther. 9, 2709-2716,
1998) . V současnosti jsou adenovirové vektory s velkou kapacitou produkovány pomocí E1A- a ElB-deletovaných pomocných virů (pomocný-virus), které poskytují v trans virové funkce nezbytné pro produktivní infekční cyklus. Dodnes se adenovirové vektory s velkou kapacitou pro DNA produkují v buňkách 293 nebo v buněčných liniích odvozených z buněk 293. V jednom způsobu produkce (Parks et al., supra; Hardy et al., supra), jsou adenovirové vektory produkovány v modifikovaných buňkách 293, které navíc k E1A a E1B, exprimují rekombinázu
-7Cre z bakteriofága Pl. V tomto systému je sbalovací signál pomocného viru obklopen rozpoznávací sekvencí loxP z bakteriofága Pl. Po infekci Cre-exprimujících buněk 293 pomocným virem a adenovirovým vektorem s velkou kapacitou pro DNA je sbalovací signál pomocného viru vystřižen. Z tohoto důvodu dohází především ke sbalování vektoru obsahujícího normální sbalovací signál, ale nikoliv pomocného viru.
d) Deletované adenovirové vektory
Tyto vektory byly popsány jako vektory první generace, které mají rozpoznávací sekvenci loxP bakteriofága Pl umístěnou ve virovém genomu takovým způsobem, že po infekci Cre-exprimujících buněk 293 většina nebo dokonce všechny virové kódující sekvence jsou deletovány rekombinací mezi rozpoznávací sekvencí loxP. Velikost genomu těchto vektorů je přibližně 9 kb. Kapacita pro příjem cizorodé DNA je podobná, přibližně také 9 kb (Lieber et al., J. Virol. 70, 8944-8960, 1996).
Adeno-asociované viry (AAV)
AAV patří do „čeledi parvovirů, rodu dependovirů, a mají dvě odlišné životní formy, a sice vyskytují se buďto jako lytický virus nebo provirus. Aby došlo k lytické infekci, virus vyžaduje koinfekci pomocným virem (adenovirus, virus vakcínie, virus herpes simplex). V nepřítomnosti pomocného viru není AAV schopen se replikovat, integruje se do genomu a existuje zde jako inaktivní provirus. Když dojde k infekci buněk nesoucích AAV jako integrovaný provirus, např. adenovirem, provirus je schopen znovu vstoupit do cyklu ·· ··
-8lytické infekce (Samulski, Curr. Opin. Gent. Dev. 3, 74-80,
1993).
AAV kapsidy obsahují genom z jednořetězcové lineární DNA, buďto pozitivní nebo negativní polarity. Existuje několik sérotypů AAV. Nejdůkladněji prozkoumaný sérotyp AAV-2. Genom AAV-2 sestává z 4680 nukleotidů. Genom obsahuje na svých koncích sekvence invertovaných terminálních repetic (ITR) o délce 145 párů baží. Prvních 125 párů baží vytváří vlásenkovou strukturu tvaru T sestávající ze dvou vnitřních palindromů.
AAV genom kóduje nestrukturní replikační proteiny (Rep) a strukturní kapsidové proteiny (Cap). Různé replikační proteiny (Rep78, Rep68, Rep52, Rep40) se vytvářejí z různých promotorů (p5 a pl9) a pomocí alternativního sestřihu. Různé kapsidové proteiny (VP1, VP2, VP3) se vytvářejí alternativním sestřihem z p40 promotoru.
AAV vektory
AAV vektory obsahují pouze úseky ITR z AAV a určité sousední nekódující AAV sekvence. Z tohoto důvodu je kapacita pro příjem cizorodé DNA přibližně 4,5 kb. Pro produkci rekombinantních AAV vektorů byly popsány různé systémy (Skulimowski a Samulski, in: Methods in Molecular Gentics, Vol. 7, Adoph ed., Academie Press, pp. 3-12). Tyto systémy poskytují všechny složky nezbytné pro replikaci, expresi a sbalení rekombinantního vektoru. Specificky jde o expresní kazety, které kódují Rep a Cap proteiny z AAV, a adenovirové pomocné funkce. Adenovirové pomocné funkce nezbytné pro produkci AAV jsou specificky E1A, E1B, E2, E4 a VA. Funkce E1A a E1B poskytují buňky 293, které se až dosud k produkci užívaly. Ve způsobech dnešních jsou funkce E2, E4 a VA • •44 • 4 ·
-9poskytnuty buďto koinfekcí adenovirem nebo kotransfekcí E2-, E4- a VA-exprimujícími plazmidy (Samulski et al., J. Virol. 63, 3822-3828, 1989; Allen et al., J. Virol. 71, 6816-6822,
1997; Tamayose et al., Hum. Gen Ther. 7, 507-513, 1996; Flotte et al., Gen Ther. 2, 29-37, 1995; Conway et al., J. Virol. 71, 8780-8789, 1997; Chiorini et al., Hum. Gen Ther. 6, 1531-1541, 1995; Ferrari et al., J. Virol. 70, 3227-3234, 1996; Salvetti et al., Hum. Gen Ther. 9, 695-706, 1998; Xiao et al., J.
Virol. 72, 2224-2232, 1998, Grimm et al., Hum. Gen Ther. 9,
2745-2760, 1998; Zhang et al., Hum. Gen Ther. 10, 2527-2537,
1999). Alternativně byly vyvinuty strategie, které užily hybridní vektory adenovirus/AAV nebo herpes simplex virus/AAV k produkci AAV vektorů (Conway et al., supra; Johnston et al., Hum. Gen Ther. 8, 359-370, 1997, Thrasher et al., Gen Ther. 2, 481-485, 1995; Fisher et al., Hum. Gen Ther. 7, 2079-2087, 1996; Johnston et al., Hum. Gen Ther. 8, 359-370, 1997).
Všechny tyto způsoby produkce mají společné to, že se k produkci užívají E1A- a ElB-exprimující buňky 293.
Producentské buněčné linie
Z důvodů bezpečnosti adenovirové vektory určené pro humánní použití mají obvykle delece genů E1A a E1B. Produkce probíhá v komplementačních buněčné linii, která poskytuje v trans funkci El. Většina adenovirových vektorů byla dodnes produkována v buněčné linii 293. V nedávných letech však byly připraveny další buněčné linie, které mohou být užity k produkci El-deletovaných adenovirových vektorů.
• ·
-10a) Buňky HEK 293
Buňky HEK 293 byly po dlouhou dobu jediné buňky, které se mohly užívat k produkci El-deletovaných adenovirových vektorů. HEK 293 buňky byly připraveny v roce 1977 transfekcí „rozstříhané adenovirové DNA do humánních embryonálních ledvinných buněk (HEK buňky). Z celkového počtu osmi transfekčních experimentů, každý v průměru z 20 HEK kulturami, byla získán jediný imortalizovaný buněčný klon (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59-74, 1977). Buněčná linie (buňky HEK 293) založená z tohoto klonu obsahuje úplnou levou část 11 % adenovirovového genomu (páry baží 1 až 4344 z genomu Ad5) , včetně genů E1A a E1B a levého úseku ITR a také adenovirového sbalovacího signálu (Louis et al., Virology 233, 423-429,
1997). Značným problémem pro produkci adenovirových vektorů je sekvenční homologie mezi El-deletovanými adenovirovými vektory a částí adenovirové DNA integrované v buňkách 293. Homologní rekombinace mezi vektorem a adenovirovou DNA integrovanou v buňkách 293 je zodpovědná za vznik replikačně-kompetentních adenovirů (RCA) (Lochmuller et al., Hum. Gen Ther. 5, 14851491, 1994; Hehir et al., J. Virol. 70, 8459-8467, 1996). HEK 293 buňky jsou z tohoto důvodu nevhodné pro produkci adenovirových vektorů farmaceutické kvality, protože takové produkční jednotky jsou často kontaminované nepřijatelným množstvím RCA. Výskyt RCA je produkci vektorů pro klinické naprosto nepřijatelný při použití, neboť replikačně vektoru pro kompetentní adenoviry replikačně-defektní adenoviry, jsou schopné replikace v humánních tkáních a navíc komplementovat replikačně-defektní adenoviry (Lochmuller et al., supra; Imler et al., Hum. Gen Ther. 6, 711-721, 1995;
Hehir et al., supra).
mají výrazné vyssi toxicitu než nekontrolované jsou schopné • · ···· · · · * » · · · · · « » · · · · · · <
-11b) Humánní embryonální retinové buňky (HER buňky) a buněčné linie
Ačkoliv buňky hlodavců se mohou snadno transformovat adenovirovou El funkcí, primární humánní buňky se ukázaly jako relativně rezistentní k transformaci E1A a E1B. Jak již bylo zmíněno výše, Graham a spolupracovníci byli schopni izolovat pouze jediný buněčný klon z HEK buněk, které byly transfekovány „rozstříhanou DNA z Ad5. Gallimore a spolupracovníci zkoušeli po dlouhou dobu neúspěšné transformovat primární HEK buňky funkcí El z Adl2 (Gallimore et al., Anticancer Res., 6, 499-508, 1986). Tyto experimenty byly prováděny neúspěšně po dobu 3 let s více než 1 mg EcoRI fragmentu cDNA z Adl2 obsahujícího geny E1A a E1B. Po mnoha pokusech se podařilo izolovat jen čtyři HEK buněčné linie Adl2-El (Whittaker et al., Mol. Cell. Biol., 4, 110-116, 1984). Podobně Gallimore a spolupracovníci zkoušeli neúspěšně transformovat i jiné primární humánní buňky funkcí El, včetně takových buněk, jako jsou keratinocyty, kožní fibroblasty, hepatocyty a urotheliální buňky (Gallimore et al., Anticancer Res., 6, 499-508, 1986). Jediný typ humánních buněk, který bylo možné dosud reprodukovatelně transformovat adenovirovou funkcí El jsou humánní embryonální retinové buňky (HER buňky). HER buňky představují směs buněk získanou z bílé neurální retiny. Pro získání těchto buněk je nezbytné vyjmout oko z orbitální dutiny humánního fétu, zpravidla mezi 16. a 20. týdnem gestace. Oko se otevře horizontální incizí a bílá neurální retina se vyjme pinzetou a vloží do buněčné kultury.
Na základě dřívějších pozorování, a sice že a) Adl2indukované nádory primárně pocházejí z primitivního neurálního epitelu (Mukai et al., Prog. Neuropathol. 3, 89-128, 1976), a že b) Adl2 po intraokulární inokulaci indukuje nádory retiny u * 0 0 · 00 04 « ··* · · 0 0 ·«· 0 *000 · · * φ · φ φ · ··· 0 ·
-12k laboratorních potkanů a paviánů (Mukai et al., supra; Mukai et al., Science 210, 1023-1025, 1980), Byrd a spolupracovníci zjistili, že humánní embryonální retinoblasty (HER buňky) se mohou transformovat El geny z Adl2 (Byrd et al., Nátuře 298, 69-71, 1982). Ačkoliv účinnost transformace buněk HER byla menší než u primárních potkaních buněk, účinnost transformace byla více než 100 x vyšší než pro HEK buňky. Byly zahájeny . výzkumy s cílem vytvořit komplementační buněčné linie, které by se mohly využít k izolaci Adl2 El mutant.
V dalších výzkumech této skupiny (Gallimore et al., Cancer cells 4, 339-348, 1986) bylo ukázáno, že HER buňky se se mohou transformovat účinně plazmidovou DNA, která exprimuje geny E1A a E1B z Ad5. Účinnost transformace a vznik E1A- a ElB-exprimující buněčné linie byly asi 20 x vyšší s El geny z Ad5 než s El geny z Adl2.
Na základě těchto údajů, Fallaux a spolupracovníci ’ (Fallaux et al., Hum. Gen Ther. 7, 215-222, 1996; Fallaux et al., Hum. Gen Ther. 9, 1909-1917, 1998) založil E1A- a E1Bexprimující buněčné linie tak, že transformoval HER buňky plazmidy, které exprimovaly geny E1A a E1B z Ad5. Buněčná linie 911, která byla připravena transformací plazmidem, který obsahoval geny E1A a E1B z Ad5 (nukleotidy 79 až 5789 z genomu Ad5) , exprimuje E1A pod kontrolou přirozeného E1A promotoru . (Fallaux et al., supra; patentová přihláška W097/00326). Bylo tak možné založit další E1A- a ElB-exprimující HER buněčné linie transfekcí plazmidu, který obsahoval nukleotidy 459 až 3510 z genomu Ad5, a ve kterém je E1A gen pod kontrolou promotoru humánní fosfoglycerátkinázy (PGK), a ve kterém je dále přirozený E1B polyadenylační signál nahrazen póly(A) sekvencí povrchového antigenu z viru heptatitidy B (HBV) (Fallaux et al., supra; patentová přihláška W097/00326). Tyto v iř ·* ··*· ♦· ·* ··« 9 9» 9 9 9 9
9999 9 9 99 9 9 9 · «««««« 9 9 9 · ·
999 *· »» ··· ♦· 9 a··
-13a HER buněčné linie bývají označovány jako PER buněčné linie.
Výhodou těchto novějších buněčných linií PER ve srovnání s s buněčnými liniemi 293 nebo 911 je chybějící sekvenční homologie s DNA adenovirových vektorů první generace a integrovanou Ad5 DNA. Z tohoto důvodu dochází k významné redukci možnosti vytvářet RCA. Tyto E1A- a ElB-transformované HER buněčné linie (911 buňky a PER buňky) byly schopny komplementovat chybějící El v adenovirových vektorech první generace a tak byly užívány k produkci těchto vektorů.
Podobně byly připraveny buněčná linie transformací HER buněk plazmidem pTG6559, jak je uvedeno v publikaci Imler a spolupracovníci (Imler et al., supra; viz také WO 94/28152). Plazmid pTG6559 obsahuje sekvenci kódující geny E1A a E1B a gen proteinu IX (nukleotidy 505 až 4034 z genomu Ad5), přičemž E1A gen je pod kontrolou promotoru myší fosfoglycerátkinázy (PGK), a sdílený polyadenylační signál proteinů genů E1B a IX , geny byl nahrazen polyadenylačním signálem králičího genu pro β-globin.
i
Na rozdíl od popsaných pokusů získat primární humánní buňky transformací geny E1A a E1B z Ad5, byly učiněno několik málo pokusů exprimovat E1A a E1B různých sérotypů trvale v již dříve dobře zavedených buněčných liniích (Grodzicker et al., Cell, 21, 453-463, 1980; Babiss et al., J. Virol. 46, 454-465, 1983; Shiroki et al., J. Virol. 45, 1074-1082, 1983; Imler et al., supra; viz také WO 94/28152). Nevýhodami těchto buněčných linií byla potřeba koexprese selekčního markéru a často nedostatečná stálost exprese E1A a E1B. Jelikož tyto buněčné linie jsou od počátku imortalizované buněčné linie, exprese E1A a E1B není nezbytná pro přežití buněčné linie, takže přírodní selekce E1A a E1B není v tomto případě nutná, na rozdíl od použití primárních buněk.
9 « ·γ ·*··· ·· · » · ·♦* · · ··» • Λ · · · · · • · · * · ·
A»· ·· ·» ··»
9
999 9
-14V minulosti byla příprava buněčné linie pro produkci adenovirového vektoru nebo pro produkci AAV vektoru spojena se zvláštními obtížemi. Humánní embryonální ledvinné buňky (HEK buňky) lze získat z buněk humánních fétů. To se provádí tak, že se vyjmou ledviny z fétu a ledvinné buňky se vloží do buněčné kultury. Transfekce buněk HEK „rozstříhanou Ad5 DNA a následná integrace levého konce Ad5 DNA, a po té exprese genů EIA a E1B vedly k transformaci buněk v jediném publikovaném případě. Tak byla tímto způsobem založena jediná buněčná linie (tj. 293 buňky) (Graham et al., supra; viz také část Producentské buněčné linie, sekce a) . 293 buňky se užívají k produkci adenovirových vektorů a AAV vektorů.
Humánní embryonální retinové buňky (HER buňky) lze získat z oční bulvy humánních fétů. To se provádí tak, že se vyjme oko z fétu a buňky z retiny se vloží do buněčné kultury. Bylo možné transfekcí HER buněk adenovirovými geny EIA a E1B transformovat HER buňky (viz také část Producentské buněčné linie, sekce b). Buňky transformované EIA a E1B se mohou užívat k produkci adenovirových vektorů.
V obou uvedených případech je nezbytné vyjmout orgán z humánního fétu, který je získán buďto ze spontánního nebo terapeutického abortu, nebo z přerušení těhotenství ze sociálních důvodů, a pak z těchto orgánů založit buněčnou kulturu. Po zavedení primární kultury se mohou takové buňky transformovat metodou transfekce adenovirovými geny EIA a E1B. Buněčné linie takto připravené a exprimující EIA a E1B pak mohou být využity k produkci adenovirových vektorů nebo AAV vektorů.
Je jasné, že získání primární buněk z orgánů fétů je velmi obtížné. Jelikož primární kultury mohou být založeny pouze z čerstvých tkání, pro získání vhodné tkáně je třeba • · · · ! · · * · · • · · · ·
-15vynaložit značné logistické úsilí. Kromě toho, použití fetální tkáně získané buďto ze spontánních nebo terapeutických abortů nebo z přerušení těhotenství ze sociálních důvodů přináší zvláštní etické požadavky a nutnou péči při zakládání takových primárních kultur. Ačkoliv je laboratoř původců součástí gynekologické kliniky, kde se často provádí přerušení těhotenství, nebylo možné získat vhodnou tkáň po dobu delší než jeden rok. Odebrání tkáně z fétu po abortu vyžaduje prohlášení informovaného souhlasu těhotné ženy. Často bylo nemožné získat takový souhlas těhotné ženy pro odebrání orgánů po té, co byla detailně informována o výzkumném projektu, t j. o odebrání oka z fétu pro vědecký lékařský výzkum.
Použití permanentní buněčné linie amniocytů pro produkci vektorů pro přenos genů nebylo dosud popsáno. Byly zmíněny pouze humánní amniocyty, které byly transformovány opičím virem (SV40) a/nebo virem Kirstenova sarkomu (Sack, In Vitro 17 pp. 1-19, 1981; Walen, et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 57-65, 1986). Infekce samotným SV40 vedla k prodloužené době života (tj. tzv. imortalizaci), zatímco infekce virem Kirstenova sarkomu nikoliv. Infekce oběma viry současně nakonec vedla ke vzniku buněk maligního nádoru (Walen a Arnstein, supra). V této souvislosti je třeba zmínit, SV40-transformovaná amniocytová buněčná linie není vhodná pro produkci vektorů pro přenos genů, protože tyto buňky samy produkují SV40, který je znám jako onkogenní virus (Graffney et al., Cancer Res. 30, 871-879, 1970). Transformovatelnost humánních buněk SV40 však neposkytuje žádnou informaci o transformovatelnosti adenovirové El jejich funkce použitelnosti pro produkci vektorů pro přenos genů. Tak např. keratinocyty se mohou transformovat SV40 (viz Sack, supra), avšak evidentně se nemohou, stejně jako kožní fibroblasty a hepatocyty, transformovat Adl2 (Gallimore et al., 1986, ··· ·· ·· ···
-16* supra). Z hlediska produkce virových vektorů, zvláště adenovirových vektorů, v imortalizovaných buňkách, to není jen imortalizovatelnost sama, co je důležité; jde také o dobrou možnost infekce a pak produktivní průběh této infekce. Tyto vlastnosti nelze předvídat, a otázka, zda konkrétní buněčný typ může být užit k produkci vektorů pro přenos genů musí být vždy nově vyřešena pro konkrétní buňky.
k
Podstata vynálezu
Cílem předkládaného vynálezu je proto poskytnout nový způsob účinné, jednoduché a snadno reprodukovatelné přípravy amniocytové buněčné linie, a její použití, kromě jiného, pro produkci adenovirových vektorů, AAV vektorů, a retrovirových nebo lentivirových vektorů.
* Bylo zjištěno, a to zcela překvapivě, že transfekce buněk z amniotické tekutiny (amniocytů) , která se rutinním způsobem získává při diagnostické biopsii (amniocentéze) pro účely prenatální diagnostiky, adenovirovými geny E1A a E1B vedla k velkému počtu permanentních buněčných linií, které exprimovaly geny E1A a E1B funkčně aktivním způsobem, a které byly vhodné pro produkci vektorů pro přenos genů.
' Jeden aspekt předkládaného vynálezu je proto permanentní buněčná linie amniocytů obsahující alespoň jednu nukleovou kyselinu, která exprimuje genové produkty adenovirových úseků E1A a E1B. Termín permanentní buněčná linie znamená podle vynálezu, že odpovídající buňky byly nějak geneticky modifikovány, aby byly schopné růst permanentně v buněčné kultuře. Naproti tomu primární buňky jsou buňky, které byly získány vyjmutím z organizmu a následně kultivovány a mají jen
-17omezenou dobu života. Permanentní buněčná linie amniocytů pro potřeby předkládaného vynálezu mohou být připraveny způsobem popsaným zde, který obsahuje krok transfekce primárních amniocytů funkcí El adenovirus. Alespoň jedna nukleová kyselina, která vede k expresi produktu adenovirového genu El, může být jakákoliv vhodná nukleová kyselina nebo nukleová kyselina, která vede k trvalé expresi těchto genových produktů. Může být integrovaná v genomu buňky, tj. chromozomálně, nebo je přítomna vně chromozómu, např. jako epizomálně se replikující plazmid nebo minichromozóm. Exprese různých genových produktů však může být způsobena jednou a toutéž molekulou nukleové kyseliny, nebo např. různými molekulami nukleové kyseliny. Termín exprese znamená ve stavu techniky způsob produkce genového produktu, kterým je specifický protein, který způsobuje specifický znak nebo specifickou vlastnost, nebo produkce forem RNA, které nejsou translatovány do proteinů (jako je např. antisense RNA nebo tRNA). Vhodné možnosti, jak dosáhnout požadované exprese, budou odborníkovi jasné na základě předkládaného popisu, a zejména na základě navrženého postupu. Nová amniocytová
| buněčná linie je vhodná | nejen | k | produkci vektorů pro | přenos | |
| genů v obecném smyslu, | ale | také konkrétně | pro produkci | ||
| adenovirových vektorů | první | generace, | které | j sou | |
| charakteristické delecemi genů | E1A a E1B, | které | j sou | ||
| komplementovány buněčnou | linií. |
Alespoň jedna nukleová kyselina také výhodně způsobuje expresi genových produktů adenovirových E2A, E2B a/nebo E4 úseků a/nebo Cre rekombinázy. To činí buněčnou linii zvláště vhodnou pro produkci adenovirových vektorů druhé generace, které jsou charakteristické delecemi E2 a/nebo E4 genů kromě delecí genů E1A a E1B. Exprese Cre rekombinázy bakteriofága PÍ je zvláště výhodná v produkci adenovirových vektorů s velkou
0 0 0 • 0 ·0 • 0 » · · · • 0 0 0 · · 9
-18kapacitou pomocí E1A- a ElB-deletovaného pomocného viru (viz také Parks et al., supra; Hardy et al., supra). Exprese genových produktů úseku E1A je výhodně pod kontrolou konstitutivního promotoru, výhodně promotoru fosfoglycerátkinázy (PGK). Výhodné je pro expresi genových produktů úseku E1B, jestliže je pod kontrolou adenovirového promotoru, výhodně adenovirového E1B promotoru. Možnou alternativou je využít, například cytomegalovirový (CMV) promotor. Všechny adenovirové genové produkty výhodně pocházejí z adenoviru stejného subrodu, např. humánního adenoviru typu 5 (Ad5). Permanentní buněčná linie amniocytů je normálně humánní buněčná linie, protože je pak zvláště vhodná pro produkci vektorů pro přenos genů pocházejících z humánních virů, jak je například humánní adenovirus nebo humánní AAV.
Možnou alternativou je také buněčná linie z primátů nebo jiných savců, například krávy, která je zvláště vhodná pro produkci vektorů pro přenos genů pocházejících z virů vyskytujících se endemicky u daného živočišného druhu. Například permanentní buněčná linie amniocytů získaná transformací amniocytů geny E1A a E1B hovězího (bovinního) adenoviru jsou vhodné pro produkci vektorů odvozených z bovinního adenoviru.
Další aspekt předkládaného vynálezu je způsob přípravy permanentní buněčné linie amniocytů, konkrétně amniocytové buněčná linie jak byla definována výše, kterýžto způsob zahrnuje transfekci amniocytů alespoň jednou nukleovou kyselinou, která způsobuje expresi adenovirových genových produktů úseku E1A a úseku E1B. Výsledné buněčné klony se dále izolují, a je-li to třeba, klonují se dále pro získání jediné buněčné linie. Termín transfekce znamená v tomto popisu jakýkoliv způsob vhodný k vnesení nukleové kyseliny
-19(nukleových kyselin) do buňky. K příkladům, které lze zmínit, patří elektroporace, lipozomové systémy a jakákoliv kombinace těchto způsobů. Termín amniocyty znamená v tomto popisu v širším smyslu všechny buňky, které jsou přítomné v amniotické tekutině a mohou být tedy získány biopsií amniotické tekutiny. Pocházejí buďto z amnionu nebo fetálních tkání, které jsou v kontaktu s amniotickou tekutinou. Byly popsány tři hlavní třídy amniocytů, které se rozlišují na základě morfologických kritérií: fibroblastům podobné buňky (F buňky), epiteloidní buňky (E buňky) a buňky amniotické tekutiny (AF buňky) (Hohn et al., Pediat. Res. 8, 746-754, 1974). AF buňky představují hlavní buněčný typ. V úzkém smyslu proto zde termín amniocyty označuje amniocyty typu AF. Výhodně se užívají primární amniocyty. Buňky označované jako primární buňky jsou takové buňky, které mohou být získány odebráním z organizmu a kultivovány v buněčné kultuře, avšak mají jen omezenou dobu života, zatímco tzv. permanentní buněčné linie jsou schopné pokračovat v růstu neomezeně. Je zvláště výhodné v této souvislosti použít humánní primární amniocyty, které vedou k vytvoření humánní buněčné linie (viz výše). Avšak je také možné užít primární amniocyty z primátů a dalších druhů savců, např. krav. Na základě předloženého popisu je odborníkovi jasné, že pro vytvoření vhodné permanentní buněčné linii je možné analogicky užít buňky, které se mohou získat z amniotické membrány, např. trypsinizací, nebo biopsií choriových klků.
Alespoň jedna nukleová kyselina, která způsobuje expresi adenovirových produktů El genu je genomická DNA, cDNA, syntetická DNA, RNA a nebo mRNA. Nukleová kyselina se výhodně užívá ve formě DNA expresního vektoru. K příkladům patří integrativní vektory, bakteriální plazmidy, epizomálně se replikující plazmidy nebo minichromozómy. Výhodná je exprese
-20plazmidů, jejichž integrace do genomu recipientni (příjemcovské) buňky se provede transfekcí. Termín alespoň jedna nukleová kyselina vyjadřuje skutečnost, že elementy, které způsobují expresi, mohou být přítomny na jedné a téže nukleové kyselině nebo na několika různých nukleových kyselinách. Například se mohou připravit separátní nukleové kyseliny pro expresi genových produktů E1A, E1B, E2A, E2B a/nebo E4 úseků a/nebo Cre rekombinázy. Také si lze představit, že amniocyty, které mají být transfekovány, již exprimují jeden z těchto genových produktů, takže je třeba vyvolat jen expresi dalšího (dalších) genového produktu (produktů), nebo že exprese jednoho nebo více těchto genových produktů je spuštěna pouhým vnesením vhodných regulačních elementů. Vhodné metody a způsoby přípravy a mutageneze nukleových kyselin, genové exprese a proteinových analýz jsou odborníků snadno k dispozici (viz například Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Glover, D.M., DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. II: Exprese Systems, IRL Press (1995); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1999); Rees, A.R. et al., Protein Engineering: A Practical Approach, IRL Press (1993)). Je výhodné pro genový produkt nebo genové produkty úseku E1A, aby byly exprimovány pod kontrolou konstitutivního promotoru, konkrétně promotoru fosfoglycerátkinázy (PGK), a pro genové produkty úseku E1B, aby byly exprimovány pod kontrolou adenovirového promotoru, konkrétně adenovirovového E1B promotoru. Namísto adenovirového promotoru je také možné užít například cytomegalovirový (CMV) promotor.
Ve zvláštním provedení transfekce amniocytů a/nebo výsledné buněčné linie navíc způsobuje expresi genových produktů adenovirovových úseků E2A a/nebo E2B a/nebo E4 a/nebo ·· · · · · · · • · · · · · • · · · · · ·
-21 Cre rekombinázy. Všechny tyto možnosti již byly dříve diskutovány nebo popsány ve stavu techniky a jsou tedy odborníkovi dostupné. Pokud jde o jednotlivé geny, odkazujeme na další dostupné informace, a sice: E2A: Genbank přírůst, číslo M73260; Kruiyer et al., Nucl. Acids Res. 9, 4439-4457,
1981; Kruiyer et al., Nucl. Acids Res. 10, 4493-4500, 1982.
E2B: Genbank přírůst, číslo M73260; Dekker et al., Gen 27, 115-120, 1984; Shu et al., Virology 165, 348-356, 1988. E3:
Genbank přírůst, číslo M73620; Cladaras et al., Virology 140, 28-43, 1985. E4: Genbank přírůst, číslo M73620 a D12587;
Virtanen et al., J. Virol. 51, 822-831, 1984; Dix et al., J. Gen. Virol. 73, 2975-2976, 1992. Čtecí rámce jsou v některých případech známé jen pro Ad2 a mohou být obvykle přiřazeny na základě srovnání sekvencí, např. v případě Ad5. Cre rekombináza: Genbank přírůst, číslo X03453; Sternberg et al., J. Mol. Biol. 187, 197-212, 1986.
Adenovirové genové produkty výhodně všechny pocházejí z jednoho konkrétního adenovirového sérotypu, konkrétně z humánního adenovirů typu 5 (Ad5). Konkrétní adenovirovový sérotyp, ze kterého pocházejí geny E1A a E1B použité pro transformaci amniocytů, není kritickým faktorem předkládaného vynálezu. K příkladům adenovirových sérotypů, které se mohou užít v předkládaném vynálezu a jsou známy ze stavu techniky, patří více než 40 humánních sérotypů, například Adl2 (podrod, „subgenus A) , Ad3 a Ad7 (podrod B) , Ad2 a Ad5 (podrod C), Ad8 (podrod D) , Ad4 (podrod E) , Ad40 (podrod F) (Wigand et al., in: Adenovirus DNA, Doerfler, ed., Martinus Nijhoff
Publishing, Boston, pp. 408-441, 1986). Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu adenovirové vektory pocházející z podrodu C jsou produkovány transformací amniocytů geny E1A a E1B, které pocházejí z adenovirů stejného podrodu. Například adenovirové vektory sérotypu 2 nebo 5 jsou produkovány • · · ··· ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · · ·
-22transformací geny E1A a E1B sérotypu 2 nebo 5. Adenovirové vektory založené na Adl2 jsou produkovány transformací geny E1A a E1B z Adl2 etc. K produkci non-humánních adenovirových vektorů, kam patří známé adenoviry pocházející z hovězího dobytka, ovcí, prasat a dalších savců, se amniocytové buněčné linie připravují transformací buněk konkrétního biologického druhu. To je obvykle nutné, protože adenovirové funkce zpravidla nemohou být mezidruhově účinně komplementovány.
Ve zvláštním provedení předkládaného vynálezu, amniocyty získané pro diagnostické účely v rámci prenatální diagnostiky biopsií amniotické tekutiny a již více nepotřebné pro diagnostické účely byly transfekovány expresním plazmidem, který exprimoval geny E1A a E1B z Ad5. Tento konstrukt byl připraven tak, aby gen E1A byl pod kontrolou myšího fosforglycerátkinázového promotoru, a gen E1B byl pod kontrolou přirozeného adenovirového E1B promotoru. Přirozené sestřihové akceptorové místo E1B a E1B polyadenylační sekvence byly nahrazeny odpovídajícími sekvencemi viru SV4 0. Několik týdnů po transfekci plazmidovou DNA byl pozorován velký počet buněčných klonů, a ty byly izolovány, klonovány, byly z nich založeny imortalizované buněčné linie a nakonec byly analyzovány. Všechny analyzované buněčné klony exprimovaly proteiny E1A a E1B. Bylo ukázáno, pomocí infekce El-deletovaným β-gal-exprimujícím adenovirovým vektorem a následným obarvením, že všechny tyto buňky mohou být infikovány. Infekční experimenty s El-deletovanými adenovirovými vektory první generace vedly k odhalení toho, že buněčné linie jsou vhodné pro produkci adenovirových vektorů. V těchto experimentech byly nejdříve buněčné linie infikovány β-gal-exprimujícím adenovirovým vektorem první generace. Po 48 až 72 hodinách, když se na buňkách projevil cytopatický
0 · · ····
-23účinek(CPE), byly buňky sklizeny a adenovirový vektor byl uvolněn z buněk třikrát opakovaným zamražením a roztátím buněk. Část buněčného lyzátu byla užita buněk 293 a pak byla exprese β-gal detekován histochemicky přibližně 24 hodin po přenosu genu. Bylo tak možné určit přímo z počtu β-galpozitivních buněk výtěžek produkce vektoru v jednotlivých buněčných liniích. Amniocytové buněčné linie se mohou takto získat bez obtíží a reprodukovatelně a jsou velmi vhodné pro produkci vektorů pro přenos genů. Některé z takto izolovaných buněčných linií dovolují, adenovirovoué vektory byly produkovány stejně dobře nebo lépe než v buňkách 293. Podle očekávání buněčné linie vykazovaly rozdíly v produkci rekombinantního adenovirového vektoru (viz Obr. 4). Buněčné linie N52.E6 a N52.F4 se odlišovaly rychlým růstem a zvláště dobrou produkcí adenovirových vektorů, což jsou výhodné vlastnosti pro použití těchto buněčných linií pro produkci vektorů pro přenos genů.
Konstrukce E1A- a ElB-exprimujících expresních plazmidů použitých pro transformaci amniocytů vylučuje vytvoření replikačně-kompetentních adenovirů (RCA) homologní rekombinací adenovirového vektoru nebo adenovirovového pomocného viru s DNA integrovanou do transformovaných amniocytů, na rozdíl od buněk 293. Alternativně mohou být jednotlivé El funkce vneseny různými expresními plazmidy, které se transformují do buňky, která má být transfekována. Je samozřejmě také možné, stejně jako u buněčné linie 293, provést transformaci amniocytů a testovat jednotlivé várky produkovaných vektorů pro přenos genů na obsah RCA, např. pomocí PCR nebo testem infekčnosti. Várky obsahující RCA se pak likvidují, je-li to třeba.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká permanentní buněčné linie amniocytů, která se může připravit způsobem • 4 4 4 4 · · · · · · · · • 44 444 4444
4 4 4 · 4 4 4 4 · · · ·· · · 4 · 4 4 4 · · ··· 44 44 444 44 4444
-24k podle předkládaného vynálezu. Ve specifickém provedení se vynález týká permanentní buněčné linie amniocytů N52.E6, která byla uložena 26. října 1999 v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)) v souladu s Budapešťskou smlouvou pod přírůstkovým číslem DSM ACC2416.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká použití amniocytů pro produkci adenovirem-transformovaných permanentních buněčných linií amniocytů. Termín adenoviremtransformovaná znamená v tomto popisu transformaci jedním nebo více transformujícími adenovirovými geny. Transformace se v této souvislosti týká přeměny linie eukaryotických buněk, která podlého kontrole růstu, na tzv. permanentní buněčnou linii, která roste neomezeně. A dalším aspektem předkládaného vynálezu je použití adenovirových genových produktů E1A a E1B úseků pro produkci permanentní buněčná linie amniocytů.
Předkládaný vynález se dále týká použití permanentní buněčné linie amniocytů pro produkci vektorů pro přenos genů. Vektor pro přenos genů zde označuje obecně všechny vektory, s jejichž pomocí se jeden nebo více terapeutických genů může přenést nebo vnést do požadované cílové buňky, a konkrétně virové vektory mající tyto vlastnosti. Navíc permanentní . buněčná linie amniocytů může být užita k produkci adenovirových mutant. Adenovirové mutanty označují adenoviry, které mají alespoň jednu mutaci v genu E1A a/nebo E1B. Ve výhodném provedení, na rozdíl od adenovirových vektorů pro přenos genů, nenesou žádné terapeutické geny. Typickým příkladem je adenovirová mutanta, ve které E1B protein velikosti 55 kD není exprimován (např. adenovirová mutanta d21520, viz Barker et al., Virology 156, 107-121, 1987).
• · · · ·· · · ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·
-25Adenovirové mutanta, ve které E1B protein velikosti 55 kD není exprimován je velice zajímavá pro terapii onkologických onemocnění, protože virová mutanta se replikuje výlučně v nádorových buňkách a vůbec ne a nebo v zanedbatelné míře v primárních normálních buňkách (Bischoff et al., Science 274, 373-376, 1996; Kirn et al., Nátuře Med. 4, 1341-1342, 1998).
Výhodným provedením vynálezu je použití permanentní buněčné linie amniocytů pro produkci adenovirových vektorů, AAV (adeno-asociované viry) vektorů, retrovirových vektorů, lentivirových vektorů, chimérických vektorů adenovirus-AAV, chimérických vektorů adenovirus-retrovirus a/nebo chimérických vektorů adenovirus-lentivirus. Použití pro produkci vektorů z herpetických virů je také možné.
AAV vektory normálně obsahují pouze úseky ITR z AAV a nějaké sousedící nekódující AAV sekvence. Jejich kapacita pro příjem cizorodé DNA je asi 4,5 kb. Jak bylo již zmíněno výše, pro produkci rekombinantních AAV vektorů existují různé systémy. Všem těmto systémům je společné to, že poskytují všechny složky nezbytné pro replikaci, expresi a sbalení rekombinantního vektoru. Specificky obsahují expresní kazety, které kódují AAV proteiny rep a cap, a adenovirové pomocné funkce. Adenovirové pomocné funkce nezbytné pro produkci AAV jsou geny E1A, E1B, E2, E4 a VA. Funkce E1A a E1B poskytují E1A- a ElB-exprimující amniocytové buněčné linie a mohou tudíž být použity k produkci AAV vektorů. Funkce E2, E4 a VA lze poskytnout koinfekcí adenovirem nebo kotransfekcí E2-, E4- a
VA-exprimujícími plazmidy nebo užitím hybridních vektorů adenovirus/AAV nebo herpes simplex virus/AAV (Samulski et al., supra; Allen et al., supra; Tamayose et al., supra; Flotte et al., supra; Conway et al., supra; Chiorini et al., supra;
·· ····«· 99 99 • ··· ···· ··· · · · 4 4 4 · · ····· · 4 · · ·
-26Ferrari et al., supra; Salvetti et al., supra; Xiao et al., supra; Grimm et al., supra; Zhang et al., supra).
Retrovirové vektory, čili vektory odvozené z retrovirů, mají obdobně velký význam jako nosiče pro transfekci v rámci genové terapie, např. pro genovou terapii centrálního nervového systému (Suhr et al., Arch. Neurol. 56, 287-292,
1999). Retrovirové vektory mohou být produkovány ve stabilních vektor-produkujících buněčných liniích nebo využitím přechodné (transientní) transfekce. Jednotlivé složky užité k produkci retrovirových vektorů normálně zahrnují jeden nebo více plazmidů, které exprimují strukturní proteiny a replikační a integrační proteiny, a také plazmid, který obsahuje vektor samotný (Miller, in:. Retroviruses, Coffin, Hughes, Varmus ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997, pp. 437-473). Jestliže jsou užity tyto plazmidy, které obsahují replikační počátek, jako je např. replikační počátek SV40, amniocytové buněčné linie jsou modifikovány tak, aby proteiny, které podporují replikaci plazmidů, byly trvale exprimovány. Například v případě plazmidů, které obsahují replikační počátek SV40, se užívá amniocytová buněčná linie,
| která exprimuje T antigen SV40. | z | lentivirů | ||
| Lentivirové | vektory | jsou vektory odvozené | ||
| (Naldini et al., | Science | 272, 263-267, 1996; | Duli | et al., |
| J. Virol. 72, 8463-8471, | 1998). Lentivirové vektory | mohou být |
produkovány v trvalých vektor-produkujících buněčných liniích nebo pomocí přechodné transfekce.
Chimérické vektory jsou vektory, které jsou výsledkem fúze nukleové kyseliny ze dvou nebo více různých virových vektorů. Permanentní buněčná linie amniocytů může být užita podle předkládaného vynálezu také pro produkci chimérických vektorů. V takovém systému například adenovirový vektor, ·· 4 4·· ·· · · • · 4 · · · · • · 4 · 4 · 4 · • · · · · · ·
-27výhodně adenovirový vektor s velkou kapacitou, nese DNA fragment, který má také sekvenční informaci integrujícího viru, která pochází například z retroviru nebo AAV. Po transkripci v cílové buňce je integrující se virus nesoucí terapeutický gen uvolněn z adenovirového základu (např. v případě retrovirového inzertu vytvořením infekčních retrovirových částic, které transdukují sousední buňky a integrují se trvale ve formě DNA). Příklady chimérických vektorů produkovaných v buňkách 293 byly popsány již dříve, např. jako chimérický vektor adenovirus-retrovirus (Feng et al., Nátuře Biotech. 15, 866-870, 1997) a chimérický vektor adenovirus-AAV (Recchia et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96, 2615-2620, 1999) . Produkce v E1A a ElB-exprimující amniocytové buněčné linii je však výhodná, neboť zde, na rozdíl od buněk 293, nemohou vznikat replikačně-kompetentní vektory homologní rekombinací.
Adenovirové vektory, tj. vektory odvozené z adenovirů, jsou velmi důležité, a to konkrétně jako nosiče pro transfekci pro genové terapie. Adenovirové vektory mohou být adenovirové vektory první generace, adenovirové vektory druhé generace, adenovirové vektory s velkou kapacitou pro DNA a/nebo deletované adenovirové vektory, které jsou produkovány pomocí permanentní buněčné linie amniocytů.
a) Produkce adenovirových vektorů první generace
Adenovirové vektory první generace jsou obvykle charakterizovány delecemi genů E1A a E1B. Některé adenovirové vektory první generace obsahují, kromě delecí genů E1A a E1B, obsahují navíc delece úseku E3. E3 funkce je postradatelná pro růst adenovirových vektorů v buněčné kultuře.
·· ··
-28Adenovirové vektory první generace mohou být produkovány v E1A- a ElB-exprimující amniocytové buněčné linii. To se provádí infikováním E1A- a ElB-exprimujících buněk výhodně infekcí o síle 3 až 5 infekčních jednotek na jednu buňku (3 až 5 MOI). Po době přibližně 36 až 72 hodin se na buňkách projeví cytopatický účinek. Buňky se pak sklidí standardními postupy. Adenovirovové vektory pak mohou být purifikovány na hustotním gradientu CsCl centrifugaci nebo chromatografickými metodami.
b) Produkce adenovirových vektorů druhé generace
Adenovirové vektory druhé generace jsou charakteristické delecemi genů E1A a E1B. Některé adenovirové vektory druhé generace také obsahují deleci úseku E3. Kromě delecí genů E1A a E1B, adenovirové vektory druhé generace jsou charakteristické inaktivací a výhodně delecí alespoň jednoho dalšího esenciálního adenovirového genu, např. genu E2A, genu E2B a/nebo genu E4, nebo například delecemi funkce E2v kombinaci s delecemi funkce E4.
K produkci adenovirových vektorů druhé generace je třeba, aby v důsledku amniocytovou funkce, kterou vektor sám neexprimuje, buďto inaktivace a/nebo delece, byla poskytnuta buněčnou linií. Pro tento účel mohou být amniocytové buněčné linie, které trvale exprimují E1A a E1B stabilně modifikovány transfekcí expresní kazety, která exprimuje genové produkty kódující jednu nebo více dalších adenovirových funkcí. Například k produkci druhé generace adenovirových vektorů, které mají, navíc k deleci genů ElA a E1B, také deleci E2A, E2B a/nebo E4 genu, se vhodný gen nebo geny vnesou transfekcí společně se selekčním markérem do E1Aa ElB-exprimující amniocytové buněčné linie. Buněčné klony, které navíc k expresi funkcí ElA a E1B také exprimují E2A, E2B t · · · » ·
-29a/nebo E4 funkce, pak mohou být užity k produkci vektorů druhé generace. geny E2 a/nebo E4 jsou obvykle pod transkripční kontrolou heterologního promotoru, které je buďto konstitutivně aktivní nebo může být regulován.
c) Produkce adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA
Adenovirové vektory s velkou kapacitou pro DNA jsou charakteristické delecí většiny nebo dokonce všech virových kódujících sekvencí. Tyto vektory výhodně obsahují jen virové úseky ITR a virový sbalovací signál. Adenovirové funkce poskytuje pomocný virus v trans. Byly popsány různé systémy pro produkci adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA. Společným rysem všech těchto systémů dosud popsaných a užívajících pomocný virus je to, že pomocný virus odpovídá replikačně defektnímu E1A- a ElB-deletovanému adenoviru. Pomocný virus obsahuje buďto úplný sbalovací signál (Mitani et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 3854-3858, 1995; Fisher et al., Virology 217, 11-22, 1996; Kumar-Singh a Chamberlain, Hum. Mol. Gent. 5, 913-921, 1996) nebo mutovaný sbalovací signál (Kochanek et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5731-5736, 1996). Ve druhém z uvedených příkladů je vektor výhodně sbalován do virových kapsid, protože pomocný virus obsahuje zeslabený sbalovací signál a tudíž je sbalování méně účinné. Alternativně je sbalovací signál pomocného viru „vystřižen pomocí rekombinázy po infekci producentské buněčné linie (Parks et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 13565-13570, 1996; Hardy et al., J. Virol. 71, 1842-1849, 1997). Například sbalovací signál pomocného viru může sousedit s loxP rozpoznávací sekvencí bakteriofága Pl. Exprese Cre rekombinázy bakteriofága Pl pak vede k vystřižení sbalovacího signálu pomocného viru. Avšak z důvodu absence sbalovacího • ··» · · · · ··· · ···« · ♦ · • · · · » · · · · ·
-30signálu pak nedochází ke sbalování pomocného viru do kapsidy. Gen pro Cre rekombinázu z bakteriofága Pl se vnese transfekcí společně se selekčním markérem do E1A- a ElB-exprimující amniocytové buněčné linie. Buněčné klony, které navíc k expresi funkcí E1A a E1B také exprimují funkci Cre bakteriofága Pl mohou být využity k produkci vektorů s velkou kapacitou pro DNA.
d) Produkce „deletovaných adenovirových vektorů „Deletované adenovirové vektory byly popsány jako vektory první generace, které mají loxP rozpoznávací sekvenci bakteriofága Pl umístěnou ve virovém genomu takovým způsobem, že po infekci Cre-exprimující 293 buňky, většina virových kódujících sekvencí nebo dokonce všechny virové kódující sekvence jsou deletovány rekombinací mezi loxP rozpoznávacími sekvencemi. Velikost genomu těchto vektorů je přibližně 9 kb. Kapacita pro příjem cizorodé DNA je obdobně přibližně 9 kb (Lieber et al., J. Virol, 70, 8944-8960, 1996). Pro použití k produkci deletovaných adenovirových vektorů se gen Cre rekombinázy z bakteriofága Pl vnese transfekcí společně se selekčním markérem do E1A- a ElB-exprimující amniocytové buněčná linie. Buněčné klony, které navíc k expresi funkcí E1A a E1B také exprimují funkci Cre bakteriofága Pl se pak využijí k produkci deletovaných Ad vektorů.
e) Produkce vektorů pro přenos genů s modifikovaným tropismem
Ve výhodném provedení vynálezu permanentní buněčná linie amniocytů se užívá k produkci vektorů pro přenos genů, kteréžto vektory mají modifikovaný tropismus. Tropismus viru
9r »»>· ·* »· * · * · « * · « « · · * · 9 9 t · · · · · 9
-31 a z něho odvozeného virového vektoru rozhoduje o tom, zda buňka určitého typu může být vektorem transdukována nebo nikoliv. Příjem (vstup) vektoru pro přenos genů do buňky je prvním krokem pro úspěšný genový přenos do buňky. Tropismus virového vektoru je tak esenciálním faktorem pro účinný in vitro nebo in vivo genový přenos do konkrétních buněk nebo tkání. Interakce povrchu virového vektoru (kapsidy v případě adenovirovového nebo AAV vektoru, virové „obálky v případě retrovirového nebo lentivirovového vektoru) s buněčnou membránou cílové buňky je nezbytná pro vstup do buňky. Ačkoliv přesný mechanismus vstupu virového vektoru do cílové buňky se někdy liší pro různé vektory, ve všech případech hraje nezbytnou úlohu interakce povrchových struktur virového vektoru (obvykle proteinové ligandy) se strukturami na povrchu cílové buňky (obvykle receptory nebo adhezní molekuly) . K příjmu adenovirových vektorů dochází například endocytózou zprostředkovanou receptorem. To znamená, že část adenovirové kapsidy se váže na buněčné receptory. V případě adenovirových vektorů odvozených z Ad2 nebo Ad5, podle znalostí stavu techniky, jde obvykle o vazbu „kulovité („knob) domény vláknitého proteinu na receptor coxsackie adenoviru (CAR) a část pentonové báze na integriny ανβ3 nebo ανβ5. Vazba „knob domény na CAR je podle znalostí stavu techniky nezbytná pro adhezi vektoru k buněčné membráně cílové buňky, zatímco vazba pentonové báze k integrinům je nezbytná pro internalizaci vektoru do cílové buňky.
Amniocytové buněčné linie mohou být využity k produkci vektorů s modifikovaným tropismem. To platí například pro produkci adenovirových vektorů první a druhé generace, adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA, deletovaných adenovirových vektorů, chimérických adenovirových vektorů, AAV vektorů, retrovirových a/nebo lentivirových vektorů. K
9* ·««!
• 9 9« «9 · ··» 9 · · · • · · · 9 999« 9 9 9 ·« 999 9 999 9 9
Β9· 99 9 999
999 99 49 ··· ·· 9999
-32produkci vektorů s modifikovaným tropismem v amniocytové buněčné linii mohou být užity různé strategie. Přitom strategie pro konkrétní modifikaci tropismu se mohou lišit pro různé vektory {např. adenovirovové vektory, AAV vektory, retrovirovové vektory). Společným rysem těchto strategií je to, že povrch konkrétního vektoru (virové kapsidy v případě adenovirových a AAV vektorů, virové obálky v případě retrovirovových a lentivirových vektorů) je změněn tak, že také vazba vektoru k cílové buňce je změněna. K příkladům modifikací adenovirových vektorů patří:
a) Výměna vláknitých proteinů mezi různými sérotypy: tak vznikají adenovirové vektory, jejichž kapsida nese vláknitý protein odlišného sérotypu. K příkladům patří záměna přirozeného vláknitého proteinu adenovirových vektorů odvozených ze sérotypu 2 vláknitým proteinem pocházejícím ze sérotypu 17 (Zabner et al., J. Virol. 73, 8689-8695, 1999) nebo ze sérotypu 9 (Roelvink et al.,
J. Virol. 70, 7614-7621, 1996). K dalším příkladům patří záměna přirozeného vláknitého proteinu adenovirových vektorů odvozených ze sérotypu 5 vláknitým proteinem pocházejícm ze sérotypu 7a (Gall et al., J. Virol, 70, 2116-2123, 1996) nebo ze sérotypu 3 (Stevenson et al.,
J. Virol. 71, 4782-4790, 1997; Krasnykh et al., J. Virol.
70, 6839-6846, 1996; Douglas et al., Neuromuscul. Disord.
7, 284-298, 1997).
b) Odstranění vláknitého proteinu: vláknitý protein může být odstraněn metodami genového inženýrství, takže pak k příjmu vektoru do buňky dochází výlučně prostřednictvím interakce pentonové báze nebo hexonového proteinu (Falgout et al., J. Virol. 62, 622-625, 1988; Legrand et al., J. Virol. 73, 907-919, 1999).
4* ···* ·· 99
9 9 9
9 99 9 9999 9 « 9 ·»·«·· 9 · » » · * 9 9 9 9 9 9 9»
999 >· ·· *·· *· 9999
-33c) Modifikace C konce vláknitého proteinu peptidem: K příkladům patří modifikace C konce polylysinovým peptidem (Yoshida et al., Hum. Gen Ther. 9, 2503-2515, 1998: Wickham et al., Nat. Biotechnol. 14, 1570-1573, 1996;
Wickham et al., J. Virol. 71, 8221-8229, 1997), polyhistidinovým peptidem (Douglas et al., Nat. Biotechnol. 17, 470-475, 1999) nebo gastrin-uvolňujícím peptidem (Michael et al., Gen Ther. 2, 660-668, 1995).
d) Modifikace částí „knob domény vláknitého proteinu inzercí (vložením) peptidů: K příkladům patří inzerce epitopu FLAG (Krasnykh et al., J. Virol. 72, 1844-1852, 1998) nebo inzerce peptidů RGD (Dmitriev et al., J. Virol. 72,
| 9706-9713, | 1998; Kasono | et al., | Clin Cancer | Res. 5, | |
| 2571-2579, | 1999). | ||||
| e) Modifikace | pentonové báze: | jedním | příkladem | je | nahrazení |
| motivu RGD v pentonové | bázi | motivem | LDV | s cílem |
zprostředkovat navázání vektoru na integriny α4β1 (Wickham et al., Gen Ther. 2, 750-756, 1995).
f) Modifikace hexonového proteinu: jedním příkladem je inzerce epitopu pocházejícího z polioviru typu 3 (Crompton et al., J. Gen. Virol. 75, 133-139, 1994).
Alternativní strategie, která může být užita ke změnění tropismu vektorů produkovaných v amniocytové buněčné linii je založena na použití ligandů, které zprostředkovávají vazbu vektoru na struktury buněčné membrány, jako jsou například buněčné receptory nebo adhezní molekuly. Tyto ligandy jsou peptidy, proteiny nebo protilátky. Ligandy mohou být navázány na povrchu vektorů různými způsoby. Navázání ligandů na povrch vektorů (kapsidy v případě adenovirovového nebo AAV vektoru) lze provést užitím protilátek nebo chemickým zesítěním („crosslinking). Při použití protilátek je možné užít takové • A ···· · · · · • · · · · ·
-34protilátky, jejichž specificita je namířena proti kapsidě vektoru (např. proti „knob doméně vláknitého proteinu). Alternativně, je možné užít protilátky, jejichž specificita je namířena proti epitopu, který byl vložen jako neoepitop (např. epitop FLAG nebo epitop myc) do kapsidy vektoru. Příklady jsou odborníkům dobře známy. Tak v publikaci Wickham et al., J. Virol. 70, 6831-6838, 1996 (anti-FLAG/anti-a-integrin); in Wickham et al., Cancer Immunol. Immunther. 45, 149-151, 1997; Harari et al., Gen Ther. 6, 801-807, 1999 (anti-FLAG/anti-Eselectin) byly popsány příklady použití bispecifické protilátky pro transdukci endotelových buněk, v publikacích Miller et al., Cancer Res. 58, 5738-5748, 1998; Blackwell et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 125, 856-863, 1999 (anti-Ad/anti-EGFR) pro transdukci nádorových buněk; v publikaci Wickham et al., J. Virol. 71, 7663-7669, 1997 (anti-FLAG/anti-CD3) pro transdukci T lymfocytů; v publikaci Tillman et al., J. Immunol. 162, 6378-6383, 1999 (antiCD40/anti-Ad) pro transdukci dendritických buněk. Příklady použití jednořetězcové protilátky se specificitou k jedné determinantě virové kapsidy, která je navázána k ligandu, byly popsány v publikacích Watkins et al., Gen Ther. 4, 1004-1012, 1997; in Goldman et al., Cancer Res. 57, 1447-1451, 1997; Rancourt et al., Clin. Cancer Res. 4, 2455-2461, 1998; Gu et al., Cancer Res. 59, 2608-2614, 1999; Rogers et al., Gen Ther. 4, 1387-1392, 1997 (anti-Ad/FGF2) popisujících transdukci nádorových buněk exprimujících FGF2-receptor; v publikacích Douglas et al., Nat. Biotechnol. 14, 1574-1578, 1996; Douglas et al., Neuromuscular Disord. 7, 284-298, 1997 (anti-Ad/Folat) popisujících transdukci nádorových buněk, které exprimovaly receptor kyseliny listové na buněčném povrchu.
V případě vektorů pro přenos genů, u kterých byl zrušen původní přirozený tropismus a byl nahrazen jiným tropismem,
-35např. vložením ligandu do „knob domény vláknitého proteinu z Ad5, je nutné modifikovat permanentní buněčnou linii amniocytů výhodně tak, aby trvale exprimovala receptor, který rozpoznává tento nový ligand (Douglas et al., Nat. Biotechnol. 17, 470-475, 1999). Je obdobně možné, aby se permanentní buněčná linie amniocytů užila k produkci vektorů pro přenos genů, které mají defekt v produkci jednoho nebo více strukturních proteinů. K tomu se užije komplementace konkrétních defektů vektoru pro genový přenos permanentní buněčnou linií amniocytů. Například adenovirové vektory, které mají mutaci v genu kódujícím vláknitý protein, mohou být produkovány v amniocytová buněčné linii, která komplementuje defekt vláknitého proteinu. Toho je dosaženo vnesením expresní kazety pro vláknitý protein do amniocytové buněčná linie a trvalou nebo indukovatelnou expresí vláknitého proteinu v amniocytové buněčné linii (Von Seggern et al., J. Gen. Virol. 79, 1461-1468, 1998). Vláknitý protein exprimovaný v amniocytové buněčné linii je přirozený, nemodifikovaný vláknitý protein nebo změněný protein, např. vláknitý protein s modifikovaným tropismem (Von Seggern et al., supra}. V permanentní buněčné linii amniocytů je také možné produkovat adenovirové vektory zcela postrádající vláknitý protein (Legrand et al., J. Virol., 73, 907-919, 1999; Von Seggern et al., J. Virol. 73, 1601-1608, 1999).
Použití E1A- a ElB-exprimující amniocytové buněčné linie je výhodné, protože na rozdíl od buněk 293 , nedochází k vytváření replikačně-kompetentních vektorů homologní rekombinací. Ve zvláštním provedení vynálezu je pro produkci vektorů pro přenos genů použita amniocytová buněčná linie přičemž je to buněčná linie podle předkládaného vynálezu.
·· «0
| Cell 51 | , 919, |
| 7, 726 | 1985), |
| fibrózy | (CFTR) |
| 679, | 1991), |
| al., J. | . Biol. |
Terapeutické geny
Produkty genů, konkrétně produkty terapeutických genů, které mohou být kódovány a exprimovány pomocí vektorů, produkovaných v transformovaných amniotických buňkách, čili v permanentní amniotické buněčná linii, jsou např. jakékoliv protein svalů, koagulační faktory, membránové proteiny nebo proteiny buněčného cyklu. K příkladům proteinů, které mohou být exprimovány vektory produkovanými v transformovaných amniocytech patří dystrofin (Hoffman et al., Cell 51, 919,
1987), faktor VIII (Wion et al., Nátuře 317, transmembránový regulátorový protein cystické fibrózy (CFTR) (Anderson et al., Science 251, ornitintranskarbamyláza (OTC) (Murakami et Chem., 263, 18437, 1988), alfal-antitrypsin (Fagerhol et al., in: Hum. Gent., vol. 11, Harris ed., Plenům, New York, p. 1, 1981). Geny kódující tyto proteiny jsou známé a mohou být klonovány z genomických nebo cDNA knihoven (bank). K příkladům dalších genů patří gen pro dystrofin (Lee et al., Nátuře 349, 334, 1991), gen faktoru VIII (Toole et al., Nátuře 312, 342
1984), CFTR gen (Rommens et al., Science 245, 1059, 1989,
Riordan et al., Science 245, 1066, 1989), OTC gen (Horwich et al., Science 224, 1066, 1984), a (Lemarchand et al., Proč. Nati,
1992).
gen pro alfal-antitrypsin Acad. Sci. USA, 89, 6482,
K příkladům dalších genů, které mohou být exprimovány vektory, které mohou být produkovány v transformovaných amniocytech, patří gen p53 užitečný pro léčení nádorových onemocnění (Wills et al., Hum. Gen Ther. 5, 1079, 1994,
Clayman et al., Cancer Res. 55, 1, 1995), gen Rb pro léčení cévních proliferativních nemocí (Chang et al., Science 267,
518, 1995), nebo gen pro thymidinkinázu z viru herpes simplex • · • · ··»· · · ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · « ·· ·· ··· ·· ····
-3Ί(HSV) typu 1 užitečný pro terapii nádorových onemocnění. Geny exprimované vektory produkovanými v transformovaných amniocytech nemusí vždy jen kódovat protein. Tak například mohou exprimovat funkční RNAs. K příkladům vhodných RNA patří antisense RNA (Magrath, Ann. Oncol. 5, Suppl 1), 67-70 1994, Milligan et al., Ann. NY Acad. Sci. 716, 228-241, 1994, Schreier, Pharma. Acta. Helv., 68, 145-159 1994), a také katalytická RNA (Cech, Biochem. Soc. Trans. 21, 229-234, 1993; Cech, Gen 135, 33-36, 1993; Long et al., FASEB J. 7, 25-30, 1993; Rosí et al., Pharm. Therap. 50, 245-254, 1991).
Vektory produkované v transformovaných amniocytech mohou, navíc k terapeutickým genům, obsahovat jakýkoliv reportérový gen, aby bylo možné lépe sledovat expresi vektoru. Příklady reportérových genů jsou známy ve stavu techniky a patří k nim například gen pro β-galaktosidázu (Fowler et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 1507, 1977).
Vektory, které mohou být produkovány v transformovaných amniocytech, mohou obsahovat více než jeden gen. Maximální počet genů, které mohou být vloženy v takových vektorech, závisí na kapacitě konkrétního vektoru a na velikosti genů.
Výběr promotorů, které řídí expresi terapeutických genů ve vektorech produkovaných v transformovaných amniocytech není kritický. Virové nebo nevirové promotory, které vykazují konstitutivní, tkáňově-specifickou nebo regulovatelnou aktivitu, mohou být užity pro expresi proteinů nebo funkční RNA. SV40 nebo cytomegalovirový promotor (Andersson et al., J. Biol. Chem. 264, 8222-8229, 1964) může být užit například pro konstitutivní expresi genu. Použití promotoru svalové kreatinkinázy (MCK) dovoluje tkáňově-specifickou expresi proteinu nebo funkční RNA v kosterním svalstvu a srdečním svalu. Genová exprese může být řízena kvantitativně a také • · ·· ···· · · ·· • · · · · · · ··· · ···· · · ····· · · · · ·
-38kvalitativně použitím regulovatelných systémů (Furth et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91, 9302-9306, 1994).
Do vektorů, které mohou být produkovány v transformovaných amniocytech, je možné vložit genetické elementy, které ovlivňují chování vektoru uvnitř recipientní (příjemcovské) buňky. K příkladům takových elementů patří elementy, které umožňují jaderné nasměrování vektorové DNA (Hodgson, Biotechnology 13, 222-225, 1995).
Vektory produkované takovým způsobem mohou být užity in vitro nebo in vivo. Genový přenos in vitro se uskutečňuje mimo tělo, např. přidáním vektoru k buňkám v buněčné kultuře nebo k primárním buňkám, které byly odebrány z těla pro účel genového přenosu. V případě genového přenosu in vivo může být vektor podáván různými způsoby, v závislosti na tkáni, která má být transdukována. Příkladem je injekce do arteriálního nebo žilního cévního systému, přímá injekce do relevantní tkáně (např. jater, mozku, svalu), instilace do relevantního orgánu (např. plic nebo gastrointestinálního traktu) nebo přímé podání na povrch (např. kůže, močový měchýř).
Cílem následujících obrázků a příkladů je podrobně ilustrovat vynález, aniž by jakkoliv omezily jeho rozsah.
Popis obrázků
Obr. 1 ukazuje schéma klonování: Obr. 1A znázorňuje formou diagramu jednotlivé kroky klonování plazmidu STK146. Obr. 1B znázorňuje levý konec genomu, představující asi 15 % genomu, adenoviru typu 5, zahrnující El RNA, kódující úseky, výchozí body E1A a E1B transkripce, a sestřihové akceptorové a sestřihové donorové místo, a • ·· ·· ···· ·· ·· ··· ··· · · · *
-39polyadenylační sekvenci, které jsou důležité pro klonování. Důležité je, že sestřihové donorové místo v poloze páru baží 3511 z Ad5 bylo zachováno při klonování plazmidu STK146, ale sestřihové akcpetorové místo a polyadenylační signál byly nahrazeny odpovídajícími funkcemi z SV40. Navíc E1A promotor z Ad5 byl nahrazen promotorem PGK. Takže STK146 obsahuje sekvenci Ad5from od páru baží 505 do 5322 a buněčné linie transformované tímto plazmidem neobsahují žádné sekvence Ad5, které jsou přítomny v adenovirových vektorech první nebo druhé generace nebo v pomocném viru loxP.
Obr. 2 ukazuje ostrůvky buněk (Obr. 2B a Obr. 2B) získané z amniocytů transformací adenovirovou funkcí El, a the buněčné linie N52.E6 (DSMZ ACC2416; Obr. 2C) a N52.F4 (Obr. 2D) klonované z jediné buňky. Je třeba si všimnout, že buněčné linie a jednobuněčné klony se liší morfologicky od amniocytů tím, že jsou obvykle menší a nedochází ke kontaktní inhibici při jejich růstu.
Obr. 3 ukazuje stav integrace STK146 v osmi různých El-transformovaných amniocytových buněčných liniích užitím Southernova přenosu („Southern blot).
Obr. 4 ukazuje ve formě tabulky produkci adenovirových vektorů první generace v různých klonovaných buněčných liniích na základě bfu („blue forming units, jednotek vytvářejících modré zabarvení} na jednu buňku a účinnost transfekce příslušné buněčné linie na základě vytváření plaků.
Obr. 5 ukazuje expresi E1A a E1B proteinů z Ad5 u jedenácti klonovaných amniocytových buněčných linií (Western přenos, „Western blot).
··· ·· ·· · · · · · · · · ·
-40Obr. 6 ukazuje časový průběh syntézy rekombinantních adenovirových vektorů ve dvou klonovaných buněčných liniích N52.E6 a N52.F4. Obr. 6A ukazuje syntézu adenovirového vektoru první generace, a Obr. 6B ukazuje syntézu adenovirového vektoru s velkou kapacitou pro DNA.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Klonování
Na obr. 1 je přehledně znázorněn celý postup klonování.
a) Plazmid STK136
Plazmid STK 136 obsahuje myší fosforglycerátkinázový promotor (sekvence id. č. 1; Adra et al., Gen 60, 65-74, 1987) v plazmidu pBluescript KsII (Stratagen) a byl připravena následujícím postupem:
3,5 μg plazmidu PGK-hAAT (Kay et al., Hepatology 21, 815-819, 1995) bylo naštěpeno EcoRV a a rozděleno podle velikosti na 1,5% agarózovém gelu. Pás velikosti 0,5 kb obsahující fragment promotoru PGK, který byl hledán, byl po obarvení ethidiumbromidem vyříznut a DNA byla elektroeluována. Současně pBluescript KSII byl štěpen EcoRV a HincII, a volné konce DNA byly defosforylovány. Po následné fenol/chloroformové extrakci a ethanolové precipitaci, ekvimolární množství těchto fragmentů DNA bylo ligováno a ·· · · · · · · · * • · · · · · · • · · · · · · · • · · · · · · • · ··· · · ··· ·
-41 transformováno do ultrakompetentních baktérií XL-2 Blue (Stratagen). Plazmidové klony byly charakterizovány štěpením restriktázami, a výsledný plazmid byl označen STK136 (izolát #6) .
b) Plazmid STK137
Plazmid STK137 obsahuje úplnou expresní kazetu El z Ad5 zahrnující 3' sestřihový signál a polyadenylační signál z SV40 a byl připraven následujícím postupem:
PCR amplifikace Ad5 sekvence bp 505-841 (PCR I) (Sekvence id. č. 2) ng plazmidů pXCl (Microbix) bylo amplifikováno společně se 400 ng každého z oligonukleotidů 27759 (Sekvence id. č. 3) a 27634 (Sekvence id. č. 4), 0,2 mM dNTPs a 1.25 U Pfu polymerázy v pufru obsahujícím: 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM Tris/HCl, pH 8,75, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton
X-100, 100 gg/ml BSA, v následujících podmínkách cyklování:
I: 10 minut při 94°C,
II: 1 minuta při 94°C, minuty při 50°C, minuty při 72°C,
III: 10 minut při 72°C.
Krok II byl opakován v 15 cyklech. DNA byla purifikována pomocí purifikační soupravy QIAquick PCR purification kit (Qiagen) podle pokynů výrobce a byla precipitována ethanolem.
Pro klonování PCR fragmentu, 2,5 pg pBluescript KSII bylo naštěpeno EcoRV, a volné konce DNA byly defosforylovány, ·· ·· ···· ·· ·· • · · · ···· ··· · · ··· · · · • « · · · ···· ·
-42ligovány v ekvimolárním množství s PCR fragmentem a transformováno do buněk XL-2 Blue. Takto získaný plazmid je označován dále jako #1.
PCR amplifikace Ad5 sekvence bp 3328-3522 (PCR II) Sekvence id. č. 5):
ng plazmidu pXCl (Microbix) bylo amplifikováno společně s 400 ng každého z oligonukleotidů 27635 (Sekvence id. č. 6) a 27636 (Sekvence id. č. 7) za podmínek popsaných již výše. Po provedení PCR byla DNA extrahována fenol/chloroformem, precipitována ethanolem, naštěpena EcoRI, opět extrahována fenol/chloroformem, precipitována a rozpuštěna ve 30 μΐ TE.
PCR amplifikace 3' sestřihového a polyadenylačního signálu z SV40 pomocí plazmidu pGL2-Basic, bp 1978-2749 (PCR III) (sekvence id. č. 8):
ng plazmidu pGL2-Basic (Promega, GenBank/EMBL Acc. No. : X65323) bylo amplifikováno společně s 800 ng každého z oligonukleotidů 27637 (sekvence id. č. 9) a 27638 (sekvence id. č. 10), 0,4 mM dNTPS a 2,5 U Pfu polymarázy za podmínek popsaných výše. Po provedení PCR DNA byla extrahována fenol/chloroformem, precipitována ethanolem, naštěpena EcoRI, opět extrahována fenol/chloroformem, precipitována v ethanolu a rozpuštěna ve 30 μΐ TE. Pak bylo 10 μΐ každé z DNA z PCR II a III ligováno v objemu50 μΐ, extrahováno fenol/chloroformem, precipitováno ethanolem a naštěpeno BamHI v objemu 100 μΐ. Po opakované fenol/chloroformové extrakci a ethanolové precipitaci, byla DNA ligována s ekvimolárním množstvím DNA pBluescript KSII, která byla před tím naštěpena BamHI a • · · ··· ·· ·· • · · · · · • · · · · · · • · · · ♦ ·
-43defosforylována. Takto získaný plazmid je označován dále jako #29. Pro další klonování, 3,5 gg plazmidu DNA #29 bylo naštěpeno SacII a BglII, defosforylováno, extrahováno fenol/chloroformem a precipitováno v ethanolu. Současně 3,5 gg pXCl bylo naštěpeno BglII a SacII, a fragment 2,9 kb byl frakcionován elektroforézou a pak elektroeluován. Ekvimolární množství obou DNA bylo ligováno a transformováno do buněk XL-2 Blue. Takto získaný plazmid je označován dále jako #5. Pro konečné klonování STK137, plazmid #1 byl štěpen HincII a BspEI a frakcionován elektroforézou, a fragment velikosti přibližně 350 bp byl elektroeluován. Jako vektorová DNA, plazmid #5 byl štěpen KspI (isoschizomer SacII), konce byly doplněny pomocí T4 polymerázy, a pak byly provedeny fenol/chloroformová extrakce a ethanolová precipitace. DNA pak byla naštěpena BspEI, konce byly defosforylovány, a opět byly provedeny fenol/chloroformová extrakce a ethanolová precipitace. Obě DNA byly ligovány a ligační směs pak transformována do buněk XL-2 Blue. Výsledný plazmid byl označen STK137 (izolát #34).
c) Plazmid STK146 (Sekvence id. č. 18)
Plazmid STK146 obsahuje myší PGK promotor, úplný úsek El z Ad5 (bp 505-3522) a 3' sestřihový a polyadenylační signál SV40.
Pro klonování, 4 pg STK137 bylo naštěpeno EcoRV a BamHI a rozděleno elektroforézou, a fragment velikosti 3,7 kb byl elektroeluován. Navíc 3,3 pg STK136 bylo naštěpeno EcoRV a BamHI, defosforylováno, extrahováno fenol/chloroformem a precipitováno ethanolem. Ekvimolární množství obou plazmidů bylo ligováno a transformováno do buněk XL-2 Blue. Výsledný plazmid byl označen STK139. Závěrečná sekvenční analýza STK139 • ·· ······ ·· ·· ··· ··· »··· • ··· · ···· · · · ·· ··· · ··· · ·
-44odhalila mutaci v poloze bp 2613 (číslování se vztahuje k sekvenci Ad5 DNA), která vedla k aminokyselinové záměně tyrosinu na asparagin (2613 TAC —> GAC). Z tohoto důvodu fragment obsahující mutaci v STK139 byl nahrazen BstEII (bp 1915)-BglII (bp 3328) fragmentem z pXCl. To bylo provedeno štěpením STK139 BstEII a BglII, defosforylací, fenol/chloroformovou extrakcí, ethanolovou precipitaci, rozdělením elektroforézou a elektroelucí fragmentu velikosti
5,8 kb. pXCl byl podobně naštěpen BstEII a BglII a rozdělen elektroforézou, a byl elektroeluován fragment velikosti 1,4 kb. Po ligaci a transformaci byla DNA ze 4 plazmidových
| klonů sekvencována; dva | z nich | obsahovaly | správnou | sekvenci |
| v pozici bp 2613. Izolát | č. 2 | byl zcela | sekvencován a byl | |
| označen jako STK146. | ||||
| d) Sekvencování STK146 | ||||
| 500 ng STK146 #2 | bylo | sekvencováno | užitím | 10 pmol |
následujících sekvenačních primerů ve standardních podmínkách:
Primer
| 28231 | Ad5 | nt. | 901-920 | (Sekvence | id. | č. | 11) |
| 28232 | Ad5 | nt. | 1301-1320 | (Sekvence | id. | č. | 12) |
| 28233 | Ad5 | nt. | 1701-1720 | (Sekvence | id. | č. | 13) |
| 28234 | Ad5 | nt. | 2100-2119 | (Sekvence | id. | č. | 14) |
| 28235 | Ad5 | nt. | 2500-2519 | (Sekvence | id. | č. | 15) |
| 28236 | Ad5 | nt. | 2853-2872 | (Sekvence | id. | č. | 16) |
| 28237 | Ad5 | nt. | 3249-3268 | (Sekvence | id. | č. | 17) |
• · ···· ·· ·· • · · · · · • · · · · · * • · · · · ·
-45Příklad 2
Kultivace primární amniocytová buněčné linie
Všechny reagencie pro buněčné kultury, média a séra byla zakoupena od GIBCO Life Technologies. Buněčná linie 293, která byla užita jako kontrola v některých experimentech byla kultivována v modifikovaném médium podle Eagleho (MEM) s 10% fetálním telecím sérem (FCS), lx penicilin/streptomycin při 37 °C (lOOx, katalog, č. 10378-016), 95% vlhkosti a 5% CO2. Nové El-transformované buněčné linie byly připraveny pomocí primárních fetálních buněk, které byly získány z amniotické tekutiny při amniocentéze prováděné při prenatální diagnostice. Po biopsii byly buňky přeneseny rutinními metodami do plastických kultivačních lahví a kultivovány v Hamově médiu F10 (živná směs podle Hama F10 s L-glutaminem, katalog, č. 31550-023), 10% FCS, 2% Ultroser® G, lx roztok antibiotika/antimycotika (lOOx, katalog. č. 15254-012), 2.5 μg/ml Fungizione® (amfotericin B, katalog, č. 15290-018). Některé buňky adherovaly ke dnu kultivační láhve a proliferovaly. Dostatečné množství buněk pro chromozomovou analýzu bylo k dispozici po 2 týdnech. Po stanovení karyotypu byly kultury amniocytů se správným počtem a normální strukturou chromozómů použity k přípravě buněčná linie. Buňky ze tří různých zdrojů, odebrané při amniocentéze před 3, 6 nebo 7 týdny, byly použity v různých experimentech. Jako živné médium bylo užito Hamovo médium F10 medium, s 10% FCS, 2% Ultroser®Cr, lx roztok antibiotika/antimykotika, 2,5 μg/ml Fungizione®. Kultivační podmínky byly 37°C, 95% vlhkost a 5% CO2. Sedm dní po transfekci byly amniocyty dále kultivovány v Hamově médiu F10 s 10% FCS, lx penicilin/streptomycin. Po vzniku buněčných klonů z jedné buňky, byly klony přeneseny na • · ·· ···· ·· ·· • ··· · · · · ··· · ···· · · * • ··· · ··· · » ··· ·· ·· ··· ·· ····
-46nové misky a kultivovány dále v médiu alfa-MEM s 10% FCS, lx penicilin/streptomycin.
Příklad 3
Transfekce a transformace amniocytů
Pro transfekci byly amniocyty vysety na misky pro buněčné kultury (průměr 60 mm, povrchová plocha 22,1 cm2) v hustotě 2 - 5 χ 105 na jednu misku a transfekovány následující den. Pro transfekci bylo 20 gg plazmidu STK146 naštěpeno Seal, extrahováno fenol/chloroformem, precipitováno ethanolem a rozpuštěno ve 20 μΐ TE, takže DNA koncentrace byla 0,5 μg/μl. V počátečních experimentech byly amniocyty transfekovány 3 nebo 7 týdnů po odebrání, vždy v 5 miskách, pomocí soupravy pro transfekci Effectene transfection kit podle pokynů výrobce (Qiagen) následujícím postupem:
μΐ STK146 naštěpené Seal bylo smícháno se 146 μΐ pufru EC. Po přidání 8 μΐ enhanceru byl roztok krátce vortexován a inkubován při teplotě místnosti 5 minut. Pak bylo přidáno 25 μΐ Effectene a po 10 vteřinovém vortexování pokračovala inkubace dalších 10 minut při teplotě místnosti. Přitom bylo médium opatrně odsáto z buněk a nahrazeno 4 ml čerstvého živného média (viz sekce 2 výše). Po ukončení inkubace byl k transfekční směsi přidán 1 ml čerstvého živného média a směs byla opatrně po kapkách přidána k buňkám. Buňky byly kultivovány dále jak bylo popsáno výše. Sedm dní po transfekci byly buňky z každé misky přeneseny na větší misky (průměr 150 mm, povrch 147,8 cm2). To bylo provedeno opatrným odsátím média, buňky byly opláchnuty PBS, uvolněny pomocí • · ·· ·· · · · ··· ·
-47trypsinu a přeneseny na nové misky a pak dále kultivovány jak bylo popsáno v sekci 2. 18 až 22 dnů po transfekci byly jasně patrné klonální ostrůvky buněk morfologicky odlišitelné od amniotických buněk (Obr. 2A, 2B) . Hlavní složku netransformováné amniocytové kultury tvořily velké buňky, které projevovaly při růstu kontaktní inhibici. Buňky v transformovaných koloniích z jedné buňky byly mnohem menší, rostly mnohem rychleji a neprojevovaly při růstu žádnou kontaktní inhibici. Rostly jako buněčné ostrůvky sestávající z menších buněk, které byly těsně nahloučeny, a pod světelným mikroskopem mohly být jednoznačně bez potíží identifikovány. Tyto ostrůvky byly odebrány a přeneseny na nové misky (průměr 60 mm) obsahující výše popsané médium. Po dalším růstu byly buněčné linie přeneseny na kultivační misky s plochou
147,8 cm2 a dále kultivovány jak bylo popsáno v části 2. Od prvního přenosu na misky s plochou 147,8 cm2 byly přenosy (pasáže) buněk počítány. Z počátku pokračovala kultivace přibližně 40 buněčných klonů z buněk, které byly transfekovány 3 a 7 týdnů po odebrání. Následně, tedy po prodloužené kultivaci, došlo k výrazné změně v morfologii některých buněčných klonů, a tyto klony jevily nestabilitu růstových charakteristik. Další experimenty byly omezeny na další kultivaci a analýzu osmi morfologicky stabilních buněčných linií. Tyto linie byly označeny následovně: GS.A55 (připraveny z amniocytů transfekovaných 3 týdny po odebrání), GS.N21, GS.N24, GS.N27, GS.N49, GS.N51, GS.N52, GS.N53 (připraveny z amniocytů transfekovaných 7 týdnů po odebrání ).
V průběhu prvních pasáží všechny buněčné klony vykazovaly srovnatelnou morfologii, ale to se v následujících pasážích změnilo. Tak například některé buněčné klony změnily tvar na velmi kulatý a po dalších pasážích dokonce již nebyly adherentní (přisedlé). Jiné buněčné klony jevily výraznou • ·r ν» ··»· Μ ·♦ • · · · · * · · · · • ··· * ···· · c ·
-48vakuolizaci, ale to nemělo žádný účinek na jejich růst. Po nakloňování z jedné buňky („single-cell klonování) jevily všechny buněčné linie uniformní morfologii a například N52.EG a N52.F4 měly epiteliální vzhled. Byly srovnatelné s buňkami 293, pokud jde o rychlost růstu a buněčnou hustotu.
Příklad 4
Účinnost transformace
Aby bylo možné přesněji stanovit účinnost transformace funkcí El, byla provedena transfekce sedmi nových misek, z nichž každá obsahovala 2-5 x 105 buněk, postupem popsaným v části 3. Buňky byly přeneseny již 24 hodin po transfekcí na misky velikosti 147,8 cm2 a dále byly 5 dnů kultivovány v Hamově médiu F-10 s 10% fetálním telecím sérem, 2% Ultroser® G, roztokem 1 x antibiotikum/antimykotikum, 2,5 gg/ml Fungizione a dalších 25 dnů v Hamově médiu s 10% fetálním telecím sérem, roztokem lx penicilin/streptomycin. Miska s netransfekovanými buňkami byla jakožto kontrola kultivována za stejných podmínek. V průběhu byly počítány morfologicky jasně rozlišitelné (viz Obr. 2A, B) kolonie vzniklé v důsledku jedině transfromační události. Klony vzniklé z jediné buňky byly patrné na všech kultivačních miskách kromě netransfekované kontrolní misky. V průměru byly 4 buněčné klony na jedné misce, což odpovídalo transformační účinnosti 1 z 0,5-1 x 105 buněk.
| • «0 • · 0 · 0 · | 00 • * • 0 | 0 »0 0 • « 0 | 09 40 0 · 0 4 0 |
| 4 0 0 < | 00 | 0 0 0 | 0 0 · · · |
-49Příklad 5
Klonování z jedné buňky
Jak již bylo uvedeno, některé buněčné linie jevily odlišné morfologické charakteristiky, což byl důvod, proč bylo až 10 linií založeno z každé buněčné linie. Pasáže jednotlivých buněčných linií byly odlišné v těchto případech: GS.A55: P17, GS.N21: P24, GS.N24: P20, GS.N27: P19, GS.N49: P21, GS.N51: P39, GS.N52: P22, GS.N53: P20. Pro tento účel byly buňky uvolněny z kultivačních misek, v koncentraci 5 x 106 buněk/ml, a naředěny 1:1000, 1:50 000 a 1:500 000 živným médiem. 100 μΐ buněk z každého ředění pak vyseto na 96-jamkové destičky, a buněčné klony, které jednoznačně vznikly z jediné buňky byly dále kultivovány. Obr. 2C ukazuje buněčnou linii GS.N52.E6 (DSMZ No.), a obr. 2D ukazuje buněčnou linii GS.N52.F4; přičemž oba buněčné klony pocházejí z původní buněčné linie GS.N52.
Příklad 6
Charakterizace buněčné linie El
a) Analýza metodou Southernova přenosu (Southern blot)
Analýzy metodou Southern blot byly provedeny, aby byl vyšetřen integrační stav úseku El v buněčné linii. Pro tento účel byla izolována genomická DNA ze všech osmi El amniotických klonů (viz část 5.), a 5 μg každé DNA bylo naštěpeno EcoRV, rozděleno elektroforézou a přeneseno na nylonovou membránu. EcoRV štěpí jedenkrát v expresní kazetě El. Hybridizace s radioaktivně značenou STK146 DNA potvrdila • 0 »00 ♦ » »0 ·
· · 4 * · ·
000 ··
4 4 ··· »0 • · » 4 · 4 • · »
4400
-50integraci 1 až 2 kopií STK146 ve všech klonech. Obr. 3 ukazuje integrační profil v El buněčných klonech. Jsou zde vidět dva hlavní pásy s vysokou molekulovou hmotností, evidentní pro všechny klony, které ukazují na integraci jediné kopie. Buněčné klony GS.N24 a GS.N52 ukázaly další pás s relativné silnou intenzitou, který by mohl ukazovat na integraci tandemu kopií STK146. Pro žádný buněčný klon se nevyskytl pás menší než STK146 naštěpený Seal a EcoRV, což ukazuje, že všechny integrované kopie byly úplné a nebyly deletované.
b) Příprava rekombinantních adenoviru
Po nakloňování z jedné buňky byly buněčné klony testovány na schopnost produkovat rekombinantní adenovirus. To se provádělo infikováním 3 až 5 „jedno-buněčných klonů pro každou linii při asi 70% konfluenci ve 24-jamkových destičkách AdPgal (rekombinantní adenovirovový vektor první generace) s infekcí 5 MOI (multiplicita infekce). 48 hodin po infekci byly buňky lyžovány třikrát opakovaným zmrazením a táním, a množství produkovaného AdPgal bylo pak analyzováno infikováním buněk 293 a následným obarvením (MacGregor et al., in: Gen Transfer and Expression Protocols, Murray ed. Humana, Clifton, NJ, vol. 7, pp. 217-235, (1991)) pro detekci tvorby β-galaktosidázy (Obr. 4) . Tato metoda dovoluje jen přibližné určení produkce rekombinantního adenoviru, protože počet buněk a tudíž množství viru použité pro různé klony se může lišit v důsledku rozdílů ve velikosti a rychlosti růstu. Buněčné klony, které poskytly nejvyšší výtěžek v prvním testu byly analyzovány přesněji v dalším experimentu. Ten byl proveden tak, že se vyselo přibližně 3 χ 107 buněk na 3 misky (průměr 100 mm, plocha 60 cm2) . Buňky byly spočteny následující den a byly infikovány přesně 5 MOI Adβgal na základě počtu
-51 nalezených buněk. 48 hodin po infekci byly buňky sklizeny a lyžovány třikrát opakovaným zmrazením a táním, a množství produkovaného Adpgal bylo pak analyzováno infikováním buněk 293 a následným obarvením. Výsledky jsou shrnuty na obr. 4.
c) Transfekční účinnost
Některé klonované buněčné linie byly testovány na tvorbu plaků. To se provádělo transfekci buněk při asi 70% konfluenci na kultivačních miskách (průměr 60 mm) užitím 2 μς infekčního plazmidu GS66 metodou s kalciumfosfátem. Plazmid GS66 obsahuje úplný adenovirový genome s delecí v úseku El od nukleotidu 440 do nukleotidu 3523. Sekvence adenovirovové terminální repetice (ITR) jsou v tomto plazmidu ohraničeny restrikčními místy Swal, takže infekční virus a plaky mohou vznikat po transfekci plazmidem naštěpeným Swal. 24 hodin po transfekci byly buňky převrstveny 10 ml média MEM s 1% agarózou, 0,5x penicilin/streptomycin, 0,05% kvasinkovým extraktem. Plaky byly viditelné po inkubaci ve 37 °C, 95% vlhkosti, 5% CO2 asi po jednom týdnu. Obr. 4 ukazuje počet plaků jako průměrnou hodnotu ze dvou nezávislých transfekci v každém případě.
d) Exprese funkcí E1A a ElB z Ad5
| Exprese proteinů Ad5-E1A a ElB-21kD v klonované buněčné | ||||
| linii byla | detekována | analýzou Western blot | pomocí | |
| monoklonální | protilátky. | |||
| Buňky | byly opatrně | odděleny od | kultivačních | misek |
(průměr 10 cm) do PBS/lmM EDTA, peletovány a přeneseny do
150 μΐ pufru obsahujícího 50 mM tris/HCl PH 8, 140 mM NaCl,
0,5% NP40, 4 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,5 mM PMSF a 5% glycerol.
• · · • · · ·
-52Buňky byly lyžovány rozdrcením (homogenizátor Dounce) a centrifugovány při 13000 rpm 10 minut, a koncentrace proteinu v supernatantu byla stanovena pomoci soupravy pro stanovení proteinu (BIORAD, Microassay Proceduře). 10 μg proteinu bylo rozděleno na 12% SDS polyakrylamidovém gelu a přeneseno na nitrocelulózovou membránu (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech) a inkubováno s protilátkou anti-ΕΙΑ nebo anti-ElB 21kD (Calbiochem, ředění 1:300). Následující den byla membrána (blot) opláchnuta a hybridizována s druhou anti-myší protilátkou (E1A) nebo anti-potkaní protilátkou (E1B), které byly konjugovány s křenovou peroxidázou. Reakce křenové peroxidázy byla zahájena inkubací ve stejných objemech zesilovacího roztoku 1 a 2 (souprava ECL, Amersham Pharmacia Biotech), a vznikající fotochemická reakce byla vizualizována krátkou expozicí na rentgenovém filmu. Obr. 5 ukazuje výsledky Western blot analýzy.
e) Časový průběh syntézy rekombinantních adenovirových vektorů první generace a adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA
Dvě klonované buněčné linie N52.E6 a N52.F4 ukázaly nejvyšší výtěžky rekombinantního adenovirového vektoru první generace ve výše popsaném experimentu. Další znalosti o průběhu jsou důležité pro optimalizaci produkce adenovirových vektorů, zvláště když jsou buňky adaptované pro suspenzní kultury a úspěšnost infekce nelze sledovat na základě cytopatického účinku. Pro tuto analýzu bylo infikováno několik misek (průměr 6 cm), každá s 3 χ 106 buňkami, 5 MOI AdPgal a sklizeny v uvedených časových bodech po infekci. Výtěžek rekombinantního adenoviru byl stanoven infikováním buněk 293, obarvením a spočítáním modrých buněk (Obr. 6 A).
• · V V « V • · · · • · • ·· ·· ··*
-53Do budoucna lze také počítat s užitím nových buněčných linií pro produkci adenovirových vektorů s velkou kapacitou DNA (viz výše). Produkce takových adenovirových vektorů vyžaduje pomocný virus, který v trans poskytuje deletované funkce a proteiny nutné pro lytický infekční cyklus. Sbalovací signál v takových pomocných virech je deletován pomocí loxP rozpoznávací sekvence Cre rekombinázy, která je exprimována buněčnou linií po infekci. V dalších experimentech budou nové El-transformované buněčné linie transfekovány Cre-exprimujícím plazmidem, takže budou trvale exprimovat rekombinázu.
V předběžných experimentech bylo testováno, zda nové El amniocyty jsou také vhodné k produkci adenovirových vektorů s velkou kapacitou pro DNA, a zda produkční kinetika a množství produkovaného vektoru odpovídá výsledkům dosahovaným se současnými existujícími Cre-exprimujícími buňkami 293. Pro tento účel bylo několik misek, každá s 3 χ 106 buňkami, buněčných linií N52.E6 a N52.F4 infikováno 5 MOI pomocného viru loxP a 10 MOI AdGS46 (β-gal-exprimující adenovirovový vektor s velkou kapacitou DNA) a byly sklizeny v uvedených časech po infekci. Výtěžky β-gal-exprimujícího adenovirového vektoru s velkou kapacitou DNA byly stanoveny infikováním buněk 293, obarvením a spočtením modrých buněk (Obr. 6B) . Množství adenovirového vektoru s velkou kapacitou DNA syntetizované v amniocytech odpovídalo množství, které je produkováno v Cre-exprimujících buňkách 293 buňky (data nejsou uvedena).
-54SEZNAM SEKVENCÍ
| <210> | 1 | |||||
| <211> | 513 | |||||
| <212> | DNA | |||||
| <213> | Myš, | fosfoglycerátkinázový | promotor | |||
| <400> | 1 | |||||
| 1 | GAATTCTACC | GGGTAGGGGA | GGCGCTTTTC | CCAAGGCAGT | CTGGAGCATG | |
| 51 | CGCTTTAGCA | GCCCCGCTGG | CACTTGGCGC | TACACAAGTG | GCCTCTGGCC | |
| 101 | TCGCACACAT | TCCACATCCA | CCGGTAGGCG | CCAACCGGCT | CCGTTCTTTG | |
| 151 | GTGGCCCCTT | CGCGCCACCT | TCTACTCCTC | CCCTAGTCAG | GAAGTTCCCC | |
| 201 | CCCGCCCCGC | AGCTCGCGTC | GTGCAGGACG | TGACAAATGG | AAGTAGCACG | |
| 251 | TCTCACTAGT | CTCGTGCAGA | TGGACAGCAC | CGCTGAGCAA | TGGAAGCGGG | |
| 301 | TAGGCCTTTG | GGGCAGCGGC | CAATAGCAGC | TTTGCTCCTT | CGCTTTCTGG | |
| 351 | GCTCAGAGGC | TGGGAAGGGG | TGGGTCCGGG | GGCGGGCTCA | GGGGCGGGCT | |
| 401 | CAGGGGCGGG | GCGGGCGCCC | GAAGGTCCTC | CGGAGGCCCG | GCATTCTCGC | |
| 451 | ACGCTTCAAA | AGCGCACGTC | TGCCGCGCTG | TTCTCCTCTT | CCTCATCTCC | |
| 501 | GGGCCTTTCG | ACC |
| <210> | 2 |
| <211> | 336 |
| <212> | DNA |
| <213> | Ad5 |
| <400> | 2 |
| 1 GAGTGCCAGC GAGTAGAGTT TTCTCCTCCG AGCCGCTCCG ACACCGGGAC | |
| 51 TGAAAATGAG ACATATTATC TGCCACGGAG GTGTTATTAC CGAAGAAATG | |
| 101 GCCGCCAGTC TTTTGGACCA GCTGATCGAA GAGGTACTGG CTGATAATCT | |
| 151 TCCACCTCCT AGCCATTTTG AACCACCTAC CCTTCACGAA CTGTATGATT |
201 TAGACGTGAC GGCCCCCGAA GATCCCAACG AGGAGGCGGT TTCGCAGATT • · · · • ·
-55251 TTTCCCGACT CTGTAATGTT GGCGGTGCAG GAAGGGATTG ACTTACTCAC
301 TTTTCCGCCG GCGCCCGGTT CTCCGGAGCC GCCTCAC <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 3
ATCGAGTGCC AGCGAGTAGA GTTTTCTCC 29 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 4
GTGAGGCGGC TCCGGAGAAC CG 22 <210> 5 <211> 216 <212> DNA <213> Ad5 <400> 5
CTCGCGGATC CAGATCTGGA AGGTGCTGAG GTACGATGAG ACCCGCACCA 51 GGTGCAGACC CTGCGAGTGT GGCGGTAAAC ATATTAGGAA CCAGCCTGTG 101
ATGCTGGATG TGACCGAGGA GCTGAGGCCC GATCACTTGG TGCTGGCCTG 151 CACCCGCGCT GAGTTTGGCT CTAGCGATGA AGATACAGAT TGAGGTACTG 201
AAATGGAATT CCGGTC
-56<210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Umělá sekvence
GACGCCAATT CCATTTCAGT ACCTCAATCT GT <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Umělá sekvence
CTCGCGGATC CAGATCTGGA AGGTGCTGA GG 32 <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
782
DNA
SV40 (pGL2basic), Genbank X65323
CGACTGAATT CAATTTTTAA GTGTATAATG TGTTAAACTA CTGATTCTAA
TTGTTTGTGT ATTTTAGATT CCAACCTATG GAACTGATGA ATGGGAGCAG
101 TGGTGGAATG CCTTTAATGA GGAAAACCTG TTTTGCTCAG AAGAAATGCC
151 ATCTAGTGAT GATGAGGCTA CTGCTGACTC TCAACATTCT ACTCCTCCAA
201 AAAAGAAGAG AAAGGTAGAA GACCCCAAGG ACTTTCCTTC AGAATTGCTA
251 AGTTTTTTGA GTCATGCTGT GTTTAGTAAT AGAACTCTTG CTTGCTTTGC
301 TATTTACACC ACAAAGGAAA AAGCTGCACT GCTATACAAG AAAATTATGG
351 AAAAATATTC TGTAACCTTT ATAAGTAGGC ATAACAGTTA TAATCATAAC
-57401 ATACTGTTTT TTCTTACTCC ACACAGGCAT AGAGTGTCTG CTATTAATAA
451 CTATGCTCAA AAATTGTGTA CCTTTAGCTT TTTAATTTGT AAAGGGGTTA
501 ATAAGGAATA TTTGATGTAT AGTGCCTTGA CTAGAGATCA TAATCAGCCA
551 TACCACATTT GTAGAGGTTT TACTTGCTTT AAAAAACCTC CCACACCTCC
601 CCCTGAACCT GAAACATAAA ATGAATGCAA TTGTTGTTGT TAACTTGTTT
651 ATTGCAGCTT ATAATGGTTA CAAATAAAGC AATAGCATCA CAAATTTCAC
701 AAATAAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCTAG TTGTGGTTTG TCCAAACTCA
751 TCAATGTATC TTATCATGTC TGGATCCGTC GA <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 9
CGACTGAATT CAATTTTTAA GTGTATAATG TG 32 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 10
TCGACGGATC CAGACATGAT AAGATAC 27 <210> 11 <211> 20 <212> DNA
-58• · · · * » • ·
<213>
<400>
Umělá sekvence
CCTTGTACCG GAGGTGATCG 20 <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Umělá sekvence
TGGCGCCTGC TATCCTGAGA 20 <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Umělá sekvence
TACATCTGAC CTCATGGAGG 20 <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Umělá sekvence
CAAGAATCGC CTGCTACTGT 20
<210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Umělá sekvence
GGCTGCAGCC AGGGGATGAT 20 <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Umělá sekvence
AGGGTTCGGG GCTGTGCCTT 20 <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
DNA
Umělá sekvence
CCTGAACGGG GTGTTTGACA 20 <210>
<211>
<212>
7090
DNA <213> Plasmid STK146 »« · · φ · · · · · • · · · · ’ • · · · · ·
-60GTGGCACTTT
TAAATACATT
GCTTCAATAA
TCGCCCTTAT
CCAGAAACGC
AGTGGGTTAC
TTCGCCCCGA
TGTGGCGCGG
CCGCATACAC
AAAAGCATCT
ATAACCATGA
AGGACCGAAG
CTCGCCTTGA
GAGCGTGACA
ATTAACTGGC
GGATGGAGGC
GCTGGCTGGT
CGGTATCATT
TTATCTACAC
ATCGCTGAGA
AGTTTACTCA
AAAGGATCTA
TAACGTGAGT
AGGATCTTCT
CAAAAAAACC
CCAACTCTTT
TCGGGGAAAT
CAAATATGTA
TATTGAAAAA
TCCCTTTTTT
TGGTGAAAGT
ATCGAACTGG
AGAACGTTTT
TATTATCCCG
TATTCTCAGA
TACGGATGGC
GTGATAACAC
GAGCTAACCG
TCGTTGGGAA
CCACGATGCC
GAACTACTTA
GGATAAAGTT
TTATTGCTGA
GCAGCACTGG
GACGGGGAGT
TAGGTGCCTC
TATATACTTT
GGTGAAGATC
TTTCGTTCCA
TGAGATCCTT
ACCGCTACCA
TTCCGAAGGT
GTGCGCGGAA
TCCGCTCATG
GGAAGAGTAT
GCGGCATTTT
AAAAGATGCT
ATCTCAACAG
CCAATGATGA
TATTGACGCC
ATGACTTGGT
ATGACAGTAA
TGCGGCCAAC
CTTTTTTGCA
CCGGAGCTGA
TGTAGCAATG
CTCTAGCTTC
GCAGGACCAC
TAAATCTGGA
GGCCAGATGG
CAGGCAACTA
ACTGATTAAG
AGATTGATTT
CTTTTTGATA
CTGAGCGTCA
TTTTTCTGCG
GCGGTGGTTT
AACTGGCTTC
CCCCTATTTG
AGACAATAAC
GAGTATTCAA
GCCTTCCTGT
GAAGATCAGT
CGGTAAGATC
GCACTTTTAA
GGGCAAGAGC
TGAGTACTCA
GAGAATTATG
TTACTTCTGA
CAACATGGGG
ATGAAGCCAT
GCAACAACGT
CCGGCAACAA
TTCTGCGCTC
GCCGGTGAGC
TAAGCCCTCC
TGGATGAACG
CATTGGTAAC
AAAACTTCAT
ATCTCATGAC
GACCCCGTAG
CGTAATCTGC
GTTTGCCGGA
AGCAGAGCGC
TTTATTTTTC
CCTGATAAAT
CATTTCCGTG
TTTTGCTCAC
TGGGTGCACG
CTTGAGAGTT
AGTTCTGCTA
AACTCGGTCG
CCAGTCACAG
CAGTGCTGCC
CAACGATCGG
GATCATGTAA
ACCAAACGAC
TGCGCAAACT
TTAATAGACT
GGCCCTTCCG
GTGGGTCTCG
CGTATCGTAG
AAATAGACAG
TGTCAGACCA
TTTTAATTTA
CAAAATCCCT
AAAAGATCAA
TGCTTGCAAA
TCAAGAGCTA
AGATACCAAA
TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG ·· · · · · ·» · · • · · · · · · • ···· · · ·
-61 TAGCACCGCC TACATACCTC
GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG
ACCGGATAAG GCGCAGCGGT
CCAGCTTGGA GCGAACGACC
CTATGAGAAA GCGCCACGCT
GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA
GAAACGCCTG GTATCTTTAT
GAGCGTCGAT TTTTGTGATG
CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT
CTCACATGTT CTTTCCTGCG
ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA
CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG
CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG
CCCGACTGGA AAGCGGGCAG
CACTCATTAG GCACCCCAGG
TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA
CATGATTACG CCAAGCGCGC
GGGTACCGGG CCCCCCCTCG
CGCTTTTCCC AAGGCAGTCT
CTTGGCGCTA CACAAGTGGC
GGTAGGCGCC AACCGGCTCC
TACTCCTCCC CTAGTCAGGA
GCAGGACGTG ACAAATGGAA
GACAGCACCG CTGAGCAATG
ATAGCAGCTT TGCTCCTTCG
GGTCCGGGGG CGGGCTCAGG
AGGTCCTCCG GAGGCCCGGC
GCTCTGCTAA TCCTGTTACC
TCTTACCGGG TTGGACTCAA
CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG
TACACCGAAC TGAGATACCT
TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG
CAGGAGAGCG CACGAGGGAG
AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA
CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC
TACGGTTCCT GGCCTTTTGC
TTATCCCCTG ATTCTGTGGA
TACCGCTCGC CGCAGCCGAA
AAGCGGAAGA GCGCCCAATA
ATTCATTAAT GCAGCTGGCA
TGAGCGCAAC GCAATTAATG
CTTTACACTT TATGCTTCCG
TAACAATTTC ACACAGGAAA
AATTAACCCT CACTAAAGGG
AGGTCATCGA ATTCTACCGG
GGAGCATGCG CTTTAGCAGC
CTCTGGCCTC GCACACATTC
GTTCTTTGGT GGCCCCTTCG
AGTTCCCCCC CGCCCCGCAG
GTAGCACGTC TCACTAGTCT
GAAGCGGGTA GGCCTTTGGG
CTTTCTGGGC TCAGAGGCTG
GGCGGGCTCA GGGGCGGGGC
ATTCTCGCAC GCTTCAAAAG
AGTGGCTGCT
GACGATAGTT
TGCACACAGC
ACAGCGTGAG
ACAGGTATCC
CTTCCAGGGG
CCTCTGACTT
TATGGAAAAA
TGGCCTTTTG
TAACCGTATT
CGACCGAGCG
CGCAAACCGC
CGACAGGTTT
TGAGTTAGCT
GCTCGTATGT
CAGCTATGAC
AACAAAAGCT
GTAGGGGAGG
CCCGCTGGCA
CACATCCACC
CGCCACCTTC
CTCGCGTCGT
CGTGCAGATG
GCAGCGGCCA
GGAAGGGGTG
GGGCGCCCGA
CGCACGTCTG
CCGCGCTGTT CTCCTCTTCC TCATCTCCGG GCCTTTCGAC CAGCTTGATA
TCGAGTGCCA GCGAGTAGAG TTTTCTCCTC CGAGCCGCTC CGACACCGGG
ACTGAAAATG AGACATATTA TCTGCCACGG AGGTGTTATT ACCGAAGAAA
TGGCCGCCAG TCTTTTGGAC CAGCTGATCG AAGAGGTACT GGCTGATAAT
CTTCCACCTC CTAGCCATTT TGAACCACCT ACCCTTCACG AACTGTATGA
TTTAGACGTG ACGGCCCCCG AAGATCCCAA CGAGGAGGCG GTTTCGCAGA
TTTTTCCCGA CTCTGTAATG TTGGCGGTGC AGGAAGGGAT TGACTTACTC
ACTTTTCCGC CGGCGCCCGG TTCTCCGGAG CCGCCTCACC TTTCCCGGCA
GCCCGAGCAG CCGGAGCAGA GAGCCTTGGG TCCGGTTTCT ATGCCAAACC
TTGTACCGGA GGTGATCGAT CTTACCTGCC ACGAGGCTGG CTTTCCACCC
AGTGACGACG AGGATGAAGA GGGTGAGGAG TTTGTGTTAG ATTATGTGGA
GCACCCCGGG CACGGTTGCA GGTCTTGTCA TTATCACCGG AGGAATACGG
GGGACCCAGA TATTATGTGT TCGCTTTGCT ATATGAGGAC CTGTGGCATG
TTTGTCTACA GTAAGTGAAA ATTATGGGCA GTGGGTGATA GAGTGGTGGG
TTTGGTGTGG TAATTTTTTT TTTAATTTTT ACAGTTTTGT GGTTTAAAGA
ATTTTGTATT GTGATTTTTT TAAAAGGTCC TGTGTCTGAA CCTGAGCCTG
AGCCCGAGCC AGAACCGGAG CCTGCAAGAC CTACCCGCCG TCCTAAAATG
GCGCCTGCTA TCCTGAGACG CCCGACATCA CCTGTGTCTA GAGAATGCAA
TAGTAGTACG GATAGCTGTG ACTCCGGTCC TTCTAACACA CCTCCTGAGA
TACACCCGGT GGTCCCGCTG TGCCCCATTA AACCAGTTGC CGTGAGAGTT
GGTGGGCGTC GCCAGGCTGT GGAATGTATC GAGGACTTGC TTAACGAGCC
TGGGCAACCT TTGGACTTGA GCTGTAAACG CCCCAGGCCA TAAGGTGTAA
ACCTGTGATT GCGTGTGTGG TTAACGCCTT TGTTTGCTGA ATGAGTTGAT
GTAAGTTTAA TAAAGGGTGA GATAATGTTT AACTTGCATG GCGTGTTAAA
TGGGGCGGGG CTTAAAGGGT ATATAATGCG CCGTGGGCTA ATCTTGGTTA
CATCTGACCT CATGGAGGCT TGGGAGTGTT TGGAAGATTT TTCTGCTGTG
CGTAACTTGC TGGAACAGAG CTCTAACAGT ACCTCTTGGT TTTGGAGGTT
TCTGTGGGGC TCATCCCAGG CAAAGTTAGT CTGCAGAATT AAGGAGGATT
ACAAGTGGGA ATTTGAAGAG CTTTTGAAAT CCTGTGGTGA GCTGTTTGAT
»♦·· ·· ·· • · · · · • · · · · · • · · · · • · · · «·* ·· ····
| TCTTTGAATC | TGGGTCACCA | GGCGCTTTTC | CAAGAGAAGG | TCATCAAGAC |
| TTTGGATTTT | TCCACACCGG | GGCGCGCTGC | GGCTGCTGTT | GCTTTTTTGA |
| GTTTTATAAA | GGATAAATGG | AGCGAAGAAA | CCCATCTGAG | CGGGGGGTAC |
| CTGCTGGATT | TTCTGGCCAT | GCATCTGTGG | AGAGCGGTTG | TGAGACACAA |
| GAATCGCCTG | CTACTGTTGT | CTTCCGTCCG | CCCGGCGATA | ATACCGACGG |
| AGGAGCAGCA | GCAGCAGCAG | GAGGAAGCCA | GGCGGCGGCG | GCAGGAGCAG |
| AGCCCATGGA | ACCCGAGAGC | CGGCCTGGAC | CCTCGGGAAT | GAATGTTGTA |
| CAGGTGGCTG | AACTGTATCC | AGAACTGAGA | CGCATTTTGA | CAATTACAGA |
| GGATGGGCAG | GGGCTAAAGG | GGGTAAAGAG | GGAGCGGGGG | GCTTGTGAGG |
| CTACAGAGGA | GGCTAGGAAT | CTAGCTTTTA | GCTTAATGAC | CAGACACCGT |
| CCTGAGTGTA | TTACTTTTCA | ACAGATCAAG | GATAATTGCG | CTAATGAGCT |
| TGATCTGCTG | GCGCAGAAGT | ATTCCATAGA | GCAGCTGACC | ACTTACTGGC |
| TGCAGCCAGG | GGATGATTTT | GAGGAGGCTA | TTAGGGTATA | TGCAAAGGTG |
| GCACTTAGGC | CAGATTGCAA | GTACAAGATC | AGCAAACTTG | TAAATATCAG |
| GAATTGTTGC | TACATTTCTG | GGAACGGGGC | CGAGGTGGAG | ATAGATACGG |
| AGGATAGGGT | GGCCTTTAGA | TGTAGCATGA | TAAATATGTG | GCCGGGGGTG |
| CTTGGCATGG | ACGGGGTGGT | TATTATGAAT | GTAAGGTTTA | CTGGCCCCAA |
| TTTTAGCGGT | ACGGTTTTCC | TGGCCAATAC | CAACCTTATC | CTACACGGTG |
| TAAGCTTCTA | TGGGTTTAAC | AATACCTGTG | TGGAAGCCTG | GACCGATGTA |
| AGGGTTCGGG | GCTGTGCCTT | TTACTGCTGC | TGGAAGGGGG | TGGTGTGTCG |
| CCCCAAAAGC | AGGGCTTCAA | TTAAGAAATG | CCTCTTTGAA | AGGTGTACCT |
| TGGGTATCCT | GTCTGAGGGT | AACTCCAGGG | TGCGCCACAA | TGTGGCCTCC |
| GACTGTGGTT | GCTTCATGCT | AGTGAAAAGC | GTGGCTGTGA | TTAAGCATAA |
| CATGGTATGT | GGCAACTGCG | AGGACAGGGC | CTCTCAGATG | CTGACCTGCT |
| CGGACGGCAA | CTGTCACCTG | CTGAAGACCA | TTCACGTAGC | CAGCCACTCT |
| CGCAAGGCCT | GGCCAGTGTT | TGAGCATAAC | ATACTGACCC | GCTGTTCCTT |
| GCATTTGGGT | AACAGGAGGG | GGGTGTTCCT | ACCTTACCAA | TGCAATTTGA |
GTCACACTAA GATATTGCTT GAGCCCGAGA GCATGTCCAA GGTGAACCTG ·· ♦»·· • 4 ·
4
| AACGGGGTGT | TTGACATGAC | CATGAAGATC | TGGAAGGTGC | TGAGGTACGA |
| TGAGACCCGC | ACCAGGTGCA | GACCCTGCGA | GTGTGGCGGT | AAACATATTA |
| GGAACCAGCC | TGTGATGCTG | GATGTGACCG | AGGAGCTGAG | GCCCGATCAC |
| TTGGTGCTGG | CCTGCACCCG | CGCTGAGTTT | GGCTCTAGCG | ATGAAGATAC |
| AGATTGAGGT | ACTGAAATGG | AATTCCTCTA | GTGATGATGA | GGCTACTGCT |
| GACTCTCAAC | ATTCTACTCC | TCCAAAAAAG | AAGAGAAAGG | TAGAAGACCC |
| CAAGGACTTT | CCTTCAGAAT | TGCTAAGTTT | TTTGAGTCAT | GCTGTGTTTA |
| GTAATAGAAC | TCTTGCTTGC | TTTGCTATTT | ACACCACAAA | GGAAAAAGCT |
| GCACTGCTAT | ACAAGAAAAT | TATGGAAAAA | TATTCTGTAA | CCTTTATAAG |
| TAGGCATAAC | AGTTATAATC | ATAACATACT | GTTTTTTCTT | ACTCCACACA |
| GGCATAGAGT | GTCTGCTATT | AATAACTATG | CTCAAAAATT | GTGTACCTTT |
| AGCTTTTTAA | TTTGTAAAGG | GGTTAATAAG | GAATATTTGA | TGTATAGTGC |
| CTTGACTAGA | GATCATAATC | AGCCATACCA | CATTTGTAGA | GGTTTTACTT |
| GCTTTAAAAA | ACCTCCCACA | CCTCCCCCTG | AACCTGAAAC | ATAAAATGAA |
| TGCAATTGTT | GTTGTTAACT | TGTTTATTGC | AGCTTATAAT | GGTTACAAAT |
| AAAGCAATAG | CATCACAAAT | TTCACAAATA | AAGCATTTTT | TTCACTGCAT |
| TCTAGTTGTG | GTTTGTCCAA | ACTCATCAAT | GTATCTTATC | ATGTCTGGAT |
| CCACTAGTTC | TAGAGCGGCC | GCCACCGCGG | TGGAGCTCCA | ATTCGCCCTA |
| TAGTGAGTCG | TATTACGCGC | GCTCACTGGC | CGTCGTTTTA | CAACGTCGTG |
| ACTGGGAAAA | CCCTGGCGTT | ACCCAACTTA | ATCGCCTTGC | AGCACATCCC |
| CCTTTCGCCA | GCTGGCGTAA | TAGCGAAGAG | GCCCGCACCG | ATCGCCCTTC |
| CCAACAGTTG | CGCAGCCTGA | ATGGCGAATG | GGACGCGCCC | TGTAGCGGCG |
| CATTAAGCGC | GGCGGGTGTG | GTGGTTACGC | GCAGCGTGAC | CGCTACACTT |
| GCCAGCGCCC | TAGCGCCCGC | TCCTTTCGCT | TTCTTCCCTT | CCTTTCTCGC |
| CACGTTCGCC | GGCTTTCCCC | GTCAAGCTCT | AAATCGGGGG | CTCCCTTTAG |
| GGTTCCGATT | TAGTGCTTTA | CGGCACCTCG | ACCCCAAAAA | ACTTGATTAG |
| GGTGATGGTT | CACGTAGTGG | GCCATCGCCC | TGATAGACGG | TTTTTCGCCC |
TTTGACGTTG GAGTCCACGT TCTTTAATAG TGGACTCTTG TTCCAAACTG
40·· ·· « • · » · · · * · · · · · · • · * · · · • · · · · « • · ··· 4 · ·«
| 6951 | GAACAACACT | CAACCCTATC | TCGGTCTATT | CTTTTGATTT | ATAAGGGATT |
| 7001 | TTGCCGATTT | CGGCCTATTG | GTTAAAAAAT | GAGCTGATTT | AACAAAAATT |
| 7051 | TAACGCGAAT | TTTAACAAAA | TATTAACGCT | TACAATTTAG |
Claims (20)
- NÁROKY-661. Permanentní buněčná linie amniocytů, které obsahují alespoň jednu nukleovou kyselinu, která exprimuje genové produkty adenovirových úseků E1A a E1B..
- 2. Buněčná linie podle nároku kyselina dále způsobuje adenovirových úseků E2A, rekombinázy.1, kde alespoň jedna nukleová expresi genových produktůE2B a/nebo E4 a/nebo Cre
- 3. Buněčná linie podle nároku 1 nebo 2, kde exprese genového produktu úseku E1A je pod kontrolou konstitutivního promotoru, výhodně promotoru fosfoglycerátkinázy (PGK).
- 4. Buněčná linie podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde exprese genového produktu (genových produktů) úseku E1B je pod kontrolou adenovirového promotoru, výhodně adenovirového E1B promotoru.
- 5. Buněčná linie podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde adenovirové genové produkty pocházejí z humánního adenoviru typu 5.
- 6. Buněčná linie podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, která je humánní buněčná linie.
- 7. Způsob přípravy permanentní buněčné linie amniocytů, vyznačující se tím, že zahrnuje krok transfekce amniocytů alespoň jednou nukleovou kyselinou, která způsobuje expresi adenovirových genových produktů úseku E1A a úseku E1B.> » · · » · • · » • Ť · · · • * · • · · » · · · * se tím, že se humánní primární ící se tím, že-678. Způsob podle nároku 7 vyznačující užijí primární amniocyty, konkrétně amniocyty.
- 9. Způsob podle nároku 7 nebo 8 vyznačuj nukleová kyselina se užije ve formě expresního vektoru.
- 10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 9 vyznačující se tím, že exprese genového produktu úseku E1A je pod kontrolou konstitutivního promotoru, výhodně promotoru fosfoglycerátkinázy (PGK), a exprese genového produktu (genových produktů) úseku E1B je pod kontrolou adenovirového promotoru, výhodně adenovirového E1B promotoru.
- 11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 10 vyznačující se tím, že transfekce amniocytů a/nebo výsledné buněčné linie navíc způsobuje expresi genových produktů adenovirových úseků E2A a/nebo E2B a/nebo E4 a/nebo Cre rekombinázy.
- 12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 7 až 11 vyznačující se tím, že adenovirové genové produkty pocházejí z humánního adenoviru typu 5.
- 13. Permanentní buněčná linie amniocytů, kterou lze připravit způsobem podle kteréhokoliv z nároků 7 až 12.
- 14. Permanentní buněčná linie amniocytů N52.E6 (DSM ACC2416).
- 15. Použití amniocytů pro přípravu adenovirem-transformované permanentní buněčné linie amniocytů.• · · · »h ·»··-6816. Použití adenovirových genových produktů úseků E1A a E1B pro přípravu permanentní buněčné linie amniocytů.
- 17. Použití permanentní buněčné linie amniocytů pro produkci vektorů pro přenos genů a/nebo adenovirových mutant.
- 18. Použití podle nároku 17 pro produkci adenovirových vektorů, vektorů AAV (adeno-asociované viry), retrovirových vektorů, lentivirových vektorů, chimérických vektorů adenovirus-AAV, chimérických vektorů adenovirus-retrovirus a/nebo chimérických vektorů adenovirus-lentivirus.
- 19. Použití podle nároku 18, kdy adenovirové vektory jsou adenovirové vektory první generace, adenovirové vektory druhé generace, adenovirové vektory s velkou kapacitou pro DNA a/nebo deletované adenovirové vektory.
- 20. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19 pro produkci vektorů pro přenos genů s modifikovaným tropismem a/nebo adenovirových mutant s modifikovaným tropismem.
- 21. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 20, kdy buněčná linie amniocytů je definována v kterémkoliv z nároků 1 až 6, 13 nebo 14.
- 22. Způsob produkce vektorů pro přenos genů a/nebo adenovirových mutant vyznačující se tím, že se užije permanentní buněčná linie amniocytů.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19955558A DE19955558C2 (de) | 1999-11-18 | 1999-11-18 | Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021709A3 true CZ20021709A3 (cs) | 2002-08-14 |
| CZ300124B6 CZ300124B6 (cs) | 2009-02-18 |
Family
ID=7929523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021709A CZ300124B6 (cs) | 1999-11-18 | 2000-11-07 | Permanentní bunecná linie amniocytu, zpusob její prípravy a její použití k produkci vektoru pro prenos genu |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1230354B1 (cs) |
| JP (1) | JP4456790B2 (cs) |
| CN (1) | CN100412201C (cs) |
| AT (1) | ATE257512T1 (cs) |
| AU (1) | AU784003B2 (cs) |
| CA (1) | CA2391591C (cs) |
| CZ (1) | CZ300124B6 (cs) |
| DE (2) | DE19955558C2 (cs) |
| DK (1) | DK1230354T3 (cs) |
| ES (1) | ES2211647T3 (cs) |
| HU (1) | HU227440B1 (cs) |
| IL (2) | IL149291A0 (cs) |
| PL (1) | PL205966B1 (cs) |
| PT (1) | PT1230354E (cs) |
| TR (1) | TR200400402T4 (cs) |
| WO (1) | WO2001036615A2 (cs) |
Families Citing this family (70)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1528101A1 (en) * | 2003-11-03 | 2005-05-04 | ProBioGen AG | Immortalized avian cell lines for virus production |
| WO2005080556A2 (en) | 2004-02-23 | 2005-09-01 | Crucell Holland B.V. | Virus purification methods |
| ATE412737T1 (de) | 2005-04-11 | 2008-11-15 | Crucell Holland Bv | Virusreinigung mit ultrafiltration |
| DE102005054628A1 (de) * | 2005-11-16 | 2007-05-24 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Verfahren zur Herstellung von permanenten humanen Zelllinien |
| CA2661748C (en) | 2006-08-28 | 2016-02-09 | Alex Eon-Duval | Process for the purification of fc-containing proteins |
| NZ593235A (en) | 2008-11-03 | 2013-02-22 | Crucell Holland Bv | Method for the production of recombinant adenovirus serotype 35 |
| DE102009003439A1 (de) | 2009-02-05 | 2010-08-26 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Neue permanente humane Zelllinie |
| ES2445713T3 (es) | 2009-10-15 | 2014-03-04 | Crucell Holland B.V. | Proceso para la purificación de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular |
| EP2488636B1 (en) | 2009-10-15 | 2014-03-12 | Crucell Holland B.V. | Method for the purification of adenovirus particles from high cell density cultures |
| CN102762721B (zh) | 2010-02-15 | 2015-03-11 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 用于生产Ad26腺病毒载体的方法 |
| AU2011307655B2 (en) | 2010-08-16 | 2015-12-17 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Permanent human amniocyte cell lines for producing influenza viruses |
| JP5969044B2 (ja) * | 2011-11-24 | 2016-08-10 | バイロメッド カンパニー リミテッド | アデノウイルス生産新規細胞株及びその用途 |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| PL2825640T3 (pl) | 2012-03-12 | 2016-10-31 | Partie rekombinowanych adenowirusów o zmienionych końcach | |
| WO2013139911A1 (en) | 2012-03-22 | 2013-09-26 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against rsv |
| EP2662451A1 (en) * | 2012-05-07 | 2013-11-13 | Stefan Kochanek | Nucleic acid construct and use of the same |
| US20150259387A1 (en) * | 2012-10-19 | 2015-09-17 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Production of a hcmv based vaccine in human amniocyte cell lines |
| EP2722337A1 (en) * | 2012-10-19 | 2014-04-23 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | Production of a HCMV based vaccine in human amniocyte cell lines |
| PT2988780T (pt) | 2013-04-25 | 2019-03-25 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Polipeptídeos f de pré-fusão do rsv solúveis estabilizados |
| CN105408348B (zh) | 2013-06-17 | 2021-07-06 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| WO2015000856A1 (de) | 2013-07-01 | 2015-01-08 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | Immortalisierte humane chorionzelllinie sowie verfahren zur immortalisierung humaner chorionzellen |
| CA2965562C (en) | 2014-11-04 | 2023-11-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Therapeutic hpv16 vaccines |
| EP3042952A1 (en) | 2015-01-07 | 2016-07-13 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | O-glycan sialylated recombinant glycoproteins and cell lines for producing the same |
| US10570417B2 (en) | 2015-04-14 | 2020-02-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter |
| EA035909B1 (ru) | 2015-07-07 | 2020-08-31 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv до слияния |
| EP3821906A1 (en) | 2015-07-07 | 2021-05-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against rsv comprising modified f polypeptide |
| EA037295B1 (ru) | 2015-08-20 | 2021-03-05 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Терапевтические вакцины против hpv18 |
| KR102500970B1 (ko) | 2016-04-05 | 2023-02-17 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Rsv에 대한 백신 |
| PH12022552125A1 (en) | 2016-04-05 | 2023-04-12 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized soluble pre-fusion rsv f proteins |
| SG11201808809PA (en) | 2016-05-02 | 2018-11-29 | Janssen Vaccine & Prevention B V | Therapeutic hpv vaccine combinations |
| CN109154000B (zh) | 2016-05-12 | 2022-07-05 | 扬森疫苗与预防公司 | 有效和平衡的双向启动子 |
| WO2017207480A1 (en) | 2016-05-30 | 2017-12-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion rsv f proteins |
| US11001858B2 (en) | 2016-06-20 | 2021-05-11 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
| US10744196B2 (en) | 2016-07-14 | 2020-08-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HPV vaccines |
| MX2019009316A (es) | 2017-02-09 | 2019-09-19 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Promotor corto y potente para la expresion de genes heterologos. |
| EP3382014A1 (en) | 2017-03-29 | 2018-10-03 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | Recombinant glycoproteins with reduced antennary fucosylation |
| US11229692B2 (en) | 2017-05-17 | 2022-01-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection |
| EA202090738A1 (ru) | 2017-09-15 | 2020-06-10 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Способ безопасного индуцирования иммунитета против rsv |
| WO2019086466A1 (en) | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus and uses thereof |
| AU2018357912B2 (en) | 2017-10-31 | 2023-11-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus and uses thereof |
| AU2018359492B2 (en) | 2017-10-31 | 2023-12-14 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus and uses thereof |
| SG11202003398SA (en) | 2017-10-31 | 2020-05-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Adenovirus vectors and uses thereof |
| PE20211469A1 (es) | 2018-11-13 | 2021-08-05 | Janssen Vaccines And Prevention B V | Proteinas f de prefusion del vrs estabilizadas |
| TWI852977B (zh) | 2019-01-10 | 2024-08-21 | 美商健生生物科技公司 | 前列腺新抗原及其用途 |
| EP3736286A1 (en) | 2019-05-09 | 2020-11-11 | Biotest AG | Single chain factor viii molecule |
| WO2020229579A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Prophylactic treatment of respiratory syncytial virus infection with an adenovirus based vaccine |
| AU2020275455A1 (en) | 2019-05-15 | 2021-12-09 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine |
| EP3785726A1 (en) | 2019-09-02 | 2021-03-03 | Biotest AG | Factor viii protein with increased half-life |
| AU2020342349A1 (en) | 2019-09-02 | 2022-03-03 | Biotest Ag | Factor VIII protein with increased half-life |
| BR112022005268A2 (pt) | 2019-10-03 | 2022-08-16 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Vetores adenovirais e usos dos mesmos |
| AU2020385683A1 (en) | 2019-11-18 | 2022-06-30 | Janssen Biotech, Inc. | Vaccines based on mutant CALR and JAK2 and their uses |
| TW202144388A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途 |
| TW202144389A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途 |
| WO2021165226A1 (en) | 2020-02-17 | 2021-08-26 | Biotest Ag | Subcutaneous administration of factor viii |
| EP4176087A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-05-10 | Janssen Biotech, Inc. | A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment |
| US12295997B2 (en) | 2020-07-06 | 2025-05-13 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate neoantigens and their uses |
| WO2022009049A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-13 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate neoantigens and their uses |
| HRP20250766T1 (hr) | 2020-10-15 | 2025-08-15 | F. Hoffmann - La Roche Ag | Konstrukti nukleinske kiseline za transkripciju va rna |
| MX2023004178A (es) | 2020-10-15 | 2023-05-03 | Hoffmann La Roche | Construcciones de acido nucleico para la activacion simultanea de genes. |
| KR20240099288A (ko) | 2021-10-18 | 2024-06-28 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 아데노바이러스-연관 바이러스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 진핵세포 |
| EP4508241A1 (en) | 2022-04-13 | 2025-02-19 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for determining aav genomes |
| WO2023227438A1 (en) | 2022-05-23 | 2023-11-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Raman-based method for the differentiation of aav particle serotype and aav particle loading status |
| CN119301260A (zh) | 2022-06-03 | 2025-01-10 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于生产重组aav颗粒的方法 |
| AR129895A1 (es) | 2022-07-14 | 2024-10-09 | Hoffmann La Roche | Método para producir partículas de aav recombinantes |
| WO2024056561A1 (en) | 2022-09-12 | 2024-03-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for separating full and empty aav particles |
| CN120641755A (zh) | 2023-02-07 | 2025-09-12 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测抗aav颗粒抗体的方法 |
| WO2024194280A1 (en) | 2023-03-21 | 2024-09-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of recombinant aav particle preparations |
| CN117487761A (zh) * | 2023-09-25 | 2024-02-02 | 南京农业大学 | 表达Cre基因猪骨髓巨噬细胞系的构建方法及其应用 |
| WO2025158316A1 (en) | 2024-01-26 | 2025-07-31 | Janssen Biotech, Inc. | Ovarian neoantigens and use thereof |
| WO2025168663A1 (en) | 2024-02-09 | 2025-08-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing recombinant adeno-associated viral particles |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI0833934T2 (sl) * | 1995-06-15 | 2013-04-30 | Crucell Holland B.V. | Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji |
-
1999
- 1999-11-18 DE DE19955558A patent/DE19955558C2/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-11-07 PT PT00979539T patent/PT1230354E/pt unknown
- 2000-11-07 CN CNB008159017A patent/CN100412201C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 EP EP00979539A patent/EP1230354B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 HU HU0203387A patent/HU227440B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-11-07 JP JP2001538494A patent/JP4456790B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 PL PL357495A patent/PL205966B1/pl unknown
- 2000-11-07 AT AT00979539T patent/ATE257512T1/de active
- 2000-11-07 IL IL14929100A patent/IL149291A0/xx active IP Right Grant
- 2000-11-07 WO PCT/EP2000/010992 patent/WO2001036615A2/de active IP Right Grant
- 2000-11-07 CA CA002391591A patent/CA2391591C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 TR TR2004/00402T patent/TR200400402T4/xx unknown
- 2000-11-07 AU AU16990/01A patent/AU784003B2/en not_active Expired
- 2000-11-07 CZ CZ20021709A patent/CZ300124B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-11-07 ES ES00979539T patent/ES2211647T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 DE DE50004995T patent/DE50004995D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-07 DK DK00979539T patent/DK1230354T3/da active
-
2002
- 2002-04-23 IL IL149291A patent/IL149291A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19955558A1 (de) | 2001-06-07 |
| CA2391591A1 (en) | 2001-05-25 |
| DE19955558C2 (de) | 2003-03-20 |
| CN100412201C (zh) | 2008-08-20 |
| CZ300124B6 (cs) | 2009-02-18 |
| WO2001036615A2 (de) | 2001-05-25 |
| AU784003B2 (en) | 2006-01-12 |
| PL357495A1 (en) | 2004-07-26 |
| PL205966B1 (pl) | 2010-06-30 |
| HUP0203387A3 (en) | 2005-07-28 |
| WO2001036615A3 (de) | 2002-01-10 |
| CA2391591C (en) | 2008-12-30 |
| PT1230354E (pt) | 2004-04-30 |
| JP2003514526A (ja) | 2003-04-22 |
| CN1433476A (zh) | 2003-07-30 |
| IL149291A (en) | 2008-11-26 |
| DK1230354T3 (da) | 2004-03-22 |
| HUP0203387A2 (hu) | 2002-12-28 |
| ES2211647T3 (es) | 2004-07-16 |
| ATE257512T1 (de) | 2004-01-15 |
| AU1699001A (en) | 2001-05-30 |
| EP1230354A2 (de) | 2002-08-14 |
| EP1230354B1 (de) | 2004-01-07 |
| TR200400402T4 (tr) | 2004-03-22 |
| JP4456790B2 (ja) | 2010-04-28 |
| HU227440B1 (en) | 2011-06-28 |
| DE50004995D1 (de) | 2004-02-12 |
| IL149291A0 (en) | 2002-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU784003B2 (en) | Permanent amniocyte cell line, the production thereof and its use for producing gene transfer vectors | |
| US6558948B1 (en) | Permanent amniocytic cell line, its production and use for the production of gene transfer vectors | |
| ES2966692T3 (es) | Vectores de virus adenoasociados poliploides y métodos de fabricación y uso de los mismos | |
| US20090098599A1 (en) | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use | |
| Wu et al. | A 50-kDa membrane protein mediates sialic acid-independent binding and infection of conjunctival cells by adenovirus type 37 | |
| KR20010034487A (ko) | 섬유 혹의 ｈｉ 루프내에 이종성 펩타이드 에피토프를함유하는 아데노바이러스 벡터 | |
| US7456008B2 (en) | Modified virus comprising one or more non-native polypeptides | |
| AU2001270879A1 (en) | Modified virus having altered tropism | |
| KR20190118163A (ko) | 가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 유전자 요법 | |
| WO2000042208A1 (en) | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use | |
| AU2001263689B2 (en) | Modified bovine adenovirus having altered tropism | |
| AU2001263689A1 (en) | Modified bovine adenovirus having altered tropism | |
| de Vrij et al. | Enhanced transduction of CAR-negative cells by protein IX-gene deleted adenovirus 5 vectors | |
| Murakami et al. | Chimeric adenoviral vectors incorporating a fiber of human adenovirus 3 efficiently mediate gene transfer into prostate cancer cells | |
| KR102208879B1 (ko) | 핵산 구조 및 이의 용도 | |
| FR2860004A1 (fr) | Nouveau vecteur adenoviral pour l'infection de cellules deficientes ou depourvues en recepteurs car | |
| DE29924144U1 (de) | Permanente Amniozyten-Zelllinie | |
| Mei et al. | Highly heterogeneous fiber genes in the two closely related adenovirus genome types Ad35p and Ad34a | |
| HK40061867A (en) | Recombinant newcastle disease virus, preparation method, recombinant plasmid and application thereof | |
| Class et al. | Patent application title: NUCLEIC ACID CONSTRUCT AND USE OF THE SAME Inventors: Stefan Kochanek (Ulm, DE) Stefan Kochanek Tanja Lucas (Regensburg, DE) Claudia Kueppers (Weil Am Rhein, DE) | |
| CN113462657A (zh) | 重组新城疫病毒及制备方法、重组质粒、及其应用 | |
| Fishbein et al. | 879. Transduction Enhancement by the Adenovirus/Polymer Complexes Derivatized with Protein Transduction Domain Peptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20181107 |