JP2010106025A

JP2010106025A - （１ｓ，４ｒ）−または（１ｒ，４ｓ）−４−（２−アミノ−６−クロロ−９ｈ−プリン−９−イル）−２−シクロペンテン−１−メタノールの製造方法

Info

Publication number: JP2010106025A
Application number: JP2009256399A
Authority: JP
Inventors: Christine Dr Bernegger; ベアネッガークリスチーネ; Eva-Maria Urban; マリアウルバンエヴァ; Olwen Mary Dr Birch; メアリバーチオルウェン; Kurt Burgdorf; ブルクドルフクルト; Frank Brux; ブルックスフランク; Kay-Sara Etter; エッターケイ・サラ; Pierre Dr Bossard; ボサールピエール; Walter Dr Brieden; ブリーデンヴァルター; Laurent Dr Duc; デュクローラン; John Gordon; ゴードンジョン
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 1997-05-13
Filing date: 2009-11-09
Publication date: 2010-05-13
Also published as: DE59811884D1; CZ145898A3; CN1115343C; HUP9801083A2; EP0878548A3; HU226327B1; CA2237297C; DK0878548T3; SK284810B6; CN1515673A; JP4540136B2; KR100601764B1; SK58998A3; JPH115793A; CN1302116C; US6156893A; SK285228B6; SK285229B6; PT878548E; CA2237297A1

Abstract

【課題】医薬中間体として有用な４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン誘導体の製造方法を提供する。
【解決手段】第一段階において、４−アミノ−２−シクロペンテンカルボン酸のラセミ体または光学活性な異性体のいずれか１つを、カルボン酸ハロゲン化物でアシル化して、４−アシルアミノ−２−シクロペンテンカルボン酸誘導体とし、第二段階において該アシルアミノ−２−シクロペンテンカルボン酸誘導体を還元することによる、下式で表される４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン誘導体（ＸＩＩＩ）の製造方法。

［式中、Ｒ^１はＣ１〜４アルキル等を表す。］
【選択図】なし

Description

発明の説明

本発明は、下記の式ＩおよびIIの（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−４−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２−シクロペンテン−１−メタノール

の製造方法に関し、また、下記の一般式XVIおよびXVIIの光学活性な化合物

の製造方法にも関する。

（１Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２−シクロペンテン−１−メタノールは、２−アミノプリン・ヌクレオシドの製造、たとえば（１Ｓ，４Ｒ）−４−［２−アミノ−６−（シクロプロピルアミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル］−２−シクロペンテン−１−メタノールの製造（ＷＯ９５／２１１６１）、または１５９２Ｕ８９（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，６１，４１９２−４１９３；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，６１，７９６３−７９６６）の製造における、重要な中間体である。

（１Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−２−シクロペンテン−１−メタノールから出発する（１Ｓ，４Ｒ）−４−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２−シクロペンテン−１−メタノールの製造は、ＷＯ９５／２１１６１に記述されている。その方法の不利な点は、前駆体（１Ｓ，４Ｒ）−４−アミノ−２−シクロペンテン−１−メタノールが、（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの、費用のかかるＢＯＣ保護基（ｔ−ブチロキシカルボニル保護基）で置換されたものを経て、初めて入手できるということである（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，６０，４６０２−４６１６）。

本発明の目的は、（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−４−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２−シクロペンテン−１−メタノールの、簡単でコストが安く、かつ経済的な製造方法を提供することにある。

この目的は、請求項１に記載の新規な方法によって達成される。

その新規な方法の第一段階は、下式III の（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン

をアシル化して、下の一般式IVの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン誘導体

（式中、Ｒ^１はＣ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、アリールまたはアリロキシを表す。）を得ることからなる。

Ｃ_１〜４アルキルは、置換されていてもよいし、非置換であってもよい。ここで置換Ｃ_１〜４アルキルとは、ハロゲン原子で置換されているものを意味する。Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩが、ハロゲン原子として使用できる。Ｃ_１〜４アルキルを挙げれば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、イソプロピル、クロロメチル、ブロモメチル、ジクロロメチル、ジブロモメチルである。Ｃ_１〜４アルキルとして好ましく使用されるものは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチルまたはクロロメチルである。

Ｃ_１〜４アルコキシとしては、たとえば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ｔ−ブトキシまたはイソブトキシを使用することができる。Ｃ_１〜４アルコキシとして好ましく使用されるものは、ｔ−ブトキシである。

アリールとしては、たとえばフェニルまたはベンジル、好ましくはフェニルを使用することができる。アリロキシとしては、たとえばベンジロキシまたはフェノキシが使用できる。

前駆体である（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンは、ＥＰ−Ａ０５０８３５２の開示に従って製造できる。

アシル化は、一般式XIのカルボン酸ハロゲン化物

を使用するか、または一般式XIIのカルボン酸無水物

（これらの式中、Ｒ^１は前記した意味を有し、Ｘはハロゲン原子を表す。Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩがハロゲン原子として使用できる。ＣｌまたはＦが好ましく使用される。）
を使用することによって実施できる。

カルボン酸ハロゲン化物の例は、アセチルクロライド、クロロアセチルクロライド、ブチリルクロライド、イソブチリルクロライド、フェニルアセチルクロライド、ベンジルクロロフォルメート(Ｃｂｚ−Ｃｌ)、プロピオニルクロライド、ベンゾイルクロライド、アリルクロロフォルメートまたはｔ−ブチロキシカルボニルフルオライドである。カルボン酸無水物の例は、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート、無水ブタン酸、無水酢酸または無水プロピオン酸である。

アシル化は、溶剤を使用せずに実施することもできるし、アプロティックな溶剤を使用して実施することもできる。

アシル化は、アプロティックな溶剤中で好都合に実施することができる。適切なアプロティック溶剤の例は、ジイソプロピルエーテル、ピリジン、アセトニトリル、ジメチルフォルムアミド、トリエチルアミン、テトラヒドロフラン、トルエン、メチレンクロライ
ド、Ｎ−メチルピロリジンまたはこれらの混合物である。

アシル化は、温度−８０〜５０℃、好ましくは０〜２５℃において、好都合に実施することができる。

この新規な方法の第二段階では、式IVの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５エン−３−オン誘導体を還元して、一般式Ｖのシクロペンテン誘導体

（式中、Ｒ^１は前記した意味を有する。）とする。

この還元は、アルカリ金属ボロハイドライドもしくはアルカリ土類金属ボロハイドライドを使用して、またはアルカリ金属アルミニウムハイドライドもしくはアルカリ土類金属アルミニウムハイドライド、またはヴィトライド“Ｖｉｔｒｉｄｅ”すなわちナトリウム・ビス（２−メトキシエチル）アルミニウム・ハイドライドを使用して、好都合に実施することができる。ナトリウムまたはカリウムのアルミニウムハイドライドが、アルカリ金属アルミニウムハイドライドとして使用できる。カルシウムボロハイドライドが、アルカリ土類金属ボロハイドライドとして使用できる。アルミニウムナイトライドが、ナイトライドとして使用できる。

還元は、プロティックな溶剤中で好都合に実施することができる。使用できるプロティックな溶剤は、低級アルコール例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール、イソブタノールもしくは水、または上記のアルコールと水との混合物である。

還元は、温度−４０〜４０℃、好ましくは０〜２０℃において、好都合に実施することができる。

この新規な方法の第三段階では、一般式Ｖのシクロペンテン誘導体を、式VIまたはVII の（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン誘導体

とする変換を、微生物を利用するか、または、Ｎ−アセチルアミノアルコール・ヒドロラーゼ活性またはペニシリンＧアシラーゼ活性を有する酵素を利用するかして、実施する。このバイオ変換は、アシル化された（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−アミノ
アルコールを変換して（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン（一般式VIまたはVII）とする。

一般式Ｖのシクロペンテン誘導体を、唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および唯一の炭素源として資化する能力をもった微生物は、すべてこの変換に適している。そのような微生物は、土壌のサンプル、スラッジ、または排水から、それらを、一般式Ｖのシクロペンタン誘導体を、

（式中、Ｒ^１は前記した意味を有する。）
・唯一の窒素源および唯一の炭素源として含有するか、
・唯一の窒素源として含有し、かつ適宜の炭素源をも含有するか、または
・唯一の炭素源として含有し、かつ適宜の窒素源をも含有する
栄養培地中で、常法に従って培養することにより、単離することができる。

一般式Ｖのシクロペンタン誘導体の適切なものの例は、Ｎ−アセチル−、Ｎ−プロピオニル−、Ｎ−イソブチリル−、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル（ＮＢＯＣ）、Ｎ−ブチリルまたはＮ−フェニルアセチル−１−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンタンである。

微生物は、適当な窒素源として、たとえばアンモニア、硝酸塩、アミノ酸または尿素を、成長の基質として利用することができる。微生物は、適当な炭素源として、たとえば糖類、糖アルコール、Ｃ_２−Ｃ_４カルボン酸またはアミノ酸を、成長の基質として利用することができる。グルコースのようなヘキソースや、ペントースが糖類として使用できる。たとえばグリセロールは、糖アルコールとして使用できる。Ｃ_２−Ｃ_４カルボン酸としては、たとえば酢酸またはプロピオン酸が使用できる。アミノ酸としては、たとえばロイシン、
アラニン、アスパラギンが使用できる。

選択のための培地および培養のための培地として使用できるものは、当業者が常用しているもの、たとえば下記の表１に記載したもの、または完全培地（イーストエキスを含有する培地）たとえば栄養イーストブロス（ＮＹＢ）であるが、表１に記載のものを使用
することが好ましい。

培養および選択の間、微生物の活性酵素が好都合に誘発される。一般式Ｖのシクロペンテン誘導体は、酵素誘発剤として役立つ。

培養および選択は、通常、温度２０℃から４０℃、好ましくは３０℃から３８℃で、ｐＨ５．５からｐＨ８の間で、好ましくはｐＨ６．８からｐＨ７．８の間で行なわれる。

バイオ変換は、シクロペンタン誘導体のうち（１Ｓ，４Ｒ）異性体を唯一の炭素源として、唯一の炭素源および窒素源として、または唯一の窒素源として資化するものを用いて実施するのが好適である。

バイオ変換は、好ましくは、アルカリゲネス／ボルデテラ(Alcaligenes/Bordetella)、ロドコッカス(Rhodococcus)、アースロバクター(Arthroebacter)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、アグロバクテリウム／リゾビウム(Agrobacterium/rhizobium)、バチルス(Bacillus)、シュードモナス(Pseudomonas) またはゴルドナ(Gordona)属の微生物を利用して実施する。とりわけ好ましいのは、アルカリゲネス／ボルデテラＦＢ１８８（ＤＳＭ１１１７２）種、ロドコッカス・エリスロポリス(R. erythropolis)ＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）種、アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８）、ロドコッカスｓｐ．ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）、アルカリゲネス・キシロソキシダンス(A. xylosoxydans)ｓｓｐ．デニトリフィカンス(denitrificans)ＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）、アグロバクテリウム／リゾビウムＨＳＺ３０、バチルス・シンプレックス(B.simplex)Ｋ２、シュードモナス・プチダ(S. putuda)Ｋ３２、またはゴルドナｓｐ．ＣＢ１００（ＤＳＭ１０６８７）、およびこれらの機能的に同等な変異種および突然変異種である。ブダペスト条約に従う、ドイッチェザンムルング・フォン・ミクロオーガニスメン・ウント・ツエルクルトゥーレンＧｍｂＨ，マシェローダヴェク１ｂ，Ｄ３８１２４，ブラウンシュヴァイクへの寄託は、微生物ＤＳＭ１０６８６およびＤＳＭ１０６８７に関しては１９９５年５月２０日、微生物ＤＳＭ１０３２８およびＤＳＭ１０３２９に関しては１９９５年１１月６日、微生物ＤＳＭ１１２９１に関しては１９９６年１０月８日、そして微生物ＤＳＭ１１１７２に関しては１９９５年９月２０日に、それぞれ行なわれた。

「機能的に同等な変異種および突然変異種」とは、オリジナルな微生物として本質的に同じ特性と機能を有する微生物を意味する。この種の変異種および突然変異種は、偶然に、たとえばＵＶ照射によって作り出すことができる。

アルカリゲネス／ボルデテラＦＢ１８８（ＤＳＭ１１１７２）の分類学的記述
細胞の形捍状
幅 μｍ０．５−０．６
長さ μｍ１．０−２．５
運動性＋
鞭毛化ペリトリカス
グラム反応性 −
３％ＫＯＨによる分解＋
アミノペプチダーゼ（ツエルニー）＋
胞子 −
オキシダーゼ＋
カタラーゼ＋
ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ） −
ＮＯ_３からのＮＯ_２ −
脱硝化 −
ウレアーゼ −
ゼラチンの加水分解 −
酸の生成（ＯＦ試験）下記物質から：
グルコース −
フラクトース −
アラビノース −
アジペート＋
カプレート＋
シトレート＋
マレート＋
マンニトール −。

ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）の分類学的記述
１．コロニーの形態および色：短い分岐した菌糸で、古くなると棒状体と球状体とに分解する。コロニーは光輝があり、部分的に融合的であって、ピンク色を帯びたベージュ色。ＲＡＬ１００１；
２．ペプチドグリカンの判別されたアミノ酸：メソジアミノピメリン酸；
３．ミコリン酸：ロドコッカスミコリン酸；ミコリン酸鎖長（Ｃ_３２−Ｃ_４４）の測定、および寄託時のデータをＤＳＭのミコリン酸データバンクと比較することにより、ロドコッカス・エリスロポリス株のパターンとの間に、大きな類似性のあることがわかった（類似度０．５８８）。

４．脂肪酸パターン：非分岐の飽和および不飽和の脂肪酸にプラスしてチューバーキュロステアリン酸。

５．菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列に基づいて、ロドコッカス・エリスロポリスの特定の領域における配列との間に、高いレベルでの一致（１００％）が見出された。

上記の同定の結果は、非多義的である。その理由は、３種（ミコリン酸、脂肪酸、１６ＳｒＤＮＡ)の相互に独立した方法で、この菌株にロドコッカス・エリスロポリス種の判定が与えられたからである。

ゴルドナｓｐ．ＣＢ１００（ＤＳＭ１０６８７）の分類学的記述
１．コロニーの形態および色：短い分岐した菌糸で、古くなると棒状体と球状体とに分解する。コロニーは淡いオレンジ色。（ＲＡＬ２００８）；
２．ペプチドグリカンの判別されたアミノ酸：メソジアミノピメリン酸；
３．メナキノン・パターン：ＭＫ−９（Ｈ₂）１００％；
４．ミコリン酸：ゴルドナミコリン酸；ミコリン酸の鎖長（Ｃ_５０−Ｃ_６０）は高温ガスクロマトグラフィーによって測定した。そのパターンは、代表的なゴルドナ属に見いだされるパターンに対応している。

５．脂肪酸パターン：非分岐の飽和および不飽和の脂肪酸にプラスしてチューバーキュロステアリン酸。

６．菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列に基づいて、ゴルドナ・リュブロパーチンクタ(G. rubropertincta) の特定の領域における配列との間に、比較的低い一致（９８．８％）が見出されただけである。

判明した結果（メナキノン、ミコリン酸、脂肪酸、１６ＳｒＤＮＡ）に基づけば、単離した菌はゴルドナ属に非多義的に分類できないわけではないが、これらの結果だけで既知のゴルドナのいずれかの種に分類することは不可能である。

アルカリゲネス・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）の分類学的記述
株の特性
細胞の形捍状
幅 μｍ０．５−０．６
長さ μｍ１．５−３．０
運動性＋
鞭毛化ペリトリカス
グラム反応性 −
３％ＫＯＨによる分解＋
アミノペプチダーゼ（ツエルニー）＋
胞子 −
オキシダーゼ＋
カタラーゼ＋
嫌気的成長 −
ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）＋
ＮＯ_３からのＮＯ_２＋
脱硝＋
ウレアーゼ −
加水分解
ゼラチンの −
ツイーン（Tween）８０の −
酸の生成（ＯＦ試験）：
グルコース好気的 −
キシロース８０ −
基質の資化
グルコース −
フラクトース −
アラビノース −
シトレート＋
マレート＋
マンニトール −
アースロバクターｓｐ．ＨＳＺ５（ＤＳＭ１０３２８）の分類学的記述
特徴グラム陽性不規則な捍状であって、顕著な捍−球の成長サイクル；厳密に好気的；グルコースからの酸またはガスの生成なし
運動性 −
胞子 −
カタラーゼ＋
細胞壁中のメソ−ジアミノピメリン酸：なし
ペプチドグリキカン型：Ａ３α， L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala
１６ＳｒＤＮＡ配列の類似性：最大の変動率をもつ領域の配列に関して見いだされた最も高い値は、アースロバクター・パセンス(A. pascens)、エー・ラモスス(A. ramosusu) およびエー・オキシダンス(A. oxydans)に対する９８．２％である。

アグロバクテリウム／リゾビウムＨＳＺ３０の分類学的記述
細胞の形プレオモルフィックな捍状
幅 μｍ０．６−１．０
長さ μｍ１．５−３．０
グラム反応性 −
３％ＫＯＨによる分解＋
アミノペプチダーゼ＋
胞子 −
オキシダーゼ＋
カタラーゼ＋
運動性＋
嫌気的成長 −
硝酸塩から亜硝酸塩 −
脱硝 −
ウレアーゼ＋
ゼラチンの加水分解 −
酸の生成：
Ｌ−アラビノース＋
ガラクトース −
メレジトース −
フコース＋
ラビトール −
マンニトール −
エリスリトール −
リトマスミルクのアルカリ化＋
ケトラクトース −
１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列から、約９６％の、比較可能な程度に大きい類似性が、アグロバクテリウム属およびリゾビウム属の代表的なものとの間に見いだされた。これらの属の中での、特定の種に非多義的な分類をすることは可能ではない。

バチルス・シンプレックスＫ２の分類学的記述
細胞の形捍状
幅［μｍ］０．８−１．０
長さ［μｍ］３．０−５．０
胞子 −
楕円体 −
環状体 −
スポランギウム −
カタラーゼ＋
嫌気的成長 −
ＶＰ反応ｎ．ｇ．
最高温度
積極的な成長 ℃ ４０
消極的な成長 ℃ ４５
培地のｐＨ５．７における成長 −
ＮａＣｌ２％＋
５％ −
７％ −
１０％ −
リゾチーム培地＋
酸の生成：
Ｄ−グルコース＋
Ｌ−アラビノース＋
Ｄ−キシロース −
Ｄ−マンニトール＋
Ｄ−フラクトース＋
フラクトースからのガス −
レシチナーゼ −
加水分解
デンプンの＋
ゼラチンの＋
カゼインの −
ツイーン８０の＋
アエスクリンの −
資化
シトレートの＋
プロピオネートの −
硝酸塩から亜硝酸塩＋
インドール −
フェニルアラニン・デアミナーゼ −
アルギニン・ジヒドロラーゼ −
細胞の脂肪酸を分析した結果、バチルス属への帰属が確認された。１６ＳｒＤＮＡの部分的配列決定により、バチルス・シンプレックスへの類似性が１００％認められた。

シュードモナス・プチダＫ３２の分類学的記述
細胞の形捍状
幅［μｍ］０．８−０．９
長さ［μｍ］１．５−４．０
運動性＋
鞭毛化極＞１
グラム反応 −
３％ＫＯＨによる分解＋
アミノペプチダーゼ＋
胞子 −
オキシダーゼ＋
カタラーゼ＋
嫌気的成長 −
色素
蛍光色＋
ピオシアニン −
ＡＤＨ＋
硝酸塩から亜硝酸塩 −
脱硝 −
ウレアーゼ −
ゼラチンの加水分解 −
基質の資化
アジペート −
シトレート＋
マレート＋
Ｄ−マンデレート＋
フェニルアセテート＋
Ｄ−酒石酸塩 −
Ｄ−グルコース＋
トレハロース −
マンニトール −
ベンゾイルフォルメート −
プロピレングリコール＋
ブチルアミン＋
トリプタミン −
アセタミド＋
馬尿酸塩＋
細胞の脂肪酸のプロフィールは、シュードモナス・プチダに典型的なものである。

１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列により、シュードモナス・メンドシーナ(P.mendocina)およびシュードモナス・アルカリゲネス(P. alcaligenes)への類似性が、約９８％認められた。シュードモナス・プチダへの類似性は、９７．４％であった。

ロドコッカスｓｐ．ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）の分類学的記述
１．コロニーの形態および色：短い分岐した菌糸で、古くなると棒状体と球状体とに分解する。コロニーはツヤがなく、淡い赤オレンジ色。ＲＡＬ２００８；
２．ペプチドグリカンの判別されたアミノ酸：メソジアミノピメリン酸；
３．ミコリン酸：ロドコッカスミコリン酸；ミコリン酸鎖長（Ｃ_３２−Ｃ_４４）の測定、および寄託時のデータをＤＳＭのミコリン酸データバンクと比較することにより、ロドコッカス・ルーバー(R. ruber)株のパターンとの間に、ごく小さな類似性のあることがわかった（類似度０．０１９）。この相関係数はあまりに低く、種の同定には使えない。

４．脂肪酸パターン：非分岐の飽和および不飽和の脂肪酸にプラスしてチューバーキュロステアリン酸。この脂肪酸パターンは、ロドコッカス属の代表的な菌のすべてとそれに近い関係を有するもの、たとえばミコバクテリウム(Mycobacterium)、ノカルディア(Nocardia) およびゴルドナに関して、判別を可能にするものである。脂肪酸パターンの定性的および定量的な相違を含めることによって、種のレベルへの異同の決定を行なうことを企てた。多数の方法を利用して、ロドコッカスｓｐ．ＦＢ３８７の脂肪酸パターンのデータをデータバンクのそれらと比較した。しかし、この方法では、ロドコッカスｓｐ．ＦＢ３８７を、すでに記述されたいずれかの種に分類することは、類似度が小さい（０．０６３）ため、可能ではなかった。

５．菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列に基づいて、９６−８１８は、ロドコッカス・オパクス(R. opacus)に、相関度９７．９％をもって分類された。この配列の一致は、この分類の非多義的な種の決定に必要な９９．５％に対して、はるかに低い。

得られる結果に基づき、ロドコッカスｓｐ．ＦＢ３８７株は、新規であって、いまだロドコッカス種において記述されたことがないと推測される。

バイオ変換は、常法に従ったこれら微生物の初期の培養の後、静止細胞（成長していない細胞で、もはや炭素源もエネルギー源も必要としない）を用いて、または成長している細胞を用いて、実施することができる。バイオ変換は、静止細胞を用いて実施することが好ましい。

Ｎ−アセチルアミノアルコール・ヒドロラーゼ活性を有し、バイオ変換に適切な酵素は、上述した微生物の細胞から、当業技術で常用の方法たとえば細胞壁の破壊によって、単離することができる。この目的には、たとえば超音波またはフレンチプレス法が利用できる。これらの酵素は、微生物ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）から単離することが好ましい。

適切なペニシリンＧアシラーゼは、多くの微生物から得ることができる。たとえば、バクテリアまたはアクチノミセテスであり、とりわけ下に記す微生物である：エシェリチア・コリＡＴＣＣ９６３７、バチルス・メガテリウム、ストレプトミセス・ラベンデ
ュラエ(Streptmyces lavendulae) ＡＴＣＣ１３６６４、ノカルディアｓｐ．ＡＴＣＣ１３６３５、プロビデンシア・レットゲリ(Providencia rettgeri) ＡＴＣＣ９９１８、アースロバクター・ヴィスコスス(A.viscosus) ＡＴＣＣ１５２９４、ロドコッカス・ファシアンス(R. fascians)ＡＴＣＣ１２９７５、ストレプトミセス・フェオクロモゲネス(Streptmyces phaeochromogenes) ＡＴＣＣ２１２８９、アクロモバクターＡＴＣＣ２３５８４およびミクロコッカス・ロゼウス(Micrococcus roseus) ＡＴＣＣ４１６。購入可能なペニシリンＧアシラーゼが使用でき、たとえば、Ｅ．コリからのペニシリンＧアシラーゼＥＣ３．５．１．１１（ベーリンガー・マンハイム）またはバチルス・メガテリウムからのものが使用できる。

固定化したペニシリンＧアシラーゼが、好ましい態様で使用される。

バイオ変換は、当業技術で常用の培地、たとえば水に低いモル濃度で溶解したフォスフェート、シトレートまたはヘペス(Hepes)の緩衝液、完全培地たとえば栄養イーストブロス（ＮＹＢ）または前掲の表の培地を使用して実施できる。バイオ変換は、好ましくは表１に記載した培地、または低モル濃度フォスフェート緩衝液中で実施する。

本発明のバイオ変換は、シクロペンテン誘導体（式Ｖ）の一回の、または連続的な添加のもとに、その濃度が１０重量％、好ましくは２重量％を超えないようにして行なうのが好都合である。

バイオ変換の間のｐＨは、５から９、好ましくは６から８の範囲内とすることができる。バイオ変換は、温度２０から４０℃、好ましくは２５から３０℃において、好都合に実施できる。

第４段階においては、シクロペンタン誘導体（式VIまたはVII）は、式VIIIのＮ−（２−アミノ−４，６−ジクロロ−５−ピリミジニル）フォルムアルデヒド

を用いて、式IXまたはＸの（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−４−［（２−アミノ−６−クロロ−５−フォルムアミド−４−ピリミジニル）アミノ］−２−シクロペンテン−１−メタノール

に変換する。

Ｎ−（２−アミノ−４，６−ジクロロ−５−ピリミジニル）フォルムアミドは、ＷＯ９５／２１１６１の開示に従って製造することができる。

第四段階は、塩基の存在下に好都合に実施することができる。塩基としては、有機塩基も無機塩基も使用できる。トリアルキルアミンが、有機塩基として使用できる。使用できるトリアルキルアミンの例は、トリエチルアミン、トリブチルアミン、トリベンジルアミン、ピリジンまたはＮ−メチルピロリドンでる。使用できる無機塩基の例は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の炭酸塩、またはアルカリ金属またはアルカリ土類金属の炭酸水素塩、たとえば炭酸カリウムまたは炭酸水素ナトリウムである。

第四段階の反応は、プロティックな溶媒の中で好都合に実施できる。低級脂肪族アルコール、たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールまたはイソブタノールが、プロティックな溶媒として使用できる。

第四段階の反応は、温度０から１５０℃、好ましくは２０から１００℃において好都合に実施できる。

第五段階においては、（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−４−［（２−アミノ−６−クロロ−５−フォルムアミド−４−ピリミジニル）アミノ］−２−シクロペンテン−１−メタノール（式IX，Ｘ）を、ＷＯ９５／２１１６１に開示された既知の方法によって環化し、式ＩまたはIIの最終生成物とする。

環化は、通常、オルト蟻酸トリアルキルに溶解して、濃厚な水性の酸の存在下に実施する。使用できるオルト蟻酸トリアルキルは、トリメチルまたはトリエチル・オルトフォルメートである。水性の酸としては、たとえば、塩酸、硫酸またはメタンスルフォン酸を使用することができる。

本発明はさらに、一般式XVI またはXVIIの光学活性な化合物

（式中、Ｒ^１は前記した意味を有する。）の製造方法にも関する。これらの化合物は、式Ｖのシクロペンテン誘導体を、

（式中、Ｒ^１は前記した意味を有する。）微生物、Ｎ−アセチルアミノ−アルコール・ヒドロラーゼまたはペニシリンＧアシラーゼを利用して、式VIおよびVII（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン

に変換し、それを環化して式XVIまたはXVIIの化合物にすることによって、製造することができる。これらの手段については、すでに記述した。

微生物による変換も、環化も、ともにすでに述べたところとそれ自体同じ条件で実施することができる。

環化は、温度０℃から１００℃、好ましくは２０℃から８０℃において好都合に実施することができる。

この方法によって製造される光学活性な化合物の例は、（１Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンのｅｅ９８％のもの、（１Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンのｅｅ９８％のもの、（１Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−ブチリル−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンのｅｅ９８％のもの、光学活性な（１Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンおよび光学活性な（１Ｓ，４Ｒ）−Ｎ−ブチリル−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンである。

これらの化合物のうち、光学活性な（１Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−ブチリル−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンは、文献未記載の化合物である。従って、本発明は光学活性な（１Ｒ，４Ｓ）−Ｎ−ブチリル−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンのエナンチオマーエクセスが０％を超えるもの、好ましくは８０％以上、９０％ないし９５％のエナンチオマーエクセス、とりわけ９８％以上のエナンチオマーエクセスを有するものにも関する。これらの光学活性な化合物は、当業者に既知の手法によってラセミ化し、ラセミ体のＮ−ブチリル−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンとすることができる。これもまた、文献に記載されたことがない物質である。

一般式XIIIの光学的に活性な４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン誘導体

（式中、Ｒ^１は前記した意味を有する。）
の製造は、第一段階において、式XIVのシクロペンテン−４−カルボン酸

のラセミ体または光学活性な異性体のいずれかを、一般式XIのカルボン酸ハロゲン化物

（式中、Ｒ^１およびＸは前記した意味を有する。）
を使用してアシル化し、一般式XVのシクロペンテン−４−カルボン酸誘導体としたのち、

第二段階において、後者を還元して式XIIIの所望の化合物を得ることからなる。

ここで、光学活性４−（ヒドロキシメチル）−シクロペンテン誘導体（式XIII）および光学活性４−（ヒドロキシメチル）−シクロペンテン誘導体（式XV）の語は、対応する（１Ｒ，４Ｓ）または（１Ｓ，４Ｒ）異性体を意味する。

この製造方法の第一段階すなわちアシル化は、一般式XIのハロゲン化カルボニルを使用して実施する。使用できるハロゲン化カルボニルは、すでに記載したところで挙げたものと同じであって、ｔ−ブチロキシカルボニルが好ましく使用される。

第一段階の反応は、ｐＨ８〜１４、好ましくは１２〜１４、温度０〜５０℃、好ましくは１５〜２５℃で、好都合に実施できる。

適当な溶媒は、水とエーテル類との混合物である。使用できるエーテル類はジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、グリコールのジメチルまたはジエチルエーテルである。

製造方法の第二段階である還元は、アルカリ金属アルミニウムハイドライドを用いて、ボラン／ジ−Ｃ_1-4 アルキルサルファイド錯体を用いて、またはボラン／テトラヒドロフラン錯体を用いて実施することができる。リチウム、ナトリウムまたはカリウムのアルミニウムハイドライドが、アルカリ金属アルミニウムハイドライドとして使用でき、中でもリチウムアルミニウムハイドライドが好ましく使用される。ボラン／ジメチルサルファイド、ボラン／ジエチルサルファイド、ボラン／ジプロピルサルファイドまたはボラン／ジブチルサルファイドの錯体が、ボラン／ジ−Ｃ_1-4 アルキルサルファイド錯体として使用できる。ボラン／ジメチルサルファイド錯体が好ましく使用される。

第二段階においては、溶媒として、上記したエーテル類のいずれかを、水を混合せずに使用することが好都合である。

第二段階の反応は、温度−５０〜５℃、好ましくは−２５〜−１０℃において実施することができる。

［実施例１］
（±）−２−アセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
１００ｇの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンをアセトニトリル（８００ml）およびピリジン（１６１．２６ml）中に、窒素雰囲気下に溶解した。１２℃において、１０４．５ｇのアセチルクロライドを、２時間にわたって、滴下して加えた。混合物を、室温で４．５時間撹拌した。８００mlの水を混合物に加え、アセトニトリルを減圧下に蒸発させて除いた。水相を３回、４００mlの酢酸エチルで抽出した。一体にした有機相を１ＮのＨＣｌ（４００ml）、水（４００ml）、飽和ＮａＣｌ溶液（４００ml）で洗浄したのち、硫酸マグネシウムで乾燥し、完全に蒸発させた。その残渣をメチレン・クロライドにとり、シリカゲルを通して濾過した。濾液を濃縮し、生成物
を蒸留により精製した。１０７．７６ｇの生成物が、透明な液体として得られた。収率は７１％。沸点（０．０７torr）：５１℃。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：δ［ppm］２．２５（ＡＢ syst.，２Ｈ）
４００ＭＨｚ２．８（ｓ，３Ｈ）；
３．４２（ｍ，１Ｈ）；
５．３０（ｍ，１Ｈ）；
６．８９（ｍ，１Ｈ）；
６．９２（ｍ，１Ｈ）。

［実施例２］
（±）−２−ブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
１００．３ｇの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを、アセトニトリル（７２０ml）およびピリジン（１４２ml）中に、窒素雰囲気下に溶解した。１２℃において、１４１．８ｇのブチリルクロライドを、１時間にわたって滴下して加えた。混合物を、室温で３時間撹拌した。７２０mlの水を混合物に加え、各相を分離した。アセトニトリルは減圧下に蒸発させて除き、水相を３回、３００mlの酢酸エチルで抽出した。一体にした有機相を１ＮのＨＣｌ（３５０ml）、飽和ＮａＣｌ溶液（４００ml）および水（５００ml）で洗浄したのち、硫酸マグネシウムで乾燥し、完全に蒸発させた。生成物を蒸留により精製した。１０７．７６ｇの生成物が、透明な液体として得
られた。収率は８５％。沸点（０．０５torr）：７０℃。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）：δ［ppm］０．９８（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，３Ｈ）
４００ＭＨｚ１．５８−１．６５（２Ｈ）；
２．２３（ＡＢ syst.，２Ｈ）；
２．８２−２．９０（２Ｈ）；
３．４２（ｍ，１Ｈ）；
５．３０（ｍ，１Ｈ）；
６．６２（ｍ，１Ｈ）；
６．９０（ｍ，１Ｈ）。

［実施例３］
（±）−２−フェニルアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
３３．４ｇの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを、アセトニトリル（２４０ml）およびピリジン（４８．３ml）中に、窒素雰囲気下に溶解した。１２℃において、６８．６ｇのフェニルアセチルクロライドを、３０分間にわたって滴下して加えた。混合物を、室温で３．５時間撹拌した。２４０mlの水を混合物に加えた。アセトニトリルを減圧下に蒸発させて除き、水相を３回、酢酸エチル（１５０ml）で抽出した。一体にした有機相を１ＮのＨＣｌ（１５０ml）、飽和ＮａＣｌ溶液（１５０ml）および水（１５０ml）で洗浄したのち、硫酸マグネシウムで乾燥し、完全に蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルを通して（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）精製した。７８．３４ｇの粗生成物が、黄色の油として得られた。

［実施例４］
（±）−２−プロピオニル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
４７ｇの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを、アセトニトリル（３２５ml）およびピリジン（４１ml）中に、窒素雰囲気下に溶解した。１２℃において、４３．９ｇのプロピオニルクロライドを、１時間にわたって滴下して加えた。混合物を、室温で５時間撹拌した。１４５mlの水を混合物に加え、アセトニトリルを減圧下に蒸発させて除いた。水相を３回、１１５mlの酢酸エチルで抽出した。一体にした有機相を、１ＮのＨＣｌ（１４０ml）、飽和したＮａＨＣＯ₃ 溶液（４０ml）およびＮａＣｌ溶液（４０ml）で洗浄したのち、硫酸ナトリウムで乾燥し、完全に蒸発させた。残渣を蒸留により精製した。５５．８ｇの標題化合物が得られ、放置したところ固化し
た。収率は８１．６％であった。

沸点：２．８mbarにおいて７５−８０℃
融点：５４−５６℃。

^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］０．９５（ｔ，３Ｈ）
４００ＭＨｚ２．１０（quart.，１Ｈ）；
２．２８（quart.，２Ｈ）；
２．６４（ｍ，２Ｈ）；
３．４２（ｓ，１Ｈ）；
５．１６（ｓ，１Ｈ）；
６．７８（ｍ，１Ｈ）；
６．９６（ｍ，１Ｈ）。

［実施例５］
（±）−２−イソブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
４５．１ｇの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを、アセトニトリル（３１０ml）およびピリジン（３９ml）中に、窒素雰囲気のもとに溶解した。１０℃において、５４．１ｇのイソブチリルクロライドを、１時間にわたって滴下して加えた。混合物を、室温で５時間撹拌した。１４０mlの水を混合物に加え、アセトニトリルを減圧下に蒸発させて除いた。水相を４×１２０mlの酢酸エチルで抽出した。一体にした有機相を、１ＮのＨＣｌ（５０ml）、飽和したＮａＨＣＯ_３溶液（５０ml）およびＮａＣｌ溶液（５０ml）で洗浄したのち、硫酸ナトリウムで乾燥し、完全に蒸発させた。残渣をｎ−ヘキサン（２４０ml）中、活性炭とともに、環流下に沸騰させた。活性炭を
濾過して分け、濾液を０℃に冷却して、標題化合物を濾過により分け取った。５４．５ｇの生成物が得られた。収率は７６％であった。

融点：４１−４２℃。

^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］０．９２（ｄ，３Ｈ）
４００ＭＨｚ１．０６（ｄ，３Ｈ）；
２．１０（ｍ，１Ｈ）；
２．２８（ｍ，１Ｈ）；
３．４０（ｍ，２Ｈ）；
５．１６（ｓ，１Ｈ）；
６．７８（ｍ，１Ｈ）；
７．９２（ｍ，１Ｈ）。

［実施例６］
（±）−２−クロロアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンの製造
１０．１ｇの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを、ジクロロメタン（１０ml）、ピリジン（８．４ml）および０．２２ｇの４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの混合物中に、１０℃で、窒素雰囲気下に溶解した。１３．５ｇのクロロアセチルクロライドを、１時間にわたって滴下して加えた。温度は４４℃に上昇した。混合物をさらに２時間、室温で撹拌した。１００mlの水を混合物に加えた。相分離の後、水相を１００mlのジクロロメタンで抽出した。一体にした有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、完全に蒸発させた。残渣を、１００mlジイソプロピルエーテル中、１ｇの活性炭の存在下に、１０分間、環流下に沸騰させた。熱濾過したのち、濾液を室温に冷却して、固体を濾過により分け、乾燥した。１０．３５ｇの標題化合物が得られた。収率は６０％であった。
融点：８６−８８℃。

^１Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃ ）：δ［ppm］２．２８（ｄ，１Ｈ）
４００ＭＨｚ２．４０（ｄ，１Ｈ）；
３．４８（ｓ，１Ｈ）；
４．５６（ｄ，２Ｈ）；
５．３０（ｓ，１Ｈ）；
６．７０（ｄ，１Ｈ）；
６．９４（ｍ，１Ｈ）。

［実施例７］
（±）−１−アセチルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
７９．５６ｇの（±）−２−アセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを、エタノール（４５０ml）中に、窒素雰囲気下に溶解して、−１０℃に冷却した。１９．８ｇのナトリウム・ボロハイドライドを、小部分に分けて４５分間にわたって添加した。

混合物を３時間、０℃で撹拌し、ついで濃硫酸でｐＨを１．８に調節した。酢酸エチル（２００ml）をこの混合物に加え、固体を濾過分離した。ついで完全に蒸発させた。残渣を水にとり、メチレンクロライドで洗浄して、蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルで濾過することにより精製した。５１．８３ｇの生成物が、白色の固体として得られた。収率は、使用した２−アセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを基準にして、６４％であった。

^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］１．１８（ｍ，１Ｈ）
４００ＭＨｚ１．７８（ｓ，３Ｈ）；
２．２９（ｍ，１Ｈ）；
２．６６（ｍ，１Ｈ）；
３．３５（ｓ，２Ｈ）；
４．５８（ｓ，１Ｈ）；
４．７２（ｍ，１Ｈ）；
５．６１（ｄ，１Ｈ）；
５．８５（ｄ，１Ｈ）；
７．８３（ｄ，１Ｈ）。

［実施例８］
（±）−１−ブチリルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
７３．８７ｇの（±）−２−ブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを、エタノール（４００ml）に、窒素雰囲気下に溶解して、−１０℃に冷却した。１５．６８ｇのナトリウム・ボロハイドライドを、小部分に分けて、４５分間にわたって添加した。混合物を３時間、０℃で撹拌し、ついで濃硫酸でｐＨを１．５に調節した。酢酸エチル（２００ml）をこの混合物に加え、固体を濾過分離した。ついで完全に蒸発させた。残渣を水にとり、メチレンクロライドで洗浄して、蒸発させたのち、高度の減圧下に乾燥した。６０．５５ｇの生成物が得られた。収率は、使用した２−ブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを基準にして、８０％であった。

融点：７１−７２℃。

^１Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ［ppm］０．９８（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，３Ｈ）；
４００ＭＨｚ１．４０−１．５０（１Ｈ）；
１．５８−１．６８（２Ｈ）；
２．１０−２．１８（２Ｈ）；
２．４２−２．５５（１Ｈ）；
２．８５（ｍ，１Ｈ）；
３．６２（ＡＢ syst.，２Ｈ）；
４．９８（ｍ，１Ｈ）；
５．７８−５．８２（２Ｈ）；
６．３８（ｍ，１Ｈ）。

［実施例９］
（±）−１−フェニルアセチルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
７７ｇの粗製の（±）−２−フェニルアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを、エタノール（４５０ml）に、窒素雰囲気下に溶解して、−１０℃に冷却した。１３．２ｇのナトリウム・ボロハイドライドを、小部分に分けて、１時間にわたって添加した。混合物を３．５時間、室温で撹拌し、ついで濃硫酸でｐＨを１．８に調節した。この混合物を、シリカゲル濾過（ヘキセン：酢酸エチル＝２：８）により精製した。酢酸エチルからの再結晶をへて、１５．８９ｇの白色の固体が得られた。収率は、使用した２−フェニルアセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを基準にして、８０％であった。

^１Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃ ）：δ［ppm］１．２８−１．３５（１Ｈ）；
４００ＭＨｚ１．４０（ｍ，１Ｈ）；
２．３８−２．４５（１Ｈ）；
２．７９（ｍ，１Ｈ）；
３．５０（ＡＢ，syst.，２Ｈ）；
３．５２（ｓ，３Ｈ）；
４．９８（ｍ，１Ｈ）；
５．７５（ｍ，２Ｈ）；
５．９８（ｍ，１Ｈ）；
７．２０−７．３８（５Ｈ）。

［実施例１０］
（±）−１−ＢＯＣ−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン（ＢＯＣ＝ｔ−ブトキシカルボニル）の製造
１５ｇの粗製の（±）−１−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン塩酸塩（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８１，４６，３２６８の記載に従って製造）を、１５０mlの水と１５０mlのジオキサンとの混合物に、窒素雰囲気下に室温で溶解した。溶液のｐＨを１Ｎ−ＮａＯＨで１４に調整し、ｔ−ブチロキシカルボニル・フルオライド（ＢＯＣ−Ｆ，２０％過剰）のジエチルエーテル溶液を加えて、混合物をさらに３時間、室温で撹拌した（ＢＯＣ−Ｆは、Ｓｙｎｔｈｅｉｓ，１９７５，５９９の開示に従って製造した）。濃塩酸を加えて、ｐＨを２に調節した。有機溶剤の蒸留除去後、５０mlの水を残渣に加え、その混合物を３×１００mlの酢酸エチルで抽出した。一体にした有機相を、完全に蒸発させた。残渣を、１１０mlのジイソプロピルエーテルと８０mlのｎ−ヘキサンとの混合溶媒から再結晶した。１１．９５ｇの標題化合物が得られた。

収率は５６％であった。

融点：６８−７０℃。

^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］１．１８（ｍ，１Ｈ）；
４００ＭＨｚ１．３８（ｓ，９Ｈ）；
２．２６（ｍ，１Ｈ）；
２．６５（ｍ，１Ｈ）；
３．３３（ｔ，２Ｈ）；
４．４５（ｍ，１Ｈ）；
４．５５（ｔ，１Ｈ）；
５．６２（ｍ，１Ｈ）；
５．７９（ｍ，１Ｈ）；
６．７３（ｄ，１Ｈ）。

［実施例１１］
（±）−１−プロピオニルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
１６．６ｇの粗製の（±）−２−プロピオニル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを、水（１４０ml）および２−ブタノール（６６ml）の混合溶媒に、窒素雰囲気下に溶解して、−５℃に冷却した。３ｇのナトリウム・ボロハイドライドを、小部分に分けて、２時間にわたって添加した。混合物を１０℃で２．５時間撹拌し、ついで濃塩酸と水の混合物（１／１）で、ｐＨを２．２に調節した。この溶液を蒸発濃
縮して４０ｇとし、２Ｎ−ＮａＯＨでｐＨを６．２に調節した。混合物を、５×５０mlのジクロロメタンで抽出した。一体にした有機相を完全に蒸発させ、残渣をトルエン（１５０ml）中で再結晶させた。１１．１ｇの標題化合物が得られ、収率は６５％であった。

融点：６７−６８℃。

^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］０．９６（ｔ，３Ｈ）；
４００ＭＨｚ１．１６（quint.，１Ｈ）；
２．０４（quart.，２Ｈ）；
２．２６（ｍ，１Ｈ）；
２．６６（ｍ，１Ｈ）；
３．３４（ｍ，２Ｈ）；
４．５８（ｔ，１Ｈ）；
４．７２（ｍ，１Ｈ）；
５．６１（ｍ，１Ｈ）；
５．８４（ｍ，１Ｈ）；
７．７２（ｄ，１Ｈ）。

［実施例１２］
（±）−１−イソブチリルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
９ｇの（±）−２−イソブチリル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オンを、水（３２ml）および２−ブタノール（８４ml）の混合溶媒に、窒素雰囲気下に溶解して、０℃に冷却した。１．３７ｇのナトリウム・ボロハイドライドを、小部分に分けて、３．５時間にわたって添加した。混合物を３時間、２０℃で撹拌し、ついで濃塩酸と水との混合物（１／１）でｐＨを２．５に調節したのち、２Ｎ−ＮａＯＨで中和した。この溶液を蒸発濃縮し４０ｇとした。残渣を、３×８０mlのジクロロメタンで抽出した。一体にした有機相を完全に蒸発させた。その結果残った固体を、トルエン２５ml中で再結晶させた。６．８ｇの標題化合物が得られ、収率は７３．６％であった。

融点：８０−８１℃。

^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］０．９８（ｄ，６Ｈ）；
４００ＭＨｚ１．１６（quint.，１Ｈ）；
２．３０（ｍ，２Ｈ）；
２．６８（ｍ，１Ｈ）；
３．３２（ｔ，２Ｈ）；
４．５８（ｔ，１Ｈ）；
４．７０（ｍ，１Ｈ）；
５．６１（ｍ，１Ｈ）；
５．８２（ｍ，１Ｈ）；
７．６８（ｄ，１Ｈ）。

［実施例１３］
ペニシリンＧアシラーゼを使用した（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
Ｅ．コリからのペニシリンＧアシラーゼＥＣ３．５．１．１１（ベーリンガー・マンハイム社）１６５Ｕ（単位）／ｇまたはバチルス・メガテリウムからのペニシリンＧアシラーゼＥＣ３．５．１．１１を、バイオ変換に使用した。

この目的で、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５−９；４ml）を、１重量％の１−フェニルアセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンの非ラセミ体および４００mgの適当なペニシリンＧアシラーゼとともに、培養器に入れて３７℃に保った。

所定の時間間隔をおいてサンプルをとり、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０，ブタノール：水：氷酢酸＝３：１：１，ニンヒドリンを用いて検出）、ガスクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣにより分析した。上記の酵素は、フェニルアセチル基を高い活性をもって離脱させ、それによって最高４０％の対応するアミノアルコールを放出させた。遊離したアミノアルコールは、８０％のｅｅをもって得られた。

［実施例１４］
微生物を使用した（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
１４．１ヴィスプにあるＡＲＡ水処理プラントからの下水スラッジ（２０％）を、０．５重量％の１−アセチル−、１−プロピオニル−、１−イソブチリルまたは１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを含有するＡ＋Ｎ培地（表１参照）中、３７℃で、撹拌下に培養した。（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキメチル）−２−シクロペンテンの生成を薄層クロマトグラフィーで追跡した。

それらの１％濃縮体を用いて１−３転移を行ない、固体培地（表１の培地中の板状寒天；２０ｇ／ｌ）上で単離した。微生物アルカリゲネス／ボルデテラＦＢ１８８（ＤＳＭ１１７２）、ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）、ゴルドナｓｐ．ＣＢ１００（ＤＳＭ１０６８７）およびロドコッカスｓｐ．ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）が、このようにして単離された。

１４．２単離された微生物を、０．５％の１−アセチル−、１−プロピオニル−、１−イソブチリルまたは１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを含有する培地（表１）中で培養した。それらは、２４ないし３６時間で、光学密度（ＯＤ）２ないし３に成長した。このようにして得た細胞を、成長の後期エクスポネンシャル相において収穫し、１０ｍＭのフォスフェート緩衝液で洗浄した。

続いてバイオ変換を、１重量％の１−アセチル−、１−プロピオニル−、１−イソブチリルまたは１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを含有する５０ｍＭフォスフェート緩衝液（ｐＨ４．５−９）中で実施した。薄層クロマトグラ
フィーによって、基質の５０％が加水分解され（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンに変化したことが判明した。ＨＰＬＣ分析によるｅｅ値は、８０から９３％の間にあった。

基質として１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを使用した場合、バイオ変換の速度は、ＤＳＭ１０６８６株に関してＡ＋Ｎ培地上で培養したときに０．１４（ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ）であり、１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル
２−シクロペンテンを含有するＮＹＢ（栄養イーストブロス）培地上で培養したときに０．０３（ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ）であった。

同様な変換を、ＤＳＭ１０６８７株で、基質（１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン）濃度２００ｍＭにおいて実施したところ、バイオ変換速度は０．１６１（ｇ／ｌ／ｈ／ＯＤ）であった。

１４．３ロドコッカス・エリスロポリスＤＳＭ１０６８６を、酢酸アンモニウムを炭素および窒素源として加えた最小限培地（表２参照）上、６リットルの発酵器中、３０℃で、細胞密度がＯＤ６５０＞２５に至るまで培養した。細胞成長の間、５０％の酢酸を、追加のＣ源として連続的に添加した。酵素の活性を誘発するため、６０ｇの（＋／−）−１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを加え、培養を数
時間継続した。最後に、さらに４０ｇの（＋／−）１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを追加し、培養をさらに１０時間行なった。バイオ変換の進行を、ＨＰＬＣによりオンラインで追跡した。分析収率が、使用した基質ラセミ体基準で４０％、ｅｅが８５％に達したとき、酸を加えて培養を停止した。

１４．４.
１４．３と同様にして、微生物アースロバクターｓｐ．ＨＺＳ５（ＤＳＭ１０３２８）、ロドコッカスｓｐ．ＦＢ３８７（ＤＳＭ１１２９１）、アルカリゲネス・キシロソキシダンスｓｓｐ．デニトリフィカンスＨＳＺ１７（ＤＳＭ１０３２９）、アグロバクテリウム／リゾビウウムＨＳＺ３０、バチルス・シンプレックスＫ２およびシュードモナス・プチダＫ３２を、培地（表１）中、酢酸ナトリウム上で、以下の記述では「アミノアルコール」と略称する１−アセチル−、１−プロピオニル−、１−イソブチリル−または１−ブチリル−アミノ−４ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンが存在する場合と、しない場合とについて培養を行なった。

次の結果が、アミノアルコールを含有しない場合の培養によって、対数増殖細胞において得られた（ＨＰＬＣ分析）：

さらに、菌株Ｋ２およびＫ１７を培養し、収穫して６０時間のバイオ変換を行なった。

対数増殖細胞および定常増殖細胞をすべてのバッチから収穫し、静止細胞としてバイオ変換に使用した。アミノアルコールで誘発された細胞もされなかった細胞も、初期速度に関して、差異はＴＬＣ分析から認められなかった。

［実施例１５］
ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）からのＮ−アセチルアミノアルコール・ハイドラーゼの精製
酵素を、以下に述べるように精製して、ＳＤＡ−ＰＡＧＥ（ファルマシア・ファストPharmacia Phast ゲル、１０−１５％勾配）中、分子量５０ｋＤにおいてただ一本のタンパク質バンドが残るまでにした。

ロドコッカッス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）の細胞を５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ６．２）中で洗浄し、光学密度ＯＤ650nm １９０まで濃縮した。フェニルメタンスルフォニル・フルオライド（ＰＭＳＦ）を最終濃度１ｍＭとなるよう添加し、ＳＮＡｓｅを添加した後、粗抽出物を得るため、細胞をフレンチプレスで処理した。遠心分離の結果、２００mlの、細胞を含まず、タンパク質濃度４．８ｍｇ／ｍｌの抽出物を得た。

９６０ｍｇの細胞を含まない抽出物を、あらかじめ１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡にした、ハイロードHiLoar ２６／１０Ｑ−セファロースイオン交換クロマトグラフィー（ファルマシア）に載せた。

カラムを同じ緩衝液で洗浄した後、タンパク質を、線状勾配緩衝液（１５００ml；勾配は、１ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．０から、１ｍＭのＤＴＴおよび１ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．０に変化）で溶出した。酵素は、３７０および４３０ｍＭのＮａＣｌカラム、ｐＨ７．６から溶出した。活性な分画を集め、９mlに濃縮した。タンパク質含有量は４１ｍｇであった。

さらなる精製のため、このタンパク質溶液を、あらかじめ５０ｍＭのＮａＣｌと１ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡にした、ハイロード２６／６０スーパーデックスSuperd ex７５ゲル濾過クロマトグラフィーカラム（ファルマシア）に載せた。活性な分画を一体にしたところ、全タンパク質含有量は１０．９ｍｇであった。

このタンパク質溶液を、あらかじめ１ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡にした、モノ(Mono)ＱＨＲＳ５／５カラム（ファルマシア）に載せた。タンパク質は、１ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）−１ｍＭのＤＴＴおよび１ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．５）の線状勾配（４０ｍｌ）の下で溶出した。酵素は、３９０ｍＭ−ＮａＣｌおよび４４０ｍＭ−ＮａＣｌの間で溶出した。活性な分画は、１．４ｍｇのタンパク質を含有していた。

最終的な精製工程においては、上記と同じ緩衝液で平衡にした同じカラムを使用した。使用した溶出液勾配は、同じ緩衝液で、ＮａＣｌが０−５００ｍＭと変化し、ｐＨが７．０−８．５と変化するものであった。このようにして、純粋な酵素４３０μｇを単離することができた。

酵素のＮ−末端配列は、タンパク質ブロットから直接決定された。下記の２０個のアミノ酸の配列が得られた：Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｅ−Ｇ；ｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ。

この配列は、既知のタンパク質のアミノ酸配列と類似性を示さなかった。

［実施例１６］
酵素の特徴付け
精製した酵素と、セルフリーエキストラクトであってセファデックスSEphadexＧ−２５カラム（ＰＤ−１０，ファルマシア）を用いて脱塩してあるものと、両方について、酵素の特徴付けを行なった。

セルフリーエキストラクト中のタンパク質濃度は７．３ｍｇ／ｍｌであり、精製した酵素のタンパク質濃度は１３５μｇ／ｍｌであった。セルフリーエキストラクトに、ＰＭＳＦを添加しなかった。

１６．１Ｋｍの測定
Ｋｍの測定をセルフリーエキストラクトについて行なった。ｐＨ７．０、温度３０℃における反応のＫｍは、基質１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンに関して、２２．５ｍＭであった。

１６．２最適ｐＨ
１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン（２５ｍＭ）の加水分解に最適なｐＨの決定を、精製酵素についても、セルフリーエキストラクトについても、ｐＨ６．２−９．０の範囲において、下記の緩衝液の中で行なった。

トリス緩衝液１００ｍＭｐＨ９．０；８．５；８．０；７．５；７．０
クエン酸／リン酸緩衝液１００ｍＭｐＨ７．０；６．５５；６．２
活性は、２４時間測定した。

反応に対する最適ｐＨは、１Ｒ，４Ｓおよび１Ｓ，４Ｒエナンチオマーに関し、ｐＨ７．０から７．５の間にあった。
セルフリーエキストラクトの活性に対する最適のｐＨは、ｐＨ７．０であった。しかし、選択性は、ｐＨ６．０から７．０の間でより良かった。

図１は、ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）からのＮ−アセチルアミノアルコール・ハイドロラーゼ（セルフリーエキストラクト）の、ｐＨを関数とする活性を示す。実施例１６．２において示された最適反応温度は、２５から３０℃の間にあった。

図２は、ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）からのＮ−アセチルアミノアルコール・ハイドロラーゼ（セルフリーエキストラクト）の、温度を関数とする活性を示す。

１６．４
分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、５０ｋＤと測定された。

１６．５
下記の基質を加水分解した：
１−アセチルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン、
１−ブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン、
１−プロピオニルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン、
１−イソブチリルアミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン。

［実施例１７］
（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン塩酸塩の製造
（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン（製造は実施例１４と類似の方法によった）の溶液３７４．１ｇを蒸発させ、１２３．７ｇに濃縮した。この溶液は、６０．２mmolの上記化合物を含んでいた（ＨＰＬＣ）。濃度３０％のＮａＯＨを加えて、ｐＨを２から１１．７に調整し、３×７０ｍｌのイソブタノールで抽出した。一体にしたイソブタノール抽出液のｐＨを、ガス状のＨＣｌを用いて１に調節
し、６５ｇに濃縮して濾過した（固体不純物の除去）。６０ｍｌのアセトンを、激しく撹拌している濾液に、２０℃において滴下して加えた。不透明な混合物に、標題化合物の結晶を接種して、５℃において１時間撹拌した。濾過および乾燥をへて、５．２ｇの生成物を得た。収率は５８％であった。

融点：１２５−１２７℃。

^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］１．４４（ｍ，１Ｈ）；
４００ＭＨｚ２．３５（ｍ，１Ｈ）；
２．８３（ｍ，１Ｈ）；
３．４２（ｍ，２Ｈ）；
４．１０（ｓ，１Ｈ）；
４．８０（ｓ，１Ｈ）；
５．８０（ｄ，１Ｈ）；
６．０６（ｄ，１Ｈ）；
８．１３（ｓ，３Ｈ）。

［実施例１８］
（１Ｒ，４Ｓ）−１−ＢＯＣ−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン（製造は実施例１４と類似の方法によった。；４４．６mmol）の溶液７５ｇのｐＨを、濃度３０％のＮａＯＨを加えて８に調整し、６ｇのＮａＨＣＯ_３を添加した。混合物を５２℃に加熱した。激しく撹拌しながら、６０ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加し、１１．１２ｇのＢＯＣ無水物の１８．２ｍｌのジイソプロピルエーテル溶液を、２時間かけて量り入れた。混合物をセライトCeriteで濾過し、二相を分離した。水相を６５ｍｌのジイソプロピルエーテルで抽出した。一体にした有機相を４５ｍｌの水で洗浄し、蒸発させて３７．５ｇに濃縮し、５０℃に加熱した。３１ｍｌのｎ−ヘキサンを、この溶液に滴下して加えた。

ゆっくりと（２時間）０℃に冷却し、標題化合物を濾過により得て、これをｎ−ヘキサン／ジイソプロピルエーテル＝１／１混合液１２ｍｌで洗浄し、乾燥した。６．７５ｇの生成物を得た。収率は７１％であった。

融点：７０−７１℃。

ｅｅ９８％（キラルＨＰＬＣカラムで較正）。

^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］１．１８（ｍ，１Ｈ）；
４００ＭＨｚ１．２７（ｓ，９Ｈ）；
２．２８（ｍ，１Ｈ）；
２．６３（ｍ，１Ｈ）；
３．３３（ｑ，２Ｈ）；
４．４３（ｍ，１Ｈ）；
４．５６（ｔ，１Ｈ）；
５．６２（ｍ，１Ｈ）；
５．７８（ｍ，１Ｈ）；
６．７２（ｄ，１Ｈ）。

［実施例１９］
（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン塩酸塩の製造
８７．８ｇの（１Ｒ，４Ｓ）−１−ＢＯＣ−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテンを、２７０ｍｌの２Ｎ−ＨＣｌと１３４０ｍｌのメタノールとの混合液に溶解した。混合物を、環流下に、４．５時間沸騰させた。メタノールを蒸留除去し、残渣を８００ｍｌの水に溶解した。水性の溶液を２回、３４０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。水性層を完全に蒸発させた（５０℃，６０mbar）。固体を、５０℃において真空下に乾燥し、１５０ｍｌのジエチルエーテル中に懸濁させ、濾過した後、５０ｍｌのジエチルエーテルで２回、洗浄した。乾燥して、標題化合物を９５％の収率（５８．４ｇ）で得た。

生成物の物理的および分光工学的なデータは、実施例１７の生成物のそれらと同じであった。

［実施例２０］
（１Ｒ，４Ｓ）−１−アセチルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
２５ｇの（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン塩酸塩を１８２ｍｌの無水酢酸に溶解し、０℃において、これに、１８．２５ｇのトリエチルアミンの無水酢酸６０ｍｌ中の溶液を添加した。混合物を８０℃において３時間撹拌し、ついで室温に冷却した。トリエチルアミン塩酸塩を濾過分離し、１２０ｍｌのｎ−ヘキサンで洗浄した。濾液を蒸発させた。残渣を３００ｍｌのトルエンに混合し、５．２ｇの活性炭および１３ｇのセライトの存在下に、室温で２０分間撹拌した。濾過およびフィルターケークの洗浄（３×４０ｍｌのトルエン）後、溶媒を完全に蒸発除去した。残渣を１８０ｍｌのメタノールおよび１５．５ｇのＫ_２ＣＯ_３と混合し、室温で１０時間撹拌した。懸濁液を濾過し、濾液を蒸発させた。残渣を７５０ｍｌの酢酸イソプロピルに懸濁させ、０．５ｇの活性炭の存在下に、還流下に１．５時間沸騰させた。活性炭の濾過分離後（７０〜８０℃）、濾液を０℃に一夜冷却した。標題化合物を濾別し、８０ｍｌの冷酢酸イソプロピルで洗浄し、真空下に乾燥した。１７．２ｇの生成物が得られた。収率は６６％であった。

融点：７７−８０℃。

ｅｅ９８％（キラルＨＰＬＣカラムで較正）
^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］１．１５（ｍ，１Ｈ）；
４００ＭＨｚ１．７８（ｓ，３Ｈ）；
２．２５（ｍ，１Ｈ）；
２．６６（ｍ，１Ｈ）；
３．３５（ｍ，２Ｈ）；
４．５８（ｔ，１Ｈ）；
４．７０（ｍ，１Ｈ）；
５．６２（ｍ，１Ｈ）；
５．８５（ｍ，１Ｈ）；
７．８０（ｄ，１Ｈ）。

［実施例２１］
（１Ｓ，４Ｒ）−１−アセチルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
標題に掲げたエナンチオマーは、２５ｇの（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン・塩酸塩から出発して、実施例１８の方法により、製造することができた（収率６８％）。生成物の分光光学的および物理的データは、実施例２０と同じであった。

［実施例２２］
（１Ｓ，４Ｒ）−１−ブチリルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
３４．７ｇの（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン・塩酸塩および２ｇの４−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノピリジンを、６００mlのメチレンクロライドに溶解した。溶液を０℃に冷却した。ついで、５２ｇのトリエチルアミンを滴下して加えた（５分間）。混合物を、３０分間撹拌した。３５．２ｇのブチリルクロライドを６０mlのメチレンクロライドに溶解した溶液を、この混合物に、０℃におい
て、１時間をかけて加えた。混合物をさらに１．５時間、０℃と２０℃の間の温度で撹拌し、ついで６００mlの水を加えた。相分離の後、水相を６００mlのメチレンクロライドで抽出した。一体にした有機相を、濃度１０％のＮａＯＨを毎回５００ml用いて３回洗浄し、完全に蒸発させた。乾燥した固体を、１２０mlのメタノールに溶解した。その溶液を５ｇのＫ_２ＣＯ_３と混合し、さらに２時間、室温で撹拌した。無機塩類を濾過して分け、２０mlのメタノールで洗浄した。濾液を、２Ｎ−ＨＣｌで中和した。懸濁体を濾過し、フィルターケークを２０mlのメタノールで洗浄した。濾液を完全に蒸発させた。固体残渣を乾燥し、１５０mlのトルエンから再結晶した。２８．５ｇの標題化合物が得られた。
収率は６７％であった。

融点：７１−７２℃
ｅｅ９８％（キラルＨＰＬＣで較正）
^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］０．８５（ｔ，３Ｈ）；
４００ＭＨｚ１．１５（ｍ，１Ｈ）；
１．５０（ｑ，２Ｈ）；
２．０３（ｄ，２Ｈ）；
２．２８（ｍ，１Ｈ）；
２．６７（ｍ，１Ｈ）；
３．３５（ｄ，２Ｈ）；
４．６２（ｓ，１Ｈ）；
４．７６（ｍ，１Ｈ）；
５．６３（ｍ，１Ｈ）；
５．８５（ｍ，１Ｈ）；
７．７７（ｄ，１Ｈ）。

［実施例２３］
（１Ｓ，４Ｒ）−１−ブチリルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
標題のエナンチオマーは、３４．７ｇの（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン・ハイドロクロライドから出発して、実施例２０の方法により、製造することができた（収率６３％）。生成物の分光光学的および物理的データは、実施例２２と同じであった。

［実施例２４］
（１Ｓ，４Ｒ）−１−［（２−アミノ−６−クロロ−５−フォルムアミド−４−ピリミジニル）アミノ］−４（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
２．０７ｇのＮ−（２−アミノ−４，６−ジクロロ−５−ピリミジニル）フォルムアミドを、４０mlのイソブタノール中（白色の懸濁体として）、８０℃に加熱した。１．９７ｇの（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−ヒドロキシメチル−２−シクロペンテン・塩酸塩、３．８ｇのトリエチルアミンおよび１５mlのイソブタノールを、この混合物に加えた。混合物を８０℃においてさらに１３時間撹拌した。１０mlの１Ｎ−ＮａＯＨを、この透明な溶液に２０℃で加え、続いて蒸発させ、乾固に至らせた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィーにかけた（シリカゲル６０カラム、長さ８cm、直径６．５cm、溶離剤は酢酸エチル／メタノール＝９５／５）。溶離剤を蒸発除去して残渣を乾燥した後、２．１ｇの標
題化合物が得られた。収率は７４％であった。

融点：１７４−１７６℃
ｅｅ９８％（キラルＨＰＬＣで較正）
^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］１．３７（ｍ，１Ｈ）；
４００ＭＨｚ２．３５（ｍ，１Ｈ）；
２．７３（ｍ，２Ｈ）；
３．３８（ｔ，２Ｈ）；
４．６８（ｍ，１Ｈ）；
５．０８（ｍ，１Ｈ）；
５．７０（ｄ，１Ｈ）；
５．８５（ｄ，１Ｈ）；
６．４０；６．５５および
６．６５（ｓ，ｄｄ，３Ｈとともに）
７．７８および８．１０（ｄとｓ，
１Ｈとともに）
８．５５および８．９５（ｄとｓ，
１Ｈとともに）
［実施例２５］
（１Ｒ，４Ｓ）−１−［（２−アミノ−６−クロロ−５−フォルムアミド−４−ピリミジニル）アミノ］−４（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
１４５．２mlの（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン溶液（実施例１４に類似の方法により製造した）を、２５．５mlに濃縮し、セライト上で濾過した。フィルターケークを、７．５mlの水で洗浄した。濾液は１７．７mmolの上記化合物を含有していた（ＨＰＬＣ）。これに濃ＨＣｌを加えてｐＨを６．６から１に調整し、３回、２０mlずつのイソブタノールで抽出した。有機相は捨てた。水性相
は濃度３０％のＮａＯＨでｐＨを１２に調整し、３回、１０mlずつのイソブタノールで抽出した。一体にした有機相を蒸発濃縮して１５mlとし、２．５３ｇのトリエチルアミンを加えた。この混合物に、２．０７ｇのＮ−（２−アミノ−４，６−ジクロロ−５−ピリミジニル）フォルムアミドの４０mlのエタノール中の溶液を、実施例２４と同様に加えた。混合物を、８０℃において１６時間撹拌した。実施例２２と同様に処理して、２．４ｇの標題化合物を得た。収率は８５％であった。
生成物の分光光学的および物理的データは、実施例２４と同じであった。

［実施例２６］
（±）−１−ＢＯＣ−アミノ−２−シクロペンテン−４−カルボン酸の製造
１６．４ｇの粗製（±）−１−ＢＯＣ−アミノ−２−シクロペンテン−４−カルボン酸・塩酸塩（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８１，４６，３２６８に記載のようにして製造）を、８０mlの水と８０mlのジオキサンの混合物に、室温で、窒素雰囲気下に溶解した。溶液を、１Ｎ−ＨＣｌでｐＨ１４に調整し、ｔ−ブチロキシカルボニル・フルオライド（ＢＯＣ−Ｆ，２０％過剰）の、ジエチルエーテル溶液を添加した（ＢＯＣ−Ｆは、ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９７５，５９９に記載のようにして製造したもの）。混合物を、さらに５時間、室温で撹拌した。濃ＨＣｌでｐＨを２に調整した。有機溶媒を蒸留除去した後、５０mlの水を残渣に加え、混合物を３回、各回１００mlの酢酸エチルで抽出した。有機相を蒸発させて５０mlにし、２５mlのトルエンで希釈した。冷却した（０〜１０℃）後、標題化合物を濾過し、乾燥した。１４．３ｇの製品が得られた。収率は６３％であった。

融点：１２６−１２７℃
^１Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆ ）：δ［ppm］１．１４（ｓ，９Ｈ）
４００ＭＨｚ１．７０（ｍ，１Ｈ）；
２．４０（ｍ，１Ｈ）；
３．４０（ｍ，１Ｈ）；
４．４７（ｍ，１Ｈ）；
５．７０（ｔ，１Ｈ）；
４．８７（ｔ，１Ｈ）；
６．８８（ｄ，１Ｈ）；
１２．３０（ｄ，１Ｈ）。

［実施例２７］
（±）−１−ＢＯＣ−アミノ−２−シクロペンテン−４−カルボン酸からの（±）−１−ＢＯＣ−アミノ−４（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
２５０mlのテトラヒドロフランと１０．０２ｇ（０．１６４mmol）のＬｉＡｌＨ_３とを、５００mlの撹拌機つき容器に入れ、３０．０ｇ（０．１３２mol）の（±）−１−ＢＯＣ−アミノ−２−シクロペンテン−４−カルボン酸のテトラヒドロフラン７５ml中の溶液を、−１０℃で、１時間かけて計量して入れた。つぎに、１０ｇの水、１０ｇの濃度１５％ＮａＯＨ溶液、および水２０ｇをこれに添加し、濾過した。残渣を２回、各回１００mlのｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄し、一体にした有機相を、蒸発乾固させた。ヘキサン８０mlを添加したのち、実施例１０で製造した化合物を接種したところ、標題化合物が、結晶性の固体として分離された。収量は１５．８４ｇ（５６％）であった。生成物の分光光学的および物理的データは、実施例１０と同じであった。

［実施例２８］
（１Ｒ，４Ｓ）−１−ＢＯＣ−アミノ−２−シクロペンテン−４−カルボン酸からの（１Ｒ，４Ｓ）−１−ＢＯＣ−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンの製造
８０mlのテトラヒドロフランと、１１．３８ｇ（５０．０７mmol）の（１Ｒ，４Ｓ）−１−ＢＯＣ−アミノ−２−シクロペンテン−４−カルボン酸（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、１９９３，４，１１１７に記載のようにして製造）とを、５００mlの撹拌機つき容器に入れ、５mlのボラン／ジメチルサルファイド錯体を、−１５℃で、１時間かけて計量して入れ、混合物をこの温度で３時間撹拌した。４ｇのＮａＯＨを水６０mlに溶解した溶液を加え、室温まで温めた。トルエンを用いた抽出、シリカゲルを通す濾過、およびそれに続く酢酸エチル／ｎ−ヘキサン１：１中の再結晶によって、収率５７％に相当する５．４ｇの標題化合物が、白色の結晶状固体として得られた。生成物の分光光学的および物理的データは、実施例１０と同じであった。ｅｅは９９％（同じキラルＨＰＬＣカラム）。

実施例１６のデータであって、ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）からのＮ−アセチルアミノアルコール・ハイドロラーゼ（細胞を含有しないエキス）の、ｐＨを関数とする活性を示すグラフ。やはり実施例１６のデータであって、ロドコッカス・エリスロポリスＣＢ１０１（ＤＳＭ１０６８６）からのＮ−アセチルアミノアルコール・ハイドロラーゼ（細胞を含有しないエキス）の、温度を関数とする活性を示すグラフ。

Claims

下式ＩまたはIIの（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−４−（２−アミノ−６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−２−シクロペンテン−１−メタノールまたはその塩を製造する方法であって、

第一段階において、式IIIの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン

をアシル化して、一般式IVの（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−３−オン誘導体とし、

（式中、Ｒ^１はＣ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、アリールまたはアリロキシを表す。）
第二段階において、後者を還元して、一般式Ｖのシクロペンテン誘導体とし、

（式中、Ｒ^１は前記した意味を有する。）
第三段階において、後者を、一般式Ｖのシクロペンテン誘導体を唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および唯一の炭素源として資化する能力をもった微生物を利用するか、Ｎ−アセチルアミノアルコール・ヒドロラーゼ活性またはペニシリンＧアシラーゼ活性を有する酵素を利用するかして、一般式VIまたはVII の（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン誘導体とし、

第四段階において、後者を、式VIIIのＮ−（２−アミノ−４、６−ジクロロ−５−ピリミジニル）フォルムアミドを用いて、

式IXまたはＸの（１Ｓ，４Ｒ）−または（１Ｒ，４Ｓ）−４−［（２−アミノ−６−クロロ−５−フォルムアミド−４−ピリミジニル）アミノ］−２−シクロペンテン−１−メタノールとし、

第五段階において、後者を既知の手法により環化して、最終生成物である式ＩまたはIIの化合物を得ることを特徴とする製造方法。
第一段階のアシル化を、一般式XIのハロゲン化カルボニル

（式中、Ｒ^１は前記した意味を有し、Ｘはハロゲン原子を表す。）
または一般式XIIのカルボン酸無水物

を使用して実施することを特徴とする請求項１の製造方法。
第一段階のアシル化を、アプロティックな溶媒を使用して実施することを特徴とする請求項１または２の製造方法。
第二段階の還元を、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のボロハイドライド、アルカリ金属またはアルカリ土類金属のアルミニウムハイドライド、またはビトライド（Vitride）を使用して実施することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかの製造方法。
第二段階の還元を、プロティックな溶媒を使用して実施することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかの製造方法。
第三段階の反応を、ロドコッカス(Rhodococcus) 、ゴルドナ(Gordona)、アースロバクター(Arthrobacter)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、アグロバクテリウム／リゾビウム(Agrobacterium/Rhizobium)、バチルス(BAcillus)、シュードモナス(Pseudomonas)またはアルカリゲネス／ボルデテラ(Alcaligenes/Brodetella)属の微生物を利用して実施することを特徴とする請求項１ないし５のいずれかの製造方法。
第三段階の反応を、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium) またはエシェリチア・コリ(Escherichia coli)からのペニシリンＧアシラーゼを使用して実施することを特徴とする請求項１ないし６のいずれかの製造方法。
第三段階の生物学的変換を、温度２０ないし４０℃、およびｐＨ５ないし９において実施することを特徴とする請求項１ないし７のいずれかの製造方法。
第四段階の反応を、塩基の存在下に実施することを特徴とする請求項１ないし８のいずれかの製造方法。
第四段階の反応を、プロティックな溶媒中で実施することを特徴とする請求項１ないし９のいずれかの製造方法。
一般式XVI またはXVIIの（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン誘導体のエナンチオマーを製造する方法であって、

（式中、Ｒ^１は前記した意味を有する。）
第一段階において、一般式Ｖのシクロペンテン誘導体を、

（式中、Ｒ^１は前記した意味を有する。）
一般式Ｖのシクロペンテン誘導体を唯一の窒素源として、唯一の炭素源として、または唯一の窒素源および唯一の炭素源として資化する能力をもった微生物を利用するか、Ｎ−アセチルアミノアルコール・ヒドロラーゼ活性またはペニシリンＧアシラーゼ活性を有する酵素を利用するかして、式VIまたはVII の（１Ｒ，４Ｓ）−または（１Ｓ，４Ｒ）−１−アミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン

に変換し、後者を第二段階においてアシル化して、式XVI またはXVIIの化合物を得ることを特徴とする製造方法。
請求項１１の方法によって得られ、０％を超えるエナンチオマー・アクセスの状態にある、式XVIII の（１Ｒ，４Ｓ）−１−ブチリルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテンのエナンチオマー。
請求項１１の方法によって得られ、少なくとも８０％のエナンチオマー・アクセスの状態にある請求項１２のエナンチオマー。
請求項１１の方法によって得られ、少なくとも９０％のエナンチオマー・アクセスの状態にある請求項１２のエナンチオマー。
請求項１１の方法によって得られ、少なくとも９５％のエナンチオマー・アクセスの状態にある請求項１２のエナンチオマー。
請求項１１の方法によって得られ、少なくとも９８％のエナンチオマー・アクセスの状態にある請求項１２のエナンチオマー。
１−ブチルアミノ−４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン誘導体のラセミ体。
式XIIIの４−（ヒドロキシメチル）−２−シクロペンテン誘導体

（式中、Ｒ^１は、前記した意味を有する。）
のラセミ体または光学活性体の製造方法であって、第一段階において、式XIV のシクロペンテン−４−カルボン酸

のラセミ体または光学活性な異性体のいずれか１つを、一般式XIのカルボン酸ハロゲン化物

（式中、Ｒ^１およびＸは、前記した意味を有する。）
でアシル化して、一般式XVのシクロペンテン−４−カルボン酸誘導体とし、

第二段階において後者を還元して、目的とする式XIIIの化合物を得ることを特徴とする製造方法。