HU197930B - Process for producing low viscosity, high molecule hyaluronic acid sterilizable with filtering - Google Patents
Process for producing low viscosity, high molecule hyaluronic acid sterilizable with filtering Download PDFInfo
- Publication number
- HU197930B HU197930B HU8727A HU2787A HU197930B HU 197930 B HU197930 B HU 197930B HU 8727 A HU8727 A HU 8727A HU 2787 A HU2787 A HU 2787A HU 197930 B HU197930 B HU 197930B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- viscosity
- molecular weight
- hyaluronic acid
- aqueous solution
- heat treatment
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
Description
A találmány tárgya eljárás alacsony viszkozitású, nagymolekulájú és szűréssel sterilizálható hialuronsav előállítására.
Ismert, hogy a hialuronsav és sói (HA) előnyösen alkalmazhatók a szem- vagy ízületi folyadék pótlására (például 4 141 973.,
517 795. és 2 975 104. számú USA-beli szabadalmi leírások).
A hialuronsavat vagy sóit a legtöbb célra nagy móltömegű polimer formájában alkalmazzák. A HA-termékek, így a Hylartil (Pharmacia, a 4 141 973. számú USA-beli szabadalmi leírás alapján) nagy móltömegűek, azonban nagy viszkozitásúak is. Az ilyen nagy viszkozitású termék néhány célra előnyösen alkalmazható (például adhézióképződés csökkentése sebészeti beavatkozások után), az injekciós célra felhasznált HA azonban előnyösen alacsony viszkozitású és szűrhető, vagyis szűréssel sterilizálható. Néhány új extrakciós eljárás alacsony viszkozitású HA-t eredményez, ennek azonban móltömege is alacsony (Sterivet-termék, 4 517 195. számú USA-beli szabadalmi leírás, valamint Shimada és Matsumura, 1975). Ez a termék nyilvánvalóan rendelkezik bizonyos előnyökkel az injektálhatóság vonatkozásában, azonban alacsony móltömege miatt nagyobb dózisban (5,0 ml Sterivet a 2,0 ml Pharmacia termékkel szemben) kell alkalmazni. Ezenkívül a Sterivet HA szűréssel nem, csak hővel sterilizálható.
Nem ismert olyan eljárás, amely lehetővé teszi nagy móltömegű HA alacsony móltömegű HA-ból történő előállítását. Az irodalomból ismert azonban egy olyan eljárás, amely a viszkozitást a pH beállításával csökkenti (Mitra és munkatársai: 1983; Mitra, Raghunathan és munkatársai, 1983 és Sheenan és munkatársai 1983). Az irodalomban a molekulatömegről nem tesznek említést, azonban a reverzibilis pH értéket a HA molekula konformáció változásával hozzák összefüggésbe. Elméleti fejtegetésük szerint a lecsökkenteti viszkozitás feltehetően a polimer megnövelt rugalmasságára vezethető vissza, ami a rend/ /rendetlenség átmenet következménye. Ez azonban a polimer instabilitására és ennek következtében alacsonyabb móltömegre utal. Swann (1969) felvetette, hogy a viszkozitás a hidroxilcsoportok ionizálásával és a csoportok közötti hidrogén-hidaknak az a-Helix-szerkezet statisztikai csavarodáson belüli felszakításával csökkenthető. Érdekes módon ez a jelenség a magas pH-val elért víszkozitáscsökkenést a pH =3,0 érték alá történő csökkentésével teljes mértékben megfordítja. A valóságban mintegy pH = 2,5 értéknél egy viszkoelasztikus ragacs keletkezik. (Gibbs és munkatársai, 1968). Érdekes továbbá, hogy a magas pH-nál alacsony viszkozitású J4A szűréssel csak nehezen sterilizálható. A szűrő előtt egy gélréteg alakul ki, ami a nagy térfogatú szűrést gyakorlatilag lehetetlenné teszi.
Viszonylag egyszerű és új eljárást találtunk nagy molekulájú és nagy viszkozitású HA (célszerűen nátrium-hialuronát, NaH) előállítására, melyet nagy átlagos móltömeg (előnyösen 1,2x10® feletti), szűk móltömegtartomány, alacsony viszkozitás (előnyösen mintegy
5-10-4 m2/s alatt 1 tömeg%-os oldatban 37°C hőmérsékleten), nagyfokú tisztaság (1,25 mg/ /ml alatti, előnyösen 0,1 mg/ml alatti fehérje vagy aminosav, HPLC vagy UV spektrometria segítségével mérve és 45 mg/ml alatti, előnyösen 5,0 pg/ml alatti nukleinsav a fenti technikákkal mérve) jellemez.
Az alacsony viszkozitású HA, amely nagy móltömeggel és szűk móltömegtartománnyal rendelkezik, előállítható a HA oldat szabályozott hőkezelésével. Meglepő módon a viszkozitás csökkentés fenti módszerei nem közvetlenül reverzibilisek, mint a pH változás említett folyamata, és a viszkozitás csökkentésével egyidejűleg nem csökkenti a móltömeget. A viszkozitáscsökkentés említett módszerei ezenkívül lehetővé teszik a HA szűréssel történő sterilizálását is, míg a pH beállításával csökkentett vizskozitású termék nem szűrhető.
A hőkezeléssel végzett viszkozitáscsökkentésnél az idő és hőmérséklet hatása összeadódik. Minél hosszabb ideig végezzük a hőkezelést egy állandó hőmérsékleten (célszerűen 50—70°C közötti hőmérsékleten), annál alacsonyabb lesz a viszkozitás. Ha viszont a hőmérsékletet 121°C értékkel emeljük, az adott viszkozitást rövidebb idő alatt elérjük. A túl magas hőmérséklet és túl hosszú idő azonban (60 perc felett és 121°C hőmérséklet felett) karamellizálódást és bizonyos hidrolizálódást okoz, ami nemkívánatos módon csökkenti a móltömeget. A szűrési technika alkalmazása esetén szűkpórusú membránként közepes pórusnagyságú, előnyösen mintegy 1 pm alatti, elsősorban 0,5 pm alatti pórusnagyságú membránt alkalmazunk.
A találmány szerinti eljárással előállított HA terméket viszonylag magas móltömeg (például legalább 1 000 000, előnyösen legalább 1 800 000) és mesterségesen beállított viszkozitás (például mintegy 5· 10-5 m2/s alatti, előnyösen mintegy 1,5-10-4 m2/s alatti viszkozitás a nátriumsó 1 tömeg%-os vizes oldatában mérve) jellemzi. A viszkozitás csökkentésére szolgáló találmány szerinti eljárást, amelynek során a nagy közepes móltömeg jelentős mértékben nem csökken, a következő példákkal és táblázatokkal világítjuk meg közelebbről (ellenkező értelmű megjelölés hiányában a móltömeget FPLC segítségével határoztuk meg és a viszkozitás NaH 1 tömeg%-os vizes oldatára vonatkozik 37°C hőmérsékleten).
A nagy móltömegű és nagy viszkozitású HA előállításához egy, a HA-t vagy NaH-t nem oldó fürdőbe merülő, folyamatosan mozgó rudazatot alkalmazunk, amelyen a kiváló HA vagy NaH megtapad. A mozgó rudazat, amelyet a továbbiakban tekercselőnek nevezünk, a folyékony közegnek, amelyben a HA kicsapó-2197930 dik, rotációs nyíróhatást kölcsönöz és mozgó szubsztrátot eredményez, amelyen a kiváló HA megtapad. A tekercselő rozsdamentes acélrudakból vagy pálcákból áll, amelyek függőlegesen helyezkednek el és forgó tengelyen van rögzítve. Előnyös a függőleges tengely. A ten-. gelyt motor segítségével forgatjuk, amelynek sebességét szabályozni lehet. A tekercselő pontos méretét és felépítését a tartóedény nagyságától és az összegyűlő HA mennyiségétől függően változtathatjuk. Előnyösen alkalmazható a dróthálóból készített forgó hengerből álló ketrecszeríí szerkezet. Az ilyen tekercselő alkalmazása során a nagymolekulájú és nagyviszkozitású HA előállítása az alábbi módon történik.
A nátrium-hialuronát oldatát enyhe, adott esetben több részre osztott áramlással a terméket nem oldó folyadékkal, előnyösen etanollal töltött edénybe vezetjük. A folyadékkal érintkezve a termék rögtön telítődik a folyadékkal és így hosszú fonalak formájában kicsapódik. A fonalakat a forgó tekercselővel mozgásban tartjuk, amelyek a tartóedényben lévő folyadékot is megforgatják. A fel nem oldott nátrium-hialuronát kicsapódott fonalai a tekercselő „ujjaival” vagy függőleges pálcáival érintkezve megtapadnak azon. Miután a termék hajlamos arra, hogy önmagával vagy a legtöbb felületen megtapadjon, összegyűlik a tekercselőn. Feltehető, hogy ez a tapadás hosszabb polimereket eredményez, amelyekben számos hidrogén-híd alakul ki az egyes csoportok között, amely önmagában is a nagyobb móltömeg és a nagyobb viszkozitás irányába hat. Ha az alján keresztül üríthető tartóedényt alkalmazunk, lehetővé válik, hogy a hígított folyadékot a tartóedénybó'l eltávolítsuk és kívánság szerint vizes vagy puíferolt oldatot vezessünk be. A kicsapódott termék ily módon a tertóedényben újabb kezelés nélkül ismét oldhatóvá tehető. Megjegyezzük, hogy a 4 517 795. számú USA-beli szabadalmi leírásban adott kitanítás a fenti munkamódszertől teljes mértékben eltér. A 4 517 795. számú USA-beli szabadalmi leírásban ugyanis többször hangsúlyozzák, hogy az etanol-HA oldatot nem keverik.
A hőkezelés módja:
Az 1—3. táblázatok mutatják a hő hatását a viszkozitásra. A viszkozitásadatokat Cannon - Manning - Semimikroviskosimeters - rel mértük az ASTM D445 és D2515 előírásai szerint 37°C hőmérsékleten. A móltömeget gélszüréssel (Heftmann, kromatográfia) határoztuk meg Fást Protein Liquid Chromatograph (FPLC) segítségével TSK HW 65F vagy TSK HW 75F oszlopon az alábbi munkamódszerrel:
Tömegátlag meghatározása a nátrium-hialuronát móltömegéhez (Mw)
1.0 Cél
Olyan folyadékkromatográfiás módszert kell kidolgozni, amely lehetővé teszi a nátrium-hialuronát molekula átlagos tömegének meg4 határozását ismert standard móltömeg átlagértékekhez viszonyítva.
2.0 Tartomány
Felhasználható bármely nátrium-hialuronát nyersanyaghoz és/vagy késztermék mintához.
3.0 Elvek
Gélszűrés (méret szerinti kizárásos kromatográfia) segítségévei az analit-cSúcs-elúciós térfogat és a hasonló molekulaszerkezetű és sűrűségű, de ismert átlagos móltömegű anyag analízisével felvett standard görbe öszszehasonlításával információt nyerünk a móltömegről. A standard görbét olyan moleku la-méreitartományban kell felvenni, amelybe beleesik a vizsgált minta mérete.
4.0 Munkamódszer
4.1 Készülék paramétere
Oszlop: Fractogél TSK HW 65 F (EM Sciences) frakcionálási tartomány = = 50.000—5.000.000 móltömeg (globuláris faj)
Oszlopméret: 50 cm±;2 cm x 2,01 cm belső átmérőjű gélágy.
Mozgó fázis; PBS-P, 0,22 pm PTEE-π szűrve (150 ml/injekció).
Áramlási sebesség: 2 ml/perc. Papírsebesség: 0,20 cm/perc. Detektorérzékenység: 4 x 0,05 (ISCO VY). Hullámhossz: 205—208 nm. Irányítóberendezés: LCC 500 (Pharmacia), a megadott paraméterű oszlop üzemelésére programozva.
Injektált térfogat: 1000 pl.
Hőmérséklet: Az oszlopot állandó hőmérsékleten kell tartani, amelynek során a szobahőmérséklet a legelőnyösebb. A hőmérséklet változása megzavarja az alapvonalat, és csak azonos hőmérsékleten elvégzett vizsgálatokat lehet fenntartás nélkül összehasonlítani.
Az oszlopot a mozgó fázissal állandó alapvonal kialakulásáig hagyjuk stabilizálódni.
4.2 Standard görbe felállítása
4.2. a Reagensek
Mozgó fázis: Tireoglobulin (Sigma # T— 1001) M„=669 000 vagy ezzel ekvivalens, valamint kék dextrán
4.2. b Standardok
0,006 g anyag 25 ml mérőlombikba tarténő bemérésével tireoglobulin törzsoldatot készítünk. Az anyagot a mozgó fázissal jelig töltjük. Teljes oldódás után az elegyet időnként felrázzuk. 10 ml törzsoldatot 20 ml mérőlombikban pipettálunk. Ezután a mozgó fázissal jelig töltjük. A kapott oldat 125 pg/ml tireoglobulint tartalmaz.
4.2 c 0,08 g anyag 20 ml merőlombikba történő bemérésével kék dextrán (Blue Dextran) törzsoldatot készítünk. A mozgó fázissal jelig töltjük. Teljes oldódás után az elegyet időnként felrázzuk. 5 ml törzsoldatot 20 ml mérő3
-3197930 lombikba pipettálunk. A. mozgó fázissal jelig töltjük. A kapott oldat 1000 pg/rpl kék dextránt tartalmaz. A két törzsoldat hűtés közben 30 napon keresztül tárolható. A munkaoldatokat a törzsoldatokból naponta frissen készítjük. A két munkaoldatot kromatograf álás előtt 0,22 pm-es szűrőn szűrjük.
4.2. d Az Μ» standard oldatokból 3,5 ml-t a megfelelően megjelölt vizsgálati csövekbe mérünk. A vezérlőberendezésen beállítjuk a befecskendezések számát.
4.2. e A két standardnál meghatározzuk az elúció közepes átlagtérfogatát (Ve).
4.2. f Mindkét standardnál Ka» értéket számolunk az alábbi képlet szerint:
Ve—Va
Ka» -V,-Vo a képletben
Ve = elúciós térfogat,
Vo = üres térfogat (teljes kizárás a gélpórusokból)
Vo=(Vr0,33),
V/ = a töltött gél ossz oszloptérfogata Ka» = a stacionális. géltérfogat tört része, amely az oldott faj diffúziójához minden esetben rendelkezésre áll.
V) = nr2h, r = az oszlop belső dimenziójának rádiusza, h = az oszlop töltetmagassága.
4.2. g A grafikus ábrázoláshoz az X tengelyre a standard lóg Mw értékét, az Y tengelyre a Ko» értékre visszük fel. A diagramban felvisszük a standardok Ka» értékét és berajzoljuk mindkét standard pontot metsző kiegyenlítő görbét, vagy a fenti adatokat lineáris regresszióra programozott számítógépbe vagy komputerbe visszük be.
4.3 A minta átlagos móltömegének meghatározása
4.3. a 0,80—1,2% HA-t tartalmazó mintából 0,48—0,52 grammot 20 ml mérőlombikba mérünk. A mozgó fázissal jelig töltjük (hígítás 1:40).
4.3. b Ha a minta HA-tartalma 0,80% alatt van, 0,78—0,82 grammot mérünk 20 ml mérőhengerbe. A mozgó fázissal jelig töltjük. (Hígítás 1:25).
4.3. c Ha a minta 1,2—2,0% HA-t tartalmaz, 0,31—0,35 grammot 20 ml mérőlombikba mérünk. A mozgó fázissal jelig töltjük (hígítás 1:60).
4.3. d A fent megadott munkamódszert követve a 0,7 pm-en átszűrt mintából 1000 pl-t fecskendezünk be a standard meghatározásakor alkalmazott körülmények között.
4.3. e Minden befecskendezésnél meghatározzuk a Ve értékét és kiszámítjuk a Ka» értékét.
4.3. f A minta Ka» értékéből grafikusan.vagy számítógép segítségével meghatározzuk az lg Μ» értékét. A logaritmus visszaszámolásával kiszámítjuk az átlagos móltömeget.
5.0 Az eredmények érvényessége
5.1 Standard
A standard értékek érvényesek, ha a tireoglobulin V» értékei 1,25—1,39 ml/cm gél közé esnek. A kék dextrán első csúcsának Ve értéke 0,82— 0,90 ml/cm gél (a második csúcs 2.000.000 alatti móltömegű frakcióhoz tartozik).
5.2 Minta
Az eredmények érvényesek, ha a minta Ve értékei a standard görbére esnek.
5.3 Az eredmények érvényesek, ha a standard vagy minta Ka» értékei 0,0 és 1,0 közé esnek.
5.4 Az eredmények érvényesek, ha a minta koncentrációja 0,20—0,30 mg/ml közé esik (vagy eltolódás lehetséges).
6.0 Megjegyzés
A standard görbét 30 naponként ismét fel kell venni, kivéve, ha a paraméterek változása, például a gél besűrűsödése vagy új oszlop alkalmazása nem teszi szükségessé a korábbi felvételt.
A PBS-P mozgó fázis összetétele:
0,5 g nátrium-kloridot, 0,223 g dinátrium-hidrogén-foszfátot (vízmentes) és 0,04 g nátrium-dihidrogén-foszfát-monohidrátot 1000 ml -es mérőlombikban ionmentesített vízzel jelig töltünk. A vízmentes dinátrium-hidrogén-foszfát helyett alkalmazhatunk 0,28 g dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrátot is. Az elegyet jól elkeverjük, majd felhasználás előtt 0,22 pm-es szűrőn szűrjük. Az elegy steril körülmények között 15 napon keresztül szobahőmérsékleten tárolható.
Az 1. táblázatban szereplő elegyeket nyitott edényben 7—20 napon keresztül mintegy 60°C konstans hőmérsékleten melegítettük. A kezelés hatására a viszkozitás jelentősen (például az 1. számú elegynél 4,475x xl0~3-ról 1,34-10 _4-re) csökken, míg a móltömeg állandó marad. A 2. ábra a 2. számú elegy alikvot részének FPLC csúcsát mutatja, amelyet a hőkezelés során vettünk fel. Az összes csúcs azonos, ami arra utal, hogy a móltömeg hő hatására a legkisebb mértékben sem változik.
A 2. táblázatban szereplő adatokat 1 tömeg%-os nátrium-hialuronát (NaH) oldat három alikvot részének azonos ideig 30—50°C közötti hőmérsékleten történő hőkezelésével vettünk fel. Nyilvánvaló, hogy az ilyen polimer oldat viszkozitása hosszú tárolás alatt már 30°C hőmérsékleten csökken (3,18· 10-4-ről 2,98· 10-4-re). Ha a hőmérsékletet 50°C értékre emeljük, azonos időtartamon belül nagyobb viszkozitás-csökkenést (vagyis 3,18x xl0~4-ról 1,75- 10 4-re) kapunk. A móltömeg nem változik.
A magas hőmérséklet hatását az NaH viszkozitására a 3. táblázat mutatja. 1,1 tömeg% NaH oldatot 30 percen keresztül autoklávban (1,034 bar nyomás és 121°C hőmérséklet) hőkezeltük. Ezután ismét autoklávoztuk. A 3. táblázat szerint a rövid idejű, magas hőmérsékletű hőkezelés a móltömeg megváltozása nélkül jelentősen befolyásolja a viszkozitást.
-4197930
Azt találtuk, hogy a hőkezelés a paraméterek széles határán belül hatásos, amely határok bizonyos mértékben függnek a kiindulási anyag viszkozitásától. Különösen előnyös tartomány a 7—20 nap és 55—80°C közötti hőmérséklet nyitott edényben. Ügy tűnik, a viszkozitáscsökkenést gátolja, ha a hőkezelést zárt edényben végezzük.
A szűrés munkamódszere:
A szűrési technika során a viszkozitás csökkenése a pórusmérettől, az áramlási sebességtől és a valóságos szűrések számától függ. A módszert legalább 1 tömeg%-os vagy ennél töményebb HA oldatoknál célszerű alkalmazni, mivel hígított oldatban a molekulák nincsenek eléggé összekapcsolódva ahhoz, hogy a szűrő pórusain áthaladva konfigurációszerű változást szenvedjenek. Ilyen koncentrációknál a viszkozitás elég magas a szűrés különböző speciális lépéseinek, így nagy nyomás vagy vákuum alkalmazása és a szűrési felület és a szűrt térfogat közötti nagyobb arány igénybevételéhez. Minél kisebb a pórusméret (mintegy 0,5 pm alatt), és minél nagyobb a nyomás vagy a vákuum, annál alacsonyabb lesz a viszkozitás. Ezenkívül a viszkozitáscsökkenést közvetlenül befolyásolja a szűrések száma. A 4. táblázat a szűrés fenti hatásait mutatja. A cellulóz-nitrát szűrőt 165—340 mbar vákuumban alkalmaztuk. A viszkozitásezesetben is a móltömeg változása nélkül csökken. Feltehető, hogy erre a célra valamennyi filtermátrix anyag felhasználható.
Megjegyezzük, hogy a HA vagy NaH átlagos körülmények között 0,22 pm-es membránszűrőn csak nehezen sterilizálható. Maga a HA vagy NaH, amelyet a viszkozitás csökkenésére, mint fent említettük pH = 11 értékre állítunk, csak nehezen megy át a szűrőn. Azt találtuk azonban, hogy a találmány szerinti hőkezeléssel olyan HA vagy NaH nyerhető, amely 0,22 pm-es szűrőn könnyen átmegy, ami lehetővé teszi a végtermék sterilizálását. Az elméleti meggondolások szerint a viszkozitás találmány szerinti csökkenése a molekula konformációját hasonló módon változtatja meg, mint a pH emelés. A nagy viszkozitású NaH vagy HA eredetileg merev oc-Helix-szerkezetét a csoportok közötti kötések hővel vagy szűréssel történő roncsolásával fellazítjuk. A találmány szerinti eljárás során azonban a viszkozitás csökkenés nem fordítható vissza a hőmérséklet vagy a pH egyszerű lecsökkentésével, mint ez a pH változással kiváltott viszkozitás csökkenésnél megfigyelhető.
A találmány szerinti eljárások lehetővé teszik nagymolekulájú, alacsony viszkozitású HA előállítását, amely szűréssel sterilizálható. Az eljárás előnyös megvalósítási módját az 1. példában mutatjuk be.
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal mutatjuk be, anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.
1. példa
1. 0,5 tömeg% vagy ennél töményebb HA (vagy HA só, előnyösen kálium- vagy nátriumsó) oldatot alkalmazunk. A HA baktériumos fermentációból vagy más forrásból (vagyis kakastaréjból, köldökzsinórból vagy hasonlóból) származik. Előnyösen baktériumos eredetű HA-t alkalmazunk, A HA előállítását ismerteti például a 192 617. számú magyar szabadalmi leírás.
2. Tekercselőberendezést építünk fel, amelyben a 95%-os etanolban felvett HA oldatot az etanol mozgatása közben egy tartóedénybe vezetjük. A tekercselőberendezés a taróedénybe benyúló függőleges tengelyből és ehhez csatlakozó, hengerpalást mentén elhelyezett függőleges rudazatból áll.
3. A HA-t az etanolhoz adjuk, miközben a tekercselő az etanolt lassú-közepes sebességgel keveri.
4. A tekercselést az utolsó HA-oldat hozzáadása után mintegy 30 percen keresztül folytatjuk.
5. Miután a kicsapódott HA a tekercselőre feltekeredett, az etanolt a tartóedényből leengedjük.
6. A tartóedényt injekciós célra alkalmas vízzel töltjük meg. Bemeritjük a tekercselőt és alacsony sebességgel addig forgatjuk, amíg a HA teljesen oldódik.
7. A kívánt tisztaság, a kívánt móltömeg, vagy a kívánt viszkozitás eléréséig ismételjük a 2—6. pontokat.
8. A viszkozitás csökkentése, a nagy móltömeg megőrzése és a szűk móltömeg tartomány megtartása érdekében hőkezelést végzünk.
a) A tisztított HA vagy NaH oldatokat, amelynek HA tartalma mintegy 1,2 tömeg%, a viszkózus oldat keverésére alkalmas keverővei ellátott duplafalú tartóedénybe vezetjük.
b) A hőmérsékletet előnyösen 55—65°C közötti értéken beszabályozzuk.
c) Az eredeti térfogat fenntartása érdekében az elpárolgott vizet injekciós célra alkalmas vízzel pótoljuk.
d) A viszkozitást addig figyeljük, amíg eléri vagy túllépi az előre meghatározott, előnyösen 1,5· 10-4 m2/s alatti értéket.
9. A hőkezelés után alacsony viszkozitású, nagy móltömegű, szűk móltömegtartományú és nagyfokú tisztaságú HA anyagot kapunk. A termék fénnyel és hővel szemben ellenálló.
10. A végtermék előállításához a 9. pontban leírt anyagot sterilizáljuk. Ezt előnyösen szűréssel végezzük 0,22 pm-es szűrőn. Alkal· mazható azonban hősterilizálás is.
A kapott terméket hosszabb időn keresztül szobahőmérsékleten fény hatásának (több hónap) és legalább 50°C-n magasabb hőmérséklet hatásának (12 hónap) tettük ki. A kezelés során a móltömeg és a koncentráció nem változott.
-5197930
A fentiek mellett elvégzett analitikai és in vivő vizsgálatok azt mutatják, hogy a termék antigéntől mentes. Lovakon és nyulakon a Western Trans biot Elektrophorese technikával végrehajtott hiperimmunizálás során antitestet nem tudtunk kimutatni. 7 napos intervallum alatt 1 tömeg%-os vizes pufferolt oldatból három intramuszkuláris injekciót adtunk be, a nyulaknál 0,5 ml és a lovaknál 2,0 ml térfogat bán. Az Arthus-jelenséghez hasonló bőrreakció teszt (Arthus Phenomenon Like Skin Reaction Test), amely nyúl hiperimmunizálásából, makrofág érzékeny színezéknek a fülvénába történő befecskendezéséből és HA ezt követő intraperitoneális befecskendezéséből áll, szintén negatív indikációt, vagyis az immunreakció hiányát adja. A nátriumsó 1 tömeg%-os vizes pufferolt oldatából két ml befecskendezése ló tibiotarzális vagy radiálkarpális ízületébe nem okoz immunreakciót, mint ezt az injekció utáni duzzadásból (a pufferolt oldószer befecskendezésével összehasonlítva) megállapítottuk.
A fenti eredmények igazolására egy negyedik HA mintán technikai méretekben elvégzett teljes eljárást móltömeg és viszkozitás szempontjából vizsgáltuk. A mérési eredményeket az 5. táblázat tartalmazza. Megjegyezzük, hogy a minták 9,0—10,0 mg/ml HA-t tartalmaztak injekciós célra alkalmas vízben oldva. A móltömeg és a viszkozitás a tekercselés hatására nő, míg a viszkozitás a hőkezelés hatására csökken. Ennek eredményeként a kapott termék nagy móltömegű és alacsony viszkozitású.
Nagy móltömegű és nagy viszkozitású termék előállításához a hőkezelési lépést elhagy15 juk. Ezesetben β-propiolakton vagy γ-sugársterilizálást végzünk.
Az előnyös eljárás megvalósításával a 6. táblázatban megadott jellemzőkkel rendelkező termék nyerhető. Ez a táblázat a találmány szerint előállított terméket a kereskedelmi forgalomban lévő termékkel (Pharmacia és Sterivet) hasonlítja össze. Az adatok igazolják a találmány szerint előállított termék előnyös tulajdonságait.
A hőhatás az NaH viszkozitására, . táblázat a mól tömeg változása neTkül
| HA minta sorszáma | Viszkozitás hőkezelés előtt m2 / s | M | Viszko- zitás hőkezelés után m2/s | Hőkezelés időtarta- ma (nap) | M w mól tömeg hőkezelés után | |
| w mól tömeg kezelés i | ho- elott | |||||
| 1 . | 4,475.10-3 | 2,0 x 10 | b | 1,34.10-4 | 9 | 1,8 x 10 6 |
| 2. | 9,24 .10-4 | 1,7 x 10 | 6 | 6,8 .10-5 | 7 | 1.8 x 10 6 |
| 3. | 1,382.10-3 | 1,9 x 10 | 6 | 1,85.10-4 | 20* | 1,8 x 10 6 |
k = A kezdeti hőkezelést zárt edényben végezzük.
2. táblázat
Alacsony hőmérsékletű hosszú idejű hőkezelés hatása NaH oldat viszkozitására
Hőkezelés Viszkozitás Mól tömeg
| 2 / KK m is | ||||
| hőkezelés nélkül | 3,18.10-4 | 1,1 | X | 10 |
| 30°C, 1 hónap | 2,98.10-4 | 1,1 | X | 10 |
| 40°C, 1 hónap | 2,48.10-4 | 1,1 | X | 10 |
| 50°C, 1 hónap | 1,75.10-4 | 1,1 | X | 10 |
3ííf = Az anyagot előzetes tekercselés nélkül vizsgáltuk.
-6197930
3. táblázat
Magas hőmérséklet hatása NaH oldat viszkozitására
| Hőkezelés | Viszkozitás /m2/s/ | Mól tömeg |
| nincs hőkezelés | 4,475.10-3 | 1,7 x 10 |
| 121°C, 30 perc | 4,54 .10* | 1,8 x 10 |
| 121°C, 60 perc | 9,6 .10 -5 | 1,8 x 10 |
4. táblázat*
Szűrés hatása a viszkozitásra
Kezelési mód kezelés nélkül vakuumszurés (1,0 jjm szúró) vakuumszurés (0,45 pm szóró) vakuumszurés (0,22 pm szúró)
| Viszkozitás /m2/s/ | Mól tömeg |
| 1,226.103 | 1,1 x 10 |
| 9,98 .10-4 | 1,1 x 10 |
| 5,42 ,10'4 | 1,1 x 10' |
| 2,79 .10-4 | 1,1 x 10' |
x = A mintát vizsgálat előtt tekercseltük, amely a móltömeg/ /viszkozitás aranyt a normál hialuronsavhoz képest megváltoztatja.
.-Hl
5. táblázat
A móltömeg és viszkozitás változása a 4. számú mintán három tekercselés és egy hókezelés után
| Kezelés | Mól tömeg | Viszkozitás |
| 1. tekercselés után | 1,2 x 106 | 6,5.10-5 |
| 2. tekercselés után | 1,9 x 106 | 1,70.10-4 |
| 3. tekercselés után | 2,0 x 106 | 1,126.10 -3 |
| hókezelés után | 2,0 x 106 | 9,0.10 -5 |
x = A tekercselt, de nem hÓkezelt minták viszkozitását
0,5 tömeg%-os vizes oldatban 37°C hőmérsékleten mértük.
6. táblázat
Találmány szerint előállított termék (BAYVET) és kereskedelmi forgalomban lévó termékek (PHARMACIA és STERIVET) összehasonlítása
| Paraméter | BAYVET | PHARMACIA | STERIVET |
| koncentráció | 0,9-1,1 | 0,99 | 0,93 |
| átlagos móltömeg | >1,8 x 106 | 1,9 x 106 | 1,1 x 105 |
| móltömeg tartomány | 1,8-3,5 x 106 | ||
| viszkozitás (n2/sj | i1,50.10^ | >1,000.10'3 | 1,5.10-5 |
| aminosav (mg/ml) | <0,1 | 0,38 | 0,47 |
| nukleinsav (ng/ml) | <5,0 | 53,8 | 6,0 |
| fényállóság | igen | nem | 2 |
| hoállósag | igen | nem | 2 |
| szűrési sterilizálás | igen | nem | nem |
+
A fehérjetartalmat HPLC segítségevei határozzuk meg és aminosavban fejez-
Claims (2)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás hialuronsav előállítására, amely* nek fehérjetartalma legfeljebb 1,25 mg/ml, nukleinsavtartaíma legfeljebb 45 pg/ml, átlagos móltömege legalább 1,8x10® Dalton, irreverzibilis viszkozitása 1 tömeg% vizes oldatban 37°C hőmérsékleten legfeljebb 5xl0-4 m2/ /s és amely 0,22 pm szűrőn átszűrve sterilizálható, azzal jellemezve, hogy önmagában ismert módon előállított hialuronsav vagy sójának legalább 0,5 tömeg%-os vizes oldatát folyamatosan 95 tömeg%-os etanolba visszük be és a kicsapódó hialuronsavat folyamatosan egy, a kicspószerb'en forgó rudazaton felveszszük, majd a felvett hialuronsavat 50—200-szoros mennyiségű vízben oldjuk, a kicsapást és a feloldást kívánt esetben megismételjük, végül a vizes oldatot 50—120°C hőmérsékleten 5xl0~* m2/s alatti viszkozitásig — 1 tömeg%-os vizes oldatban 37°C hőmérsékleten mérve — kevertetjük.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kicsapott és feloldott hialuronsav vizes oldatát 50°C közelében legalább 2 órán keresztül l,5xl0-4 m2/s alatti viszkozitásig kevertetjük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/816,548 US5093487A (en) | 1986-01-06 | 1986-01-06 | Low viscosity high molecular weight filter sterilizable hyaluronic acid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT44583A HUT44583A (en) | 1988-03-28 |
| HU197930B true HU197930B (en) | 1989-06-28 |
Family
ID=25220927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU8727A HU197930B (en) | 1986-01-06 | 1987-01-05 | Process for producing low viscosity, high molecule hyaluronic acid sterilizable with filtering |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5093487A (hu) |
| EP (1) | EP0228698A3 (hu) |
| JP (1) | JPS62230801A (hu) |
| KR (1) | KR870007208A (hu) |
| AU (1) | AU605472B2 (hu) |
| CA (1) | CA1291750C (hu) |
| CS (1) | CS271468B2 (hu) |
| DK (1) | DK2987A (hu) |
| FI (1) | FI870005A (hu) |
| HU (1) | HU197930B (hu) |
| IL (1) | IL81147A (hu) |
| NO (1) | NO865263L (hu) |
| ZA (1) | ZA8728B (hu) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2893451B2 (ja) * | 1988-08-09 | 1999-05-24 | 昭和産業株式会社 | 高分子量のヒアルロン酸を製造する方法 |
| GB9024223D0 (en) * | 1990-11-07 | 1990-12-19 | Fermentech Ltd | Production of hyaluronic acid |
| IT1247175B (it) * | 1991-04-19 | 1994-12-12 | Fidia Spa | Procedimento per la purificazione di acido ialuronico e frazione di acido ialuronico puro per uso oftalmico. |
| IT1274984B (it) * | 1994-12-09 | 1997-07-29 | Technopharma Sa | Soluzioni viscosizzate con ialuronato di sodio per l'uso come fluido maschera nella fotocheratectomia terapeutica mediante laser a accimeri |
| SE9904066D0 (sv) * | 1999-11-08 | 1999-11-08 | Jim Aakerblom | Steril, icke-antigen hyaluronsyralösning och användning därav |
| ES2397382T3 (es) * | 2002-08-07 | 2013-03-06 | Laboratoire Medidom S.A. | Proceso para preparar una formulación estéril de ácido hialurónico de alto peso molecular |
| US8187639B2 (en) | 2005-09-27 | 2012-05-29 | Tissue Tech, Inc. | Amniotic membrane preparations and purified compositions and anti-angiogenesis treatment |
| US8153162B2 (en) | 2005-09-27 | 2012-04-10 | Tissuetech, Inc. | Purified amniotic membrane compositions and methods of use |
| ITMI20061668A1 (it) * | 2006-09-01 | 2008-03-02 | Schiena Michele Giuseppe Di | Composizione a base di acido ialuronico e suoi sali per il trattamento di lesioni epiteliali |
| JP5118385B2 (ja) * | 2007-04-24 | 2013-01-16 | 久光製薬株式会社 | 薬液の滅菌方法、並びにプレフィルドシリンジ及びその製造方法 |
| JP2011503047A (ja) * | 2007-11-13 | 2011-01-27 | バイオ−テクノロジー ゼネラル（イスラエル）リミテッド | 粘弾性生体高分子のための希釈濾過滅菌プロセス |
| CA2758571A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Tissuetech, Inc. | Compositions containing hc-ha complex and methods of use thereof |
| US8283463B2 (en) | 2010-02-09 | 2012-10-09 | Bausch & Lomb Incorporated | Sterile hyaluronic acid solutions |
| JP2011195604A (ja) * | 2010-03-17 | 2011-10-06 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒアルロン酸及び／又はその塩の含有液中の異物除去方法 |
| KR101223652B1 (ko) * | 2010-10-07 | 2013-01-17 | 주식회사 한국비엔씨 | 히알루론산 유도체의 입자 제조 장치 및 방법 |
| ITMI20110033A1 (it) | 2011-01-17 | 2012-07-18 | Biofarmitalia Spa | Composizione terapeutica mucoadesiva a base di acido ialuronico per la prevenzione e terapia di lesioni epiteliali, delle mucose del corpo umano |
| WO2012149486A1 (en) | 2011-04-28 | 2012-11-01 | Tissuetech, Inc. | Methods of modulating bone remodeling |
| ES2822301T3 (es) | 2011-06-10 | 2021-04-30 | Tissuetech Inc | Métodos de procesamiento de tejidos de soporte fetal |
| KR101379930B1 (ko) * | 2011-12-12 | 2014-04-14 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 후발성 백내장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법 |
| ES2846789T3 (es) | 2012-07-11 | 2021-07-29 | Tissuetech Inc | Composiciones que contienen complejos HC-HA/PTX3 y métodos de uso de los mismos |
| TW201603818A (zh) | 2014-06-03 | 2016-02-01 | 組織科技股份有限公司 | 組成物及方法 |
| WO2016138025A2 (en) | 2015-02-23 | 2016-09-01 | Tissuetech, Inc. | Apparatuses and methods for treating ophthalmic diseases and disorders |
| JP2018516869A (ja) | 2015-05-20 | 2018-06-28 | ティッシュテック，インク． | 上皮細胞の増殖および上皮間葉転換を防ぐための組成物および方法 |
| DE102015226456A1 (de) * | 2015-12-22 | 2017-06-22 | Heraeus Medical Gmbh | Verfahren zur Sterilisation von wässrigen Polysaccharidlösungen und sterile wässrige Polysaccharidlösungen |
| TW201733600A (zh) | 2016-01-29 | 2017-10-01 | 帝聖工業公司 | 胎兒扶持組織物及使用方法 |
| JPWO2023219171A1 (hu) * | 2022-05-13 | 2023-11-16 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2975104A (en) * | 1959-05-21 | 1961-03-14 | American Home Prod | Medium and method for producing and isolating hyaluronic acid |
| AT252264B (de) * | 1965-03-17 | 1967-02-10 | Etapharm Chem Pharm Lab Ges M | Verfahren zur Herstellung eines reinen hochviskosen Hyaluronsäurepräparates |
| US4141973A (en) * | 1975-10-17 | 1979-02-27 | Biotrics, Inc. | Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof |
| US4517295A (en) * | 1983-02-18 | 1985-05-14 | Diagnostic, Inc. | Hyaluronic acid from bacterial culture |
| NO160722C (no) * | 1983-11-25 | 1989-05-24 | Miles Inc | Fremgangsmaate for fremstilling av ultraren hyaluronsyre. |
| NO161573C (no) * | 1983-11-25 | 1989-08-30 | Miles Inc | Fremgangsmaate til fremstilling av hyaluronsyre. |
| US4780414A (en) * | 1985-01-18 | 1988-10-25 | Bio-Technology General Corp. | Method of producing high molecular weight sodium hyallronate by fermentation of streptococcus |
| JPH0837001A (ja) * | 1994-07-26 | 1996-02-06 | Shin Kobe Electric Mach Co Ltd | 鉛蓄電池用正極板及びその製造方法 |
-
1986
- 1986-01-06 US US06/816,548 patent/US5093487A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-03 CA CA000521989A patent/CA1291750C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-23 NO NO865263A patent/NO865263L/no unknown
- 1986-12-23 EP EP86117973A patent/EP0228698A3/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-01-02 IL IL81147A patent/IL81147A/xx unknown
- 1987-01-02 FI FI870005A patent/FI870005A/fi not_active Application Discontinuation
- 1987-01-02 AU AU67140/87A patent/AU605472B2/en not_active Ceased
- 1987-01-05 HU HU8727A patent/HU197930B/hu not_active IP Right Cessation
- 1987-01-05 CS CS8797A patent/CS271468B2/cs unknown
- 1987-01-05 DK DK002987A patent/DK2987A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-01-05 ZA ZA8728A patent/ZA8728B/xx unknown
- 1987-01-06 KR KR870000019A patent/KR870007208A/ko not_active Application Discontinuation
- 1987-01-06 JP JP62000235A patent/JPS62230801A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT44583A (en) | 1988-03-28 |
| AU6714087A (en) | 1988-05-12 |
| ZA8728B (en) | 1987-09-30 |
| CS9787A2 (en) | 1990-02-12 |
| AU605472B2 (en) | 1991-01-17 |
| DK2987A (da) | 1987-07-07 |
| JPS62230801A (ja) | 1987-10-09 |
| IL81147A0 (en) | 1987-08-31 |
| DK2987D0 (da) | 1987-01-05 |
| KR870007208A (ko) | 1987-08-17 |
| FI870005A (fi) | 1987-07-07 |
| NO865263L (no) | 1987-07-07 |
| US5093487A (en) | 1992-03-03 |
| EP0228698A2 (de) | 1987-07-15 |
| CS271468B2 (en) | 1990-10-12 |
| CA1291750C (en) | 1991-11-05 |
| EP0228698A3 (de) | 1988-08-10 |
| FI870005A0 (fi) | 1987-01-02 |
| IL81147A (en) | 1990-11-05 |
| NO865263D0 (no) | 1986-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU197930B (en) | Process for producing low viscosity, high molecule hyaluronic acid sterilizable with filtering | |
| Chang et al. | Structure and properties of hydrogels prepared from cellulose in NaOH/urea aqueous solutions | |
| Sionkowska et al. | Preparation and characterization of collagen/hyaluronic acid/chitosan film crosslinked with dialdehyde starch | |
| JP4827727B2 (ja) | 低分子量及び高分子量の多糖の架橋；注射用単相ヒドロゲルの調製；多糖及び得られたヒドロゲル | |
| Siemann | The solubility parameter of poly (DL-lactic acid) | |
| Lozinsky et al. | Study of cryostructuration of polymer systems. XI. The formation of PVA cryogels by freezing–thawing the polymer aqueous solutions containing additives of some polyols | |
| Harrington et al. | Geometry of the myosin dimer in high-salt media. I. Association behavior of rod segments from myosin | |
| Carnali | Gelation in physically associating biopolymer systems | |
| JP2002542352A (ja) | ポリ（エチレングリコール）と架橋したポリ（プロピレンフマラート） | |
| JP3708238B2 (ja) | 屈折率分布型光学素子の製造方法 | |
| Tokita et al. | Dynamic viscoelasticity of bovine vitreous body | |
| Hernández-Escolano et al. | The design and characterisation of sol–gel coatings for the controlled-release of active molecules | |
| JPH0674351B2 (ja) | ゲル化トリアセチルセルロース製品の製造方法 | |
| Hu et al. | Injectable hydrogels by inclusion complexation between a three-armed star copolymer (mPEG-acetal-PCL-acetal-) 3 and α-cyclodextrin for pH-triggered drug delivery | |
| Blight et al. | Manipulation of insoluble films at an oil/water interface | |
| Shurshina et al. | Influence of supramolecular organization on some characteristics of chitosan succinamide films produced from aqueous solutions | |
| Shapiro | 1H NMR self-diffusion study of morphology and structure of polyvinyl alcohol cryogels | |
| Mráček et al. | The diffusion process of sodium hyaluronate (Na‐Ha) and Na‐Ha‐n‐alkyl derivatives films swelling | |
| Antonov et al. | Effects of pharmaceutical preparations on the rate of degradation of poly (Lactide-Co-Glycolide) scaffolds | |
| JP7346380B2 (ja) | 新規光架橋性アルギン酸誘導体 | |
| Glass | Adsorption characteristics of water‐soluble polymers at aqueous‐organic liquid interfaces | |
| Ogawa et al. | X-ray diffraction study of polysaccharides | |
| Nakazata et al. | Gelation of the lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH | |
| Grisel et al. | Rheological properties of schizophyllan in presence of borate ions | |
| Michurov et al. | Cryostructuring of polymeric systems. 61. Physicochemical properties of poly (vinyl alcohol) cryogels prepared on the basis of urea-containing DMSO-solutions of the polymer and evaluation of the resultant gel materials as potential drug carriers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |