NO865263L - Lavviskos hoeymolekylaer filtersteriliserbar hyaluronsyre. - Google Patents

Description

Fordelene ved anvendelsen av hyaluronsyre og dens salter

(HA) som erstatningsstoff av øyne- og leddvæsker er vel-kjent, sml. eksempelvis US-patenter 4 141 973, 4 517 795

og 2 975 104. De fleste anvendelsesformål av hyaluronsyre eller dens salter krever en polymer med høy molekylvekt. HA-produkter som hylartil (Pharmacia ifølge US-patent 4 141 973) har en høy molekylvekt imidlertid er de også høyviskose. et slikt høyviskost produkt kan være ideelt for mange for-

mål (dvs. nedsettelse av addisjonssdannelser etter kirurgis-ke inngrep), Ha til injeksjon bør imidlertid fortrinnsvis ha lav viskositet og være filtrérbar, spesielt filtersteriliserbar. Noen nye ekstraheringsfremgangsmåter fremstiller lavviskose HA, imidlertid har disse også en lav molekylvekt (Sterivet-produkt, US-patent 4 517 195 og Shimada og Matsu-mura 1975). Tydeligvis har dette produkt noen fordeler med hensyn til injiserbarheten imidlertid krever dens lave molekylvekt anvendelsen av høyere doseringer (5,0 ml Sterivet i forhold til 2,0 ml av farmacia-produkter). Dessuten er Sterivet-HA ikke filtersteriliserbar, men må steriliseres

ved hjelp av varme.

Ingen har hittil omtalt arbeidsmåter til fremstilling av høymolekylært HA av lavmolekylært HA. Imidlertid er det i litteraturen beskrevet en fremgangsmåte til nedsettelse av viskositeten ved innstilling av pH (Mitra et al, 1983, Mitra, Raghunathan et al, 1983 og Sheehan et al, 1983). Disse grupper diskuterer ikke molekylvekten, setter imidlertid denne foreteelse av reversibel pH-verdi i forhold til en konformasjonsendring i HA-molekylet. De omstiller teoretiske overveielser dithen at en nedsatt viskositet sannsynligvis er å tilbakeføre på en øket fleksibilitet av den polymere som kan være følgen av en overgang orden til uorden. Dette antyder en ustabilitet av den polymere og en endelig nedsatt moelkylvekt. Som (1969) stilte til diskusjon at tap av viskositet kunne være forårsaket ved en ionisering av hydroksyl-gruppene og en oppbrytning av mellomrest-hydrogenbindingene innen den statiske vikling av a-helixstrukturen av HA. Interessant lar denne foreteelse seg anvende av en høy pH- dannende viskositetsnedsettelse fullstendig synkning av pH omtrent 2,5. Faktisk frembringes en pH på omtrent 2,5,

et viskoelastisk kitt (Gibbs et al, 1968). Det er likeledes av interesse at HA med lav viskositet i høy pH er meget van-skelig å sterilisere ved filtrering. Foran filteret oppbygger det seg et gelsjikt som praktisk talt umuliggjør filtrering i stort volum.

Det er nå funnet relativt enkle og nye arbeidsteknikker til fremstilling av høymolekylært HA, hensiktsmessig i form av natriumhyaluronat, NaH) med høy'viskositet, og til nedsettelse av HA-viskositeten uten nedsettelse av den ønskede høye midlere molekylvekt. Det derved fremstilte HA-produkt erkarakterisert veden høy midlere molekylvekt (fortrinnsvis større enn ca. 1,2 x 10^) med smalt molekylvektsområde,

lav viskositet (fortrinnsvis mindre enn ca. 500 cSt i en opp-løsning på 1 vekt-% ved 37°C)v ultrahøy renhet (< 1,25 mg/ml, fortrinnsvis < 0,1 mg/ml protein eller aminosyrer, og ved hjelp av HPLC eller UV-spektrometri og <45 mg/ml, fortrinnsvis ^5,0 yg/ml nukleinsyre, målt ved hjelp av de samme teknikker).

En lavviskos HA som dessuten har høy moelylvekt med et smalt molekylvektsomdråde, kan enten fåes ved en målrettet kontroll-ert varmebehandling av HA oppløsningen, eller ved filtrering av en oppløsning med minimalkonsentrasjon under høyt trykk eller vakuum gjennom sneverporede membraner. Meget over-raskende er disse prosesser av viskositetssenkning ikke umiddelbart reversible som dette er tilfellet ved den ovenfor omtalte prosess ved pH-endring, og senket heller ikke molekylvekt i sammenheng med senkningen av viskositeten. Dessuten muliggjør de her omtalte teknikker av viskositetssenkning av HA sluttproduktet filtersteriliseres til en anvendelse av pH til senkning av viskositeten ikke gir et fil-trerbart produkt.

Prosessen av varmeavhengig viskositetssenkning er direkte proporsjonalt tid og temperatur. Jo lengre varmebehandlingen gjennomføres ved en konstant temperatur (fortrinnsvis i om rådet på 50°C til 70°C) desto lavere ble viskositeten. En økning av temperaturen til en verdi rundt 121°C senker viskositeten i løpet av kortere tidsrom.

Innvirkningen av en for høy temperatur under en for lang

tid (over 60 minutter ved over 121°C) fører til karamelli-sering og en viss hydrolyse, som har til følge en uønsket senkning av molekylvekten. Ved anvendelse av filtrerings-teknikken bør den sneverporede membran ha en midlere pore-størrelse på mindre enn ca. 1 ym, fortrinnsvis på mindre enn 0,5 ym.

Et meget viktig aspekt av foreliggende HA-produkt er at det har en realtivt høy molekylvekt (minst ca. 1 000 000, fortrinnsvis minst 1 800 000) og en kunstig frembragt viskositet (f. eks. mindre enn ca. 500 cSt, fortrinnsvis mindre enn ca. 500 cSt, målt som 1 %-ig vandig oppløsning av natrium-saltet). Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til senkning av viskositeten uten nevneverdig nedsettelse av den høye midlere molekylvekt forklarer de følgende eksempler og tabeller (hvori molekylvekten er bestemt ved hjelp av FPLC og viskositeten er den av en vandig oppløsning med 1 vekt-% NaH ved 37°C hvis intet annet er angitt).

En fremgangsmåte hvorav det fremkommer en forøket molekylvekt og en øket viskositet av HA arbeider med anvendelsen av en i et bad av et ikke oppløsningsmiddel for HA eller NaH dyppende kontinuerlig i en bevegende innretning hvorpå det utfallende HA eller utfallende NaH kleber. Et vikleapparat, her betegnet som "vikler", gir det flytende medium hvori HA utfelles en rotasjonsskjaéring og gir et substrat som beveger seg hvorpå det utfallende HA kan gjøres fast. Vikleren er fremstillet av stenger eller staver av ikke rustende stål som er anordnet i loddrett orientering, og er fastgjort på en roterende aksel. En loddrett aksel foretrekkes. Akselen dreies ved hjelp'av en motor, hvis hastighet kan reguleres. Den nøyaktige størrelse og bygningstype av vikleren kan vari-ere alt etter størrelsen av beholderen, mengden av HA som skal samles. En av en roterende sylinder av masketråd bestående buelignende konstruksjon foretrekkes. Under anvendelse av denne vikler forløper fremgangsmåten til fremstilling av høymolekylært og høyviskos HA således som det beskrives neden-for .

Oppløsningen av natriumhyaluronat innføres i form av en fin strøm eller flere fine strømmer i en beholder av ikke opp-løsningsmiddel, fortrinnsvis etanol. Ved berøring med ikke oppløsningsmiddel mettes produktet med en gang med ikke opp-løsningsmidlet, og faller derved ut i form av lange snorer. Disse snorer holdes i bevegelse ved rotasjon av vikleapparatet som på sin side setter oppløsningsmidlet i beholderen i en dreiebevegelse. Ved berøring av den utfelte snor av uoppp-løselig natriumhyaluronat med "fingerne" eller loddrette staver av vikleren kleber utfellingen ,seg til disse. Da produktet tenderer til å klebe til seg selv og til de fleste overflater, samler det seg da på vikleren. Man antar at denne klebing i seg selv frembringer lengre polymere som danner tallrike hydrogenbindinger med restene, hvilket igjen har til følge en høyere molekylvekt og en høyere viskositet. Ved anvendelse av en beholder som kan tømmes fra bunnen, er det deretter mulig å utta fra beholderen den nå fortynnede ikke oppløsningsmiddel, og etter ønske å tilføre en oppløs-ning med vann eller puffer. Det utfelte produkt kan på denne måte i beholderen uten videre håndteres, og igjen gjøres opp-løselig. Det er her å bemerke at den lære som fremgår av US-patent 4 517 795 fører bort fra en arbeidsmåte som denne.

I US-patent 4 517 795 betones gjentatt at etanol-HA-oppløs-ningen ikke skal omrøres eller sammenblandes.

Varmebehandlingametode

Tabellen 1 til 3 viser virkningen av varme på viskositeten. Samtlige viskositeter ble målt ved hjelp av et Cannon-Manning-semimikroviskosimeter tilsvarende de i ASTM D445 og D2515 omtalte arbeidsforskrifter ved 37°C er angitt i centistokes,

(cSt). Molekylarvekten ble bestemt ved gelfiltrering (Heft-mann, Kromatografi) ved hjelp av en fast protein Liquid Chromatograph (FPLC) og en TSK HZ 65F- eller TSK HZ 75F-søyle etter følgende arbeidsmåte.

Bestemmelse av vektsmiddelet av molekylarvekten (Mw) for natriumhyaluronat.

1.0 Formål

Å gjøre en metode av væskekromatografi disponibel for å bestemme en midlere vekt for„.natriumhyaluronat-molekyl i forhold til kjente molekylarvekt-middelverdier.

2.0 Område

Anvendbart på alle råstoffer i fremgangsmåten og/eller ferdigprodukt-prøver av natriumhyaluronat.

3.0 Prinsipper

Gelfiltrering (utelukkelseskromatografi etter størrelse) formår å bestemme en molekylarvekts-informas jon ved sammen-ligning av analy1-topp-elusjons-volumina med en standard-kurve som ble oppstillet på grunn av analyse av stoffer med lignende molekylform og tetthet som likeledes har en kjent midlere molekylvekt. Standardkurven skal for å være ytelsesdyktig være oppstillet over et område av mole-kylstørrelsesstandard, hvori den interesserende analyt faller.

4.0 Arbeidsmåte

4.1 Instrument- parametere

Søyle - Fractogel TSK HW 65F (EM Sciences) fraksjon-eringsområde = molekylvekt M W50 000 til 5 000 000 (globulære arter).

søylestørrel-

se - 50 cm - 2 cm x 2,01 cm indre diameter gel-lagring.

Mobil fase -' PBS-P (formel tilføyet) filtrert over 0,22

ym PTFE (150 ml/injeksjon).

Strømningshastighet - 2 ml/min.

Papirhastighet - 0,20 cm/min.

Detektorfølsomhet - 4 x 0,05 (ISCO VY).

Bølgelengde - 205 nm til 208 nm.

Syreapparat - LCC 500 (Pharmacia), programmert til drift av søylen tilsvarende de angitte instrument-parametere.

Injeksjonsvolum - 1000 yl.

Temperatur - søylen må holdes på konstant temperatur idet værelsestemperatur er mest gunstig. Konstansen av'-'basislinjen påvirkes uheldig når temperaturen svinger under et gjennom-løp, og bare gjennomløp ved samme temperatur

er uten videre sammenlignbar.

Man lar søylen med den mobile fase stabilisere seg inntil det er oppnådd en konstant basislinje.

4.2 Oppstilling av en standard- kurve

4.2.a Reagenser

Mobil fase:

Thyreoglobulin (Sigma #T-1001) Mw 669 000 eller ekvivalent og blå dekstran.

4.2.b Standard

Man tilbereder en thyreoglobulin-stamoppløsning ved innveining av 0,006 g i en 25 ml målekolbe. Man fortynner med den mobile fase inntil merket. Man lar stoffet oppløse seg fullstendig og ryster for blanding fra tid til annen. Man pipetterer 10 ml av stamoppløsningen i en 20 ml målekolbe. Man fortynner med den mobile fase inntil merket. Den dannede oppløsning inneholder 125 yg/ml thyreoglobulin.

4.2.C Man tilbereder en stamoppløsning av blå dekstran ved innveining av 0,0 8 g i en 20 ml målekolbe. Man fortynner ved den mobile fase inntil merket. Man lar stoffet oppløse seg fullstendig, og ryster for blanding fra tid til annen. Man pipetterer 5 ml av stamoppløsningen i en 20 ml målekolbe. Man for-

tynner med den mobile fase inntil merket. Den dannede oppløsning inneholder 1000 yg/ml blå dekstran .

De to stamoppløsninger er avkjølt bestandig i 30 dager. Man ansetter arbeidsoppløsningene daglig friske fra stamoppløsningene. Man filtrerer begge arbeidsoppløsninger før kromatografien gjennom et

0,22 ym filter.

4.2.d Man pipetterer 3,5 ml av hver M -standard i tilsvarende betegnede duplikat-prøverør. Man innstill-er syreapparatet på tallet av injeksjoner.

4.2.e Man bestemmer en midlere gjennomsnittsvolum av elu-eringen (ve) f°r begge standarder.

4.2.f Man beregner K for hver standard etter

av

V = elueringsvolum,

Vq - tomvolum (total utelukkelse av gel-porene), V0= (Vt' 0,33) '

- samlet søylevolum av den pakkede gel,

K^v = brøkdel av det stasjonære gel-volum, som til enhver tid står til disposisjon for diffu-sjonen av den oppløste art,

Vfc = 1f r2 h

r = radien av søylens indre dimensjon,

h = høyde av pakningen i søylen.

4.2.g Man fremstiller en grafisk gjengivelse av hvis X-akse oppføres log Mw av standarden og hvis Y-akse det oppføres K . Man innfører K -verdiene av stan-av av

dard i diagrammet og tegner de to standard-punkter skjærende utligningskurver.

Eller:

Man inntar de overnevnte data i en for "linjær regress jon" programmerte regner eller computer.

4.3 Bestemmelse av prøvens midlere molekylvekt.

4.3.a Når analyten inneholder 0,80 til 1,2 % HA innveier man en prøve av 0,48 til 0,52 g i en 20 ml målekolbe. Man fortynner med den mobile fase inntil merket (fortynning 1:40) .

4.3.b Når analytene inneholder mindre enn 0,80 % HA innveier man en prøve på 0,78 til 0,82 g i en 20 ml målekolbe. Man fortynner med den mobile fase inntil merket (fortynning 1:25).

4.3.c Når analytene inneholder 1,2 til 2,0 % HA innveier man en prøve på 0,31" til 0,35 g i en 20 ml målekolbe. Man fortynner med den mobile fase inntil merket, (fortynning 1:60).

4.3.d Man følger de ovenfor til instrumentelle innretning angitte arbeidsmåter. Man injiserer prøve på 1000 pl av de ved 0,2 ym filtrerte prøver.under de samme instrumentelle betingelser som ved standard-iseringen .

4.3.e Man bestemmer Vg for hver injeksjon. Man beregner K som ovenfor,

av

4.3.f Man oppfører Kav~verdiene for prøve eller innfører dem. Man bestemmer den tilsvarende verdi log Mw på X-aksen. Man bestemmer antilog til tallmessig bestemmelse av den midlere molekylvekt.

5.0 Validitet av resultatene

5.1 Standarder

Standard-verdier er gyldige når Vg for thyreoglobulin utgjør 0,25 til 1,39 ml/cm gel. V for den første

e

topp av blå dekstran utgjør 0,82 til 0,90 ml/cm gel (den annen topp er den av en fraksjon med en mindre

M enn 2 000 000).

w

5 . 2 Prøver

Resultatene er gyldige når prøve-Ve~verdiene faller

i standard-kurven.

5.3 Resultatene er gyldige når K -verdiene for standard-av

prøvene er mindre enn 1,0, imidlertid større enn 0,0.

5.4 Resultatene er gyldige når analytkonsentrasjonen ligger

i området på 0,20 mg/ml til 0,30 mg/ml (eller en forskyv-ning kunne finne sted).

6.0 Anmerkning

Standard-kurven skulle fornyes hver 30.dag med friske reagenser hvis ikke endringer i systemparameterene krever en hyppigere utvurdering, f. eks. en fortetning av gelen eller en ny søyle.

Formel for den mobile fase PBS- P

Man har

8.5 •- g NaCl

0,22 3 g Na^HPO^(vannfritt)(kan hvis nødvendig erstattes

med 0,2 8 g Na2PC>4 i hydrat) og

0,04 g NaH2P04. H20

i en 1000 ml målekolbe og fortynne med destillert avionisert vann inntil merket. Man blander godt. Man filtrerer før bruk gjennom et 0,22 ym filter. Blandingen er ved oppbevar-ing i steril omgivelse bestandig i 15 dager ved værelsestemperatur.

For tabell 1 ble blandingene oppvarmet i 7 til 20 dager i et åpent kar på en konstant temperatur på ca. 60°C. Ved anvendelsen av denne foretrukkede behandling faller viskositeten ty-delig (f. eks. fra 4475 til 134 for blanding 1), mens molekylvekten forblir lik. Fig.. 2 viser FPLC-topper for aliquote deler av blanding 2 som ble uttatt ved varmebehandlingen. Samtlige topper er identiske hvilke viser at ved varme be-virkes ikke engang små svingninger eller forskyvninger av molekylarvekten.

De i tabell 2 oppførte dataer ble oppnådd ved oppvarming av tre aliquote deler av den samme 1 %-oppløsning av natriumhyaluronat (NaH) under et konstant tidsrom, imidlertid under anvendelse av temperaturer mellom 30°C og 50°C. Det er tyde-lig at viskositeten av en slik polymeroppløsning sogar kan senkes ved langtidsoppbevaring ved 30°C (fra 318 til under 2 98).

Økningen av temperaturen til 50°C bevirker i det samme tidsrom en større viskositetsnedgang (dvs. fra 318 til under 175) . Igjen ble molekylarvekten ikke påvirket.

Effekten av en høy temperatur på viskositeten av NaH er vist

i tabell 3. En oppløsning av 1,1 % NaH ble autoklavert i 30 minutter (1,034 bar (15 psi) trykk ved 121°C). Den ble deretter re-autoklavert. Av tabell 3 fremgår at ved denne korttids høytemperaturbehandling ble viskositeten senket be-traktelig uten at molekylvekten ble påvirket.

Det er funnet at varmebehandlingen er virksom over et bredt område av betingelser og f. eks. avhenger det av utgangsma-terialets viskositet. Et foretrukket område ligger mellom ca, 27 dager ved temperaturer mellom ca. 55°C og 80°C i et åpent kar. Det synes som viskositetssenkningen hemmes når varmebehandlingen gjennomføres i et lukket kar.

Filtreringsmetode

Anvendelsen av filtreringsteknikker til nedsettelse av viskositet avhenger av porestørrelse, strømningshastighet og an-tallet av faktiske filtreringer. Teknikken skulle anvendes på Ha-oppløsningen av ca. 1 vekt-% eller mer da i mere fortynnede oppløsninger molekylene ikke er tilstrekkelig komplek-sert når i gjennomgang gjennom filterporene å fundergå en konfigurasjonsmessig modifisering. Ved slike konsentrasjoner er viskositeten høy nok for å kreve spesielle skritt til gjennomføring av filtrering som anvendelse av høyere trykk eller vakuum og større forhold mellom filterflate og oppløs-ningsvblum. Jo mindre porestørrelse er (f. eks. under 0,5 ym) og jo høyere trykket eller vakuum er, desto lavere blir viskositeten. Dessuten minskes viskositeten i direkte forhold til antall filtreringer. Tabell 4 viser denne filtrerings-effekt. Cellulosenitrater ble anvendt med et vakuum på 12,5 til 36 cm Hg. Igjen minskes viskositeten uten at molekylarvekten påvirkes.' Man antar at dette forhold er ethvert filter-matriksmaterial avtagbart.

'Det er å bemerke at HA eller NaH normalt bare er meget van-skelig filtersteriliserbart ved hjelp av et 0,22 ym membran-filter. Selv HA eller NaH som det ble beskrevet i det fore-gående når senking av viskositeten ble bragt til pH 11, formår ikke uten videre å passere.dette filter. Det er imidlertid funnet at enten fremgangsmåten ved oppvarming eller fremgangsmåten ved filtrering frembringer HA eller NaH, som lett går igjennom et 0,22 ym filter hvilket muliggjør steri-lisering av den ferdige sluttproduktformulering. Teoretiske overveielser giår mot at begge fremgangsmåter av viskositets-sekning eller molekylkonformasjdnen på tilsvarende måte som det sees ved pH-økning. Den opprinnelige stive a-Helix-struktur av NaH eller HA av høyere viskositet avspennes ved brytning av mellomrestbindingene ved varme eller filtrering. Ved begge fremgangsmåter er imidlertid viskositetsnedsettelsen ikke reversible at enkeltemperaturen eller pH senkes, slik dette iakttas ved den ved pH-endring bevirkede viskositets-endiring.

De to her omtalte fremgangsmåter muliggjør fremstillingen av høymolekylære lavviskose HA, som ved slutten er filtersteri-liserbare. Den foretrukkede fremstillingsfremgangsmåte er an-ført i eksempel 1.

Oppfinnelsen forklares nærmere ved hjelp av følgende eksempler som imidlertid ikke er å anse som begrensende, i eksemplene refereres samtlige deler og prosenttall seg til vekt, hvis intet annet er angitt.

Eksempler

1. Man anvender oppløsning inneholdende HA (som sådanne eller som salt, fortrinnsvis kalium eller natrium) i en konsentrasjon på tilnærmet 0,5 % eller høyere. HA stammer fra en bakterie-fermenteringskilde eller en annen kilde (dvs. fra hanekammer, navlesnorer etc). HA som bakter-ielle kilder foretrekkes. 2. Man oppbygger et vikler-apparat således at HA-oppløsningen

kan innmates i 95 % etanol til en beholder mens vikler-

en blander etanol.

3. Man setter HA til etanolen, mens vikleren blander etanolen langsomt til måtelig hastighet. 4. Man fortsetter viklingen etter tilsetning av den siste HA-oppløsning ennå omtrent 30 minutter.

5. Man tømmer etanolen fra beholderen etter at den utfelte

HA har viklet seg rundt vikler-buret.

6. Man fyller beholderene med vann til injeksjon. Man inn-stiller viklere og lar den gå videre med langsom hastig-hét inntil HA har oppløst seg fullstendig. 7. Man gjentar trinnene;,2 til 6, til det er oppnådd den ønskede renhet, den ønskede molekylarvekt eller den ønskede viskositet. 8. Til nedsettelse av viskositet og opprettholdelse av den høye molekylarvekt og det snevre molekylarvektområdet gjennomføres varmebehandling.

a. Man overfører den rensede HA- eller NaH-oppløsning med

ca. 1,2 % HA i en ommantlet beholder med en blander som er i stand til omrøring av en høyviskos oppløsning.

b. Man regulerer fortrinnsvis varmen til en verdi mellom

75°C og 65°C.

c. Såvidt fordampning finner sted, etterfylles vann til injeksjon (WFI), for å opprettholde det opprinnelige volum. d. Viskositeten overvåkes inntil det på forhånd fastlagte verdi fortrinnsvis under 150 cSt oppnås eller underskrides. 9. Etter varmebehandlingen er HA-materialet av lav viskositet, høy molekylarvekt, et snevert molekylarvektsområde, og har ultrahøy renhet. Materialet er også bestandig mot lys og varme. 10. For fremstilling av sluttprodukter steriliseres det i 9. omtalte HA-material. Dette foregår fortrinnsvis ved hjelp av sterilfiltrering gjennom et filter av 0,22 ym. Varme-sterilisering kan likeledes anvendes.

Produkt, som var blitt dannet etter arbeidsmåten ifølge dette eksempel ble gjentatt testet etter langtidsinnvirkning av lys ved værelsestemperatur (flere måneder), og etter langtidsinnvirkning av temperaturer på minst 60°C (12 måneder). Molekylarvekten og % AI var uendret etter disse behandlinger.

Det ble dessuten såvel ved analytiske prøver som også ved

in vivo-undersøkelser funnet at produktet er antigenfritt. Hyperimmuniseringen såvel av hester som også av kaniner frem-kalte ingen ved hjelp av Western Transblot Elektroforese-teknikker påvisbare antistoffer. Tre intramuskulære injeksjoner av en vandig pufferet oppløsning av 1 vekt-% ble fore-tatt i intervaller på 7 dager, idet det ble gitt injeksjoner på 0,5 ml for kaniner på 2,0 ml for hester. Den til Arthus-fenomenet likeartede hudreaksjonsprøve (Arthus Phenomenon Like Skin Reaction Test) som omfatter etterfølgende injeksjon av et makrofagt følsomt farvestoff i en ørevene og den etter-følgende intraperitoneale injeksjon av denne HA, likeledes en negativ indiaksjon, dvs, ingen immunreaksjon. Injeksjonen av 2 ml av en puffret vandig oppløsning av 1 vekt-% av natrium-saltet enten i tibiotarsal- eller radialcarpal-leddet av en hest frembragte ingen immunreaksjon sli.k den ble vurdert på grunn av hevingen etter injeksjonen (sml. med den ved injeksjon av det puffrede oppløsningsmiddel alene).

Til anskueliggjørelse av resultatene av de ovenfor omtalte arbeidsmåter, ble en fjerde HA-blander i teknisk målestokk under det samlede fremgangsmåte undersøkt på molekylarvekt og viskositet. Måleverdiene er oppført i tabell 5. Det er å anmerke at alle prøver er inneholdt 9,0 og 10,0 mg/ml HA oppløst i vann til injeksjon. Molekylvekt og viskositet øker som følger av viklingen imidlertid bare viskositeten avtar ved varmebehandlingen. På grunn av dette har det resulterende produkt en høy moelkylarvekt og en lav viskositet.

Når det er ønsket et høymolekylært høyviskost produkt, kan trinnet med varmebehandling utelates. En 6-propiolakton-eller gamma-strålesterilisering kan gjennomføres.

Under anvendelse av den foretrukkede fremgangsmåte kan det fremstilles et produkt med de i tabell 6 angitte spesifika-sjoner. Denne tabell '.sammenligner produktet ifølge oppfinnelsen med de i handelen oppnåelige produkter fra Pharmacia og Sterivet. Dette bekrefter det enestående i dets produkt-karakteristiske verdier.

Claims (10)

1. I det vesentlige ren,., lys- og varembestanding hyaluronsyre eller et salt herav med en midlere molekylvekt på minst ca. 1 200 000 u (Dalton) middels FPLS, en irreversibel viskositet på mindre enn ca. 500 cSt i en vandig oppløsning med 1 vekt-% av natrium-saltet ved 37°C og den evne uten videre å la seg filtersterilisere gjennom et filter på 0,22<y>m.

2. Lys- og varmebestandi<g>''h<y>aluronsyre eller et salt herav med følgende karakteristika: a) en midlere molekylarvekt bestemt ved hjelp av FPLC på minst 1,2 x 10^ u (Dalton), b) en molekylarvektfordeling som gir .en enkelt i den vesentlige symmetrisk FPLC-fordelingstopp, idet minst 98 % av materialet har en vekt mellom ca. 1,2 x 10^ og 4,0 x IO<6>, c) en viskositet av en vandig oppløsning med 1 vekt-% av natriumsaltet ved 37°C som mindre enn ca. 500 cSt, d) evnen å være lett filtersteriliserbar gjennom et filter på 0,22 ym porestørrelse, e) et proteininnhold på mindre enn ca. 1,25 mg/ml, og et nukleinsyreinnhold på mindre enn 0,45 yg/ml ved hjelp av UV-ekstinksjon, f) uteblivelse av en nevneverdig immunreaksjon når 2 'ml av en vandig oppløsning av 1 vekt-% av natriumsaltet enten injiseres i tibiotarsal- eller radialcarpal-ledd av en hest, vurdert på grunn av hevelsen etter injeksjonen.

3. Fremgangsmåte til fremstilling av en blanding inneholdende hyaluronsyre eller et salt herav, omfatter trinnene a) utvinning av hyaluronsyre (HA) eller et salt herav fra en kilde som ved fermentering fra hanekammer eller navlesnorer , b) utfelling av HA under anvendelse av en spesiell vikler til økning av molekylvekten på minst ca. 1 800 000, c) oppvarming av produktet fra trinn b) under betingelser som er tilstrekkelig til uten nevneverdig senkning av molekylvekten å senke viskositeten på mindre enn ca. 500 cSt.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisertved at produktet oppvarmes til minst 50°C.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisertved at i trinn b) økes molekylvekten til minst ca.

2 000 500, oppvarmingen til minst 50°C varighet minst 72 timer, og gjennomfører til betingelser som er tilstrekkelig til senkning av viskositeten på mindre enn ca. 150 cSt.

6. Fremgangsmåte til fremstilling av en blanding inneholdende en hyaluronsyre eller et salt herav, omfattende trinnene a) utvinning av hyaluronsyre (HA) eller et salt herav ved fermentering eller fra en annen kilde, b) utfelling av HA-produkter fra trinn a) under anvendelse av en spesiell vikler til økning av molekylvekten til minst ca. 1 800 000. c) Filtrering av produktet fra trinn b) gjennom et filter med en midlere porestørrelse på ca. 1 ym eller mindre under betingelsene som er tilstrekkelig til å sikre en senkning av viskositeten til mindre enn ca. 500 cSt.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at filteret i trinn b) har en midlere porestørrelse på mindre enn ca. 0,5 ym.

8. Fremgangsmåte til forsnevring av molekylarvektsfordelingen og til økning av molekylarvekten av hyaluronsyre eller et salt herav, omfattende en utfelling av dette i et bad er ikke opp-løsningsmiddel som inneholder en innreting som beveger seg kontinuerlig hvilket det utfelte material kan klebe.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at det utfelte material gjenoppløses og behandles for senkning av dens viskositet til mindre enn ca. 500 cSt, målt på en vandig oppløsning med 1 vekt-% av natriumsaltet ved værelsestemperatur.

10. Fremgangsmåte til senkning av en viskositet av en høy-molekylær hyaluronsyre eller et salt herav, omfattende oppvarming av en oppløsning av et slikt material med en molekylarvekt bestemt ved hjelp av FPLC på minst ca. 1,1 x 106y (Dalton) og en viskositet av en vandig oppløsning med 1 vekt-% av natriumsaltet ved 37°C over 500 cSt i et tidsrom, og ved en temperatur som er tilstrekkelig til å senke viskositeten ute at derved molekylarvekten påvirkes nevneverdig.