JPH115793A - (1s,4r)−または(1r,4s)−4−(2−アミノ−6−クロロ−9h−プリン−9−イル)−2−シクロペンテン−1−メタノールの製造方法 - Google Patents
(1s,4r)−または(1r,4s)−4−(2−アミノ−6−クロロ−9h−プリン−9−イル)−2−シクロペンテン−1−メタノールの製造方法Info
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- JPH115793A JPH115793A JP10129338A JP12933898A JPH115793A JP H115793 A JPH115793 A JP H115793A JP 10129338 A JP10129338 A JP 10129338A JP 12933898 A JP12933898 A JP 12933898A JP H115793 A JPH115793 A JP H115793A
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Abstract
る。 【解決手段】 第一段階で(±)−2−アザビシクロ
[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−オンをアシル化
し第二段階でこれを還元してシクロペンテン誘導体と
し、第三段階でこれを窒素源および(または)炭素源と
して資化する能力をもった微生物を利用するか、または
N−アセチルアミノアルコール・ヒドロラーゼ活性など
を有する酵素を利用するかして(1S,4R)−または
(1R,4S)−1−アミノ−4−(ヒドロキシメチ
ル)−2−シクロペンテン誘導体とし、第四段階でこれ
を(1S,4R)−または(1R,4S)−4−[(2
−アミノ−6−クロロ−5−フォルムアミド−4−ピリ
ミジニル)アミノ]−2−シクロペンテン−1−メタノ
ールとし、第五段階でこれを既知の手法により環化す
る。
Description
IIの(1S,4R)−または(1R,4S)−4−(2
−アミノ−6−クロロ−9H−プリン−9−イル)−2
−シクロペンテン−1−メタノール
IおよびXVIIの光学活性な化合物
−クロロ−9H−プリン−9−イル)−2−シクロペン
テン−1−メタノールは、2−アミノプリン・ヌクレオ
シドの製造、たとえば(1S,4R)−4−[2−アミ
ノ−6−(シクロプロピルアミノ)−9H−プリン−9
−イル]−2−シクロペンテン−1−メタノールの製造
(WO 95/21 161)、または1592U89
(J.Org.Chem.,1996,61,4192
−4193; J.Org.Chem.,1996,6
1,7963−7966)の製造における、重要な中間
体である。
ペンテン−1−メタノールから出発する(1S,4R)
−4−(2−アミノ−6−クロロ−9H−プリン−9−
イル)−2−シクロペンテン−1−メタノールの製造
は、WO 95/21 161に記述されている。 その
方法の不利な点は、前駆体(1S,4R)−4−アミノ
−2−シクロペンテン−1−メタノールが、(±)−2
−アザビシクロ[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−
オンの、費用のかかるBOC保護基(t−ブチロキシカ
ルボニル保護基)で置換されたものを経て、初めて入手
できるということである(J.Org.Chem.,1
995,60,4602−4616)。
S,4R)−または(1R,4S)−4−(2−アミノ
−6−クロロ−9H−プリン−9−イル)−2−シクロ
ペンテン−1−メタノールの、簡単でコストが安く、か
つ経済的な製造方法を提供することにある。
記載の新規な方法によって達成される。
(±)−2−アザビシクロ[2.2.1]ヘプト−5−
エン−3−オン
2−アザビシクロ[2.2.1]ヘプト−5−エン−3
−オン誘導体
コキシ、アリールまたはアリロキシを表す。)を得るこ
とからなる。
し、非置換であってもよい。 ここで置換C1-4 アルキ
ルとは、ハロゲン原子で置換されているものを意味す
る。F,Cl,BrまたはIが、ハロゲン原子として使
用できる。 C1-4 アルキルのを挙げれば、メチル、エ
チル、プロピル、ブチル、イソブチル、t−ブチル、イ
ソプロピル、クロロメチル、ブロモメチル、ジクロロメ
チル、ジブロモメチルである。 C1-4 アルキルとして
好ましく使用されるものは、メチル、エチル、プロピ
ル、ブチル、イソブチルまたはクロロメチルである。
トキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、t−ブトキ
シまたはイソブトキシを使用することができる。 C
1-4 アルコキシとして好ましく使用されるものは、t−
ブトキシである。
はベンジル、好ましくはフェニルを使用することができ
る。 アリロキシとしては、たとえばベンジロキシまた
はフェノキシが使用できる。
[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−オンは、EP−
A 0508352の開示に従って製造できる。
ン化物
ン酸無水物
し、Xはハロゲン原子を表す。 F,Cl,Brまたは
Iがハロゲン原子として使用できる。 ClまたはFが
好ましく使用される。)を使用することによって実施で
きる。
クロライド、クロロアセチルクロライド、ブチリルクロ
ライド、イソブチリルクロライド、フェニルアセチルク
ロライド、ベンジルクロロフォルメート(Cbz−C
l)、プロピオニルクロライド、ベンゾイルクロライ
ド、アリルクロロフォルメートまたはt−ブチロキシカ
ルボニルフルオライドである。 カルボン酸無水物の例
は、ジ−t−ブチルジカーボネート、無水ブタン酸、無
水酢酸または無水プロピオン酸である。
ともできるし、アプロティックな溶剤を使用して実施す
ることもできる。
都合に実施することができる。 適切なアプロティック
溶剤の例は、ジイソプロピルエーテル、ピリジン、アセ
トニトリル、ジメチルフォルムアミド、トリエチルアミ
ン、テトラヒドロフラン、トルエン、メチレンクロライ
ド、N−メチルピロリジンまたはこれらの混合物であ
る。
くは0〜25℃において、好都合に実施することができ
る。
(±)−2−アザビシクロ[2.2.1]ヘプト−5−
エン−3−オン誘導体を還元して、一般式Vのシクロペ
ンテン誘導体
とする。
ドもしくはアルカリ土類金属ボロハイドライドを使用し
て、またはアルカリ金属アルミニウムハイドライドもし
くはアルカリ土類金属アルミニウムハイドライド、また
はヴィトライド“Vitride”すなわちナトリウム
・ビス(2−メトキシエチル)アルミニウム・ハイドラ
イドを使用して、好都合に実施することができる。 ナ
トリウムまたはカリウムのアルミニウムハイドライド
が、アルカリ金属アルミニウムハイドライドとして使用
できる。 カルシウムボロハイドライドが、アルカリ土
類金属ボロハイドライドとして使用できる。 アルミニ
ウムナイトライドが、ナイトライドとして使用できる。
実施することができる。 使用できるプロティックな溶
剤は、低級アルコールたとえばメタノール、エタノー
ル、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、se
c-ブタノール、t-ブタノール、イソブタノールもしくは
水、または上記のアルコールと水との混合物である。
0〜20℃において、好都合に実施することができる。
のシクロペンテン誘導体を、式VIまたはVII の(1S,
4R)−または(1R,4S)−1−アミノ−4−(ヒ
ドロキシメチル)−2−シクロペンテン誘導体
は、N−アセチルアミノアルコール・ヒドロラーゼ活性
またはペニシリンGアシラーゼ活性を有する酵素を利用
するかして、実施する。 このバイオ変換は、アシル化
された(1S,4R)−または(1R,4S)−アミノ
アルコールを変換して(1R,4S)−または(1S,
4R)−1−アミノ−4−(ヒドロキシメチル)−2−
シクロペンテン(一般式VIまたはVII)とする。
の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒
素源および唯一の炭素源として資化する能力をもった微
生物は、すべてこの変換に適している。 そのような微
生物は、土壌のサンプル、スラッジ、または排水から、
それらを、一般式Vのシクロペンタン誘導体を、
有するか、または ・唯一の炭素源として含有し、かつ適宜の窒素源をも含
有する 栄養培地中で、常法に従って培養することにより、単離
することができる。
ものの例は、N−アセチル−、N−プロピオニル−、N
−イソブチリル−、N−t−ブトキシカルボニル(N−
BOC)、N−ブチリルまたはN−フェニルアセチル−
1−アミノ−4−ヒドロキシメチル−2−シクロペンタ
ンである。
アンモニア、硝酸塩、アミノ酸または尿素を、成長の基
質として利用することができる。 微生物は、適当な炭
素源として、たとえば糖類、糖アルコール、C2−C4カ
ルボン酸またはアミノ酸を、成長の基質として利用する
ことができる。 グルコースのようなヘキソースや、ペ
ントースが糖類として使用できる。 たとえばグリセロ
ールは、糖アルコールとして使用できる。 C2−C4カ
ルボン酸としては、たとえば酢酸またはプロピオン酸が
使用できる。 アミノ酸としては、たとえばロイシン、
アラニン、アスパラギンが使用できる。
として使用できるものは、当業者が常用しているもの、
たとえば下記の表1に記載したもの、または完全培地
(イーストエキスを含有する培地)たとえば栄養イース
トブロス(NYB)であるが、表1に記載のものを使用
することが好ましい。
好都合に誘発される。 一般式Vのシクロペンテン誘導
体は、酵素誘発剤として役立つ。
40℃、好ましくは30℃から38℃で、pH5.5か
らpH8の間で、好ましくはpH6.8からpH7.8
の間で行なわれる。
ち(1S,4R)異性体を唯一の炭素源として、唯一の
炭素源および窒素源として、または唯一の窒素源として
資化するものを用いて実施するのが好適である。
ス/ボルデテラ(Alcaligenes/Bordetella)、ロドコッカ
ス(Rhodococcus)、アースロバクター(Arthroebacter)、
アルカリゲネス(Alcaligenes)、アグロバクテリウム/
リゾビウム(Agrobacterium/rhizobium)、バチルス(Baci
llus)、シュードモナス(Pseudomonas) またはゴルドナ
(Gordona)属の微生物を利用して実施する。 とりわけ
好ましいのは、アルカリゲネス/ボルデテラFB188
(DSM11172)種、ロドコッカス・エリスロポリ
ス(R. erythropolis)CB101(DSM10686)
種、アースロバクターsp.HSZ5(DSM1032
8)、ロドコッカスsp.FB387(DSM1129
1)、アルカリゲネス・キシロソキシダンス(A. xyloso
xydans)ssp.デニトリフィカンス(denitrificans)H
SZ17(DSM10329)、アグロバクテリウム/
リゾビウムHSZ30、バチルス・シンプレックス(B.s
implex)K2、シュードモナス・プチダ(S. putuda)K3
2、またはゴルドナsp.CB100(DSM1068
7)、およびこれらの機能的に同等な変異種および突然
変異種である。 ブダペスト条約に従う、ドイッチェ・
ザンムルング・フォン・ミクロオーガニスメン・ウント
・ツエルクルトゥーレンGmbH,マシェローダヴェク
1b,D38124,ブラウンシュヴァイクへの寄託
は、微生物DSM10686およびDSM10687に
関しては1995年5月20日、微生物DSM1032
8およびDSM10329に関しては1995年11月
6日、微生物DSM11291に関しては1996年1
0月8日、そして微生物DSM11172に関しては1
995年9月20日に、それぞれ行なわれた。
種」とは、オリジナルな微生物として本質的に同じ特性
と機能を有する微生物を意味する。 この種の変異種お
よび突然変異種は、偶然に、たとえばUV照射によって
作り出すことができる。
古くなると棒状体と球状体とに分解する。 コロニーは
光輝があり、部分的に融合的であって、ピンク色を帯び
たベージュ色。 RAL 1001; 2.ペプチドグリカンの判別されたアミノ酸: メソジ
アミノピメリン酸; 3.ミコリン酸: ロドコッカスミコリン酸; ミコリ
ン酸鎖長(C32−C44)の測定、および寄託時のデータ
をDSMのミコリン酸データバンクと比較することによ
り、ロドコッカス・エリスロポリス株のパターンとの間
に、大きな類似性のあることがわかった(類似度0.5
88)。 4.脂肪酸パターン:非分岐の飽和および不飽和の脂肪
酸にプラスしてチューバーキュロステアリン酸。 5.菌株の16S rDNA の部分的な配列に基づい
て、ロドコッカス・エリスロポリスの特定の領域におけ
る配列との間に、高いレベルでの一致(100%) が
見出された。
その理由は、3種(ミコリン酸、脂肪酸、16S rD
NA)の相互に独立した方法で、この菌株にロドコッカ
ス・エリスロポリス種の判定が与えられたからである。
87)の分類学的記述 1.コロニーの形態および色: 短い分岐した菌糸で、
古くなると棒状体と球状体とに分解する。 コロニーは
淡いオレンジ色。(RAL 2008); 2.ペプチドグリカンの判別されたアミノ酸: メソジ
アミノピメリン酸; 3.メナキノン・パターン: MK−9(H2)100
%; 4.ミコリン酸: ゴルドナミコリン酸; ミコリン酸
の鎖長(C50−C60)は高温ガスクロマトグラフィーに
よって測定した。 そのパターンは、代表的なゴルドナ
属に見いだされるパターンに対応している。
不飽和の脂肪酸にプラスしてチューバーキュロステアリ
ン酸。 6.菌株の16S rDNA の部分的な配列に基づい
て、ゴルドナ・リュブロパーチンクタ(G. rubropertinc
ta) の特定の領域における配列との間に、比較的低い一
致(98.8%)が見出されただけである。
脂肪酸、16S rDNA)に基づけば、単離した菌は
ゴルドナ属に非多義的に分類できないわけではないが、
これらの結果だけで既知のゴルドナのいずれかの種に分
類することは不可能である。
較可能な程度に大きい類似性が、アグロバクテリウム属
およびリゾビウム属の代表的なものとの間に見いだされ
た。 これらの属の中での、特定の種に非多義的な分類
をすることは可能ではない。
認された。16S rDNA の部分的配列決定により、
バチルス・シンプレックスへの類似性が100%認めら
れた。
ダに典型的なものである。16S rDNA の部分的な
配列により、シュードモナス・メンドシーナ(P.mendoci
na)およびシュードモナス・アルカリゲネス(P. alcalig
enes)への類似性が、、約98%認められた。 シュード
モナス・プチダへの類似性は、97.4%であった。
1291)の分類学的記述 1.コロニーの形態および色: 短い分岐した菌糸で、
古くなると棒状体と球状体とに分解する。 コロニーは
ツヤがなく、淡い赤オレンジ色。 RAL 2008; 2.ペプチドグリカンの判別されたアミノ酸: メソジ
アミノピメリン酸; 3.ミコリン酸: ロドコッカスミコリン酸; ミコリ
ン酸鎖長(C32−C44)の測定、および寄託時のデータ
をDSMのミコリン酸データバンクと比較することによ
り、ロドコッカス・ルーバー(R. ruber)株のパターンと
の間に、ごく小さな類似性のあることがわかった(類似
度0.019)。 この相関係数はあまりに低く、種の
同定には使えない。
不飽和の脂肪酸にプラスしてチューバーキュロステアリ
ン酸。 この脂肪酸パターンは、ロドコッカス属の代表
的な菌のすべてとそれに近い関係を有するもの、たとえ
ばミコバクテリウム(Mycobacterium)、ノカルディア(No
cardia) およびゴルドナに関して、判別を可能にするも
のである。 脂肪酸パターンの定性的および定量的な相
違を含めることによって、種のレベルへの異同の決定を
行なうことを企てた。 多数の方法を利用して、ロドコ
ッカスsp.FB387の脂肪酸パターンのデータをデ
ータバンクのそれらと比較した。 しかし、この方法で
は、ロドコッカスsp.FB387を、すでに記述され
たいずれかの種に分類することは、類似度が小さい
(0.063)ため、可能ではなかった。
列に基づいて、96−818は、ロドコッカス・オパク
ス(R. opacus)に、相関度97.9%をもって分類され
た。この配列の一致は、この分類の非多義的な種の決定
に必要な99.5%に対して、はるかに低い。
p.FB387株は、新規であって、いまだロドコッカ
ス種において記述されたことがないと推測される。
の初期の培養の後、静止細胞(成長していない細胞で、
もはや炭素源もエネルギー源も必要としない)を用い
て、または成長している細胞を用いて、実施することが
できる。 バイオ変換は、静止細胞を用いて実施するこ
とが好ましい。
ーゼ活性を有し、バイオ変換に適切な酵素は、上述した
微生物の細胞から、当業技術で常用の方法たとえば細胞
壁の破壊によって、単離することができる。 この目的
には、たとえば超音波またはフレンチプレス法が利用で
きる。 これらの酵素は、微生物ロドコッカス・エリス
ロポリスCB101(DSM10686)から単離する
ことが好ましい。
微生物から得ることができる。 たとえば、バクテリア
またはアクチノミセテスであり、とりわけ下に記す微生
物である: エシェリチア・コリ ATCC 9637、
バチルス・メガテリウム、ストレプトミセス・ラベンデ
ュラエ(Streptmyces lavendulae) ATCC 1366
4、ノカルディアsp.ATCC 13635、プロビ
デンシア・レットゲリ(Providencia rettgeri) ATC
C 9918、アースロバクター・ヴィスコスス(A.visc
osus) ATCC 15294、ロドコッカス・ファシア
ンス(R. fascians)ATCC 12975、ストレプトミ
セス・フェオクロモゲネス(Streptmyces phaeochromoge
nes) ATCC 21289、アクロモバクター ATC
C 23584およびミクロコッカス・ロゼウス(Microc
occus roseus) ATCC 416。購入可能なペニシリ
ンGアシラーゼが使用でき、たとえば、E.コリからの
ペニシリンGアシラーゼEC3.5.1.11(ベーリ
ンガー・マンハイム)またはバチルス・メガテリウムか
らのものが使用できる。
ましい態様で使用される。
とえば水に低いモル濃度で溶解したフォスフェート、シ
トレートまたはヘペス(Hepes)の緩衝液、完全培地たと
えば栄養イーストブロス(NYB)または前掲の表の培
地を使用して実施できる。バイオ変換は、好ましくは表
1に記載した培地、または低モル濃度フォスフェート緩
衝液中で実施する。
導体(式V)の一回の、または連続的な添加のもとに、
その濃度が10重量%、好ましくは2重量%を超えない
ようにして行なうのが好都合である。
しくは6から8の範囲内とすることができる。 バイオ
変換は、温度20から40℃、好ましくは25から30
℃において、好都合に実施できる。
体(式VIまたはVII)は、式VIIIのN−(2−アミノ−
4,6−ジクロロ−5−ピリミジニル)フォルムアルデ
ヒド
−または(1R,4S)−4−[(2−アミノ−6−ク
ロロ−5−フォルムアミド−4−ピリミジニル)アミ
ノ]−2−シクロペンテン−1−メタノール
−ピリミジニル)フォルムアミドは、WO 95/21
161の開示に従って製造することができる。
するこっとができる。 塩基としては、有機塩基も無機
塩基も使用できる。 トリアルキルアミンが、有機塩基
として使用できる。 使用できるトリアルキルアミンの
例は、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリベン
ジルアミン、ピリジンまたはN−メチルピロリドンであ
る。 使用できる無機塩基の例は、アルカリ金属または
アルカリ土類金属の炭酸塩、またはアルカリ金属または
アルカリ土類金属の炭酸水素塩、たとえば炭酸カリウム
または炭酸水素ナトリウムである。
中で好都合に実施できる。 低級脂肪族アルコール、た
とえばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプ
ロパノール、ブタノールなたはイソブタノールが、プロ
ティックな溶媒として使用できる。
好ましくは20から100℃において好都合に実施でき
る。
たは(1R,4S)−4−[(2−アミノ−6−クロロ
−5−フォルムアミド−4−ピリミジニル)アミノ]−
2−シクロペンテン−1−メタノール(式IX,X)を、
WO 95/21 161に開示された既知の方法によっ
て環化し、式IまたはIIの最終生成物とする。
溶解して、濃厚な水性の酸の存在下に実施する。 使用
できるオルト蟻酸トリアルキルは、トリメチルまたはト
リエチル・オルトフォルメートである。 水性の酸とし
ては、たとえば、塩酸、硫酸またはメタンスルフォン酸
を使用することができる。
光学活性な化合物
の製造方法にも関する。 これらの化合物は、式Vのシ
クロペンテン誘導体を、
微生物、N−アセチルアミノ−アルコール・ヒドロラー
ゼまたはペニシリンGアシラーゼを利用して、式VIおよ
びVII(1R,4S)−または(1S,4R)−1−ア
ミノ−(ヒドロキシメチル)−2−シクロペンテン
Iの化合物にすることによって、製造することができ
る。 これらの手段については、すでに記述した。
に述べたところとそれ自体同じ条件で実施することがで
きる。
は20℃から80℃において好都合に実施することがで
きる。
合物の例は、(1R,4S)−N−t−ブトキシカルボ
ニル−1−アミノ−4−(ヒドロキシメチル)−2−シ
クロペンテンのee98%のもの、(1R,4S)−N
−アセチル−1−アミノ−4−(ヒドロキシメチル)−
2−シクロペンテンのee98%のもの、(1R,4
S)−N−ブチリル−1−アミノ−4−(ヒドロキシメ
チル)−2−シクロペンテンのee98%のもの、光学
活性な(1S,4R)−N−アセチル−1−アミノ−4
−(ヒドロキシメチル)−2−シクロペンテンおよび光
学活性な(1S,4R)−N−ブチリル−1−アミノ−
4−(ヒドロキシメチル)−2−シクロペンテンであ
る。
R,4S)−N−ブチリル−1−アミノ−4−(ヒドロ
キシメチル)−2−シクロペンテンは、文献未記載の化
合物である。 従って、本発明は光学活性な(1R,4
S)−N−ブチリル−1−アミノ−4−(ヒドロキシメ
チル)−2−シクロペンテンのエナンチオマーエクセス
が0%を超えるもの、好ましくは80%以上、90%な
いし95%のエナンチオマーエクセス、とりわけ98%
以上のエナンチオマーエクセスを有するものにも関す
る。 これらの光学活性な化合物は、当業者に既知の手
法によってラセミ化し、ラセミ体のN−ブチリル−1−
アミノ−4−(ヒドロキシメチル)−2−シクロペンテ
ンとすることができる。 これもまた、文献に記載され
たことがない物質である。
キシメチル)−2−シクロペンテン誘導体
の製造は、第一段階において、式XIVのシクロペンテン
−4−カルボン酸
れかを、一般式XIのカルボン酸ハロゲン化物
する。)を使用してアシル化し、一般式XVのシクロペン
テン−4−カルボン酸誘導体としたのち、
の所望の化合物を得ることからなる。
ル)−シクロペンテン誘導体(式XIII)および光学活性
4−(ヒドロキシメチル)−シクロペンテン誘導体(式
XV)の語は、対応する(1R,4S)または(1S,4
R)異性体を意味する。
は、一般式XIのハロゲン化カルボニルを使用して実施す
る。 使用できるハロゲン化カルボニルは、すでに記載
したところで挙げたものと同じであって、t−ブチロキ
シカルボニルが好ましく使用される。
くは12〜14、温度0〜50℃、好ましくは15〜2
5℃で、好都合に実施できる。
である。 使用できるエーテル類はジオキサン、テトラ
ヒドロフラン、ジエチルエーテル、グリコールのジメチ
ルまたはジエチルエーテルである。
リ金属アルミニウムハイドライドを用いて、ボラン/ジ
−C1-4 アルキルサルファイド錯体を用いて、またはボ
ラン/テトラヒドロフラン錯体を用いて実施することが
できる。 リチウム、ナトリウムまたはカリウムのアル
ミニウムハイドライドが、アルカリ金属アルミニウムハ
イドライドとして使用でき、中でもリチウムアルミニウ
ムハイドライドが好ましく使用される。 ボラン/ジメ
チルサルファイド、ボラン/ジエチルサルファイド、ボ
ラン/ジプロピルサルファイドまたはボラン/ジブチル
サルファイドの錯体が、ボラン/ジ−C1-4 アルキルサ
ルファイド錯体として使用できる。 ボラン/ジメチル
サルファイド錯体が好ましく使用される。
たエーテル類のいずれかを、水を混合せずに使用するこ
とが好都合である。
ましくは−25〜−10℃において実施することができ
る。
1]ヘプト−5−エン−3−オンの製造 100gの(±)−2−アザビシクロ[2.2.1]ヘ
プト−5−エン−3−オンをアセトニトリル(800m
l)およびピリジン(161.26ml)中に、窒素雰囲
気下に溶解した。 12℃において、104.5gのア
セチルクロライドを、2時間にわたって、滴下して加え
た。 混合物を、室温で4.5時間撹拌した。 800
mlの水を混合物に加え、アセトニトリルを減圧下に蒸発
させて除いた。 水相を3回、400mlの酢酸エチルで
抽出した。 一体にした有機相を1NのHCl(400
ml)、水(400ml)、飽和NaCl溶液(400ml)
で洗浄したのち、硫酸マグネシウムで乾燥し、完全に蒸
発させた。 その残渣をメチレン・クロライドにとり、
シリカゲルを通して濾過した。 濾液を濃縮し、生成物
を蒸留により精製した。 107.76gの生成物が、
透明な液体として得られた。 収率は71%。 沸点
(0.07torr):51℃。
1]ヘプト−5−エン−3−オンの製造 100.3gの(±)−2−アザビシクロ[2.2.
1]ヘプト−5−エン−3−オンを、アセトニトリル
(720ml)およびピリジン(142ml)中に、窒素雰
囲気下に溶解した。 12℃において、141.8gの
ブチリルクロライドを、1時間にわたって滴下して加え
た。 混合物を、室温で3時間撹拌した。720mlの水
を混合物に加え、各相を分離した。 アセトニトリルは
減圧下に蒸発させて除き、水相を3回、300mlの酢酸
エチルで抽出した。 一体にした有機相を1NのHCl
(350ml)、飽和NaCl溶液(400ml)および水
(500ml)で洗浄したのち、硫酸マグネシウムで乾燥
し、完全に蒸発させた。 生成物を蒸留により精製し
た。 107.76gの生成物が、透明な液体として得
られた。 収率は85%。 沸点(0.05torr):7
0℃。
[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−オンの製造 33.4gの(±)−2−アザビシクロ[2.2.1]
ヘプト−5−エン−3−オンを、アセトニトリル(24
0ml)およびピリジン(48.3ml)中に、窒素雰囲気
下に溶解した。 12℃において、68.6gのフェニ
ルアセチルクロライドを、30分間にわたって滴下して
加えた。 混合物を、室温で3.5時間撹拌した。 2
40mlの水を混合物に加えた。 アセトニトリルを減圧
下に蒸発させて除き、水相を3回、酢酸エチル(150
ml)で抽出した。 一体にした有機相を1NのHCl
(150ml)、飽和NaCl溶液(150ml)および水
(150ml)で洗浄したのち、硫酸マグネシウムで乾燥
し、完全に蒸発させた。 粗生成物を、シリカゲルを通
して(ヘキサン:酢酸エチル=1:1)精製した。7
8.34gの粗生成物が、黄色の油として得られた。
2.1]ヘプト−5−エン−3−オンの製造 47gの(±)−2−アザビシクロ[2.2.1]ヘプ
ト−5−エン−3−オンを、アセトニトリル(325m
l)およびピリジン(41ml)中に、窒素雰囲気下に溶
解した。 12℃において、43.9gのプロピオニル
クロライドを、1時間にわたって滴下して加えた。 混
合物を、室温で5時間撹拌した。 145mlの水を混合
物に加え、アセトニトリルを減圧下に蒸発させて除い
た。 水相を3回、115mlの酢酸エチルで抽出した。
一体にした有機相を、1NのHCl(140ml)、飽
和したNaHCO3溶液(40ml)およびNaCl溶液
(40ml)で洗浄したのち、硫酸ナトリウムで乾燥し、
完全に蒸発させた。 残渣を蒸留により精製した。 5
5.8gの標題化合物が得られ、放置したところ固化し
た。 収率は81.6%であった。 沸点:2.8mbarにおいて75−80℃ 融点:54−56℃。
2.1]ヘプト−5−エン−3−オンの製造 45.1gの(±)−2−アザビシクロ[2.2.1]
ヘプト−5−エン−3−オンを、アセトニトリル(31
0ml)およびピリジン(39ml)中に、窒素雰囲気のも
とに溶解した。 10℃において、54.1gのイソブ
チリルクロライドを、1時間にわたって滴下して加え
た。 混合物を、室温で5時間撹拌した。140mlの水
を混合物に加え、アセトニトリルを減圧下に蒸発させて
除いた。水相を4×120mlの酢酸エチルで抽出した。
一体にした有機相を、1NのHCl(50ml)、飽和
したNaHCO3溶液(50ml)およびNaCl溶液
(50ml)で洗浄したのち、硫酸ナトリウムで乾燥し、
完全に蒸発させた。 残渣をn−ヘキサン(240ml)
中、活性炭とともに、環流下に沸騰させた。 活性炭を
濾過して分け、濾液を0℃に冷却して、標題化合物を濾
過により分け取った。54.5gの生成物が得られた。
収率は76%であった。 融点:41−42℃。
2.1]ヘプト−5−エン−3−オンの製造 10.1gの(±)−2−アザビシクロ[2.2.1]
ヘプト−5−エン−3−オンを、ジクロロメタン(10
ml)、ピリジン(8.4ml)および0.22gの4−
N,N−ジメチルアミノピリジンの混合物中に、10℃
で、窒素雰囲気下に溶解した。 13.5gのクロロア
セチルクロライドを、1時間にわたって滴下して加え
た。 温度は44℃に上昇した。 混合物をさらに2時
間、室温で撹拌した。 100mlの水を混合物に加え
た。 相分離の後、水相を100mlのジクロロメタンで
抽出した。 一体にした有機相を硫酸ナトリウムで乾燥
し、完全に蒸発させた。 残渣を、100mlジイソプロ
ピルエーテル中、1gの活性炭の存在下に、10分間、
環流下に沸騰させた。 熱濾過したのち、濾液を室温に
冷却して、固体を濾過により分け、乾燥した。 10.
35gの標題化合物が得られた。 収率は60%であっ
た。 融点:86−88℃。
ル)−2−シクロペンテンの製造 79.56gの(±)−2−アセチル−2−アザビシク
ロ[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−オンを、エタ
ノール(450ml)中に、窒素雰囲気下に溶解して、−
10℃に冷却した。 19.8gのナトリウム・ボロハ
イドライドを、小部分に分けて45分間にわたって添加
した。
硫酸でpHを1.8に調節した。酢酸エチル(200m
l)をこの混合物に加え、固体を濾過分離した。 つい
で完全に蒸発させた。 残渣を水にとり、メチレンクロ
ライドで洗浄して、蒸発させた。 粗生成物を、シリカ
ゲルで濾過することにより精製した。 51.83gの
生成物が、白色の固体として得られた。 収率は、使用
した2−アセチル−2−アザビシクロ[2.2.1]ヘ
プト−5−エン−3−オンを基準にして、64%であっ
た。
ル)−2−シクロペンテンの製造 73.87gの(±)−2−ブチリル−2−アザビシク
ロ[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−オンを、エタ
ノール(400ml)に、窒素雰囲気下に溶解して、−1
0℃に冷却した。 15.68gのナトリウム・ボロハ
イドライドを、小部分に分けて、45分間にわたって添
加した。 混合物を3時間、0℃で撹拌し、ついで濃硫
酸でpHを1.5に調節した。 酢酸エチル(200m
l)をこの混合物に加え、固体を濾過分離した。 つい
で完全に蒸発させた。 残渣を水にとり、メチレンクロ
ライドで洗浄して、蒸発させたのち、高度の減圧下に乾
燥した。 60.55gの生成物が得られた。 収率
は、使用した2−ブチリル−2−アザビシクロ[2.
2.1]ヘプト−5−エン−3−オンを基準にして、8
0%であった。 融点:71−72℃。
シメチル)−2−シクロペンテンの製造 77gの粗製の(±)−2−フェニルアセチル−2−ア
ザビシクロ[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−オン
を、エタノール(450ml)に、窒素雰囲気下に溶解し
て、−10℃に冷却した。 13.2gのナトリウム・
ボロハイドライドを、小部分に分けて、1時間にわたっ
て添加した。 混合物を3.5時間、室温で撹拌し、つ
いで濃硫酸でpHを1.8に調節した。 この混合物
を、シリカゲル濾過(ヘキセン:酢酸エチル=2:8)
により精製した。 酢酸エチルからの再結晶をへて、1
5.89gの白色の固体が得られた。 収率は、使用し
た2−フェニルアセチル−2−アザビシクロ[2.2.
1]ヘプト−5−エン−3−オンを基準にして、80%
であった。
ル)−2−シクロペンテン(BOC=t−ブトキシカル
ボニル)の製造 15gの粗製の(±)−1−アミノ−4−ヒドロキシメ
チル−2−シクロペンテン塩酸塩(J.Org.Che
m.,1981,46,3268の記載に従って製造)
を、150mlの水と150mlのジオキサンとの混合物
に、窒素雰囲気下に室温で溶解した。 溶液のpHを1
N−NaOHで14に調整し、t−ブチロキシカルボニ
ル・フルオライド(BOC−F,20%過剰)のジエチ
ルエーテル溶液を加えて、混合物をさらに3時間、室温
で撹拌した(BOC−Fは、Syntheis,197
5,599の開示に従って製造した)。 濃塩酸を加え
て、pHを2に調節した。 有機溶剤の蒸留除去後、5
0mlの水を残渣に加え、その混合物を3×100mlの酢
酸エチルで抽出した。 一体にした有機相を、完全に蒸
発させた。 残渣を、110mlのジイソプロピルエーテ
ルと80mlのn−ヘキサンとの混合溶媒から再結晶し
た。 11.95gの標題化合物が得られた。収率は5
6%であった。 融点:68−70℃。
チル)−2−シクロペンテンの製造 16.6gの粗製の(±)−2−プロピオニル−2−ア
ザビシクロ[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−オン
を、水(140ml)および2−ブタノール(66ml)の
混合溶媒に、窒素雰囲気下に溶解して、−5℃に冷却し
た。 3gのナトリウム・ボロハイドライドを、小部分
に分けて、2時間にわたって添加した。混合物を10℃
で2.5時間撹拌し、ついで濃塩酸と水の混合物(1/
1)で、pHを2.2に調節した。 この溶液を蒸発濃
縮して40gとし、2N−NaOHでpHを6.2に調
節した。 混合物を、5×50mlのジクロロメタンで抽
出した。 一体にした有機相を完全に蒸発させ、残渣を
トルエン(150ml)中で再結晶させた。 11.1g
の標題化合物が得られ、収率は65%であった。 融点:67−68℃。
チル)−2−シクロペンテンの製造 9gの(±)−2−イソブチリル−2−アザビシクロ
[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−オンを、水(3
2ml)および2−ブタノール(84ml)の混合溶媒に、
窒素雰囲気下に溶解して、0℃に冷却した。 1.37
gのナトリウム・ボロハイドライドを、小部分に分け
て、3.5時間にわたって添加した。 混合物を3時
間、20℃で撹拌し、ついで濃塩酸と水との混合物(1
/1)でpHを2.5に調節したのち、2N−NaOH
で中和した。 この溶液を蒸発濃縮し40gとした。
残渣を、3×80mlのジクロロメタンで抽出した。 一
体にした有機相を完全に蒸発させた。 その結果残った
固体を、トルエン25ml中で再結晶させた。 6.8g
の標題化合物が得られ、収率は73.6%であった。 融点:80−81℃。
−アミノ−4−(ヒドロキシメチル)−2−シクロペン
テンの製造 E.コリからのペニシリンGアシラーゼEC3.5.
1.11(ベーリンガー・マンハイム社)165U(単
位)/gまたはバチルス・メガテリウムからのペニシリ
ンGアシラーゼEC3.5.1.11を、バイオ変換に
使用した。
緩衝溶液(pH5−9;4ml)を、1重量%の1−フェ
ニルアセチルアミノ−4−ヒドロキシメチル−2−シク
ロペンテンの非ラセミ体および400mgの適当なペニシ
リンGアシラーゼとともに、培養器に入れて37℃に保
った。
薄層クロマトグラフィー(シリカゲル60,ブタノー
ル:水:氷酢酸=3:1:1,ニンヒドリンを用いて検
出)、ガスクロマトグラフィーまたはHPLCにより分
析した。 上記の酵素は、フェニルアセチル基を高い活
性をもって離脱させ、それによって最高40%の対応す
るアミノアルコールを放出させた。 遊離したアミノア
ルコールは、80%のeeをもって得られた。
(ヒドロキシメチル)−2−シクロペンテンの製造 14.1 ヴィスプにあるARA水処理プラントからの
下水スラッジ(20%)を、0.5重量%の1−アセチ
ル−、1−プロピオニル−、1−イソブチリルまたは1
−ブチリルアミノ−4−ヒドロキシメチル−2−シクロ
ペンテンを含有するA+N培地(表1参照)中、37℃
で、撹拌下に培養した。 (1R,4S)−1−アミノ
−4−(ヒドロキメチル)−2−シクロペンテンの生成
を薄層クロマトグラフィーで追跡した。
行ない、固体培地(表1の培地中の板状寒天;20g/
l)上で単離した。 微生物アルカリゲネス/ボルデテ
ラFB188(DSM1172)、ロドコッカス・エリ
スロポリスCB101(DSM10686)、ゴルドナ
sp.CB100(DSM10687)およびロドコッ
カスsp.FB387(DSM11291)が、このよ
うにして単離された。
の1−アセチル−、1−プロピオニル−、1−イソブチ
リルまたは1−ブチリルアミノ−4−ヒドロキシメチル
−2−シクロペンテンを含有する培地(表1)中で培養
した。 それらは、24ないし36時間で、光学密度
(OD)2ないし3に成長した。 このようにして得た
細胞を、成長の後期エクスポネンシャル相において収穫
し、10mMのフォスフェート緩衝液で洗浄した。
チル−、1−プロピオニル−、1−イソブチリルまたは
1−ブチリルアミノ−4−ヒドロキシメチル−2−シク
ロペンテンを含有する50mMフォスフェート緩衝液
(pH4.5−9)中で実施した。 薄層クロマトグラ
フィーによって、基質の50%が加水分解され(1R,
4S)−1−アミノ−4−(ヒドロキシメチル)−2−
シクロペンテンに変化したことが判明した。 HPLC
分析によるee値は、80から93%の間にあった。
ロキシメチル−2−シクロペンテンを使用した場合、バ
イオ変換の速度は、DSM10686株に関してA+N
培地上で培養したときに0.14(g/l/h/OD)
であり、1−ブチリルアミノ−4−ヒドロキシメチル−
2−シクロペンテンを含有するNYB(栄養イーストブ
ロス)培地上で培養したときに0.03(g/l/h/
OD)であった。
質(1−ブチリルアミノ−4−ヒドロキシメチル−2−
シクロペンテン)濃度200mMにおいて実施したとこ
ろ、バイオ変換速度は0.161(g/l/h/OD)
であった。
86を、酢酸アンモニウムを炭素および窒素源として加
えた最小限培地(表2参照)上、6リットルの発酵器
中、30℃で、細胞密度がOD650>25に至るまで
培養した。 細胞成長の間、50%の酢酸を、追加のC
源として連続的に添加した。 酵素の活性を誘発するた
め、60gの(+/−)−1−アセチルアミノ−4−ヒ
ドロキシメチル−2−シクロペンテンを加え、培養を数
時間継続した。 最後に、さらに40gの(+/−)−
1−アセチルアミノ−4−ヒドロキシメチル−2−シク
ロペンテンを追加し、培養をさらに10時間行なった。
バイオ変換の進行を、HPLCによりオンラインで追
跡した。 分析収率が、使用した基質ラセミ体基準で4
0%、eeが85%に達したとき、酸を加えて培養を停
止した。
HZS5(DSM10328)、ロドコッカスsp.F
B387(DSM11291)、アルカリゲネス・キシ
ロソキシダンスssp.デニトリフィカンスHSZ17
(DSM10329)、アグロバクテリウム/リゾビウ
ウムHSZ30、バチルス・シンプレックスK2および
シュードモナス・プチダK32を、培地(表1)中、酢
酸ナトリウム上で、以下の記述では「アミノアルコー
ル」と略称する1−アセチル−、1−プロピオニル−、
1−イソブチリル−または1−ブチリル−アミノ−4−
ヒドロキシメチル−2−シクロペンテンが存在する場合
と、しない場合とについて培養を行なった。
い場合の培養によって、対数増殖細胞において得られた
(HPLC分析): 菌 株 速度[mmol/OD.h] ee/転化率[%] HSZ5 (DSM10328) 0.05 88.7/16 HSZ17(DSM10329) 0.005 95/23 K32 0.05 54/1 CB101(DSM10686) 0.1 84/39 さらに、菌株K2およびK17を培養し、収穫して60
時間のバイオ変換を行なった。
収穫し、静止細胞としてバイオ変換に使用した。 アミ
ノアルコールで誘発された細胞もされなかった細胞も、
初期速度に関して、差異はTLC分析から認められなか
った。
686)からのN−アセチルアミノアルコール・ハイド
ラーゼの精製 酵素を、以下に述べるように精製して、SDA−PAG
E(ファルマシア・ファストPharmacia Phast ゲル、1
0−15%勾配)中、分子量50kDにおいてただ一本
のタンパク質バンドが残るまでにした。
1(DSM10686)の細胞を50mMのトリス緩衝
液(pH6.2)中で洗浄し、光学密度OD650nm 19
0まで濃縮した。 フェニルメタンスルフォニル・フル
オライド(PMSF)を最終濃度1mMとなるよう添加
し、SNAseを添加した後、粗抽出物を得るため、細
胞をフレンチプレスで処理した。 遠心分離の結果、2
00mlの、細胞を含まず、タンパク質濃度4.8mg/
mlの抽出物を得た。
らかじめ1mMのジチオスレイトール(DTT)を含有
する50mMのトリス緩衝液(pH8.0)で平衡にし
た、ハイロードHiLoar 26/10 Q−セファロースイ
オン交換クロマトグラフィー(ファルマシア)に載せ
た。
ク質を、線状勾配緩衝液(1500ml;勾配は、1mM
のDTTを含有する50mMトリス緩衝液pH8.0か
ら、1mMのDTTおよび1MのNaClを含有する5
0mMトリス緩衝液pH7.0に変化)で溶出した。
酵素は、370および430mMのNaClカラム、p
H7.6から溶出した。 活性な分画を集め、9mlに濃
縮した。 タンパク質含有量は41mgであった。
を、あらかじめ50mMのNaClと1mMのDTTを
含有する50mMのトリス緩衝液(pH8.0)で平衡
にした、ハイロード26/60スーパーデックスSuperd
ex75ゲル濾過クロマトグラフィーカラム(ファルマシ
ア)に載せた。 活性な分画を一体にしたところ、全タ
ンパク質含有量は10.9mgであった。
のDTTを含有する50mMのトリス緩衝液(pH8.
5)で平衡にした、モノ(Mono)QHRS5/5カラム
(ファルマシア)に載せた。 タンパク質は、1mMの
DTTを含有する50mMトリス緩衝液(pH8.5)
−1mMのDTTおよび1MのNaClを含有する50
mMトリス緩衝液pH8.5)の線状勾配(40ml)
の下で溶出した。 酵素は、390mM−NaClおよ
び440mM−NaClの間で溶出した。 活性な分画
は、1.4mgのタンパク質を含有していた。
緩衝液で平衡にした同じカラムを使用した。 使用した
溶出液勾配は、同じ緩衝液で、NaClが0−500m
Mと変化し、pHが7.0−8.5と変化するものであ
った。 このようにして、純粋な酵素430μgを単離
することができた。
トから直接決定された。 下記の20個のアミノ酸の配
列が得られた: Thr−Glu−Gln−Asn−L
eu−His−Trp−Leu−Ser−Ala−Th
e−G;lu−Met−Ala−Ala−Ser−Va
l−Ala−Ser−Asn。
配列と類似性を示さなかった。
ファデックスSEphadexG−25カラム(PD−10,フ
ァルマシア)を用いて脱塩してあるものと、両方につい
て、酵素の特徴付けを行なった。
濃度は7.3mg/mlであり、精製した酵素のタンパ
ク質濃度は135μg/mlであった。 セルフリーエ
キストラクトに、PMSFを添加しなかった。
た。 pH7.0、温度30℃における反応のKmは、
基質1−アセチルアミノ−4−ヒドロキシメチル−2−
シクロペンテンに関して、22.5mMであった。
ロペンテン(25mM)の加水分解に最適なpHの決定
を、精製酵素についても、セルフリーエキストラクトに
ついても、pH6.2−9.0の範囲において、下記の
緩衝液の中で行なった。 トリス緩衝液100mM pH 9.0; 8.5; 8.
0; 7.5; 7.0 クエン酸/リン酸緩衝液100mM pH 7.0;
6.55; 6.2 活性は、24時間測定した。反応に対する最適pHは、
1R,4Sおよび1S,4Rエナンチオマーに関し、p
H7.0から7.5の間にあった。セルフリーエキスト
ラクトの活性に対する最適のpHは、pH7.0であっ
た。 しかし、選択性は、pH6.0から7.0の間で
より良かった。
B101(DSM10686)からのN−アセチルアミ
ノアルコール・ハイドロラーゼ(セルフリーエキストラ
クト)の、pHを関数とする活性を示す。 実施例1
6.2において示された最適反応温度は、25から30
℃の間にあった。
B101(DSM10686)からのN−アセチルアミ
ノアルコール・ハイドロラーゼ(セルフリーエキストラ
クト)の、温度を関数とする活性を示す。
された。
ヒドロキシメチル−2−シクロペンテン、1−ブチリル
アミノ−4−ヒドロキシメチル−2−シクロペンテン、
1−プロピオニルアミノ−4−ヒドロキシメチル−2−
シクロペンテン、1−イソブチリルアミノ−4−ヒドロ
キシメチル−2−シクロペンテン。
ル)−2−シクロペンテン塩酸塩の製造 (1R,4S)−1−アミノ−4−ヒドロキシメチル−
2−シクロペンテン(製造は実施例14と類似の方法に
よった)の溶液374.1gを蒸発させ、123.7g
に濃縮した。 この溶液は、60.2mmolの上記化合物
を含んでいた(HPLC)。 濃度30%のNaOHを
加えて、pHを2から11.7に調整し、3×70ml
のイソブタノールで抽出した。 一体にしたイソブタノ
ール抽出液のpHを、ガス状のHClを用いて1に調節
し、65gに濃縮して濾過した(固体不純物の除去)。
60mlのアセトンを、激しく撹拌している濾液に、
20℃において滴下して加えた。 不透明な混合物に、
標題化合物の結晶を接種して、5℃において1時間撹拌
した。 濾過および乾燥をへて、5.2gの生成物を得
た。収率は58%であった。 融点:125−127℃。
シメチル)−2−シクロペンテンの製造 (1R,4S)−1−アミノ−4−ヒドロキシメチル−
2−シクロペンテン(製造は実施例14と類似の方法に
よった。;44.6mmol)の溶液75gのpHを、濃度
30%のNaOHを加えて8に調整し、6gのNaHC
O3 を添加した。 混合物を52℃に加熱した。 激し
く撹拌しながら、60mlのジイソプロピルエーテルを
添加し、11.12gのBOC無水物の18.2mlの
ジイソプロピルエーテル溶液を、2時間かけて量り入れ
た。 混合物をセライトCeriteで濾過し、二相を分離し
た。 水相を65mlのジイソプロピルエーテルで抽出
した。 一体にした有機相を45mlの水で洗浄し、蒸
発させて37.5gに濃縮し、50℃に加熱した。 3
1mlのn−ヘキサンを、この溶液に滴下して加えた。
ゆっくりと(2時間)0℃に冷却し、標題化合物を濾
過により得て、これをn−ヘキサン/ジイソプロピルエ
ーテル=1/1混合液12mlで洗浄し、乾燥した。
6.75gの生成物を得た。 収率は71%であった。 融点:70−71℃。 ee98%(キラルHPLCカラムで較正)。
ル)−2−シクロペンテン塩酸塩の製造 87.8gの(1R,4S)−1−BOC−アミノ−4
−ヒドロキシメチル−2−シクロペンテンを、270m
lの2N−HClと1340mlのメタノールとの混合
液に溶解した。 混合物を、環流下に、4.5時間沸騰
させた。 メタノールを蒸留除去し、残渣を800ml
の水に溶解した。 水性の溶液を2回、340mlの酢
酸エチルで抽出した。 水性層を完全に蒸発させた(5
0℃,60mbar)。 固体を、50℃において真空下に
乾燥し、150mlのジエチルエーテル中に懸濁させ、
濾過した後、50mlのジエチルエーテルで2回、洗浄
した。 乾燥して、標題化合物を95%の収率(58.
4g)で得た。
は、実施例17の生成物のそれらと同じであった。
シメチル)−2−シクロペンテンの製造 25gの(1R,4S)−1−アミノ−4−(ヒドロキ
シメチル)−2−シクロペンテン塩酸塩を182mlの
無水酢酸に溶解し、0℃において、これに、18.25
gのトリエチルアミンの無水酢酸60ml中の溶液を添
加した。 混合物を80℃において3時間撹拌し、つい
で室温に冷却した。 トリエチルアミン塩酸塩を濾過分
離し、120mlのn−ヘキサンで洗浄した。 濾液を
蒸発させた。 残渣を300mlのトルエンに混合し、
5.2gの活性炭および13gのセライトの存在下に、
室温で20分間撹拌した。 濾過およびフィルターケー
クの洗浄(3×40mlのトルエン)後、溶媒を完全に
蒸発除去した。 残渣を180mlのメタノールおよび
15.5gのK2CO3と混合し、室温で10時間撹拌し
た。 懸濁液を濾過し、濾液を蒸発させた。 残渣を7
50mlの酢酸イソプロピルに懸濁させ、0.5gの活
性炭の存在下に、還流下に1.5時間沸騰させた。 活
性炭の濾過分離後(70〜80℃)、濾液を0℃に一夜
冷却した。標題化合物を濾別し、80mlの冷酢酸イソ
プロピルで洗浄し、真空下に乾燥した。 17.2gの
生成物が得られた。 収率は66%であった。 融点:77−80℃。
正)1 H−NMR (DMSO-d6):δ[ppm] 1.15(m,1H); 400MHz 1.78(s,3H); 2.25(m,1H); 2.66(m,1H); 3.35(m,2H); 4.58(t,1H); 4.70(m,1H); 5.62(m,1H); 5.85(m,1H); 7.80(d,1H)。
シメチル)−2−シクロペンテンの製造 標題に掲げたエナンチオマーは、25gの(1S,4
R)−1−アミノ−4−ヒドロキシメチル−2−シクロ
ペンテン・塩酸塩から出発して、実施例18の方法によ
り、製造することができた(収率68%)。 生成物の
分光光学的および物理的データは、実施例20と同じで
あった。
シメチル)−2−シクロペンテンの製造 34.7gの(1R,4S)−1−アミノ−4−ヒドロ
キシメチル−2−シクロペンテン・塩酸塩および2gの
4−N,N−ジメチル−アミノピリジンを、600mlの
メチレンクロライドに溶解した。 溶液を0℃に冷却し
た。 ついで、52gのトリエチルアミンを滴下して加
えた(5分間)。 混合物を、30分間撹拌した。 3
5.2gのブチリルクロライドを60mlのメチレンクロ
ライドに溶解した溶液を、この混合物に、0℃におい
て、1時間をかけて加えた。 混合物をさらに1.5時
間、0℃と20℃の間の温度で撹拌し、ついで600ml
の水を加えた。 相分離の後、水相を600mlのメチレ
ンクロライドで抽出した。一体にした有機相を、濃度1
0%のNaOHを毎回500ml用いて3回洗浄し、完全
に蒸発させた。 乾燥した固体を、120mlのメタノー
ルに溶解した。 その溶液を5gのK2CO3と混合し、
さらに2時間、室温で撹拌した。 無機塩類を濾過して
分け、20mlのメタノールで洗浄した。 濾液を、2N
−HClで中和した。 懸濁体を濾過し、フィルターケ
ークを20mlのメタノールで洗浄した。 濾液を完全に
蒸発させた。固体残渣を乾燥し、150mlのトルエンか
ら再結晶した。 28.5gの標題化合物が得られた。
収率は67%であった。
シメチル)−2−シクロペンテンの製造 標題のエナンチオマーは、34.7gの(1S,4R)
−1−アミノ−4−ヒドロキシメチル−2−シクロペン
テン・ハイドロクロライドから出発して、実施例20の
方法により、製造することができた(収率63%)。
生成物の分光光学的および物理的データは、実施例22
と同じであった。
−フォルムアミド−4−ピリミジニル)アミノ]−4−
(ヒドロキシメチル)−2−シクロペンテンの製造 2.07gのN−(2−アミノ−4,6−ジクロロ−5
−ピリミジニル)フォルムアミドを、40mlのイソブタ
ノール中(白色の懸濁体として)、80℃に加熱した。
1.97gの(1R,4S)−1−アミノ−4−ヒド
ロキシメチル−2−シクロペンテン・塩酸塩、3.8g
のトリエチルアミンおよび15mlのイソブタノールを、
この混合物に加えた。 混合物を80℃においてさらに
13時間撹拌した。 10mlの1N−NaOHを、この
透明な溶液に20℃で加え、続いて蒸発させ、乾固に至
らせた。 残渣を、フラッシュクロマトグラフィーにか
けた(シリカゲル60カラム、長さ8cm、直径6.5c
m、溶離剤は酢酸エチル/メタノール=95/5)。
溶離剤を蒸発除去して残渣を乾燥した後、2.1gの標
題化合物が得られた。 収率は74%であった。
−フォルムアミド−4−ピリミジニル)アミノ]−4−
(ヒドロキシメチル)−2−シクロペンテンの製造 145.2mlの(1R,4S)−1−アミノ−(ヒドロ
キシメチル)−2−シクロペンテン溶液(実施例14に
類似の方法により製造した)を、25.5mlに濃縮し、
セライト上で濾過した。 フィルターケークを、7.5
mlの水で洗浄した。 濾液は17.7mmolの上記化合物
を含有していた(HPLC)。 これに濃HClを加え
てpHを6.6から1に調整し、3回、20mlずつのイ
ソブタノールで抽出した。 有機相は捨てた。 水性相
は濃度30%のNaOHでpHを12に調整し、3回、
10mlずつのイソブタノールで抽出した。 一体にした
有機相を蒸発濃縮して15mlとし、2.53gのトリエ
チルアミンを加えた。 この混合物に、2.07gのN
−(2−アミノ−4,6−ジクロロ−5−ピリミジニ
ル)フォルムアミドの40mlのエタノール中の溶液を、
実施例24と同様に加えた。混合物を、80℃において
16時間撹拌した。 実施例22と同様に処理して、
2.4gの標題化合物を得た。 収率は85%であっ
た。
は、実施例24と同じであった。
−カルボン酸の製造 16.4gの粗製(±)−1−BOC−アミノ−2−シ
クロペンテン−4−カルボン酸・塩酸塩(J.Org.
Chem.,1981,46,3268に記載のように
して製造)を、80mlの水と80mlのジオキサンの混合
物に、室温で、窒素雰囲気下に溶解した。 溶液を、1
N−HClでpH14に調整し、t−ブチロキシカルボ
ニル・フルオライド(BOC−F,20%過剰)の、ジ
エチルエーテル溶液を添加した(BOC−Fは、syn
thesis,1975,599に記載のようにして製
造したもの)。 混合物を、さらに5時間、室温で撹拌
した。 濃HClでpHを2に調整した。 有機溶媒を
蒸留除去した後、50mlの水を残渣に加え、混合物を3
回、各回100mlの酢酸エチルで抽出した。 有機相を
蒸発させて50mlにし、25mlのトルエンで希釈した。
冷却した(0〜10℃)後、標題化合物を濾過し、乾
燥した。 14.3gの製品が得られた。収率は63%
であった。
−カルボン酸からの(±)−1−BOC−アミノ−4−
(ヒドロキシメチル)−2−シクロペンテンの製造 250mlのテトラヒドロフランと10.02g(0.1
64mmol)のLiAlH3とを、500mlの撹拌機つき
容器に入れ、30.0g(0.132mol)の(±)−
1−BOC−アミノ−2−シクロペンテン−4−カルボ
ン酸のテトラヒドロフラン75ml中の溶液を、−10℃
で、1時間かけて計量して入れた。 つぎに、10gの
水、10gの濃度15%NaOH溶液、および水20g
をこれに添加し、濾過した。 残渣を2回、各回100
mlのt−ブチルメチルエーテルで洗浄し、一体にした有
機相を、蒸発乾固させた。 ヘキサン80mlを添加した
のち、実施例10で製造した化合物を接種したところ、
標題化合物が、結晶性の固体として分離された。 収量
は15.84g(56%)であった。 生成物の分光光
学的および物理的データは、実施例10と同じであっ
た。
テン−4−カルボン酸からの(1R,4S)−1−BO
C−アミノ−4−(ヒドロキシメチル)−2−シクロペ
ンテンの製造 80mlのテトラヒドロフランと、11.38g(50.
07mmol)の(1R,4S)−1−BOC−アミノ−2
−シクロペンテン−4−カルボン酸(Tetrahed
ron:Asymmetry、1993,4,1117
に記載のようにして製造)とを、500mlの撹拌機つき
容器に入れ、5mlのボラン/ジメチルサルファイド錯体
を、−15℃で、1時間かけて計量して入れ、混合物を
この温度で3時間撹拌した。 4gのNaOHを水60
mlに溶解した溶液を加え、室温まで温めた。 トルエン
を用いた抽出、シリカゲルを通す濾過、およびそれに続
く酢酸エチル/n−ヘキサン1:1中の再結晶によっ
て、収率57%に相当する5.4gの標題化合物が、白
色の結晶状固体として得られた。 生成物の分光光学的
および物理的データは、実施例10と同じであった。
eeは99%(同じキラルHPLCカラム)。
・エリスロポリスCB101(DSM10686)から
のN−アセチルアミノアルコール・ハイドロラーゼ(細
胞を含有しないエキス)の、pHを関数とする活性を示
すグラフ。
ッカス・エリスロポリスCB101(DSM1068
6)からのN−アセチルアミノアルコール・ハイドロラ
ーゼ(細胞を含有しないエキス)の、温度を関数とする
活性を示すグラフ。
Claims (18)
- 【請求項1】 下式IまたはIIの(1S,4R)−また
は(1R,4S)−4−(2−アミノ−6−クロロ−9
H−プリン−9−イル)−2−シクロペンテン−1−メ
タノールまたはその塩を製造する方法であって、 【化1】 第一段階において、式IIIの(±)−2−アザビシクロ
[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−オン 【化2】 をアシル化して、一般式IVの(±)−2−アザビシクロ
[2.2.1]ヘプト−5−エン−3−オン誘導体と
し、 【化3】 (式中、R1 はC1-4アルキル、C1-4アルコキシ、アリ
ールまたはアリロキシを表す。) 第二段階において、後者を還元して、一般式Vのシクロ
ペンテン誘導体とし、 【化4】 (式中、R1 は前記した意味を有する。) 第三段階において、後者を、一般式Vのシクロペンテン
誘導体を唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、ま
たは唯一の窒素源および唯一の炭素源として資化する能
力をもった微生物を利用するか、N−アセチルアミノア
ルコール・ヒドロラーゼ活性またはペニシリンGアシラ
ーゼ活性を有する酵素を利用するかして、一般式VIまた
はVII の(1S,4R)−または(1R,4S)−1−
アミノ−4−(ヒドロキシメチル)−2−シクロペンテ
ン誘導体とし、 【化5】 第四段階において、後者を、式VIIIのN−(2−アミノ
−4、6−ジクロロ−5−ピリミジニル)フォルムアミ
ドを用いて、 【化6】 式IXまたはXの(1S,4R)−または(1R,4S)
−4−[(2−アミノ−6−クロロ−5−フォルムアミ
ド−4−ピリミジニル)アミノ]−2−シクロペンテン
−1−メタノールとし、 【化7】 第五段階において、後者を既知の手法により環化して、
最終生成物である式IまたはIIの化合物を得ることを特
徴とする製造方法。 - 【請求項2】 第一段階のアシル化を、一般式XIのハロ
ゲン化カルボニル 【化8】 (式中、R1 は前記した意味を有し、Xはハロゲン原子
を表す。) または一般式XIIのカルボン酸無水物 【化9】 を使用して実施することを特徴とする請求項1の製造方
法。 - 【請求項3】 第一段階のアシル化を、アプロティック
な溶媒を使用して実施することを特徴とする請求項1ま
たは2の製造方法。 - 【請求項4】 第二段階の還元を、アルカリ金属または
アルカリ土類金属のボロハイドライド、アルカリ金属ま
たはアルカリ土類金属のアルミニウムハイドライド、ま
たはビトライド(Vitride)を使用して実施することを
特徴とする請求項1ないし3のいずれかの製造方法。 - 【請求項5】 第二段階の還元を、プロティックな溶媒
を使用して実施することを特徴とする請求項1ないし4
のいずれかの製造方法。 - 【請求項6】 第三段階の反応を、ロドコッカス(Rhodo
coccus) 、ゴルドナ(Gordona)、アースロバクター(Arth
robacter)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、アグロバク
テリウム/リゾビウム(Agrobacterium/Rhizobium)、バ
チルス(BAcillus)、シュードモナス(Pseudomonas)また
はアルカリゲネス/ボルデテラ(Alcaligenes/Brodetell
a)属の微生物を利用して実施することを特徴とする請求
項1ないし5のいずれかの製造方法。 - 【請求項7】 第三段階の反応を、バチルス・メガテリ
ウム(Bacillus megaterium) またはエシェリチア・コリ
(Escherichia coli)からのペニシリンGアシラーゼを使
用して実施することを特徴とする請求項1ないし6のい
ずれかの製造方法。 - 【請求項8】 第三段階の生物学的変換を、温度20な
いし40℃、およびpH5ないし9において実施するこ
とを特徴とする請求項1ないし7のいずれかの製造方
法。 - 【請求項9】 第四段階の反応を、塩基の存在下に実施
することを特徴とする請求項1ないし8のいずれかの製
造方法。 - 【請求項10】 第四段階の反応を、プロティックな溶
媒中で実施することを特徴とする請求項1ないし9のい
ずれかの製造方法。 - 【請求項11】 一般式XVI またはXVIIの(1R,4
S)−または(1S,4R)−1−アミノ−4−(ヒド
ロキシメチル)−2−シクロペンテン誘導体のエナンチ
オマーを製造する方法であって、 【化10】 (式中、R1 は前記した意味を有する。) 第一段階において、一般式Vのシクロペンテン誘導体
を、 【化11】 (式中、R1 は前記した意味を有する。) 一般式Vのシクロペンテン誘導体を唯一の窒素源とし
て、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および唯
一の炭素源として資化する能力をもった微生物を利用す
るか、N−アセチルアミノアルコール・ヒドロラーゼ活
性またはペニシリンGアシラーゼ活性を有する酵素を利
用するかして、式VIまたはVII の(1R,4S)−また
は(1S,4R)−1−アミノ−4−(ヒドロキシメチ
ル)−2−シクロペンテン 【化12】 に変換し、後者を第二段階においてアシル化して、式XV
I またはXVIIの化合物を得ることを特徴とする製造方
法。 - 【請求項12】 請求項11の方法によって得られ、0
%を超えるエナンチオマー・アクセスの状態にある、式
XVIII の(1R,4S)−1−ブチリルアミノ−4−
(ヒドロキシメチル)−2−シクロペンテンのエナンチ
オマー。 【化13】 - 【請求項13】 請求項11の方法によって得られ、少
なくとも80%のエナンチオマー・アクセスの状態にあ
る請求項12のエナンチオマー。 - 【請求項14】 請求項11の方法によって得られ、少
なくとも90%のエナンチオマー・アクセスの状態にあ
る請求項12のエナンチオマー。 - 【請求項15】 請求項11の方法によって得られ、少
なくとも95%のエナンチオマー・アクセスの状態にあ
る請求項12のエナンチオマー。 - 【請求項16】 請求項11の方法によって得られ、少
なくとも98%のエナンチオマー・アクセスの状態にあ
る請求項12のエナンチオマー。 - 【請求項17】 1−ブチルアミノ−4−(ヒドロキシ
メチル)−2−シクロペンテン誘導体のラセミ体。 - 【請求項18】 式XIIIの4−(ヒドロキシメチル)−
2−シクロペンテン誘導体 【化14】 (式中、R1 は前記した意味を有する。)のラセミ体ま
たは光学活性体の製造方法であって、第一段階におい
て、式XIV のシクロペンテン−4−カルボン酸 【化15】 のラセミ体または光学活性な異性体のいずれか一つを、
一般式XIのカルボン酸ハロゲン化物 【化16】 (式中、R1 およびXは、前記した意味を有する。)で
アシル化して、一般式XVのシクロペンテン−4−カルボ
ン酸誘導体とし、 【化17】 第二段階において後者を還元して、目的とする式XIIIの
化合物を得ることを特徴とする製造方法。
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