CS271468B2 - Method of hyaluronic acid's insulation - Google Patents
Method of hyaluronic acid's insulation Download PDFInfo
- Publication number
- CS271468B2 CS271468B2 CS8797A CS9787A CS271468B2 CS 271468 B2 CS271468 B2 CS 271468B2 CS 8797 A CS8797 A CS 8797A CS 9787 A CS9787 A CS 9787A CS 271468 B2 CS271468 B2 CS 271468B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- molecular weight
- viscosity
- hyaluronic acid
- solution
- filtration
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Filtering Materials (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu izolace hyaluronové kyeeliny e nízkou viskozitou, vysokou molekulovou hmotnosti a snadnou filtrovatelností nebo způsobu izolece směsi obsahující rovněž aůl hyaluronové kyseliny·
Výhody použití hyaluronové kyeeliny a eolí této kyaeliny jako náhrady oční nebo kloubové kapaliny jeou dobře známé (erov. například americké patentové spisy č. 141 973, 4 517 795 a 2 975 104). Většina účelů použití hyaluronové kyeeliny nebo eolí této kyeeliny vyžaduje polymer e vysokou molekulovou hmotností. Výrobky obsahující hyaluronovou kyselinu nebo její sůl, Jako například Hylartil (Pharmacla, americký patentový epie č. 4 141 973) mají vysokou molekulovou hmotnost, avšak mají také vysokou viskozitu. Takovýto vysoce viskozní produkt může být ideální pro mnohé účely (například ke sníženi adheeních vazeb při chirurgických zásazích). Kyselina hyaluronové nebo její eůl pro injekční účely by však měla mít výhodně nízkou viskozitu, a měla by být filtrovatelná, zejména pak by měla být sterilovatelná filtraci. Pomocí některých nových extrekčních postupů ee připravuje nízkoviekózní kyselina hyaluronová nebo její sůl, avšak v těchto případech mají vyrobené produkty také nízkou molekulovou hmotnost (erov. produkt Sterivet, americký patentový epie č. 4 517 195, e Shimada a Mateumura, 1975). Tento produkt má zřejmě některé výhody pokud jde o injekční aplikaci, avšak jeho nízká molekulová hmotnost vyžaduje použití vyšších dávek (5,0 ml přípravku Steřívet, popřípadě více než 2,0 ml přípravku Pharmacia podle amerického patentového spisu Č· 4 141 973). Kromě toho není přípravek Sterivet-HA eterilovatelný filtrací, nýbrž je nutno jej sterilizovat teplem.
Dosud nebyl popsán způsob získávání vyeokomolekulární hyaluronové kyeeliny nebo solí této kyeeliny (v další čáeti zkráceně označovány jako HA) z nízkomolekulární hyaluronové kyseliny nebo Její soli. V literatuře se však popisuje způsob snižováni viekozity úpravou hodnoty pH (erov. Mitra a delší, 1983; Mitra, Raghunathan a další, 1983 a Sheehen a další, 1983). Tyto skupiny autorů nediskutují molekulovou hmotnost, uvádějí však tento Jev reversibilní hodnoty pH do vztahu ke změně konformity v molekule HA. Uvádějí teoretické úvahy o tom, že enížená viskozita Je pravděpodobně způsobena zvýšenou flexibilitou polymeru, která může být důsledkem přechodu od určitého řádu к neuspořádanému stavu. To naznačuje nestabilitu polymeru a konečně sníženou molekulovou hmotnost. V roce 1969 vyslovil Swann názor, že ztráta viekozity může být způsobena ionizací hydroxylových skupin a přerušením vazeb mezi vodíkem a vzniklým zbytkem v rámci statistického uspořádání xové struktury HA. Zajímavým způsobem se dá tento jev snížení viekozity, mající původ ve vyeokém pH, zcela obrátit snížením hodnoty pH pod 3,0· Skutečně se při hodnotě pH eei
2,5 připraví viekózně elastický tmel (Gibbe a další, 1968). Oe rovněž zajímavé, že HA s nízkou viskozitou, lze při vyeokém pH sterilizovat filtrací Jen velmi obtížně Před filtrem se vytvoří vrstva gelu, která činí filtraci velkého objemu prakticky nemožnou.
Nyní byla nalezena relativně jednoduchá a nová pracovní technika к získávání vysokomolekulární HA (účelně ve formě natriumhyaluronátu, NaH) a vysokou viskozitou, jakož i ke snížení viekozity HA bez snížení požadované vysoké střední molekulové hmotnosti. Přitom se získaný produkt HA vyznačuje vysokou střední molekulovou hmotností (výhodně vyšěí než asi 1,2 χ 106) e úzkým rozsahem molekulové hmotnosti, nízkou viskozitou (výhodně nižší než asi 500 cSt v roztoku, který obsahuje 1 % hmotnostní HA při 37 °C) ultravysokou čistotou (<1,25 mg/mol, výhodně <0,1 mg/ral, proteinu nebo aminokyselin, měřeno pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie nebo UV spektrometrie, a <45 mg/ml, výhodně <Í5,0/Ug/ml, nukleových kyselin, měřeno stejnou technikou).
Předmětem předloženého vynálezu Je způsob izolace hyaluronové kyseliny se střední molekulovou hmotností stanovenou pomocí vysoce účinné kapalinová chromatografie alespoň
1,2 x 10 , e polymolekularitou poskytující při vysoce účinné kapalinové chromatografií jediný, v podstatě symetrický pik, přičemž alespoň 98 % materiálu má hmotnost mezi 1,2 x , 8 viskozitou vodného roztoku obsahujícího 1 % hmotností sodné soli hyaluronové kyšeCS 271 468 B2 líny při teplotě 37 °C menší než 500 cSt a ee schopností být enadno sterilovatelnou filtraci při průchodu filtrem o velikosti pórů 0,22/um, který spočívá v tom, že ae roztok hyaluronové kyseliny nebo solí této kyseliny ve vodě zavádí ve formě jednoho nebo několika tenkých proudů do rozpouštědla, ve kterém jeou hyaluronové kyselina nebo její soli jen obtížně rozpustné, jako je alkohol mísitelný s vodou, a vysrážená kyselina hyaluronová se kontinuálně zachycuje v lázni, načež ee takto izolovaná hyaluronové kyselina znovu rozpustí a získaný roztok se zahřívá na teplotu mezi 50 a 121 °C nebo ee takto izolovaná hyaluronové kyselina znovu rozpustí a filtruje se membránou se střední velikoetí pórů menší než 1/um·
Nízkoviskózní HA, která má Ještě vysokou molekulovou hmotnoet e úzkým rozmezím molekulové hmotnoeti, ee může získat buň záměrným kontrolovaným působením tepla na roztok HA nebo filtrací roztoku s minimální koncentrací za vyeokého tlaku nebo za aníženého tlaku membránou s úzkými póry· Překvapivě nejsou tyto způsoby snižování viskozity bezprostředně reversibilními, jak je tomu v případě shora popisovaného způsobu změny pH, a při těchto postupech se rovněž nesnižuje molekulová hmotnost v souvislosti s poklesem viskozity· Kromě toho umožňují zde popsané způsoby snižování viskozity, že konečný produkt HA lze sterilizovat filtrací, zatímco při použití pH ke změně viekozity se nezíská filtrovatelný produkt ·
Způsob snižování viskozity působením tepla je přímo závislý na době působení a na teplotě· čím déle ee provádí půeobení tepla při konstantní teplotě (výhodně v rozmezí od 50 °C do 70 °C), tím nižší je viskozita· Zvýšení teploty na hodnotu kolem 121 °C sníží viskozitu v kratším časovém intervalu· Působení příliš vysoké teploty po dobu příliš dlouhou (více než 60 minut při teplotě vyšší než 121 °C) vede ke karamelizaci a určité hydrolýze, která má za následek nežádoucí snížení molekulové hmotnoeti· Při použití filtrační techniky by měla mít membrána s úzkými póry póry ea etřední velikostí menší než asi l^um, výhodně menší než 0,5/Um·
Velmi důležitým aspektem produktu HA, který se připravuje postupem podle tohoto vynálezu, Je, že má vysokou molekulovou hmotnost (napříkled alespoň asi 1 000 000, výhodně alespoň 1 800 000) a uměle upravenou viekozitu (například menší než aei 500 cSt, výhodně menší než esi 150 cSt, měřeno za použití 1% vodného roztoku sodné soli)·
Postup podle vynálezu ke snížení viskozity bez za zmínku stojícího snížení vyeoké etřední molekulové hmotnosti ee blíže objeeňuje v následujících příkladech e tabulkách (ve kterých ee molekulová hmotnost určuje vysoce účinnou kapalinovou chromatografií a viskozita se udává, pokud není uvedeno jinak, jako viskozita vodného roztoku 8 1 % hmotnostním NaH při teplotě 37 °C)·
Způsob, při kterém ee získává zvýšená molekulová hmotnost a zvýšená viskozita HA, pracuje za použití kontinuálně ee pohybujícího zařízení ponořeného do lázně nerozpouštědla pro HA nebo NaH, na kterém ulpívá vznikající HA nebo vznikající NaH· Navíjecí přístroj, dále označovaný jako nevíječ”, udílí kapalnému prostředí, uvnitř kterého se sráží HA, rotační střihový pohyb, a skýtá pohybující se substrát, na kterém se může zachytit vznikající HA. Navíječ je zhotoven z tyčí nebo prutů z nerezavějící oceli, které jeou uspořádány ve svislé orientaci, a je připevněn na rotující hřídeli. Výhodnou je svielá hřídel. Hřídel ee otáčí pomotí motoru, jehož rychlost se může regulovat. Přesná velikost a způsob konstrukce navíječe se může měnit v závieloeti na velikosti nádoby a množství izolované HA· Výhodná je konstrukce na způsob klece, která sestává z otáčejícího se válce z drátěného pletiva· Za použití tohoto navíječe probíhá způsob výroby vysoce molekulární a vysoce viekózní HA tak, jak se dále popisuje·
Roztok natriumhyaluronátu se ve formě slabého proudu nebo několika slabých proudů zavádí do nádoby s nerozpouštědlem, výhodně s ethanolem. Při styku s nerozpouštědlem se
CS 271 468 B2 produkt ihned nasytí nerozpouětědlem a tím se vyeráží ve formě dlouhých provazců. Tyto provazce ee otáčením navíjecího přístroje udržují v pohybu, ke kterému ee na druhé straně přidá v otáčivém pohybu nerozpouštědlo v nádobě. Při styku vyloučeného provazce nerozpustného natriumhyaluronátu e prsty** nebo svislými pruty navíječe na nich ulpívá sraženina. Vzhledem к tomu, že produkt má eklon к tomu, aby se sám na sebe na většině ploch lepil, shromežňuje se potom na navíječi. Má ee za to, že tato adheze na sebe vede к přípravě delších polymerů, které tvoří mezi zbytky četné vodíkové vazby, což má opět za následek vyšší molekulovou hmotnost a vyšší viskozitu. Použitím nádoby, ktorá se může vyprazdňovat dnem, je potom možné, odebírat nyní zředěné nerozpouštědlo z nádoby a podle přání přivádět к roztoku vodu nebo pufr. Vysréžený produkt lze tímto způsobem v nádobě učinit bez další manipulace opět rozpustným. Nutno uvést, že údaje obsažené v americkém patentovém spisu Č. 4 617 795 vyvracejí možnoat takového pracovního postupu. V americkém patentovém spisu Č. 4 517 795 se opakovaně zdůrazňuje, že roztok HA v ethanolu se nemá míchat nebo míait.
Metoda působení teplem:
Tabulky 1 až 3 demonstrují vliv tepla na viskozitu. Veškeré viskozity se měřily poocí Cannon-Menningova semiroikroviekozimetru v souhlase s pracovními předpisy popsanými v ASTM D445 a D2515 při teplotě 37 °C a uvádějí ee v Jednotkách centistok (cSt). Molekulová hmotnost byla stanovována gelovou filtrací (Heftmann, Chromatography) pomocí FPLC (Faet Protein Liquid Chromátograph) a sloupce TSK HW 65F nebo TSK HW 75F následujícím pracovním postupem:
Stanovení střední hmotnosti molekuly (Mw) pro natriumhyaluronát
1.0 Účel:
Učinit metodu kapalinové chromatografie schopnou к určení střední hmotnosti molekuly natriumhyaluronátu v relaci ke známým standardům střední hmotnosti molekuly.
2.0 Oblast použiti:
Použitelnost pro všechny suroviny při postupu nebo/a vzorky konečných produktů natriumhyaluronátu.
3.0 Principy:
Gelová filtrace (vylučovací chromatografie podle velikosti) umožňuje informaci o molekulové hmotnosti srovnáváním piku analytu v eluovanóm objsmu ee standardní křivkou, které byla zkonstruována na základě analýzy látek s podobným tvarem molekuly a s podobnou hustotou, která má rovněž známou střední molekulovou hmotnost. Standardní křivka by měla pro případ použitelnosti dávat rozsah standardů takových velikostí molekul, do kterého spadá zkoumaný analyt.
4.0 Pracovní postup:
4.1 Parametry:
Sloupec - Fractogel TSK HW 65F (EM Sciences) rozsah frakcionace molekulová hmotnost Mw 50 000 až 5 000 000 (kuličkový druh).
Velikost sloupce - 50 cm 2 cm x 2,01 cm vnitřní průměr gelového lože.
Mobilní fáze - PBS-P (vzorec připojen) filtrovaná přes 0,22/Um PTFE (150 ml/injekce).
Rychlost proudění - 2 ml/min.
Rychlost papíru - 0,20 cm/min.
Citlivost detektoru - 4 x 0,05 (ISCO VY).
CS 271 469 B2
Vlnová délka - 205 nm až 209 nm.
Ovládací přístroj - LCC 500 (Pharmacia), programovaný na provoz sloupce odpovídající udaným parametrům.
Naatřikovaný objem - 1000 /U1.
Teplota - Sloupec ee musí udržovat na konstantní teplotě· přičemž nejpříznlvějěi je teplota místnosti. Stálost základního průběhu je nepříznivě ovlivňována· jestliže teplota během průtoku kolísá; bez dalšího jsou srovnatelné pouze průtoky při stejné teplotě
Sloupec se stabilizuje mobilní fází až к dosažení konstantního základního průběhu.
4.2 Sestaveni standardní křivky:
4.2. a Reagencie:
Mobilní fáze:
Thyreoglobulin (Sigma T-1001) Mw 669 000 nebo ekvivalent a Blue Oextran.
4.2. b Standardy:
Připraví se základní roztok Thyreoglobulinu navážením 0,006 g do odměrné banky o obsahu 25 ml. Mobilní fázi ss navážka zředí až po značku. Látka se nechá úplně rozpustit а к lepšímu rozpuštění se směs Čas od času protřepává. Potom ss z tohoto základního roztoku odměří pipetou 10 ml do odměrné baňky o obsahu 20 ml. Tento roztok se zředí mobilní fází až po značku. Získaný roztok obsahuje 125 /Ug/ml Thyreoglobulinu.
4.2. c Připraví se základní roztok Blue Oextranu navážením 0.08 g do odměrné baňky o obsahu 20 ml. Potom sé přidá mobilní fáze ež po značku. Látka se nechá úplně rozpustit e к lepšímu rozpouštění se směs čas od Času protřepává. Potom se z tohoto základního roztoku odměří pipetou 5 ml do odměrné baňky o obsahu 20 ml. Tento roztok se přidáním mobilní fáze až po značku zředí. Získaný roztok pak obsahuje 1000 /ug/ml Blue Oextranu.
Oba základní roztoky jsou v ochlazeném stavu stálé po 30 dnů. Pracovní roztoky se připravují z těchto základních roztoků denně čerstvé. Oba pracovní roztoky se před chromatografováním filtrují přes filtr 0,22 ^um.
4.2. d Pomocí pipety se odměří 3,5 ml každého M^-standardu do příslušně označených du- plikátních zkumavek.
Ovládací přístroj se nařídí na počet injekcí.
4.2. e Určí se střední průměrný objem eluce (νθ) pro oba standardy.
4.2. f Vypočte se Kav pro každý standard podle vzorce
ve kterém
V » eluční objem,
VQ prázdný objem, (úplné vyplnění pórů gelu),
VQ · (Vt . 0.33)·
Vt » celkový objem sloupce naplněného gelem.
Kav Po<^ stacionárního objemu gelu, který Je v každém časovém okamžiku к dispozici pro difúzí rozpuštěné látky·
Vt . ÍTr2 h, r poloměr vnitřního rozměru sloupce.
h · výška náplně ve sloupci.
CS 271 468 82
4.2.g Zhotoví se grafické znázornění, na kterém je na oce X vynesen log Mw standardů a na ose Y je vyneeen Kav· Do diagramu se vynesou hodnoty KaV standardů a vyznačí se oba standardní body protínající vyrovnávací křivky.
Nebo :
Shora uvedená data se předají počítači, který je naprogramován na “lineární regresi* ·
4.3 Stanovení střední molekulové hmotnosti vzorku:
4.3. a Jestliže analyt obsahuje 0,80 až 1,2 % HA, odváží ее do odměrné baňky o obsahu ml 0,48 až 0,52 g vzorku· Vzorek se zředí mobilní fází až po značku (zředění 1(40).
4.3. b Oestliže analyt obsahuje méně než 0,80 % HA, odváží se do odměrné baňky o obsahu ml 0,78 až 0,82 g vzorku· Vzorek se zředí mobilní fází až po značku (zředění 1:25)·
4.3. c Destliže analyt obsahuje 1,2 až 2,0 % HA, odváží ее do odměrné baňky o obsahu ml 0,31 až 0,35 g vzorku· Vzorek se zředí mobilní fází až po značku (zředění 1:60).
4.3. d Dále se postupuje způsobem uvedeným shora pro instrumentální zařízení· Za stej- ných podmínek jako při standardizaci se nastřikují vzorky 1000 ^ul, filtrované přes filtr o velikosti pórů 0,2 ^um ·
4.3. e Pro každý nástřik se určí hodnota νθ· Podle shora uvedeného vzorce se vypočte hodnoto Kav·
4.3. f Vynesou se hodnoty KfiV pro vzorek· Určí se odpovídající hodnota log na ose
X· Určí se anti-log pro číselné stenovení střední molekulové hmotností.
5.0 Platnost výsledků:
5.1 Standardy:
Hodnoty etandardů jeou platné, jestliže νθ pro Thyreoglobulin činí 1,25 až 1,39 ml/cm gelu· VQ pro první pík 61ue Dextranu činí 0,82 až 0,90 ml/cm gelu (druhý pík je pík frakce e meněí Mw než 2 000 000).
5.2 Vzorky:
Výsledky jsou platné, když hodnoty V0 vzorku spadají do standardní křivky.
5.3 Výsledky jsou platné, když hodnoty Kav pro standardy nebo vzorky jsou meněí než 1,0, avěak větší než 0,0·
5.4 Výsledky jsou platné, když mg/ml (nebo by mohlo dojit koncentrace analytu leží v rozsahu od 0,20 mg/ml do 0,30 к posunu)·
6.0 Poznámka:
Standardní křivka by se měla každých 30 dnů obnovit β čerstvými reagenciemi, pokud změny v parametrech systému nevyžaduji čaetějěi vyhodnocení, například zhutnění gelu nebo nový sloupec.
Vzor pro mobilní fázi PBS-P
Do odměrné baňky o obsahu 1000 ml se odváží
8,5 g chloridu sodného,
0,223 g monohydrogenfosforečnanu sodného (Na2HP04) - bezvodého nebo 0,28 g dihydrátu monohydrogenfosforečnanu sodného a
0,04 g monohydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného (NaH2P04 . H20),
CS 271 468 B2 a obsah ее zředí destilovanou deionisovanou vodou až po značku· Směs se dobře promlel· Před upotřebením ee zfiltruje přes filtr 0,22 ^um. Tato směs Je při uchovávání ve sterilním proetředí stálá po dobu 15 dnů při teplotě místnosti·
Pro tabulku 1 byly šarže zahřívány 7 až 20 dnů v otevřené nádobě na konstantní teplotu aei 60 °C. Při použiti této výhodné úpravy ee viakozita významně sníží (například z 4475 na 134 pro ěarži 1), zatímco molekulová hmotnost zůstává konstantní· Obr· 2 znázorňuje píky FPLC pro alikvotní podíly Šarže 2, které byly odebírány v průběhu tepelného působení· Všechny píky jsou shodné, což ukazuje· že působením tepla nedochází ani к nepatrným změnám nebo posunům molekulové hmotnosti·
Oata uvedená v tabulce 2 byla získána zahříváním třech alikvotních podílů stejného 1% roztoku natriumhyaluronátu (NaH) během konstantního časového intervalu, avšak za použití teplot mezi 30 °C a 50 °C· 3e zřejmé, že viskozita roztoku takovéhoto polymeru se může snížit dokonce i dlouhodobým uchováváním při teplotě 30 °C (z 318 na 298). Zvýšení teploty na 50 °C způsobí ve stejném časovém Intervalu větší pokles viskozity (tj· z 318 na 175). Molekulová hmotnost zůstává opět neovlivněna.
Účinek vysoké teploty na viskozitu NaH ilustruje tabulka 3. 1,1% roztok natriumhyaluronátu ee zahřívá v autoklávu 30 minut (0,1034 MPA: 121 °C)· Poté se tento proces opakuje· Z tabulky 3 vyplývá, že tímto krátkodobým působením vysoké teploty viskozita značně klesne* aniž by přitom byla ovlivněna molekulová hmotnost·
Bylo zjištěno, že působení tepla je účinné v širokém rozmezí podmínek a je poněkud závislé na viskozitě výchozí látky· Zvláště výhodný rozsah se pohybuje mezi asi 7 a 20 dny při teplotách mezi asi 55 °C a 80 °C.v otevřené nádobě· Zdá se, jakoby snižování viskozity bylo inhibováno, jestliže se působení tepla uskutečňuje v uzavřené nádobě·
Metoda filtrace:
Použití filtračních technik ke snižování viskozity závisí na velikostí pórů, rychlosti proudění a na počtu skutečných filtrací. Tato technika by měla být používána pro roztoky HA o koncentraci asi 1 % hmotnostního nebo vyšší, vzhledem к tomu, že ve zředěných roztocích nejsou molekuly dostatečně sdruženy, aby při průchodu póry filtru mohlo dojít к jejich strukturní modifikaci. Při takových koncentracích je viskozita dostatečně vysoká, takže vyžaduje speciální opatření při provádění filtrace, jako je použití vyšších tlaků nebo snížených tlaků a vyšších poměrů filtrační plochy vůči objemu rozpouštědla. čím menší je velikost pórů (asi méně než 0*5 ^um) a čím vyšší je tlak nebo vakuum, tím nižší bude viskozita. Kromě toho se viskozita snižuje přímo úměrně к počtu filtrací. Tabulka 4 ilustruje tento efekt filtrace. Používá se filtru z nitrátu celulózy za vakua 16 662 až 34 658 Pa. Viskozita se přitom opět snižuje, aniž by byla ovlivněna molekulová hmotnost· Pro tento účel lze použít každý filtrační materiál·
Nutno poznamenat, že HA nebo NaH jsou obvykle sterilizovatelné filtrací jen velmi obtížně za použití membránového filtru o velikosti pórů 0,22 ^um. Dokonce ani HA nebo NaH, které popřípadě, jak bylo popsáno shora, byly upraveny za účelem snížení viskozity na pH 11, nejsou schopny bez dalšího procházet tímto filtrem. Nyní věak bylo zjištěno, že bu3 za použití popsaného postupu zahřívání nebo popsaného postupu filtrace se získá HA nebo NaH, které snadno procházejí filtrem o velikosti pórů 0,22 ^um, což umožňuje sterilizaci hotového přípravku konečného produktu. Teoretické úvahy vycházejí z toho, že oba popsané postupy snižování viskozity mšní tvar molekuly podobným způsobem, jako při zvyšování hodnoty pH. Původně tuhá X-helixová struktura NaH nebo HA vyeoké viskozity se s rozrušením vazeb vedlejších zbytků teplem nebo filtrací uvolní. Při obou shora popsaných postupech není však snížení viskozity reversibllni. Proto ee působením teploty nebo pH nezmění jako v případě změny viskozity, které bylo dosaženo změnami pH.
CS 271 468 B2
Oba zde popsané postupy umožňují výrobu vyeokomolekulární HA o nízké viekozitě, která se může nakonec sterilizovat filtraci· Výhodný způsob výroby blíže ilustruje příklad 1.
Dále uvedené příklady vynález blíže objasňují, avšak rozsah vynálezu v žádném směru neomezují. Veškeré díly a procenta, které se uvádějí v příkladech, se vztahují na hmotnost, pokud není výslovně uvedeno jinak.
Příklady provedení
Přiklad 1
1. Použije se roztoku HA (Jako takové nebo ve formě soli, výhodně ve formě draselné nebo sodné soli) o koncentraci přibližně 0,5 % nebo vyšší. HA pochází z bakteriálně-fermentačního zdroje nebo z jiného zdroje (tj. z kohoutích hřebenů, pupečních šňůr atd.). Výhodná je HA z bakteriálního zdroje.
2. Vestaví se navíjecí přístroj tak, aby bylo možno přivádět do nádoby roztok HA v 95% ethanolu, zatímco se ethanol míchá pomocí navíjecího přístroje.
3. К ethanolu se přidá HA, zatímco navíjecí přístroj míchá ethanol pomalu až mírnou rychlostí.
4. V míchání pomocí navíjecího přístroje se pokračuje ještě asi 30 minut po přidání poslední části roztoku HA.
5. Ethanol se vypustí z nádoby, když se vyloučená HA navinula kolem klece navíječe.
6. Nádoba se naplní vodou pro injekce. Navíjecí přístroj se zapojí a nechá se dále běžet pomalou rychlostí až do okamžiku, kdy se HA zcela rozpustí.
7. Opakují se stupně 2 až 6 až к dosažení požadované čistoty, požadované molekulové hmotnosti nebo požadované viskozity.
8. Ke snížení viskozity a zachování vysoké molekulové hmotnosti a úzkého rozsahu molekulové hmotnosti se provede působení teplem.
a) Roztok vyčištěné HA nebo NaH s asi 1,2 % HA se převede do nádoby opatřené pláštěm a míchadlem umožňujícím mícháni vysoce viskózního roztoku.
b) Teplota tepelného media se nařídí výhodně na hodnotu mezi 55 °C a 65 °C.
c) Pokud nedochází к odpařování, doplňuje se voda pro injekční účely, aby se zachoval původní objem.
d) Sleduje se viekozita, až se dosáhne předem stanovené hodnoty, výhodně pod 150 cSt, nebo hodnoty nižší.
9. Po tomto tepelném zpracování má produkt HA nízkou viskozitu, vysokou molekulovou hmotnost, úzký rozsah molekulové hmotnosti a je vysoce čistý. Získaný materiál je rovněž stálý vůči působení světla a tepla.
10. Za účelem výroby konečného produktu se materiál HA, získaný v 9. stupni, sterilizuje. Tato sterilizace se provádí výhodně filtrací za použití filtru o velikosti pórů 0,22/um. Použít lze rovněž sterilizace teplem.
Produkt, který byl získán pracovním postupem popsaným v tomto příkladu, ss opakovaně zkouši po dlouhodobém působení světla při teplotě místnosti (několik měsíců) a po dlouhodobém působení teplot alespoň 50 °C (12 měsíců). Molekulová hmotnost a % AI zůstaly i poté nezměněny.
Kromě toho bylo jak analytickými testy tak i pokusem in vivo zjištěno, že produkt neobsahuje antigsn. Hyperimunizaci jak koní tak 1 králíků se nevytvořily žádné protilátky, které by bylo možno prokázat technikou elektroforézy (Western Transblot). Intramuskulární injekce vodného pufrovaného roztoku o koncentraci 1 % byly podávány v intervalech 7 dnů, přičemž pro králíky bylo použito injekce 0,5 ml a pro koně 2,0 ml. Kožní reakce rovnoceCS 271 468 B2 ná Arhueovu fenoménu (Arthus Phenomenon Like Skin Reaction Test), která zahrnuje hyperimunizaci králíka, následující injekci barviva citlivého vůči makrofágům do ušní žíly a následující intraperitoneální injekci této HAf skýtá rovnšž negativní indikaci, tj. žádnou imunologickou reakci· Injekce 2 ml pufrovaného vodného roztoku sodné soli o koncentraci 1% hmotnostního bud do tibiotarsálni oblasti nebo do radiálkarpálního kloubu koně nevyvolala imunologickou reakci, jak bylo posouzeno podle otoku po injekci (ve srovnání s otokem, který byl vyvolán injekci samotného pufrovaného rozpouštědla·
К objasnění výsledků popisovaných pracovních postupů byla testována Čtvrtá šarže HA v technickém měřítku po celou dobu pokusu na molekulovou hmotnost a viskozity. Naměřené hodnoty jsou uvedeny v tabulce 5« Nutno poznamenat, že všechny vzorky obsahovaly HA v koncentraci mezi 9,0 a 10,0 mg/ml rozpuštěnou ve vodě pro injekční účely. Molekulová hmotnost a viskozita rostou jako důsledek navíjení, avšak viskozita samotná klesá působením tepla· Na základě těchto skutečností má výsledný produkt vysokou molekulovou hmotnost a nízkou viskozitu.
□e-li žádoucí vysokomolekulární, vysoce viskozní produkt, je možno vynechat stupeň působení tepla· Sterilizaci lze provádět rovněž použitím Л-propiolaktonu nebo gama zářením .
Za použití výhodného provedení postupu lze vyrobit produkt s vlastnostmi uvedenými v tabulce 6· Tato tabulka obsahuje srovnání produktu, který byl vyroben postupem podle vynálezu, s produkty běžnými na trhu, tj. s produkty známými pod označením Pharmacia a Steří vet. Tyto údaje potvrzují Jedinečnost charakteristických hodnot produktu podle vynálezu.
Tabulka 1
Vliv tepla na viskozitu NaH, přičemž nedochází к žádnému účinku na molekulovou hmotnost
HA | viskozita | viskozita | počet dnů | ||
šarže | před zahříváním | w před zahříváním | po zahřívání | během nichž ae působilo | po zahřívání |
(cSt) | teplem |
1 | 4475 | 2.0 | X | 106 | 134 | 9 | 1.8 | X | 106 |
2 | 924 | 1.7 | X | 106 | 68 | 7 | 1.8 | X | 106 |
3 | 1382 | 1.9 | X | 106 | 185 | 20x | 1,8 | X | 106 |
Poznámka:
x počáteční působení se provádělo v uzavřené nádobě.
Tabulka 2
Vliv dlouhodobého působení tepla při nižších teplotách na viskozitu roztoku NaH
působení na | viskozita | molekulová | ||||
vzorek | cStxx | hmotnost | ||||
žádné | 318 | 1.1 | X | 10e | ||
30 °C. | 1 | měsíc | 298 | 1,2 | X | 106 |
40 °C. | 1 | měsíc | 248 | 1.1 | X | 106 |
50 °C, | 1 | měsíc | 175 | 1.1 | X | 106 |
xx materiál nabyl podroben navíjecímu postupu.
CS 271 468 Θ2
Tabulka 3
Vliv vysoké teploty na viskozitu roztoku NaH
působení na | viskozita | molekulové |
vzorek | cSt | hmotnost |
žádné | 4475 | 1,7 χ 106 |
121 °C, 30 min | 454 | 1,8 χ 106 |
121 °C, SO min | 96 | 1,8 χ 106 |
i
Vliv filtrace na viskozitu | Tabulka 4X | |
působení na vzorek | viskozita cSt | molekulová hmotnost |
žádné | 1226 | 1,1 x 106 |
vakuová filtrace (filtr 1,0 ^um) | 998 | 1,1 χ 106 |
vakuová filtrace (filtr 0,45 /um) | 542 | 1,1 χ 106 |
vakuová filtrace | 279 | 1,1 x 105 |
(filtr 0,22 zum) x materiál byl zpracováván za použiti navíjecího postupu, který mění vztah molekulové hmotnost/viskozita oproti stavu pozorovanému v typickém případě hyaluronové kyseliny.
Tabulka 5 Platnost molekulové hmotnosti a vlekozity ěarže 4 v průběhu tří navíjecích stupňů a působení tepla | ||
stupeň postupu | molekulová hmotnost / χ ΙΟ6 и (x 10s Oalton)/ | viskozita x cSt |
po 1« navíjení | 1,2 | 65 |
po 2« navíjení | 1,9 | ‘ 170 |
po 3. navíjení | . 2'° | 1126 |
konečný produkt po působení tepla | 2,0 | 90 |
x vlekozity po navíjecích stupních, avěak nikoli po působení tepla, byly měřeny ze použití vodných roztoků o koncentrací 0,5 % hmotnostního při 37 °C.
CS 271 468 B2
Tabulka 6
Srovnání produktu podle vynálezu (BAYVET) a produkty známými na trhu pod označením PHARMACIA a STERIVET
zkoumaný parametr | BAYVET | PHARMACIA | STERIVET |
% AI | 0.9-1,1 | 0,99 | 0,93 |
střední molekulová hmotnost Zx ΙΟθ u (x 10b dalton)J7 | >1,8 | 1.9 | 1.1 |
střední molekulová hmotnost л Zx 106 u (x 10b daltonlZ | 1,8-3,5 | ||
viskozita (cSt) | < 150 | >1000 | 15 |
aminokyseliny (mg/ml) | <0,1 | 0,38 | 0,47 |
nukleinové kyseliny (^ug/ml) | <5,0 | 53,0 | 6,0 |
stálost na světle | ano | ne | ? |
odolnost vůči teplu | ano | ne | ? |
sterilizace filtrací | ano | ne | ne |
PŘEDMĚT VYNÁLEZU
Claims (1)
- Způsob izolace hyaluronové kyseliny ee střední molekulovou hmotností stanovenou pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie alespoň 1,2 x 106, s polymolekularitou poskytující při vysoce účinné kapalinové chromatografli jediný, v podstatě symetrický pík, přičemž alespoň 98 % materiálu má hmotnost mezi 1,2 x 10 a 4,0 x 10 , 8 viskozitou vodného roztoku obsahujícího 1 % hmotnostní sodné soli hyaluronové kyseliny při teplotě 37 °C menši než 500 cSt a ee schopností být snadno sterilizovatalnou filtrací při průchodu filtrem o velikosti póru 0,22 ^um, vyznačující se tím, že se roztok hyaluronové kyeeliny nebo solí této kyseliny ve vodě zavádí ve formě jednoho nebo několika tenkých proudů do rozpouštědla, ve kterém jsou hyaluronová kyselina nebo její soli jen obtížně rozpustné, jako jsou alkoholy mísitelné s vodou, a vysréžená hyaluronová kyselina se kontinuálně zachycuje v lázni, načež ee takto izolovaná hyaluronová kyselina znovu rozpustí a získaný roztok se zahřívá na teplotu mezi 50 a 121 °C nebo se takto izolovaná hyaluronová kyselina znovu rozpustí a filtruje se membránou ee střední velikostí pórů menší než 1 /Um.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/816,548 US5093487A (en) | 1986-01-06 | 1986-01-06 | Low viscosity high molecular weight filter sterilizable hyaluronic acid |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CS9787A2 CS9787A2 (en) | 1990-02-12 |
CS271468B2 true CS271468B2 (en) | 1990-10-12 |
Family
ID=25220927
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CS8797A CS271468B2 (en) | 1986-01-06 | 1987-01-05 | Method of hyaluronic acid's insulation |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5093487A (cs) |
EP (1) | EP0228698A3 (cs) |
JP (1) | JPS62230801A (cs) |
KR (1) | KR870007208A (cs) |
AU (1) | AU605472B2 (cs) |
CA (1) | CA1291750C (cs) |
CS (1) | CS271468B2 (cs) |
DK (1) | DK2987A (cs) |
FI (1) | FI870005A (cs) |
HU (1) | HU197930B (cs) |
IL (1) | IL81147A (cs) |
NO (1) | NO865263L (cs) |
ZA (1) | ZA8728B (cs) |
Families Citing this family (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2893451B2 (ja) * | 1988-08-09 | 1999-05-24 | 昭和産業株式会社 | 高分子量のヒアルロン酸を製造する方法 |
GB9024223D0 (en) * | 1990-11-07 | 1990-12-19 | Fermentech Ltd | Production of hyaluronic acid |
IT1247175B (it) * | 1991-04-19 | 1994-12-12 | Fidia Spa | Procedimento per la purificazione di acido ialuronico e frazione di acido ialuronico puro per uso oftalmico. |
IT1274984B (it) * | 1994-12-09 | 1997-07-29 | Technopharma Sa | Soluzioni viscosizzate con ialuronato di sodio per l'uso come fluido maschera nella fotocheratectomia terapeutica mediante laser a accimeri |
SE9904066D0 (sv) * | 1999-11-08 | 1999-11-08 | Jim Aakerblom | Steril, icke-antigen hyaluronsyralösning och användning därav |
ES2397382T3 (es) * | 2002-08-07 | 2013-03-06 | Laboratoire Medidom S.A. | Proceso para preparar una formulación estéril de ácido hialurónico de alto peso molecular |
US8187639B2 (en) | 2005-09-27 | 2012-05-29 | Tissue Tech, Inc. | Amniotic membrane preparations and purified compositions and anti-angiogenesis treatment |
US8153162B2 (en) | 2005-09-27 | 2012-04-10 | Tissuetech, Inc. | Purified amniotic membrane compositions and methods of use |
ITMI20061668A1 (it) * | 2006-09-01 | 2008-03-02 | Schiena Michele Giuseppe Di | Composizione a base di acido ialuronico e suoi sali per il trattamento di lesioni epiteliali |
JP5118385B2 (ja) * | 2007-04-24 | 2013-01-16 | 久光製薬株式会社 | 薬液の滅菌方法、並びにプレフィルドシリンジ及びその製造方法 |
JP2011503047A (ja) * | 2007-11-13 | 2011-01-27 | バイオ−テクノロジー ゼネラル(イスラエル)リミテッド | 粘弾性生体高分子のための希釈濾過滅菌プロセス |
CA2758571A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Tissuetech, Inc. | Compositions containing hc-ha complex and methods of use thereof |
US8283463B2 (en) | 2010-02-09 | 2012-10-09 | Bausch & Lomb Incorporated | Sterile hyaluronic acid solutions |
JP2011195604A (ja) * | 2010-03-17 | 2011-10-06 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒアルロン酸及び/又はその塩の含有液中の異物除去方法 |
KR101223652B1 (ko) * | 2010-10-07 | 2013-01-17 | 주식회사 한국비엔씨 | 히알루론산 유도체의 입자 제조 장치 및 방법 |
ITMI20110033A1 (it) | 2011-01-17 | 2012-07-18 | Biofarmitalia Spa | Composizione terapeutica mucoadesiva a base di acido ialuronico per la prevenzione e terapia di lesioni epiteliali, delle mucose del corpo umano |
WO2012149486A1 (en) | 2011-04-28 | 2012-11-01 | Tissuetech, Inc. | Methods of modulating bone remodeling |
ES2822301T3 (es) | 2011-06-10 | 2021-04-30 | Tissuetech Inc | Métodos de procesamiento de tejidos de soporte fetal |
KR101379930B1 (ko) * | 2011-12-12 | 2014-04-14 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 후발성 백내장 억제용 조성물 및 이의 제조 방법 |
ES2846789T3 (es) | 2012-07-11 | 2021-07-29 | Tissuetech Inc | Composiciones que contienen complejos HC-HA/PTX3 y métodos de uso de los mismos |
TW201603818A (zh) | 2014-06-03 | 2016-02-01 | 組織科技股份有限公司 | 組成物及方法 |
WO2016138025A2 (en) | 2015-02-23 | 2016-09-01 | Tissuetech, Inc. | Apparatuses and methods for treating ophthalmic diseases and disorders |
JP2018516869A (ja) | 2015-05-20 | 2018-06-28 | ティッシュテック,インク. | 上皮細胞の増殖および上皮間葉転換を防ぐための組成物および方法 |
DE102015226456A1 (de) * | 2015-12-22 | 2017-06-22 | Heraeus Medical Gmbh | Verfahren zur Sterilisation von wässrigen Polysaccharidlösungen und sterile wässrige Polysaccharidlösungen |
TW201733600A (zh) | 2016-01-29 | 2017-10-01 | 帝聖工業公司 | 胎兒扶持組織物及使用方法 |
JPWO2023219171A1 (cs) * | 2022-05-13 | 2023-11-16 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2975104A (en) * | 1959-05-21 | 1961-03-14 | American Home Prod | Medium and method for producing and isolating hyaluronic acid |
AT252264B (de) * | 1965-03-17 | 1967-02-10 | Etapharm Chem Pharm Lab Ges M | Verfahren zur Herstellung eines reinen hochviskosen Hyaluronsäurepräparates |
US4141973A (en) * | 1975-10-17 | 1979-02-27 | Biotrics, Inc. | Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof |
US4517295A (en) * | 1983-02-18 | 1985-05-14 | Diagnostic, Inc. | Hyaluronic acid from bacterial culture |
NO160722C (no) * | 1983-11-25 | 1989-05-24 | Miles Inc | Fremgangsmaate for fremstilling av ultraren hyaluronsyre. |
NO161573C (no) * | 1983-11-25 | 1989-08-30 | Miles Inc | Fremgangsmaate til fremstilling av hyaluronsyre. |
US4780414A (en) * | 1985-01-18 | 1988-10-25 | Bio-Technology General Corp. | Method of producing high molecular weight sodium hyallronate by fermentation of streptococcus |
JPH0837001A (ja) * | 1994-07-26 | 1996-02-06 | Shin Kobe Electric Mach Co Ltd | 鉛蓄電池用正極板及びその製造方法 |
-
1986
- 1986-01-06 US US06/816,548 patent/US5093487A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-03 CA CA000521989A patent/CA1291750C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-23 NO NO865263A patent/NO865263L/no unknown
- 1986-12-23 EP EP86117973A patent/EP0228698A3/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-01-02 IL IL81147A patent/IL81147A/xx unknown
- 1987-01-02 FI FI870005A patent/FI870005A/fi not_active Application Discontinuation
- 1987-01-02 AU AU67140/87A patent/AU605472B2/en not_active Ceased
- 1987-01-05 HU HU8727A patent/HU197930B/hu not_active IP Right Cessation
- 1987-01-05 CS CS8797A patent/CS271468B2/cs unknown
- 1987-01-05 DK DK002987A patent/DK2987A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-01-05 ZA ZA8728A patent/ZA8728B/xx unknown
- 1987-01-06 KR KR870000019A patent/KR870007208A/ko not_active Application Discontinuation
- 1987-01-06 JP JP62000235A patent/JPS62230801A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HU197930B (en) | 1989-06-28 |
HUT44583A (en) | 1988-03-28 |
AU6714087A (en) | 1988-05-12 |
ZA8728B (en) | 1987-09-30 |
CS9787A2 (en) | 1990-02-12 |
AU605472B2 (en) | 1991-01-17 |
DK2987A (da) | 1987-07-07 |
JPS62230801A (ja) | 1987-10-09 |
IL81147A0 (en) | 1987-08-31 |
DK2987D0 (da) | 1987-01-05 |
KR870007208A (ko) | 1987-08-17 |
FI870005A (fi) | 1987-07-07 |
NO865263L (no) | 1987-07-07 |
US5093487A (en) | 1992-03-03 |
EP0228698A2 (de) | 1987-07-15 |
CA1291750C (en) | 1991-11-05 |
EP0228698A3 (de) | 1988-08-10 |
FI870005A0 (fi) | 1987-01-02 |
IL81147A (en) | 1990-11-05 |
NO865263D0 (no) | 1986-12-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CS271468B2 (en) | Method of hyaluronic acid's insulation | |
Yan et al. | Tumor growth suppression induced by biomimetic silk fibroin hydrogels | |
RU2099350C1 (ru) | Ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты, способ их получения, фармацевтическая композиция, содержащая ассоциаты депротонированной гиалуроновой кислоты, и способ ее получения | |
Ramiah et al. | The thermal expansion of cellulose, hemicellulose, and lignin | |
McAllister et al. | Thermodynamics of aqueous methylcellulose solutions | |
JPS61207401A (ja) | 化学的に修飾したヒアルロン酸製剤とそれの動物組織からの回収法 | |
Harding et al. | Further observations on the size, shape and hydration of kappa-carrageenan in dilute solution | |
Houben et al. | Indirect solid freeform fabrication of an initiator‐free photocrosslinkable hydrogel precursor for the creation of porous scaffolds | |
DE69333586T2 (de) | Verfahren und zusammensetzung zur konservierung von antigenen und verfahren zur verwendung von durch selbiges verfahren hergestellten zytologischem material | |
DE1813571A1 (de) | Plasmastreckmittel aus Staerke und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE1523133B2 (de) | Vergleichsstandard zur kolorimetrischen Bestimmung des Gesamtcholesterins im menschlichen Blutplasma | |
EP2059783B1 (en) | Composition and method for handling tissue samples | |
Peat et al. | 438. Determination of the degree of polymerisation of reducing oligosaccharides | |
Stary | Mucosaccharides and glycoproteins: chemistry and physiopathology | |
Jayaprakash et al. | One-pot chemo-, regio-, and stereoselective double-differential glycosidation mediated by lanthanide triflates | |
WO1993021928A1 (en) | Liquid glucose control solution and process of making the same | |
KR20210125031A (ko) | 단백질 하이드로겔, 이의 제조 방법 및 용도 | |
AU2015328052B2 (en) | Dissolution testing of hydrophobic active pharmaceutical ingredients such as avermectins with or without pyrantel | |
Mráček et al. | The diffusion process of sodium hyaluronate (Na‐Ha) and Na‐Ha‐n‐alkyl derivatives films swelling | |
CN114601966A (zh) | 透明质酸钠凝胶润滑液、填充剂及其制备方法和应用 | |
Antonov et al. | Effects of pharmaceutical preparations on the rate of degradation of poly (Lactide-Co-Glycolide) scaffolds | |
EP0276442B1 (de) | Eindeckmittel für Mikroskopie-Präparate | |
Michurov et al. | Cryostructuring of polymeric systems. 61. Physicochemical properties of poly (vinyl alcohol) cryogels prepared on the basis of urea-containing DMSO-solutions of the polymer and evaluation of the resultant gel materials as potential drug carriers | |
Holmvik | Depolymerisation and Characterisation of Xanthans-A study of rheological and structural properties for Enhanced Oil Recovery | |
US4594237A (en) | Method for testing chemical and biological substances |