CZ297887B6 - Zpusob výroby enantiomeru derivátu (1R, 4S)- nebo(1S, 4R)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenua enantiomer (1R, 4S)-N-butyryl-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten - Google Patents

Zpusob výroby enantiomeru derivátu (1R, 4S)- nebo(1S, 4R)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenua enantiomer (1R, 4S)-N-butyryl-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten Download PDF

Info

Publication number
CZ297887B6
CZ297887B6 CZ20060694A CZ2006694A CZ297887B6 CZ 297887 B6 CZ297887 B6 CZ 297887B6 CZ 20060694 A CZ20060694 A CZ 20060694A CZ 2006694 A CZ2006694 A CZ 2006694A CZ 297887 B6 CZ297887 B6 CZ 297887B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cyclopentene
amino
hydroxymethyl
enantiomer
dsm
Prior art date
Application number
CZ20060694A
Other languages
English (en)
Inventor
Bernegger@Christine
Maria Urban@Eva
Mary Birch@Olwen
Burgdorf@Kurt
Brux@Frank
Etter@Kay-Sara
Bossard@Pierre
Brieden@Walter
Duc@Laurent
Gordon@John
O´Murchu@Colm
Guggisberg@Yves
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of CZ297887B6 publication Critical patent/CZ297887B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/26Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32Nitrogen atom
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/16Preparation of optical isomers
    • C07C231/18Preparation of optical isomers by stereospecific synthesis
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00Carboxylic acid amides
    • C07C233/01Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/23Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06Esters of carbamic acids
    • C07C271/08Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/24Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/56Ring systems containing three or more rings
    • C07D209/80[b, c]- or [b, d]-condensed
    • C07D209/94[b, c]- or [b, d]-condensed containing carbocyclic rings other than six-membered
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/40Heterocyclic compounds containing purine ring systems with halogen atoms or perhalogeno-alkyl radicals directly attached in position 2 or 6
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001Amines; Imines
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07BGENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07Optical isomers
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/10Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being unsaturated

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Zpusob výroby enantiomeru derivátu (1R, 4S)- nebo(1S, 4R)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenuvzorcu XVI, XVII. V prvním stupni se premenuje derivát cyklopentenu vzorce V pomocí mikroorganismu,který je schopný zuzitkovat derivát cyklopentenu vzorce V jako jediný zdroj dusíku, uhlíku, nebo uhlíku a dusíku, pomocí N-acetylaminoalkoholhydrolázy nebo pomocí acylázy penicilinu G na (1R,4S)- nebo (1S, 4R)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenvzorcu VI, VII, a ten se ve druhém stupni acylujena slouceninu vzorce XVI nebo XVII. Enantiomer (1R,4S)-N-butyryl-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu vzorce XVIII s více nez 0 % enantiomerním prebytkem.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nového způsobu výroby enantiomerů derivátu (1R,4S)- nebo —(1S,4R)—1— amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu a enantiomerů (ÍR,4S)-N-butyryl-l-amino-4(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu.
Dosavadní stav techniky
Způsob výroby (lS,4R)-4-(2-ainino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-l-methanolu z (lS,4R)-4-amino-2-cyklopenten-l-methanolu je popsán ve WO 95/21 161. Nevýhodou tohoto způsobuje to, že lze edukt (lS,4S)-4-amino-2-cyklopenten-l-methanol získat výhradně přes (±j-2-azobicyklo[2.2.1]hept-5-en-3-on substituovaný drahou BOD-chránicí skupinou (tercbutyloxykarbonylová chránící skupina) (J. Org. Chem., 1995, 60, 4602-4616).
Úkolem vynálezu bylo poskytnout jednoduchý, výhodný a hospodárnější způsob výroby enantiomeru derivátu (1R,4S)- nebo (lS,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu a enantiomer (1 R,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je způsob výroby opticky aktivních enantiomerů derivátu (1R,4S)- nebo (lS,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu obecných vzorců XVI, XVII
(XVII), kde R1 znamená Ci^-alkyl, Cj^-alkoxy, aryl nebo aryloxy.
Tyto sloučeniny lze získat přeměnou derivátu cyklopentenu obecného vzorce V kde R1 znamená C| 4alkyl, C|.4alkoxy, aryl, nebo aryloxy pomoci mikroorganismu, který zužitkuje derivát cyklopentenu V, pomocí N-acetylaminoalkoholhydroláz nebo acyláz penicilinu G na (1R,4S)- nebo (lS,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten vzorců VI, VII no
(VII)
-1 CZ 297887 B6 přičemž posledně uvedená sloučenina se acyluje na sloučeninu vzorců XVI nebo XVII.
Dále se vynález týká enantiomeru (lR,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu vzorce XVIII
(XVIII).
Ci 4—alkyl může být substituovaný nebo nesubstituovaný. Pod pojmem substituovaný C| 4—alkyl se v následujícím rozumí C1 4 alky 1 substituovaný atomem halogenu. Jako atom halogenu lze použít F, Cl, Br nebo J. Jako příklady pro C|4—alkyl jsou methyl, ethyl, propyl, butyl, izobutyl, terc-butyl, izopropyl, chlormethyl, brommethyl, dichlormethyl, dibrommethyl. Výhodně se jako Ci^-alkyl používá methyl, ethyl, propyl, butyl, izobutyl nebo chlormethyl.
Jako Ci ^-alkoxy lze například použít methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, terc-butoxy nebo izobutoxy. Výhodně se jako Ci_4-alkoxy používá terc-butoxy.
Jako aryl se může například použít fenyl nebo benzyl, výhodně fenyl. Jako aryloxy se může například použít benzyloxy nebo fenoxy.
Pro biotransformaci jsou vhodné všechny mikroorganismy, které zužitkují derivát cyklopentenu obecného vzorce V jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku. Mikroorganismy lze izolovat ze vzorků půdy, kalu nebo odpadních vod za pomocí obvyklých mikrobiologických technik. Izolace mikroorganismů se uskutečňuje tak, že se pěstují obvyklým způsobem v živném médiu, které obsahuje deriváty cyklopentenu obecného vzorce V
kde R1 má uvedený význam,
-jako jediný zdroj uhlíku a dusíku
-jako jediný zdroj dusíku s vhodným zdrojem uhlíku nebo
-jakojediný zdroj uhlíku s vhodným zdrojem dusíku.
Jako derivát cyklopentenu obecného vzorce V jsou vhodné například: Ν-acetyl-, N-propionyl-, N-izobutyryl, N-terc-butoxykarbonyl-(N-BOC), N-butyryl nebo N-fenylacetyl-l-amino-4hydroxymethyl-2-cyklopenten.
Jako vhodný zdroj dusíku mohou mikroorganismy jako růstový substrát využívat amonium, nitráty, aminokyseliny nebo močoviny. Jako vhodné zdroje uhlíku mohou mikroorganismy využívat jako růstový substrát například cukr, cukerné alkoholy, C2-C4-karboxylové kyseliny nebo aminokyseliny. Jako cukr se mohou použít hexosy jako glukóza nebo pentosy. Jako cukerný alkohol lze například použít glycerin. Jako C2-C4-karboxylové kyseliny lze například použít kyselinu octovou nebo propionovou. Jako aminokyseliny lze například použít leucin, alanin, asparagin.
Jako selekční a růstové médium se mohou použít v oboru běžně užívaná média, jako například médium uvedené v tabulce 1 nebo „plné médium“ (médium obsahující extrakt kvasnic) jako například „Nutrient Yeast Broth“ (NYB), výhodně médium uvedené v tabulce 1.
-2CZ 297887 B6
Při pěstování a selekci se účelně indukují účinné enzymy mikroorganismů. Jako induktor enzymů se mohou použít deriváty cyklopentenu obecného vzorce V.
Obvykle se uskutečňuje pěstování a selekce při teplotě od 20 do 40 °C, výhodně od 30 do 38 °C a hodnotě pH mezi 5,5 a 8, výhodně mezi pH 6,8 a pH 7,8.
Účelně se provádí biotransformace s mikroorganismy, které zužitkují (lR,4S)-izomery derivátu cyklopentenu jako jediný zdroj uhlíku, jako jediný zdroj uhlíku a dusíku nebo jako jediný zdroj dusíku.
Výhodně se biotransformace provádí pomocí mikroorganismů rodu Alcaligenes/Bordetella, Rhodococcus, Arthrobacter, Alcaligenes, Agrobacterium/Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas nebo Gordona, zejména druhu alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Arhrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylózoxydans ssp. denitrificans HSZ17 (DSM 10329), Agrobacterium/rhizobium HSZ30, Bacillus sipmplex K2, Pseuromonas putioda K32 nebo Gordona sp. CB 100 (DSM 10687), jakož i s jejich funkčně ekvivalentními variantami a mutanty. Mikroorganismy DSM 10686 a 10687 byly uloženy 20.05. 1996, mikroorganismy DSM 10328 a DSM 10329 byly uloženy 06.11.1995, mikroorganismy DSM 11291 08.10.1996 a mikroorganismus DSM 11172 20.09.1996 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčný kultur GmbH, Mascheroderweg 1B, D38124 Braunschweig, podle Budapešťské úmluvy.
Pod výrazem „funkčně ekvivalentní varianty a mutanty“ se rozumějí mikroorganismy, které mají podstatně stejné vlastnosti a funkce jako původní mikroorganismy. Takové varianty mutanty mohou vzniknout náhodně, například UV-ozářením.
Taxonomický popis Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 11172) buněčná forma tyčinky šířka pm 0,5-0,6 délka pm 1,0-2,5 pohyblivost+ mrskání peritrich
Gram-reakcelyže 3%ním KOH+ aminpeptidáza (Cemy)+ sporyoxidáza+ kataláza+
ADH (alkoholdehydrogenáza)
NO2 z NO3 denitrifikace ureáza hydrolýza želatiny kyselina z (OF-test): glukózy fruktózy arabinózy adipátu+ kaprátu+ citrátu+ malátu+ mannitolu
-3 CZ 297887 B6
Taxonomický popis Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 106 86)
1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáří rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou lesklé částečně rozteklé, béžový s růžovým tónem, RAL 1001;
2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová
3. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové mikroorganismu Rhodococcus; určení délky řetězce kyseliny mykolové (C32-C44) a srovnání údajů s údaji zanesenými do databanky DSMkyselin mikolových ukázalo na velmi vysokou podobnost se vzorky kmenů Rhodococcus erythropolis (podobnost 0,588).
4. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.
5. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu byla zjištěna vysoká shodnost (100%) se sekvencemi specifických oblastí Rhodococcus erythropolis.
Výsledek identifikace je jednoznačný, neboť tři na sobě nezávislé kmeny (kyseliny mikolové, mastné kyseliny, 16S rDNA), přiřadily kmen druhu Rhodococcus erythropolis.
Taxonomický popis Gordona Sp. CB 100 (DSM 10687)
1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvení hyíy, které se ve stáří rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou světle oranžové, (RAL 2008);
2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová
3. Vzorek menachinonu: MK-9(H2) 100%;
4. Kyseliny mykolové: kyseliny mykolové mikroorganismu Gordona; určení délky řetězce kyseliny mikolové (C50-C60) se uskutečnilo pomocí vysokoteplotní plynové chromatografie. Tento vzorek odpovídá vzorku, jaký se nalézá u zástupců rodu Gordona.
5. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.
6. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu byla jištěna relativně nízká hmotnost (98,8%) se sekvencemi specifických oblastí Gordona rubropertincta.
Na základě předložených výsledků (menachinony, kyseliny mikolové, mastné kyseliny, 16S rDNA) lze izolát sice jednoznačně přiřadit rodu Gordona. Přiřazení ke známému druhu Gordona není možné na základě těchto výsledků. Je tedy třeba předpokládat, že se u kmenu DSM 10687 jedná o nový dosud nepopsaný druh rodu Gordona.
Taxonomický popis Alcaligenes xylózoxydans ssp. denitrificans HSZ 17 (DSM 10329)
Vlastnosti kmene buněčná forma tyčinky šířka pm 0,5-0,6 délka pm 1,5-3,0 pohyblivost+ mrskání peritrichin
Gram-reakcelyže 3%ním KOH+ aminopeptidáza (Cemy)+ sporyoxidáza+
-4CZ 297887 B6 kataláza růst anaerobně
SDH (alkoholdehydrogenáza)+
NO2 z NO3+ denitrifikace+ ureáza hydrolýza želatinyTween 80kyselina z (OF-test):
glukózy aerobněxylózy 80zužitkování substrátu glukózyfruktózyarabinózycitrátu+ malátu+ mannitoluTaxonomický popis Arthrobacter sp. HSZ5 (DSM 10328) charakteristika:
pohyblivost spory kataláza
Gram-pozitivní nepravidelné tyčinky s výrazným růstovým cyklem tyčinky-koky; striktně aerobní; žádná tvorba kyseliny nebo plynu z glukózy +
m&so-diaminopimelinová kyselina v buněčné stěně: ne peptidoglykanový typ: A3oc, L-Lys-LSer-L-Thr-L-Ala
podobnost sekvence 16S rDNA: sekvencování oblasti s největší variabilitou prokázáno jako nejvyšší hodnoty 98,2 % s Arthrobacter pascens, A. ramosus a A. oxydans
Taxonomický popis Agrobacterium/Rhizobium HSZ30 buněčná forma šířka pm délka pm Gram-reakce lyže 3%ním KOH aminopeptidáza spory oxidáza kataláza pohyblivost růst anaerobně nitrit z nitrátu denitrifikace pleomorfní tyčinky
0,6-1,0
1,5-3,0 +
+ +
+ +
-5CZ 297887 B6
ureáza +
hydrolýza želatiny -
kyselina z:
L-arabinózy +
galaktózy -
melezitózy -
fukózy +
arabitolu
mannitolu
erythritolu -
alkalizace lakmusového mléka: +
ketolaktóza -
Parciální sekvencování 16S rDNA prokázalo srovnatelně
rodů Agrobacteriu a Rhizobium. Jednoznačné přiřazení
těchto rodů není možné.
Taxonomický popis Bacillus simplex K2
buněčná forma tyčinky
šířka pm 0,8-1,0
délka pm 3,0-5,0
spory
elipsoidní -
kulaté -
sporangium -
kataláza +
anaerobní růst
VP reakce k.W.
maximální teplota
pozitivní růst při °C 40
negativní růst při °C 45
růst v
médium pH 5,7
NaCl 2 % +
5%
7%
10%
médiu s lysozymem +
kyselina z (ASS)
D-glukózy +
L-arabinózy +
D-xylózy
D-mannitu +
D-firuktózy +
plyn z fruktózy -
lecithináza -
hydrolýza škrobu +
želatiny +
kaseinu velké ca 96% podrobnosti k zástupcům k jednomu druhu popsanému v rámci
CZ 297887 B6
Tween 80 eskulinu zužitkování citrátu propionátu nitrit z nitrátu indol fenylalanindesamináza arginindihydroláza + + +
Analýza buněčných mastných kyselin potvrdila přiřazení k rodu Bacillus.
Parciální sekvencování 16S rDNA prokázala 100 % podobnost k Bacillus simplex.
Taxonomický popis Pseudomonas putida K32
Buněčná forma šířka μιη délka μιη pohyblivost mrskání Gram-reakce lyže 3%ním KOH aminopeptidáza spory oxidáza kataláza růst anaerobně pigmenty fluoreskující pyocyanin ADH nitrit z nitrátu denitrifikace tyčinky 0,8-0,9 l,5%,0 + polámí>l + + + + + +
ureáza hydrolýza želatiny zužitkování substrátu adipát citrát malát D-mandelát fenylacetát D-tartrát D-glukóza trehalóza mannitol benzoylformiát propylenglukol butylamin benzylamin tryptamin + + + + + + + +
acetamid + hippurát +
Profil buněčných mastných kyselin je typický pro Pseudomonas putida.
Parciální sekvencování 16S rDNA prokázala ca 98 % podobnost k Pseudomonas mondocina a Pseudomonas alcaligenes. Podobnost k Peudomonas putida byla 97,4 %.
Taxonomický popis Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291)
1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které se ve stáří rozpadají na tyčinky a koky, kolonie jsou mastné, světle červenooranžové RAL 2008;
2. Diagnostikovaná aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelinová;
3. Kyselina mykolové: kyseliny mykolové mikroorganismu Rhodococcus;
Určení délky řetězce kyseliny mykolové (C32-C44) a srovnání údajů se záznamu DSMZdatabanky mykolových kyselin prokázalo jen velmi malou podobnost ke vzorkům kmenů Rhodococcus ruber (podobnost, 0,019). Tento korelační faktor je příliš malý na to, aby mohl být použit pro identifikaci druhu.
4. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené, nenasycené a nenasycené mastné kyseliny plus kyselina tuberkulostearinová.
Tento vzorek mastných kyselin je diagnostický pro všechny zástupce rodu Rhodococcus a jejich blízké příbuzné jako Mycobakterium, Nocardia a Gordona. Byl učiněn pokus o diferenciaci druhu při zohlednění kvalitativních a kvantitativních rozdílů ve vzorku mastných kyselin. Pomocí numerických metod se vzorek mastných kyselin z Rhodococcus sp. FB 387 srovnal se záznamy databanky. Také pomocí této metody se nemohl Rhodococcus sp. FB 387 z důvodu malé podobnosti (0,063) přiřadit k žádnému popsanému druhu Rhodococcus.
5. Při parciálním sekvencování 16S rDNA kmenu bylo přiřazeno 96-818 s 97,9% korelaci Rhodococcus opacus. Tato schopnost sekvence je hodně pod 99,5 %, jak se požaduje pro jednoznačné přiřazení k druhu v tomto taxonu.
Na základě předložených výsledků je možné vycházet z toho, že se u kmene Rhodococcus sp. FB 387 jedná o nový dosud nepopsaný druh.
Biotransformace se může provádět po obvyklém pěstování těchto mikroorganismů s buňkami v klidu (nerostoucí buňky, které již nepotřebují žádné zdroj uhlíku a energie) nebo s rostoucími buňkami. Výhodně se biotransformace provádí s buňkami v klidu.
Enzymy s N-acetylaminoalkoholhydrolázovou aktivitou vhodné pro biotransformaci lze například izolovat v oboru běžným způsobem otevření popsaných buněk mikroorganismů. K tomu se může například použít metody s ultrazvukem nebo Frenschovu tlakovou metodu. Výhodně se tyto enzymy izolují z mikroorganismů Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686).
Vhodné acylázy penicilinu G se získají z mnoha mikroorganismů, například z bakterií nebo aktinomycetenů, zvláště z následujících mikroorganismů: Escherichia coli ATCC 9637, Bacillus megaterium, Streptomyces lavendulae ATCC 13664, Nocardia sp. ATCC 13635, Providencia rettgeri ATCC 9918, Arthrobacte viscosus ATCC 15294, Rhodococcus fascians ATCC 12975, Streptomyces phaeochromogenes ATCC 21289, Achromobacter ATCC 23584 a Micrococcus roseus ATCC 416. Zejména se používají obchodně dostupné acylázy penicilinu G jako acyláza EC 3.5.1.11 penicilinu G z E. coli (Boehring Mannheim) nebo z Bacillus megaterium. Ve výhodném provedení se používají imobilizované acylázy penicilinu G.
-8CZ 297887 B6
Biotransformace se může provádět v médiích známých v oboru, jako například v nízkomolámích fosfátových, citrátových nebo Hepes-pufrech, ve vodě, v úplných médiích jako například „Nutrient Yeath“ (NYB) nebo v médiích popsaných v tabulce 1. Výhodně se biotransformace provádí v médiu uvedeném v tabulce 1 nebo nízkomolámím fosfátovém pufru.
Účelně se biotransformace provádí za jednorázového nebo kontinuálních přidávání derivátu cyklopentenu (vzorec V) tak, že koncentrace nepřesáhne 10 % hmotn., výhodně 2 % hmotn.
Hodnota pH během biotransformace může být v rozmezí od 5 do 9, výhodně od 6 do 8. Účelně se biotransformace provádí při teplotě od 20 do 40 °C, výhodně od 25 do 30 °C.
Acylaci je možné uskutečnit s halogenidem karboxylové kyseliny obecného vzorce XI
(xi), nebo anhydridem karboxylové kyseliny obecného vzorce XII
O o
II II c C / \ / \ 1 O R1 (XII),
kde R1 má uvedený význam a x znamená atom halogenu. Jako atom halogenu X se mohou použít F, Cl, Br nebo J. Výhodně se používají Cl nebo F.
Příklady pro halogenidy karboxylových kyselin jsou: acetylchlorid, chloracetylchlorid, chlorid kyseliny máselné, chlorid kyseliny izomáselné, chlorid kyseliny fenyloctové, benzylester kyseliny chlormravenčí (Cbz-Cl), chlorid kyseliny propionové, benzoylchlorid, allylester kyseliny chlormravenčí nebo terc.butyloxykarbonylfluorid. Příklady pro anhydridy karboxylových kyselin jsou: terc-butoxykarbonylanhydrid. anhydrid kyseliny máselné, anhydrid kyseliny octové nebo anhydrid kyseliny propionové.
Acylaci lze provést bez rozpouštědla nebo s aprotickým rozpouštědlem. Účelně se acylace provádí v aprotickém rozpouštědle. Jako aprotické rozpouštědlo jsou vhodné například diizopropylether, pyridin, acetonitril, dimethylformamid, triethylamin, tetrahydrofuran, toluen, methylenchlorid, N-methylpyrrolidon, popřípadě jejich směsi.
Účelně se acylace provádí při teplotě od 20 do 100 °C, výhodně od 0 do 80 °C.
Příklady opticky aktivních sloučenin, které se vyrábějí podle tohoto způsobu jsou: (lR,4S)-N-terc-butoxykarbonyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten s hodnotou ee 98 %.
(lR,4S)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten s hodnotou ee 98 %, (1R,4S)—N—butyryl—1—amino—4—(hydroxymethyl)—2—cyklopenten s hodnotou ee 98 %, opticky aktivní (lS,4R)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten a opticky aktivní (1 S,4R)-N-butyiyl-l -amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten.
-9CZ 297887 B6
Z těchto sloučenin není ještě v literatuře popsaná opticky aktivní sloučenina (IR, 4S)-N-butyl-lamino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten. Součástí vynálezu je proto také opticky aktivní (lR,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten svíce než 0% enantiomemí přebytek, výhodně v nejméně 80 %, 90 % nebo 95 % enantiomemím přebytku, obzvláště v nejméně 98 % enantiomemím přebytku. Tyto opticky aktivní sloučeniny se mohou racemizovat v oboru známým způsobem na racemický N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Výroba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu pomocí acyláz penicilinu G
Pro biotransformaci se použila acyláza EC 3.5.1.11 penicilinu G z E. coli (Boehring Mannheim) 165 U (jednotek)/g nebo acyláza EC 3.5.1.11 penicilinu G zBacillus megaterium. Ktomu se inkubovalo 50mM pufru fosforečnanu sodného (pH 5-9; 4 ml); s 1 % hmotn. neracemického Nfenylacetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a 400 mg odpovídající acylázy penicilinu G při 37 °C.
Po určitých časových intervalech se odebíraly vzorky a analyzovaly pomocí tenkovrstevné chromatografie (křemičitanový gel 60, butanol:voda:ledová kys. octová=3:1:1; detekce ninhydrinem), plynové chromatografíe (kapilární sloupec, HP-5,5 % fenylmethylsiloxanu) nebo pomocí HPLC. Enzym odštěpil s vysokou aktivitou fenacetylovou skupinu a uvolnil až 40% odpovídajícího aminoalkoholu. Volný aminoalkohol se získá s ee-hodnotou 80 %.
Příklad 2
Výroba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu pomocí mikroorganismů
2.1 Kal (20%) z čističky ARA ve Visp se inkuboval vA+N médiu (viz tabulka 1), které obsahovalo 0,5 % hmotn. Ν-acetyl-, N-propionyl-, Ν-izobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu, při 37 °C za třepání. Tvorba (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu se sledovala pomocí tenkovrstevné chromatografíe.
% těchto obohacených vzorků se l-3x přeočkovalo a jednotlivě naneslo na pevná média (Plate Count Agar v mediu z tabulky 1; 20 g/1). Tímto způsobem se izolovaly mikroorganismy Alcaligenes/Bordetella FB 188 (DSM 1172), Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686), Gordona sp. CB 100 (DSM 10687) a Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291).
2.2 Takto izolované mikroorganismy se pěstovaly v médiu (tabulka 1), které obsahovalo 0,5 % Ν-acetyl-, N-propionyl-, Ν-izobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu. Rostly 24 až 36 hodin až k optické hustotě (OD) od 2 do 3. Takto získané buňky se sebraly v pozdně exponenciální růstové fázi a promyly v 10 mM fosfátovém pufru.
Následující biotransformace se provedla v 50 mM fosfátovém pufru (pH 4,5-9), který obsahoval 1 % hmotn. N-acetyl-, Ν-izobutyryl-, nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu. Tenko vršte vnou chromatografíi se zjistilo, že 50 % substrátu bylo hydrolyzována na (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten. HPLC analýzy udaly ee-hodnoty mezi 80 a 93 %.
Jestliže se jako substrát použil N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, byla biotransformace 0,14 (g/l/h/OD) pro kmen DSM 10686, když se pěstovalo na A+N médiu a
CZ 297887 B6
0,03 (g/l/h/OD), když se pěstovalo na NYB („Nutrient Yaest Broth“) médiu, které obsahovalo Nbutyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.
Jestliže se provedla stejná přeměna s kmenem DSM 10687 při koncentraci substrátu (N-butyryll-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten) 200 mM, byla biotransformace 0,161 (g/l/h/OD).
Tabulka 1 médium A + N
MgCl2 CaCl2 FeCl3 Na2SO4 KH2PO4 Na2HPO4 NaCl roztok vitaminů roztok stupových prvků pH 7,5 0,4 g/1 0,014 g/1 0,8 mg/1 0,1 g/1 I g/1 2,5 g/1 3 g/1 1 ml/1 1 ml/1
2.3 Rhodococcus eiytropolis DSM 10686 se pěstoval v 6 ml fermentoru v minimálním médiu (srovnej tabulku 2) s octanem amonným (3 g/1) jako zdroj uhlíku, popřípadě dusíku při 30 °C do buněčné hustoty OD 650>25. Během buněčného růstu se kontinuálně přidávalo 50 % kyselina octová jako dodatečný zdroj uhlíku. Pro indukování enzymové aktivity se pak přidalo 60 g (+/-)N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a inkubovalo několik hodin. Nakonec se ještě jednou přidalo 40 g (±)-N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a pak dalších deset hodin inkubovalo. Průběh biotranformace se sledoval on-line pomocí HPLC. Při dosažení 40 % analytického výtěžku, vztaženo na vnesený racemický substrát, a ee-hodnoty 85 % se fermentace ukončila přidáním kyseliny.
Tabulka 2 složení média
Komponenty extrakt kvasnic pepton M66 KH2PO4 Na2HPO4.2H2O K2SO4 NHi-acetát CaCl2 MgCl2.6 H2O roztok stopových prvků (viz dole) PPG (polypropylenglykol) Koncentrace 0,5 g/1 0,5 g/1 4,0 g/1 0,5 g/1 2,0 g/1 3,0 g/1 0,2 g/1 1,0 g/1 1,5 ml/1 0,1 g/1
Roztok stopových prvků KOH EDTA . Na2.2H2O ZnSO4.7H2O MnCl2.4H2O h3bo3 CoC12.6H2O CuC12.2H2O 15,1 g/1 100,0 g/1 9,0 g/1 4,0 g/1 2.7 g/1 1.8 g/1 1,5 g/1
- 11 CZ 297887 B6
NiCl2.6H2O 0,18 g/1
Na2MoO4.2H2O 0,27 g/1
2.4 Podobně jako v příkladu 2.3 se pěstovaly mikroorganismy Arthobacter sp. HSZ 5 (DSM 10328), Rhodococcus sp. FB 387 (DSM 11291), Alcaligenes xylózoxydans ssp denitrificans HSZ 17 (DSM 10329), Agrobacterim/Rhizobium HSZ 30, Bacillus simplex K2 a Pseudomonas putioda K32 na octanu sodném v médiu (tabulka 1) se sloučeninami a bez sloučenin N-acetyl-, Ν-propionyl-, N-izobutyryl nebo N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, v dalším zkráceně označené jako aminoalkoholy.
Následující výsledky se dosáhly s exponenciálními buňkami, které se pěstovaly bez aminoalkoholů (analyzováno HPLC):
Kmen
HSZ 5 (DSM 10328)
HSZ 17 (DSM 10329)
K32
CB101 (DSM 10686)
Poměr v procentech [nMol/OD.h]
0,05
0,005
0,05
0,1
Hodnota ee/přeměna [%]
88,7/16
95/23
54/1
84/39
Kmeny K2 a K17 se pěstovaly, sebraly a podrobily se 60-hodinové biotransformaci.
Kmen
Poměr v procentech [mMol/OD.h]
K2
HSZ 30
Hodnota ee/přeměna [%]
92/10
93/3,5
Ze všech násad se sebraly exponenciální a stacionární buňky a použily se pro biotransformaci jako buňky v klidu. Na základě DC-analýzy se nepozoroval žádný rozdíl v počátečním poměru u buněk indukovaných nebo neindukovaných aminoalkoholem.
Příklad 3
Čištění N-acetylaminoalkoholhydrolázy z Rhodococcus eiythropolic CB101 (DSM 10686)
Enzym byl čištěn jak je dále uvedeno až byl pozorován už jen jeden svazek proteinů v SDSPAGE (Pharmacia Phast Gel, 10-15 % gradient) při molekulové hmotnosti 50 kD.
Buňky Rhodococcus erythropolis CB101 (DSM 10686) se promyly v 50 mM Tris-pufru (pH 6,2) a koncentrovaly na optickou hustotu 190 při OD650nm· Po přidání fenylmethansulfonylfluoridu (PMSF) na konečnou koncentraci 1 mM a DNAzy se buňky podrobily Frenchovu lisu (tlakové zařízení), aby se získal surový extrakt. Po odstředění se získalo 200 ml bezbuněčného extraktu s koncentrací proteinů 4,8 mg ml'1.
960 mg bezbuněčného extraktu se naneslo na iontoměničový chromatografícký sloupec HiLoad 26/10 Q-Sepharose (Pharmacia), který byl ekvilibrován 50 mM Tris-pufrem (pH 8,0), který obsahoval 1 mM dithiothreitolu (DTT).
Po promytí sloupce stejným pufrem byly proteiny eluovány lineárním gradientem pufru (1500 ml; gradien: 50 mM Tris-pufr (pH 8,0), obsahující 1 mM DTT- 50mM Tris-pufr (pH 7,0), obsahující 1 mM DTT a 1 M NaCl). Enzym se eluoval ze sloupce mezi 370 a 430 mM NaCl a při pH 7,6. Aktivní frakce se sbíraly a zahustily na 9 ml. Obsah proteinů byl 41 mg.
Pro další čištění se roztok proteinů nanesl na gelověfíltrační chromatografícký sloupec HiLoad 26/60 Superdex 75 (Pharmacia), který byl ekvilibrován 50 mM Tris-pufrem, který obsahoval 50 mM NaCl a 1 mM DTT. Aktivní frakce se spojily a měly společný obsah proteinů 10,9 mg.
- 12CZ 297887 B6
Tento proteinový roztok se nanesl na sloupec Mono Q HR5/5 (Pharmacia), který byl ekvilibrován mM Tris-pufrem (pH 8,5) obsahujícím 1 mM DDT. Proteiny byly eluovány lineárním gradientem (40 ml) 50 mM Tris-pufr (pH 8,5), obsahující 1 mM DTT - 50 mM Tris-pufr (pH 8,5), obsahující 1 mM DTT a 1 M NaCI. Enzym se eluoval mezi 390 mM NaCI a 440 mM NaCI.
Aktivní frakce obsahovaly 1,4 mg proteinu.
V posledním čisticím kroku se použil stejný sloupec ekvilibrovaný stejným pufrem. Jako eluční gradient sloužil stejný pufr s 0-500 mM NaCI a pH 7,0-8,5. Tímto způsobem se dalo izolovat 430 pg čistého enzymu.
N-koncová sekvence enzymu se určila přímo z „Protein-Blot“. Získala se sekvence 20 následujících aminokyselin: Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-AlaSer-V al-Ala-Ser-Asn.
Tato sekvence není homologní ke známým proteinů.
Příklad 4
Charakterizace enzymu
Charakterizace enzymu se prováděla jak s čištěným enzymem, tak také s bezbuněčným extraktem, který byl odsolen pomocí sloupce Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia).
Koncentrace proteinů v bezbuněčném extraktu byl 7,3 mg ml'1 a koncentrace proteinů v čištěném enzymu byla 135 pg ml’1. PMSF se k bezbuněčnému extraktu nepřidával.
4.1 Určení Km
Určení Km se provedlo v bezbuněčném extraktu. Hodnota Km reakce byla při pH 7,0 a při teplotě 30 °C 22,5 mM pro substrát N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.
4.2 pH optimum pH optimum pro hydrolýzu N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu (25 mM) se určovalo s čištěným enzymem a v bezbuněčném extraktu v rozsahu pH od 6,2 - 9,0 v následujících roztocích pufru.
Tris-pufr 100 mM pH 9,0; 8,5; 8,0; 7,5; 7,0 citrát-fosfátový pufr 100 mM pH 7,0; 6,55; 6,2
Aktivita se měřila 24 hodin.
pH optimum reakce bylo mezi pH 7,0 a 7,5 pro produkci 1R,4S a 1S,4R enantiomeru.
U bezbuněčného extraktu bylo pH optimum aktivity při pH 7,0. Selektivita byl avšak lepší mezi pH 6,0 a pH 7,0
Obr. 1 znázorňuje aktivitu A-acetylaminoalkoholhydrolázy (bezbuněčné extrakt) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) v závislosti na hodnotě pH.
4.3 Teplotní optimum pro reakci uvedenou v příkladu 16.2 leželo mezi 25 a 30 °C.
Obr. 2 znázorňuje aktivitu A-acetylaminoalkoholhydrolázy (bezbuněčný extrakt) z Rhodococcus erythropolis CB 101 (DSM 10686) v závislosti na teplotě.
4.4. Molekulová hmotnost byla určena podle SDS-PAGE na 50 kD.
4.5 Jako substráty byly hydrolyzovány: N-acetyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-butyryl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-propionyl-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-izobutyryl-1 -amino—4-hydroxymethyl-2-cyklopenten, N-izobuty 1l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopenten.
- 13 CZ 297887 B6
Příklad 5
Výroba hydrochloridu (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)—2-cyklopentenu
374,1 g roztoku (lR,4S)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu (obdobná výroba jako v příkladu 14) se odpařilo na 123,7 g. Roztok obsahoval 60,2 mMol hořejší sloučeniny (HPLC) a pH se upravilo 30%ním NaOH z hodnoty 2 na 11,7, pak se extrahoval 3x 70 ml izobutanolu. Spojené izobutanolové extrakty se plynným HC1 upravily na pH 1, zahustily na 65 g filtrovaly (odstranění pevných nečistot). K filtrátu se při 20 °C a při dobrém míchání přikapalo 60 ml acetonu. Kalná směs se naočkovávala krystaly titulní sloučeniny a míchala 1 hod. při 5 °C. Po filtraci a sušení se získalo 5,2 g produktu. Výtěžek byl 58 %.
t.t.: 125 až 127 °C.
ee-hodnota 98 % (cejchovaný chirální HPLC-sloupec)
Ή-NMR (DMSO-d6): δ [ppm]
400 MHz
1,44 (m, 1H);
2,35 (m, 1H);
2,83 (m, 1H);
3,42 (m, 2H);
4,10 (s,lH);
4.80 (s, 1H);
5.80 (d, 1H);
6,06 (d, 1H);
8,13 (s, 3H).
Příklad 6
Výroba (lR,4S)-N-BOC-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu pH75g roztoku (ÍR,4S)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu (obdobná výroba jako v příkladu 14; 44,6 mMol sloučenin) se upravilo 30%ním NaOH na hodnotu 8 a k roztoku se přidalo 6 g NaHCO3. Směs se zahřála na 52 °C. Za dobrého míchání se k tomu přidalo 60 ml diizopropyletheru a pak během 2 hod. přidával roztok 11,12 g BOC-anhydridu v 18,2 ml diizopropyletheru. Směs se filtrovala přes Celíte a fáze se oddělily. Vodná fáze se extrahovala 65 ml diizopropyletheru. Spojené organické fáze se promyly 45 ml vody, pak se odpařily na 37,5 g a zahřály na 50 °C. K roztoku se přikapalo 31 ml n-hexanu. Po pomalém ochlazení na 0 °C (2 hod.) se titulní sloučenina filtrovala, promyla 12 ml n-hexan/diizopropylether 1/1 a sušila. Získalo se 6,75 g produktu. Výtěžek byl 71 %.
t.t.: 70 až 71 °C ee-hodnota 98 % (cejchovaný chirální HPLC-sloupec)
Ή-NMR (DMSO-d6): δ [ppm] 400 MHz 1,18 (m, 1H); 1.27 (m, 9H); 2.28 (m, 1H); 2,63 (m, 1H); 3,33 (q, 2H); 4,43 (m, 1H); 4,56 (t, 1H); 5,62 (m, 1H); 5,78 (m, 1H); 6,72 (d, 1H).
- 14CZ 297887 B6
Příklad 7
Výroba hydrochloridu (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
87,8 g (lR,4S)-N-BOC-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu se rozpustilo ve 270 ml 2N NC1 a 1340 ml methanolu. Směs se při zpětném toku vařila 4,5 hodiny. Po destilaci methanolu se zbytek rozpustil v 800 ml vody. Vodný roztok se 2x extrahoval 340 ml ethylacetátu. Vodná fáze se úplně odpařila (50°C/6 kPa). Pevná látka se sušila ve vakuu při 50 °C, suspendovala 150 ml diethyletheru, filtrovala a 2x promyla 50 ml diethyletheru. Po sušení se získala titulní sloučenina s 95 % výtěžkem (58,4 g).
Fyzikální a spektroskopická data produktu byla stejná jako v příkladu 5.
Příklad 8
Výroba (1 R,4S)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu g hydrochloridu (lR,4S)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu se rozpustilo v 182 ml anhydridu kyseliny octové a při 0 °C se přidal roztok 18,25 g triethylaminu v 60 ml anhydridu kyseliny octové. Směs se míchala 3 hodiny při 80 °C, pak se ochladila na teplotu místnosti. Triethylaminhydrochlorid se odfiltroval a promyl 120 ml n-hexanu. Filtrát se odpařil. Ke zbytku se přidalo 300 ml toluenu a při teplotě místnosti v přítomnosti 5,2 g aktivního uhlí a 13 g Celitu se 20 minut míchalo. Po filtraci a promytí filtračního koláče (3x 40 ml toluenu) se rozpouštědlo úplně zahustilo. Ke zbytku se přidalo 180 ml methanolu a 15,5 g K2CO3 a míchalo se 10 hodin při pokojové teplotě. Suspenze se filtrovala a filtrát se odpařil. Zbytek se suspendoval v 750 ml izopropylacetátu a vařilo se 1,5 hodiny při zpětném toku v přítomnosti 0,5 g aktivního uhlí. Po filtrování aktivního uhlí (70 až 80 °C) se filtrát přes noc chladil na 0 °C. Titulní sloučenina se filtrovala, promyla 80 ml studeného izopropylacetátu a sušila za vakua. Získalo se 17,2 g produktu. Výtěžek byl 66 %.
t.t.: 77 až 80 °C ee-hodnota 98 % (cejchovaný chirální HPLC-sloupec) 'H-NMR (DMSO-d6): δ [ppm] 1,15 (m, 1H);
400 MHz 1,78 (m,lH);
2,25 (m, IH);
2,66 (m, IH);
3,35 (m, 2H);
4,58 (t, IH);
4,70 (m, IH);
5,62 (m, IH);
5,85 (m, IH);
7,80 (d, IH).
Příklad 9
Výroba (1 S,4R)-N-acetyl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
Z 25 g výchozího hydrochloridu (lS,4R)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu se způsobem podle příkladu 18 vyrobil titulní enantiomer (výtěžek 68 %). Fyzikální a spektroskopická data produktu byla stejně jako v příkladu 8.
- 15 CZ 297887 B6
Příklad 10
Výroba (1 R,4S)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
34,7 g hydrochloridu (lR,4S)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu a 2 g 4-N,N-dimethylaminopyridinu se rozpustilo v 600 ml methylenchloridu. Roztok se ochladil na 0 °C. Pak se přikapalo 52 g triethylaminu (5 min.). Směs se ještě 30 min. dále míchala. Ke směsi se při 0 °C 1 hodinu přidával roztok 35,2 g butyrylchloridu v 60 ml methylenchloridu. Směs se ještě dále míchala 1,5 hodiny mezi 0 až 20 °C, pak se přidalo 600 ml vody. Po rozdělení fází se vodná fáze extrahovala 600 ml methylenchloridu. Spojené organické fáze se 3x promyly pokaždé 50 ml 10 % NaOH, pak úplně odpařily. Suchá pevná látka se rozpustila ve 120 ml methanolu. K roztoku se přidalo 5 g K2CO3 při teplotě místnosti se dále míchalo 2 hodiny. Anorganické soli se odfiltrovaly a promyly 20 ml methanolu. Filtrát se neutralizoval 2N HC1. Suspenze se odfiltrovala a filtrační koláč se promyl 20 ml methanolu. Filtrát se úplně odpařil. Pevný zbytek se sušil a krystalizoval ve 150 ml toluenu. Získalo se 28,5 g titulní sloučeniny. Výtěžek byl 67 %.
t.t.: 71 až 72 °C ee-hodnota 98 % (cejchovaný chirální HPLC-sloupec) ’Η-NMR (DMSO-d6): δ [ppm]
400 MHz
0,85 (m, 3H);
1,15 (m, 1H);
1,50 (q, 2H);
2,03 (d, 2H);
2,28 (m, 1H);
2,67 (m, 1H);
3,35 (d, 2H);
4.62 (s, 1H);
4.76 (m, 1H);
5.63 (m, 1H);
5,85 (m, 1H);
7.77 (d, 1H);
Příklad 11
Výroba (1 S,4R)-N-butyryl-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
Z 34,7 g hydrochloridu (lS,4R)-l-amino-4-hydroxymethyl-2-cyklopentenu jako výchozí sloučeniny se způsobem podle příkladu 10 vyrobil titulní enantiomer (výtěžek 63%). Fyzikální s spektroskopická data produktu byla stejná jako v příkladu 10.
-16CZ 297887 B6

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob výroby enantiomeru derivátu (1R,4S)~ nebo (1 S,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-
  2. 2-cyklopentenu obecných vzorců XVI, XVII
    110
    HO kde R1 znamená CA-alkyl, C| 4-alkoxy, aryl nebo aryloxy, vyznačující se tím, že se v prvním stupni přeměňuje derivát cyklopentenu obecného vzorce V
    HO kde R1 má výše uvedený význam, pomocí mikroorganismu, který je schopný zužitkovat derivát cyklopentenu obecného vzorce V jako jediný zdroj dusíku, jako jediný zdroj uhlíku, nebo jako jediný zdroj uhlíku a dusíku, pomocí enzymu sN-acetylaminoalkoholhydrolázovou aktivitou nebo pomocí acylázy penicilinu G na (1R,4S)- nebo (lS,4R)-l-amino-4-(hydroxymethyl)-2cyklopenten vzorců VI, VII no (VI) nebo 110 (VII) a ten se ve druhém stupni acyluje na sloučeninu obecného vzorce XVI nebo XVII.
    2. Enantiomer (1 R,4S)-N-butyryl-I-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu vzorce XVIII
    HO (XVIII) s více než 0 % enantiomemím přebytkem, který se získá způsobem podle nároku 1.
  3. 3. Enantiomer podle nároku 2, v nejméně 80 % enantiomemím přebytku, který se získá způsobem podle nároku 1.
  4. 4. Enantiomer podle nároku 2, v nejméně 90 % enantiomemím přebytku, který se získá způsobem podle nároku 1.
  5. 5. Enantiomer podle nároku 2, v nejméně 95 % enantiomemím přebytku, který se získá způsobem podle nároku 1.
  6. 6. Enantiomer podle nároku 2, v nejméně 98 % enantiomemím přebytku, který se získá způsobem podle nároku 1.
CZ20060694A 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby enantiomeru derivátu (1R, 4S)- nebo(1S, 4R)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenua enantiomer (1R, 4S)-N-butyryl-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten CZ297887B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH111697 1997-05-13
CH274097 1997-11-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ297887B6 true CZ297887B6 (cs) 2007-04-18

Family

ID=25686703

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20060695A CZ297888B6 (cs) 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby racemického nebo opticky aktivního derivátu 4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu
CZ20060694A CZ297887B6 (cs) 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby enantiomeru derivátu (1R, 4S)- nebo(1S, 4R)-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenua enantiomer (1R, 4S)-N-butyryl-1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyklopenten
CZ0145898A CZ297894B6 (cs) 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby (1S,4R)- nebo (1R,4S)-4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-1-methanolu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20060695A CZ297888B6 (cs) 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby racemického nebo opticky aktivního derivátu 4-(hydroxymethyl)-2-cyklopentenu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0145898A CZ297894B6 (cs) 1997-05-13 1998-05-11 Zpusob výroby (1S,4R)- nebo (1R,4S)-4-(2-amino-6-chlor-9-H-purin-9-yl)-2-cyklopenten-1-methanolu

Country Status (16)

Country Link
US (4) US6156893A (cs)
EP (2) EP0878548B1 (cs)
JP (3) JP4540136B2 (cs)
KR (2) KR100577886B1 (cs)
CN (2) CN1115343C (cs)
AT (1) ATE275206T1 (cs)
CA (1) CA2237297C (cs)
CZ (3) CZ297888B6 (cs)
DE (1) DE59811884D1 (cs)
DK (1) DK0878548T3 (cs)
ES (1) ES2223095T3 (cs)
HU (1) HU226327B1 (cs)
NO (1) NO324679B1 (cs)
PL (1) PL197848B1 (cs)
PT (1) PT878548E (cs)
SK (3) SK285229B6 (cs)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69402548T2 (de) * 1993-06-21 1997-07-17 Merrell Pharma Inc Carbocyclische nucleoside mittel nützlich als selektive inhibitoren von proinflammatorischen cytokinen
GB9717928D0 (en) * 1997-08-22 1997-10-29 Glaxo Group Ltd Process for the enatioselective hydrolysis of n-derivatised lactams
GB9721780D0 (en) * 1997-10-14 1997-12-10 Glaxo Group Ltd Process for the synthesis of chloropurine intermediates
CZ298102B6 (cs) * 1997-11-27 2007-06-20 Lonza Ag Zpusob výroby aminoalkoholu
SK285795B6 (sk) * 1998-12-23 2007-08-02 Lonza Ag Spôsob výroby enantiomérne obohatených derivátov 1-amino-4-(hydroxymetyl)-cyklopent-2-énu
ES2284029T5 (es) * 2003-07-25 2012-02-17 Prometic Biosciences Inc. Preparación de sales metálicas de ácidos grasos de cadena media.
DE102005061756B4 (de) 2005-12-21 2008-01-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Ramipril
US8236853B1 (en) 2007-12-03 2012-08-07 University Of South Florida Formation of cyclopentene nitro-ester and derivatives
WO2012099904A1 (en) 2011-01-18 2012-07-26 General Atomics Hydrolase enzyme substrates and uses thereof
CN102557990B (zh) * 2011-04-25 2014-06-25 开原亨泰制药股份有限公司 (1s,4r)n-叔丁氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1-羧酸甲酯的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0590685A1 (en) * 1992-10-02 1994-04-06 Kuraray Co., Ltd. Process for optical resolution of (+)-cis-4-aminocyclopent-2-en-1-carboxylic acid derivative
WO1997045529A1 (de) * 1996-05-30 1997-12-04 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von aminoalkoholen und derivaten davon

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4931559A (en) * 1988-01-20 1990-06-05 Regents Of The University Of Minnesota Optically-active isomers of dideoxycarbocyclic nucleosides
US4950758A (en) * 1988-01-20 1990-08-21 Regents Of The University Of Minnesota Optically-active isomers of dideoxycarbocyclic nucleosides
MY104575A (en) * 1989-12-22 1994-04-30 The Wellcome Foundation Ltd Therapeutic nucleosides.
CA2055086A1 (en) * 1991-02-12 1992-08-13 Chikara Kaneko Cyclopentene derivatives and their use
US5200527A (en) * 1991-04-08 1993-04-06 Lonza Ltd. Process for the production of 2-azabicyclo [2.2.1] hept-5-en-3-one
GB9204015D0 (en) * 1992-02-25 1992-04-08 Wellcome Found Therapeutic nucleosides
GB9205071D0 (en) * 1992-03-09 1992-04-22 Wellcome Found Therapeutic nucleosides
GB9217823D0 (en) * 1992-08-21 1992-10-07 Glaxo Group Ltd Chemical process
GB9402161D0 (en) * 1994-02-04 1994-03-30 Wellcome Found Chloropyrimidine intermediates
GB9625455D0 (en) * 1996-12-07 1997-01-22 Glaxo Group Ltd Process for resolving mixtures of carbocyclic steroisomers

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0590685A1 (en) * 1992-10-02 1994-04-06 Kuraray Co., Ltd. Process for optical resolution of (+)-cis-4-aminocyclopent-2-en-1-carboxylic acid derivative
WO1997045529A1 (de) * 1996-05-30 1997-12-04 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von aminoalkoholen und derivaten davon

Also Published As

Publication number Publication date
EP0878548A3 (de) 1999-10-13
PL326267A1 (en) 1998-11-23
SK284810B6 (sk) 2005-12-01
CA2237297C (en) 2008-03-11
JPH115793A (ja) 1999-01-12
JP2010106025A (ja) 2010-05-13
US6252112B1 (en) 2001-06-26
EP0878548A2 (de) 1998-11-18
US6137007A (en) 2000-10-24
CZ297888B6 (cs) 2007-04-18
HU226327B1 (en) 2008-08-28
NO982149D0 (no) 1998-05-12
DK0878548T3 (da) 2004-12-06
JP2010116397A (ja) 2010-05-27
SK58998A3 (en) 1998-12-02
PT878548E (pt) 2005-01-31
ATE275206T1 (de) 2004-09-15
US6156893A (en) 2000-12-05
NO324679B1 (no) 2007-12-03
PL197848B1 (pl) 2008-05-30
CN1515673A (zh) 2004-07-28
KR100601764B1 (ko) 2006-07-19
KR100577886B1 (ko) 2006-08-30
CN1115343C (zh) 2003-07-23
US6262295B1 (en) 2001-07-17
NO982149L (no) 1998-11-16
SK285228B6 (sk) 2006-09-07
EP0878548B1 (de) 2004-09-01
JP4540136B2 (ja) 2010-09-08
HUP9801083A2 (hu) 1999-11-29
KR19980086933A (ko) 1998-12-05
HK1092782A1 (en) 2007-02-16
CZ145898A3 (cs) 1998-12-16
HUP9801083A3 (en) 2001-09-28
CN1302116C (zh) 2007-02-28
HU9801083D0 (en) 1998-07-28
CA2237297A1 (en) 1998-11-13
ES2223095T3 (es) 2005-02-16
DE59811884D1 (de) 2004-10-07
EP1502914A1 (de) 2005-02-02
SK285229B6 (sk) 2006-09-07
CN1201794A (zh) 1998-12-16
CZ297894B6 (cs) 2007-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2010106025A (ja) (1s,4r)−または(1r,4s)−4−(2−アミノ−6−クロロ−9h−プリン−9−イル)−2−シクロペンテン−1−メタノールの製造方法
US7405065B2 (en) Enzyme for the preparation of 1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyclopentene derivatives
US20020037559A1 (en) Process for producing n-protected d-proline derivatives
KR100562734B1 (ko) 아미노 알코올 및 그의 유도체의 제조방법
JP2001506500A (ja) D−プロリン誘導体を調製する方法
HK1092782B (en) Process for preparing racimatic of optically active 4-(hydroxymethyl)-2-cyclopentene derivative
HK1072933A (en) Process for the preparation of 1-amino-4-(hydroxymethyl)-2-cyclopentene derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20120511