CZ145898A3 - Způsob výroby (1S,4R)- nebo (1R,4S)-4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-1-methanolu - Google Patents

Způsob výroby (1S,4R)- nebo (1R,4S)-4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-1-methanolu Download PDF

Info

Publication number
CZ145898A3
CZ145898A3 CZ981458A CZ145898A CZ145898A3 CZ 145898 A3 CZ145898 A3 CZ 145898A3 CZ 981458 A CZ981458 A CZ 981458A CZ 145898 A CZ145898 A CZ 145898A CZ 145898 A3 CZ145898 A3 CZ 145898A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cyclopentene
amino
formula
hydroxymethyl
carried out
Prior art date
Application number
CZ981458A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ297894B6 (cs
Inventor
Christine Dr. Bernegger
Eva Maria Urban
Olwen Mary Dr. Birch
Kurt Burgdorf
Frank Brux
Kay-Sara Etter
Pierre Dr. Bossard
Walter Dr. Brieden
Laurent Dr. Duc
John Gordon
Colm Dr. O´Murchu
Yves Dr. Guggisberg
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of CZ145898A3 publication Critical patent/CZ145898A3/cs
Publication of CZ297894B6 publication Critical patent/CZ297894B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/26—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32—Nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00—Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/16—Preparation of optical isomers
    • C07C231/18—Preparation of optical isomers by stereospecific synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/23—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/24—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/56—Ring systems containing three or more rings
    • C07D209/80—[b, c]- or [b, d]-condensed
    • C07D209/94—[b, c]- or [b, d]-condensed containing carbocyclic rings other than six-membered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/40—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with halogen atoms or perhalogeno-alkyl radicals directly attached in position 2 or 6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/10—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being unsaturated

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Vynález se týká nového způsobu výroby (1S,4R)- nebo (1R,4S)~ -4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-l-methanolu vzorců I a II
jakož i nového způsobu výroby obecných vzorců XVI a XVII opticky aktivních sloučenin
(IS,4R)-4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-l-methanol je důležitý meziprodukt pro výrobu 2-aminopurinnukleosidů, jako například pro výrobu (IS,4R)-4-[2-amino-6-(cyklopropylamino) -9-H-purin-9-yl]-2-cyklopenten-l-methanolu (WO 95/21 161) nebo pro výrobu 1592U89 (J.Org.Chem.,1996,61,4192-4193; J.Org.Chem., 1996,61,7963-7966).
Dosavadní stav techniky
Způsob výroby (IS,4R)-4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-l-methanolu z (IS,4R)-4-amino-2-cyklopenten-l-methanolu je popsán ve WO 95/21 161. Nevýhodou tohoto způsobu je • ·
• · · · • · · · · • · · • · · ·
- 2 to, že lze edukt (IS,4R)-4-amino-2-cyklopenten-l-methanol získat výhradně přes (±)-2-azobicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on substituovaný drahou BOC-chránicí skupinou (terč, butyloxykarbonylová chránící skupina) (J.Org.Chem.,1995,60,4602-4616).
Úkolem vynálezu bylo poskytnout jednoduchý, výhodný a hospodárnější způsob výroby (1S,4R)- nebo (IR,4S)-4-(2-amino-6chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-l-methanolu.
Podstata vynálezu
Tato úloha se vyřešila způsobem podle vynálezu podle nároku 1. První stupeň způsobu podle vynálezu se provádí tak, že se acyluje (±)-2-azobicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on obecného vzorce III
za vzniku derivátu (±)-2-azobicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu obecného vzorce IV
kde R1 znamená C1_4~alkyl, C1_4-alkoxy, aryl nebo aryloxy.
C1_4-alkyl může být substituovaný nebo nesubstituovaný. Pod pojmem substituovaný C1_4~alkyl se v následujícím rozumí Cj.^-alkyl substituovaný atomem halogenu. Jako atom halogenu lze použít F, Cl, Br nebo J. Jako příklady pro C1_4~alkyl jsou methyl, ethyl, propyl, butyl, isobutyl, terč, butyl, isopropyl, chlormethyl, brommethyl, dichlormethyl, dibrommethyl. Výhodně se jako C1_4-alkyl používá methyl, ethyl, propyl, butyl, isobutyl nebo chlormethyl.
• · • · • · ·· ··♦ · · ·· • · · · · · · ···· • · ·· · · · · · · ·· • · ·· · · ·· ··· ··· ·· ··· ·· ··
- 3 Jako C1_4~alkoxy lze například použít methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, terč, butoxy nebo isobutoxy. Výhodně se jako
C^-^-alkoxy používá terč, butoxy.
Jako aryl se může například použít fenyl nebo benzyl, výhodně fenyl. Jako aryloxy se může například použít benzyloxy nebo fenoxy.
Edukt (±)-2-azobicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on lze vyrobit podle EP-A 0 508 352.
Acylaci lze uskutečnit halogenidem karboxylové kyseliny obecného vzorce XI
R1 - C - X
XI nebo anhydridem karboxylové kyseliny obecného vzorce XII
II
C
R'-'O o
II
XII kde R1 má uvedený význam a X znamená atom halogenu. Jako atom halogenu X se mohou použít F, Cl, Br nebo J. Výhodně se používá Cl nebo F.
Příklady pro halogenidy karboxylových kyselin jsou: acetylchlorid, chloracetylchlorid, chlorid kyseliny máselné, chlorid kyseliny isomáselné, chlorid kyseliny fenyloctové, benzylester kyseliny chlormravenčí (Cbz-Cl), chlorid kyseliny propionové, benzoylchlorid, allylester kyseliny chlormravenčí nebo terč. butyloxykarbonylfluorid. Příklady pro anhydridy • · • ·
- 4 karboxylových kyselin jsou: terč, butoxykarbonylanhydrid, anhydrid kyseliny máselné, anhydrid kyseliny octové nebo anhydrid kyseliny propionové.
Acylaci lze provést bez rozpouštědla nebo s aprotickým rozpouštědlem. Účelně se acylace provádí v aprotickém rozpouštědle. Jako aprotické rozpouštědlo jsou vhodné například diisopropylether, pyridin, acetonitríl, dimethylformamid, triethylamin, tetrahydrofuran, toluen, methylenchlorid, N-methylpyrrolidon, popřípadě jejich směsi.
Účelně se acylace provádí při teplotě od -80 až 50 °C, výhodně od 0 do 25 °C.
Ve druhém stupni způsobu podle vynálezu se redukuje derivát (±)-2-azobicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu obecného vzorce IV na derivát cyklopentenu obecného vzorce V
kde R1 má uvedený význam.
Redukce se účelně provádí borhydridem alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy, aluminiumhydridem alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy nebo vitridem (natrium-bis-(2-methoxyethoxy)aluminiumhydrid). Jako aluminiumhydrid alkalického kovu lze použít natrium- nebo kaliumaluminiumhydrid. Jako borhydrid alkalického kovu lze použít natrium- nebo kaliumborhydrid. Jako borhydrid kovu alkalické zeminy použít kalciumborhydrid. Jako nitrid lze například použít nitrid hlinitý.
Účelně se redukce provádí v protickém rozpouštědle. Jako protické rozpouštědlo se mohou použít nízké alifatické alkoholy jako je methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, sek.
• · • · ···· ·· · · • · · · · · ···· · · · · • ·· ···· · • · · · · ___ ___ ·· ··· ·· ··
- 5 butanol, terč, butanol, iso-butanol nebo voda, popřípadě směs jmenovaných alkoholů a vody.
Redukce se účelně provádí při teplotě od -40 do 40 °C, výhodně od 0 do 20 °C.
Třetí stupeň způsobu podle vynálezu, přeměna derivátu cyklopentenu obecného vzorce V na (1R,4S)- nebo (lS,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten vzorců VI a VII
se provádí bud' pomocí mikroorganismů, enzymu s N-acetylaminoalkoholhydrolasovou aktivitou nebo pomocí acylas penicilinu G. Při této biotransformaci se přeměňuje acylovaný derivát (1S,4R)nebo (IR,4S)-aminoalkoholu, přičemž vznikne (1R,4S)- nebo (1S,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten (vzorce VI, VI).
Pro biotransformaci zužitkují derivát zdroj dusíku, jako uhlíku a dusíku. Mikroorganismy kalu nebo odpadních vod jsou vhodné cyklopentenu jediný zdroj všechny mikroorganismy, obecného vzorce V jako uhlíku nebo jako jediný lze izolovat ze vzorků za pomocí obvyklých které jediný zdroj půdy, mikrobiologických technik. Izaloce mikroorganismů se uskutečňuje tak, že se pěstují obvyklým způsobem v živném mediu, které obsahuje derivát cyklopentenu obecného vzorce V
O kde R1 má uvedený význam, • · · · · · « · • · · ·
- jako jediný zdroj
- jako jediný zdroj
- jako jediný zdroj uhlíku a dusíku dusíku se vhodným zdrojem uhlíku nebo uhlíku se vhodným zdrojem dusíku.
Jako deriváty cyklopentenu obecného vzorce V jsou vhodné například: Ν-acetyl-, N-propionyl-, N-isobutyryl, N-terc.butoxykarbonyl-(N-BOC), N-butyryl nebo N-fenylacetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.
Jako vhodný zdroj dusíku mohou mikroorganismy jako růstový substrát využívat amonium, nitráty, aminokyseliny nebo močoviny.
Jako vhodné zdroje uhlíku mohou mikroorganismy využívat jako růstový substrát například cukr, cukerné alkoholy,
C2-C4-karboxylové kyseliny nebo aminokyseliny. Jako cukr se mohou použít hexosy jako glukosa nebo pentosy. Jako cukerný alkohol lze například použít glycerin. Jako C2-C4-karboxylové kyseliny lze například použít kyselinu octovou nebo propionovou. Jako aminokyseliny lze například použít leucin, alanin, asparagin.
Jako selekční a růstové medium se mohou použít v oboru běžně užívaná media, jako například medium uvedené v tabulce 1 nebo plné medium (medium obsahující extrakt kvasnic) jako například Nutrient Yeast Broth (NYB), výhodně medium uvedené v tabulce 1.
Při pěstování a selekci se účelně indukují účinné enzymy mikroorganismů. Jako induktor enzymů se mohou použít deriváty cyklopentenu obecného vzorce V.
Obvykle se uskutečňuje pěstování a selekce při teplotě od 20 do 40 °C, výhodně od 30 do 38 °C a hodnotě pH mezi 5,5 a 8, výhodně mezi pH 6,8 a pH 7,8.
Účelně se provádí biotransformace s mikroorganismy, které zužitkují (lR,4S)-isomery derivátu cyklopentenu jako jediný zdroj uhlíku, jako jediný zdroj uhlíku a dusíku nebo jako jediný zdroj dusíku.
• · · · · ·
- Ί pohyblivost mrskání
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH aminopeptidáza (Cerny)
Výhodně se biotransformace provádí pomocí mikroorganismů rodu Alcaligenes/Bordetella, Rhodococcus, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Gordona, zejména druhu Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putioda K32 nebo Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), jakož i s jejich funkčně ekvivalentními variantami a mutanty. Mikroorganismy DSM 10686 a 10687 byly uloženy 20.05.1996, mikroorgansimy DSM 10328 a DSM 10329 byly uloženy 06.11.1995, mikroorganismus DSM 11291 08.10.1996 a mikroorganismus DSM 11172 20.09.1996 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH, Mascheroderweg lb, D38124 Braunschweig, podle Budapešťské úmluvy.
Pod výrazem funkčně ekvivalentní varianty a mutanty se rozumějí mikroorganismy, které mají vpodstatě stejné vlastnosti a funkce jako původní mikroorganismy. Takové varianty a mutanty mohou vzniknout náhodně, například UV-ozářením.
Taxonomický popis Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172) tyčinky
0,5-0,6 1,0-2,5 + peritrich +
+ + + bunecna forma šířka μ,ιη délka μ,ιη spory oxidáza kataláza ·
4
4
4
4 • · ·
• 44
ADH (alkoholdehydrogenáza) no2 z no3 denitrifikace ureáza hydrolýza želatiny kyselina z (OF-test):
glukosy fruktosy arabinosy adipátu+ kaprátu+ citrátu+ malátu+ mannitolu
Taxonomický popis Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 106 86)
1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáří rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou lesklé částečně rozteklé, béžový s růžovým tónem, RAL 1001;
2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová
3. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové mikroorganismu
Rhodococcus; určení délky řetězce kyseliny mikolové (C32 -C44) a srovnání údajů s údaji zanesenými do databanky DSM-kyselin mikolových ukázalo na velmi vysokou podobnost se vzorky kmenů Rhodococcus erythropolis (podobnost 0,588).
4. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.
5. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu byla zjištěna vysoká shodnost (100%) se sekvencemi spezifických oblastí Rhodococcus erythropolis.
φφ φφφφ φφ • φ φ φ φφφ φφφφ • φ φφφφφ φφφφ φ φφφφ φφ φφφφφ φ φ φφ φ φφφ φφφ φφφ φφ φφφ φφ φφ
- 9 Výsledek identifikace je jednoznačný, nebot tři na sobě nezávislé metody (kyseliny mikolové, mastné kyseliny, 16S rDNA) přiřadily kmen druhu Rhodococcus erythropolis.
Taxonomický popis Gordona sp. CB 100 (DSM 10687)
1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáří rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou světle oranžové, (RAL 2008);
2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová
3. Vzorek menachinonu: MK-9(H2) 100%;
4. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové mikroorganismu
Gordona; určení délky řetězce kyseliny mikolové (C5oC6O^ se uskutečnilo pomocí vysokoteplotní plynové chromatografie. Tento vzorek odpovídá vzorku, jaký se nalézá u zástupců rodu Gordona.
5. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.
6. Při parciálním sekvencováni 16S rDNA kmenu byla zjištěna relativně nízká shodnost (98,8%) se sekvencemi spezifických oblasti Gordona rubropertincta.
Na základě předložených výsledků (menachinony, kyseliny mikolové, mastné kyseliny, 16S rDNA) lze izolát sice jednoznačně přiřadit rodu Gordona. Přiřazení ke známému druhu Gordona není možné na základě těchto výsledků. Je tedy třeba předpokládat, že se u kmenu DSM 10687 jedná o nový dosud nepopsaný druh rodu Gordona.
• · to · · to
- 10 Taxonomický popis Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans
HSZ 17 (DSM 10329)
Vlastnosti kmene buněčná forma tyčinky šířka |im
0,5-0,6 délka μιη
1,5-3,0 pohyblivost mrskání peritrich
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH + aminopeptidáza (Cerny) + spory oxidáza kataláza růst anaerobně
ADH (alkoholdehydrogenáza)+
NC>2 z NO3+ denitrifikace+ ureáza hydrolýza želatiny
Tween 80 • 9 999 9
9 9 9 9 9 kyselina z (OF-test):
glukosy aerobně xylosy 80 zužitkování substrátu glukosy fruktosy arabinosycitrátu+ malátu+ mannitolu
Taxonomický popis Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328) charakteristika: Gram-positivní nepravidelné tyčinky s výrazným růstovým cyklem tyčinky-koky; striktně aerobní; žádná tvorba kyseliny nebo plynu z glukosy pohyblivost spory katalasa meso-diaminopimelinová kysselina v buněčné stěně: ne peptidoglykanový typ: A3a, L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala podobnost sekvence 16S rDNA: sekvencování oblasti s největší variabilitou prokázalo jako nejvyšší hodnoty 98,2 % s Arthrobacter pascens, A.ramosus a A.oxydans
Taxonomický popis Agrobacterium/Rhizobium HSZ30 buněčná forma šířka p.m délka μιη pleomorfní tyčinky
0,6-1,0
1,5-3,0 • » ♦ · * a • · • ta
Gram-reakce lyže 3 %ním KOH + aminopeptidáza + spóry oxidáza kataláza
pohyblivost +
růst anaerobně -
nitrit z nitrátu -
denitrifikace
ureáza hydrolýza želatiny kyselina z: L-arabinosy galaktosy melezitosy fukosy arabitolu mannitolu erythritolu alkalizace lakmusového mléka: + ketolaktosa
Parciální sekvencování 16S rDNA prokázalo srovnatelně velké ca 96 % podobnosti k zástupcům rodů Agrobacterium a Rhizobium.
- 13 44 4444 ·· er • 4 4 4 44444
4 4 444 4 4 44
44 * 44 444 4*
4 4 4 4 44
444 44 444 4444
Jednoznačné přiřazeni k jednomu druhu rodů není možné.
popsanému v rámci těchto
Taxonomický popis Bacillus simplex K2
buněčná forma tyčinky
šířka μιη 0,8-1,0
délka μιη 3,0-5,0
spory —
elipsoidní -
kulaté -
sporangium —
kataláza +
anaerobní růst -
VP reakce k.W.
maximální teplota
positivní růst při °C 40
negativní růst při °C 45
růst v
mediu pH 5,7 -
Naci 2 % +
5 % -
7 % -
10 % -
mediu s lysozymem +
kyselina z (ASS)
D-glukosy +
L-arabinosy +
D-xylosy -
·· ····
D-mannitu +
D-fruktosy +
plyn z fruktosy -
lecithináza
hydrolýza
škrobu +
želatiny +
kaseinu -
Tween 80 eskulinu zužitkování citrátu propionátu nitrit z nitrátu indol fenylalanindesamináza arginindihydroláza
Analýza buněčných mastných kyselin potvrdila přiřazení k rodu Bacillus.
Parciální sekvencování 16S rDNA prokázala 100 % podobnost k Bacillus simplex.
tyčinky
0,8-0,9
1,5-4,0
Taxonomický popis Pseudomonas putida K32 buněčná forma šířka μιη délka μιη • · • · · ·
pohyblivost +
mrskání polarní>l
Gram-reakce -
lyže 3 %ním KOH +
aminopeptidáza +
spory -
oxidáza +
kataláza +
růst anaerobně pigmenty fluoreskující pyocyanin
ADH + nitrit z nitrátu denitrifikace ureáza hydrolýza želatiny zužitkování substrátu adipát citrát + malát + D-mandelát + fenylacetát +
D-tartrát
D-glukosa + trehalosa mannitol benzoylformiát propylenglykol + butylamin + benzylamin + tryptamin acetamid + hippurát +
Profil buněčných mastných kyselin je typický pro Pseudomonas putida.
Parciální sekvencování 16S rDNA prokázala ca 98 % podobnost k Pseudomonas mendocina a Pseudomonas alcaligenes. Podobnost k Pseudomonas putida byla 97,4 %.
Taxonomický popis Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291)
1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáří rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou matné, světle červenooranžové RAL 2008;
2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová;
3. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové mikroorganismu Rhodococcus;
Určení délky řetězce kyseliny mykolové (C32~C44) a srovnání údajů se záznami DSMZ-databanky mykolových kyselin prokázalo jen velmi malou podobnost ke vzorkům kmenů Rhodococcus ruber (podobnost, 0,019). Tento korelační faktor je příliš malý na to, aby mohl být použit pro identifikaci druhu.
5. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.
Tento vzorek mastných kyselin je diagnostický pro všechny zástupce rodu Rhodococcus a jejich blízké příbuzné jako Mycobakterium, Nocardia a Gordona. Byl učiněn pokus o diferenciaci druhu při zohlednění kvalitativních a kvantitativních rozdílů ve vzorku mastných kyselin. Pomocí numerických metod se vzorek mastných kyselin z Rhodococcus sp. FB 387 srovnal se záznamy databanky. Také pomocí této metody se nemohl Rhodococcus sp. FB 387 z důvodu malé podobnosti (0,063) přiřadit k žádnému popsanému druhu Rhodococcus.
5. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu bylo přiřazeno 96-818 s 97,9 % korelací Rhodococcus opacus. Tato shodnost sekvence je hodně pod 99,5 %, jak se požaduje pro jednoznačné přiřazení k druhu v tomto taxonu.
Na základě předložených výsledků je možné vycházet z toho, že se u kmene Rhodococcus sp. FB 387 jedná o nový dosud nepopsaný druh.
Biotransformace se může provádět po obvyklém pěstování těchto mikroorganismů s buňkami v klidu (nerostoucí buňky, které již nepotřebují žádný zdroj uhlíku a energie) nebo s rostoucími buňkami. Výhodně se biotransformace provádí s buňkami v klidu.
Enzymy s N-acetylaminoalkoholhydrolasovou aktivitou vhodné pro biotransformaci lze například isolovat v oboru běžným způsobem otevřením popsaných buněk mikroorganismů. K tomu se může například použít metody s ultrazvukem nebo Frenschovu tlakovou metodu. Výhodně se tyto enzymy isolují z mikroorganismů Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686).
Vhodné acylázy penicilinu G se získají z mnoha mikroorganismů, například z bakterii nebo aktinomycetenů, zvláště z následujících mikroorganismů: Escherichia coli ATCC 9637, Bacillus megaterium, Streptomyces lavendulae ATCC 13664, Nocardia sp. ATCC 13635, Providencia rettgeri ATCC 9918, Arthrobacter viscosus ATCC 15294, Rhodococcus fascians ATCC 12975, Streptomy18 • · · ···· · ··· * · · · · · · ···· • · · · · · · ··· ··· ·· ··· «· 99 ces phaeochromogenes ATCC 21289, Achromobacter ATCC 23584 a Micrococcus roseus ATCC 416. Zejména se používají obchodně dostupné acylázy penicillinu G jako acyláza EC 3.5.1.11 penicilinu G z E.coli (Boehring Mannheim) nebo z Bacillus megaterium.
Ve výhodném provedení se používají imobilizované acylázy penicilinu G.
Biotransformace se může provádět v mediích známých v oboru, jako například v nízkomolárních fosfátových, citrátových nebo Hepes-pufrech, ve vodě, v úplných mediích jako například Nutrient Yeast Broth (NYB) nebo v mediích popsaných v tabulce 1. Výhodně se biotransformace provádí v mediu uvedeném v tabulce 1 nebo nízkomolárním fosfátovém pufru.
Účelně se biotransformace provádí za jednorázového nebo kontinuálního přidávání derivátu cyklopentenu (vzorec V) tak, že koncentrace nepřesáhne 10 % hmotn., výhodně 2 % hmotn.
Hodnota pH během biotransformace může být v rozmezí od 5 do 9, výhodně od 6 do 8. Účelně se biotransformace provádí při teplotě od 20 do 40 °C, výhodně od 25 do 30 °C.
Ve čtvrtém stupni se derivát cyklopentenu (vzorec VI nebo
VII) s N-(2-amino-4,6-dichlorpyrimidin)-5-yl)formamidem vzorce
VIII
VIII převede na (1S,4R)- nebo (lR,4S)-4-[(2-amino-6-chlor-5-formamido-4-pyrimidinyl)-amino]-2-cyklopenten-l-methanol vzorce IX nebo X
ch2oh
- 19 N-(2-amino-4,6-dichlorpyrimidin)-5-yl)formamid se může vyrobit polde WO 95/21 161.
Účelně se reakce ve čtvrtém stupni provádí v přítomnosti báze. Jako báze se mohou použít organické báze nebo anorganické báze. Jako organické báze se mohou použít trialkylaminy. Příklady trialkylaminů jsou triethylamin, tributylamin, tribenzylamin, pyridin nebo N-methylpyrrolidin. Jako anorganické báze se mohou použít například uhličitany alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, popřípadě hydrogenuhličitany alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, jako například uhličitan draselný nebo hydrogenuhličitan sodný.
Účelně se reakce ve čtvrtém stupni provádí v protickém rozpouštědle. Jako protické rozpouštědlo lze použít nízké alifatické alkoholy jako methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol nebo isobutanol.
Účelně se reakce ve čtvrtém stupni provádí při teplotě od 0 do 150 °C, výhodně od 20 do 100 °C.
V pátém stupni se (1S,4R)- nebo (IR,4S)-4-[(2-amino-6-chlor-5-formamido—4-pyrimidinyl)-amino]-2-cyklopenten-l-methanol (vzorce IX,X) cyklizuje známým způsobem podle WO 95/21 161 na konečný produkt vzorce I nebo II.
Obvykle se cyklizace provádí při rozpuštění v trialkylorthoformátech v přítomnosti koncentrované vodné trialkylorthoformáty se mohou například použít triethylorthoformát. Jako vodná kyselina se kyseliny. Jako trimethyl- nebo může například použít kyselina chlorovodíková, kyselina sírová nebo kyselina methansulfonová.
Jako další součást vynálezu je způsob výroby opticky aktivních sloučenin obecných vzorců XVI, XVII ···
XVI
Ί kde R má uvedený význam. Tyto sloučeniny lze získat přeměnou derivátu cyklopentenu obecného vzorce V
kde R1 má uvedený význam, pomoci již dříve popsaných mikroorganismů, N-acetylaminoalkoholhydroláz nebo acyláz penicilinu G na (1R,4S)- nebo (IS,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten vzorců VI, VII
přičemž posledně uvedená sloučenina se acyluje na sloučeninu vzorců XVI nebo XVII.
Jak mikrobiologická přeměna tak acylace se provádějí za stejných dříve popsaných podmínek.
Účelně se acylace provádí při- teplotě od 20 do 100 °C, výhodně od 0 do 80 °C.
Příklady opticky aktivních sloučenin, které se vyrábějí podle tohoto způsobu jsou:
(IR,4S)-N-terc.butoxykarbonyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten s hodnotou ee 98 %, (IR,4S)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten s hodnotou ee 98 %, • · ··· · • · · • · · »t • ·· • · · · (IR,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten s hodnotou ee 98 %, opticky aktivní (IS , 4R)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl )-2-cyklopenten a opticky aktivní (IS,4R)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl )-2-cyklopenten.
Z těchto sloučenin není ještě v literatuře popsaná opticky aktivní sloučenina (IR,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl ) -2-cyklopenten . Součásti vynálezu je proto také opticky aktivní (IR,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten s více než 0 % enantiomerním přebytkem, výhodně v nejméně 80 %, 90 % nebo 95 % enantiomerním přebytku, obvzláště v nejméně 98 % enantiomerním přebytku. Tyto opticky aktivní sloučeniny se mohou racemizovat v oboru známým způsobem na v literatuře ještě nepopsaný racemický N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten.
Způsob výroby racemického nebo opticky aktivního derivátu
4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu obecného vzorce XIII
HO
XIII kde R1 má uvedený význam, se provádí tak, že se v prvním stupni acyluje cyklopenten-4-karboxylová kyselina vzorce XIV
XIV ve formě racemátu nebo jednoho z jeho opticky aktivních isomerů, s halogenidem karboxylové kyseliny obecného vzorce XI
O
Η
R1 - C - X XI kde R1 a X mají uvedený význam, na racemický nebo opticky aktivní derivát cyklopenten-4-karboxylové kyseliny obecného vzorce XV
a ten se ve druhém stupni redukuje na požadovaný produkt vzorce XIII.
Pod opticky aktivními deriváty 4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu (vzorec XIII) a opticky aktivními deriváty cyklopenten-4karboxylové kyseliny (vzorec XV) se rozumějí odpovídající (1R,4S) nebo (1S,4R) isomery.
První stupeň tohoto způsobu, acylace, se provádí halogenidem karboxylové kyseliny bbecného vzorce XI. Jako halogenidy karboxylové kyseliny se mohou použít stejné jako už dříve popsané, výhodně se používá terč, butyloxykarbonylfluorid.
Účelně se reakce v prvním stupni provádí při hodnotě pH od 8 do 14, výhodně od 12 do 14 a při teplotě od 0 do 50 °C, výhodně od 15 do 25 °C.
Jako rozpouštědla jsou vhodné směsi vody s ethery. Jako ether lze použit dioxan, tetrahydrofuran, diethylether, glykoldimethyl- nebo -diethylether.
•9 ···· • ·
• · · ι» • · · · •· ·· ·· · ·· • ··
99··
Druhý stupeň způsobu, redukce, se může provádět s aluminiumhydridem alkalického kovu, s boran-di-C1_4-alkylsulfidovým komplexem nebo boran-tetrahydrofuranovým komplexem. Jako aluminiumhydrid alkalického kovu se může použít aluminiumhydrid lithný, sodný nebo draselný, výhodně aluminiumhydrid lithný. Jako boran-di-C1_4~alkylsulfidový komplex se mohou použít borandimethylsulfidový, borandiethylsulfidový, borandipropylsulfidový nebo borandibutylsulfidový komplex. Výhodně se používá borandimethylsulfidový komplex.
Účelně se jako rozpouštědlo používá ve druhém stupni jeden ze shora uvedených etherů, bez vody.
Reakce ve druhém stupni se může provádět při teplotě od -50 do 5 °C, výhodně od -25 do -10 °C.
Příklady provrdení vynálezu
Příklad 1
Výroba (±)-2-acetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
100 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (800 ml) a pyridinu (161,26 ml). Při 12 °C se přikapalo 104,5 g acetylchloridu po dobu 2 hodin. Směs se ještě míchala 4,5 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 800 ml vody a acetonitril se odpařil za vakua. Vodná fáze se 3krát extrahovala 400 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se ještě promyly IN HC1 (400 ml), vodou (400 ml), nasyceným NaCl (400 ml), sušily s síranem hořečnatým a zcela odpařily. Ke zbytku se přidal methylenchlorid a to se filtrovala přes křemičitanový gel. Filtrát se zahustil a produkt se čistil destilaci. Získalo se 107,76 g produktu jako čirá kapalina. Výtěžek představoval 71 %.
kPq,07 torr • t ····
- 24 2,25 (AB syst.,2H);
2,8(s,3H);
3,42(m,lH);
5,30(m,lH);
6,89(m,lH);
6,92(m,lH).
1H-NMR (CDC13):δ[ppm]
400 MHz
Příklad 2
Výroba (±)-2-butyryl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
103 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (720 ml) a pyridinu (142 ml). Při 12 °C se přikapalo 141,8 g chloridu kyseliny máselné po dobu 1 hodiny. Reakce se ještě míchala 3 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 720 ml vody a fáze se oddělily. Acetonitríl se odpařil za vakua a vodní fáze se 3krát extrahovala ethylacetátem (300 ml). Spojené organické fáze se ještě promyly IN HC1 (350 ml), nasyceným NaCl (400 ml) a vodou (500 ml), sušily se síranem hořečnatým a úplně odpařily. Produkt se čistil destilací. Získalo se 107,76 g produktu jako čirá kapalina. Výtěžek představoval 85 %.
kPq,05 torr; 70 c ^H-NMR (CDC13 ) : δ [ppm]
400 MHz
0,98(t,J=8,5 Hz,3H);
1,58-1,65(2H);
2,23(AB syst., 2H) ;
2,82-2,90(2H);
3,42(m,lH);
5,30(m,lH);
6,62(m,lH);
6,92(m,lH).
- 25 Příklad 3
Výroba (±)-2-fenylacetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
9 9 9 9999 99 99
• 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 999 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 99 99 999 99 99
33,4 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (240 ml) a pyridinu (48,3 ml). Při 12 °C se přikapalo 68,6 g chloridu kyseliny fenyloctové po dobu 30 minut. Směs se ještě míchala 3,5 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 240 ml vody. Acetonitril se odpařil za vakua a vodní fáze se 3krát extrahovala ethylacetátem (150 ml). Spojené organické fáze se ještě promyly IN HCl (150 ml), nasyceným NaCl (150 ml) a vodou (150 ml), sušily se síranem hořečnatým a úplně odpařily. Surový produkt se filtroval přes křemičitanový gel (hexan:ethylacetát=l:l). Získalo se 78,34 g surového produktu jako žlutý olej.
Příklad 4
Výroba (±)-2-propionyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (325 ml) a pyridinu (41 ml). Při 12 °C se přikapalo 43,9 g chloridu kyseliny propionové po dobu 1 hodiny. Reakce se ještě míchala 5 hodin při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 145 ml vody a acetonitril se odpařil za vakua. Vodná fáze se 3krát extrahovala 115 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se ještě promyly IN HCl (140 ml), nasycenými roztoky NaHCO3 (40 ml) a NaCl (40 ml), sušily se síranem sodným a úplně odpařily. Zbytek se čistil destilací. Získalo se 55,8 g titulní sloučeniny, která stáním ztuhla. Výtěžek byl 81,6 %.
Kp2,8 mbar 75-80 °C
t.t..: 54-56 °C ·· ··»· • 4·· ·· · · · · · * · *· * · · · ·· · · *· · * * · · · 9 9 99 9 99
9 9 9 9 9 99
999 999 99 999 9999
- 26 1H-NMR (DMSO-d6):8[ppm] 0,95 (t,3H);
400 MHz 2,10(quad.,IH);
2,28(quad.,IH);
2,64(m,2H);
3,42(s,lH); 5,16(m,lH); 6,78(m,lH); 6,96(m,lH).
Příklad 5
Výroba (±)-2-isobutyryl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
45,1 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v acetonitrilu (310 ml) a pyridinu (39 ml). Při 10 °C se přikapalo 54,1 g chloridu kyseliny isomaselné po dobu 1 hodiny. Reakce se ještě míchala 5 hodin při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 140 ml vody a acetonitril se odpařil za vakua. Vodná fáze se 4krát extrahovala 120 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se ještě promyly IH HCI (50 ml), nasycenými roztoky NaHCO3 (50 ml) a NaCl (50 ml), sušily se síranem sodným a úplně odpařily. Zbytek se vařil v n-hexanu (240 ml) s aktivním uhlím za zpětného toku. Po filtraci aktivního uhlí se filtrát ochladil při 0 °C a titulní sloučenina filtrovala. Získalo se
54,5 g produktu. Výtěžek byl 76 %.
t.t..: 41-42 °C
1H-NMR (DMSO-dg) :8[ppm] 0,92 (d,3H);
400 MHz l,06(d,3H);
2,10(m,lH); 2,28(m,lH);
3,40(m,2H);
5,16(S,1H);
6,78(m,lH);
7,92(m,lH).
···· • · • ··· • · • · · ♦ · Φ··
·« ·· • · · · • · ·· ·· · · · • · · ·· ··
Přiklad 6
Výroba (±)-2-chloracetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
10,1 g (±)-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem a při 10 °C ve směsi dichlormethanu (10 ml), pyridinu (8,4 ml) a 0,22 g 4-N,N-dimethylaminopyridinu. Přikapalo se
13,5 g chloracetylchloridu po dobu 1 hodiny. Teplota stoupla až na 44 °C. Směs se dále míchala 2 hodiny při teplotě místnosti. Ke směsi se přidalo 100 ml vody. Po oddělení fází se vodná fáze extrahovala 100 ml dichlormethanu. Spojené organické fáze se sušily se síranem sodným a úplně odpařily. Zbytek se vařil ve 100 ml diisopropyletheru za zpětného toku v přítomnosti 1 g aktivního uhlí po dobu 10 minut. Po horké filtraci se filtrát ochladil na teplotu místnosti, pevná látka se filtrovala a sušila. Získalo se 10, 35 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 60 %.
t.t..: 86-88 °C 1H-NMR (CDC13):δ[ppm] 2,28 (d,lH);
400 MHz 2,40(d,lH);
3,48(s,lH); 4,56(d,2H); 5,30(s,lH);
6,70(d,lH);
6,94(m,lH).
Příklad 7
Výroba (±)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
79,56 g (±)-2-acetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v ethanolu (450 ml) a ochladilo na -10 °C. Po částech se po dobu 45 minut přidávalo 19,8 g natriumborhydridu.
Reakce se ještě míchala 3 hodiny při teplotě 0 °C a pak se upra- 28 -
• Φ Φ* ···· ·· ··
• · Φ · • « • • · • ·
• • • · ··· • · • ·
• • • · · • • ··· • ·
• * • · • • • ·
• · · ·♦· ·· ··· • · ··
vilo pH na 1,8 pomocí koncentrované kyseliny sírové. Ke směsi se přidal ethylacetát (200 ml) a pevné látky se odfiltrovaly. Pak se to úplně odpařilo. Ke zbytku se přidala voda, promylo se methylenchloridem a odpařilo. Surový produkt se ještě čistil filtrací s křemičitanovým gelem. Získalo se 51,83 g produktu jako bílá pevná látka. Výtěžek byl 64 % vztaženo na vnesený 2-acettyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-on.
1H-NMR (DMSO-d6):δ[ppm]
400 MHz
1,18 (m,lH); l,78(s,3H);
2,29(m,IH);
2,66(m,lH);
3,35(s,2H);
4,58(s,lH);
4,72(m,lH);
5,61(d,lH);
5,85(d,lH);
7,83(d,lH).
Přiklad 8
Výroba (±)-N-butyryl-l-amino-4~(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
73,87 g (±)-2-butyryl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v ethanolu (400 ml) a ochladilo na -10 °C. Po částech se po dobu 45 minut přidávalo 15,68 g natriumborhydridu. Reakce se ještě míchala 3 hodiny při teplotě 0 °C a pak se upravilo pH na 1,5 pomocí koncentrované kyseliny sírové. Ke směsi se přidal ethylacetát (200 ml) a pevné látky se odfiltrovaly. Pak se to úplně odpařilo. Ke zbytku se přidala voda, promyl se methylenchloridem, odpařil a sušil za vysokého vakua. Získalo se 60,55 g produktu. Výtěžek byl 80 % vztaženo na vnesený (±)-2-butyryl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-on.
t.t.: 71-72 °C ♦» ♦·»♦ ·· ··
- 29 0,98(t,J=8,5Hz, 3H);
1,40-1,50(IH);
1,58-1,68(2H);
2,10-2,18(2H);
2,42-2,55(IH);
2,85(m,lH);
3,62(AB syst.,2H);
4,98(m,lH);
5,78-5,82(2H);
6,38(m,lH).
1H-NMR (CDC13):δ[ppm]
400 MHz
Příklad 9
Výroba (±)-N-fenylacetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu g surového (±)-2-fenylacetyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5en-3-onu se rozpustilo pod dusíkem v ethanolu (450 ml) a ochladilo na - 10 °C. Po částech se po dobu 1 hodiny přidávalo 13,2 g natriumborhydridu. Reakce se ještě míchala 3,5 hodin při teplotě místnosti a pak se upravilo pH na 1,8 pomocí koncentrované kyseliny sírové. Tato směs se čistila filtrací s křemičitanovým gelem (hexan:ethylacetát=2:8). Po překrystalování z ethylacetátu se získalo 15,89 g bílé pevné látky. Výtěžek byl 80 % vztaženo na vnesený (±)-2-fenylacettyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-on.
1H-NMR (CDC13):δ[ppm] 1,28-1,35(IH);
400 MHz l,40(m,lH) ;
2,38-2,45(IH);
2,79(m,IH);
3,50(AB syst.,2H);
3,52(s,3H); 4,98(m,lH);
5,75(m,2H);
5,98(m,lH);
7,20-7,38(5H).
♦ · φ« *·«··*· ♦ · ·· · · ····· * * ♦ · ······· • 9 · · * · · *···· • · · · ·· · * ··· ♦ ·· ·«··· ··
- 30 Příklad 10
Výroba (±)-N-BOC-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu (B0C=terc.butoxykarbonyl) g surového hydrochloridu (±)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu (vyrobeného podle J.Org.Chem.1981,46,3268) se rozpustilo pod dusíkem při pokojové teplotě ve směsi 150 ml vody a 150 ml dioxanu. Roztok se upravil IN NaOH na hodnotu pH 14, pak se přidal roztok terč.butyloxykarbonylfluoridu (BOC-F, 20 % přebytek) v diethyletheru a při teplotě místnosti ještě 3 hodiny dále míchal (BOC-F připravený podle Synthesis 1975,599). Hodnota pH se upravila koncentrovanou HC1 na 2. Po destilaci organických rozpouštědel se ke zbytku přidalo 50 ml vody a směs se 3krát extrahovala 100 ml ethylacetátu. Spojené organické fáze se úplně odpařily. Zbytek se kristalizoval ve směsi 110 ml diisopropyletheru a 80 ml n-hexanu. Získalo se 11,95 g titulní sloučeniny. Výtěžek představoval 56 %.
t.t.: 68-70 °C 1H-NMR (DMSO-dg):δ[ppm] 1,18 (m,lH);
400 MHz l,38(s,9H);
2,26(m,lH); 2,65(m,lH);
3,33(t,2H); 4,45(m,lH); 4,55(t,lH);
5,62(m,lH);
5,79(m,lH);
6,73(d,lH).
Příklad 11
Výroba (±)-N-propionyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
16,6 g (±)-2-propionyl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu
9999 • · • · · · a e • · • a • ♦ ·· • · · ♦ · ·♦· · ·· «
• · • · t ·· se rozpustilo pod dusíkem ve vodě (140 ml) a 2-butanolu (66 ml) a ochladilo na -5°C. Po částech se po dobu 2 hodin přidávaly 3 g natriumborhydridu. Směs se ještě °C a pak se upravilo pH na kyseliny chlorovodíkové a vody (1/1). g a pH se upravilo na hodnotu 6,2 s 2N 5krát 50 ml dichlormethanu. Spojené odpařily a zbytek se překrystalizoval z toluenu (150 ml). Získalo se 11,1 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 65 %.
míchala 2,5 hodiny při teplotě
2,2 pomocí směsi
Roztok se
NaOH. Směs organické koncentrované odpařil na 40 se extrahovala fáze se úplně
t.t.:
67-68 °C 1H-NMR (DMSO-d6):S[ppm]
400 MHz
0,96(t,3H);
1,16(quint.,IH); 2,04(quad.,2H);
2,26(m,lH)
2,66(m,lH)
3,34(m,2H)
4,58(t,lH)
4,72(m,lH)
5,61(m,lH)
5,84(m,lH)
7,72(d,lH)
Příklad 12
Výroba (±)-N-isobutyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu se rozpustilo pod dusíkem ve vodě (32 ml) a ochladilo na 0 °C. Po částech
1,37 g natriumborhydridu. teplotě 20 °C, váné kyseliny
Ιο 2N NaOH.
3krát 80 ml odpařily.
« g (±)-2-isobutyryl-2-azabicyklo[2.2.1.]hept-5-en-3-onu a 2-butanolu (84 ml) se po dobu 3,5 hodiny přidávalo
Směs se dále míchala 3 hodiny při pak se upravilo pH na 2,5 pomocí směsi koncentrochlorovodíkové a vody (1/1) a pak se neutralizovaSměs se odpařila na 40 g. Zbytek se extrahoval dichlormethanu. Spojené organické fáze se úplně
Získaná pevná látka krystalizovala v 25ml toluenu.
«· ·«*· ·β ·· ·· «·* ··«· • · « · ··· · « ·· • · · · · · · ···· · • * · · · ·*· ·« «·· ·* «·« ·· «
- 32 Získalo se 6,8 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 73,6 %.
t.t.: 80-81 °C 1H-NMR (DMSO-dg):δ[ppm] 0,98(d,6H);
400 MHz l,16(quint.,1H);
2,30(m,2H); 2,68(m,lH);
3,32(t,2H); 4,58(t,lH);
4,70(m,lH);
5,61(m,lH); 5,82(m,lH); 7,68(d,lH).
Příklad 13
Výroba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu pomocí acyláz penicilinu G
Pro biotransformaci se použila acyláza EC 3.5.1.11 penicilinu G z E.coli (Boehring Mannheim) 165 U (jednotek)/g nebo acyláza EC 3.5.1.11 penicilinu G z Bacillus megaterium. K tomu se inkubovalo 50 mM pufru fosforečnanu sodného (pH 5-9;
ml) s 1 % hmotn. neracemického N-fenylacetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a 400 mg odpovídající acylázy penicilinu G při 37 °C.
Po určitých časových intervalech se odebíraly vzorky a analyzovaly pomocí tenkovrstevné chromatografie (křemičitanový gel 60, butanol:voda:ledová kys. octová=3:1:1; detekce ninhydrinem), plynové chromatografie (kapilární sloupec, HP-5,5 % fenylmethylsiloxanu) nebo pomocí HPLC. Enzym odštěpil s vysokou aktivitou fenacetylovou skupinu a uvolnil až 40 % odpovídajícího aminoalkoholu. Volný aminoalkohol se získal s ee-hodnotou 80 %.
• · ·· 9·99 ♦··· »· ·· ······· • · · · ··· · · ·· • · · · · · · ··· C · • · · · ···· ··· ··· ·« ··· ·· ··
- 33 Příklad 14
Výroba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu pomocí mikroorganismů
14.1 Kal (20 %) z čističky ARA ve Visp se inkuboval v A+N mediu (viz tabulka 1), které obsahovalo 0,5 % hmotn. N-acetyl-, N-propionyl-, N-isobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu, při 37 °C za třepání. Tvorba (1R,4S)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu se sledovala pomocí tenkovrstevné chromatografie.
% těchto obohacených vzorků se l-3x přeočkovalo a jednotlivě naneslo na pevná media (Plate Count Agar v mediu z tabulky 1; 20 g/1). Tímto způsobem se izolovaly mikroorganismy Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 1172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Gordona sp. CB 100 (DSM 10687) a Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291) .
14.2 Takto izolované mikroorganismy se pěstovaly v mediu (tabulka 1), které obsahovalo 0,5 % Ν-acetyl-, N-propionyl-,
N-isobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu. Rostly 24 až 36 hodin až k optické hustotě (OD) od 2 do 3. Takto získané buňky se sebraly v pozdně exponenciální růstové fázi a promyly v 10 mM fosfátovém pufru.
Následující biotransformace se provedla v 50 mM fosfátovém pufru (pH 4,5-9), který obsahoval 1 % hmotn. Ν-acetyl-, N-isobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu. Tenkovrstevnou chromatografii se zjistilo, že 50 % substrátu bylo hydrolyzována na (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten. HPLC analýzy udaly ee-hodnoty mezi 80 a 93 %.
Jestliže se jako substrát použil N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, byla biotransformace 0,14 (g/l/h/OD) pro kmen DSM 10686, když se pěstoválo na A+N mediu a 0,03 (g/l/h/OD), když se pěstovalo na NYB (Nutrient Yaest Broth) mediu, které obsahovalo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.
·· ···· · · ·· • · · ♦ ♦ · * ♦
• · ·
Jestliže se provedla stejná přeměna s kmenem DSM 10687 při koncentraci substrátu (N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten) 200 mM, byla biotransformace 0,161 (g/l/h/OD).
Tabulka 1 medium A + N
MgCl2
CaCl2
FeCl3
Na2SC>4 kh2po4
0,4 g/1
0,014 g/1
0,8 mg/1
0,1 g/1
Na2HPO4
NaCl roztok vitamínů i g/i
2,5 g/1 g/1 ml/1 roztok stupových prvků 1 ml/1 pH 7,5
14.3. Rhodococcus erythropolis DSM 10686 se pěstoval v 6 1 fermentoru v minimálním mediu (srovnej tabulku 2) s octanem amonným (3 g/1) jako zdroj uhlíku, popřípadě dusíku při 30 °C do buněčné hustoty OD 650>25. Během buněčného růstu se kontinuálně přidávala 50 % kyselina octová jako dodatečný zdroj uhlíku. Pro indukování enzymové aktivity se pak přidalo 60 g (+/-)-N-acetyl-lamino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a inkubovalo několik hodin. Nakonec se ještě jednou přidalo 40 g (+)-N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a pak dalších deset hodin inkubovalo. Průběh biotransformace se sledoval on-line pomocí HPLC. Při dosažení 40 % analytického výtěžku, vztaženo na vnesený racemický substrát, a ee-hodnoty 85 % se fermentace ukončila přidáním kyseliny.
- 35 Tabulka 2 složení media
Komponenty
Koncentrace extrakt kvasnic
0,5 g/1 pepton M66
0,5 g/1
KH2PO4 4,0 g/i
Na2HPO4.2H2O 0,5 g/i
k2so4 2,0 g/i
NH4~acetát 3,0 g/i
CaCl2 0,2 g/i
MgCl2.6 H2O 1,0 g/i
roztok stopových prvků (viz dole) 1,5 ml/l
PPG (polypropylenglykol)
0,1 g/1
Roztok stopových prvků
ΚΟΗ 15,1 g/1
EDTA.Na2 . 2H2O 100,0 g/1
ZnSO4 . 7H2O 9,0 g/1
MnCl2 . 4H2O 4,0 g/1
H3B°3 2,7 g/1
CoC12 . 6H2O 1,8 g/i
CUC12 . 2H2O 1,5<g/l
NÍC12 . 6H2O 0,18 g/1
Na2Mo04 . 2H2O 0,27 g/1
14.4 Podobně jako v příkladu 14.3· se pěstovaly mikroorganismy Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2 a Pseudomonas putioda K32 na octanu sodném v mediu (tabulka 1) se sloučeninami a bez sloučenin Ν-acetyl-, N-propionyl-, N-isobutyryl nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, v dalším zkráceně označené jako aminoalkoholy.
• · · · • · ·
- 36 Následující výsledky se dosáhly s exponenciálními buňkami, které se pěstovaly bez aminoalkoholů (analyzováno HPLC):
Kmen Poměr v procentech [mMol/OD.h] Hodnota ee/přeměna [%]
HSZ 5 (DSM 10328) 0,05 88,7/16
HSZ 17 (DSM 10329) 0,005 95/23
K3 2 0,05 54/1
CB101 (DSM 10686) 0,1 84/39
Kmeny K2 a K17 se pěstovaly, sebraly a podrobily se
60-hodinové biotransformaci.
Kmen Poměr v procentech [mMol/OD.h] Hodnota ee/přeměna [%]
K2 — 92/10
HSZ 30 - 93/3,5
Ze všech násad se sebraly exponenciální a stacionární buňky a použily se pro biotransformaci jako buňky v klidu. Na základě DC-analýzy se nepozoroval žádný rozdíl v počátečním poměru u buněk indukovaných nebo neidukovaných aminoalkoholem.
Příklad 15
Čištěni N-acetylaminoalkoholhydrolase z Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686)
Enzym byl čištěn jak je dále uvedeno až byl pozorován už jen jeden svazek proteinů v SDS-PAGE (Pharmacia Phast Gel, 10-15 % gradient) při molekulové hmotnosti 50 kD.
Buňky Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686) se promyly v 50 mM Tris-pufru (pH 6,2) a koncentrovaly na optickou hustotu
- 37 190 při OD650nm* Po Přidání fenylmethansulfonylfluoridu (PMSF) na konečnou koncentraci 1 mM a DNAzy se buňky podrobily
Frenchovu lisu (tlakové zařízeni), aby se získal surový extrakt.
Po odstředění se získalo 200 koncentrací proteinů 4,8 mg ml-1. 960 mg bezbuněčného extraktu chromatografický sloupec HiLoad který byl ekvilibrován 50 mM obsahoval 1 mM dithiothreitolu (D ml bezbuněčného extraktu s se naneslo na iontoměničový 26/10 Q-Sepharose (Pharmacia), Tris-pufrem (pH 8,0), který T) .
Po promytí sloupce stejným pufrem byly proteiny eluovány lineárním gradientem pufru (1500 ml; gradient: 50 mM Tris-pufr (pH 8,0), obsahující 1 mM DTT- 50mM Tris-pufr (pH 7,0), obsahující 1 mM DTT a 1 M NaCl). Enzym se eluoval ze sloupce mezi 370 a 430 mM NaCl a při pH 7,6. Aktivní frakce se sbíraly a zahustily na 9 ml. Obsah proteinů byl 41 mg.
Pro další čištění se roztok proteinů nanesl na gelověfiltrační chromatografický sloupec HiLoad 26/60 Superdex 75 (Pharmacia), který byl ekvilibrován 50 mM Tris-pufrem, který obsahoval 50 mM NaCl a 1 mM DTT. Aktivní frakce se spojily a měly společný obsah proteinů 10,9 mg.
Tento proteinový roztok se nanesl na sloupec Mono Q HR5/5 (Pharmacia), který byl ekvilibrován 50 mM Tris-pufrem (pH 8,5) obsahujícím 1 mM DDT. Proteiny byly eluovány lineárním gradientem (40 ml) 50 mM Tris-pufr (pH 8,5), obsahující 1 mM DTT - 50 mM Tris-pufr (pH 8,5), obsahující 1 mM DTT a 1 M NaCl.
Enzym se eluoval mezi 390 mM NaCl a 440 mM NaCl. Aktivní frakce obsahovaly 1,4 mg proteinu.
V posledním čistícím kroku se použil stejný sloupec ekvilibrovaný stejným pufrem. Jako eluční gradient sloužil stejný pufr s 0-500 mM NaCl a pH 7,0-8,5. Tímto způsobem se dalo izolovat 430 μg čistého enzymu.
N-koncová sekvence enzymu se určila přímo z Protein-Blot. Získala se sekvence 20 následujících aminokyseli:Thr-Glu-GlnAsn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-SerAsn.
Tato sekvence není homologní ke známým proteinům.
• » 999999·· • · 99 9999999 : 9 9 9 9 9 99 9 • 99 99999 • 9 99 9999 • 99 ··· 99 99999 99
Příklad 16
Charakterizace enzymu
Charakterizace enzymu se prováděla jak s čištěným enzymem, tak také s bezbuněčným extraktem, který byl odsolen pomocí sloupce Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia).
Koncentrace proteinů v bezbuněčném extraktu byla 7,3 mg ml-1 a koncentrace proteinů v čištěném enzymu byla 135 μg ml-1. PMSF se k bezbuněčnému extraktu nepřidával.
16.1 Určení Km
Určení Km se provedlo v bezbuněčném extraktu. Hodnota Km reakce byla při pH 7,0 a při teplotě 30 °C 22,5 mM pro substrát N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.
16.2 pH optimum pH optimum pro hydrolýzu N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2cyklopentenu (25 mM) se určovalo s čištěným enzymem a v bezbuněčném extraktu v rozsahu pil od 6,2 - 9,0 v následujících roztocích pufru.
Tris-pufr 100 mM pH 9,0;8,5;8,0;7,5;7,0 citrát-fosfátový pufr 100 mM pH 7,0;6,55;6,2
Aktivita se měřila 24 hodin.
pH optimum reakce bylo mezi pH 7,0 a 7,5 pro produkci 1R,4S a 1S,4R enantiomerů.
U bezbuněčného extraktu bylo pH optimum aktivity při pH 7,0. Selektivita byla však lepší mezi pH 6,0 a pH 7,0
Obr. 1 znázorňuje aktivitu A-acetylaminoalkoholhydrolázy (bezbuněčný extrakt) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) v závislosti na hodnotě pH.
16.3 Teplotní optimum pro reakci uvedenou v přikladu 16.2 leželo mezi 25 a 30 °C.
• «
A · · · · · A A · · • · · A A A
A ·A· A AAA
A AA ··· · A • A A A * • A AAA A A A A
- 39 Obr. 2 znázorňuje aktivitu A-acetylaminoalkoholhydrolázy (bezbuněčný extrakt) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) v závislosti na teplotě.
16.4 Molekulová hmotnost byla určena podle SDS-PAGE na 50 kD.
16.5 Jako substráty byly hydrolyzovány: N-acetyl-l-amino-4hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-propionyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2cyklopenten, N-isobutyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-isobutyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.
Příklad 17
Výroba hydrochloridu (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
374,1 g roztoku (IR,4S)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu (obdobná výroba jako v příkladu 14) se odpařilo na 123,7 g. Roztok obsahoval 60,2 mMol hořejší sloučeniny (HPLC) a pH se upravilo 30 %ním NaOH z hodnoty 2 na 11,7, pak se extrahoval 3x 70 ml isobutanolu. Spojené isobutanolové extrakty se plynným HC1 upravily na pH 1, zahustily na 65 g a filtrovaly (odstranění pevných nečistot). K filtrátu se při 20 °C a při dobrém mícháni přikapalo 60 ml acetonu. Kalná směs se naočkovala krystaly titulní sloučeniny a míchala 1 hod. při 5 °C. Po filtraci a sušení se získalo 5,2 g produktu. Výtěžek byl 58 %.
t.t.: 125-127 °C.
ee-hodnota 98 % (cejchovaný chirální HPLC-sloupec) 1H-NMR (DMSO-dg):δ[ppm] l,44(m,lH);
400 MHz 2,35(m,lH);
2,83(m,lH);
3,42(m,2H);
4,10(s,lH);
• ·
- 40 4,80(s,lH); 5,80(d,lH); 6,06(d,lH); 8,13(s,3H).
Příklad 18
Výroba (IR,4S)-N-BOC-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu pH 75 g roztoku (IR,4S)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu (obdobná výroba jako v příkladu 14; 44,6 mMol sloučenin) se upravilo 30 %ním NaOH na hodnotu 8 a k roztoku se přidalo 6 g NaHCO3. Směs se zahřála na 52 °C. Za dobrého míchání se k tomu přidalo 60 ml diisopropyletheru a pak během 2 hod. přidával roztok 11,12 g BOC-anhydridu v 18,2 ml diisopropyletheru. Směs se filtrovala přes Celíte a fáze se oddělily. Vodná fáze se extrahovala 65 ml diisopropyletheru. Spojené organické fáze se promyly 45 ml vody, pak se odpařily na 37,5 g a zahřály na 50 °C. K rozotku se přikapalo 31 ml n-hexanu. Po pomalém ochlazení na 0 °C (2 hod.) se titulní sloučenina filtrovala,promyla 12 ml n-hexan/diisopropylether 1/1 a sušila. Získalo se 6,75 g produktu. Výtěžek byl 71 %.
t.t.: 70-71 °C ee-hodnota 98 % (cejchovaný chirální HPLC-sloupec) 1H-NMR (DMSO-d6):δ[ppm]
400 MHz l,18(m,lH);
l,27(s,9H);
2,28(m,lH);
2,63(m,lH);
3,33(q,2H); 4,43(m,IH);
4,56(t,lH);
5,62(m,lH);
5,78(m,lH);
6,72(d,lH).
• · · · • · · · · * ♦ · · ·· · · * · · · · · · ·· «· • * · · · · · ···· · • · · · »··· ··· »·· *· ··· »> φφ
- 41 Příklad 19
Výroba hydrochloridu (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
87,8 g (IR,4S)-N-BOC-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu se rozpustilo ve 270 ml 2N HC1 a 1340 ml methanolu. Směs se při zpětném toku vařila 4,5 hodiny. Po destilaci methanolu se zbytek rozpustil v 800 ml vody. Vodný roztok se 2x extrahovala 340 ml ethylacetátu. Vodná fáze se úplně odpařila (50 °C/6 kPa). Pevná látka se sušila ve vakuu při 50 °C, suspendovala 150 ml diethyletheru, filtrovala a 2x promyla 50 ml diethyletheru. Po sušení se získala titulní sloučenina s 95 % výtěžkem (58,4 g).
Fyzikální a spektroskopická data produktu byla stejná jako v příkladu 17.
Příklad 20
Výroba (IR,4S)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu g hydrochloridu (IR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2cyklopentenu se rozpustilo v 182 ml anhydridu kyseliny octové a při 0 °C se přidal roztok 18,25 g triethylaminu v 60 ml anhydridu kyseliny octové. Směs se míchala 3 hodiny při 80 °C, pak se ochladila na teplotu místnosti, Triethylaminhydrochlorid se odfiltroval a promyl 120 ml n-hexanu. Filtrát se odpařil. Ke zbytku se přidalo 300 ml toluenu a při teplotě místnosti v přítomnosti 5,2 g aktivního uhlí a 13 g Celitu se 20 minut míchalo. Po filtarci a promytí filtračního koláče (3x 40 ml toluenu) se rozpouštědlo úplně zahustilo. Ke zbytku se přidalo 180 ml methanolu a 15,5 g K2CO3 a míchalo se 10 hodin při pokojové teplotě. Suspenze se filtrovala a filtrát se odpařil. Zbytek se suspendoval v 750 ml isopropylacetátu a vařilo se 1,5 hodiny při zpětném toku v přítomnosti 0,5 g aktivního uhlí. Po filtrování aktivního uhlí (70-80 °C) se filtrát přes noc chladil na 0 °C. Titulní sloučenina se filtrovala, promyla 80 ml studeného isopropylacetátu a sušila za vakua. Získalo se 17,2 g «· ···· a· φφ • · · φφφφ φ φ φ Φ φφφ φφφφ • · ·· φ · · φφφφ φ * φ φφ φ φφφ «·φ ··· φ· φφφ φφ ··
- 42 produktu. Výtěžek byl 66 %.
t.t.: 77-80 °C ee-hodnota 98 % (cejchovaný chirální HPLC-sloupec) 1H-NMR (DMSO-άθ):δ[ppm] l,15(m,lH);
400 MHz l,78(s,3H);
2,25(m,IH); 2,66(m,lH);
3,35(m,2H);
4,58(t,lH); 4,70(m,lH); 5,62(m,lH);
5,85(m,IH);
7,80(d,lH).
Příklad 21
Výroba (1S,4R)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
Z 25 g výchozího hydrochloridu (1S,4R)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu se způsobem podle příkladu 18 vyrobil titulní enantiomer (výtěžek 68 %). Fyzikální a spektroskopická data produktu byla stejné jako v příkladu 20.
Příklad 22
Výroba (IR,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
34,7 g hydrochloridu (IR,4S)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a 2 g 4-N,N-dimethylaminopyridinu se rozpustilo v 600 ml methylenchloridu. Roztok se ochladil na O °C. Pak se přikapalo 52 g triethylaminu (5 min.). Směs se ještě 30 min. dále míchala. Ke směsi se při 0 °C 1 hodinu přidával roztok 35,2 g butyrylchloridu v 60 ml methylenchloridu. Směs se ještě dále míchala 1,5 hodiny mezi 0 až 20 °C, pak se přidalo 600 ml vody. Po rozděleni fází se vodná fáze extrahovala 600 ml methylenchloridu. Spojené organické fáze se 3x promyly pokaždé 500 ml 10 % NaOH, pak úplně odpařily.
• · ·
- 43 rozpustila ve 120 ml při teplotě místnosti soli se odfiltrovaly se neutralizoval 2N methanolu. K roztoku se dále míchalo a promyly 20 Suspenze ml methanolu. krystalizoval
HC1.
ml se
Suchá pevná látka se se přidalo 5 g K2 CO3 hodiny. Anorganické methanolu. Filtrát odfiltrovala a filtrační koláč se promyl Filtrát se úplně odpařil. Pevný zbytek se sušil a ve 150 ml toluenu. Získalo se 28,5 g titulní sloučeniny. Výtěžek
t.t.: 71-72 °C ee-hodnota 98 % (cejchovaný chirální HPLC-sloupec) 1H-NMR (DMSO-dg):δ[ppm]
400 MHz
Příklad 23
Výroba (1S,4R)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
Z 34,7 g hydrochloridu (1S,4R)-l-amino-4-hydroxymethyl-2cyklopentenu jako výchozí sloučeniny se způsobem podle příkladu 20 mohl vyrobit titulní enantiomer (výtěžek 63 %). Fyzikální a spektroskopická data produktu byla stejná jako v přikladu 22.
• · · ·
• · · · · · · «V» «*· ·» ··* ·♦ - 44 -
Příklad 24
Výroba (IR,4S)-1-[(2-amino-6-chlor-5-formamidopyrimidin-4-yl)amino]-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
2,07 g N-(2-amino-4,6-dichlorpyrimidin-5-yl)formamidu se zahřálo na 80 °C ve 40 ml isobutanolu (bílá suspenze). Ke směsi se přidal roztok 1,97 g hydrochloridu (IR,4S)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu, 3,8 g triethylaminu a 15 ml isobutanolu. Směs se 13 hodin při 80 °C dále míchala. K čirému roztoku se při 20 °C přidalo 10 ml IN NaOH a odpařilo se až do sucha. Zbytek se se podrobil flash-chromatografii (sloupec křemičitanového gelu 60, délka 8 cm, průměr 6,5 cm, eluční činidlo ethylacetát/methanol 95/5). Po odpaření elučního činidla a sušení zbytku se získalo 2,1 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 74 %.
t.t.: 174-176 °C ee-hodnota 98 % (cejchovaný chirální HPLC-sloupec) 1H-NMR (DMSO-d6):S[ppm] l,37(m,lH);
400 MHz 2,35(m,lH); 2,73(m,lH); 3,38(t,2H); 4,68(m,lH)i 5,08(m,lH); 5,70(d,lH); 5,85(d,lH); 6,40;6,55; a 6,65(s,d, a d,spolu 3H); 7,78 a 8,10(d a s,spolu IH); 8,55 a 8,95(d a s,spolu IH).
- 45 Přiklad 25
Výroba (lR,4S)-l-[(2-amino-6-chlor-5-formamidopyrimidin-4-yl)amino]-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
145,2 ml roztoku (IR,4S)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu (obdobná výroba jako v příkladu 14) se zahustilo na 25,5 ml a zfiltrovalo přes Celit. Filtrační koláč se promyl 7,5 ml vody. Filtrát obsahoval 17,7 mMol hořejší sloučeniny (HPLC) a koncentrovanou HC1 se upravilo pH z 6,6 na 1, pak se 3x extrahoval 20 ml isobutanolu. Organická fáze se odstranila. pH vodné fáze se upravilo 30 % NaOH na hodnotu 12 a vodná fáze se 3x extrahovala 10 ml isobutanolu. Spojené organické fáze se zahustily na 15 ml a přidaly se 2,53 g triethylaminu. Ke směsi se přidal, jako v příkladě 24 roztok 2,07 g N-(2-amino-4,6-dichlorpyrimidin-5-yl)formamidu ve 40 ml ethanolu. Směs se míchala 16 hodin při 80 °C. Po zpracováni jako v příkladě 22 se získalo 2,4 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 85 %.
Fyzikální a spektroskopická data produktu byla stejná jako v příkladu 24.
Příklad 26
Výroba (±)-N-BOC-l-amino-2-cyklopenten-4-karboxylové kyseliny
16,4 g surového hydrochloridu (±)-l-amino-2-cyklopenten-4-karboxylové kyseliny (vyrobeného podle J.Org.Chem.1981,46,3268) se rozpustilo pod dusíkem při teplotě místnosti ve směsi 80 ml vody a 80 ml dioxanu. Směs se pak upravila IN NaOH na hodnotu pH 14 a pak se přidal roztok terč.butyloxykarbonylfluoridu (BOC-F, 20 % přebytek) v diethyletheru (BOC-F připravený podle Synthesis 1975,599). Směs se při teplotě místnosti ještě 5 hodin dále míchala. Hodnota pH se upravila koncentrovanou HC1 na 2. Po destilaci organických rozpouštědel se ke zbytku přidalo 50 ml vody a směs se 3krát extrahovala 100 ml ethylacetátu. Organická fáze se odpařila na objem 50 ml a zředila 25 ml toluenu. Po ochlazení • * ·· *·φ· ·· φφ *» ·· * · ♦ · ' ·» • * 9 ♦ * · · 99 99 * * * * · 9 9 99 9 9· ♦ · · · * · φ· ··*··· 99 φφφ φφ φφ
- 46 (0-10 °C) se titulní sloučenina filtrovala a sušila. Získalo se 14,3 g produktu. Výtěžek představoval 63 %.
t.t.: 126-127 °C 1H-NMR (DMSO-dg):S[ppm] l,14(s,9H);
400 MHz l,70(m,lH);
2,40(m,lH);
3,40(m,lH); 4,47(m,IH); 5,70(t,lH);
4,87(t,lH);
6,88(d,lH); 12,30(d,lH).
Přiklad 27
Výroba (±)-N-B0C-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu z (±)-N-BOC-l-amino-2-cyklopenten-4-karboxylové kyseliny
Do 500 ml míchacího zařízení se dalo 250 ml tetrahydrofuranu a 10,02 g (0,164 mol) LiAlH4 a během 1 hodiny se přidával roztok 30,0 g (0,132 mol) (±)-N-BOC-l-amino-2-cyklopenten-4-karboxylové kyseliny v 75 ml tetrahydrofuranu při -10 °C. Pak se přidalo 10 g vody, 10 g 15 % roztoku NaOH a 20 g vody a filtrovalo. Zbytek se ještě 2x promyl pokaždé se 100 ml terč, butylmethyletheru a spojené organické fáze se odpařily do sucha. Po přidání 80 ml hexanu a naočkování sloučeniny podle příkladu 10 se titulní sloučenina vydělila jako krystalická pevná látka. Výtěžek 15,84 g (56 %). Fyzikální a spektroskopická data byla stejná jako v příkladu 10.
♦
- 47 Příklad 28
Výroba (lR,4S)-N-BOC-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu z (IR,4S)-N-BOC-l-amino-2-cyklopenten-4-karboxylové kyseliny
Do 500 ml míchacího zařízení se dalo 80 ml tetrahydrofuranu a 11,38 g (50,07 mmol) (IR,4S)-N-B0C-l-amino-2-cyklopenten-4-karboxylové kyseliny (vyrobené podle Tetrahedron: Assymetry 1993,4,1117) a během 1 hodiny při -15 °C se přidávalo 5 ml boran-dimethylsulfidového komplexu a pak se ještě při této teplotě 3 hodiny dále míchalo. Přidal se roztok 4 g NaOH v 60 ml vody a zahřálo se na teplotu místnosti. Extarkce s toluenem, filtrace přes křemičitanový gel a následující krystalizace v ethylacetátu/n-hexanu 1:1 poskytly 5,4 g titulní sloučeniny, což odpovídá výtěžku 57 %, jako bílá krystalická pevná látka.
Fyzikální a spektroskopická data byla stejná jako v příkladu 10. ee-hodnota byla 99 % (stejný chirální HPLC-sloupec).

Claims (18)

1. Způsob výroby (1S,4R)- nebo (IR,4S)-4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-l-methanolu nebo jeho soli vzorců I,
II vyznačující se tím, že se v prvním stupni acyluje (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on vzorce III na derivát (±)-2-azabicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-onu obecného vzorce IV
IV kde R1 znamená C1_4-alkyl, C1_4-alkoxy, aryl nebo aryloxy, ten se ve druhém stupni redukuje na derivát cyklopentenu obecného vzorce V
- 49 - • ♦ • · · · • · 4 « 9 · ··♦ ·«· • · ···· < · ··· • ♦ · ♦ • 4 « < · · « · • 4 • 1 • < ♦ «41 1 • 4 110^ OV V 0 kde R1 má uvedený význam, ten se ve třetím stupni přemění bud'
pomocí mikroorganismu, který je schopen zužitkovat derivát cyklopentenu obecného vzorce V jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku, nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku, pomocí enzymu s N-acetylaminoalkoholhydrolasovou aktivitou nebo pomocí acylasy penicilinu G na (1R,4S)~ nebo (lS,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten vzorců VI, VII ten se ve čtvrtém stupni převede pomocí N-(2-amino-4,6-dichlorpyrimidin)-5-yl)formamidu vzorce VIII
NIICHO
Cl
VIII na (1S,4R)- nebo (IR,4S)-4-[(2-amino-6-chlor-5-formamido-4-pyrimidinyl)-amino]-2-cyklopenten-l-methanol vzorců IX, X
N
- 50 ···« *· ♦· • · · · · * * « · ··· ·· ·· ♦ ♦ * · 4 ····· « · · · · « «* ·· · 9 9· 9 a posledně jmenovaná sloučenina se v pátém stupni cyklizuje známým způsobem na konečný produkt vzorce I nebo II.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se acylace v prvním stupni provádí s halogenidem karboxylové kyseliny obecného vzorce XI
O
II
R1- C - X XI kde R1 má uvedený význam a X znamená atom halogenu, nebo s anhydridem karboxylvé kyseliny obecného vzorce XII
O O II II C C
Rlx '0' r1
XII.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se acylace v prvním stupni provádí v aprotickém rozpouštědle.
4. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 3, vyzna- čující se vádí bor^hydridem aluminiumhydridem tím, že se redukce ve druhém stupni proalkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy, alkalického kovu nebo kovu alkalické zeminy nebo vitridem.
5. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se redukce ve druhém stupni provádí v protickém rozpouštědle.
··♦·
6. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se přeměna ve třetím stupni provádí pomocí mikroorganismů rodu Rhodococcus, Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Alcaligenes/Bordetella.
7. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se přeměna ve třetím stupni provádí pomocí acylasy penicilinu G z mikroorganismu druhu Bacillus megaterium nebo Escherichia coli.
8. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se biotransformace ve třetím stupni provádí při teplotě od 20 do 40 °C a při hodnotě pH od 5 do 9.
9. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se přeměna ve čtvrtém stupni provádí v přítomnosti báze.
10. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se přeměna ve čtvrtém stupni provádí v protickém rozpouštědle.
11. Způsob výroby enantiomeru derivátu (1R,4S)- nebo (1S,4R)-1amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu obecných vzorců XVI, XVII kde R1 má uvedený význam, vyznačující se tím, že se v prvním stupni přeměňuje derivát cyklopentenu obecného vzorce V
• * · · *·· · ·· ·· t· ·· ♦ • • • · • • • • • • • ·· • · ·· • • • · • • • ♦·· • * • * • • • • • • · « ♦ · · • · ·♦· ·· • ·
Ί kde R má uvedený význam, pomocí mikroorganismu, který je schopný zužitkovat derivát cyklopentenu obecného vzorce V jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku, nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku, pomocí enzymu s N-acetylaminoalkoholhydrolasovou aktivitou nebo pomocí acylasy penicilinu G na (1R,4S)nebo (1S,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten vzorců VI, VII VI nebo a ten se ve druhém stupni acyluje na sloučeninu vzorce XVI nebo
XVII.
12. Enantiomer (IR,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu vzorce XVIII s více než 0 % enantiomerním přebytkem, který se získá způsobem podle nároku 11.
13. Enantiomer podle nároku 12, v nejméně 80 % enantiomerním přebytku, který se získá způsobem podle nároku 11.
• • • · 9··» ·· • · • 9 • · • · 9 • 9 • · • • ♦ 9 ··· • 9 • · • • • · t • · ··· • · • 9 • • 9 9 • · · ♦ · · • · ·♦· ·· • ·
14. Enantiomer podle nároku 12, přebytku, který se získá způsobem
15. Enantiomer podle nároku 12, přebytku, který se získá způsobem
16. Enantiomer podle nároku 12, přebytku, který se získá způsobem v nejméně 90 % enantiomerním podle nároku 11.
v nejméně 95 % enantiomerním podle nároku 11.
v nejméně 98 % enantiomerním podle nároku 11.
17. Racemický N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten.
18. Způsob výroby racemického nebo opticky aktivního derivátu
4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu obecného vzorce XIII
HO i
XIII kde R1 má uvedený význam, v že se v prvním stupni acyluje vzorce XIV jící se y z n a č u cyklopenten-4-karboxylová tím, kyselina
XIV ve formě racemátu nebo jednoho z jejich opticky aktivních isomerů s halogenidem karboxylové kyseliny obecného vzorce XI
II
R1- C - X
XI kde R1 a X mají uvedený význam, na racemický nebo opticky
- 54 aktivní derivát cyklopenten-4-karboxylové kyseliny obecného vzorce XV ···· a ten se ve druhém stupni redukuje na požadovaný produkt vzorce XIII.
CZ0145898A 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby (1S,4R)- nebo (1R,4S)-4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-1-methanolu CZ297894B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH111697 1997-05-13
CH274097 1997-11-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ145898A3 true CZ145898A3 (cs) 1998-12-16
CZ297894B6 CZ297894B6 (cs) 2007-04-25

Family

ID=25686703

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20060694A CZ297887B6 (cs) 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby enantiomeru derivátu (1R, 4S)- nebo(1S, 4R)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenua enantiomer (1R, 4S)-N-butyryl-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten
CZ20060695A CZ297888B6 (cs) 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby racemického nebo opticky aktivního derivátu 4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
CZ0145898A CZ297894B6 (cs) 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby (1S,4R)- nebo (1R,4S)-4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-1-methanolu

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20060694A CZ297887B6 (cs) 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby enantiomeru derivátu (1R, 4S)- nebo(1S, 4R)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenua enantiomer (1R, 4S)-N-butyryl-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten
CZ20060695A CZ297888B6 (cs) 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby racemického nebo opticky aktivního derivátu 4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu

Country Status (17)

Country Link
US (4) US6156893A (cs)
EP (2) EP0878548B1 (cs)
JP (3) JP4540136B2 (cs)
KR (2) KR100577886B1 (cs)
CN (2) CN1302116C (cs)
AT (1) ATE275206T1 (cs)
CA (1) CA2237297C (cs)
CZ (3) CZ297887B6 (cs)
DE (1) DE59811884D1 (cs)
DK (1) DK0878548T3 (cs)
ES (1) ES2223095T3 (cs)
HK (1) HK1092782A1 (cs)
HU (1) HU226327B1 (cs)
NO (1) NO324679B1 (cs)
PL (1) PL197848B1 (cs)
PT (1) PT878548E (cs)
SK (3) SK285229B6 (cs)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100337720B1 (ko) * 1993-06-21 2002-11-02 메렐 파마슈티칼스 인크. 신규카보사이클릭뉴클레오사이드화합물
GB9717928D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Glaxo Group Ltd Process for the enatioselective hydrolysis of n-derivatised lactams
GB9721780D0 (en) * 1997-10-14 1997-12-10 Glaxo Group Ltd Process for the synthesis of chloropurine intermediates
SK284595B6 (sk) * 1997-11-27 2005-07-01 Lonza Ag Spôsob výroby (1S,4R)-4-(2-amino-6-chlór-9H-purín-9-yl)-2- cyklopentén-1-metanolu alebo jeho solí
CZ301107B6 (cs) * 1998-12-23 2009-11-11 Lonza Ag Zpusob výroby enantiomerne obohacených derivátu 1-amino-4-(hydroxymethyl)-cyklopent-2-enu
US7705169B2 (en) * 2003-07-25 2010-04-27 Prometic Biosciences Inc. Preparation of metal salts of medium-chain fatty acids
DE102005061756B4 (de) * 2005-12-21 2008-01-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Ramipril
US8236853B1 (en) 2007-12-03 2012-08-07 University Of South Florida Formation of cyclopentene nitro-ester and derivatives
WO2012099904A1 (en) 2011-01-18 2012-07-26 General Atomics Hydrolase enzyme substrates and uses thereof
CN102557990B (zh) * 2011-04-25 2014-06-25 开原亨泰制药股份有限公司 (1s，4r)n-叔丁氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯的制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4950758A (en) * 1988-01-20 1990-08-21 Regents Of The University Of Minnesota Optically-active isomers of dideoxycarbocyclic nucleosides
US4931559A (en) * 1988-01-20 1990-06-05 Regents Of The University Of Minnesota Optically-active isomers of dideoxycarbocyclic nucleosides
MY104575A (en) * 1989-12-22 1994-04-30 The Wellcome Foundation Ltd Therapeutic nucleosides.
CA2055086A1 (en) * 1991-02-12 1992-08-13 Chikara Kaneko Cyclopentene derivatives and their use
US5200527A (en) * 1991-04-08 1993-04-06 Lonza Ltd. Process for the production of 2-azabicyclo [2.2.1] hept-5-en-3-one
GB9204015D0 (en) * 1992-02-25 1992-04-08 Wellcome Found Therapeutic nucleosides
GB9205071D0 (en) * 1992-03-09 1992-04-22 Wellcome Found Therapeutic nucleosides
GB9217823D0 (en) * 1992-08-21 1992-10-07 Glaxo Group Ltd Chemical process
JPH06116217A (ja) * 1992-10-02 1994-04-26 Kuraray Co Ltd （±）−シス−４−アミノシクロペント−２−エンカルボン酸誘導体の光学分割法
GB9402161D0 (en) * 1994-02-04 1994-03-30 Wellcome Found Chloropyrimidine intermediates
JP4335314B2 (ja) * 1996-05-30 2009-09-30 ロンザ ア−ゲ− アミノアルコールおよびその誘導体の製造方法
GB9625455D0 (en) * 1996-12-07 1997-01-22 Glaxo Group Ltd Process for resolving mixtures of carbocyclic steroisomers

Also Published As

Publication number Publication date
EP0878548A2 (de) 1998-11-18
EP0878548A3 (de) 1999-10-13
PT878548E (pt) 2005-01-31
SK285228B6 (sk) 2006-09-07
SK284810B6 (sk) 2005-12-01
CN1115343C (zh) 2003-07-23
SK285229B6 (sk) 2006-09-07
JP2010116397A (ja) 2010-05-27
ES2223095T3 (es) 2005-02-16
KR100601764B1 (ko) 2006-07-19
HU9801083D0 (en) 1998-07-28
NO982149D0 (no) 1998-05-12
KR100577886B1 (ko) 2006-08-30
HK1092782A1 (en) 2007-02-16
PL197848B1 (pl) 2008-05-30
JP2010106025A (ja) 2010-05-13
HUP9801083A3 (en) 2001-09-28
EP0878548B1 (de) 2004-09-01
NO324679B1 (no) 2007-12-03
NO982149L (no) 1998-11-16
SK58998A3 (en) 1998-12-02
US6262295B1 (en) 2001-07-17
CZ297887B6 (cs) 2007-04-18
CZ297894B6 (cs) 2007-04-25
KR19980086933A (ko) 1998-12-05
US6156893A (en) 2000-12-05
JPH115793A (ja) 1999-01-12
CA2237297C (en) 2008-03-11
CZ297888B6 (cs) 2007-04-18
DE59811884D1 (de) 2004-10-07
CN1201794A (zh) 1998-12-16
CA2237297A1 (en) 1998-11-13
US6137007A (en) 2000-10-24
DK0878548T3 (da) 2004-12-06
HU226327B1 (en) 2008-08-28
HUP9801083A2 (hu) 1999-11-29
PL326267A1 (en) 1998-11-23
CN1515673A (zh) 2004-07-28
CN1302116C (zh) 2007-02-28
US6252112B1 (en) 2001-06-26
ATE275206T1 (de) 2004-09-15
JP4540136B2 (ja) 2010-09-08
EP1502914A1 (de) 2005-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100601764B1 (ko) (1ｓ,4ｒ)- 또는(1ｒ,4ｓ)-4-(2-아미노-6-클로로-9ｈ-푸린-9-일)-2-시클로펜텐-1-메탄올의 제조 방법
EP0424064B1 (en) Chiral azabicyloheptanone and a process for their preparation
KR100577891B1 (ko) Ｎ-아실아미노-알코올 히드롤라제 활성을 갖는 효소
US6136591A (en) Bioresolution of N-acylazetidine-2-carboxylic acids
JP2000506728A (ja) Ｎ―保護されたｄ―プロリン誘導体の製造方法
KR100562734B1 (ko) 아미노 알코올 및 그의 유도체의 제조방법
JP4652577B2 (ja) 光学活性な３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオン酸誘導体の製造方法
JP2001506500A (ja) Ｄ−プロリン誘導体を調製する方法

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20120511