HU226327B1 - Process for producing (1s,4r)- or (1r,4s)-4-(2-amino-6-chloro-9h-purin-9-yl)-2-cyclopentene-1-methanol - Google Patents

Process for producing (1s,4r)- or (1r,4s)-4-(2-amino-6-chloro-9h-purin-9-yl)-2-cyclopentene-1-methanol Download PDF

Info

Publication number
HU226327B1
HU226327B1 HU9801083A HUP9801083A HU226327B1 HU 226327 B1 HU226327 B1 HU 226327B1 HU 9801083 A HU9801083 A HU 9801083A HU P9801083 A HUP9801083 A HU P9801083A HU 226327 B1 HU226327 B1 HU 226327B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
amino
formula
cyclopentene
carried out
process according
Prior art date
Application number
HU9801083A
Other languages
English (en)
Inventor
Christine Dr Bernegger
Eva Maria Urban
Olwen Mary Dr Birch
Kurt Burgdorf
Frank Brux
Kay-Sara Etter
Pierre Dr Bossard
Walter Dr Brieden
Laurent Dr Duc
John Gordon
Colm Dr O'murchu
Yves Dr Guggisberg
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of HU9801083D0 publication Critical patent/HU9801083D0/hu
Publication of HUP9801083A2 publication Critical patent/HUP9801083A2/hu
Publication of HUP9801083A3 publication Critical patent/HUP9801083A3/hu
Publication of HU226327B1 publication Critical patent/HU226327B1/hu

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/26Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32Nitrogen atom
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/16Preparation of optical isomers
    • C07C231/18Preparation of optical isomers by stereospecific synthesis
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00Carboxylic acid amides
    • C07C233/01Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/23Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06Esters of carbamic acids
    • C07C271/08Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/24Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/56Ring systems containing three or more rings
    • C07D209/80[b, c]- or [b, d]-condensed
    • C07D209/94[b, c]- or [b, d]-condensed containing carbocyclic rings other than six-membered
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/40Heterocyclic compounds containing purine ring systems with halogen atoms or perhalogeno-alkyl radicals directly attached in position 2 or 6
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001Amines; Imines
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07BGENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07Optical isomers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/10Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being unsaturated

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 3 lap ábra)
HU 226 327 Β1
R1 jelentése 1-4 szénatomos alkil-, 1-4 szénatomos alkoxi-, benzil-, fenil-, benzil-oxi- vagy fenil-oxi-csoport, majd a második lépésben a kapott vegyületet az (V) általános képletű ciklopenténszármazékká redukálják, majd a harmadik lépésben a kapott vegyületeket
N-acetil-amino-alkohol-hidroláz hatású enzimet termelő mikroorganizmus vagy penicillin G-aciláz segítségével (VI) vagy (VII) képletű vegyületekké alakítják, majd a negyedik lépésben a fentiek szerint kapott vegyületet (Vili) képletű N-(2-amino-4,6-diklór-pirimidin)-5-il)-formamiddal a (IX) vagy a (X) képletű (1S,4R)- vagy (1R,4S)-4-[(2-amino-6-klór-5-formamido-4-pirimidinil)amino]-2-ciklopentén-1-metanollá alakítják, majd az ötödik lépésben az így kapott vegyületeket az (I) vagy a (II) képletű vegyületekké ciklizálják.
A találmány szerinti eljárással kapott vegyületek közbenső termékként 2-amino-purin-nukleozidok előállításához alkalmazhatók.
A találmány tárgyát új eljárás képezi az (I) vagy (II) képletű (1S,4R)- vagy (1R,4S)-4-[(2-amino-6-klór-9Hpurin-9-il]-2-ciklopentén-1-metanol előállítására. Az (1 S,4R)-4-[(2-amino-6-klór-9H-purin-9-il]-2-ciklopentén-1-metanol fontos közbenső termék a 2-amino-purín-nukleozidok előállítása, így például az (1S,4R)-4[2-amino-6-(ciklopropil-amino)-9H-purin-9-il]-2-ciklopentén-1-metanol szintézise során (WO 95/21 161), vagy az 1592U89 jelzésű vegyület előállításánál [J. Org. Chem., 61, 4192-4193, (1996); J. Org. Chem., 61, 7963-7966(1996)].
A WO95/21161 számú nemzetközi közrebocsátási iratban eljárást ismertetnek (1S,4R)-4-[(2-amino-6-klór9H-purin-9-il]-2-ciklopentén-1-metanol előállítására, ahol kiindulási anyagként (1S,4R)-4-amino-2-ciklopentén-1-metanolt használnak. Ezen eljárás hátránya, hogy az (1 S,4R)-4-amino-2-ciklopentén-1 -metanol-adduktot kizárólag a költséges BOC-védőcsoporttal (terc-butiloxi-karbonil-védőcsoport) szubsztituált (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-on-származékon keresztül lehet előállítani [J. Org. Chem., 60, 4602-4616 (1995)].
A találmány feladata egyszerű, gazdaságos és előnyös eljárás kidolgozása (1S,4R)- vagy (1R,4S)-4[(2-amino-6-klór-9H-purin-9-il]-2-ciklopentén-1-metanol előállítására.
A fenti feladatot a találmány szerint úgy oldottuk meg, hogy első lépésben a (III) képletű (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-ont (IV) általános képletű (±)-2aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-on-származékká acilezzük (e képletben R1 jelentése 1-4 szénatomos alkil-, 1-4 szénatomos alkoxi-, benzil-, fenil-, benzil-oxi- vagy fenil-oxi-csoport), majd a második lépésben a kapott vegyületeket (V) általános képletű ciklopenténszármazékká redukáljuk, majd harmadik lépésben a kapott vegyületeket N-acetil-amino-alkohol-hidroláz hatású enzimet termelő olyan mikroorganizmus segítségével, amely képes az (V) általános képletű származékot egyetlen nitrogén- vagy egyetlen szénforrásként, vagy egyetlen szén- és nitrogénforrásként hasznosítani, vagy penicillin G-aciláz segítségével (VI) vagy (VII) képletű (1R,4S)- vagy (1S,4R)-1-amino-4-(hidroxi-metil)-2-ciklopentén-vegyületekké alakítjuk, majd negyedik lépésben a fentiek szerint kapott vegyületet (Vili) képletű N-(2-amino-4,6-diklór-pirimidin)-5-il)-formamiddal (IX) vagy (X) képletű (1S,4R)- vagy (1R,4S)-4[(2-amino-6-klór-5-formamido-4-pirimidinil)-amino]-2ciklopentén-1-metanollá alakítjuk, majd ötödik lépésben az így kapott vegyületeket (I) vagy (II) képletű vegyületté ciklizáljuk.
A találmány szerinti eljárás első lépésében úgy járunk el, hogy a (III) képletű (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept5-én-3-ont (IV) általános képletű (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-on-származékká acilezzük, ahol a képletben R1 jelentése a fent megadott.
Az 1-4 szénatomos alkilcsoport lehet szubsztituált vagy szubsztituálatlan. Szubsztituált 1-4 szénatomos alkilcsoporton a leírásban halogénatommal szubsztituált 1-4 szénatomos alkilcsoportot értünk. Halogénatomként alkalmazható fluoratom, klóratom, brómatom vagy jódatom. Az 1-4 szénatomos alkilcsoportokra példaként említjük meg a metil-, etil-, propil-, butil-, izobutil-, terc-butil-, izopropil-, klór-metil-, bróm-metil-, diklórmetil- és dibróm-metil-csoportot. 1-4 szénatomos alkilcsoportként előnyösen metil-, etil-, propil-, butil-, izobutil- vagy klór-metil-csoport szerepel.
1-4 szénatomos alkoxicsoportként például metoxi-, etoxi-, propoxi-, butoxi-, terc-butoxi- vagy izobutoxicsoport alkalmazható. Előnyösen 1-4 szénatomos alkoxicsoportként terc-butoxi-csoport szerepel.
A (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-on addukt előállítható az EP-A 0 508 3 52 számú szabadalmi leírásban ismertetett megoldás szerint.
Az acilezést végezhetjük (XI) általános képletű karbonsav-halogeniddel vagy (XII) általános képletű karbonsavanhidriddel, ahol a képletekben R1 jelentése a fentiekben megadottal azonos és X jelentése halogénatom. X helyében álló halogénatomként szerepelhet fluoratom, klóratom, brómatom vagy jódatom. Előnyösen klóratomot vagy fluoratomot használunk.
A karbonsav-halogenidekre példaként említjük meg az acetil-kloridot, klór-acetil-kloridot, vajsav-kloridot, izovajsav-kloridot, fenil-ecetsav-kloridot, klór-hangyasavbenzil-észtert (CBz-CI), propionsav-kloridot, benzoil-kloridot, klórhangyasav-allil-észtert vagy terc-butil-oxi-karbonil-fluoridot. A karbonsavanhidridekre példaként említjük meg a terc-butoxi-karbonilanhidridet, vajsavanhidridet, ecetsavanhidridet és propionsavanhidridet.
Az acilezés elvégezhető oldószer nélkül vagy aprotonos oldószer jelenlétében.
Előnyösen az acilezést egy aprotonos oldószerben végezzük. Aprotonos oldószerként számításba jöhet például diizopropil-éter, piridin, acetonitril, dimetilformamid, trietil-amin, tetrahidrofurán, toluol, metilénklorid, N-metil-pirrolidon, valamint ezek elegyei. Az aci2
HU 226 327 Β1 lezést célszerűen -80 és 50 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 0 és 25 °C között végezzük.
A találmány szerinti eljárás második lépésében a kapott (IV) általános képletű (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5én-3-on-származékot az (V) általános képletű ciklopenténszármazékká redukáljuk, ahol a képletben R1 jelentése a fentiekben megadott.
A redukciót célszerűen alkálifém- vagy alkáliföldfém-bór-hidriddel, egy alkálifém- vagy alkáliföldfémalumínium-hidriddel vagy vitriddel [nátrium-bisz(2-metoxi-etoxi)-alumínium-hidrid] végezzük. Alkálifém-alumínium-hidridként alkalmazható nátrium- vagy káliumalumínium-hidrid. Alkálifém-bór-hidridként használhatunk nátrium- vagy kálium-bór-hidridet. Alkáliföldfémbór-hidridként alkalmazhatunk kalcium-bór-hidridet. Nitridként alkalmazható például alumínium-nitrid.
A redukciót célszerűen protonos oldószerben végezzük. Protonos oldószerként alkalmazhatók rövid szénláncú alifás alkoholok, mint metanol, etanol, propanol, izopropanol, butanol, szek-butanol, terc-butanol, izobutanol vagy víz, illetőleg ezen alkoholok és víz elegyei.
A redukciót célszerűen -40 °C és +40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 0 és 20 °C között végezzük.
A találmány szerinti eljárás harmadik lépésében az (V) általános képletű ciklopenténszármazéknak (VI) vagy (VII) képletű (1R.4S)- vagy (1S,4R)-1-amino-4(hidroxi-metil)-2-ciklopenténné való átalakítását N-acetil-amino-alkohol-hidroláz hatású enzimet termelő mikroorganizmus segítségével vagy penicillin G-acilázok segítségével végezzük. Ezen biotranszformációnál az acilezett (1 S,4R)- vagy (1 R,4S)-amino-alkohol-származékot átalakítjuk, amikor is (VI) vagy (VII) képletű (1R,4S)- vagy (1S,4R)-1-amino-4-(hidroxi-metil)-2-ciklopentén képződik.
A biotranszformációhoz mindazon mikroorganizmusok alkalmazhatók, amelyek az (V) általános képletű ciklopenténszármazékot egyetlen nitrogénforrásként, egyetlen szénforrásként vagy egyetlen szén- és nitrogénforrásként hasznosítják. A mikroorganizmusokat szokásos mikrobiológiai módszerekkel különíthetjük el talajmintákból, iszapokból vagy szennyvízből. A mikroorganizmusok elkülönítése oly módon történik, hogy ezeket egy (V) általános képletű ciklopenténszármazékot tartalmazó táptalajban szokásos módon tenyésztjük, ahol az (V) általános képletben R1 jelentése a fentiekben megadottal azonos; a táptalajban az (V) általános képletű vegyületet
- egyetlen szén- és nitrogénforrásként,
- egyetlen nitrogénforrásként egy megfelelő szénforrás jelenlétében, vagy
- egyetlen szénforrásként egy megfelelő nitrogénforrás jelenlétében alkalmazzuk.
(V) általános képletű ciklopenténszármazékként alkalmazható például az N-acetil-, Ν-propionil-, N-izobutiril-, N-terc-butoxi-karbonil-(N-BOC), N-butiril- vagy N-fenil-acetil-1-amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentén.
Megfelelő nitrogénforrásként a mikroorganizmusok növekedési szubsztrátumként hasznosíthatnak például ammóniumot, nitrátokat, aminosavakat vagy karbamidokat. Megfelelő szénforrásként a mikroorganizmusok növekedési szubsztrátumként hasznosíthatnak például cukrokat, cukoralkoholokat, 2-4 szénatomos karbonsavakat vagy aminosavakat. Cukorként használhatók hexózok, mint glükóz vagy pentózok. Cukoralkoholként számításba jöhet például glicerin. 2-4 szénatomos karbonsavakként alkalmazható például ecetsav vagy propionsav. Aminosavakként számításba jöhetnek például leucin, alanin, aszparagin és hasonlók.
A szelektáláshoz és a tenyésztéshez alkalmazhatók a technika állásából ismert szokásos táptalajok, vagy használhatunk teljes táptalajt (élesztőextraktumot tartalmazó táptalajt), mint például élesztő táptalajt [„Nutrient Yeast Broth (NYB)]; előnyösen az 1. táblázatban említett tápközeget alkalmazzuk.
A tenyésztés és szelektálás során célszerűen a mikroorganizmusok hatásos enzimjeit indukáljuk. Enziminduktorként alkalmazhatók az (V) általános képletű ciklopenténszármazékok.
Szokásos módon a tenyésztés és szelektálás 20 és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 30 °C-38 °C között, 5,5-8 pH-η, előnyösen 6,8 és 7,8 pH között történik.
Előnyösen a biotranszformációt olyan mikroorganizmusokkal végezzük, amelyek a ciklopenténszármazékok (1R,4S)-izomerjét egyetlen szénforrásként, egyetlen szén- és nitrogénforrásként vagy egyetlen nitrogénforrásként hasznosítják.
Előnyösen a biotranszformációt Alcaligenes/Bordetella, Rhodococcus, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas vagy Gordona, különösen Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DMS 10686), Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xyloxodans ssp. denitrificans HSZ17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 vagy Gordona sp. CB 100 (DSM 10687) fajtájú mikroorganizmusokkal, valamint ezek funkcionálisan egyenértékű variánsaival és mutánsaival végezzük. A DSM 10686 és a DSM 10687 mikroorganizmusokat 1996. május 20-án, a DSM 10328 és DSM 10329 mikroorganizmusokat 1995. november 6-án, a DSM 11291 mikroorganizmusokat 1996. október 8-án, továbbá a DSM 11172 mikroorganizmusokat 1996. szeptember 20-án helyezték letétbe a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen nevű német mikroorganizmusgyűjteményben (Mascheroderweg 1b, D38124 Braunschweig) a Budapesti Megállapodás értelmében.
A „funkcionálisan ekvivalens variánsok és mutánsok” kifejezésen olyan mikroorganizmusokat értünk, amelyek lényegében azonos tulajdonságokkal és funkciókkal rendelkeznek, mint az eredeti mikroorganizmusok. Ilyen variánsok és mutánsok képződhetnek véletlenül, például UV-besugárzás hatására.
Az Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172) mikroorganizmusok taxonómiai leírása
Sejtalak Pálcika
Szélessége, pm 0,5-0,6
Hosszúsága, pm 1,0-2,5
HU 226 327 Β1
Mozgékonysága +
Ostorozottság peritreális
Gram-reakció -
Lízis 3%-os KOH-dal +
Aminopeptidáz (Cemy) +
Spórák -
Oxidáz +
Kataláz +
ADH (alkohol-dehidrogenáz) -
NO2 NO3-ból -
Denitrifikálás -
Ureáz -
Zselatinból történő hidrolízis -
Savak (OF-vizsgálati módszer) Glükózból
Fruktózból -
Arabinózból -
Adipátból +
Kaprátból +
Citrátból +
Malátból +
Mannitból
Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) taxonómiai leírása
1. A kolóniák morfológiája és színe: rövid, elágazó fonalak, amelyek „pálcikákra és kokkuszokra esnek szét, a csillogó kolóniák részben elfolynak, beigerózsaszín árnyalattal, RAL 1001.
2. A peptidoglikánsokban lévő azonosított aminosavak: mezo-diamino-pimelinsav.
3. Mikolsavak: Rhodococcus-mikolsavak; a mikolsavlánchosszúság meghatározása (32-44 szénatomos), valamint a DSM-mikolsav-adatbankban lévő bejegyzésekkel való összehasonlítás alapján nagy hasonlóság mutatkozik a Rhodococcus erythropolis modelljével (hasonlóság: 0,588).
4. Zsírsavmodell: egyenes láncú, telített és telítetlen zsírsavak plusz tuberkulosztearinsav.
5. A törzs 16S rDNS parciális szekvenciájának vizsgálatánál nagy hasonlóságot (100%) lehetett találni a Rhodococcus erythropolis bizonyos régióiban lévő szekvenciákkal.
Az azonosítási eredmények egyértelműek, minthogy három egymástól független módszer (mikolsavak, zsírsavak, 16S rDNS) ezen törzset a Rhodococcus erythropolis fajtákhoz sorolta.
Gordona sp. CB 100 (DSM 10687) taxonómiai leírása
1. A kolóniák morfológiája és színe: rövid, elágazó láncú fonalak, amelyek idővel „pálcikákra” és kokkuszokra esnek szét, a telepek világos narancsszínűek, RAL 2008.
2. A peptidoglikánokban lévő azonosított aminosavak: mezo-diamino-pimelinsav.
3. Menachino típusa: MK-9 (H2) 100%.
4. Mikolsavak: Gordona-mikolsavak; a mikolsavak lánchosszúságának meghatározását (50-60 szénatomos) magas hőmérsékletű gázkromatográfiával végeztük; a vizsgálati eredmények összhangban állnak a Gordona fajták képviselőinél észlelt adatokkal.
5. Zsírsavmodell: egyenes láncú, telített és telítetlen zsírsavak plusz tuberkulosztearinsav.
6. A törzs 16S rDNS parciális szekvenciájának vizsgálatánál csak viszonylag kismértékű azonosságot (98%) lehetett találni a Gordona rubropertincta speciális régióiban észlelt szekvenciákkal.
Az így kapott eredmények alapján (Menachinone, mikolsavak, zsírsavak 168rDNS) az izolátumot ugyan egyértelműen a Gordona fajtához lehet hozzárendelni, azonban az eredmények alapján nem lehetséges az izolátumot egy ismert Gordona-féleséggel azonosítani. Így feltételezhető, hogy a DSM 10687 törzsnél egy új, eddig nem ismertetett Gordona fajtáról van szó.
Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrifikáns HSZ (DSM 10329) taxonómiai leírása A törzs tulajdonságai
Sejtforma Pálcika
Szélessége, pm 0,5-0,6
Hosszúsága, pm 1,5-3,0
Mozgékonysága +
Ostorozottság peritreális
Gram-reakció
3%-os KOH-dal való lízis +
Aminopeptidáz (Cerny) +
Spórák
Oxidáz +
Kataláz +
Anaerob szaporodás ADH (alkohol-dehidrogenáz) +
NO3-ból származó NO2 +
Denitrifikálás +
Ureáz
Hidrolízis
Zselatinból
Tween 80-ből Savak (OF-vizsgálati módszer)
Glükóz aerobból Xilóz 80-ból
Szu bsztrátumhasznos ítás
Glükózból
Fruktózból
Arabinózból
Citrátból +
Malátból +
Mannitból
Az Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328) taxonómiai leírása
Jellemzés Gram-pozitív szabálytalan pálcikák egy kifejezett pálcika-kokkusz szaporodási ciklussal; egyértelműen aerob; glükózból nem idéz elő sav- vagy gázképződést
Mozgékonyság
Spórák
Kataláz +
HU 226 327 Β1
Mezo-diamino-pimelinsav jelenléte a sejtfalban nem 5% 7%
Peptidoglikántlpus A3a, L-Lys-L-Ser- 10% -
L-Thr-L-Ala Lizozim táptalajban +
16S rDNS-szekvenciahasonlóság a legnagyobb varia- 5 Savak (ÁSS)
bilitással rendelkező tartományok szek- D-Glükózból +
venciájának vizsgálatából kitűnik, hogy L-Arabinózból +
legnagyobb mértékű, így 98,2%-os az D-Xilózból -
Arthrobacter pascens, , A. ramosus és A. D-Mannitból +
oxydansszal mutatott hasonlóság. 10 D-Fruktózból +
Fruktózból gázképződés -
Agrobacterium/Rhizobium HS30 taxonómiai leírása Lecitináz -
Sejtforma Pleomorf pálcikák Hidrolízis
Szélesség, pm 0,6-1,0 Keményítőből +
Hosszúság, pm 1,5-3,0 15 Zselatinból +
Gram-reakció - Kazeinből -
3%-os KOH-dal lízis - Tween 80-ból +
Aminopeptidáz + Eszkulinból -
Spórák - Citrát hasznosítása +
Oxidáz + 20 Propionát hasznosítása -
Kataláz + Nitritképződés nitrátból +
Mozgékonyság + Indol -
Anaerob körülmények között Fenilalanin-dezamináz -
szaporodás - Arginin-dihidroláz -
Nitrátból nitritképzés - 25 A sejtben lévő zsírsavak analízise alapján a Bacil
Denitrifikálás - lus fajtához való besorolás megerősítést nyert.
Ureáz + A 16S rDNS parciális szekvenciájának meghatáro
Zselatinból történő hidrolízis - zása 100%-os hasonlóságot mutat a Bacillus simplex
Savak hez.
L-Arabinózból + 30
Galaktózból - Pseudumonas putida K32 taxonómiai leírása
Melezitózból - A sejt alakja Pálcikák
Fukózból + Szélesség, pm 0,8-0,9
Arabitolból - Hosszúság, pm 1,5-4,0
Mannitból - 35 Mozgékonyság +
Eritritből - Ostorozottság poláros >1
A lakmusztej lúgosítása + Gram-reakció -
Ketolaktóz - 3%-os KOH-dal lízis +
A 16S rDNS parciális szekvencia vizsgálata mint- Aminopeptidáz +
egy 96%-os hasonlóságot mutat az Agrobacterium és 40 Spórák -
Rhizobium fajták képviselőivel. Ezen fajták valamelyi- Oxidáz +
kéhez történő egyértelmű hozzárendelés azonban nem Kataláz -
lehetséges. Anaerob körülmények közötti szaporodás
Bacillus symplex K2 taxonómiai leírása 45 Pigmentek
Sejtforma Pálcika Fluoreszkáló +
Szélesség, pm 0,8-1,0 Piocianin -
Hosszúság, pm 3,0-5,0 ADH +
Spórák - Nitritképződés nitrátból -
Ellipszoid alakú - 50 Denitrifikálás -
Gömbölyű - Ureáz -
Sporangium - Zselatin hidrolízise -
Kataláz + Szubsztrátum hasznosítása
Anaerob szaporodás - Adipátból -
VP reakció k. w. 55 Citrátból +
Maximális hőmérséklet Malátból +
Szaporodás pozitív °C-nál 40 D-Mandelátból +
Szaporodás negatív °C-nál 45 Fenil-acetátból +
Szaporodás 5,7 pH-jú táptalajban - D-Tartarátból -
NaCI 2% + 60 D-Glükózból +
HU 226 327 Β1
Trehalózból Mannitból
Benzoil-formiát Propilénglikolból +
Butil-aminból +
Benzil-aminból +
Triptaminból
Acetamidból +
Hippurátból +
A sejtben lévő zsírsavak összetétele tipikus a Pseudomonas putida fajtájú mikroorganizmusoknál.
A 16S rDNS parciális szekvenciájának ellenőrzése 98%-os hasonlóságot mutat a Pseudomonas mendocina és a Pseudomonas alcaligenes szekvenciáival. A Pseudomonas putida szekvenciájával való hasonlóság 97,4%-ot tesz ki.
Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291) taxonómiai leírása
1. A kolóniák morfológiája és színe: rövid elágazó fonalak, amelyek pálcikákká és kokkuszokká esnek szét, a kolóniák tompa, világospiros-narancs színűek RAL 2008.
2. A peptidoglikánsban lévő aminosav azonosítása: mezo-diamino-pimelinsav.
3. Mikolsavak: Rhodococcus-mikolsavak.
A mikolsav-lánchosszúság meghatározása (32-44 szénatomos), továbbá az adatoknak a DSMC-mikolsav-adatbank bejegyzéseivel való összehasonlítása igen csekély hasonlóságot mutat a Rhodococcus ruber törzsek összetételével (hasonlóság: 0,019). Ez a korrelációs faktor túl csekély a fajták azonosítására.
4. Zsírsavösszetétel: egyenes láncú, telített és telítetlen zsírsavak plusz tuberkulosztearinsav.
Ez a zsírsavmodelltípus jellemző a Rhodococcus fajtákra, valamint az ezzel rokon Mycobacterium, Nocardia és Gordona típusokra. Megkíséreltük a zsírsavösszetételben mutatkozó kvalitatív és kvantitatív különbségek alapján a fajtaszinten egy differenciálást elvégezni. A numerikus módszerek segítségével a Rhodococcus sp. FB 387 mikroorganizmus zsírsavmintáját összehasonlítottuk az adatbank bejegyzéseivel. Ezzel a módszerrel sem lehetett a Rhodococcus sp. FB 387-et egy bejegyzett Rhodococcus fajtával sem azonosítani az igen csekély hasonlóság alapján (0,063).
5. A 16S rDNS parciális szekvencia vizsgálatánál a törzs 96-818 szakaszát 97,9%-os korrelációval Rhodococcus opacushoz lehetett besorolni. Ez a szekvenciaazonosság messze 99,5% alatt van, ami pedig szükséges egy egyértelmű fajtameghatározáshoz.
A rendelkezésre álló adatok alapján abból indulunk ki, hogy a Rhodococcus sp. FB 387-es törzsnél egy új, eddig nem ismertetett Rhodococcus fajtáról van szó.
Ezen mikroorganizmus biotranszformációját szokásos tenyésztési módszerrel végezhetjük nyugvó állapotban lévő sejtekkel (már nem növekvő, azaz további szén- és energiaforrást már nem igénylő sejtekkel) vagy növekvő sejtekkel. Előnyösen a biotranszformációt nyugalomban lévő sejtekkel végezzük.
A biotranszformációhoz alkalmas N-acetil-amino-alkohol-hidroláz-aktivitással rendelkező enzimek elkülönítését végezhetjük például a fentiekben leírt mikroorganizmussejtek szakember számára jól ismert felszakításával. E műveletnél végezhetünk ultrahangos kezelést vagy alkalmazhatjuk a French-Press-módszert. Előnyösen a Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686) mikroorganizmusokból különítjük el a szükséges enzimeket.
A megfelelő penicillin G-acilázokat számos mikroorganizmusból, így például baktériumokból vagy Actinomycetesekből nyerjük, közelebbről a következő mikroorganizmusokból: Escherichia coli ATCC 9637, Bacillus megaterium, Streptomyces lavendulae ATCC 13664, Nocardia sp. ATCC 13635, Providencia rettgeri ATCC 9918, Arthrobacter viscosus ATCC 15294, Rhodococcus fascians ATCC 12975, Streptomyces phaechromogenes ATCC 21289, Achromobacter ATCC 23584 és Micrococcus roseus ATCC 416. Elsősorban a kereskedelemben beszerezhető penicillin G-acilázokat alkalmazzuk, mint Penicillin G-aciláz EC 3.5.11, amelyet E. coliból (Boehringer Mannheim) vagy Bacillus megateriumból nyernek ki.
Egy előnyös megoldást képez a rögzített penicillin G-acilázok alkalmazása.
A biotranszformáció végezhető a szakember számára jól ismert szokásos módszerekkel, mint például alacsony koncentrációjú foszfát-, citrát- vagy Hepespufferoldatban, vízben, teljes táptalajban, mint például „Nutrient Yeast Broth”-ban (NYB), vagy pedig az 1. táblázatban bemutatott összetételű táptalajban. Előnyösen a biotranszformációt az 1. táblázat szerinti táptalajban vagy alacsony koncentrációjú foszfátpufferoldatban végezzük.
Előnyösen a biotranszformációt az (V) általános képletű ciklopenténszármazéknak egyszeri vagy folyamatos hozzáadása közben végezzük, ahol a koncentráció a 10 tömeg%-ot, előnyösen 2 tömeg%-ot nem lépi túl.
Az elegy pH-ja a biotranszformáció alatt 5-9, előnyösen 6-8 pH-tartományban van. Előnyösen a biotranszformációt 20-40 °C, előnyösen 25-30 °C hőmérsékleten végezzük.
Az előállítás negyedik lépésében a (VI) vagy (VII) képletű ciklopenténvegyületet (Vili) képletű N-(2-amino-4,6-diklór-pirimidin)-5-il)-formamiddal reagáltatva (IX) vagy (X) képletű (1S,4R)- vagy (1R,4S)-4-[(2-amino-6-klór-5-formamido-4-pirimidinil)-amino]-2-ciklopentén-1-metanollá alakítjuk át.
Az N-(2-amino-4,6-diklór-pirimidin)-5-il]-formamid egy nemzetközi szabadalmi bejelentés WO 95/21 161 számú közrebocsátási iratában leírtak szerint állítható elő.
Előnyösen a negyedik lépésben történő átalakítást egy bázis jelenlétében végezzük. Bázisként alkalmazhatók szerves vagy szervetlen bázisok. Szerves bázisként használhatunk trialkil-amint. Trialkil-aminként szerepelhet például trietil-amin, tributil-amin, tribenzilamin, piridin vagy N-metil-pirrolidin. Szervetlen bázis6
HU 226 327 Β1 ként alkalmazhatók például alkálifém- vagy alkáliföldfém-karbonátok, illetőleg alkálifém- vagy alkáliföldfémhidrogén-karbonátok, mint például kálium-karbonát és nátrium-hidrogén-karbonát
Előnyösen a reakció negyedik lépését protonos oldószerben végezzük. Protonos oldószerként szerepelhetnek rövid szénláncú alifás alkoholok, mint metanol, etanol, propanol, izopropanol, butanol vagy izobutanol.
A reakció negyedik lépését előnyösen 0 °C és 150 °C közötti, előnyösen 20 °C és 100 °C közötti hőmérsékleten végezzük.
Az ötödik reakciólépésben az (1S,4R)- vagy (1R,4S)-4-[(2-amino-6-klór-5-formamido-4-pirimidinil)amino]-2-ciklopentén-1-metanolt [(IX), (X) képletű vegyület] ismert módon a WO 95/21161 számú közrebocsátási iratban leírtak szerint (I) vagy (II) képletű vegyületté ciklizáljuk.
Általában a ciklizálást a komponenseknek trialkilortoformátban való feloldása után koncentrált vizes sav jelenlétében végezzük. Trialkil-ortoformátként használhatunk például trimetil- vagy trietil-ortoformátot. Vizes savként szerepelhet például sósav, kénsav vagy metánszulfonsav.
1. példa (±)-2-Acetil-2-aza-blciklo[2.2.1]hept-5-én-3-on előállítása
100 g (±)-2-acabiciklo[2.2.1]hept-5-én-3-ont nitrogénatmoszférában 800 ml acetonitril és 161,26 ml piridin elegyében feloldunk. Az oldathoz 12 °C hőmérsékleten 104,5 g acetil-kloridot csepegtetünk mintegy 2 óra alatt. Az elegyet szobahőmérsékleten 4,5 óra hosszat keverjük. Ezután az elegyhez 800 ml vizet adunk, majd az acetonitrilt vákuumban ledesztilláljuk. A vizes fázist 400 ml etil-acetáttal háromszor extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 400 ml n HCI-dal, 400 ml vízzel, 400 ml telített NaCI-oldattal mossuk, magnézium-szulfáttal szárítjuk, majd betöményítjük. A maradékot metilén-kloriddal felvesszük, kovasavgélen átszűrjük. A szűrletet betöményítjük, a kapott terméket desztillációval tisztítjuk. 107,76 g terméket kapunk tiszta folyadék formájában. Hozam: 71%.
Forráspont: 51 °C/9,33 Pa.
1H-NMR (CDCI3) 400 MHz: δ (ppm) 2,25 (AB syst.,
2H); 2,8 (s, 3H); 3,42 (m, 1H); 5,30 (m, 1H); 5,30 (m, 1H); 6,89 (m, 1H); 6,92 (m, 1H).
2. példa (±)-2-Butiril-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-on előállítása
100,3 g (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-ont nitrogénatmoszférában 720 ml acetonitril és 142 ml piridin elegyében feloldunk. Az elegyhez 12 °C hőmérsékleten 1 óra alatt 141,8 g vajsav-kloridot csepegtetünk. A reakcióelegyet 3 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. 720 ml víz hozzáadása után a fázisokat elkülönítjük. Az acetonitrilt vákuumban ledesztilláljuk, a vizes fázist 300 ml etil-acetáttal háromszor extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 350 ml n HCI-dal, 400 ml telített NaCI-oldattal és 500 ml vízzel mossuk, magnézium-szulfáttal szárítjuk, majd teljesen betöményítjük. A kapott terméket desztillációval tisztítjuk. így 107,76 g terméket kapunk tiszta folyadék formájában. Hozam: 85%.
Forráspont: 70 °C/6,66 Pa.
1H-NMR (CDCI3) 400 MHz: δ (ppm) 0,98 (t, J=8,5 Hz,
3H); 1,58-1,76 (2H); 2,23 (AB syst, 2H); 2,82-2,90 (2H); 3,42 (m, 1H) 5,30 (m, 1H); 6,62 (m, 1H); 6,90 (m, 1H).
3. példa (±)-2-Fenil-acetil-2-aza-biciklo[2.2.1]-hept-5-én3-on előállítása
33,4 g (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-ont nitrogénatmoszférában 240 ml acetonitril és 48,3 ml piridin elegyében feloldunk. Az elegyhez 12 ’C hőmérsékleten 30 perc alatt 68,6 g fenil-ecetsav-kloridot csepegtetünk. Ezután az elegyet 3,5 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. 240 ml víz hozzáadása után az acetonitrilt vákuumban ledesztilláljuk, majd a vizes fázist 150-150 ml etil-acetáttal háromszor extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 150 ml n HCI-dal, 150 ml telített NaCI-oldattal, majd 150 ml vízzel mossuk, magnézium-szulfáttal szárítjuk, majd teljesen bepároljuk. Az így kapott nyersterméket kovasavgélen átszűrjük (hexán:etil-acetát=1:1). 78,34 g nyersterméket kapunk sárga színű olajos termék formájában.
4. példa (±)-2-Propionil-2-aza-biciklo[2.2.1 ]hept-5-én-3-on előállítása g (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-ont nitrogénatmoszférában 325 ml acetonitril és 41 ml piridin elegyében feloldunk. Az elegyhez 12 °C hőmérsékleten 1 óra alatt 43,9 g propionsav-kloridot csepegtetünk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 5 óra hosszat keverjük. 145 ml víz hozzáadása után az acetonitrilt vákuumban ledesztilláljuk. A vizes fázist 115 ml etilacetáttal háromszor extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 140 ml n HCI-dal, 40 ml telített NaHCO3-oldattal és 40 ml NaCI-oldattal mossuk, nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd teljes mértékben betöményítjük. A maradékot desztillációval tisztítjuk. így 55,8 g cím szerinti vegyületet kapunk, ami állás közben megszilárdul. Hozam: 81,6%.
Forráspont: 75-80 °C/2,8-102 Pa.
Olvadáspont: 54-56 °C.
1H-NMR (CDCI3): δ (ppm) 400 MHz 0,95 (t, 3H);
2,10 (kvad, 1H); 2,28 (kvad, 1H); 2,64 (m, 2H); 3,42 (s, 1H); 5,16 (s, 1H); 6,78 (m, 1H); 6,96 (m, 1H).
5. példa (±)-2-lzobutiril-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-on előállítása
45,1 g (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-ont nitrogénatmoszférában 310 ml acetonitril és 39 ml piridin elegyében feloldunk. Az oldathoz 10 °C hőmérsékleten 1 óra alatt 54,1 g izovajsav-kloridot csepegtetünk. A reakcióelegyet 5 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. 140 ml víz hozzáadása után az acetonitrilt
HU 226 327 Β1 vákuumban ledesztilláljuk. A vizes fázist 120-120 ml etil-acetáttal négyszer extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 50 ml n sósavval, 50 ml telített NaHCO3oldattal és 50 ml NaCI-oldattal mossuk, nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd teljes mértékben betöményítjük. A maradékot visszafolyató hűtő alkalmazásával 240 ml n-hexánban aktív szén hozzáadásával forraljuk. Az aktív szenet szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet 0 °C-ra lehűtjük, a kicsapódó cím szerinti vegyületet szűréssel elkülönítjük, (gy 54,5 g cím szerinti vegyületet kapunk. Hozam: 76%.
Olvadáspont: 41-42 °C.
1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 400 MHz 0,92 (d, 3H);
1,06 (d, 3H); 2,10 (m, 1H); 2,28 (m, 1H); 3,40 (m,
2H); 5,16 (s, 1H); 6,78 (m, 1H); 7,92 (m, 1H).
6. példa (±)-2-Klór-acetil-2-aza-biciklo[2.2.1 ]hept-5-én-3-on előállítása
10,1 g (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-ont nitrogénatmoszférában 10 °C hőmérsékleten 10 ml diklórmetán, 8,4 ml piridin és 0,22 g 4-N,N-dimetil-aminopiridin elegyében feloldunk. Az oldathoz 1 óra alatt
13,5 g klór-acetil-kloridot csepegtetünk. A hőmérséklet °C-ra emelkedik. Az elegyet szobahőmérsékleten 2 óra hosszat tovább keverjük. Az oldatot 100 ml vízzel elegyítjük. A fázisok elkülönítése után a vizes fázist 100 ml diklór-metánnal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd teljes mértékben betöményítjük. A maradékot visszafolyató hűtő alkalmazásával 1 g aktív szén jelenlétében 100 ml diizopropil-éterben 10 percig forraljuk. Az elegyet forrón leszűrjük, a szűrletet szobahőmérsékletre lehűtjük, a szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, majd szárítjuk. 10,35 g cím szerinti vegyületet kapunk. Hozam: 60%.
Olvadáspont: 86-88 °C.
1H-NMR (CDCI3): δ (ppm) 400 MHz 2,28 (d, 1H);
2,40 (d, 1H); 3,48 (s, 1H); 4,56 (d, 2H); 5,30 (s, 1H);
6,70 (d, 1H); 6,94 (m, 1H).
7. példa (±)-1-Acetil-amino-4-(hidroxi-metil)-2-ciklopentén előállítása
79,56 g (±)-2-acetil-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3ont nitrogénatmoszférában 450 ml etanolban feloldunk, majd -10 °C hőmérsékletre lehűtjük. Részletekben perc alatt 19,8 g nátrium-bór-hidridet adunk az oldathoz.
A reakcióelegyet 0 °C hőmérsékleten 3 óra hosszat keverjük, majd koncentrált kénsavval a pH-t 1,8-es értékre állítjuk. Az elegyhez 200 ml etil-acetátot adunk, majd a szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük. A szűrletet teljes mértékben betöményítjük. A maradékot vízzel felvesszük, metilén-kloriddal mossuk, majd betöményítjük. A nyersterméket kovasavgéllel végzett szűréssel tisztítjuk. így 51,83 g cím szerinti vegyületet kapunk fehér színű, szilárd anyag formájában. Hozam: 64% a kiindulási anyagként alkalmazott 2-acetil-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-on-ra számítva.
1 H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 400 MHz 1,18 (m,
1H); 1,78 (s, 3H); 2,29 (m, 1H); 2,66 (m, 1H); 3,35 (s, 2H); 4,58 (s, 1H); 4,72 (m, 1H); 5,61 (d, 1H);
5,85 (d, 1H); 7,83 (d, 1H).
8. példa (±)-1-Butiríl-amino-4-(hidroxi-metil)-2-ciklopentén előállítása
73,87 g (±)-2-butiril-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3ont nitrogénatmoszférában 400 ml etanolban feloldunk, majd -10 °C-ra lehűtjük. Az oldathoz kisebb adagokban 45 perc alatt 15,68 g nátrium-bór-hidridet adunk. A reakcióelegyet 0 °C hőmérsékleten 3 óra hosszat keverjük, majd koncentrált kénsavval a pH-t 1,5-es értékre állítjuk. Az elegyhez 200 ml etil-acetátot adunk, a szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük. A szűrietet teljes mértékben betöményítjük, a maradékot vízzel felvesszük, metilénkloriddal mossuk, bepároljuk, majd magas vákuumban szárítjuk. 60,55 g terméket kapunk. Hozam: 80% a kiindulási anyagként felhasznált (±)-2-butiril-2-aza-biciklo[2.2.1 ]hept-5-én-3-on-ra számítva.
Olvadáspont: 71-72 °C.
1H-NMR (CDCI3): δ (ppm) 400 MHz 0,98 (t,
J=8,5 Hz, 3H); 1,40-1,50 (1H); 1,58-1,68 (2H);
2,10-2,18 (2H); 2,42-2,55 (1H); 2,85 (m, 1H); 3,62 (AB syst., 2H); 4,98 (m, 1H); 5,78-5,82 (2H); 6,38 (m, 1H).
9. példa (±)-1-(Fenil-acetil-amino)-4-(hidroxi-metil)-2ciklopentén előállítása g nyers (±)-2-fenil-acetil-2-aza-biciklo[2.2.1]hept5-én-3-ont nitrogénatmoszférában 450 ml etanolban feloldunk, majd az oldatot -10 °C hőmérsékletre lehűtjük. Az oldathoz részletekben 1 óra alatt 13,2 g nátrium-bórhidridet adunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten
3,5 óra hosszat keveijük, majd koncentrált kénsavval a pH-t 1,8-es értékre állítjuk. Ezen elegyet kovasavgélen átszűrve tisztítjuk (hexán:etil-acetát=2:8). Etil-acetáttal végzett átkristályosítás után 15,89 g fehér színű, szilárd terméket kapunk. Hozam: 80% a kiindulási anyagként alkalmazott (±)-2-fenil-acetil-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5én-3-on-ra számítva.
1H-NMR (CDCI3): δ (ppm) 400 MHz 1,28-1,35 (1H);
1,40 (m, 1H); 2,38-2,45 (1H); 2,79 (m, 1H); 3,50 (AB syst., 2H); 3,52 (s, 3H); 4,98 (m, 1H); 5,75 (m,
2H); 5,98 (m, 1H); 7,20-7,38 (5H).
10. példa (±)-1-PrOpionil-amino-4-(hidroxi-metll)-2ciklopentén előállítása
16,6 g (±)-2-propionil-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én3-ont nitrogénatmoszférában 140 ml víz és 66 ml 2-butanol elegyében feloldunk, majd az oldatot -5 °C hőmérsékletre lehűtjük. Az oldathoz részletekben 2 óra alatt 3 g nátrium-bór-hidridet adunk. Az elegyet 10 °C hőmérsékleten 2,5 óra hosszat keverjük, majd a pH-t koncentrált sósav és víz 1:1 térfogatarányú elegyével 2,2-es értékre állítjuk. Az oldatot 40 g mennyiségre betöményítjük, majd 2 n NaOH-oldattal a pH-t 6,2 értékre
HU 226 327 Β1 állítjuk. Az elegyet 50-50 ml diklór-metánnal ötször extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat teljes mértékben betöményítjük, a maradékot 150 ml toluollal átkristályosítjuk. Igy 11,1 g cím szerinti vegyületet kapunk. Hozam: 65%.
Olvadáspont: 67-68 °C.
1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 400 MHz 0,96 (t, 3H);
I, 16 (kvint., 1H); 2,04 (kvad., 2H); 2,26 (m, 1H);
2,66 (m, 1H); 3,34 (m, 2H); 4,58 (t, 1H); 4,72 (m,
1H); 5,61 (m, 1H); 5,84 (m, 1H); 7,72 (d, 1H).
II. példa (±)-1-lzobutiril-amino-4-(hidroxi-metil)-2ciklopentén előállítása g (±)-2-izobutiril-3-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3ont nitrogénatmoszférában 32 ml víz és 84 ml 2-butanol elegyében feloldunk, majd az oldatot 0 °C hőmérsékletre lehűtjük. Az oldathoz részletekben 3,5 óra alatt 1,37 g nátrium-bór-hidridet adunk. Az elegyet 20 °C hőmérsékleten 3 óra hosszat tovább keverjük, majd koncentrált sósav és víz 1:1 térfogatarányú elegyével a pH-t 2,5-es értékre állítjuk, ezután az elegyet 2 n NaOH segítségével semlegesítjük. Az oldatot 40 g mennyiségre betöményítjük. A maradékot 80-80 ml diklór-metánnal háromszor extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat teljes mértékben betöményítjük. Az így kapott szilárd anyagot 25 ml toluollal átkristályosítjuk. 6,8 g cím szerinti vegyületet kapunk. Hozam: 73,6%. Olvadáspont: 80-81 °C.
1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 400 MHz 0,98 (d, 6H);
1,16 (kvint., 1H); 2,30 (m, 2H); 2,68 (m, 1H); 3,32 (t,
2H); 4,58 (t, 1H); 4,70 (m, 1H); 5,61 (m, 1H); 5,82 (m, 1H); 7,68 (d, 1H).
12. példa (1R,4S)-1-Amino-4-(hidroxi-metil)-2-ciklopentén előállítása penicillin G-aciláz alkalmazásával A biotranszformációhoz 165 U (egységj/g E. coliból származó penicillin G-aciláz EC 3.5.1.11-et (Boehringer Mannheim) vagy Bacillus megateriumból származó penicillin G-aciláz EC 3.5.1.11-et alkalmazunk. 50 mmol/l nátrium-foszfát-pufferoldatot (pH=5—9; 4 ml) 1 tömeg% nem racém N-fenil-acetil-1amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopenténnel és 400 mg megfelelő penicillin G-acilázzal 37 °C hőmérsékleten inkubálunk.
Meghatározott időközökben mintákat veszünk le, és vékonyréteg-kromatográfiával (kovasavgél 60, butanol:víz:jégecet=3:1:1; kimutatás ninhidrinnel), gázkromatográfiával (kapillárisoszlop, HP-5, 5% fenil-metilsziloxán) vagy HPLC-vel analizáljuk. Az enzim a fenilacetil-csoportot nagy aktivitással felszakítja, így 40% megfelelő amino-alkohol szabadul fel. A szabad amino-alkoholt 80% ee-értékkel kapjuk.
13. példa (1R,4S)-1-Amino-4-(hidroxi-metil)-2-ciklopentén előállítása mikroorganizmusok segítségével
13.1 A Visp-i ARA vízderítő létesítményből derítőiszapot veszünk ki (20%), ezt A+N táptalajjal elegyítjük (lásd az 1. táblázatot), ahol a táptalaj 0,5% N-acetil-, Ν-propionil-, N-izobutiril-vagy N-butiril-1-amino4-hidroxi-metil-2-ciklopentént tartalmaz, majd az elegyet rázás közben 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az (1R,4S)-1-amino-4-(hidroxi-metil)-2-ciklopentén képződését vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal követjük.
Ezen bedúsult táptalajból 1%-ot 1-3-szor átoltunk, és szilárd táptalajon (Plate Count Agar táptalajban,
1. táblázat; 20 g/l) szétoszlatjuk. Ily módon az Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 1172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10 686), Gordona sp. CB 100 (DSM 10 687) és a Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11 291) mikroorganizmusokat lehetett elkülöníteni.
13.2 Az ily módon elkülönített mikroorganizmusokat az 1. táblázatban feltüntetett táptalajban tenyésztjük, a táptalaj 0,5% N-acetil-, Ν-propionil-, N-izobutiril- vagy N-butiril-1 -amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentént tartalmaz. A tenyésztést 24-36 órán át folytatjuk, amíg egy 2-3-as optikai sűrűséget (OD) el nem érünk. Az így kapott sejteket a késői exponenciális növekedési fázisban elkülönítjük és 10 mmol/l foszfátpufferoldattal mossuk.
Az ezt követő biotranszformációt 4,5-9-es pH-jú, 50 mmol/l koncentrációjú foszfátpufferben végezzük, ahol a pufferoldat 1 tömeg% Ν-acetil-, N-izobutiril- vagy N-butiril-1-amino-4-hidroxi-metil-2ciklopentént tartalmaz. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat alapján megállapítható volt, hogy a szubsztrátum 50%-a (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciklopenténné alakult hidrolízis révén. A HPLC analízis szerint az ee-értékek 80 és 93 között vannak.
Amennyiben szubsztrátumként N-butiril-1-amino-4hidroxi-metil-2-ciklopentént alkalmazunk, úgy a biotranszformáció sebessége 0,14 (g/l/h/OD) a DSM 10 686 jelzésű törzs esetében, amennyiben a tenyésztést A+N táptalajon végeztük, a biotranszformáció sebessége 0,03 (g/l/h/OD), amennyiben a tenyésztést NYB („Nutrient Yest Broth”) táptalajon végeztük, (ahol a táptalaj N-butiril-1-amino-4-hidroximetil-2-ciklopentént tartalmazott).
Amennyiben a tenyésztést a DSM 10 687 jelzésű törzzsel végeztük, és a szubsztrátum koncentrációja (N-butiril-1 -amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentén) 200 mmol/l volt, úgy a biotranszformáció sebessége 0,161 (g/l/h/OD).
1. táblázat A+N táptalaj
MgCI2 0,4 g/l
CaCI2 0,014 g/l
FeCI3 0,8 mg/l
Na2SO4 0,1 g/l
KH2PO4 1 g/l
Na2HPO4 2,5 g/l
HU 226 327 Β1
1. táblázat (folytatás)
NaCI 3 g/l
Vitaminoldat 1 ml/l
Nyomelemoldat 1 ml/l
pH=7,5
13.3 Rhodococcus erythropolis DSM 10 686 jelzésű törzset tenyésztünk 6 l-es térfogatú fermentorban minimál táptalajon (lásd a 2, táblázatot), amely táptalaj szén-, illetőleg nitrogénforrásként ammóniumacetátot tartalmaz, a tenyésztést 30 °C hőmérsékleten 650>25 OD sejtsűrűségig végezzük. A tenyésztés alatt folyamatosan további szénforrásként 50%-os ecetsavat adunk az elegyhez. Az enzimatikus tevékenység indukálásához azután 60 g (±)-Nacetil-1-amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentént adunk az elegyhez, majd az inkubálást néhány óra hosszat tovább folytatjuk. Végül még egyszer 40 g (±)-N-acetil-1-amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentént adunk az elegyhez, majd az inkubálást további 10 óra hosszat folytatjuk. A bioátalakulás lefutását egyidejűleg on-line HPLC vizsgálattal követjük. Amikor az analitikai hozam a 40%-ot eléri a felhasznált racém szubsztrátumra vonatkozóan, és 85%-os ee-értéket kapunk, akkor a fermentációt sav hozzáadásával leállítjuk.
2. táblázat Táptalaj összetétele
Komponensek Koncentráció
Élesztőextraktum 0,5 g/l
Pepton M66 0,5 g/l
KH2PO4 4,0 g/l
Na2HPO4.2 H2O 0,5 g/l
K2SO4 2,0 g/l
NH4-acetát 3,0 g/l
Cacl2 0,2 g/l
MgCI2.6 H2O 1,0 g/l
Nyomelemoldat (lásd az alábbiakban) 1,5 mg/l
PPG (polipropilénglikol) 0,1 g/l
Nyomelemoldat
KOH 15,1 g/l
EDTA.Na2.2 H2O 100,0 g/l
ZnSO4.7 H2O 9,0 g/l
MnCI2.4 H2O 4,0 g/l
h3bo3 2,7 g/l
CoCI2.6 H2O 1,8 g/l
CuCI2.2 H2O 1,5 g/l
NíCI2.6 H2O 0,18 g/l
Na2MoO4.2 H2O 0,27 g/l
13.4 A 13.3 példában leírtak szerint eljárva az Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10 328), Rhodococcus sp FB387 (DSM 11 921), az Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10 329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2 és Pseudomonas putida K32-t tenyésztünk nátrium-acetát-tartalmú táptalajban (lásd az 1. táblázatot), a tenyésztést N-acetil-, Ν-propionil-, N-izobutiril- vagy N-butiril-1-amino-4-hidroxi-metil-2ciklopentén jelenlétében vagy a nélkül végezzük (a továbbiakban a vegyületeket röviden amino-alkoholként említve).
Az amino-alkohol nélkül végzett tenyésztésnél az exponenciális sejtszakaszban az alábbi eredményeket kaptuk (HPLC analízis eredményei).
Törzs Termelékenység ee-érték/átalakulás
(mmol/OD-h) (%-ban)
HSZ 5
(DSM 10328) 0,05 88,7/16
HSZ 17
(DSM 10329) 0,005 95/23
K32 0,05 54/1
CB101
(DSM 10686) 0,1 84/39
K2- és K17-es törzseket tenyésztünk, ezeket elkülönítjük, és 60 óra hosszat tartó biotranszformációhoz használjuk.
Törzs Termelékenység ee-érték/átalakulás (mmol/OD-h) (%-ban)
K2 - 92/10
HSZ 30 - 93/3,5
Minden egyes tételből exponenciális és stacionáris sejteket különítünk el, majd nyugvó sejtekként a biotranszformációhoz használjuk. A DC-analízissei nem lehetett különbséget megállapítani az amino-alkohollal indukált vagy nem indukált sejttenyészeteknél a kezdeti átalakítási rátában.
14. példa
Rhododoccus erythropolis CB101 (DSM 10686) tenyészetből származó N-acetil-amino-alkoholhidroláz tisztítása
Az enzimet az alábbiakban leírtak szerint tisztítjuk, mindaddig, amíg az SDS-PAGE-ban (Pharmacia Phast Gél, 10-15%-os gradiens) már csak egy 50 kD molekulatömegű fehérjesáv figyelhető meg.
Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686) sejteket 50 mmol trisz-pufferoldatban (pH=6,2) mosunk, és 190 optikai sűrűségig (OD650nm) betöményítjük. Fenil-metánszulfonil-fluoridot (PMSF) adunk az oldathoz, melynek végső koncentrációja 1 mmol/l, majd a sejteket French-Press-szel kezeljük, így nyers extraktumhoz jutunk. Centrifugálást követően 200 ml sejtmentes extraktumot kapunk, amelyben a fehérjekoncentráció 4,8 mg/ml.
960 mg sejtmentes extraktumot viszünk fel HiLoad 26/10 Q-Sepharose-loncserélő kromatográfiás oszlopra (Pharmacia), ahol az oszlopot 50 mmol/l trisz-pufferoldattal (pH=8,0) egyensúlyozzuk ki, amely pufferoldat 1 mmol/l ditiotreitolt (DTT) tartalmaz.
HU 226 327 Β1
Az oszlopot ugyanezen pufferoldattal mosva a fehérjéket egy lineáris puffergradienssel eluáljuk [1500 ml; gradiens: 50 mmol/l trisz-puffer (pH=8,0), amely 1 mmol/l DTT-t tartalmaz - 50 mmol/l trisz-puffer (pH=7,0), amely 1 mmol/l DTT-t és 1 mol/l NaCI-ot tartalmaz]. Az enzim az oszlopról 370 és 430 mmol/l nátrium-klorid között eluálódik 7,6-es pH-nál. Az aktív frakciókat egyesítjük, és 9 ml-re betöményítjük. A fehérjetartalom 41 mg-ot tesz ki.
További tisztítás céljából a fehérjeoldatot olyan gélfiltrációs kromatográfiás oszlopra (HILoad 26/60 Superdes 75 (Pharmacia) visszük fel, amely az oszlopot 50 mmol/l NaCI-ot és 1 mmol/l DTT-t tartalmazó 50 mmol/l trisz-pufferrel egyensúlyoztuk ki. Az aktív frakciókat egyesítjük, az összfehérje-tartalom: 10,9 mg.
Ezen fehérjeoldatot Mono Q HR5/5 oszlopra (Pharmacia) visszük fel, ahol az oszlopot előzőleg 1 mmol/l DTT-tartalmú 50 mmol/l trisz-pufferrel (pH=8,5) egyensúlyoztuk ki. A fehérjeeluáláshoz lineáris gradienst (40 ml) használunk, 1 mmol/l DTT-t tartalmazó 50 mmol/l trisz-pufferoldat (pH=8,5)—1 mmol/l DTT-t és 1 mol/l NaCI-ot tartalmazó 50 mmol/l trisz-pufferoldat (pH=8,5) formájában. Az enzim 390 mmol/l NaCI és 440 mmol/l NaCI között eluálódik. Az aktív frakciók
1,4 mg fehérjét tartalmaznak.
Az utolsó tisztítási lépéshez fenti pufferrel kiegyensúlyozott fenti oszlopot használunk. Az eluáláshoz gradiensként 0-500 mmol/l NaCI-ot tartalmazó azonos puffért használunk (pH=7,0-8,5). Ily módon 430 pg tiszta enzimet lehetett izolálni.
Az enzim N-terminális szekvenciáját közvetlenül a fehérjesávról határozzuk meg. A szekvencia az alábbi 20 aminosavat tartalmazza: Thr-Glu-GIn-Asn-Leu-HisTrp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-SerAsn.
Ez a szekvencia az ismert fehérjékkel semmilyen homológiát nem mutat.
15. példa
Az enzim jellemzése
Az enzim jellemzését elvégeztük a tisztított enzimmel, valamint a sejtmentes extraktummal, amit Sephadex G-25 oszlopon (PD-10, Pharmacia) sómentesítettünk.
A sejtmentes extraktum fehérjekoncentrációja
7,3 mg/ml, a tisztított enzim fehérjekoncentrációja 135 pg/ml volt. A sejtmentes extraktumhoz nem adtunk PMSF-et.
15.1 Km-meghatározás
A Km-rneghatározást sejtmentes extraktumban végezzük. Az N-acetil-1-amino-4-hidroxi-metil-2ciklopentén-szubsztrátumra vonatkozóan a 7,0 pH-nál végbemenő reakció Km-értéke 30 °C hőmérsékleten 22,5 mmol.
15.2 pH-optimum
Az N-acetil-1 -amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentén hidrolízisénél (25 mmol) a pH-optimumot a tisztított enzimmel és sejtmentes extraktummal 6,2-9,0 pH-tartományban az alábbi pufferoldattal határoztuk meg.
Trisz-puffer: 100 mmol/l, pH=9,0; 8,5; 8,0; 7,5; 7,0.
Citrát-foszfát-puffer 100 mmol/l, pH=7,0; 6,55; 6,2.
Az aktivitást 24 óra hosszat mértük.
A reakció pH-optimuma 7,0 és 7,5 pH között volt az
1R,4S- és az 1S,4R-enantiomerek képződésénél.
A sejtmentes extraktumban a pH-optimum az aktivitás szempontjából 7,0. A szelektivitás azonban kedvezőbb 6,0 és 7,0 pH között.
Az 1. ábra szemlélteti a Rhodococcus erythropolis
CB 101-ből (DSM 10 686) nyert N-acetil-amino-alkohol-hidroláz (sejtmentes extraktum) aktivitásának a pH-értéktől való függését.
15.3 A 15.2 példánál megadott reakció számára a hőmérséklet-optimum 25 és 30 °C között van.
A 2. ábra szemlélteti a Rhodococcus erythropolis
CB 101-ből (DSM 10 686) származó N-acetil-amino-alkohol-hidroláz (sejtmentes extraktum) aktivitását a hőmérséklet függvényében.
15.4 A móltömeget 50 kD-ben határoztuk meg az SDSPAGE szerint.
15.5 Szubsztrátumként az alábbi vegyületeket hidrolizáltuk: N-acetil-1-amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentén, N-butiril-1-amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentén, N-propionil-1-amino-4-hldroxi-metil-2-ciklopentén, N-izobutiril-1-amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentén, N-izobutil-1-amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentén.
16. példa (1R,4S)-1-Amino-4-(hidroxi-metil)-2-ciklopenténhidroklorid előállítása
374,1 g (1 R,4S)-1-amino-4-hidroxi-metÍI-2ciklopentén-oldatot (előállítása a 13. példában leírtak szerint) 123,7 g-ra betöményítünk. Az oldat
60,2 mmol/l koncentrációban a fenti vegyületet (HPLC) tartalmazza, az oldat pH-ját 30%-os NaOH-oldattal 2-es pH-ról 11,7-es értékre állítjuk, majd az oldatot 70-70 ml izobutanollal háromszor extraháljuk. Az egyesített izobutanolextraktumok pH-ját gáz alakú sósavval 1-es értékre állítjuk, az oldatot 65 g-ra betöményítjük, majd szűrjük (a szilárd szennyeződések eltávolítása). A szűrlethez 20 °C hőmérsékleten alapos keverés közben 60 ml acetont csepegtetünk. A zavaros elegyet a cím szerinti vegyület kristályaival beoltjuk, majd 1 óra hosszat 5 °C hőmérsékleten keverjük. Szűrés és szárítás után 5,2 g cím szerinti vegyületet kapunk. Hozam: 58%.
Olvadáspont: 125-127 °C.
ee-érték 98% (hitelesített királis HPLC oszlop).
1 H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 400 MHz 1,44 (m,
1H); 2,35 (m, 1H); 2,83 (m, 1H); 3,42 (m, 2H); 4,10 (s, 1H); 4,80 (s, 1H); 5,80 (d, 1H); 6,06 (d, 1H); 8,13 (s, 3H).
17. példa (1R,4S)-1 -[(2-Amino-6-klór-5-formamido-pirimidin4-il)-amino]-4-(hidroxi-metil)-2-ciklopentén előállítása
2,07 g N-(2-amino-4,6-diklór-pirimidin-5-il)-formamidot 40 ml izobutanollal elegyítünk, az elegyet 80 °C-ra felmelegítjük (fehér szuszpenzió). Az elegy11
HU 226 327 Β1 hez 1,97 g (1R,4S)-1-amino-4-hidroxi-metil-2ciklopentén-hidrokloridot, 3,8 g trietil-amint és 15 ml izobutanolt adunk. Az elegyet 80 °C hőmérsékleten 13 óra hosszat tovább keverjük. A tiszta oldathoz 20 °C hőmérsékleten 10 ml n NaOH-ot adunk, majd az elegyet szárazra betöményítjük. A maradékot flashkromatográfiának vetjük alá (kovasav 60-oszlop, hosszúság: 8 cm, átmérő: 6,5 cm, eluálószer: etil-acetát/metanol 95:5). Az oldószert ledesztillálva és a maradékot szárítva 2,1 g cím szerinti vegyületet kapunk. Hozam: 74%. Olvadáspont: 174-176 °C.
ee-érték 98% (hitelesített királis HPLC oszlop). 1H-NMR (DMSO-dg) 400 MHz: δ (ppm) 1,37 (m,
1H); 2,35 (m, 1H); 2,37 (m, 1H); 3,38 (t, 2H); 4,68 (m, 1H); 5,08 (m, 1H); 5,70 (d, 1H); 5,85 (d, 1H); 6,40; 6,55 és 6,65 (s, d és d, együtt 3H); 7,78 és 8,10 (d és s, együtt 1H); 8,55 és 8,95 (d és s, együtt 1H).
18. példa (1R,4S)-1-[(2-Amino-6-klór-5-formamldo-pirimidin4-il)-amino]-4-(hidroxi-metil)-2-ciklopentén előállítása
145,2 ml 13. példa szerint előállított (1R,4S)-1amino-4-hidroxi-metil-2-ciklopentén-oldatot 25,5 ml térfogatra betöményítünk, majd az oldatot Celiten leszűrjük. A szűrőn maradt szilárd anyagot 7,5 ml vízzel mossuk. A szűrlet 17,7 mmol fenti vegyületet tartalmaz (HPLC); a szűrlet pH-ját sósavval 6,6-es értékről 1-es pH-ra állítjuk, majd az oldatot 20 ml izobutanollal extraháljuk. A szerves fázist elöntjük. A vizes fázis pH-ját 30%-os NaOH-oldattal 12-es értékre állítjuk, majd
10-10 ml izobutanollal háromszor extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 15 ml térfogatra betöményítjük, ehhez 2,53 g trietil-amint adunk. Az elegyhez a 24. példához hasonlóan 2,07 g N-(2-amino-4,6-diklórpirimidin-5-il)-formamidnak 40 ml etanollal készült oldatát adjuk. Az elegyet 80 °C hőmérsékleten 16 óra hosszat keverjük. A feldolgozást a 22. példában leírtak szerint végezzük, (gy 2,4 g cím szerinti vegyülethez jutunk. Hozam: 85%.
A termék fizikai és spektroszkópiai adatai megegyeznek a 17. példában megadottakkal.

Claims (8)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás az (I) vagy (II) képletű (1S,4R)- vagy (1 R,4S)-4-(2-amino-6-klór-9H-purin-9-il)-2-ciklopentén1-metanol vagy e vegyületek sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy az
    - első lépésben a (III) képletű (±)—2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-ont a (IV) általános képletű (±)-2-aza-biciklo[2.2.1]hept-5-én-3-on-származékká acilezzük - e képletben
    R1 jelentése 1-4 szénatomos alkil- vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoport, benzil-, fenil-, benzil-oxi- vagy fenil-oxi-csoport -, majd a
    - második lépésben a kapott vegyületeket (V) általános képletű cikfopenténszármazékká redukáljuk, ahol a képletben R1 jelentése a fenti; majd a
    - harmadik lépésben a kapott vegyületeket N-acetil-amino-alkohol-hidroláz hatású enzimet termelő mikroorganizmus segítségével, amely képes az (V) általános képletű származékot egyetlen nitrogén- vagy egyetlen szénforrásként, vagy egyetlen szén- és nitrogénforrásként hasznosítani, vagy penicillin G-aciláz segítségével a (VI) vagy a (VII) képletű (1R,4S)- vagy (1S,4R)-1-amino-4(hidroxi-metil)-2-ciklopentén-vegyületekké alakítjuk, majd a
    - negyedik lépésben a fentiek szerint kapott vegyületet a (Vili) képletű N-(2-amino-4,6-diklórpirimidin)-5-il)-formamiddal a (IX) vagy a (X) képletű (1S.4R)- vagy (1R,4S)-4-[(2-amino-6-klór-5formamido-4-pirimidinil)-amino]-2-ciklopentén-1metanollá alakítjuk, végül az
    - ötödik lépésben az így kapott vegyületeket az (I) vagy a (II) képletű vegyületté ciklizáljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első lépésben történő acilezést a (XI) általános képletű karbonsav-halogeniddel végezzük, ahol a képletben R1 jelentése 1-4 szénatomos alkil- vagy 1-4 szénatomos alkoxicsoport, benzil-, fenil-, benziloxi- vagy fenil-oxi-csoport, és X jelentése halogénatom, vagy az acilezést egy (XII) általános képletű karbonsavanhidriddel végezzük, ahol a képletben R1 jelentése a fentiekben megadottal azonos.
  3. 3. Az 1. vagy 2. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első lépésben történő acilezést aprotonos oldószerben, és a második lépésben történő redukciót protonos oldószerben végezzük.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második lépésben a redukciót alkálifém- vagy alkáliföldfém-bór-hidriddel, alkálifémvagy alkáliföldfém-alumínium-hidriddel vagy vitriddel végezzük.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik lépésben történő átalakítást Rhodococcus, Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas vagy Alcaligenes/Bordetella mikroorganizmusokkal végezzük.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik lépésben történő átalakítást Bacillus megaterium vagy Escherichia coli mikroorganizmusokból nyert penicillin G-acilázzal végezzük.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik lépésben a biotranszformációt 20-40 °C hőmérsékleten és 5-9 közötti pH-η végezzük.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a negyedik lépésben történő átalakítást egy bázis jelenlétében protonos oldószerben végezzük.
HU9801083A 1997-05-13 1998-05-13 Process for producing (1s,4r)- or (1r,4s)-4-(2-amino-6-chloro-9h-purin-9-yl)-2-cyclopentene-1-methanol HU226327B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH111697 1997-05-13
CH274097 1997-11-27

Publications (4)

Publication Number Publication Date
HU9801083D0 HU9801083D0 (en) 1998-07-28
HUP9801083A2 HUP9801083A2 (hu) 1999-11-29
HUP9801083A3 HUP9801083A3 (en) 2001-09-28
HU226327B1 true HU226327B1 (en) 2008-08-28

Family

ID=25686703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9801083A HU226327B1 (en) 1997-05-13 1998-05-13 Process for producing (1s,4r)- or (1r,4s)-4-(2-amino-6-chloro-9h-purin-9-yl)-2-cyclopentene-1-methanol

Country Status (17)

Country Link
US (4) US6156893A (hu)
EP (2) EP0878548B1 (hu)
JP (3) JP4540136B2 (hu)
KR (2) KR100577886B1 (hu)
CN (2) CN1302116C (hu)
AT (1) ATE275206T1 (hu)
CA (1) CA2237297C (hu)
CZ (3) CZ297887B6 (hu)
DE (1) DE59811884D1 (hu)
DK (1) DK0878548T3 (hu)
ES (1) ES2223095T3 (hu)
HK (1) HK1092782A1 (hu)
HU (1) HU226327B1 (hu)
NO (1) NO324679B1 (hu)
PL (1) PL197848B1 (hu)
PT (1) PT878548E (hu)
SK (3) SK285228B6 (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0705263T3 (da) * 1993-06-21 1997-05-05 Merrell Pharma Inc Carbocycliske nukleoside midler anvendelige som selektive inhibitorer af proinflammatoriske cytokiner
GB9717928D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Glaxo Group Ltd Process for the enatioselective hydrolysis of n-derivatised lactams
GB9721780D0 (en) * 1997-10-14 1997-12-10 Glaxo Group Ltd Process for the synthesis of chloropurine intermediates
SK284416B6 (sk) * 1997-11-27 2005-03-04 Lonza Ag Spôsob výroby derivátov aminoalkoholov
SK285795B6 (sk) 1998-12-23 2007-08-02 Lonza Ag Spôsob výroby enantiomérne obohatených derivátov 1-amino-4-(hydroxymetyl)-cyklopent-2-énu
DK1648851T4 (da) * 2003-07-25 2011-12-19 Prometic Biosciences Inc Fremstilling af metalsalte af fedtsyrer med mellemlange kæder
DE102005061756B4 (de) 2005-12-21 2008-01-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Ramipril
US8236853B1 (en) 2007-12-03 2012-08-07 University Of South Florida Formation of cyclopentene nitro-ester and derivatives
WO2012099904A1 (en) 2011-01-18 2012-07-26 General Atomics Hydrolase enzyme substrates and uses thereof
CN102557990B (zh) * 2011-04-25 2014-06-25 开原亨泰制药股份有限公司 (1s,4r)n-叔丁氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯的制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4950758A (en) * 1988-01-20 1990-08-21 Regents Of The University Of Minnesota Optically-active isomers of dideoxycarbocyclic nucleosides
US4931559A (en) * 1988-01-20 1990-06-05 Regents Of The University Of Minnesota Optically-active isomers of dideoxycarbocyclic nucleosides
MY104575A (en) * 1989-12-22 1994-04-30 The Wellcome Foundation Ltd Therapeutic nucleosides.
CA2055086A1 (en) * 1991-02-12 1992-08-13 Chikara Kaneko Cyclopentene derivatives and their use
US5200527A (en) * 1991-04-08 1993-04-06 Lonza Ltd. Process for the production of 2-azabicyclo [2.2.1] hept-5-en-3-one
GB9204015D0 (en) * 1992-02-25 1992-04-08 Wellcome Found Therapeutic nucleosides
GB9205071D0 (en) * 1992-03-09 1992-04-22 Wellcome Found Therapeutic nucleosides
GB9217823D0 (en) * 1992-08-21 1992-10-07 Glaxo Group Ltd Chemical process
JPH06116217A (ja) * 1992-10-02 1994-04-26 Kuraray Co Ltd (±)−シス−4−アミノシクロペント−2−エンカルボン酸誘導体の光学分割法
GB9402161D0 (en) * 1994-02-04 1994-03-30 Wellcome Found Chloropyrimidine intermediates
WO1997045529A1 (de) * 1996-05-30 1997-12-04 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von aminoalkoholen und derivaten davon
GB9625455D0 (en) * 1996-12-07 1997-01-22 Glaxo Group Ltd Process for resolving mixtures of carbocyclic steroisomers

Also Published As

Publication number Publication date
SK285228B6 (sk) 2006-09-07
ES2223095T3 (es) 2005-02-16
NO324679B1 (no) 2007-12-03
HUP9801083A3 (en) 2001-09-28
US6252112B1 (en) 2001-06-26
CN1302116C (zh) 2007-02-28
CA2237297A1 (en) 1998-11-13
US6156893A (en) 2000-12-05
CZ297887B6 (cs) 2007-04-18
CZ297888B6 (cs) 2007-04-18
ATE275206T1 (de) 2004-09-15
PL326267A1 (en) 1998-11-23
CN1201794A (zh) 1998-12-16
SK285229B6 (sk) 2006-09-07
PT878548E (pt) 2005-01-31
CZ297894B6 (cs) 2007-04-25
HK1092782A1 (en) 2007-02-16
PL197848B1 (pl) 2008-05-30
US6137007A (en) 2000-10-24
DK0878548T3 (da) 2004-12-06
JP2010106025A (ja) 2010-05-13
HUP9801083A2 (hu) 1999-11-29
CN1115343C (zh) 2003-07-23
KR19980086933A (ko) 1998-12-05
EP1502914A1 (de) 2005-02-02
JPH115793A (ja) 1999-01-12
KR100601764B1 (ko) 2006-07-19
EP0878548A3 (de) 1999-10-13
DE59811884D1 (de) 2004-10-07
SK284810B6 (sk) 2005-12-01
KR100577886B1 (ko) 2006-08-30
US6262295B1 (en) 2001-07-17
CN1515673A (zh) 2004-07-28
EP0878548A2 (de) 1998-11-18
HU9801083D0 (en) 1998-07-28
CA2237297C (en) 2008-03-11
JP4540136B2 (ja) 2010-09-08
JP2010116397A (ja) 2010-05-27
SK58998A3 (en) 1998-12-02
CZ145898A3 (cs) 1998-12-16
EP0878548B1 (de) 2004-09-01
NO982149D0 (no) 1998-05-12
NO982149L (no) 1998-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100601764B1 (ko) (1s,4r)- 또는(1r,4s)-4-(2-아미노-6-클로로-9h-푸린-9-일)-2-시클로펜텐-1-메탄올의 제조 방법
US7405065B2 (en) Enzyme for the preparation of 1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyclopentene derivatives
US20020037559A1 (en) Process for producing n-protected d-proline derivatives
KR100562734B1 (ko) 아미노 알코올 및 그의 유도체의 제조방법
JP2001506500A (ja) D−プロリン誘導体を調製する方法
JP2000515010A (ja) 微生物を用いてd―プロリン誘導体を調製する方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees