HU221201B1

HU221201B1 - Process for producing 1,2,4-benzotriazin-oxide derivatives applicable as radiation sensitizer and selective cytotoxic agent, and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU221201B1
Application number: HU9200873A
Authority: HU
Inventors: Martin J Brown; Edvard W Grange; William W Lee; Abelardo P Martinez; Daniel J Pollart; Michael Tracy
Original assignee: Stanford Res Inst Int
Priority date: 1989-09-18
Filing date: 1989-09-18
Publication date: 2002-08-28
Also published as: DE68929050D1; ATE183094T1; EP0478545B1; HU9602225D0; EP0478545A4; NO920747L; HU225965B1; FI111008B; NO920747D0; WO1991004028A1; JP3034541B2; AU4428489A; NO305905B1; KR0142858B1; AU646794B2; FI920712A0; EP0478545A1; JPH05500499A; KR927003062A; DE68929050T2

Abstract

A találmány tárgya eljárás új, (I) általános képletű vegyületek, sóikés ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, ahol i) Xjelentése –NHR-csoport, ahol R (1–4 szénatomos alkil-amino)-(1–4szénatomos)-alkil- vagy di(1–4 szénatomos alkil-amino)-(1–4szénatomos)-al- kil-csoport, és Y1 és Y2 jelentése hidrogénatom vagyegyikük halogénatom vagy nitrocsoport is lehet vagy ii) X jelentése–NH2-csoport, és Y1 és Y2 közül az egyik hidrogénatom, és a másiknitrocsoport, iii) X jelentése hidrogénatom, 2–4 szénatomos alkil-,2–4 szénatomos alkenilcsoport, egy vagy több hidroxicso- porttal, 1–4szénatomos alkoxicsoporttal vagy halogénatommal szubsztituált 2–4szénatomos alkilcsoport, és Y1 és Y2 közül az egyik hidrogénatom és amásik hidrogénatom vagy nitrocsoport, azzal a feltétellel, hogy ha Xhid- rogénatom, Y1 és Y2 közül az egyik nitrocsoport. ŕ

Description

A találmány citotoxikus szerekre és hipoxiás sejtekkel szemben hatásos radioterápiára vonatkozik. Közelebbről meghatározva a találmány tárgyát, egyes új 1,2,4benzo-triazin-oxidok, és a daganatsejtek szelektív pusztítására és/vagy a daganatsejtek új triazin-oxidok általi sugárérzékenyítésére alkalmas készítmények előállítása képezi.

A hipoxiás sejteket szenzitizáló szerek olyan vegyületek, melyek szelektíven fokozzák a hipoxiás sejtek pusztító sugárzással szembeni érzékenységét. A hipoxiás körülmények között fokozottan hatékony sejtmérgek szintén felhasználhatók az alacsony oxigénnyomás alatt lévő sejtek szelektív pusztítására. A hipoxiás sejtek iránti specificitás azért fontos, mert a hipoxiás sejtek tipikusan a daganatokra jellemzők. Gyakorlatilag a szolid tömeg formájú tumorok tartalmazzák az ilyen sejteket, míg a normál sejtek oxigénellátása általában megfelelő. Ezért a daganatgátló szerek hatása a tumorokkal szemben szelektívvé tehető a szenzitizáló vegyületek hipoxiás körülmények között tapasztalható nagy aktivitása következtében, és a besugárzás is hatékonyabbá tehető e szenzitizálók jelenlétében.

Természetesen a daganatsejtek pusztítását célzó sugárkezelésnek csak akkor van gyakorlati fontossága, ha a környező normál szövet károsodása a lehető legkisebbre csökkenthető vagy elkerülhető. A sugárzás hatása oxigén jelenlétében fokozódik és kitűnt, hogy a sugárdózis növelésekor a sugárzás sejtölő hatékonysága drámaian növekszik oxigén jelenlétében. Ezért a tumorsejteket a sugárzással szemben nehéz érzékennyé tenni, minthogy oxigénellátásuk következtében a normál sejtek általában fogékonyabbak a sugárzás iránt, mint a daganatos célsejtek. Ezért a cél olyan módszer kidolgozása, amely a sugárkezeléssel szemben a tumorsejteket szenzitizálja, de a környező szövetet nem. Ez a cél azonban nehezen érhető el.

Különböző heterociklusos vegyületek, különösen az oxidált nitrogéncsoportot tartalmazók használatosak hipoxiás daganatsejtek radioszenzitizálására. Feltételezték, hogy az oxidált nitrogénfünkcionalitás felelős ezért az aktivitásért. Nitro-imidazolokat, különösen a misonidazolt (MISO) és a metronidazolt vizsgálták széles körben, és standard vegyületként általában ma is a MISO használatos a sugárérzékenyítés in vivő és in vitro értékeléséhez [lásd például Asquith és munkatársai, Radiation Rés. 60, 108-118 (1974); Hall és munkatársai, Brit. J. Cancer 37, 567-569 (1978); Brown és munkatársai, Radiation Rés. 82, 171-190 (1980); és a 4,371,540 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Bizonyos 1-szubsztituált 3(5)-nitro-s-triazolok és különböző kinoxalin-l,4-dioxid-származékok radioszenzitizáló hatását is leírták.

Ezenfelül az 1985. május 3-án közzétett 730,761 számú és az 1985. október 18-án közzétett 788,762 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban a radioszenzitizálók egy oxidált nitrogént nem tartalmazó osztályát írják le, nevezetesen a szubsztituált benzamidokat és nikotinamidokat, valamint tioanalógjaikat. E vegyületek sugárérzékenyítőknek bizonyultak. A hipoxiás sejtek szelektív szenzitizálására irányuló képességet például oxigénellátásuk fokozása útján - fontos megkülönböztetni egy a sejtek „szenzitizálásáért” szokásosan felelős más mechanizmustól: a poli(ADP-ribóz)-polimeráz enzim gátlásától, amit alapvetőnek tartanak a besugárzott sejtek „repair”-jében. E repair (kijavító) mechanizmus úgy a hipoxiás tumorsejtekben, mint a normál sejtekben működik. Ezért az utóbbi mechanizmus szerint ható „radioszenzitizálók” alkalmazásával nem érhető el a kívánt cél, azaz a daganatos célsejtek szelektív érzékenyítése.

A 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4-di-N-oxid és más rokon vegyületek csoportját eddig nem javasolták hipoxiás sejtek szelektív pusztítására vagy sugárérzékenyítésére. A 3,980,779; 3,868,371 és 4,001,410 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik e vegyületcsoport előállítását és mikrobaellenes szerekként való alkalmazását, különösen lábasjószágtakarmányhoz való hozzáadás útján. A 3,991,189 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás e vegyületek származékait ismerteti, melyek a 3-aminocsoport nitrogénatomján szubsztituenseket viselnek. E vegyületek szintén mikrobaellenes hatásúak.

Találmányunk szerint új vegyületeket állítunk elő, melyek specifikusan sugárérzékenyítik a hipoxiás sejteket, és azokat in vitro és in vivő közvetlenül mérgezik. Ezért e vegyületeket a daganat sugárkezelése előtt vagy után alkalmazva a sugárdózist túlélő hipoxiás (tumor) sejtek szelektíven pusztulnak el. E vegyületek hipoxiás sejteket radioszenzitizáló képessége és különösen a hipoxiás sejtek közvetlen szelektív pusztítása e vegyületek nem várt tulajdonsága.

A találmány szerint értékes kiegészítéssel bővítjük a hozzáférhető szelektív radioszenzitizátorok és szelektív citotoxikus szerek körét, amelyek hipoxiás tumorsejtek pusztítására alkalmasak. Az ilyen szempontból hasznos vegyületek némelyikéről újabban kimutatták, hogy ismert vegyületek. Mások azonban újak.

Ennek megfelelően, a találmány egyik aspektusa eljárás a hipoxiás daganatsejtek sugárérzékenyítésére szolgáló új (I) általános képletű vegyületek - ahol

i) X jelentése -NHR-csoport, ahol

R (1-4 szénatomos alkil-amino)-(l-4 szénatomos)alkil- vagy di(l — 4 szénatomos alkil-amino)-(l-4 szénatomos)-alkil-csoport, és

Y¹ és Y² jelentése hidrogénatom vagy egyikük halogénatom vagy nitrocsoport is lehet vagy ii) X jelentése -NH₂-csoport, és

Y¹ és Y² közül az egyik hidrogénatom, és a másik nitrocsoport, iii) X jelentése hidrogénatom, 2-4 szénatomos alkil-, 2-4 szénatomos alkenilcsoport, egy vagy több hidroxicsoporttal, 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal vagy halogénatommal szubsztituált 2-4 szénatomos alkilcsoport, és

Y¹ és Y² közül az egyik hidrogénatom és a másik hidrogénatom, vagy nitrocsoport, azzal a feltétellel, hogy ha X hidrogénatom, Y¹ és Y² közül az egyik nitrocsoport és e vegyületek sói, főleg farmakológiailag elfogadható sói előállítására.

HU 221 201 Β1

E vegyületek a frakcionált sugárterápiára kidolgozott tökéletesített eljárásban alkalmazhatók, melynek során a besugárzandó sejteket (I) általános képletű 1,2,4benzo-triazin-származékokkal huzamos időn át kezeljük az egyes sugárdózisokkal történő kezelés előtt vagy után, és a sugárdózisok kisebbek 5 gray-nél (Gy).

Ezért a fenti sugárérzékenyítő eljáráshoz használható vegyületek adott esetben szubsztituált 1,2,4-benzo-triazin-dioxidjai, amelyek a 3-helyzetben a fenti szubsztituenseket tartalmazzák, valamint az (I) általános képletű vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható sói.

A találmány szerinti egyes 1,2,4-benzo-triazin-oxidokat alkalmazva eljárást is kidolgoztunk a hipoxiás daganatsejtek szelektív pusztítására. A szelektív citotoxikus vegyületekként használható szerek a radioszenzitizálókként alkalmazható, fentebb megadott vegyületek alcsoportját képezik. Ez azt jelenti, hogy noha az (I) általános képletű minden vegyület általában hatásos sugárérzékenyítő, csak azok a vegyületek hatásos citotoxikus szerek, amelyek a 3-helyzetben szubsztituálatlanok, vagy a 3-helyzetben amino- vagy 2-4 szénatomos szénhidrogéncsoportot tartalmaznak (azaz X jelentése hidrogénatom, 2-4 szénatomos szénhidrogéncsoport, -NH₂-csoport, -NHR általános képletű csoport, ahol R jelentése a fenti). E vonatkozást tekintve a találmány szerint ezen vegyületeket tartalmazó gyógyszereket adunk meg, amelyek a hipoxiás daganatsejtek szelektív pusztítására alkalmasak.

E vegyületek farmakológiailag elfogadható sói is e vegyületcsoportba tartoznak.

A találmány szerint új, egyszerű, egylépcsős szintézist is kifejlesztettünk a 3-helyzetben szubsztituálatlan

1.2.4- benzo-triazin-oxidok előállítására [azaz olyan (I) általános képletű vegyületekére, ahol X=H], mely szerint a megfelelő 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-oxidot (rövid szénláncú alkil)-nitrittel kezeljük reduktív dezaminálás körülményei között.

Az ábrák rövid leírása (referencia)

Az ΙΑ, 1B és IC ábra a 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxid szelektív citotoxicitását mutatja hörcsög, egér és humán szövetekből származó hipoxiás sejtekkel szemben.

A 2. ábra a 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxid szer tumorsejtölést fokozó in vivő hatásosságát szemlélteti besugárzással történő kombináláskor.

A 3. ábra a 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxid in vivő tumorsejtölését mutatja, miután a tumort vérnyomáscsökkentő hatású hidralazin (1-hidrazino-ftálazin) alkalmazása útján hipoxiássá tettük.

A 4. ábra grafikonja a 3-amino-l,2,4-benzo-triazin1.4- dioxiddal való elő- vagy utókezelés CHO-sejtekre gyakorolt aerob radioszenzitizálását illusztrálja, a 22. példa leírása szerint.

Az 5. ábra 8 x2,5 Gy-vel (Gray) 4 nap alatt besugárzott SCCVII-tumorsejtek túlélését mutatja, ugyancsak a 22. példa leírása szerint.

A 6. ábra grafikusan illusztrálja a 8x2,5 Gy-vel 4 nap alatt besugárzott SCCVII-tumor növekedésének késleltetését, szintén a 22. példában leírtak szerint.

A 7. ábra grafikon formájában szemlélteti a 12 óránként 8 frakcióban, frakciónként 3-6 Gy-vel besugárzott normál egérbőr átlagos bőrreakcióját.

A találmány kivitelezése

A. A találmány szerint használható vegyületek

A leírt sugárérzékenyítő és szelektíven citotoxikus vegyületek (I) általános képletű 1,2,4-benzo-triazindioxidok.

E vegyületek, amint ezt az (I) általános képlet mutatja, a 3-helyzetben X csoportot tartalmaznak. X specifikusan változtatható a fentebb leírtak szerint, függően a kívánt aktivitástól. A fentebb közölt kiválasztási kritériumoknak megfelelően az X szubsztituens jelentése hidrogénatom; 2-4 szénatomos szubsztituálatlan alkilcsoport, mint etil-, szek-butil-csoport és hasonlók; primer aminocsoport (-NH₂); szekunder aminocsoport (-NHR), ahol R jelentése a fenti.

Ha X jelentése alkilcsoport, további szubsztituensként -OH, 1-4 szénatomos alkoxicsoportot tartalmazhat.

Ezenfelül az (I) általános képletű vegyületek Y¹ és Y² szubsztituenst is tartalmazhatnak. E csoportokat a fenti kritériumok alapján specifikusan választjuk meg, függően a kívánt hatásosságtól.

E kritériumoknak megfelelően Y¹ és Y² hidrogénatomot; nitrocsoportot; halogénatomot (például fluor, klór, bróm vagy jód) jelenthet.

Sugárérzékenyítőként és szelektív citotoxikus szerként használható, különösen ígéretes vegyületosztályt képeznek az (la) általános képletű vegyületek. Az (la) általános képletben

Y¹ és Y² egyike hidrogénatomot és másika nitrocsoportot jelent, m értéke 0-2, R_b R₂ egyike vagy mindkettő 1-4 szénatomos alkilcsoport, vagy egyikük hidrogénatom.

Ha X jelentése -NH₂-csoport vagy -NHR általános képletű csoport, például

-NH-CH₂-(CH₂)_m-CH₂NR,R₂ általános képletű csoport, mint az (la) általános képletben, úgy gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós sókként használhatók. E sók szervetlen savakkal, mint hidrogén-kloriddal, hidrogén-bromiddal vagy foszforsavval, vagy szerves savakkal, mint ecetsavval, piroszőlősavval, borostyánkősavval, mandulasavval, p-toluolszulfonsavval és másokkal állíthatók elő. (Természetesen a szénhidrogénláncon lévő aminoszubsztituensek is átalakíthatok sókká.)

Az 1,2,4-benzo-triazinok a találmány szerinti gyakorlatban mint mono- és dioxidok használhatók, azaz a triazingyűrű 1-nitrogénatomja, vagy az 1- és a 4-nitrogénatom oxidálható.

Radioszenzitizálókként és citotoxikus szerekként használható, különösen előnyös vegyületek közé tartozik a

3-éti 1-1,2,4-benzo-triazin-1,4-dioxid;

3-propil-1,2,4-benzo-triazin-1,4-dioxid;

6(7)-nitro-3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxid; 3-(3-N,N-dietil-amino-propil-amino)-1,2,4-benzo-triazin-1,4-dioxid;

HU 221 201 Β1

6(7)-nitro-3-(2-N,N-dietil-amino-etil-amino)-l,2,4-benzo-triazin-1,4-dioxid és a fenti vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható sói, valamint tioanalógjai. Megjegyzendő, hogy a legtöbb vegyületben a megadott Y¹ és Y² szubsztituensek vagy a 6- vagy a 7-helyzetet (jelölésük „6(7)”) vagy mind a 6-, mind a 7-helyzetet (jelölésük „6,7”) foglalják el, de a gyűrű 5- és/vagy 8-helyzetében is előfordulhatnak.

B. A találmány szerinti vegyületek és más 1,2,4-benzo-triazinok előállítása

Egyes 3-aminovegyületek előállítására szolgáló általános eljárásokat a fentebb idézett szabadalmi leírásokban, például a 3,980,779 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Ley és munkatársai ismertetnek. A vegyületek előállítása céljából az (a) képletű benzofuroxánt ciánamiddal reagáltatják, majd a reakciókeveréket megsavanyítják. A benzofüroxán kiindulóanyag nem szimmetrikus a saját 5- és 6-helyzetére vonatkozóan (melyek a képződő 3-amino-benzo-triazin-oxid 6- és 7-pozíciói). Ezért a 6- és 7-szubsztituált vegyületek keveréke jöhet létre. Kívánt esetben e keverék szokványos eszközökkel a 6- vagy a 7-helyzetben szubsztituált egyedi vegyületekre bonthatók szét.

A dioxid az alap monoxidból vagy 1,2,4-benzo-triazinból is előállítható persavas oxidáció útján [lásd Robbins és munkatársai, J. Chem. Soc. 3186 (1957) és Mason és munkatársai, J. Chem. Soc. B911 (1970)].

Ezenfelül a monoxid (1) l-nitro-2-amino-benzol-származékok ciklizálása útján állítható elő H₂MCN.2HC1 segítségével, vagy (2) a (b) képletű alapvegyület oxidálása útján, vagy a megfelelő dioxid szabályozott redukciója útján [lásd Mason és munkatársai fenti közleményét, vagy Wolf és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 76, 355 (1954) közleményét].

Az 1,2,4-benzo-triazinok formazánprekurzorok ciklizálásával BF₃/AcOH keverék segítségével állíthatók elő [lásd az 1. reakcióvázlatot és Atallah és Nazer, Tetrahedron 38, 1793 (1982) közleményét].

3-Amino-l,2,4-benzo-triazinok vagy az alapvegyület ciklizálása útján [lásd a 2. reakcióvázlatot és Amdt, Chem. Bér. 3522 (1913) közleményét], vagy a fentiek szerint a monoxid vagy a dioxid redukciója útján állíthatók elő.

A 3-hidroxi-l,2,4-benzo-triazin-oxidok peroxid és nátrium-wolframát használata útján (3. reakcióvázlat) (új szintetikus eljárás a 3-hidroxi-l,4-dioxid-vegyület előállítására), vagy tömény kénsav és nátrium-nitrát segítségével (4. reakcióvázlat) állíthatók elő.

A találmány körébe tartozik a 3-helyzetben szubsztituálatlan 1,2,4-benzo-triazin-oxidok előállítására alkalmas új eljárás is (e vegyületekre itt olykor „3dezamino”-vegyületekként hivatkozunk). Az új szintézis szerint a megfelelő 3-aminoszerkezeten reduktív dezaminálást hajtunk végre. A 3-dezamino-1,2,4-benzo-triazin-oxidok szintézisére használt korábbi eljárásokkal ellentétben a találmány szerinti eljárás egyszerű, egylépcsős módszer, mellyel a kívánt termék jó kitermeléssel állítható elő. Az eljárás során az (I) általános képletű 1,2,4-benzo-triazin-oxidot - ahol X jelentése -NH₂-csoport - (rövid szénláncú alkíl)-nitrittel kezeljük reduktív dezaminálási körülmények között. „Reduktív dezaminálási körülmények” alatt olyan reakciókörülményeket értünk, amelyek a várt 3-szubsztituálatlan reakciótermék legalább 10%-os, előnyösen legalább 50%-os hozamát eredményezik. Az eljáráshoz (rövid szénláncú alkil)-nitritként előnyösen terc-butilnitritet használunk. Reduktív dezaminálási körülmények között a reakciót célszerűen összeegyeztethető szerves oldószerben, például dimetil-formamidban, legalább 60 °C hőmérsékleten, jellemzően 60-65 °C hőmérséklet-tartományban hajtjuk végre. E reakciót az

5. reakcióvázlat mutatja be.

Összefoglalva, a találmány szerint úgy járunk el, hogy

a) egy (V) általános képletű vegyületet, ahol X, Y¹ és Y² a fenti, oxidálunk, vagy

b) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol

X jelentése hidrogénatom és Y¹ és Y² a fenti, egy olyan (I) általános képletű vegyületet, ahol X aminocsoport és Y¹ és Y² a fenti, rövid szénláncú alkilnitrittel kezelünk, reduktív dezaminálási körülmények között, és kívánt esetben egy keletkezett (I) általános képletű vegyületet sójává alakítunk.

C. Formulálás és alkalmazás

Mint az alábbiakból kitűnik, a találmány szerinti oxidált benzo-triazinok melegvérű állatok hipoxiás tumorsejtjeinek radioszenzitizálására vagy szelektív elpusztítására használhatók. E cél eléréséhez a vegyületeket, tumorokat szelektíven hipoxiássá tevő szerekkel együtt is alkalmazhatjuk. Az ilyen eljárásokhoz vérnyomáscsökkentő szerek, mint hidralazin, vagy a vérrel szállított oxigén mennyiségét befolyásoló szerek használhatók. Bár ezek a vegyületek jellemzően a humán daganatterápiában használatosak, más melegvérű fajok, mint más főemlősök, gazdasági állatok, mint marha, sportoláshoz használt állatok és kis háziállatok, mint ló, kutya és macska hipoxiás tumorsejtjeinek elpusztítására is használhatók.

Feltételezhető, hogy a hipoxia minden szolid rosszindulatú daganat velejárója. Ezért a találmány szerinti vegyületek daganatos hámsejtek, endotélsejtek, kötőszöveti sejtek, csontsejtek, izomsejtek, idegsejtek és agysejtek sugárérzékenyítésére vagy pusztítására használhatók. Karcinómák és szakrómák közé tartozik például a hámsejtes, mirigysejtes, alveoláris sejtes, bazálsejtes, laphámsejtes karcinóma, a cervix laphámrákja, hepatocelluláris karcinómák, Hürthle-sejtes adenoma, műkőid karcinóma és Walker-karcinóma; Abemathyszarkóma, alveoláris lágyrészszarkóma, „angiolith”, botryoid, encephaloid szarkóma, endometrium strómasejtjeiből kiinduló szarkóma, Ewing-szarkóma, óriássejtes csontszarkóma, limfoszarkóma, Jensen-szarkóma, juxtakortikális oszteogén szarkóma, Kaposi-szarkóma, velősejtes szakróma, szinoviális szarkóma. Egyéb sugárérzékenyítőkkel szenzitizált tumorokra példák találhatók Adams G. E. kézikönyvében (Cancer: A Compre4

HU 221 201 Β1 hensive Treatise. F. Becker, Ed., 6. kötet, 181-223. oldal, Plenum, New York, 1977).

A vegyületek a betegeknek orálisan vagy parenterálisan (intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, intraperitoneálisan és más hasonló módon) alkalmazhatók. Parenterális alkalmazáshoz a vegyületeket gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal együtt befecskendezhető egységdózisformává alakítjuk. A hordozóanyagok jellemzően nem mérgezők és önmagukban terápiás hatással nem rendelkeznek. Ilyen hordozóanyag például a víz, vizes hordozók, mint konyhasóoldat, Ringer-oldat, dextróz-oldat, Hank’s-oldat és nemvizes hordozók, mint zsíros olajok (például kukorica-, gyapotmag-, mogyoró- és szezámolaj), etil-oleát és izopropil-mirisztát. Előnyös hordozó a steril sóoldat és a vegyületek eléggé vízoldékonyak ahhoz, hogy az előre látható kívánalmak között oldatot képezzenek. A hordozóanyag kisebb mennyiségben adalékokat tartalmazhat, így oldhatóságot, izotóniát, és kémiai stabilitást fokozó anyagokat, például antioxidánsokat, puffereket és tartósítószereket. Orális (vagy rektális) alkalmazáshoz a vegyületeket tabletta, kapszula, végbélkúp vagy ostya formájú egységdózissá alakítjuk. Az ilyen készítmények általában szilárd, félszilárd vagy folyékony hordozót vagy hígítót tartalmaznak. Jellemző hígító és hordozó például a laktóz, dextróz, szacharóz, szorbit, mannit, keményítők, arab mézga, kalcium-foszfát, ásványolaj, kakaó vaj, theobroma-olaj, alginátok, tragakant, zselatin, metil-cellulóz, polioxi-etilén-szorbitán-monolaurát, metil-hidroxi-benzoát, propil-hidroxi-benzoát, talkum és magnézium-sztearát.

A vegyület alkalmazott mennyisége elegendő ahhoz, hogy a kezelendő rosszindulatú daganatot a sugárzás iránt érzékennyé tegye, vagy abban sejtmérgező hatást fejtsen ki, de kevesebb annál, hogy a normál szövetben toxikus hatások érvényesüljenek. E mennyiség függ a tumor típusától, a kezelendő beteg fajtájától, a javasolt dózistól és a beteg súlyától vagy testfelszínétől. Embernél a besugárzás számos frakcionálási menetrend szerint alkalmazható, azaz a teljes sugárdózis részletekben, néhány nap és néhány hét közé eső idő alatt adható le. E dózisokat leginkább napi dózisokban (azaz hetenként ötször) alkalmazzuk legfeljebb 6 héten át, vagy heti egyszeri dózisokat adunk 4-6 héten át. A benzo-triazin egyedi dózisát az egyes sugárkezelések előtt vagy után alkalmazzuk, leginkább 0,01-20 mmol/kg, szokásosan 0,1-2 mmol/kg tartományban. E kezelési menetrendnél minden egyes sugárdózis jellemzően 1-5 Gy, előnyösen kevesebb 2,5 Gy-nél, még előnyösebben 2-2,5 Gy. Jellemzően naponta egy sugárdózist alkalmazunk, bár 2 vagy több is használható, ha a beteg elviseli.

Azt találtuk, hogy a sugárérzékenyítőkként leírt vegyületek, különösen a 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4dioxid a tumort a normál bőr érzékenységének fokozása nélkül radioaszenzitizálja, és jól működik frakcionált sugárdózisok alkalmazásakor. A 22. példa szerint ha a sejteket hipoxiás körülmények között, a besugárzás előtt vagy után például 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxiddal kezeljük, a sejtek sugárérzékennyé válnak még akkor is, ha a besugárzás folyamán a szert nem alkalmazzuk és a sejtek aerobok.

Szelektív citotoxikus szerekként történő alkalmazáshoz a találmány szerinti vegyületeket egyedül, besugárzással vagy más citotoxikus szerrel, értágító szerekkel (például hidralazin) együtt, vagy más olyan feltételek között használjuk, amelyek csökkentik a vérrel szállított, rendelkezésre álló oxigén mennyiségét (anémia), vagy olyan szerekkel együtt használjuk, melyek fokozzák az oxigén hemoglobinhoz történő kötődését; e módszerek valamennyien fokozni tudják a tumorok hipoxiájának mértékét.

Példák

A következő példák tovább illusztrálják a találmány szerinti vegyületeket, az előállításukra szolgáló eljárásokat és alkalmazásukat.

Kísérleti rész

Minden reakciót lánggal szárított üvegáruban, argonatmoszféra alatt hajtunk végre. A terc-butil-nitrit az Aldrich Chemical Company terméke. A dimetil-formamidot kalcium-hidridről desztilláljuk is. A 7-nitro-3-aminol,2,4-benzo-triazin-3-amin-l-oxid a Parish Chemical Company, a trifluor-ecetsavanhidrid, N,N-dietil-etilén-diamin, Ν,Ν-dietil-propilén-diamin és nátrium-wolframátdihidrát az Aldrich Chemical Company terméke és a 70% hidrogén-peroxid az Interox America adománya. Minden reagenst további tisztítás nélkül használunk. A „flash”-kromatográfiát Merck 230-400 mesh finomságú szilikagélen hajtjuk végre pozitív argonnyomás alatt. Az NMR-spektrumokat Varian K.L-400 vagy Jeol FK.90Q spektrométerrel d₆-acetonban, d₄-metanolban vagy d₆-dimetil-szulfoxidban vesszük fel, és a megfelelő multiplett központi csúcsához viszonyítva adjuk meg (2,04; 3,30;, illetve 2,49 ppm), az UV-spektrumokat Perkin-Elmer 552 spektrofotométerrel regisztráljuk 95% etanolban, a tömegspektrumokhoz LXB 9000 tömegspektrométerrel jutunk és az elemanalíziseket Desert Analytics (Tucson, AZ) készülékkel végezzük el.

1. (referencia) példa

3-Hidroxi-l ,2,4-benzo-triazin-l ,4-dioxid előállítása

1,50 g (9,25 mmol) 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-loxid (1), 100,0 ml ecetsav és 30,0 ml 30% hidrogénperoxid elegyét keverés közben 3,05 g (9,25 mmol) Na₂WO₄.2H₂O-val kezeljük. A keveréket olajfürdőn 60 °C-on 4 napon át keverjük. A sárgás narancsszínű keveréket lehűtjük mintegy 3 °C-ra és átszűrjük az UVtartományban nem abszorbeáló halványsárga csapadék eltávolítása céljából. A hidrogén-peroxid ecetsavas narancsszínű oldatát óvatosan félszárazra bepároljuk, miközben néhányszor vizet és ecetsavat adunk hozzá a peroxid nagy részének eltávolítása céljából. A bepárolt oldatot szobahőmérsékleten állni hagyva 4 sarzsban 0,87 g [a (2) képletű nátriumsó 42%-os kitermelése] narancsszínű szilárd terméket kapunk.

UV_max (20% CH₃OH-H₂O): 262,2 (ε 39,460); 477 (ε

7,030).

HU 221 201 Β1

IR: 3530 μ, 3150 μ, 2650 μ, 2180 μ és 1635 μ. Elemanalízis a C₇H₄N₃O₃Na.l,25H₂O képlet alapján (a nátriumsóra számítva):

számított: C: 37,6%; H: 2,93%; N: 18,79%; talált: C: 37,8%; H: 2,75%; N: 18,65%.

2. (referencia) példa

7-Klór-3-hidroxi-l ,2,4-benzo-triazin-l ,4-dioxid előállítása (6. reakcióvázlat)

1,50 g (7,63 mól) (10) képletű vegyület 100 ml ecetsavval készült oldatát 2,52 g (7,63 mmol) Na₂WO₄.2H₂O-val és 30 ml 30% H₂O₂-oldattal kezeljük. Az elegyet keverés közben 6 napon át 50 °C-on melegítjük, majd lassan szárazra pároljuk a H₂O₂ eltávolítása céljából. A maradékot 250 ml vízben felforraljuk és átszűrjük a mintegy 25 mg (10) képletű kiindulóanyag eltávolítása céljából. Ezután a vizes oldatokat kétszer 250 ml etil-acetáttal extraháljuk. A fenti víz-etil-acetát keverékben megoszlott és rétegkromatográfiával és tömegspektrometriás elemzéssel (12) képletű vegyületként azonosított mélyvörös kristályos anyagot szűréssel összegyűjtve 60,0 mg (3,7%) sárgás narancsszínű - a következőkben (12) képletű vegyületként jellemzett szilárd anyagot kapunk, amely forró izopropanol és víz elegyében jól oldódik.

Tömegspektrum: M+=212 (q= 100) (10 képletű vegyület);

TLC: R_f=0,34 (aceton, szilikagél lemezek).

Miután a (12) képletű vegyületet szűréssel eltávolítottuk, a vizes rétegtől elválasztott etil-acetátos oldatokat szárazra pároljuk. Ezután a maradékot szobahőmérsékleten izopropil-alkohollal kezelve 0,41 g (25%) (11) képletű vegyületet kapunk tompa narancsszínű szilárd anyag formájában.

Tömegspektrum: M⁺=213 (q=70).

TLC: R_f=0,22 (aceton, szilikagél lemezek).

A (11) képletű vegyületet az alábbiak szerint C₇H₄C1N₃O₃.NH₃ ammóniumsóként (230,61) azonosítjuk. A (11) képlet szabad savat tömény NH₄OH-oldatban oldjuk, jég között lehűtjük és átszűrjük az oldhatatlan (12) képletű vegyület nyomainak az eltávolítása céljából. A vörös szűrletet és mosóoldatokat szárazra párolva pirosas narancsszínű szilárd anyag marad vissza. A szilárd anyagot ezután 50 ml forró 1,2-dimetoxi-etánnal kezeljük, szűrőn összegyűjtjük és további 25 ml forró 1,2-dimetil-éterrel mossuk. A szilárd terméket 56 °C/133 Pa-on P₂O₅ felett megszárítva 0,244 g (87%) (13) képletű vegyület marad vissza. Elemanalízis a C₇H₄C1N₃O₃.NH₃ képlet alapján (230,61):

számított: C: 36,5%; H: 3,06%; N: 24,30%;

talált: C: 36,5%; H: 3,07%; N: 23,94%.

UV_max (H₂O): 219 (ε 12,580); 265,4 (ε 40,000);

3830486 (ε 6,640).

3. példa

7-Nitro-3-amino-l, 2,4-benzo-triazin-l, 4-dioxid előállítása (7. reakcióvázlat)

7-Nitro-3-trifluor-acetamido-1,2,4-benzo-triazin-1 oxid (15): 7-nitro-3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l-oxid (74) (4,00 g, 19,3 mmol; Parish Chemical Co.), CHC1₃(125 ml) és trifluor-ecetsavanhidrid (12,0 ml, 85,0 mmol) oldatát szobahőmérsékleten 44 órán át keverjük. A képződött halványsárga szilárd anyagot leszűrjük, CHCl₃-mal (50 ml) mossuk és megszárítjuk. 5,35 g (91%) terméket kapunk sárga szilárd anyag formájában.

Elemanalízis a C₉H₄F₃M₅O₄ képlet alapján: számított: C: 36,7%; H: 1,33%; N: 23,10%;

talált: C: 35,7%; H: 1,23%; N: 23,06%.

7-Nitro-3-amino-1,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxid (16) : a fentebb előállított 7-nitro-3-trifluor-acetamido1,2,4-benzo-triazin-l-oxid (15) (2,50 g, 8,25 mmol) kloroformmal (200 ml) készült oldatához keverés közben Na₂WO₄.2H₂O-t (90 mg, 0,273 mmol), majd 70% H₂O₂-ot (10 ml) adunk. 15 perc múlva az oldatot trifluor-ecetsavanhidriddel (8,0 g, 56,7 mmol) kezeljük és a keverést szobahőmérsékleten 64 órán át folytatjuk. A reakcióelegyet kromatografáljuk (EtOAc, 20% MeOH: aceton és végül 20% DMF: aceton), majd acetonból átkristályosítva 1,20 g (65%) terméket (16) kapunk narancsszínű szilárd anyag formájában; olvadáspont 286-288 °C (bomlás).

Elemanalízis a C₇H₅N₅O₄ képlet alapján:

számított: C: 37,70%; H: 2,26%; N: 31,39%; talált: C: 37,70%; H: 2,13%; N: 30,94%.

4. példa

3-(3-N,N-Dietil-amino-propil-amino)-l ,2,4-benzotriazin-l ,4-dioxid előállítása (8. reakcióvázlat)

3-(3-N,N-dietil-amino-propil-amino)-l,2,4-benzo-triazin-l-oxid (18): 3-klór-l,2,4-benzo-triazin-l-oxid (17) (3,0 g, 16,5, mmol) (előállítva Sasse és munkatársai szerint, 4,289,771 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) CH₂Cl₂-dal (100 ml) készült oldatát N,N-dietil-propilén-diaminnal (9,5 ml, 88,3 mmol) kezeljük. 20 óra múlva a keveréket szobahőmérsékleten 1,2diklór-etánnal (50 ml) hígítjuk és egymás után Na₂CO₃tal és vízzel mossuk. A sárga oldatot megszárítjuk (Na₂SO₄), átszűrjük és vákuumban bepároljuk. 3,93 g (87%) terméket kapunk sárga szilárd anyag formájában. Átkristályosítás után (éter:petroléter) 47-48 °C-on olvadó tiszta anyagot kapunk.

Elemanalízis a C₁₄H₂₁N₅O (18) képlet alapján: számított: C: 61,10%; H: 7,69%; N: 25,44%;

talált: C: 61,30%; H: 7,80%; N: 25,61%.

3-(3-N,N-dietil-amino-propil-amino)-1,2,4-benzotriazin-l, 4-dioxid (18a): a fentebb előállított 3-(3-N,Ndietil-amino-propil-amino)-1,2,4-benzo-triazin-l-oxid (18) (1,60 g, 6,10 mmol) kloroformmal (50 ml) készült oldatához keverés közben trifluor-ecetsavanhidridet (22,0 ml) adunk. 15 perc múlva a keveréket lehűtjük -10 °C-ra, 70% H₂O₂-ot (10 ml) adunk hozzá, és szobahőmérsékleten 20 napon át keveijük. A reakcióelegyet szárítjuk (Na₂SO₄), átszűrjük és szárazra pároljuk. A maradékot telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban (50 ml) oldjuk és CH₂Cl₂-dal extraháljuk (háromszor 150 ml). A szerves fázist szárítjuk (Na₂SO₄), átszűrjük és bepároljuk. 0,51 g (29%) (18a) terméket kapunk piros szilárd anyag alakjában; olvadáspont 92-94 °C.

HU 221 201 Β1

NMR: δ (400 MHz, CDC1₃) 1,11 (6H, t, J=7,l Hz,

CH₃), 1,84-1,90 (2H, m, H-2’), 2,48-2,64 (4H, m, NCH₂CH₃ és H-3’), 3,68 (2H, széles t, J=5,5 Hz, Η-Γ), 7,46 (1H, ddd, J=7,l; 7,0 és 1,2 Hz, H-6), 7,84 (ddd, J = 7,0; 6,9 és 1,2 Hz, H-7), 8,31 (2H, m, H-5 és 8), 8,80 (1H, széles s, NH).

UV: λ 220, 270,476.

Elemanalízis a C₁₄H₂₁N₅O₂.1/3H₂O képlet alapján: számított: C: 56,50%; H: 7,34%; N: 23,55%;

talált: C: 56,90%; H: 7,15%; N: 23,40%.

5. példa

7-Nitro-3-(2-N,N-dietil-amino-etil-amino)-l, 2,4benzo-triazin-1,4-dioxid előállítása (9. reakcióvázlat)

7-Nitro-3-(2-N,N-dietil-amino-etil-amino)-1,2,4benzo-triazin-l-oxid-hidroklorid (20): 7-nitro-3-3-klór1,2,4-benzo-triazin-l-oxid (19) (1,60 g, 7,06 mmol) [előállítva Sasse és munkatársai, 4,289,771 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint (a) NaNO₂-tel és H₂SO₄-val 40 °C-on, és ezt követően POCI₃-dal klórozva 106 °C-on] CH₂Cl₂-dal (50 ml) készült oldatát N,N-dietil-etilén-diaminnal (6,0 ml, 42,7 mmol) kezeljük. 16 óra múlva szobahőmérsékleten a keveréket nagyvákuumban 60 °C-on szárazra pároljuk. A sárga csapadékot 20% izopropanol/éter elegyben (150 ml) 5 órán át keverjük, szűrjük, izopropanollal, majd petroléterrel mossuk és szárítjuk (80 “C/133 Pa), és így 1,80 g (74%) (20) képletű terméket kapunk sárga tűkristályok formájában.

NMR δ (90 MHz, d₆-DMSO-d₄-MeOH) 1,25 (6H, t,

J=6,0 Hz, CH₃), 3,25 (6H, m, NCH₂), 3,82 (2H, m,

Η-1 ’), 7,74 (1H, d, J=7,0 Hz, H-5), 8,52 (1H, dd,

J=7,0 és 2,0 Hz, H-6), 8,91 (1H, d, J=2,0 Hz,

H-8).

7-nitro-3-(2-N,N-dietil-amino-etil-amino)-1,2,4benzo-triazin-l,4-dioxid-hidroklorid (21): 7-nitro-3-(2N,N-dietil-amino-etil-amino)-1,2,4-benzo-triazin-1 oxid-hidroklorid [(20); előállítva a fentiek szerint) (0,50 g, 1,46 mmol) CHCl₃-mal (50 ml) készült oldatához 0 °C-on trifluor-ecetsavanhidridet (9,0 ml) adunk. 30 perc múlva 70% H₂O₂-ot (4,0 ml) adunk hozzá és az elegyet szobahőmérsékleten 3 napon át keverjük, majd megszárítjuk (Na₂SO₄), szűrjük és vákuumban szárazra pároljuk. A kapott trifluor-acetát-sót (0,67 g, 45%) telített NaHCO₃-oldatban (30 ml) oldjuk és CH₂Cl₂-dal extraháljuk (háromszor 30 ml). A diklórmetános oldatot vízzel mossuk, szárítjuk (Na₂SO₄), szűrjük, HCl-gázzal telítjük és szárazra pároljuk. 0,35 g (63% kitermelés, 28% teljes kitermelés) terméket kapunk piros szilárd anyag alakjában; olvadáspont 194-195°C.

UV: λ 260, 306,388,479.

Elemanalízis a C₁₃H₁₈N₆O₄.HC1 képlet alapján: számított: C: 43,50%; H: 5,34%; N: 23,43%;

talált: C: 43,20%; H: 5,37%; N: 23,11%.

A következő 6. példában reduktív dezaminálási reakciót végzünk olyan (I) általános képletű vegyület előállítása céljából, amely a 3-helyzetben szubsztituálatlan, azaz az X szubsztituens hidrogénatomot jelent.

6. példa

7-Nitro-l,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxid előállítása reduktív dezaminálás útján (10. reakcióvázlat) terc-Butil-nitrit (88 mg, 0,85 mmol) DMF-dal (5 ml) készült oldatához keverés közben, 60 °C-on 7nitro-3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxidot (16) adunk (38 mg, 0,17 mmol). 30 perc múlva a sötétvörös szuszpenzióhoz további terc-butil-nitritet (175 mg, 1,70 mmol) adunk, amit azonnal színváltozás és pezsgés követ. További 10 perc múlva a narancsszínű oldatot vákuumban bepároljuk és a piros szilárd anyagot 1% AcOH/CH₂Cl₂ eleggyel kromatografálva 3 mg (27) terméket kapunk sárga szilárd anyag alakjában (10% kitermelés).

NMR δ (90 MHz, d₆-dimetil-szulfoxid) 7,68 (d, 1H,

J=9,2 Hz), 7,92 (dd, 1H, J=9,2; 2,2 Hz), 8,10 (d,

1H, J=2,2 Hz), 8,65 (s, 1H).

UV: λ 420, 310, 240, 205.

MS: m/z (relatív intenzitás) 209(9), 208(100, M⁺),

192(54), 181(14), 162(16), 105(9), 77(28), 75(52),

74(27), 63(21), 62(16), 30(77), 18(26).

7. példa (referencia)

Sugárzással kombinált in vivő aktivitás vizsgálata

Az (I) általános képletnek megfelelő vegyületek in vivő aktivitását Brown J. M. [Radiat. Rés. 64, 633-647 (1975)] szerint vizsgáljuk. A próbához 20-25 g tömegű nőstény egereken növő SCCVII-karcinómákat használunk. Az egereket specifikus patogénmentes (SPF) körülmények között tartjuk és az állatok a kísérletek elkezdésekor 3-4 hónaposak. Az SCCVII-tumort intradermálisan oltjuk be az egerek oldalába, a beoltáshoz 2.10⁵ tumorsejtet használunk, melyeket az in vivő növő daganat második-nyolcadik átoltása után nyerünk. Minden egérbe két tumort transzplantálunk és akkor használjuk fel őket, amikor térfogatuk körülbelül 100 ml lesz. Ilyenkor a tumorok körülbelül 20% hipoxiás sejtet tartalmaznak.

A vizsgálandó vegyületet 5 mmol/kg, vagy az LD₅₀2/3-ának megfelelő dózisban (amelyik alacsonyabb) injiciáljuk. Vizsgálandó vegyülettel kezelt, de nem besugárzott, valamint sóoldattal kezelt és besugárzott állatokat használunk kontroliokként. Állandó 20 Gy sugárdózist alkalmazunk a szer befecskendezése előtti 2 óra és a szer beadása utáni 3 óra között változó időközben. Ilyen időközök alkalmazásakor az eredményekből következtemi lehet úgy az optimális besugárzási időre, mint az extra sejtölés mértékére, összehasonlítva a szer nélkül végzett besugárzással. Ilyen időfuggési kísérletek eredményeit 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxid használatakor a 2. ábra mutatja be. Eszerint összehasonlítva a csak besugárzáskor kapott eredményekkel, a sejtölés fokozódik, éspedig nagyobb mértékben, mint az a két egyedi citotoxikus modalitás additivitása alapján várható lenne. A citotoxicitás hasonló növekedése, amikor a szert a besugárzás előtt vagy után adjuk, inkább a hipoxiás sejtek iránti szelektív toxicitásra, semmint a benzotriazin-dioxid sugárérzékenyítő hatására utal.

Az SCCVII-tumorok besugárzása céljából a nem altatott tumoros egereket plexiüveg dobozban sugároz7

HU 221 201 Β1 zuk be. A besugárzás körülményei: 250 kV röntgensugárzás, 15 mA, fókusz-bőr távolság (FSC) 33 cm, hozzáadott filtráció 0,35 mm Cu, szövetfelező réteg 1,3 mm Cu és 317 rad/min dózisteljesítmény.

A sejtpusztulás mértékét a kimetszett és tenyésztett daganatsejtek túlélése alapján értékeljük az alábbiak szerint. A tumoros egereket a besugárzás után 24 óra múlva megöljük, a daganatokat a bőrből kivágjuk, felaprítjuk és nagy sebességű fűrészhez erősített pengével finom péppé alakítjuk. A pépet 0,02% DHázt, 0,05% pronázt és 0,02% kollagenázt tartalmazó 30 ml pufferezett Hanks-oldathoz (HBSS) adjuk. A szuszpenziót 30 percen át 37 °C-on keverjük, átszűrjük és percenkénti 1600 fordulattal 10 percig 4 °C-on centrifugáljuk. A sejtüledéket 15% fötális borjúszérummal (FCS) kiegészített komplett Waymouth’s-tápfolyadékban újraszuszpendáljuk, aliquotját elkeverjük tripánkékfestékoldattal és a sejteket hemacitométer segítségével leszámoljuk. E szérum alkalmas hígításait 5 vagy 15 ml tápfolyadékot tartalmazó 60 vagy 100 mm-es polisztirol Petri-csészékbe (Lux Scientific Corp.) visszük át. 13 napi inkubálás után a képződött telepeket rögzítjük és megfestjük, és az 50-nél több sejtből álló kolóniákat megszámoljuk. Egy 60 mm-es csészében átlagosan 25-100 kolóniát tartalmazó hígításból számoljuk ki az eredményeket.

8. példa (referencia)

Citotoxicitási próbák

A sejtmérgezés vizsgálatához 3-amino-1,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxidot és különféle aerob és hipoxiás sejteket (humán, egér és hörcsög) használunk. Kúpos palackban levő sejtekhez 1 órán át 37 °C-on levegőt, vagy 5% CO₂-ot tartalmazó N₂-gázt vezetünk be a meghatározott mennyiségű szer hozzáadása előtt. Az 1A, 1B és IC ábra egér, hörcsög és humán sejtek túlélését mutatja különböző koncentrációjú 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxid hozzáadása után. Azt találtuk, hogy hipoxiás körülmények között azonos mértékű sejtölés eléréséhez az aerob körülmények között szükséges szerkoncentrációnak 1-2%-a szükséges. A szelektív hipoxiás toxicitás ezen aránya (50-100) magasabb, mint az eddig leírt valamely vegyület esetében.

9. példa

LD_S0 meghatározása

Az LD_5o értéket (a halálos dózis 50%-a) nőstény, 20-25 g tömegű BALB/c egereken határoztuk meg ip.

injekciót követően; ha a vizsgálandó vegyület kevéssé lipofil és nagyon jól oldódik, iv. injekciót alkalmazunk. Az LD₅₀-értéket az 1., 2., 5. és 60. napon határozzuk meg a fiziológiás sóoldatban feloldott szer frakcionált dózisainak alkalmazása útján; a szert közvetlenül az injekció beadása előtt oldjuk fel a sóoldatban.

10. példa

In vivő sugárérzékenység

Az 1,6-os SER-érték („sensitizer enhancement ratio”) eléréshez szükséges szerkoncentrációt hipoxiás

sejtek tenyészetében határozzuk meg. A kísérleti ered-
mények a következők: Vegyület	Ci,₆ (mM)
7-klór-3-amino-1,2,4-benzotriazin-l-oxid	3,3
6(7)-metoxi-3 -amino-1,2,4-benzotriazin-l,4-dioxid	~l,0
3-hidroxi-1,2,4-benzo-triazin-1,4-dioxid	~2,0

A fent leírt eljárások módosíthatók a találmány szellemétől és hatókörétől való eltérés nélkül, ami a kémiában, gyógyszerészetben, orvostudományban és hasonló területeken jártas szakember előtt nyilvánvaló.

77. referenciapélda

A hidralazin vérnyomáscsökkentő szer, mely a véredények körüli simaizom ellazítása útján fejti ki hatását. Ennek következményeként a vér preferenciálisan a normál szövetek felé áramlik, nem pedig a tumorok irányába, és ez a folyamat a daganatokban közvetlenül hipoxiát eredményez. Ha a 3-amino-1,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxidot e szerrel együtt alkalmazzuk, a tumorsejtek pusztulása nagymértékben fokozódik. E kí35 sérletben sem a hidralazin, sem az említett benzo-triazin nem okoz jelentős sejtpusztulást az SCCVIIdaganatban, míg kettőjük kombinációja 10³ faktorral csökkenti a túlélést (vagyis minden 1000 sejt közül 1 marad életben). A kísérleti módszerek azonosak a

7-9. példában leírtakkal és az eredményeket a 3. ábra mutatja be.

72. példa

Néhány 1,2,4-benzo-triazin-l ,4-dioxid fizikokémiai és biológiai tulajdonságai

A következő táblázat a (22), (16), (18a), (21) és (24) képletű vegyületek különböző tulajdonságait tartalmazza, melyeket a feltalálók határoztak meg:

Táblázat

Kód	Móltömeg	Oldhatóság (mM)	Logp^a	El/2^b (mV)	RHT^C	HCR^d	LD_SO ^V
22 (referencia)	178,2	13,50	-0,32	-332	1	100	0,50
76	223,2	2,00	-0,97	-133	2	140	1,00
18a	291,4	181	-1,34	-348	3	100	0,25
21	358,9	96,40	-0,20	-140	3	211	0,40
24 (referencia)					0,60 >100

HU 221 201 Β1

A táblázathoz fűzött megjegyzések:

a) Oktanol-víz megoszlási együtthatójának logaritmusa Fujita és munkatársai [J. Am. Chem. Soc. 86, 5175 (1964)] szerint meghatározva, 7,4 pH-jú puffért használva.

b) Polarográfiás féllépcső redukciós potenciálok Britton és Robinson szerint mérve, 7,4 pH-jú puffért és csepegő higanyelektródot használva.

c) Relatív hipoxiás citotoxicitás: a 22 számú vegyület és az analóg ekvitoxikus koncentrációinak aránya hipoxiás körülmények között tartott HA-1 sejteknél. Exponenciális növekedés fázisában levő sejteket szuszpenziós tenyészetbe viszünk át, és a szerek hozzáadása előtt 90 percen át N₂-gázt vagy levegőt vezetünk be a palackba. Meghatározott időközönként mintákat veszünk a túlélés meghatározásához és az arányokat a kapott túlélési görbék összehasonlítása alapján határozzuk meg.

d) Hipoxiás citotoxicitási arány: minden analóg ekvitoxikus koncentrációjának aránya hipoxiás/aerob körülmények között tartott HA-1 sejteknél. A kezelési feltételek a fentiek.

e) Nőstény, 3-5 hónapos BALB/c egereket használunk az LD₅₀-kísérletekhez. Az LD₅₀-értéket a 9. példában leírtak szerint határozzuk meg.

Amint a táblázatból kitűnik, az új (16), (18a) és (21) képletű vegyület in vitro citotoxicitása jelentősen nagyobb hipoxiás HA-1 tumorsejtekkel szemben, összehasonlítva a 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-l,4-dioxiddal (22), de ugyanakkor megtartják a hipoxiás sejtek iránti, erősen differenciális citotoxicitásukat, aerob sejtekkel összehasonlítva. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy e szerek tumorspecificitása nagyobb és ezért tumorgátló szerekként in vivő hatásosabbak.

13. példa (referencia)

Frakcionált sugárterápia 3-amino-l,2,4-benzo-triazin-1,4-dioxidot használva

A következő kísérlet alapján megállapítottuk, hogy ha a sejteket a (22) képletű vegyülettel hipoxiás körülmények között a besugárzás előtt vagy után kezeljük, a sejtek sugárérzékennyé válnak még akkor is, ha a besugárzás folyamán a szer nincs jelen és a sejtek aerobok.

a) A 4. ábra olyan kísérlet eredményeit mutatja be, melynél kínaihörcsögpetefészek-sejtek (CHO) túlélését határozzuk meg frakcionált röntgenbesugárzás után, a hipoxiás (22) képletű vegyületet a besugárzás előtt vagy után alkalmazva. Besugárzás előtti kezelésnél a sejteket 20 μΜ koncentrációjú vegyület hatásának tesszük ki 1,0 (□), 1,5 (Δ), 2,0 (O) és 2,5 (□) órán át (3. ábra), majd a sejteket levegőztetjük és besugározzuk. E drogkezelések önmagukban mintegy 32,19, 8, illetve 2%-ra csökkentik a sejttúlélést. A besugárzás utáni drogkezelésnél 20 μΜ szert alkalmazunk 1,5 órán át (+), ami egymagában a túlélést 23%-ra csökkenti. Összehasonlítva a pre- vagy posztirradiációs hipoxiának (I) kitett sejtek túlélési görbéjével, a (22) képletű vegyülettel történő kezelés a sejteket aerob besugárzás iránt szenzitizálja. A szenzitizálás túlnyomórészt a besugárzási túlélési görbe lejtésében jut kifejezésre. A D₀-érték 1,34 Gy-ről (95% konfidenciahatárok: 1,09-1,76 Gy) 0,80 Gy-re (konfidenciahatárok: 0,73-0,88 Gy) csökken, a kontroll és kezelt sejtek túlélési görbéinek exponenciális részeire kapott egyesített adatok legkisebb négyzetes regresszióanalízise alapján. A szenzitizálás azonban alacsony sugárdózisoknál is nyilvánvaló. Az 1-3 Gy dózissal besugárzott CHOsejteknél a „kezeletlen:kezelt” sejtek túlélési aránya átlagosan 3,6. A kialakult sugárérzékenység nagysága nem változik a drogkezelés mértékének függvényében.

b) A fenti a) fejezete adatai - melyek az alacsony dózisokkal besugárzott aerob sejtek hipoxiás aktiválással történő radioszenzitizálására vonatkoznak - annak vizsgálatára indítottak bennünket, hogy a tumorsejtek preferenciális radioszenzitizálás in vivő megvalósítható-e.

Protokollunk szerint 8x2,5 Gy dózist alkalmazunk 4 nap alatt (kétszeri besugárzás naponta). Mivel az in vitro adatok szerint sugárérzékenyítés csak hipoxiaaktiválással érhető el a besugárzás előtt vagy után, és minthogy a besugárzás előtt nem akartuk a tumorokat hipoxiássá tenni (mivel ez rezisztenssé tenné őket), a daganatokat besugárzás után tesszük hipoxiássá az értágító hatású hidralazinnak (HDZ) a (22) képletű vegyület injekciójával egy időben történő alkalmazása útján. Két különböző típusú kontrollt használunk. Először a (22) képletű vegyületet egyedül alkalmazzuk a besugárzások előtt és másodszor a hatásos hipoxiás sejtszenzitizálót, nevezetesen az SR 2508 jelű vegyületet (2-nitro-imidazol-származék, DuPont, Európában fázis III klinikai kipróbálás alatt áll) alkalmazzuk minden sugárdózis előtt. Az SR 2508 hatásossága vagy hatástalansága azt mutatja, hogy a daganat reagálását a besugárzásra hipoxiás, illetve aerob sejtek határozzák-e meg. A kezelések hatékonyságát a klonogén sejtek túlélése és a daganat növekedésének késleltetése alapján határozzuk meg. Ezeket az eredményeket az 5. és 6. ábra mutatja.

Az 5. ábra szerint az SR 2508 (1000 mg per kg) hatástalan a besugárzások előtt alkalmazva, de a (22) képletű vegyület (0,08 mmol per kg) egyedül vagy hidralazinnal együtt adva erősen fokozza a sugárzással szembeni reagálást. Ez részben additív válasznak tulajdonítható (keresztek), de a további sejtölés az aerob sejtek sugárérzékenységének az eredménye.

A 6. ábrán látható, hogy az SR 2508 (100 mg per kg) az egyes sugárdózisok előtt adva nem mutat sugárérzékenyítő hatást, de a (22) képletű vegyület (0,08 mmol per kg) a besugárzás előtt egyedül vagy a besugárzás után HDZ-nal együtt adva nagymértékben fokozza a hatást, összehasonlítva a csak sugárzással vagy szerrel kapott hatással.

E kísérletek fontos és nem várt eredménye, hogy a daganatokat a (22) képletű vegyület sugárérzékennyé teszi, ha az egyes sugárdózisok előtt hidralazin nélkül alkalmazzuk. Ez nem indokolható a hipoxiás sejtek sugárérzékenységével, minthogy a hipoxiás radioszenzitizáló SR 2508 hatástalan. így az aerob daganatsejtek radioszenzitizálása forog fenn.

E jelenség nem lenne hasznos, ha aerob normál sejtek válnának sugárérzékennyé. Ezt ellenőrizendő a fenti 8 ffakciós protokollt alkalmazva meghatároztuk a nor9

HU 221 201 Β1 mái egérbőrre gyakorolt hatást a bőrreakciót értékelő, korábban is használt pontozásos skála alapján. Az eredményeket a 7. ábra mutatja. A normál bőr radioszenzitizálása nem következik be.

Összefoglalóan az adatok azt mutatják, hogy a daganatok aerob sejtjei a radioterápiában használatoshoz hasonló multifrakcionált menetrend szerint sugárérzékennyé tehetők. A sugárérzékenység specifikus (azaz normál sejtekben nem alakul ki) és valószínű, hogy a tumorok hipoxiás részeinek aktiválása által jön létre.

14. példa

A találmány szerinti eljárásokkal az alábbi vegyületeket állítottuk elő és alkalmaztuk a 7-13. példa szerinti vizsgálatokban. A vegyületeket az előzőekben megadott tömegspektrum-vizsgálatokkal azonosítottuk:

(I) általános képletű vegyületek, Y*=H

Y²	X	Molekulatömeg (MS)
H	Et	191,2
H	Pt	205,2
H	-CH(OH)Me	207,2
H	-CH₂CH₂OH	207,19
H	-ch₂ch₂ch₂oh	221,22
H	-CH₂CH₂OMe	221,22
H	-ch=ch₂	189,18

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (I) általános képletű vegyületek és sóik előállítására, ahol

i) X jelentése -NHR-csoport, ahol

R (1-4 szénatomos alkil-amino)-(l-4 szénatomos)-alkil- vagy di(l—4 szénatomos alkil-amino)(1-4 szénatomos)-alkil-csoport, és

Y¹ és Y² jelentése hidrogénatom vagy egyikük halogénatom vagy nitrocsoport is lehet vagy ii) X jelentése -NH₂-csoport, és

Y¹ és Y² közül az egyik hidrogénatom, és a másik nitrocsoport, vagy iii) X jelentése hidrogénatom, 2-4 szénatomos alkil-, 2-4 szénatomos alkenilcsoport, egy vagy több hidroxicsoporttal, 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal vagy halogénatommal szubsztituált 2-4 szénatomos alkilcsoport, és

Y¹ és Y² közül az egyik hidrogénatom és a másik hidrogénatom, vagy nitrocsoport, azzal a feltétellel, hogy ha X hidrogénatom, Y¹ és Y² közül az egyik nitrocsoport, azzal jellemezve, hogy

a) egy (V) általános képletű vegyületet, ahol X, Y¹ és Y² a fenti, oxidálunk, vagy

b) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése hidrogénatom és Y¹ és Y² a fenti, egy olyan (I) általános képletű vegyületet, ahol X aminocsoport és Y¹ és Y² a fenti, rövid szénláncú alkil-nitrittel kezelünk, reduktív dezaminálási körülmények között, és kívánt esetben egy kapott (I) általános képletű vegyületet sójává alakítunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol X jelentése -NHR általános képletű csoport, és

R, Y¹ és Y² az i) csoportban megadott, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol

Y¹ és Y² hidrogénatomot jelent, és

X az (i) csoportban megadott, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol

Y¹ hidrogénatomot és

Y² nitrocsoportot jelent, és

X az (ii) csoportban megadott, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol

X jelentése hidrogénatom, és

Y¹ és Y² az (iii) pontban megadott, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol

X jelentése 2-4 szénatomos alkil- vagy alkenilcsoport, és

Y¹ és Y² az (iii) pontban megadott, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol

X az (iii) csoportban megadott, és

Y¹ és Y² hidrogénatomot jelent, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
8. Az 1. igénypont szerinti (b) eljárás, azzal jellemezve, hogy rövid szénláncú alkil-nitritként terc-butilnitritet használunk.
9. Az 1. igénypont szerinti (b) eljárás, azzal jellemezve, hogy a reduktív dezaminálási reakciót dimetil-formamidban, 60-65 °C hőmérsékleten hajtjuk végre.
10. Eljárás sugárérzékenyítő gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületet vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját, ahol Y¹, Y²és X az 1. igénypontban megadott, gyógyászatilag alkalmazható segédanyagokkal szokásos dózisformává alakítjuk.
11. Eljárás szelektív citotoxikus gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületet vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját, ahol (i) X jelentése -NHR-csoport, ahol

HU 221 201 Β1

R (1-4 szénatomos alkil-amino)-(l-4 szénatomos)alkil- vagy di(l—4 szénatomos alkil-amino)-(l-4 szénatomos)-alkil-csoport, vagy (ii) X jelentése -NH₂-csoport, vagy (iii) X jelentése hidrogénatom, 2-4 szénatomos al- 5 kil-, 2-4 szénatomos alkenilcsoport, egy vagy több hidroxicsoporttal, 1-4 szénatomos alkoxicsoporttal vagy halogénatommal szubsztituált 2-4 szénatomos alkilcsoport, és

Y¹ és Y² az 1. igénypont megfelelő (i), (ii) vagy (iii) pontjában megadott, gyógyászatilag alkalmazható segédanyagokkal szokásos dózisformává alakítjuk.