ES2223095T3 - Procedimiento multietapa para la preparacion del (1s,4r)- y/o del (1r,4s)-4-(2-amino-6-cloro-9-h-purin-9-il)-2-ciclopenten-1-metanol. - Google Patents

Procedimiento multietapa para la preparacion del (1s,4r)- y/o del (1r,4s)-4-(2-amino-6-cloro-9-h-purin-9-il)-2-ciclopenten-1-metanol.

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Abstract

SE DESCRIBE UN NUEVO PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE (1S,4R) O (1R,4S) 4 (2 AMINO 6 CLOR 9 H PURIN 9 IL) 2 CICLOPENTEN 1 METANOL DE FORMULAS. EN EL PRIMER PASO, SE ACILA ( (MAS MENOS) ) 2 AZABICICLO[2.2.1]HEPT 5 EN 3 ON DE FORMULA, HASTA OBTENER UN DERIVADO DE ( (MAS MENOS) ) 2 AZABICICLO[2.2.1]HEPT 5 EN 3 ON DE FORMULA GENERAL, EN LA CUAL R 1 SIGNIFICA ALQUILO C 1-4 , ALCOXI C 1-4 , ARILO O ARILOXI, ESTE SE REDUCE EN UN SEGUNDO PASO HASTA OBTENER UN DERIVADO DE CICLOPENTENO DE FORMULA GENERAL, EN LA CUAL R 1 POSEE LA SIGNIFI CACION DADA, ESTE SE HACE REACCIONAR ENTONCES EN EL TERCER PASO, DE FORMA BIOTECNOLOGICA, HASTA OBTENER (1S,4R) O (1R,4S) 1 AMINO 4 (HIDROXIMETIL) 2 CICLOPENTENO DE FORMULA, Y ESTE EN EL CUARTO PASO CON N (2 AMINO 4,6 DICLORPIRIMIDINA) 5 IL)FORMAMIDA DE FORMULA.

Description

Procedimiento multietapa para la preparación del (1S, 4R)- y/o del (1R, 4S)- 4-(2-amino-6-cloro-9-H-purin-9-il)-2-ciclopenten-1-metanol.
El invento se refiere a un nuevo procedimiento para la preparación del (1S,4R)- y/o del (1R,4S)-4-(2-amino-6-cloro-9-H-purin-9-il)-2-ciclopenteno-1-metanol de las fórmulas
1
así como a un nuevo procedimiento para la preparación de compuestos ópticamente activos de las fórmulas generales XVI y XVII
2
El (1S,4R)-4-(2-amino-6-cloro-9-H-purin-9-il)-2-ciclopenteno-1-metanol es un importante producto intermedio para la preparación de nucleósidos de 2-amino-purina, tal como p.ej. para la preparación del (1S,4R)-4-[2-amino-6-(ciclopropilamino)-9-H-purin-9-il]-2-ciclopenteno-1-metanol (documento de solicitud de patente internacional WO-A-95/21161) o para la preparación de 1592U89 (J. Org. Chem., 1996, 61, 4102-4193; J. Org. Chem., 1996, 61, 7963-7966).
El documento WO-A-97/45529, más antiguo, describe un procedimiento realizado en una sola etapa, en el que a partir de derivados racémicos de 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno sustituidos en N se obtienen, mediante un desdoblamiento del racemato, por reacción con microorganismos o enzimas de tipo específico, el (1S,4R)- o el (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno. En el caso de esta reacción resultan también derivados de (1R,4S)- o (1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno sustituidos en N.
R. Vince y M. Hua (J. Med. Chem., 33, 17-21, 1990; documento de patente de los EE.UU. US-A-4.950.758) describen la síntesis del 4-(2-amino-6-cloro-9-H-purin-9-il)-2-ciclopenteno-1-metanol racémico partiendo de un 1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopenteno diacetilado. Este compuesto se hidroliza en presencia de hidróxido de bario para formar el 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno, que reacciona con la 2-amino-4,6-dicloro-pirimidina para formar el cis-[4-[(2-amino-6-cloro-4-pirimidinil)amino]-2-ciclopentenil]-carbinol racémico. Este último se somete a aminación en posición 5 por acoplamiento con la sal de diazonio obtenida a partir de p-cloro-anilina y nitrito de sodio, seguido por una reducción del grupo azo en presencia de zinc en el seno de ácido acético, mediando formación de cis-[4-[(2,5-diamino-6-cloro-4-pirimidinil)amino]-2-ciclopentenil]carbinol. La formilación del grupo amino en posición 5 mediante ortoformiato de trietilo y la subsiguiente ciclización para formar el anillo de purina, proporcionan el producto final.
S.J.C. Taylor y colaboradores (Tetrahedron. Asymmetry 4, 1117-1128, 1993) describen la síntesis de (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno ópticamente activo partiendo de (1R,4S)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona. En el caso de esta síntesis, se activa en primer lugar el nitrógeno de la (1R,4S)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona con un grupo terc.-butoxicarbonilo, a continuación se efectúa la apertura del anillo de lactama en condiciones reductoras mediante carbonato de sodio, y finalmente la separación del grupo terc.-butoxicarbonilo. La (1R,4S)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona se obtiene mediante desdoblamiento enzimático del racemato a partir de la 2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona racémica.
Un procedimiento para la preparación de (1S,4R)-4-(2-amino-6-cloro-9-H-purin-9-il)-2-ciclopenteno-1-metanol partiendo de (1S,4R)-4-amino-2-ciclopenteno-1-metanol se describe en el documento WO-A-95/21161. Resulta desventajoso en el caso de este procedimiento el hecho de que el educto (producto de partida), es decir el (1S,4R)-4-amino-2-ciclopenteno-1-metanol, se puede obtener exclusivamente pasando por la (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona sustituida con el costoso grupo protector BOC (grupo protector terc.-butiloxicarbonilo) (J. Org. Chem., 1995, 60, 4602-4616).
Fue misión del invento poner a disposición un procedimiento sencillo, favorable y más rentable para la preparación del (1S,4R)- y/o del (1R,4S)-4-(2-amino-6-cloro-9-H-purin-9-il)-2-ciclopenteno-1-metanol.
El problema planteado por esta misión se resolvió con el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1.
La primera etapa del procedimiento conforme al invento se lleva a cabo acilando la (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona de la fórmula
3
para formar un derivado de (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona de la fórmula general
4
en la que R^{1} significa alquilo C_{1-4}, alcoxi C_{1-4}, arilo o ariloxi.
Por "alquilo C_{1-4}" se entiende un alquilo C_{1-4} tanto sustituido con halógeno como también sin sustituir. Como átomo de halógeno se puede utilizar el de F, Cl, Br ó I. Ejemplos de alquilo C_{1-4} son metilo, etilo, propilo, butilo, isobutilo, terc.-butilo, isopropilo, clorometilo, bromometilo, diclorometilo y dibromometilo. De modo preferido, como alquilo C_{1-4} se utiliza metilo, etilo, propilo, butilo, isobutilo o clorometilo.
Como alcoxi C_{1-4} se puede utilizar por ejemplo metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, terc.-butoxi o isobutoxi. De modo preferido, como alcoxi C_{1-4} se utiliza terc.-butoxi.
Como arilo se puede utilizar por ejemplo fenilo o bencilo, de modo preferido fenilo. Como ariloxi se puede utilizar por ejemplo benciloxi o fenoxi.
El educto, (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona, se puede preparar de acuerdo con el documento de solicitud de patente europea EP-A-0.508.352.
La acilación se puede llevar a cabo con un halogenuro de ácido carboxílico de la fórmula general
XIR^{1} --- 
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
--- X
o con un anhídrido de ácido carboxílico de la fórmula general
5
en las que R^{1} tiene el significado mencionado y X significa un átomo de halógeno. Como átomo de halógeno X se pueden utilizar los de F, Cl, Br ó I. De modo preferido se utiliza Cl ó F.
Ejemplos de halogenuros de ácidos carboxílicos son: cloruro de acetilo, cloruro de cloroacetilo, cloruro de ácido butírico, cloruro de ácido isobutírico, cloruro de ácido fenil-acético, éster bencílico de ácido clorofórmico (Cbz-Cl), cloruro de ácido propiónico, cloruro de benzoílo, éster alílico de ácido clorofórmico o fluoruro de terc.-butiloxicarboni-
lo. Ejemplos de anhídridos de ácidos carboxílicos son: anhídrido de terc.-butoxicarbonilo, anhídrido de ácido butírico, anhídrido de ácido acético o anhídrido de ácido propiónico.
La acilación se puede llevar a cabo sin ningún disolvente o con un disolvente aprótico.
De manera conveniente, la acilación se lleva a cabo en el seno de un disolvente aprótico. Como disolvente aprótico se adecuan por ejemplo diisopropil-éter, piridina, acetonitrilo, dimetil-formamida, trietil-amina, tetrahidrofurano, tolueno, cloruro de metileno, N-metil-pirrolidona o mezclas de estos compuestos.
De manera conveniente, la acilación se lleva a cabo a una temperatura de -80 a 50ºC, de modo preferido de 0 a 25ºC.
En la segunda etapa del procedimiento conforme al invento, el derivado de (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona de la fórmula IV se reduce para formar un derivado de ciclopenteno de la fórmula general
6
en la que R^{1} tiene el significado mencionado.
La reducción se lleva a cabo de manera conveniente con un hidruro de boro y un metal alcalino o metal alcalino-térreo, con un hidruro de aluminio y un metal alcalino o metal alcalino-térreo, o con un vitruro (bis-(2-metoxi-etoxi)-hidruro de aluminio y sodio). Como hidruro de aluminio y metal alcalino se pueden utilizar el hidruro de aluminio y sodio o el de aluminio y potasio. Como hidruro de boro y un metal alcalino se puede utilizar el hidruro de boro y sodio o potasio. Como hidruro de boro y un metal alcalino-térreo se puede utilizar el hidruro de boro y calcio.
Convenientemente, la reducción se lleva a cabo en el seno de un disolvente prótico. Como disolvente prótico se pueden utilizar alcoholes alifáticos inferiores, tales como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, sec.-butanol, terc.-butanol, isobutanol o agua, o bien una mezcla de los alcoholes mencionados y de agua.
La reducción se lleva a cabo convenientemente a una temperatura de -40 a 40ºC, de modo preferido de 0 a 20ºC.
La tercera etapa del procedimiento conforme al invento, a saber la reacción del derivado de ciclopenteno de la fórmula general V para dar el (1R,4S)- y/o el (1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno de las fórmulas
7
se lleva a cabo o bien mediante microorganismos, que están capacitados para aprovechar un derivado de ciclopenteno de la fórmula general V como única fuente de nitrógeno, como única fuente de carbono o como una única fuente de carbono y de nitrógeno, extractos enzimáticos obtenidos a partir de éste, o enzimas con actividad de N-acetil-amino-alcohol hidrolasa, o mediante acilasas de penicilina G. En el caso de esta biotransformación, se hacen reaccionar los derivados acilados de (1S,4R)- y (1R,4S)-amino-alcoholes, resultando los (1S,4R)- y (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopentenos de las fórmulas VI y VII.
Para la biotransformación son apropiados todos los microorganismos, que pueden aprovechar un derivado de ciclopenteno de la fórmula general V como única fuente de nitrógeno, como única fuente de carbono o como una única fuente de carbono y de nitrógeno. Tales microorganismos y su aislamiento, los extractos enzimáticos obtenibles a partir de éstos, y las enzimas con actividad de hidrolasa de N-acetil-amino-alcohol, se describen en el documento WO-A-97/45529 más antiguo. En particular, son apropiados los microorganismos que pueden aprovechar por lo menos el enantiómero (1R,4S) de estos derivados de ciclopenteno V como única fuente de nitrógeno, como única fuente de carbono o como única fuente de carbono y de nitrógeno.
Estos microorganismos se pueden aislar en particular a partir de muestras de suelos, un lodo o aguas residuales, tomando ayuda de tecnologías microbiológicas usuales. El aislamiento de los microorganismos se efectúa cultivando éstos en un medio nutritivo que contiene un derivado de ciclopenteno de la fórmula general
8
en la que R^{1} tiene el significado mencionado,
\bullet como única fuente de carbono y de nitrógeno,
\bullet como única fuente de nitrógeno con una apropiada fuente de carbono, o
\bullet como única fuente de carbono con una apropiada fuente de nitrógeno,
de un modo usual.
En particular, se pueden aislar en este caso microorganismos, que pueden aprovechar por lo menos el enantiómero (1R,4S) del ciclopenteno de la fórmula V como única fuente de nitrógeno, como única fuente de carbono o como única fuente de carbono y de nitrógeno.
Como derivados de ciclopenteno de la fórmula general V son apropiados por ejemplo: los N-acetil-, N-propionil-, N-isobutiril-, N-terc.-butiloxicarbonil- (N-BOC)-, N-butiril- o N-fenilacetil-1-amino-4-hidroximetil-2-ciclopentenos.
Como apropiada fuente de nitrógeno, los microorganismos pueden aprovechar por ejemplo amonio, nitratos, aminoácidos o ureas como substrato de crecimiento.
Como apropiada fuente de nitrógeno los microorganismos pueden aprovechar por ejemplo azúcares, azúcar-alcoholes, ácidos carboxílicos C_{2}-C_{4} o aminoácidos como substrato de crecimiento. Como azúcares se pueden utilizar hexosas, tales como glucosa, o pentosas. Como azúcar-alcohol puede encontrar utilización por ejemplo el glicerol. Como ácidos carboxílicos C_{2}-C_{4} se pueden utilizar por ejemplo ácido acético o ácido propiónico. Como aminoácidos se pueden utilizar por ejemplo leucina, alanina o asparagina.
Como medio de selección y cultivación, se pueden utilizar los que son usuales en el sector especializado. Es apropiado, por ejemplo, el medio descrito en la Tabla 1 o un medio completo (medio que contiene un extracto de levadura) tal como p.ej. el "Nutrient Yeast Broth" (NYB = caldo de levadura nutriente). De modo preferido, se utiliza el medio descrito en la Tabla 1.
Durante la cultivación y la selección, se inducen convenientemente las enzimas eficaces de los microorganismos. Como inductor de enzimas se pueden utilizar los derivados de ciclopenteno de la fórmula general V.
Usualmente, la cultivación y la selección se efectúan a una temperatura de 20ºC a 40ºC, de modo preferido de 30ºC a 38ºC y a un pH comprendido entre pH 5,5 y pH 8, de modo preferido entre pH 6,8 y pH 7,8.
Se encontró que los microorganismos, los extractos enzimáticos y las enzimas, anteriores, están en situación de convertir a un derivado racémico de ciclopenteno de la fórmula general V, por lo menos de manera parcial, en los 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopentenos de las fórmulas VI y VII. En tal caso, el enantiómero (1R,4S) del 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno es formado por los microorganismos usualmente con muchísima mayor rapidez que el enantiómero (1S,4R). Aparentemente, los microorganismos aprovechan, en una mezcla de (1R,4S)- y (1S,4R)-enantiómeros del derivado de ciclopenteno V, de manera preferente el enantiómero (1R,4S) como fuente de carbono y/o de nitrógeno, e hidrolizan a éste por lo tanto con muchísima mayor rapidez al realizar la biotransformación.
De modo preferido, la biotransformación se lleva a cabo mediante microorganismos de los géneros Alcaligenes/Bordetella, Rhodococcus, Arthobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas o Gordona, en particular de las especies Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DMS 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ30, Bacillus simplex K2, Pseudomonas putida K32 o Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), así con sus variantes y mutantes funcionalmente equivalentes. Se depositaron los microorganismos DSM 10686 y 10687 el 20.05.1996, los microorganismos DSM 10328 y 10329 el 06.11.1995, el microorganismo DSM 11292 el 08.10.1996 y el microorganismo DSM 11172 el 20.09.1996, en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares S.A.] Mascheroderweg 1b, D38124, Braunschweig, de acuerdo con el Tratado de Budapest.
Por "variantes y mutantes funcionalmente equivalentes" se entienden microorganismos, que se derivan de los microorganismos antes mencionados, y que en lo esencial poseen las mismas propiedades y funciones que los microorganismos originales. Tales variantes y mutantes se pueden formar aleatoriamente, p.ej. por irradiación con rayos UV (ultravioletas).
La biotransformación se puede llevar a cabo después de una cultivación usual de estos microorganismos con células en reposo (células que no están creciendo, que ya no necesitan ninguna fuente de carbono ni de energía) o con células en crecimiento. De modo preferido, la biotransformación se lleva a cabo con células en reposo.
Los extractos enzimáticos, o las enzimas con actividad de N-acetil-amino-alcohol hidrolasa, que se adecuan para la biotransformación, se pueden aislar p.ej. mediante una disgregación, usual para un experto en la especialidad, de las células de microorganismos que se han descrito, y poseen entonces una selectividad correspondiente en lo que se refiere a la conversión de los derivados de ciclopenteno V. Para esto se puede utilizar por ejemplo el método de ultrasonidos o de la prensa French. De modo preferido, estas enzimas o estos extractos enzimáticos se aíslan a partir de los microorganismos Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686).
Las apropiadas acilasas de penicilina G se pueden obtener a partir de muchos microorganismos, tales como p.ej.: bacterias o Actinomicetos, en especial a partir de los siguientes microorganismos: Escherichia coli ATCC 9637, Bacillus megaterium, Streptomyces lavendulae ATCC 13664, Nocardia sp. ATCC 13635, Providencia rettgeri ATCC 9918, Arthrobacter viscosus ATCC 15294, Rhodococcus fascians ATCC 12975, Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289, Achromobacter ATCC 23584 y Micrococcus roseus ATCC 416. En particular, se utilizan acilasas de penilicina G comerciales, por ejemplo la acilasa de penicilina G, EC 3.5.1.11, procedente de E. coli (Boehringer Mannheim) o procedente de Bacillus megaterium. Las acilasas de penicilina G hidrolizan de manera preferente al enantiómero (1R,4S) de los derivados de ciclopenteno V. De manera preferida, se utilizan acilasas de penicilina G inmovilizadas.
La biotransformación se puede llevar a cabo en medios usuales para un experto en la especialidad, tal como por ejemplo en un tampón de fosfato, citrato o Hepes de baja molaridad, en presencia de agua, medios completos tales como p.ej. el "Nutrient Yeast Broth" (NYB), o en el descrito en la Tabla 1. De modo preferido, la biotransformación se lleva a cabo en el medio de acuerdo con la Tabla 1 o en un tampón de fosfato de baja molaridad.
Convenientemente, la biotransformación se lleva a cabo mediando adición en una sola vez o en régimen continuo del derivado de ciclopenteno (fórmula V), de tal manera que la concentración no supere el 10% en peso, de modo preferido el 2% en peso.
El pH puede estar situado durante la biotransformación en un intervalo de 5 a 9, de modo preferido de 6 a 8. Convenientemente, la biotransformación se lleva a cabo a una temperatura de 20 a 40ºC, de modo preferido de 25 a 30ºC.
La evolución de la reacción se puede vigilar por ejemplo mediante una HPLC (de High Performance Liquid Chromatography = cromatografía en fase líquida de alto rendimiento). Para la obtención, predominantenente, del enantiómero (1R,4S) del 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno, la reacción se interrumpe entonces de manera conveniente al alcanzarse la pureza enantiomérica óptima o deseada, por ejemplo por adición de un ácido. La reacción se puede llevar a cabo también durante tanto tiempo hasta que, junto a ello, se haya formado suficiente cantidad del enantiómero (1S,4R).
Descripción taxonómica de Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172)
Forma de las células Bastoncillos
\hskip1cm anchura \mum 0,5-0,6
\hskip1cm longitud \mum 1,0-2,5
Movilidad +
Flagelación peritrica
Reacción Gram -
Lisis por KOH al 3% +
Aminopeptidasa (Cerny) +
Esporas -
Oxidasa +
Catalasa +
ADH (alcohol deshidrogenasa) -
NO_{2} a partir de NO_{3} -
Desnitrificación -
Ureasa -
Hidrólisis de gelatina -
Ácido procedente de (ensayo OF):
\hskip1cm Glucosa -
\hskip1cm Fructosa -
\hskip1cm Arabinosa -
\hskip1cm Adipato +
\hskip1cm Caprato +
\hskip1cm Citrato +
\hskip1cm Malato +
\hskip1cm Manitol -
Descripción taxonómica de Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 106 86)
La morfología y el color de las colonias son: cortas hifas ramificadas, que al envejecer se descomponen en bastoncillos y cocos, las colonias son desde brillantes hasta en parte delicuescentes, de color beige con tono rosa, RAL 1001;
Aminoácido diagnosticado del péptido-glicano: ácido meso-diamino pimélico;
Ácidos micólicos: ácidos micólicos de Rhodococcus; la determinación de la longitud de cadena de los ácidos micólicos (C_{32}-C_{44}) y la comparación de los datos con los registros en el banco de datos de ácidos micólicos de la DSM dieron como resultado una similaridad muy alta con las muestras de las cepas de Rhodococcus erythropolis (similaridad, 0,588).
Modelo de ácidos grasos: ácidos grasos sin ramificar, saturados e insaturados, más el ácido tubérculo-esteárico.
Al realizar la secuenciación parcial del ADNr (ADN ribosomal) de 16S de la cepa se encontró una alta coincidencia (100%) con las secuencias de las regiones específicas de Rhodococcus erythropolis.
El resultado de las identificaciones es inequívoco, puesto que tres métodos independientes unos de otros (ácidos micólicos, ácidos grasos, ADNr de 16S) han asociado la cepa a la especie Rhodococcus erythropolis.
Descripción taxonómica de Gordona sp. CB 100 (DSM 10687)
Morfología y color de las colonias: cortas hifas ramificadas, que se descomponen al envejecer en bastoncillos y cocos, colonias de color anaranjado claro, (RAL 2008);
Aminoácido diagnosticado del péptido-glicano: ácido meso-diamino-pimélico;
Modelo de menaquinona: MK-9 (H_{2}) 100%.
Ácidos micólicos: ácidos micólicos de Gordona; la determinación de la longitud de cadena de los ácidos micólicos (C_{50}-C_{60}) se efectuó con ayuda de la cromatografía en fase gaseosa a alta temperatura. Este modelo corresponde al modelo que se encuentra en el caso de representantes del género Gordona.
Modelo de ácidos grasos: ácidos grasos sin ramificar, saturados e insaturados, más el ácido tubérculo-esteárico.
Al realizar la secuenciación parcial del ADNr de 16S de la cepa, se pudo encontrar solamente una coincidencia relativamente baja, de 98,8%, con las secuencias de las regiones específicas de Gordona rubropertincta.
En virtud de los resultados existentes (menaquinonas, ácidos micólicos, ácidos grasos, ADNr de 16S) el material aislado se puede asociar ciertamente de manera inequívoca al género Gordona, pero no es posible una asociación con una especie conocida de Gordona en virtud de estos resultados. Por lo tanto, hay que suponer que en el caso de la cepa DSM 10687 se trata de una nueva especie hasta ahora no descrita del género Gordona.
Descripción taxonómica de Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329) Propiedades de la cepa
Forma de las células Bastoncillos
\hskip1cm anchura \mum 0,5-0,6
\hskip1cm longitud \mum 1,5-3,0
Movilidad +
Flagelación peritrica
Reacción Gram -
Lisis por KOH al 3% +
Aminopeptidasa (Cerny) +
Esporas -
Oxidasa +
Catalasa +
Crecimiento anaerobio -
ADH (alcohol deshidrogenasa) +
NO_{2} a partir de NO_{3} +
Desnitrificación +
Ureasa -
Hidrólisis de
\hskip1cm Gelatina -
\hskip1cm Tween 80 -
Ácido procedente de (ensayo OF):
\hskip1cm Glucosa aerobia -
\hskip1cm Xilosa 80 -
(Continuación)
Aprovechamiento del substrato
\hskip1cm Glucosa -
\hskip1cm Fructosa -
\hskip1cm Arabinosa -
\hskip1cm Citrato +
\hskip1cm Malato +
\hskip1cm Manitol -
Descripción taxonómica de Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328)
Caracterización: \begin{minipage}[t]{87mm} Bastoncillos irregulares Gram-positivos con un pronunciado ciclo de crecimiento de bastoncillos y cocos; estrictamente aerobio; ninguna formación de ácidos o gases a partir de glucosa.\end{minipage}
Movilidad -
Esporas -
Catalasa +
Ácido meso-diamino-pimélico en la pared celular: no
Tipo de péptido-glicano: A3\alpha, L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala
Similaridad con la secuencia de ADNr de 16S: \begin{minipage}[t]{87mm} La secuenciación de la zona con la mayor variabilidad proporcionó como valores más altos los de 98,2% con Arthrobacter pascens, A. ramosus y A. oxydans\end{minipage}
Descripción taxonómica de Agrobacterium/Rhizobium HSZ30
Forma de las células Bastoncillos pleomorfos
\hskip1cm anchura [\mum] 0,6-1,0
\hskip1cm longitud [\mum] 1,5-3,0
Reacción Gram -
Lisis por KOH al 3% +
Aminopeptidasa +
Esporas -
Oxidasa +
Catalasa +
Movilidad +
Crecimiento anaerobio -
Nitrito a partir de nitrato -
Desnitrificación -
Ureasa +
Hidrólisis de gelatina -
Ácido procedente de:
L-arabinosa +
Galactosa -
Melezitosa -
Fucosa +
Arabitol -
Manitol -
Eritritol -
Alcalinización de la leche de Lackmus +
Ceto-lactosa -
La secuenciación parcial del ADNr de 16S dio como resultado similaridades comparablemente altas de aproximadamente 96% con representantes de los géneros Agrobacterium y Rhizobium. No es posible una inequívoca asociación a un tipo descrito dentro de estos géneros.
Descripción taxonómica de Bacillus simplex K2
Forma de las células Bastoncillos
\hskip1cm anchura [\mum] 0,8-1,0
\hskip1cm longitud [\mum] 3,0-5,0
Esporas -
Elipsoidal -
Esférica -
Catalasa +
Crecimiento anerobio -
Reacción VP Ningún crecimiento
Temperatura máxima
Crecimiento positivo a ºC 40
Crecimiento negativo a ºC 45
Crecimiento en el medio de pH 5,7 -
NaCl 2% +
\hskip1cm 5% -
\hskip1cm 7% -
\hskip1cm 10% -
Medio de lisozima +
Ácido procedente de (ASS)
D-glucosa +
L-arabinosa +
D-xilosa -
D-manita +
D-fructosa +
Gas procedente de fructosa -
Lecitinasa -
Hidrólisis de
Almidón +
Gelatina +
Caseína -
Tween 80 +
Esculina -
Aprovechamiento de
Citrato +
Propionato -
Nitrito a partir de nitrato +
Indol -
Desaminasa de fenilalanina -
Dihidrolasa de arginina -
El análisis de los ácidos grasos celulares proporcionó una confirmación de la asociación al género Bacillus.
La secuenciación parcial del ADNr de 16S proporcionó una similaridad de 100% con Bacillus simplex.
Descripción taxonómica de Pseudomonas putida K32
Forma de las células Bastoncillos
\hskip1cm anchura [\mum] 0,8-0,9
\hskip1cm [\mum] 1,5-4,0
Movilidad +
Flagelación polar >1
Reacción Gram -
Lisis por KOH al 3% +
Aminopeptidasa +
Esporas -
Oxidasa +
(Continuación)
Catalasa +
Crecimiento anerobio -
Pigmentos
fluorescentes +
Piocianina -
ADH +
Nitrito a partir de nitrato -
Desnitrificación -
Ureasa -
Hidrólisis de gelatina -
Aprovechamiento del substrato
Adipato -
Citrato +
Malato +
D-mandelato +
Fenil-acetato +
D-tartrato -
D-glucosa +
Trehalosa -
Manitol -
Formiato de benzoílo -
Propilenglicol +
Butil-amina +
Bencil-amina +
Triptamina -
Acetamida +
Hipurato +
El perfil de los ácidos grasos celulares es típico para Pseudomonas putida.
La secuenciación parcial del ADNr de 16S dio como resultado unas similaridades de aproximadamente 98% con Pseudomonas mendocina y Pseudomonas alcaligenes.
La similaridad con Pseudomonas putida era de 97,4%.
Descripción taxonómica de Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291)
1.
Morfología y color de las colonias: cortas hifas ramificadas, que al envejecer se descomponen en bastoncillos y cocos, colonias romas, de color rojo anaranjado claro RAL 2008;
2.
Aminoácido diagnosticado del péptido-glicano: ácido meso-diaminopimélico;
3.
Ácidos micólicos: ácidos micólicos de Rhodococcus;
La determinación de la longitud de cadena de ácidos micólicos (C_{32}-C_{44}) y la comparación de los datos con los registros que figuran en el banco de datos de ácidos micólicos de la DSMZ dieron como resultado solamente una similaridad muy pequeña con los modelos de cepas de Rhodococcus ruber (similaridad, 0,019). Este factor de correlación es demasiado pequeño como para poder ser aprovechado para la identificación de las especies.
4.
Modelo de ácidos grasos: ácidos grasos sin ramificar, saturados e insaturados más ácido tubérculo-esteárico.
Este modelo de ácidos grasos es de carácter diagnóstico para todos los representantes del género Rhodococcus y sus géneros afines próximos, tales como Mycobacterium, Nocardia y Gordona. Se intentó, mediando inclusión de las diferencias cualitativas y cuantitativas en el modelo de ácidos grasos, llevar a cabo una diferenciación en el plano de las especies. Con ayuda de métodos numéricos, el modelo de ácidos grasos de Rhodococcus sp. FB 387 se comparó con los registros que figuran en el banco de datos. Tampoco con este método se pudo asociar el Rhodococcus sp. FB 387 a ninguna especie descrita de Rhodococcus por causa de la pequeña similaridad (0,063).
5.
Al realizar la secuenciación parcial del ADNr de 16S de la cepa, la 96-818 fue asociada a Rhodococcus opacus con una correlación de 97,9%. Esta coincidencia entre secuencias está situada por debajo de la de 99,5% , tal y como se exige para una asociación inequívoca entre especies en este taxón.
En virtud de los presentes resultados se puede partir del hecho de que en el caso de la cepa Rhodococcus sp. FB 387 se trata de una nueva especie de Rhodococcus que hasta ahora no se ha descrito.
En la cuarta etapa, el derivado de ciclopenteno de la fórmula VI ó VII, en caso de que se desee después de haber separado los isómeros, se transformó con N-(2-amino-4,6-dicloro-pirimidin-5-il)formamida de la fórmula
9
en el (1S,4R)- o el (1R,4S)-4-[(2-amino-6-cloro-5-formamido-4-pirimidinil)-amino]-2-ciclopenteno-1-metanol de la fórmula IX o X
10
La N-(2-amino-4,6-dicloro-pirimidin-5-il)formamida se puede preparar de acuerdo con el documento WO-A-95/21161.
Convenientemente, la reacción en la cuarta etapa se lleva a cabo en presencia de una base. Como base se pueden emplear bases orgánicas o bases inorgánicas. Como bases orgánicas se pueden utilizar trialquil-aminas. Ejemplos de trialquil-aminas son trietil-amina, tributil-amina, tribencil-amina, piridina o N-metil-pirrolidina. Como bases inorgánicas se pueden emplear, por ejemplo, carbonatos de metales alcalinos o alcalino-térreos o bien hidrógeno-carbonatos de metales alcalinos o alcalino-térreos, por ejemplo carbonato de potasio e hidrógeno-carbonato de sodio.
Convenientemente, la reacción en la cuarta etapa se lleva a cabo en el seno de un disolvente prótico. Como disolvente prótico se pueden utilizar alcoholes alifáticos inferiores tales como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol o isobutanol.
La reacción en la cuarta etapa se lleva a cabo convenientemente a una temperatura de 0 a 150ºC, de modo preferido de 20 a 100ºC.
En la quinta etapa, el (1S,4R)- o el (1R,4S)-4-[(2-amino-6-cloro-5-formamido-4-pirimidinil)-amino]-2-ciclopenteno-1-metanol (fórmulas IX, X) se cicliza de una manera conocida, de acuerdo con el documento WO-A-95/21161, para formar el producto final de acuerdo con la fórmula I ó II.
Usualmente, la ciclización se lleva a cabo en estado disuelto en ortoformiatos de trialquilo en presencia de un ácido acuoso concentrado. Como ortoformiatos de trialquilo pueden encontrar utilización, por ejemplo, el ortoformiato de trimetilo o el ortoformiato de trietilo. Como ácido acuoso se puede utilizar por ejemplo ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido metano-sulfónico.
Otra parte componente del invento es un procedimiento para la preparación de los compuestos ópticamente activos de las fórmulas generales
11
en las que R^{1} tiene el significado mencionado. Estos compuestos son obtenibles mediante reacción de un derivado de ciclopenteno de la fórmula general
12
en la que R^{1} tiene el significado mencionado, mediante los microorganismos, extractos enzimáticos, N-acetil-amino-alcohol hidrolasas o acilasas de penicilina G, que ya se han descrito con anterioridad, para formar los (1R,4S)- y/o (1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopentenos de acuerdo con las fórmulas
13
siendo acilados estos últimos para formar los compuestos de las fórmulas XVI ó XVII.
El derivado de ciclopenteno de la fórmula V se puede preparar, por ejemplo, tal como se ha descrito con anterioridad. Tanto la conversión microbiológica como también la acilación se llevan a cabo en las mismas condiciones que antes se han descrito.
Convenientemente, esta acilación se lleva a cabo a una temperatura de 20ºC a 100ºC, de modo preferido de 0ºC a 80ºC.
Ejemplos de compuestos ópticamente activos, que se pueden preparar conforme al procedimiento son:
(1R,4S)-N-terc.-butoxicarbonil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno con un valor de ee (exceso enantiomérico) de 98%,
(1R,4S)-N-acetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno con un valor de ee de 98%,
(1R,4S)-N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno con un valor de ee de 98%,
(1S,4R)-N-acetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno ópticamente activo y
(1S,4R)-N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno ópticamente activo.
De estos compuestos, el (1R,4S)-N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno ópticamente activo es un compuesto que todavía no ha sido descrito en la bibliografía. Por lo tanto, también es parte componente del invento el (1R,4S)-N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno ópticamente activo con un exceso enantiomérico de más que 0%, preferiblemente en un exceso enantiomérico de por lo menos 80%, 90% ó 95%, en particular en un exceso enantiomérico de por lo menos 98%. Estos compuestos ópticamente activos se pueden racemizar de una manera conocida por un experto en la especialidad para dar el N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno racémico que todavía no se ha descrito en la bibliografía.
El procedimiento para la preparación de un derivado de 4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno racémico u ópticamente activo de la fórmula general
14
en la que R^{1} tiene el significado mencionado, se lleva a cabo en la primera etapa acilando por ejemplo un ácido ciclopenteno-4-carboxílico de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
en forma del racemato o de uno de sus isómeros ópticamente activos, con un halogenuro de ácido carboxílico de la fórmula general
XIR^{1} --- 
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
--- X
en la que R^{1} y X tienen los significados mencionados, para dar un derivado de ácido ciclopenteno-4-carboxílico racémico u ópticamente activo de la fórmula general
\vskip1.000000\baselineskip
16
y reduciendo a éste, en la segunda etapa, para formar el deseado producto de acuerdo con la fórmula XIII.
Como derivados de 4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno ópticamente activos (fórmula XIII) y derivados de ácido ciclopenteno-4-carboxílico ópticamente activos (fórmula XV) se entienden los correspondientes isómeros (1R,4S) o (1S,4R).
La primera etapa de este procedimiento, es decir la acilación, se lleva a cabo con un halogenuro de ácido carboxílico de la fórmula general XI. Como halogenuros de ácidos carboxílicos se pueden utilizar los mismos que antes se han descrito, de modo preferido se utiliza el fluoruro de terc.-butiloxicarbonilo.
Convenientemente, la reacción en la primera etapa se lleva a cabo a un valor del pH de 8 a 14, de modo preferido de 12 a 14, y a una temperatura de 0 a 50ºC, de modo preferido de 15 a 25ºC.
Como disolventes se adecuan mezclas de agua con éteres. Como éter se puede utilizar dioxano, tetrahidrofurano, dietil-éter, o bien el éter dimetílico o dietílico de glicol.
La segunda etapa del procedimiento, es decir la reducción, se puede llevar a cabo con un hidruro de aluminio y un metal alcalino, con un complejo de borano y disulfuro de di-alquilo C_{1-4} o con un complejo de borano y tetrahidrofurano. Como hidruro de aluminio y un metal alcalino se pueden utilizar un hidruro de aluminio y litio, sodio o potasio, de modo preferido se utiliza el hidruro de aluminio y litio. Como complejo de borano y sulfuro de di-alquilo C_{1-4} se pueden utilizar complejos de borano y sulfuro de dimetilo, de borano y sulfuro de dietilo, de borano y sulfuro de dipropilo, o de borano y sulfuro de dibutilo. De modo preferido, se utiliza un complejo de borano y sulfuro de dimetilo.
Convenientemente, como disolvente en la segunda etapa se utiliza uno de los éteres antes reseñados, sin agua.
La reacción en la segunda etapa se puede llevar a cabo a una temperatura de -50 a 5ºC, de modo preferido de -25 a -10ºC.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de (\pm)-2-acetil-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
100 g de (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona se disolvieron, bajo nitrógeno, en acetonitrilo (800 ml) y piridina (161,26 ml). A 12ºC se añadieron gota a gota104,5 g de cloruro de acetilo en el transcurso de 2 horas. La mezcla se agitó a la temperatura ambiente todavía durante 4,5 horas. La mezcla se reunió con 800 ml de agua, y el acetonitrilo se concentró por evaporación en vacío. La fase de agua se extrajo 3 veces, cada vez con 400 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas reunidas se lavaron todavía con HCl 1 N (400 ml), con agua (400 ml), con NaCl saturado (400 ml), se secaron con sulfato de magnesio y se concentraron totalmente por evaporación. El residuo se recogió en cloruro de metileno y se filtró a través de gel de sílice. El material filtrado se concentró por evaporación, y el producto se purificó por destilación. Se obtuvieron 107,76 g de un producto en forma de un líquido transparente.
El rendimiento fue de 71%.
P.eb._{0,07 torr}: 51ºC
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta [ppm] 2,25 (sistema AB, 2H):
400 MHz 2,8 (s, 3H);
3,42 (m, 1H);
5,30 (m, 1H);
6,89 (m, 1H);
6,92 (m, 1H).
Ejemplo 2 Preparación de (\pm)-2-butiril-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
100,3 g de (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona se disolvieron, bajo nitrógeno, en acetonitrilo (720 ml) y piridina (142 ml). A 12ºC se añadieron gota a gota 141,8 g de cloruro de ácido butírico en el transcurso de 1 hora. La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente todavía durante 3 horas. La mezcla se reunió con 720 ml de agua y las fases se separaron. El acetonitrilo se concentró por evaporación en vacío y la fase de agua se extrajo 3 veces con acetato de etilo (cada vez 300 ml). Las fases orgánicas reunidas se lavaron todavía con HCl 1 N (350 ml), con NaCl saturado (400 ml) y con agua (500 ml), se secaron con sulfato de magnesio y se concentraron totalmente por evaporación. El producto bruto se purificó por destilación. Se obtuvieron 107,76 g de un producto en forma de un líquido transparente. El rendimiento fue de 85%.
P.eb._{0,05 torr}: 70ºC
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta [ppm] 0,98 (t, J = 8,5 Hz, 3H);
400 MHz 1,58-1,65 (2H);
2,23 (sistema AB, 2H);
2,82-2,90 (2H);
3,42 (m, 1H);
5,30 (m, 1H);
6,62 (m, 1H);
6,90 (m, 1H).
Ejemplo 3 Preparación de (\pm)-2-fenilacetil-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
33,4 g de (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona se disolvieron, bajo nitrógeno, en acetonitrilo (240 ml) y piridina (48,3 ml). A 12ºC se añadieron gota a gota 68,6 g de cloruro de ácido fenil-acético en el transcurso de 30 minutos. La mezcla se agitó a la temperatura ambiente todavía durante 3,5 horas. La mezcla se reunió con 240 ml de agua. El acetonitrilo se concentró por evaporación en vacío y la fase de agua se extrajo 3 veces con acetato de etilo (cada vez 150 ml). Las fases orgánicas reunidas se lavaron todavía con HCl 1 N (150 ml), con NaCl saturado (150 ml) y con agua (150 ml), se secaron con sulfato de magnesio y se concentraron totalmente por evaporación. El producto bruto se separó por filtración a través de gel de sílice (con una mezcla de hexano y acetato de etilo = 1:1). Se obtuvieron 78,34 g de un producto bruto en forma de un aceite de color amarillo.
Ejemplo 4 Preparación de (\pm)-2-propionil-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
47 g de (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona se disolvieron, bajo nitrógeno, en acetonitrilo (325 ml) y piridina (41 ml). A 12ºC se añadieron gota a gota 43,9 g de cloruro de ácido propiónico en el transcurso de 1 h. La mezcla de reacción se agitó todavía durante 5 h a la temperatura ambiente. La mezcla se reunió con 145 ml de agua y el acetonitrilo se concentró por evaporación en vacío. La fase acuosa se extrajo 3 veces, cada vez con 115 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas reunidas se lavaron todavía con HCl 1 N (140 ml), con NaHCO_{3} saturado (40 ml) y con NaCl (40 ml), se secaron con sulfato de sodio y se concentraron totalmente por evaporación. El residuo se purificó por destilación. Se obtuvieron 55,8 g del compuesto del título, que solidifica al dejarlo reposar. El rendimiento fue de 81,6%.
P.eb. a 2,8 mbar 75-80ºC
P.f.: 54-56ºC
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta [ppm] 0,98 (t, 3H);
400 MHz 2,10 (cuadrete, 1H);
2,28 (cuadrete, 1H);
2,64 (m, 2H);
3,42 (s, 1H);
5,16 (s, 1H);
6,78 (m, 1H);
6,96 (m, 1H).
Ejemplo 5 Preparación de (\pm)-2-isobutiril-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
45,1 g de (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona se disolvieron, bajo nitrógeno, en acetonitrilo (310 ml) y piridina (39 ml). A 10ºC se añadieron gota a gota 54,1 g de cloruro de ácido isobutírico en el transcurso de 1 h. La mezcla de reacción se agitó todavía durante 5 h a la temperatura ambiente. La mezcla se reunió con 140 ml de agua, y el acetonitrilo se concentró por evaporación en vacío. La fase acuosa se extrajo 4 veces, cada vez con 120 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas reunidas se lavaron todavía con soluciones de HCl 1 N (50 ml), de NaHCO_{3} saturado (50 ml) y de NaCl (50 ml), se secaron con sulfato de sodio y se concentraron totalmente por evaporación. El residuo se hirvió a reflujo en n-hexano (240 ml) con carbón activo. Después de la filtración del carbón activo, el material filtrado se enfrió a 0ºC y el compuesto del título se filtró. Se obtuvieron 54,5 g de un producto. El rendimiento fue de 76%.
P.f.: 41-42ºC
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 0,92 (d, 3H);
400 MHz 1,06 (d, 3H);
2,10 (m, 1H);
2,28 (m, 1H);
3,40 (m, 2H);
5,16 (s, 1H);
6,78 (m, 1H);
7,92 (m, 1H).
Ejemplo 6 Preparación de (\pm)-2-cloroacetil-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona
10,1 g de (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona se disolvieron bajo nitrógeno y a 10ºC en una mezcla de diclorometano (10 ml), de piridina (8,4 ml) y 0,22 g de 4-N,N-dimetilamino-piridina. Se añadieron gota a gota 13,5 g de cloruro de cloroacetilo en el transcurso de 1 h. La temperatura subió hasta 44ºC. La mezcla se siguió agitando durante 2 h a la temperatura ambiente. A la solución se le añadieron 100 ml de agua. Después de una separación entre fases, la fase acuosa se extrajo con 100 ml de diclorometano. Las fases orgánicas reunidas se secaron con sulfato de sodio y se concentraron totalmente por evaporación. El residuo se hirvió bajo reflujo en 100 ml de diisopropil-éter, en presencia de 1 g de carbón activo en el transcurso de 10 minutos. Después de una filtración en caliente, el material filtrado se enfrió hasta la temperatura ambiente, el material sólido se filtró y se secó. Se obtuvieron 10,35 g del compuesto del título. El rendimiento fue de 60%.
P.f.: 86-88ºC
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta [ppm] 2,28 (d, 1H);
400 MHz 2,40 (d, 3H);
3,48 (s, 1H);
4,56 (d, 2H);
5,30 (s, 1H);
6,70 (d, 1H);
6,94 (m, 1H).
Ejemplo 7 Preparación de (\pm)-N-acetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
79,56 g de (\pm)-2-acetil-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3- ona se disolvieron, bajo nitrógeno, en metanol (450 ml) y se enfriaron a -10ºC. Se añadieron en porciones 19,8 g de hidruro de boro y sodio en el transcurso de 45 minutos. La mezcla de reacción se agitó a 0ºC todavía durante 3 horas y luego el pH se ajustó a 1,8 con ácido sulfúrico concentrado. Esta mezcla se reunió con acetato de etilo (200 ml) y los materiales sólidos se separaron por filtración. Luego se concentró totalmente por evaporación. El residuo se recogió en agua, se lavó con cloruro de metileno y se concentró por evaporación. El producto bruto se purificó todavía con una filtración en gel de sílice. Se obtuvieron 51,83 g de un producto en forma de un material sólido de color blanco. El rendimiento fue de 64%, referido a la 2-acetil-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona empleada.
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 1,18 (m, 1H);
400 MHz 1,78 (s, 3H);
2,29 (m, 1H);
2,66 (m, 1H);
3,35 (s, 2H);
4,58 (s, 1H);
4,72 (m, 1H);
5,61 (d, 1H);
5,85 (d, 1H);
7,83 (d, 1H).
Ejemplo 8 Preparación de (\pm)-N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
73,87 g de (\pm)-2-butiril-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona se disolvieron, bajo nitrógeno, en etanol (400 ml) y se enfriaron a -10ºC. Se añadieron en porciones 15,68 g de hidruro de boro y sodio en el transcurso de 45 minutos. La mezcla de reacción se agitó a 0ºC todavía durante 3 horas, y luego el pH se ajustó a 1,5 con ácido sulfúrico concentrado. Esta mezcla se reunió con acetato de etilo (200 ml) y los materiales sólidos se separaron por filtración. Luego se concentró totalmente por evaporación. El residuo se recogió en agua, se lavó con cloruro de metileno, se concentró nuevamente por evaporación y se secó en alto vacío. Se obtuvieron 60,55 g de un producto como material sólido de color blanco. El rendimiento fue de 80%, referido a la (\pm)-2-butiril-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona empleada.
P.f.: 71-72ºC
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta [ppm] 0,98 (t, J = 8,5 Hz, 3H);
400 MHz 1,40-1,50 (1H);
1,58-1,68 (2H);
2,10-2,18 (2H);
2,42-2,55 (1H);
2,85 (m, 1H);
3,62 (sistema AB, 2H);
4,98 (m, 1H);
5,78-5,82 (2H);
6,38 (m, 1H).
Ejemplo 9 Preparación de (\pm)-N-fenilacetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
77 g de (\pm)-2-fenilacetil-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona bruta se disolvieron en etanol (450 ml) bajo nitrógeno, y se enfriaron a -10ºC. Se añadieron en porciones 13,2 g de hidruro de boro y sodio en el transcurso de 1 hora. La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente todavía durante 3,5 horas y luego el pH se ajustó a 1,8 con ácido sulfúrico concentrado. Esta mezcla se purificó con una filtración en gel de sílice (con una mezcla de hexano y acetato de etilo = 2:8). Después de una recristalización a partir de acetato de etilo, se obtuvieron 15,89 g de un material sólido de color blanco. El rendimiento fue de 80% referido a la (\pm)-2-fenilacetil-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona empleada.
\newpage
^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta [ppm] 1,28-1,35 (1H);
400 MHz 1,40 (m, 1H);
2,38-2,45 (1H);
2,79 (m, 1H);
3,50 (sistema AB, 2H);
3,52 (s, 3H);
4,98 (m, 1H);
5,75 (m, 2H);
5,98 (m, 1H);
7,20-7,38 (5H).
Ejemplo 10 Preparación de (\pm)-N-BOC-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
(BOC = terc.-butoxicarbonilo)
15 g de (\pm)-hidrocloruro de 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno bruto (preparado de acuerdo con J. Org. Chem. 1981, 46, 3268) se disolvieron bajo nitrógeno a la temperatura ambiente en una mezcla de 150 ml agua y 150 ml de dioxano. La solución se ajustó con NaOH 1 N a un pH de 14, luego se mezcló con una solución en dietil-éter de fluoruro de terc.-butiloxicarbonilo (BOC-F, en un exceso de 20%) y se siguió agitando todavía durante 3 h a la temperatura ambiente (el BOC-F se preparó de acuerdo con Synthesis 1975, 599). El pH se ajustó a 2 con HCl concentrado. Después de una destilación de los disolventes orgánicos, se añadieron al residuo 50 ml de agua y la mezcla se extrajo 3 veces, cada vez con 100 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas reunidas se concentraron totalmente por evaporación. El residuo se cristalizó en una mezcla de 110 ml de diisopropil-éter y 80 ml de n-hexano. Se obtuvieron 11,95 g del compuesto del título.
El rendimiento fue de 56%.
P.f.: 68-70ºC
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 1,18 (m, 1H);
400 MHz 1,38 (s, 9H);
2,26 (m, 1H);
2,65 (m, 1H);
3,33 (t, 2H);
4,45 (m, 1H);
4,55 (t, 1H);
5,62 (m, 1H);
5,79 (m, 1H);
6,73 (d, 1H).
Ejemplo 11 Preparación de (\pm)-N-propionil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
16,6 g de (\pm)-2-propionil-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona se disolvieron, bajo nitrógeno, en agua (140 ml) y 2-butanol (66 ml) y se enfriaron a -5ºC. Se añadieron en porciones 3 g de hidruro de boro y sodio en el transcurso de 2 h. La mezcla se agitó a 10ºC todavía durante 2,5 h, y luego se ajustó a un pH de 2,2 con una mezcla de ácido clorhídrico concentrado y agua (1/1). La solución se concentró por evaporación hasta 40 g y se ajustó a un pH de 6,2 con NaOH 2 N. La mezcla se extrajo 5 veces, cada vez con 50 ml de diclorometano. Las fases orgánicas reunidas se concentraron totalmente por evaporación y el residuo se recristalizó en tolueno (150 ml). Se obtuvieron 11,1 g del compuesto del título. El rendimiento fue de 65%.
P.f.: 67-68ºC
\newpage
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 0,96 (t, 1H);
400 MHz 1,16 (quintete, 1H);
2,04 (cuadrete, 2H);
2,26 (m, 1H);
2,66 (m, 1H);
3,34 (m, 2H);
4,58 (t, 1H);
4,72 (m, 1H);
5,61 (m, 1H);
5,84 (m, 1H);
7,72 (d, 1H).
Ejemplo 12 Preparación de (\pm)-N-isobutiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
9 g de (\pm)-2-isobutiril-3-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona se disolvieron, bajo nitrógeno, en agua (32 ml) y 2-butanol (84 ml) y se enfriaron a 0ºC. Se añadieron en porciones 1,37 g de hidruro de boro y sodio en el transcurso de 3,5 h. La mezcla se siguió agitando a 20ºC durante 3 h, luego se ajustó a un pH de 2,5 con una mezcla de ácido clorhídrico concentrado y agua (1/1) y seguidamente se neutralizó con NaOH 2 N. La solución se concentró por evaporación hasta dejar 40 g. El residuo se extrajo 3 veces, cada vez con 80 ml de diclorometano. Las fases orgánicas reunidas se concentraron totalmente por evaporación. El material sólido obtenido se cristalizó en 25 ml de tolueno. Se obtuvieron 6,8 g del compuesto del título. El rendimiento fue de 73,6%.
P.f.: 80-811C
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 0,98 (d, 6H);
400 MHz 1,16 (quintete, 1H);
2,30 (m, 2H);
2,68 (m, 1H);
3,32 (t, 2H);
4,58 (t, 1H);
4,70 (m, 1H);
5,61 (m, 1H);
5,82 (m, 1H);
7,68 (d, 1H).
Ejemplo 13 Preparación de (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno mediante acilasas de penicilina G
Para la biotransformación se empleó la acilasa de penicilina G EC 3.5.1.11 procedente de E. coli (Boehringer Mannheim) 165 U (unidades)/g o la acilasa de penicilina G EC 3.5.1.11 procedente de Bacillus megaterium. Para esto, se incubó un tampón de fosfato de sodio 50 mM (de pH 5-9; 4 ml) con 1% en peso de N-fenilacetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno no racémico y con 400 mg de la correspondiente acilasa de penicilina G, a 37ºC.
Después de unos determinados intervalos de tiempo, se sacaron muestras y se analizaron mediante una cromatografía de capa fina (en gel de sílice Kieselgel 60, con una mezcla de butanol, agua y ácido acético glacial = 3:1:1; detección con ninhidrina), una cromatografía de gases (en columna capilar, HP-5, con 5% de fenil-metil-siloxano) o una HPLC. La enzima separaba con alta actividad el grupo fenacetilo y ponía en libertad en tal caso, hasta en un 40%, el correspondiente amino-alcohol. El amino-alcohol libre se obtuvo con un valor de ee de 80%.
Ejemplo 14 Preparación de (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno mediante microorganismos
14.1
Un lodo de clarificación (al 20%) procedente de la instalación de depuración ARA en Visp se incubó mediando sacudimiento a 37ºC en el medio A + N (véase la Tabla 1), que contenía 0,5% en peso de N-acetil-, N-propionil-, N-isobutiril- o N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno. La formación de (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno se vigiló mediante una cromatografía de capa fina. 1% de estas porciones enriquecidas se sobreinocularon 1-3 veces y se aislaron sobre medios sólidos (Plate Count Agar en el medio de la Tabla 1; 20 g/l).
De esta manera se aislaron los microorganismos Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DMS 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Gordona sp. CB 100 (DSM 10687) y Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291).
14.2
Los microorganismos aislados de esta manera se cultivaron en el medio (véase la Tabla 1), que contenía 0,5% de N-acetil-, N-propionil-, N-isobutiril- o N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno. Ellos crecieron en el transcurso de 24 a 36 horas hasta alcanzar una densidad óptica (OD) de 2 a 3. Las células obtenidas de este modo se cosecharon en la fase de crecimiento exponencial tardío, y se lavaron en un tampón de fosfato 10 mM.
La biotransformación subsiguiente se llevó a cabo en un tampón de fosfato 50 mM (de pH 4,5-9) que contenía 1% en peso de N-acetil-, N-isobutiril- o N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno. Después de una cromatografía de capa fina se comprobó que un 50% del substrato se había hidrolizado para formar el (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno. Los análisis por HPLC dieron unos valores de ee comprendidos entre 80 y 93%.
Si como substrato se empleó N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno, entonces la tasa de biotransformación fue de 0,14 (g/l/h/OD) para la cepa DSM 10686, cuando la cultivación se efectuó en un medio A + N, y de 0,03 (g/l/h/OD) cuando la cultivación se efectuó en el medio NYB ("Nutrient Yeast Broth") que contenía N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno.
Si la misma conversión se llevó a cabo con la cepa DSM 10687 a una concentración de 200 mM del substrato (N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno. La tasa de biotransformación fue de 0,161 (g/l/h/OD).
TABLA 1 Medio A + N
MgCl_{2} 0,4 g/l
CaCl_{2} 0,014 g/l
FeCl_{3} 0,8 mg/l
Na_{2}SO_{4} 0,1 g/l
KH_{2}PO_{4} 1 g/l
Na_{2}HPO_{4} 2,5 g/l
NaCl 3 g/l
Solución de vitaminas 1 ml/l
Solución de oligoelementos 1 ml/l
pH 7,5
14.3
Se cultivó Rhodococcus erythropolis DSM 10686 en un fermentador que tenía una capacidad de 6 l en un medio mínimo (compárese la Tabla 2) con acetato de amonio (3 g/l) como fuente de carbono o de nitrógeno a 30ºC hasta llegar a una densidad de células de OD 650 > 25. Durante el crecimiento de las células, se añadió de una manera continua ácido acético al 50% como fuente de C adicional. Con el fin de inducir la actividad enzimática, se añadieron luego 60 g de (\pm)-N-acetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno, y se siguió incubando durante algunas horas. Finalmente, se añadieron todavía una vez más 40 g de (\pm)-N-acetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno y luego se incubó durante diez horas adicionales. La evolución de la biotransformación se vigiló on-line con una HPLC. Con la consecución de un rendimiento analítico de 40%, referido al substrato racémico empleado, y de un valor de ee de 85%, se interrumpió la fermentación mediante la adición de un ácido.
TABLA 2 Composición del medio
Componente Concentración
Extracto de levadura 0,5 g/l
Peptona M66 0,5 g/l
KH_{2}PO_{4} 4,0 g/l
Na_{2}HPO_{4}\cdot2H_{2}O 0,5 g/l
K_{2}SO_{4} 2,0 g/l
Acetato de NH_{4} 3,0 g/l
CaCl_{2} 0,2 g/l
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 1,0 g/l
Solución de oligoelementos (véase más abajo) 1,5 ml/l
PPG (polipropilen-glicol) 0,1 g/l
Solución de oligoelementos
KOH 15,1 g/l
EDTA\cdotNa_{2}\cdot2H_{2}O 100,0 g/l
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O 9,0 g/l
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O 4,0 g/l
H_{3}BO_{3} 2,7 g/l
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O 1,8 g/l
CuCl_{2}\cdot2H_{2}O 1,5 g/l
NiCl_{2}\cdot6H_{2}O 0,18 g/l
Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O 0,27 g/l
14.4
De una manera análoga al Ejemplo 14.3, se cultivaron los microorganismos Arthrobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB387 (DSM 11291), Alcaligenes xylosoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterium/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2 y Pseudomonas putida K32 sobre acetato de sodio en el medio (Tabla 1) con y sin N-acetil-, N-propionil-, N-isobutiril- o N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno, citados abreviadamente en lo sucesivo como amino-alcoholes.
Los siguientes resultados se consiguieron con células exponenciales, que habían sido cultivadas sin amino-alcoholes (analizado por HPLC):
Cepa Tasa [mmol/OD\cdoth] Valor de ee/conversión [%]
HSZ 5 (DSM 10328) 0,05 88,7/16
HSZ 17 (DSM 10329) 0,005 95/23
K32 0,05 54/1
CB101 (DSM 10686) 0,1 84/39
Las cepas K2 y HSZ 30 se cultivaron, se cosecharon y se sometieron a una biotransformación durante 60 horas.
Cepa Tasa [mmol/OD\cdoth] Valor de ee/conversión [%]
K2 - 92/10
HSZ 30 - 93/3,5
De todas las tandas se cosecharon células exponenciales y estacionarias, y se emplearon como células en reposo para la biotransformación. En virtud del análisis por DC (cromatografía de capa fina) no se pudo observar ninguna diferencia en cuanto a la tasa inicial entre las células inducidas con un aminoalcohol o las no inducidas.
Ejemplo 15 Purificación de la N-acetil-amino-alcohol hidrolasa procedente de Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686)
La enzima se purificó tal como se describe seguidamente, hasta que se observase solamente una banda proteínica en la SDS-PAGE [electroforesis en gel de dodecil-sulfato de sodio-poli(acril-amida)] (Pharmacia Phast Gel, gradiente 10-15%) con un peso molecular de 50 kD.
Células de Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686) se lavaron en un tampón Tris 50 mM (de pH 6,2) y se concentraron hasta alcanzar una densidad óptica a 650 nm OD_{650nm} de 190. Después de haber añadido fluoruro de fenil-metano-sulfonilo (PMSF) hasta alcanzar una concentración final de 1 mM, y DNAsa, las células se trataron con la prensa French, con el fin de obtener un extracto bruto. Después de una centrifugación se obtuvieron 200 ml de un extracto exento de células, con una concentración de proteínas de 4,8 mg ml^{-1}.
960 mg del extracto exento de células se aplicaron sobre una columna para cromatografía con intercambio de iones HiLoad 26/10 Q-Sepharose (de Pharmacia), que había sido equilibrada con un tampón Tris de 50 mM (pH 8,0), que contenía 1 mM de ditiotreitol (DTT).
Después de haber lavado la columna con el mismo tampón, las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de tampones (1.500 ml; gradiente desde un tampón Tris de 50 mM (de pH 8,0) que contenía 1 mM de DTT hasta un tampón Tris de 50 mM (de pH 7,0) que contenía 1 mM de DTT y 1 M de NaCl). La enzima se eluía desde la columna entre 370 y 430 mM de NaCl y a un pH de 7,6. Las fracciones activas se reunieron y se concentraron hasta 9 ml. El contenido de proteínas era de 41 mg.
Para la purificación ulterior, la solución de proteínas se aplicó sobre una columna para cromatografía con filtración en gel, de HiLoad 26/60 Superdex 75 (de Pharmacia), que había sido equilibrada con un tampón Tris de 50 mM que contenía 50 mM de NaCl y 1 mM de DTT. Las fracciones activas se reunieron y tenían un contenido total de proteínas de 10,9 mg.
Esta solución de proteínas se aplicó sobre una columna de Mono Q HR5/5 (de Pharmacia) que había sido equilibrada con un tampón Tris de 50 mM (de pH 8,5) que contenía 1 mM de DTT. Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal (40 ml) desde un tampón Tris de 50 mM (de pH 8,5), que contenía 1 mM de DTT, hasta un tampón Tris de 50 mM (de pH 8,5) que contenía 1 mM de DTT y 1 M de NaCl. La enzima se eluía entre 390 mM de NaCl y 440 mM de NaCl. Las fracciones activas contenían 1,4 mg de proteína.
En la última etapa de purificación se utilizó la misma columna, equilibrada con el mismo tampón. Como gradiente de elución sirvió el mismo tampón con 0-500 mM de NaCl y un pH de 7,0-8,5. De esta manera se pudieron aislar 430 \mug de una enzima pura.
La secuencia terminal de N de la enzima se determinó directamente a partir de la "Protein-Blot" ["transferencia de borrón de proteína"]. Se obtuvo una secuencia de los siguientes 20 aminoácidos (compárese el documento WO-A-97/45529):
Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn.
Ejemplo 16 Caracterización enzimática
La caracterización enzimática se llevó a cabo tanto con una enzima purificada como también con un extracto exento de células, que se había desalinizado mediante una columna de Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia).
La concentración de proteínas en el extracto exento de células fue de 7,3 mg ml^{-1} y
la concentración de proteínas de la enzima purificada fue de 135 \mug ml^{-1}.
No se añadió PMSF al extracto exento de células.
16.1
Determinación de la K_{m}
La determinación de la K_{m} se llevó a cabo en el extracto exento de células. El valor de la K_{m} de la reacción, a un pH de 7,0 y a una temperatura de 30ºC, fue de 22,5 mM para el substrato N-acetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno.
16.2
Valor óptimo del pH
El valor óptimo del pH para la hidrólisis de N-acetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno (25 mM) se determinó con la enzima purificada y en el extracto exento de células, en un intervalo de valores de pH de 6,2-9,0, en las siguientes soluciones tamponadoras.
Tampones Tris de 100 mM de pH 9,0; 8,5; 8,0; 7,5; 7,0
Tampones de citrato-fosfato de 100 mM de pH 7,0; 6,55; 6,2
La actividad se midió durante 24 h.
El valor óptimo del pH para la reacción estaba situado entre pH 7,0 y pH 7,5 para la producción del enantiómero (1R,4S) y del enantiómero (1S,4R).
En el extracto exento de células, el valor óptimo del pH para la actividad estaba situado en pH 7,0. La selectividad era, sin embargo, mejor entre pH 6,0 y pH 7,0.
La Figura 1 muestra la actividad de la N-acetil-amino-alcohol hidrolasa (en el extracto exento de células) procedente de Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) en dependencia con respecto del valor del pH.
16.3
El valor óptimo de la temperatura para la reacción indicada en el Ejemplo 16.2 estaba situado entre 25 y 30ºC.
La Figura 2 muestra la actividad de la N-acetil-amino-alcohol hidrolasa (en el extracto exento de células) procedente de Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) en dependencia con respecto de la temperatura.
16.4
El peso molecular se determinó como de 50 kD de acuerdo con una SDS-PAGE.
16.5
Como substratos se hidrolizaron:
N-acetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno,
N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno,
N-propionil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno,
N-isobutiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno, y
N-isobutil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno.
Ejemplo 17 Preparación del (1R,4S)-hidrocloruro de 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
374,1 g de una solución de (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno (preparación similar a como en el Ejemplo 14) se concentraron por evaporación hasta 123,7 g. La solución contenía 60,2 mmol del anterior compuesto (según una HPLC) y se ajustó, con NaOH al 30%, desde un pH de 2 a un pH de 11,7 y luego se extrajo 3 veces, cada vez con 70 ml de isobutanol. Los extractos en isobutanol reunidos se ajustaron con HCl gaseoso a un pH de 11,7, se aumentaron de concentración hasta 65 g y se filtraron (con eliminación de las impurezas sólidas). Al material filtrado se les añadieron gota a gota 60 ml de acetona a 201C y mediando una buena agitación. La mezcla turbia se inoculó con cristales del compuesto del título y se agitó a 5ºC durante 1 h. Después de una filtración y una desecación se obtuvieron 5,2 g de un producto. El rendimiento fue de 58%.
P.f.: 125-127ºC
Valor de ee: 98% (en una columna de HPLC quiral calibrada)
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 1,44 (m, 1H);
400 MHz 2,35 (m, 1H);
2,83 (m, 1H);
3,42 (m, 2H);
4,10 (s, 1H);
4,80 (s, 1H);
5,80 (d, 1H);
6,06 (d, 1H);
8,13 (s, 3H).
Ejemplo 18 Preparación de (1R,4S)-N-BOC-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
75 g de una solución de (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno (preparación similar a como la del Ejemplo 14; 44,6 mmol de los compuestos) se ajustaron a un pH de 8 con NaOH al 30% y se mezclaron con 6 g de NaHCO_{3}. La mezcla se calentó a 52ºC. Mediando buena agitación, se añadieron a esto 60 ml de diisopropil-éter y luego, durante 2 h, se añadió dosificadamente una solución de 11,12 g de anhídrido de BOC en 18,2 ml de diisopropil-éter. La mezcla se filtró a través de Celite y las fases se separaron. La fase de agua se extrajo con 65 ml de diisopropil-éter. Las fases orgánicas reunidas se lavaron con 45 ml de agua, luego se concentraron por evaporación hasta 37,5 g y se calentaron a 50ºC. A la solución se le añadieron gota a gota 31 ml de n-hexano. Después de lento enfriamiento a 0ºC (durante 2 h), el compuesto del título se filtró, se lavó con 12 ml de una mezcla de n-hexano y diisopropil-éter 1/1 y se secó. Se obtuvieron 6,75 g de un producto. El rendimiento fue de 71%.
P.f.: 70-71ºC
Valor de ee 98% (columna de HPLC quiral calibrada)
\newpage
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 1,18 (m, 1H);
400 MHz 1,27 (s, 9H);
2,28 (m, 1H);
2,63 (m, 1H);
3,33 (q, 2H);
4,43 (m, 1H);
4,56 (t, 1H);
5,62 (m, 1H);
5,78 (m, 1H);
6,72 (d, 1H).
Ejemplo 19 Preparación del (1R,4S)-hidrocloruro de 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
87,8 g de (1R,4S)-N-BOC-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno se disolvieron en 270 ml de HCl 2 N y 1.340 ml de metanol. La mezcla se hirvió a reflujo durante 4,5 h. Después de haber destilado el metanol, el residuo se disolvió en 800 ml de agua. La solución acuosa se extrajo 2 veces, cada vez con 340 ml de acetato de etilo. La fase de agua se concentró totalmente por evaporación (a 50ºC/60 mbar). El material sólido se secó en vacío a 50ºC, se suspendió con 150 ml de dietil-éter, se separó por filtración y se lavó 2 veces, cada vez con 50 ml de dietil-éter. Después de una desecación, el compuesto del título se obtuvo con un rendimiento de 95% (58,4 g).
Los datos físicos y espectroscópicos del producto eran iguales a como en el Ejemplo 17.
Ejemplo 20 Preparación de (1R,4S)-N-acetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
25 g del (1R,4S)-hidrocloruro de 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno se disolvieron en 182 ml de anhídrido de ácido acético y se mezclaron a 0ºC con una solución de 18,25 g de trietil-amina en 60 ml de anhídrido de ácido acético. La mezcla se agitó a 80ºC durante 3 h y luego se enfrió a la temperatura ambiente. El hidrocloruro de trietil-amina se separó por filtración y se lavó con 120 ml de n-hexano. El material filtrado se concentró por evaporación. El residuo se mezcló con 300 ml de tolueno y se agitó a la temperatura ambiente, en presencia de 5,2 g de carbón activo y 13 g de Celite, durante 20 min. Después de una filtración y un lavado de la torta de filtración (3 veces, cada vez con 40 ml de tolueno) el disolvente se concentró totalmente por evaporación. El residuo se mezcló con 180 ml de metanol y 15,5 g de K_{2}CO_{3}, y se agitó durante 10 h a la temperatura ambiente. La suspensión se separó por filtración y el material filtrado se concentró por evaporación. El residuo se suspendió en 750 ml de acetato de isopropilo y se hirvió a reflujo durante 1,5 h, en presencia de 0,5 g de carbón activo. Después de la filtración en carbón activo (a 70-80ºC) el material filtrado se enfrió a 0ºC durante una noche. El compuesto del título se filtró, se lavó con 80 ml de acetato de isopropilo frío y se secó en vacío. Se obtuvieron 17,2 g de un producto. El rendimiento fue de 66%.
P.f.: 77-80ºC
Valor de ee 98% (en una columna de HPLC quiral calibrada)
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 1,15 (m, 1H);
400 MHz 1,78 (s, 3H);
2,25 (m, 1H);
2,66 (m, 1H);
3,35 (m, 2H);
4,58 (t, 1H);
4,70 (m, 1H);
5,62 (m, 1H);
5,85 (m, 1H);
7,80 (d, 1H).
Ejemplo 21 Preparación de (1S,4R)-N-acetil-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
Partiendo de 25 g del (1S,4R)-hidrocloruro de 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno se pudo preparar el enantiómero del título con el procedimiento de acuerdo con el Ejemplo 18 (rendimiento 68%). Los datos espectroscópicos y físicos del producto eran iguales a como en el Ejemplo 20.
Ejemplo 22 Preparación de (1R,4S)-N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
34,7 g del (1R,4S)-hidrocloruro de 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno y 2 g de N,N-dimetilamino-piridina se disolvieron en 600 ml de cloruro de metileno. La solución se enfrió a 0ºC. Luego se añadieron gota a gota 52 g de trietil-amina (5 min). La mezcla se siguió agitando todavía durante 30 min. A la mezcla se le añadió dosificadamente durante 1 h a 0ºC una solución de 35,2 g de cloruro de butirilo en 60 ml de cloruro de metileno. La mezcla se siguió agitando todavía entre 0 y 20ºC durante 1,5 h, y luego se reunió con 600 ml de agua. Después de una separación entre fases, la fase de agua se extrajo con 600 ml de cloruro de metileno. Las fases orgánicas reunidas se lavaron 3 veces, cada vez con 500 ml de NaOH al 10 %, y luego se concentraron totalmente por evaporación. El material sólido secado se disolvió en 120 ml de metanol. La solución se mezcló con 5 g de K_{2}CO_{3} y se siguió agitando durante 2 h a la temperatura ambiente. Las sales inorgánicas se separaron por filtración y se enjuagaron con 20 ml de metanol. El material filtrado se neutralizó con HCl 2 N. La suspensión se separó por filtración y la torta del filtro se lavó con 20 ml de metanol. El material filtrado se concentró totalmente por evaporación. El residuo sólido se secó y se cristalizó en 150 ml de tolueno. Se obtuvieron 28,5 g del compuesto del título. El rendimiento fue de 67%.
P.f.: 71-72ºC
Valor de ee: 98% (en una columna de HPLC quiral calibrada)
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 0,85 (t, 3H);
400 MHz 1,15 (m, 1H);
1,50 (q, 2H);
2,03 (d, 2H);
2,28 (m, 1H);
2,67 (m, 1H);
3,35 (d, 2H);
4,62 (s, 1H);
4,76 (m, 1H);
5,63 (m, 1H);
5,85 (m, 1H);
7,77 (d, 1H).
Ejemplo 23 Preparación de (1S,4R)-N-butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
Partiendo de 34,7 g del (1S,4R)-hidrocloruro de 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno, se pudo preparar el enantiómero del título con el procedimiento del Ejemplo 20 (rendimiento 63%). Los datos espectroscópicos y físicos del producto eran iguales a como en el Ejemplo 22.
Ejemplo 24 Preparación de (1R,4S)-1-[(2-amino-6-cloro-5-formamido-pirimidin-4-il)amino]-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
2,07 g de N-(2-amino-4,6-dicloro-pirimidin-5-il)formamida se calentaron a 80ºC en 40 ml de isobutanol (suspensión de color blanco). A la mezcla se le añadió una solución de 1,97 g del (1R,4S)-hidrocloruro de 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno, 3,8 g de trietil-amina y 15 ml de isobutanol. La mezcla se siguió agitando durante 13 h a 80ºC. La solución transparente se mezcló a 20ºC con 10 ml de NaOH 1 N y se concentró hasta sequedad por evaporación. El residuo se cromatografió "flash" [= con resolución rápida] (en una columna de gel de sílice Kieselgel 60, longitud 8 cm, diámetro 6,5 cm, agente eluyente: mezcla de acetato de etilo y metanol 95/5). Después de haber concentrado por evaporación el agente eluyente y de haber secado el residuo, se obtuvieron 2,1 g del compuesto del título. El rendimiento fue de 74%.
P.f.: 174-176ºC
Valor de ee: 98% (en columna de HPLC quiral calibrada)
\newpage
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 1,87 (m, 1H);
400 MHz 2,35 (m, 1H);
2,73 (m, 1H);
3,38 (t, 2H);
4,68 (m, 1H);
5,08 (m, 1H);
5,70 (d, 1H);
5,85 (d, 1H);
6,40; 6,55 y 6,65 (s, d, y d, en común 3H);
7,78 y 8,10 (d y s, en común 1H);
8,55 y 8,95 (d y s, en común 1H).
Ejemplo 25 Preparación de (1R,4S)-1-[(2-amino-6-cloro-5-formamido-pirimidin-4-il)amino]-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno
145,2 ml de una solución de (1R,4S)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno (preparación similar a como en el Ejemplo 14) se concentraron hasta 25,5 ml y se separaron por filtración a través de Celite. La torta de filtración se lavó con 7,5 ml de agua. El material filtrado contenía 17,7 mmol del compuesto anterior (según la HPLC) y se ajustó con HCl concentrado desde un pH de 6,6 hasta un pH de 1, luego se extrajo 3 veces, cada vez con 10 ml de isobutanol. La fase orgánica se desechó. La fase acuosa se ajustó a un pH de 12 con NaOH al 30% y se extrajo 3 veces, cada vez con 10 ml de isobutanol. Las fases orgánicas reunidas se concentraron por evaporación hasta 15 ml y se mezclaron con 2,53 g de trietil-amina. La mezcla se mezcló, igual a como en el Ejemplo 24, con una solución de 2,07 g de N-(2-amino-4,6-dicloro-pirimidin)-5-il)formamida en 40 ml de etanol. La mezcla se agitó a 80ºC durante 16 h. Después del tratamiento como en el Ejemplo 22 se obtuvieron 2,4 g del compuesto del título. El rendimiento fue de 85%.
Los datos físicos y espectroscópicos del producto eran iguales a como en el Ejemplo 24.
Ejemplo 26 Preparación de (\pm)-N-BOC-ácido 1-amino-2-ciclopenteno-4-carboxílico
16,4 g del (\pm)-hidrocloruro de ácido 1-amino-2-ciclopenteno-4-carboxílico bruto (preparado de acuerdo con J. Org. Chem. 1981, 46, 3268) se disolvieron bajo nitrógeno a la temperatura ambiente en una mezcla de 80 ml de agua y 80 ml de dioxano. La mezcla se ajustó luego a un pH de 14 con NaOH 1 N y se reunió con una solución en dietil-éter de fluoruro de terc.-butiloxicarbonilo (BOC-F, en un exceso de 20%) (el BOC-F se prepara de acuerdo con Synthesis 1975, 599). La mezcla se siguió agitando todavía durante 5 h a la temperatura ambiente. El pH se ajustó a 2 con HCl concentrado. Después de la destilación de los disolventes orgánicos, al residuo se le añadieron 50 ml de agua y se extrajo 3 veces, cada vez con 100 ml de acetato de etilo. La fase orgánica se concentró por evaporación hasta 50 ml y se diluyó con 25 ml de tolueno. Después de haber enfriado (a 0-10ºC) el compuesto del título se filtró y se secó. Se obtuvieron 14,3 g de un producto. El rendimiento fue de 63%.
P.f.: 126-127ºC
^{1}H-NMR (DMSO-d_{6}): \delta [ppm] 1,14 (s, 9H);
400 MHz 1,70 (m, 1H);
2,40 (m, 1H);
3,40 (m, 1H);
4,47 (m, 1H);
5,70 (t, 1H);
4,87 (t, 1H);
6,88 (d, 1H);
12,30 (d, 1H).
Ejemplo 27 Preparación de (\pm)-N-BOC-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno a partir de (\pm)-N-BOC-ácido 1-amino-2-ciclopenteno-4-carboxílico
En un dispositivo con sistema de agitación con una capacidad de 500 ml se dispusieron previamente 250 ml de tetrahidrofurano y 10,02 g (0,164 mol) de LiAlH_{4} y se añadió dosificadamente en el transcurso de 1 h a -10ºC una solución de 30,0 g (0,132 mol) de (\pm)-N-BOC-ácido 1-amino-2-ciclopenteno-4-carboxílico en 75 ml de tetrahidrofurano. A continuación, se añadieron 10 g de agua, 10 g de una solución al 15% de NaOH y 20 g de agua, y se separó por filtración. El residuo se lavó todavía 2 veces, cada vez con 100 ml de terc.-butil-metil-éter, y las fases orgánicas reunidas se concentraron hasta sequedad por evaporación. Después de la adición de 80 ml de hexano y de la inoculación con el compuesto de acuerdo con el Ejemplo 10, precipitó el compuesto del título como un material sólido cristalino. Rendimiento 15,84 g (56%). Los datos físicos y espectroscópicos eran iguales a como en el Ejemplo 10.
Ejemplo 28 Preparación de (1R,4S)-N-BOC-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno a partir de (1R,4S)-N-BOC-ácido 1-amino-2-ciclopenteno-4-carboxílico
En un dispositivo con sistema de agitación con una capacidad de 500 ml se dispusieron previamente 80 ml de tetrahidrofurano y 11,38 g (50,07 mmol) de (1R,4S)-N-BOC-ácido 1-amino-2-ciclopenteno-4-carboxílico (preparado de acuerdo con Tetrahedron: Asymmetry 1993, 4, 1117) y se añadieron dosificadamente 5 ml de un complejo de borano y sulfuro de dimetilo en el transcurso de 1 h a -15ºC y a continuación se siguió agitando todavía durante 3 h a esta temperatura. Se añadió una solución de 4 g de NaOH en 60 ml de agua y se calentó a la temperatura ambiente. La extracción con tolueno, la filtración a través de gel de sílice y la subsiguiente cristalización en una mezcla de acetato de etilo y n-hexano 1:1 proporcionaron 5,4 g del compuesto del título, correspondientes a un rendimiento de 57% en forma de un material sólido cristalino de color blanco. Los datos físicos y espectroscópicos eran iguales a como en el Ejemplo 10. El valor de ee fue de 99% (en la misma columna de HPLC quiral).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: LONZA AG
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Muenchensteinerstrasse 38
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
LOCALIDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 4002
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
DENOMINACIÓN DEL INVENTO: Procedimiento para la preparación de (1S,4R)- y/o (1R,4S)-4-(2-amino-6-cloro-9-H-purin-9-il)-2-ciclopenteno-1-metanol
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOPORTE DE DATOS: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SISTEMA LÓGICO - SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPÓTESIS: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DEL FRAGMENTO: Terminal de N
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Rhodococcus erythropolis 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
INDIVIDUO/MATERIAL AISLADO : Rhodococcus erythropolis CB101
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Glu Gln Asn Leu His Trp Leu Ser Ala Thr Glu Met Ala Ala Ser}
\sac{Val Ala Ser Asn}

Claims (14)

1. Procedimiento para la preparación de (1S,4R)- y/o (1R,4S)-4-(2-amino-6-cloro-9-H-purin-9-il)-2-ciclopenteno-1-metanol de las fórmulas I ó II
17
o de sus sales, caracterizado porque, en una primera etapa, se acila una (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona de la fórmula
18
para dar un derivado de (\pm)-2-aza-biciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona de la fórmula general
19
en la que R^{1} significa alquilo C_{1-4}, alcoxi C_{1-4}, arilo o ariloxi, éste, en una segunda etapa, se reduce para formar un derivado de 1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno de la fórmula general
20
en la que R^{1} tiene el significado mencionado, éste, en una tercera etapa, se hace reaccionar mediante un microorganismo, que está capacitado para aprovechar derivados de ciclopentano de la fórmula general V como única fuente de nitrógeno, como única fuente de carbono o como única fuente de carbono y de nitrógeno, extractos enzimáticos obtenidos a partir de éste, una enzima con actividad de N-acetil-amino-alcohol hidrolasa o una acilasa de penicilina G, para dar el (1R,4S)- o (1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno de acuerdo con las fórmulas
21
éste, eventualmente después de haber separado los enantiómeros, se transforma, en una cuarta etapa, con N-(2-amino-4,6-dicloro-pirimidin-5-il)-formamida de la fórmula
22
en el (1S,4R)- o el (1R,4S)-4-[(2-amino-6-cloro-5-formamido-4-pirimidinil)-amino]-2-ciclopenteno-1-metanol de las fórmulas
23
y este último, en una quinta etapa, se cicliza para dar el producto final de acuerdo con las fórmulas I ó II.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la acilación en la primera etapa se lleva a cabo con un halogenuro de ácido carboxílico de la fórmula general
R^{1} --- 
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
--- X
en la que R^{1} tiene el significado mencionado y X significa un átomo de halógeno, o con un anhídrido de ácido carboxílico de la fórmula general
24
en la que R^{1} tiene el significado mencionado.
3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque la acilación en la primera etapa se lleva a cabo en el seno de un disolvente aprótico.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque la reducción en la segunda etapa se lleva a cabo con un hidruro de boro y un metal alcalino o metal alcalino-térreo, un hidruro de aluminio y un metal alcalino o metal alcalino-térreo, o con un vitruro.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque la reducción en la segunda etapa se lleva a cabo en el seno de un disolvente prótico.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque la reacción en la tercera etapa se lleva a cabo mediante microorganismos del género Rhodococcus, Gordona, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas o Alcaligenes/Bordetella.
\newpage
7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque la reacción en la tercera etapa se lleva a cabo mediante una acilasa de penicilina G procedente de microorganismos de las especies Bacillus megaterium o Escherichia coli.
8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7,
caracterizado porque la reacción en la tercera etapa se lleva a cabo a una temperatura de 20 a 40ºC y a un valor del pH de 5 a 9.
9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8,
caracterizado porque la reacción en la cuarta etapa se lleva a cabo en presencia de una base.
10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9,
caracterizado porque la reacción en la cuarta etapa se lleva a cabo en el seno de un disolvente prótico.
11. Procedimiento para la preparación de derivados de (1R,4S)- y/o (1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno de las fórmulas generales XVI ó XVII
25
en las que R^{1} significa alquilo C_{1-4}, alcoxi C_{1-4}, arilo o ariloxi,
caracterizado porque un derivado de ciclopenteno de la fórmula general
26
en la que R^{1} tiene el significado antes mencionado, se hace reaccionar mediante un microorganismo, que está capacitado para aprovechar derivados de ciclopentano de la fórmula general V como única fuente de nitrógeno, como única fuente de carbono o como única fuente de carbono y de nitrógeno, extractos enzimáticos obtenidos a partir de éste, una enzima con actividad de N-acetil-amino-alcohol hidrolasa o una acilasa de penicilina G, para dar el (1R,4S)- y el (1S,4R)-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno de acuerdo con las fórmulas
27
y éste, eventualmente después de haber separado los enantiómeros, se acila para formar los compuestos de las fórmulas XVI ó XVII.
12. (1R,4S)-N-Butiril-1-amino-4-(hidroximetil)-2-ciclopenteno de la fórmula
28
en un exceso enantiomérico.
13. Enantiómero de acuerdo con la reivindicación 12 con un exceso enantiomérico de por lo menos 80%.
14. Enantiómero de acuerdo con la reivindicación 12 con un exceso enantiomérico de por lo menos 98%.
ES98108721T 1997-05-13 1998-05-13 Procedimiento multietapa para la preparacion del (1s,4r)- y/o del (1r,4s)-4-(2-amino-6-cloro-9-h-purin-9-il)-2-ciclopenten-1-metanol. Expired - Lifetime ES2223095T3 (es)

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