HU195855B - Process for production of ll-e 33288-marked antibioticumkomplex and its components with antitumor effect and medical compositions containing them - Google Patents
Process for production of ll-e 33288-marked antibioticumkomplex and its components with antitumor effect and medical compositions containing them Download PDFInfo
- Publication number
- HU195855B HU195855B HU854365A HU436585A HU195855B HU 195855 B HU195855 B HU 195855B HU 854365 A HU854365 A HU 854365A HU 436585 A HU436585 A HU 436585A HU 195855 B HU195855 B HU 195855B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ethyl acetate
- following
- saturated
- aqueous potassium
- potassium dihydrogen
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/29—Micromonospora
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
Description
Találmányunk az (LI,-E33288cci-Br, LL-E33288c<i-J, LL-E33288«2-Br, LL-E33288c«-J,
LL-E33288oc3-Br, LL-33288c£3-J, LL-E33288fZ,-Br, LL-E33288/J ι-Br, 1Λ.-Ε33288β i-J, Lb-E33288fij-Br, LL-E33288őj-J LL-E33288yi-Br, LI,-E33288yi-J, és LL-E33288ii-J jelzésű új antibaktérium- és tumorellenes hatású szerek fermentációs úton történő előállítására, nyers oldatokból történő kinyerése és feldúsitására, valamint tisztítására vonatkozik. Találmányunk ezenkívül egy, több vagy az öszszes fenti komponenst tartalmazó baktériuméa tumorellenes szerek, ezek hígított formáinak és nyers koncentrátumainak előállítására vonatkozik új Micromonospora törzseikkel.
A találmányunk szerinti eljárással előállítható antibiotikumok az LL-E33288 komplexnek felelnek meg. Az I.L-E33288 antibiotikumok kémiailag egymással szoros rokonságban álló vegyületek. A 14 antibiotikumot fermentációs úton állítjuk elő és közvetlenül keverék alakjában nyerjük; ez az LL-E33288 komplex, az I.L-E33288 jód-komplex vagy LL-E33288 bróm-komplex. Az LL-E33288 antibiotikumok jódtaralmú komponensei (pl. «i-J, cC2—J, cca-J, ¢1-J, ¢2-3, yi-3 és íj-3) csak szervetlen vagy szerves jód időt tartalmazó táptalajon végzett fermentációk esetében keletkeznek, míg a bórtartalmú komponensek (pl. «ί-Βγ, «-Br, «-Br, «4-Br, Si-Br, ¢2-81^ és yi-Br,) hasonlóképpen csak szervetlen vagy szerves brómidomol tartalmazó táptalajon végrehajtott fermentációk esetében képződnek. Az LL-E33288 komplexben levő komponensek aránya a fermentációs körülményektől, s a bróm- és jód tartatomtól függ. A komplex fő-komponensei az LL-E33288 ¢1 és LL-E33288 >1 antibiotikumok, amelyek összesen, a komplex kb. 90 %-át alkotják. Mellck-komponens az L,L-E33288ocj, LL-E33288«,
LL-E33288cc3, LL-E33288«-Er, LL-E33288A2 és LL-E33288Si-J. Ezek össztömege a komplex tömegének kb. 10 %-a.
Az LL-E33288 antibiotikumok Gram-pozitiv és Gram-negativ baktériumok ellen hatékonyak. A .Biochemical Induktion Assay' {Elespuru R. és Yarmolinsky M.: Environmental Mutagenesís 1, 65-78 (1979/1 módosított tesztje szerint valmennyi komponens hatásosnak bizonyult, a teszt során specifikusan mérik a teszt-vegyület azon képességét, hogy közvetlenül vagy közvetett módon képes-e DMA károsodást megindítani. A fenti teszt során az I,L-E33288üi-Br, és LL-E33288 yi-Br, már 1.10'6 mcg/ml koncentrációnál _n’ dózisban aktívnak bizonyult
A rajzok rövid ismertetése
Az 1. ábrán az LL-E33288^-Br UV abszorpciós spektrumát tüntetjük fel.
A 2. ábrán az LL-E33288a ,-Br ÍR abszorpciós spektrumát mutatjuk be.
A 3. ábrán az LL-E33288¢ ι-Br proton mágneses rezonancia (a továbbiakban PMR1 spektrumát mutatjuk be.
A 4. ábrán az LL-E33288¢ι-Br ,3C mágneses rezonancia spektrumát (a továbbiakban ME) mutatjuk be.
Az .5, ábrán az LL-.E33288yi-Br UV abszorpciós siiektrumát tüntetjük fel.
A C. ábra az LL-E33288yi-Br ÍR abszorpciós spektrumát tartalmazza.
A 7. ábrán az LL-E33288yj-Br PMR spektrumét mutatjuk be.
A 8. ábrán az LL-E33288yi-Br 13C MR spektrumát tüntetjük fel.
A 9. ábra az LL-E33288«-J PMR spektrumát tartalmazza.
A 10 ábrán LL-E33288ocj-J PMR spektrumét mutatjuk be.
A 11. ábrán az LL-E33288¢ i-3 UV abszorpciós spektrumát tüntetjük fel.
A 12. ábrán az LL-E332883ι-J IR abszorpciós spektrumát mutatjuk be.
A 13. ábra az LL-E33288íi-J PHR spektrumát tartalmazza.
| A 14. | ábrán az | LL-E33288^-3 | I3C | MR |
| spektrumát | mutatjuk | be. | ||
| A. 15. | ábra az | LL-E33288-J1-.I | UV | ab- |
| szorbciós spektrumát | tartalmazza. | |||
| A 16. | ábrán az | LL-E33288yi-J | IR | ab- |
szorbciós spektrumát mutatjuk fce.
A 17. ábrán az LL-E33288y i-3 PMR spektrumát tüntetjük fel.
A 18. ábra az LL-E33288y i-J ”C MR spektrumát tartalmazza.
Az LL-E33288fli-Br és LL-E33288yi-J antibiotikumok fizikai-kémiai jellemzőit az alábbiakban ismertetjük:
LL-í'332St!űi-Br
1) Hozzávetőleges elem analízis: C%= 45 48,6; H7.=5,6; N7.=2,9; S%=9,1 és Br’/.=5,5. A kémiai analízis elektronspektroszkópiás meghatározása (ESCA) során azt találtuk, hogy csak az alábbi elemek vannak jelen: C, Η, N,
0, S és Br.
2) OP: 146-150 »C (bomlás).
3) Fajlagos forgatóképesség: [κ]26 s = -49 i 10 0 (c=0,l%, etanol).
4) UV abszorbciós spektrum: lásd 1. ábra (metanol; savas metanol; bázikus metanol).
5) IR abszorbciós spektrum: lásd 2. ábra (KBr lemezek).
6) PMR spektrum: lásd 3. ábra (300 MHz, CDCb).
7) I3C MR spektrum: lásd 4. ábra (75,43 60 MHz, CDCb, ppm, TMS);
A fontosabb csúcsok az alábbiakban:
| 17.60 | ' (o); | 17.64 | (q); |
| 22.4 | (q); | 22.8 | (q); |
| 36.9 | (t); | 39.2 | (t/d); |
| 52.7 | (q); | 54.6 | (t/d); |
| 57.8 | (d); | 61.0 | (q/d) |
| 66.9 | (d); | 68.4 | (d); |
| 70.2 | (d); | 71.1 | (d); |
| 76.1 | (d); | 81.0 | (d); |
| 97.4 | (d); | 99.7 | (d); |
| 115.1 | <s); | 123.4 | (d); |
| 130.2 | (s); | 130.8 | (s); |
| 149.5 | (b); | 191.7 | («>-, |
| 18.9 | (q); | 19.7 | (q); |
| 23.5 | (q); | 34.3 | <t); |
| 47.8 | (d); | 51.7 | (q); |
| 56.3 | (q); | 57.2 | (q); |
| 61.7 | (d); | 62.4 | (t); |
| 69.1 | (d); | 69.7 | (d); |
| 71.9 | (d); | 72.1 | (s/t) |
| 83.3 | (s); | 88.2 | (s); |
| 100.8 | (s); | 102.5 | (d); |
| 124.4 | (d); | 126.5 | (d); |
| 144.6 | (b); | 149.3 | (s); |
| 192.4 | (s>; |
8) Molekulatömeg: 1333 ill. 1335, 79Br ill.
slBr-ra, FAB-MS meghatározás szerint. 15
9) Összképlet: Cs^Hs^NaOíjSíBr; pontos tömegek 1258, 3699 (79Br) és 1260, 3726 (81Br) értéknél, nagy felbontóképességű FAB-MS meghatározás szerint és
CsiHaiNsOnSsBr-re (M+H-C2H4OS) számítva. 20
LL.-E33288 ji-Bi·
1) UV abszorbciós spektrum: lásd 5. ábra (metanol; savas metanol; bazikus metanol).
2) IR spektrum abszorbciós spektrum: lásd 6. ábra (líBr lemezek).
j; PMR spektrum: lásd 7.ábra (300 MHz, CI >C i.i).
4) 13C MR spektrum: lásd 8. ábra (75,43 MHz, CDCb, pprn, TMS).
| A fontosabb csúcsok | az alábbiak: |
| 14.4 | 17.6 |
| 19.7 | - |
| - | 34.0 |
| 42.1 | - |
| 54.1 | 56.3 |
| 59.3 | 61.1 |
| 67.2 | 68. Jí |
| 70.1 | 70.8 |
| 71.8 | 76.1 |
| 82.9 | 88.4 |
| 100.0 | 100.2 |
| 115.3 | 123.0 |
| 130.4 | 131.1 |
| 144.7 | - |
| 155.6 | 192.5 |
| 17.9 | 19.0 |
| 22.8 | - |
| 37.6 | 39.5 |
| 51.6 | 52.7 |
| 57.3 | - |
| 61.8 | 61.9 |
| 68.23 | 69.7 |
| 71.1 | 71.7 |
| - | 81.0 |
| - | 97.8 |
| 101.3 | 103.0 |
| 124.9 | 126.9 |
| 131.8 | 138.0 |
| 149.5 | 149.6 |
| 192.9 |
5) Összegképlet: CsalbabbChaSíBr, az UV, ÍR, H NBR és l3NMR adatoknak az LL-E33288^i-Br és LL-E33288}| ι-J megfelelő értékeivel való Összehasonlítás útján.
6) Molekulatömeg: 1319 ill. 1321, 798r ill. 81Br-re. az összegképlet alapján számítva.
Az LL-F.33288«:i-J, LL-E33288oC2-J, 1,1,-E33288oC3-J és LL-E33288jjj-J és LL-E33288 71-J antibiotikumok fizikai-kémiai jellemzőit az alábbiakban ismertetjük:
3) Proton mágneses rezonancia spektrum: lásd 9. ábra (300 MHz, CDCb).
5 ,.1.-E33288&-J
1) Molekulatömeg: 1066 (FAB-MS meghatározás szerint).
2) PMR spektrum: lásd 10. ábra (300 50 MHz, CDCb).
LL-E33288OI-J
LL-k'332880i-J
1) Molekulatömeg: 1145 (FAB-MS meghatározás szerint).
LL-£33288a!i-J'
1) Eleklronspeklroszkópiás kémiai analízis (ESCA) szerint csak az alábbi elemeket tartalmazza: C, N, 0, S, J.
2) Molekulatömeg: 1131 (FAB-MS szerint meghatározva).
1) UV abszorbciós spektrum: lásd II.
ábra (metanol, savas metanol, bazikus metanol).
2) ÍR abszorbciós spektrum: lásd 12. ábra (líBr lemez).
3) PMR spektrum: lásd 13. ábra (300
MHz, CDCb).
4) 13C MR spektrum: lásd 14. ábra (75, 13 MHz, CDCb, ppm. TMS);
A fontosabb csücsök az alábbiak:
| - | 17.5 |
| - | 22.4 |
| 25.4 | 34.3 |
| - | 47.9 |
| 54.8 | 56.3 |
| 60.9 | - |
| 67.0 | 68.4 |
| 69.6 | 70.4 |
| 72.2 | 76.2 |
| 83.3 | 88.1 |
| 99.6 | 99.6 |
| 112.4 | 123.4 |
| - | - |
| - | - |
| - | 192.3 |
| 17.6 | 18.9 |
| 22.8 | 23.4 |
| 36.9 | 39.2 |
| 51.6 | 52.8 |
| 57.2 | 57.9 |
| 61.6 | 62.2 |
| 68.4 | 69.1 |
| 71.1 | 71.8 |
| - | 80.8 |
| 93.6 | 97.4 |
| - | 102.6 |
| 124.4 | 126.4 |
| 133.4 | - |
| - | - |
| 192.6 | - |
5) Összegképlet: CsíHeiNjOzzSiJ, az UV IR, >H NMR és 13NMR adatoknak az LL-E33288/S ι-Br és LL-E33288-ji-J megfelelő értékeivel való összehasonlítás alapján.
6) Molekulatömeg: 1381, az összegképletből számítva.
LL-E33288yi-J
1) Elektronspektroszkópiás elemanalizis (ESCA) szerint csak az alábbi elemeket tartalmazza: C, Η, N, 0, S, J.
2) Hozzávetőleges elemanalizis: C%=48,4; H%=5,4; N%=2,8; S%=9,0; J%=9,2;
3) Molekulatömeg: 1367 (FAB-MS meghatározás szerint).
4) Összegképlet: CsaHeshbCLsSú; a M+H pontos tömege nagy felbontóképességű FAB-MS meghatározÉB szerint 1368; 3397; C53H83 NjChíSiJ képletre.
| 5) UV abszorpciós ábra (metanol, savas me | spektrum: lásd tanol, bázikus ír | 15. leta- | |
| 25 | no’). 6) IR abszorpciós | spektrum: lásd | 16. |
| ábra (KBr lemez). 7) PMR spektrum: | lásd 17. ábra | (300 | |
| 30 | MHz, CDCb). 8) 13C MR spektrum: lásd 18. ábra | (75, |
MHz, CDCb, ppm. TMS).
| A fontosabb csúcsok az alábbiak: | (q) | ||
| 14,5 | (q) | 17.6 | |
| 25.4 | (q) | 34.1 | (t) |
| 42.3 | (t/s) | - | |
| 54.8 | (t) | 56.3 | (q) |
| 60.4 | (d) | 60.9 | <q) |
| 67.0 | (d) | 68.4 | (d) |
| 69.7 | (d) | 70.5 | (d) |
| 72.1 | (s) | 75.7 | (d) |
| 82.8 | (s) | 88.1 | (s) |
| 99.6 | (d) | 99.7 | (d) |
| - | 123.4 | (d) | |
| 130.2 | <s) | 131.0 | (s) |
| 143.0 | (s) | 145.1 | |
| 154.5 | 192.0 | (s) |
| 17.6 | (q) | 18.9 | (q) |
| 22.8 | (q) | - | |
| 37.0 | (t) | 39.1 | (t) |
| 51.5 | (d) | 52.8 | (q) |
| 57.2 | (q) | - | |
| 61.3 | (t) | 61.7 | (q) |
| 68.5 | <d) | 69.2 | (d) |
| 71.1 | (d) | 71.8 | (d) |
| 75.8 | (d) | 80.9 | (d) |
| 93.5 | (s) | 97.3 | (d) |
| 100.8 | (s) | 102.6 | (d) |
| 124.4 | (d) | 126.2 | (d) |
| 133.4 | (s) | 139.1 | (s) |
| 150.6 | (s) | 151.5 | <s) |
| 192.5 | (s) |
Az LL-E33288 komponenseket célszerűen nagyteljesitóképességű folyadék-kromatográfiával (HPCL) és vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) választjuk szét. A megfelelő jódozott és brómozolt komponensek HPLC úton történő elválasztása nehéz, bár nem lehetetlen; ezek a származékok azonban vékonyréteg-kromatográfiás úton nem választhatók szét.
Az LL-E33288-Br komponensek HPLC analitikai szétválasztása során előnyösen az alábbi körülményeket alkalmazhatjuk:
Oszlop „Separalyte Cis 5 m, 4,6 nm x 25 cm (Analytischem International);
Oldószer acetonitril és 0,2 mólos vizes ammónium-acetát 60 : 40 elegye;
Áramlási sebesség 1,5 ml/perc 55 Detektor kettős hullámhossz UV 254 nm és
280 értékeknél Érzékenység 0-0,02 A.U.F.S.
Az IA táblázatban az LL-E33288,fli-Br, LL--E332880z-Br és LL-E33288-ji-Br fenti kö60 rülmények között mért hozzávetőleges réténél iós időit és térfogatait adjuk meg.
IA Táblázat
| LL-E33288 komponensek | Retenciós idő (perc) | Retenciós térfogat (ml) |
| β ι-Br | 5.7 | 8.6 |
| 02-Br | 7.1 | 10.7 |
| χι-Br | 4.3 | 6.5 |
| ’A jódtartalmú LL-E33288 komponensek | 10 | Áramlási sebesség: | 1,2 ml/perc | |
| HPLC analitikai | szétválasztásánál előnyösen | Detektor: | kettős hullámhossz UV | |
| az alábbi körülményeket alkalmazhatjuk: | 254 nm és 280 nm ér- | |||
| Oszlop: | NOVA-PAK Cjt Radial- | lékeknél | ||
| -PÁK töltet, RCM-100 | Érzékenység: | 0-0,02 A.U.F.S. | ||
| radiális kompressziós | 15 | Az IB táblázatban az alábbi komponen- | ||
| modulusszal (Millipore, | sek hozzávetőleges | retenációs időit és | ||
| Waters Chromatography | térfogatait tüntetjük | fel: LL-E33288«i-J, LL- | ||
| Division) | E33288ccj-J, LL-E33288cC3-J, LL-E33288(Si-J, | |||
| Oldószer: | acetonitril és 0,2 mólos | LL-E332880I-J, LL- | E33288 -ji-J és LL- | |
| vizes ammónium-acetél | 20 | -E33288ái-J. | ||
| 50 : 50 elegye | ||||
| IB Táblázat | ||||
| LL-E33288 komponensek Retenciós idő (p | ere) Retenciós térfogat (ml) | |||
| OC1-J | 11.9 | 14.3 | ||
| 0C2-J | 9.1 | 10.9 | ||
| OC3-J | 1.5 | 1.8 | ||
| βι-J | 4.4 | 5.3 | ||
| 32-J | 5.0 | 6.0 | ||
| •31-J | 3.6 | 4.3 | ||
| <$i-J | 2.G | 3.1 | ||
| Az LI.-E33288 komponenseket az alábbi | indukciós kísérlet se- | |||
| TLC rendszerek | segítségével választjuk szét | gitségével. | ||
| és azonosítjuk: | 0ldÓ6zer-rendszerek: | I. 0,1 mólos vizes káli- | ||
| Adszorbens: | szilikagél 60 F25< elő- | um-dihidrogén-foszfát- | ||
| re-bevont alumíniumle- | •10 | tál telített etil-acetát, | ||
| mezek, 0,2 nm réteg- | 11. 0,1 mólos vizes ká- | |||
| vastagság, EM reagen- | lium-dihidrogén-fosz- | |||
| sek. | faltai telített, 3% izo- | |||
| Kimutatás: | Láthatóvátélel rövid- | propil-alkoholt tártál- | ||
| hullámhosszú (254 nm) | 45 | mazó etil-acetát, III. | ||
| UV-lámpával kioltó ha- | etil-acetát és metanol | |||
| tás segítségével és Ba- | 95 : 5 elegye. | |||
| cillus subtilis felhasz- | A II. táblázatban az LL-E33288 | |||
| nálásávnl végzett bio- | komponenseknek a fenti három rendszerben | |||
| autográfia útján vagy | 50 | mért hozzávetőleges | Rr értékeit tüntetjük | |
| módosított biokémiai | fel. |
II. Táblázat
Rr érték
LL-E33288 komponensek I. II. III.
oldószer-rendszer
| ou-Br, | cCl-J | 0.67 | 0.80 | 0.79 |
| λ-Βγ, | (Í2— J | 0.61 | 0.75 | 0.73 |
| tO-Br, | 0C3-J | 0.55 | 0.69 | 0.61 |
| tO-Br | 0.49 | 0.64 | 0.54 | |
| 02-Br | βι-J | 0.32 | 0.41 | 0.45 |
-510
| LL-E33288 komponensek | Rt érték | |||
| I. | II. | III. | ||
| oldószer-rendszer | ||||
| βι-Br, βι-J | 0.24 | 0.35 | 0.36 | |
| ji-Br, -ji-J | 0.18 | 0.28 | 0.27 | |
| Íl-J | 0.11 | 0.19 |
A Micromonospora echinospova spp. c;ilichensis új törzs szabályozott körülmények között végzett fermentációja során az alábbi baktérium- és tumorellenes hatású ágensek keletkeznek: I.L-E33238xi-Br, LL-E33288a:2-Br, LL-E33288tí3-Br, LL-E33288^-Br, l,LE33288ói-Br, I,L-E33288í2-Br, LL-E33288:<i-Br, LL-E33288o-i-.J, LL-E33288o:z-J, LL-E33288'<3-J, hL-E33288űi-J, LL-E33288Ü2-J,
LL-E33288?j-J és LL-E33288Ő1-J. A fenti mikroorganizmust a Medical Research Division, American Cyananiid Company, Pearl River, Neu York törzstenyészelénél LL-E33288 szám alatt tartjuk fenn. A törzs életképes tenyészetét a Culture Collection Laboratory, Northern Régiónál Research Center LL S. DepertRianl of Agriculture Peoria Illjonis intézményénél 1984. augusztus 9-én deponáltuk és az állandó gyűjteményhez csatoltuk. A törzs deponálási száma NRRL 15839.
Az LL-E33288 törzset Texasban gyűjtött agyagtalajmintából izoláltuk.
Az NRRL 15839 törzs morfológiai és kémiai meghatározások alapján a Micromonospora genus-hoz tarozik. A törzs a vegetatív bifa-fonalakon különálló vagy tömegben elhelyezkedő nionospórákat termel. Léghifa-fona1 ik nem figyelhetők meg. A spórák elektroiúkioszkópos vizsgálat alapján rücskösnek bizonyultak.
Teljes sejt-elemzés alapján a törzs a diamino-pimelinsav (DAP) mezo-izomerjét tartalmazza. A DAP 3-hidroxi-származéka nagy(fő) mennyiségben van jelen. A törzs ezenkívül teljes sejtcukorhidrolizátumában xilóz és nyomokban arabinóz jelenlétét mutatja (a teljes sejtcukor a D-tipusnak felel meg.)
Makromorfológiai és fiziológiai vizsgálatok alapján a NRRL 15839 törzs M. echinospora al-speciesnek tekinthető (legköz.elebb a
M. echinosporá ssp. pallida törzshöz áll.
Az NRRLI5839 törzs morfológiai jellemzőit az A és B táblázatban foglaljuk össze. A fiziológiai adatokat a C és D táblázat tartalmazza.
A Táblázat.
| ISP Agar táptalaj | Spóra Vegetatív micélium | Oldható pigment | |
| Élesztő-maláta (ISP 2) Zab maláta (ISP 3) Szervetlen sók -keményítő (ISP 4) Glicerinaszparagin (ISP 5) | fekete spórák vékony peremmel | sötét-narancssárga (72) színtelen - halvány-narancssárga (73) sötét-narancssárgától (72) világos sárgásbarnáig (76) halvány-narancssárgától (73) - színtelen | világos-barnáB |
| B Táblázat | |||
| NRRL makromorfológiá ja | Actinomyceták | tenyésztésére felhasznált különböző agar táptalajokon (28 »C, 2 hét) | |
| Agartáptalaj | NRRL-I58.39 |
Pablum drapp vég.
enyhén fekete spórák olduhaló pig. nincs
-612
| Agar táp talaj | ' NRRL-15839 |
| Élesztő | drapp vég. spórák nincsenek oldható pig. nincs |
| Czapek | drapp vég. enyhén fekete spórák oldható pig. nincs |
| Élesztő dextróz | cserszínű ve.g. közepes fekete spórák enyhe sötét pig. |
| Táptalaj | színtelentől cserszínű vég. enyhe fekete spórák nincs old h aló pig. |
| Téptalaj-gilcerin | színtelentől világosdrapp vég. nincsenek fekete spórák nincs oldható pig. |
| Benett-féle dextrin | színtelentől drapp vég. enyhe: fekete spórák enyhe rózsaszín-barna pig. |
| Glükóz-aszparagin | színtelentől világos narancs-drapp vég. spórák nincsenek nincs oldható pig. |
vég. = vegetatív hifa-fonalak; pig. = pigment í? Táblázat
ARRL 15839 szénhidJ'ál hasznosítása
Arabirióz +
Cellulóz
Fruktóz +
Glükóz +
Inozit
Mannit
Raf finóz ±
Ramnóz +
Szacharóz +
Xilóz +
D Táblázat
NRRL-15839 fiziológiai i'eakció
| Hidrolízis | ||
| Kazein | + | |
| Xantin | - | |
| Hipoxantin | - | |
| Tirozin | + | |
| Adenin | - | |
| Zselatin | + | |
| Burgonyakcszító | + | |
| Esculin | + | |
| Termelés | ||
| Nitrát reduktáz | + | |
| Poszfoíaz | Gy | |
| Ureűz | - | |
| Növekedés | ||
| Szalicín | - |
-714
NRRL-15839 fiziológiai reakció
| 5% Náci Lizozim táptalaj | - | |
| Dekarboxilezés | ||
| Acetát | ||
| Denzozit | - | |
| Citrát | - | |
| Laktat | - | |
| Malát | - | |
| Mucát | - | |
| Oxalát | - | |
| Propionát | + | |
| Piruvál | + | |
| Szűkeiét | - | |
| Tartarát | - | |
| Sav | ||
| Adonit-ból | - | |
| Arabinóz-ból | + | |
| Cellobióz-ból | + | |
| Dextrin-bői | ||
| Bulcit-ból | - | |
| Eritritből | - | |
| Fruktózból | + | |
| Galaktózból | V | |
| Glükózból | ||
| Glicerinből | - | |
| Inozitból | - | |
| Laktózból | - | |
| Maltózból | + | |
| Mannitból | - | |
| Mannózból | + | |
| α-metil-D-glü Rozidból | - | |
| - ........... | Melibiózbó) | |
| Raffinózból | + | |
| Ramnózból | + | |
| Szalicinból | ||
| Szorbitból | ||
| Szaccharinbói | + | |
| Trehalózból | t | |
| Xilózból | + | |
| β-metil-D-xilozidbói | ||
| Növekedés | ||
| 10° | ||
| 42° | + | |
| 45° | + |
+ - pozitív, - = negatív, V = változó, Gy = gyenge.
Az LL-E33288-R66, RRRL—15975 mutáns
A fermentáció termelésének javítása céljából az LL-E33288 erdeti tenyészetét (NRRL-15839) lemezen tenyésztjük és 50 db különálló telepet izolálunk. Ezeket NS1-NS50 jelöléssel látjuk el (NS=természetes szelekció,„natural selection”).
A fenti izolált törzsekkel végzett fermentációk tanúsága szerint a közepes spóraképződést mutató törzsek általában jobb LL-E33288 komplex termelést adnak. E csoport reprezentatív képviselője az izolált NS6 törzs.
Az izolált NS6 törzset kiindulási tenyészetként alkalmazva spóra-szuszpenziókat készítünk és ezeket különböző mulagén ágensekkel kezeljük. Nitrozo-guaninides ke50 zelés után különálló telepeket izoláltunk, ezek azonban nem mutattak számottevően jobb LL-E33288 komplex termelést. UV besugárzás után különálló telepeket izolálva azt találtuk, hogy az UV 610 jelű telep magas termelőképességű mutáns. Az izolált UV 610 mutánsból nyertük az 1-7. sz. al-izolátumokat. A további kísérletekhez az UV 610!3) jelű al-izolátumokat alkalmazzuk.
Az LL-E33288 komplex rendkívül erős baktériumellenes és antineoplasztikus tulajdonságai miatt lehetséges, hogy bizonyos antibiotikum-határ-koncentráció elérése után a bioszintetizált antibiotikum a termelő törzsre toxikus) gátló hatást fejt ki. Ezért megkisé-816 .17 reltük az LL-E33288 antibiotikum-komplexszel szemben rezisztens izolátumok kinyerését.
Az UV 610(3) izolálom vegetatív tenyészetét készítjük el és alkalmazzuk a fermentációhoz; ezzel a tenyészettel lombikban levő és pentonból, dextrózböl, melaszból és vízből álló táptalajt oltunk be. A táptalajhoz 8 pg/ ml koncentrációban LL-E33288fii-Br-t adunk. Ebből a lombikból több lemezt öntünk és a 7. napon rezisztens populációt nyerünk. Összesen 97 telepet izolálunk (RL-R97), Az R66 sz. izolátumot választjuk potenciálisan javított LL-E33288/)i-Br termelő törzsnek.
A mutáns származásának történetét az alábbi sematikus ábrán mutatjuk be.:
E33288 (vad típus)
NS6 (természetes szelekció) — NTG (NG1-NG120) (nitrózó-guanidin) — UV (UV-UV200) (UV) — UV (UV201-UV400 (UV) — UV (UV4O1-UV7O2) (UV)
UV610 (+) (al-izolálum 3) (R1-R97) (rezisztens telepek)
I
R66
Az R66 mutánst a Medical Research Divisiori, American Cynnamid Company Pearl River, New York törzstenyészetében tartjuk fenn. A mikroorganizmus életképes tenyésze5 tét a Culture Collection Laboratory, Northern Régiónál Research Center, US. Department os Agriculture Peoria Illionis intézménynél 1985. június 6-án NRRL 15 975 számon deponáltuk.
Az NRRL-15975 mutáns morfológiailag ]0 kevesebb spórát képez, mint az NRRL-15839 törzs. A két törzset a DD táblázatban hasonlítjuk össze. Kémiailag az NRRL-15839 és NRRL-15975 törzs azonos teljes-sejtcukor-képet mutat (D-tipus: xilóz és nyomnyi arabi15 nóz). A teljes sejt diamino-pimelinsav analízise azt mutatja, hogy az NRRL-15975 törzs mezo-izomert nem képez, csupán a 3-hidroxi-származékot (az NRRL-15839 törzs mindkét vegyülete tartalmazza). Ez azoban a kéiniai20 -taxonómiai besorolást nem változtatja meg.
Fiziológiai tesztek szerint az NRRL-15839 és NRRL-15975 törzs csupán két fiziológiai reakcióban különbözik egymástól (lásd D táblázat). Az NRRL-15975 törzs nitrát-reduktázra negatív mig laktát-hasznosítása pozitív. Az NRRL-15839 törzs mindkét fenti tesztben gyengén pozitív, azonban többhónapos ferde agar tenyészete már negatív. így a fenti jellemzők a taxonómiai egységen belül változó30 nak tekinte.ndők.
DD Táblázat.
| NRRL | 15839 ás NRRL 15975 | lörzs | : morfológiai összehasonlítása |
| Agar táptalaj | NRRL 15839 | NRRL 15975 | |
| Bennet-féle | V1 drapp-oserszínű | drapp-cser színű | |
| dextrin | Sp fekete, bőséges | nincs | |
| SS nincs | nincs | ||
| Czapek | V narancs-cserszínű | narancs-cserszínű | |
| Sp fekete, nyomok | nincs | ||
| SS nincs | nincs | ||
| élesztő extrakt | V narancs-cserszínű, | narancs-cserszínű, csavart | |
| Czapek | Sp lapos, fekete, nyomok | nincs | |
| SS nincs | enyhén sárgás | ||
| Burgonya- | V nagyon gyenge növek | nagyon gyenge növek. | |
| dextróz | Sp nincs | nincs | |
| SS nincs | nincs | ||
| Táptalaj- | V cserszínű | cserszínű | |
| glicerin | Sp fekete, rilkás | fekete | |
| SS nincs | nincs | ||
| Táptalaj | V cserszínű | cserszínű | |
| Sp fekete, szép | nincs | ||
| SS nincs | nincs | ||
| 1 ζ V z vegetatív hifa-fonalak; Sp z spórák; | kópikus jellemzőknek teljesen megfelelő mik- | ||
| SS = oldható, pigment. | 60 | roorganizmusokkal való előállítására. Találmá- | |
| Megjegyezzük, hogy | találmányunkat nem | nyunk a fenti mikroorganizmusokból külön- | |
| korlátozzuk az új baktérium- és tuniorellenes | bözó módszerekkel, pl. röntgenbesugárzással, | ||
| szereknek a megnevezeti | mikroorganizmusok- | UV-besugár zással, Ν’-metil-W-nitro-N-nit- | |
| ka] vagy a fenti, csupán | bemulató és ismer- | rózó-guanidinnel vagy aktinofágokkal való | |
| tető jelleggel közöli növekedési és mikrosz- | C5 | kezeléssel stb. - készíteti mutánsok felhasz- |
-918 nálásával végrehajtott fermentációs eljárásokra is kiterjed.
Az LL-E33288 komponensek in vitro antibakteriális aktivitását a Gramm-pozitiv és Gramm-negaliv baktériumok spektruma ellen, 5 standard agar-hígitásos módszerekkel határozzuk meg. Az antibiotikumok felére csökkenő koncentrációit tartalmazó hígítási-sort (Mueller-Hinton) Petri-csészékbe öntünk. Az fii.
agar-felületeket megfelelő berendezés segítségével 1-5 104 telepképző baktériumegységgel beoltjuk. Minimális gátló koncentrációnak (MIC) a törzs azon legkisebb koncentrációját tekintjük, amely a baktérium növekedését kb. 35 °C-on kb. 18 órán ál végzett inkubálás után gátolja. A kapott eredményeke!. a 111. táblázatban foglaljuk össze.
| LL-E33288 | komponensek | in vitro | an ti bakteriális a ktivi tása | ||
| Minimális gátló | koncentráció, | mcg/ml | |||
| Mikrooraganizmus | βι-Br | β i-J | li-Br | u-J | |
| Escherichia coli | CMC 84-11 | 0.25 | 0.50 | 0.50 | 0.25 |
| tt 11 | No. 311-(MP) | 0.12 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| tr >» | ATTC 25922 | 0.12 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| Klebsiella pneumoniae | CMC 84-5 | 0.25 | 0.50 | 0.50 | 0.25 |
| rt M | AD (MP) | 0.12 | 0.50 | 0.50 | 0.25 |
| Enterobacter cloacae | CMC 84-4 | 0.5 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| ” aerogenes | 10 83-44 | 0.25 | 0.25 | 0.50 | 0.50 |
| Serratia marcescens | CMC 83-27 | 0.12 | 0.25 | 0.50 | 0.25 |
| rt rt | F35 (MP) | 0.12 | 0.50 | 0.25 | 0.12 |
| Morganella morganii | 10 83-18 | 0.5 | 1 | 0.50 | 0.25 |
| Providencia stuarlii | CMC 83-82 | 0.25 | 0.50 | 1 | 0.25 |
| Ciirobacter diversus | K 82-84 | 0.12 | 0.50 | 0.50 | 0.25 |
| ” freundii | 10 83-13 | 0.12 | 0.25 | 0.25 | 0.12 |
| Ac inetobacter sp. | CMC 83-89 | 0.06 | 0.25 | 0.25 | 0.12 |
| ” sp. | 10 83-49 | 0.12 | 0.25 | 0.25 | 0.06 |
| (IJ. Táblázat (folytatása) | |||||
| Organizmus | Minimális gátló koncentráció, βι-Br β í—J Tii-Br | mcg/ml | |||
| Pseudomonas aeruginosa | 12-4-4 (MP) | 0.5 | 0.50 | 1 | 0.25 |
| rt rt | ATCC 27853 | 0.25 | 0.25 | 0.50 | 0.12 |
| Staphylococcus aureus | Smith | <0.0025 | £0.000031 | £0.000031 | £0.000031 |
| rt rt | SSC 82-31 | £0.00025 | £0.000031 | £0.000031 | £0.000031 |
| tt tr | ATCC 25923 | £0.00025 | £0.000031 | £0.000031 | £0.000031 |
| tr rt | SSC 82-20 | £0.00025 | £0.000031 | <0.000031 | £0.000031 |
| rt tr | SSC 82-26 | £0.00025 | £0.000031 | £0.000031 | £0.000031 |
| rt n | SSC 82-24 | £0.00025 | £0.000031 | £0.000031 | £0.000031 |
| rt tr | SSc 82-57 | £0.00025 | £0.000031 | £0.000031 | £0.000031 |
| Staphylococcus epidermidis | CMC-83-133 | £0.00025 | £0.000031 | £0.000031 | £0.000031 |
| n 99 | ATCC 12228 | £0.00025 | £0.000031 | £0.000031 | £0.000031 |
| Enterococcus sp. | CMC 83-53 | 0.0038 | 0.031 | 0.062 | 0.0078 |
| Streptococcus faecalis | ATCC 29212 | £0.00025 | 0.00012 | £0.000031 | 0.00012 |
| Micrococcus luteus | PCI 1001 | £0.00025 | £0.000031 | £0.000031 | £0.000031 |
| Bacillus subtilis | ATCC | £0.00025 | £0.000031 | £0.000031 | £0.000031 |
Az anti-neoplasztikus hatás vizsgálatára a National Cancer Institute bizonyos in vivő teszt-módszereket dolgozott ki, amelyeket a „Cancer Chernotherapy Reports III. rész, 3. kötet, 2. sz. (1972) helyen közöltek (Geran és tsai). A fenti jegyzetek alapján standard screenelési módszereket dolgoztak ki, amelyeket a tumorellenes szerek kipróbálása teGO rcn általánosan alkalmaznál;. A fenti módszerek közül találmányunk szempontjából a limfoeita leukémia P388, melanotikus melanoma
R1S, L1210 leukémia és colon 26 adenoc.arcinoma különösen jelentős. A fenti neoplazmá65 kát transzplantá Iható tumorok tesztelésére
-1020 alkalmazzák, egéren. A fenti tesztnél a kezelt állatok (T) túlélési idejének a kontroll (C) állatokhoz viszonyított %-os növekedéseiből következtetni lehet a humán leukémia és solid tumorok kez.elése terén várható aktivitásra.
Linifocitás leukémia Γ388 teszt
Azonos nemű BDFi egereket alkalmazunk (testtömeg: 173 ± 3 g). Csoportonként 5-6 egeret alkalmazunk. A tumor transzplantálása oly módon történik, hogy intraperiteális injekcióval 0,5 ml 106 limfocita leukémia P388 sejtet tartalmazó hig aszoitikus folyadékot fecskendezünk be. Az LL-E33288 antibiotikumot a P388 rendszerre kifejtett hatásának vizsgálata során a különálló βι-Br és -ji-Br komponenseket és az összes komponenst tartalmazó komplexet (bróm-komplex) egyaránt felhasználjuk. A teszt-vegyületet intraperitoneálisan 0,5 ml térfogatban 0,2%-os Klucel n nátrium-klorid-oldatban, a tumorral való be5 oltástól számított 1., 5. és 9. napon a megadott dózisokban adjuk be. Az egereket lemérjük és a túlélő állatokat 30 napon át meghatározott szempontok szerint megfigyeljük és az eredményeket feljegyezzük. Az át10 lagos túlélési időt és a kezelt (T) per kontroll (C) állatokra a túlélési idők hányadosát kiszámítjuk. Pozitív kontrollként ciszplatint alkalmazunk, 0,5 ml 0,2%-os Klucel i. p. injekció formájában, az 1., 5. és 9. napon a megadott dózisokban befecskendezve. A kapott eredményeket a IV. táblázat tartalmazza.
Szignifikáns tumorellenes hatásúnak azokat a teszt-vegyületeket tekintjük, amelyek esetében a T/C x 100 (%) érték 125 vagy ennél nagyobb.
JV. Táblázat
Limfocita leukémia P388 teszt
| Teszt-vegyület | Dózis (mg/kg) | Átlagos túlélés (napok) | T/C x 100 (%) |
| LL-E33288 | 3.2 | 16.5 | 156 |
| 1.6 | 17.5 | 165 | |
| (Bróm-komplex) | 0.8 | 18.5 | 175 |
| 0.4 | 10 | 179 | |
| (1.2 | 16.5 | 156 | |
| Kontroll | - | 10.6 | - |
| Pozitív kontroll | 1.0 | 21.5 | 203 |
| 0.25 | 15 | 142 | |
| 0.06 | 14.5 | 137 | |
| LL-E33288/S i-Br | 0.4 | 13 | 105 |
| 0.2 | 18 | 145 | |
| 0.1 | 19 | 153 | |
| 0.05 | 17.5 | 141 | |
| 0.025 | 18 | 145 | |
| 0.012 | 14 | 113 | |
| Kontroll | - | 12.4 | - |
| Pozitív kontroll | 1.0 | 25.5 | 206 |
| 0.4 | 19 | 153 | |
| 0.06 | 15 | 121 | |
| LL-E33288-ji-Br | 0.2 | 14 | 113 |
| 0.1 | 21 | 169 | |
| 0.05 | 19.5 | 157 | |
| 0.025 | 18 | 145 | |
| 0.012 | 14.5 | 117 | |
| Kontroll | - | 12.4 | - |
| Pozitív kontroll | 1.0 | 25.5 | 206 |
| 0.4 | 19 | 153 | |
| 0.06 | 15 | 121 | |
| >lelanotikus niilanomu ülő | csoport 6-6 | állatból áll. 1 g melanotikus me- | |
| lanoma Bie | tumort 10 ml hidegen egyensúly- | ||
| A teszthez azonos nemű, 17 i ' | i g test- | ha hoz.ott nátrium-klorid-oldatban homogeni- | |
| tömegű BDFi egereket alkalmazunk | ; minden 65 | zálunk és minden kísérleti egérbe a homoge- |
-1122
| nizátum 0.5 ml-es | aliquot részletét intaperi- | túlélő állatokat 60 napon át megfigyeljük. Az | |
| toneálisan implantáljuk. Az LL-E33288 ariti- | átlagos túlélési | idő hányadosát kiszámítjuk. | |
| biotiku mókát a Βίε | rendszerben különálló βι- | Pozitív kontroll | vegyületként ciszplatint |
| -Br és p-Br komponens alakjában és az | vagy adriamicint | alkalmazunk. Az eredménye- | |
| összes komponenst | tartalmazó komplex (bróin- 5 | két az V. tábláza | tban foglaljuk össze. |
| -komplex) formájában vizsgáljuk. A teszt-ve- | Szignifikáns | tumorellenes hatásúnak | |
| gyűleteket a tumor inokulálásától számított | azokat a teszt-vegyületeket tekintjük, ame- | ||
| 1-9. napon különböző dózisokban i.p. adjuk | lyekre a T/C x ' | 100(%) érték 125 vagy ennél | |
| be az állatoknak. | Az egereket lemérjük és a | nagyobb. | |
| V. 7'á blúzát | |||
| Melanotikus melanoma B16 teszt | |||
| Átlagos | |||
| Teszt-vegyület | Dózis | túlélés | T/C x 100 |
| (mg/kg) | (napok) | (%) | |
| LL-E33288 | 0.8 | 30 | 188 |
| (Bróm-komplex) | 0.4 | 29.5 | 184 |
| 0.2 | 27 | 169 | |
| 0.1 | 24 | 150 | |
| Kontroll | - | 16 | - |
| Ciszplatin | 0.4 | 25 | 156 |
| 0.2 | 25 | 156 | |
| 0.1 | 23 | 144 | |
| 0.05 | 21.5 | 134 | |
| LL-E33288íi-Br | 0.05 | 32 | 168 |
| 0.025 | 33.5 | 176 | |
| 0.0125 | 32 | 168 | |
| Kontroll | - | 19 | - |
| Adriamicin | 0.8 | >60 | >316 |
| 0.4 | >60 | >316 | |
| LL-E33288-ji-Br | 0.05 | 33.5 | 176 |
| 0.025 | 30 | 159 | |
| 0.0125 | 37 | 195 | |
| Kontroll | - | 19 | - |
| Adriamicin | 0.8 | >60 | >316 |
| 0.4 | >60 | >316 |
Limfocita leukémia L121Í) teszt
A teszthez azonos nemű, 17 i 3 g testtömegű BDFi egereket alkalmazunk. Minden csoport 6 állatból, míg a kontroll csoport 18 egérből áll. A tumort 0.5 ml limfocita leukémia L1210 105 sejt/egér koncentrációban való i.p. befecskendezésével juttatjuk az állatok szervezetébe. Az LL-E33288 antibiotikumokat az L1210 rendszerben különálló /31— -Br komponens alakjában és az összes komponenst tartalmazó komplex (bróm-komplex) formájában vizsgáljuk. A teszt-vegyülctet a tumor inokulálásától számított ]., 5. és 9.
napon vagy az 1-9. napon különböző dózisokban adagoljuk. Az egereket lemérjük és a túlélők számát 60 napon át megfigyeljük. Az átlagos túlélési időt és a kezelt (T) per kontroll (C) állatokra a túlélési hányadosát kiszámítjuk. Pozitív kontrollként 1,4-dihidro-5,8-bisz-[ (2-(2-dihid ro-etilamino)-etil)-ami50 no]-antrakinon-dihidro-kloridol vagy ciszplatint adagolunk, intraperitoneálisan a megadott dózisokban. Az eredményeket a VI. táblázatban foglaljuk össze.
Szignifikáns tumorellenes hatásúnak azokat a teszt-vegyüleleket tekintjük, amelyekre a T/C x 100(%) érték 125 vagy ennél nagyobb.
-1224
495855
VI. Tánlázat
| Limfocita leukémia 1.1210 teszt | |||
| Teszt-vegyület | Dózis (mg/kg) | ÁLlalagos túlélés (napok) | T/C x 100 (%) |
| LI.-E33288 | 1.5 | 29 | 174 |
| (Bróm-komplex) | 0.8 | 28.5 | 171 |
| 0.4 | 22.5 | 135 | |
| 0.2 | 22.5 | 135 | |
| Kontroll | - | 16.7 | - |
| Antrakinon | 1.6 | 30 | 180 |
| 0.8 | 30 | 180 | |
| 0.4 | 30 | 180 | |
| LL-E332880j-Rr | 0.2 | 11.3 | 136 |
| 0.1 | 11.4 | 137 | |
| 0.05 | 1 1 | 133 | |
| 0.025 | 11.3 | 136 | |
| Kontroll | - | 8.3 | - |
| Ciszplatin | 5 | 7.5 | 90 |
| 2.5 | 12 | 145 | |
| 1.25 | 11 | 133 | |
| Colon 26 adenocarejnoma | feSZÍ | góljuk. A leszt-vegyületet a tumor implantá- | |
| lásból számított 1., 5. és 9. napon i.p. ada- | |||
| A teszthez 17 í 3 | g testtömegő CD2E1 30 | góljuk. Az egereket lemérjük és a pusztulást | |
| nőstényegeret alkalmazunk. A teszt-csoportok | 60 napon át | feljegyezzük. A kezelt (T) per | |
| 5 vagy 6, mig a kezdeti | en kontroll csoportok | kontroll (C) | állatok átlagos túlélési idejét |
| (3db) 5 vagy 6 állatból | állnak. A tumort in- | kiszámítjuk. | Pozitív kontroll-vegyűletként |
| traperiteálisari (vagy szubkutáns úton) 0,5 ml | ciszplatint alkalmazunk. Az eredményeket a | ||
| 2% Colon 26 tumorszuszpenziót tartalmazó 35 | VII. táblázat | laralmazza. Azokat a vegyüle- | |
| antibiotikum tartalmú Eagle-féle MÉM tápkö- | leket tekintjük szignifikáns tumorellenes | ||
| zeg befecskendezésével | implantáljuk. Az LL- | hatásúnak, amelyekre a T/C x 100(%) érték | |
| -E33288 antibiotikumokat | a Colon 26 rendsze- | 130 vagy ennél nagyobb. | |
| ren komplex (bróm-komplex) formájában vizs- | |||
| Vil. Ti. | blúzát | ||
| Colon 26 adenocar | cinoma teszt | ||
| Átlagos | |||
| Teszt-vegyület | Dózis | túlélés | T/C x 100 |
| (mg/kg) | (napok) | (%) | |
| LL-E33288 | 1.5 | 39.5 | 212 |
| (Bróm-komplex) | 0.8 | 32.5 | 175 |
| 0.4 | 34 | 183 | |
| 0.2 | 25.5 | 137 | |
| Kontroll | - | 18.6 | - |
| Pozitív kontroll | 1 | 29 | 156 |
| 0.5 | 38.5 | 207 | |
| 0.25 | 37.5 | 202 | |
| MÖ07Ö szarkóma· | pót i,p. inokulálunk. Az LL-E33288 antibioti- | ||
| 60 | kuinokat a | M5176 rendszerben az összes | |
| M5076 retikuláris | szarkóma sejteket | komponenst | magábanfoglaló komplex (bróm- |
| szubkutáns implantátum | formájában elszapo- | -komplex) alíi | kjában vizsgáljuk. A teszt-ve- |
| rltunk C57B2 nóstényegerekberi. A tumoréi- | gyületeket a | tumor inokulálástól (0. nap) | |
| lenes hatás vizsgálata | során him- és nős- | számított 1., | 5., 9., 13- és 17. napon i.p. |
| tény BDEi egerekbe 0,5 | ml 10%-os tumorpé- 65 | adagoljuk. A | 60 napon minden leszt-vegyü- |
-1326 lel dózisra meghatározzuk az. átlagos túlélési időt és a kezelt (T) per kontroll (C) állatokra a túlélési idő hányadost kiszámítjuk. Az. eredményeket a Vili. táblázatban foglaljuk össze. Pozitív kontrollként ciszplatint alkalmazunk. Azokat a teszt-vegyületeket tekintjük sz.ignifikáns hatásúnak, amelyekre a T/C x 100 (%) hányados 125 vagy ennél nagyobi).
Víff. Táblázat
M!>07fí szarkoma
| Teszt-vegyület | Dózis (mg/kg) | /átlagos túlélés (napok) | T/C x 100 (%) | |
| LL-E33288 | 1.5 | 50 | 175 | |
| (Bróm-komplex) | 0.8 | 50 | 175 | |
| 0.4 | 39.5 | 139 | ||
| Kontroll | - | 28.5 | - | |
| Ciszplatin | 1 | 30 | 105 | |
| 0.5 | 44.5 | 156 | ||
| 0.25 | 45 | 158 | ||
| Λ fenti módszerek kei | ! az alábbi jódkom- |
ponensek antineoplasz.tik us aktivitását határozzuk meg:
IX. Táblázat
| L/nifocítás leukémia /\'ítí8 teszi | |||
| Teszt-vegy ölet | Dózis (mg/kg) | Átlagos túlélés (napok) | T/C x 100 (%) |
| I.L-E33288p-J | .005 | >25.5 | > 196 |
| (1.teszt) | .0025 | 22 | 169 |
| .00125 | 18.5 | 142 | |
| .0006 | 18 | 138 | |
| .000.'! | 15.5 | 119 | |
| .000 15 | 15 | 115 | |
| Kontroll | - | 13 | - |
| Pozitív kontroll | 1.6 | 22.5 | 173 |
| Nnvantron „R” x | |||
| LL-E33288i-J | .01 | 11 | 100 |
| (2. teszt) | .005 | 18 | 164 |
| .0025 | 22.5 | 205 | |
| .00125 | 18.5 | 168 | |
| .0006 | 16 | 145 | |
| .0003 | 14 | 127 | |
| .00015 | 14 | 127 | |
| Kontroll | - | 11 | - |
| Pozitív kontroll | 1.6 | 19 | 173 |
| Novantron ..R | 0.8 | 16 | 145 |
x = 1,4-dihidro-5,8-bisz[ {2-(2-hidroxi-e1il-amino)-eliI)-ainino]-antrakkinon-dihidroklorid.
| A'. Táblázat | |||
| .Welanotíkus melanoma Βίε leszt | |||
| Teszt-vegyület | Dózis | Átlagos túlélés | T/C x 100 |
| (mg/kg) | (napok) | (%) |
I.L-E3328B.ji-J .0025 26.5 156
-1428 .· 11: ig'i-.s
Teszi-vegyület Dózis lúlélés T/C x 100 (mg/kg) (n:i|i<ik) (%)
| .00125 | 27 | 159 | |
| .0006 | 42.5 | 250 | |
| .0003 | 35.5 | 209 | |
| .00015 | 33.5 | 197 | |
| .00007 | 30.5 | 179 | |
| Kontrol] | - | - | |
| Adriamicin | 0.8 | 48 | 282 |
| 0.4 | 40 | 235 | |
| 0.2 | 34.5 | 203 |
| XI, Táblázat | ||||
| Limfocitás leukémia L1210 teszt | ||||
| Átlagos | ||||
| Teszt-vegyület | Dózis | túlélés | T/C x 100 | |
| (mg/kg) | (napok) | (%) | ||
| L-E33288-J1-.) | .01 | 8 | 89 | |
| .005 | 14 | 156 | ||
| .0025 | 11 | 122 | ||
| .0012 | 10.5 | 117 | ||
| .0006 | 10 | 111 | ||
| Kontroll | - | 9 | - | |
| Pozitív kontroll | 3.2 | 15 | 167 | |
| Novantron „R | 1.6 | 11.5 | 128 | |
| 0.8 | ~12 | 133 | ||
| 0.4 | 11 | 122 |
| XII, Táblázat Colon 26 adenocarcínoma | teszt | ||
| Teszt-vegyület | Dózis | Átlagos túlélés | T/C x 100 |
| (mg/kg) | (napok) | (%) | |
| LL-E33288-J1-J | .01 | 11 | 59 |
| .005 | 25.5 | 138 | |
| .0025 | 27 | 146 | |
| .00125 | 22.5 | 122 | |
| .0006 | 23.5 | 127 | |
| .0003 | 20 | 108 | |
| .00015 | 17.5 | 95 | |
| .00007 | 17 | 92 | |
| Kontrol] | - | 18.5 | - |
| Pozitív kontroll | 2 | 15.5 | 84 |
| Ciszplalin | 1 | 27.5 | 149 |
| 0.5 | 23.5 | 127 |
Általános fermentációs köruliuenvek
A Micromonospora echinospora NRRL 15839 vagy NRRL 15975 törzs fermentációját a folyékony tápközegek széles skáláján hajthatjuk végre. A találmányunk szerinti új baktérium- és tumorellenes anyagok termeléséhez felhasználható tápközegek asszimilálható szénforrást (pl. keményítőt, cukrot, melaszt, glicerint, stb.), asszimilálható nit16
-1530 rogénforrást, (pl. fehérjéi, fehérjehidrolizátumol, polipeptideket, aminosavakal, kukoricalekvárt, stb.) és szervetlen anionokat és kationokat (pl. kálium-, nátrium-, ammónium-, kalcium-, szulfát-, karbonát-, foszfát-, kloridionokat, stb.) és bróm-forrást (pl. nálrium-bromidot) vagy jód-forrást (pl. kálium-jodidot) tartalmaznak. A tápközeg nyomelemeket (pl. bort, molibdént, rezet stb.) is tartalmaz, a többi komponensben jelenlevő szennyezések formájában. A fermentációs tankban vagy lombikban a levegőztetést oly módon biztosítjuk, hogy a fermentációs közegbe vagy felszíne alá steril levegőt nyomatunk. A tankokban a további keverést mechanikus eszközökkel végezzük el. Szükség esetén habzásgátlót (pl. szilikont) adhatunk a rendszerhez.
Az LL-E33288 antibiotikumok izolálása-, nak és szétválasztásának általános ismertetése:
Az LL-E33288 antibiotikumokat a fermentléből extrakcióval (pl. szerves oldószerrel, mint pl. etil-acetáttal vagy diklór-metánnal) nyerjük ki. A szerves extraktumban levő antibiotikum komplexet kis szénatomszámú szénhidrogénekből végzett szelektív kicsapással tovább tisztíthatjuk. A kapott nyers LL.-E33288 antibiotikum komplexet ezután oszlop-kromatográfiás lépések sorozatával tovább tisztítjuk és egyes komponenseire szétválasztjuk. Az oszlop-kromatografálást szilikagélen, Sephandex (pl. Pharmaci Fine Chemicals) és Cie kötött kovasavon végezzük el.
Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük.
1. példa
Inokulum készítése
Primer inokolum táptalaj tipikus összetétele a következő:
liter fenti steril tápközeg inokulálására, majd 48 órán át 30 ’C-on keverés közben (ford ulatszém: 180-200 percenként) inkubáljuk. Ily módon tercier vagy beoltó inokulumot nyerünk.
2. példa
| marhahúsextrakt | kb. | 0.3 | % |
| tripton | kb. | 0.5 | % |
| dextróz | kb. | 0.5 | % |
| dextrin | kb. | 2.4 | % |
| kalcium-karbonát | kb. | 0.4 | % |
| élesztőextrakt | kb. | 0.5 | % |
| víz | . 100% ig |
A fenti tápközeg pH-ját 7-re állítjuk be majd sterilezzük. A steril tápkőzeg 100 ml-es részletét tartalmazó lombikot az NRRI. 15839 törzs fagyasztott micéliumával inokuláljuk. A beoltott tápközeget forgó rázatógépen 48 órán át 32 ’C-on erőteljesen keverjük. Az inokulált tápközeggel inokulálunk 14 literes fermentorban levő 10 liter fenti steril tápközegei. Keverés közben 32 ’C-on 48 órán át inkubáljuk. A kapott szekunder inokulumot használjuk fel tankban elhelyezett 300
Tank fermentáció
| Alábbi összetételű fermentációs tápközeget | |
| készítünk: | |
| dextróz | kb. 0.5 % |
| szaccharóz | kb. 1.5 % |
| pcpton, bakterio- | |
| lógiai minőségű, | kb. 0.2 % |
| kétbázisu kálium-foszfát | kb. 0.01 % |
| melasz | kb. 0.5 % |
| kalcium-karbonát | kb. 0.5 % |
| bóm-forrás | nyomokban |
| VZ | 100%-ig. |
2800 liter fenti tápközeget slerilezünk majd 300 liter, az 1. példa szerint előállított tercier (beoltó) inokulummal beoltjuk. A levegőztetés mértéke 0,53 liter steril levegő (1 fermentlé) perc, a keverés sebessége percenként 110 fordulat. A hőmérséklet kb. 28 °C-on tartjuk és a fermentációt 97 óra u'.án megszakítjuk.
Λ fermentációt ill. az LL-E33288 antibiotikum termelést a fermentlé antibakteriális aktivitásának meghatározása útján, biokémiai indukciós teszttel, TLC és HPLC analízissel követjük nyomon.
A teljes fermentlé pH-ját 6-ra állítjuk be, majd fele térfogatnyi etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumot bepároljuk, a visszamaradó szirupot hexánnal kétszer mossuk, majd diatomaföldön átszűrjük. A szűrőlepényt etil-acetáttal alaposan összekeverjük, majd szűrjük. A szűrletet 3 literre bepároljuk, fölös mennyiségű vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, majd hexán hozzáadásával kicsapjuk. Kb. 26,7 g nyers LL-E33288 komplexet kapunk.
3. példa
LL-E33288cn-Br, ca-Br, ca-Br, és <a-Br elválasztása az Ll,-E33288#i-Br, βι-Br és 71-.Br anyagoktól
A második példa szerint előállított
2G,7 g nyers LL-E33288 komplexet (bróm-komplex) három egyenlő részre osztunk és három külön 2,4 x 110 cm-es töltött (Silica-WoelmR, 32-63 m. Woelm Palma) és 0.1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal egyensúlyba hozott szilikagéloszlopon kromatografáljuk. Az oszlopokat előbb a fenti oldószerrel 3 ml/perc áthaladási sebességgel 18 órán át eluáljuk és 18 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. Az eluálást ezután 95 : 5 arányú etil17
-1632
-acetát/metanol eleggyel folytatjuk, 8 órán ét. Az oszlopokat végül 90 : 10 arányú etil -acetát/metanol eleggyel 10 órán át eluáljuk. A frakciókat módosított biokémiai indukció teszt (DIAI segítségével meghatározzuk. A pozitív reakciót adó frakciókat TLC-nek vetjük alá, előre bevont szilikagél GO lemezeket felhasználva és az előhívást 0.1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 3 % izopropanolt tartalmazó etil-acetáttal végezzük el. A detektálás módosított BIA felhasználásiéval, bioautográfiával történik.
Az LL-E33288<ci-Br, <C2-Br, to-Br és <<.-Br (LL-E33288x-Br komplex) tartalmú frakciókat a három oszlopról összegyűjtünk, szárazra pároljuk, majd a maradékot etil — -acetátban oldjuk és kevés vízzel mossuk. Az etíl-ac.etátos oldatot vízmentes nátrium-
| -szulfát | felett szárítjuk | és bepároljuk. | Kb. |
| 4,2 g nyers LL-E33288oc | -Br komplexet | ka- | |
| púnk. | |||
| Az | LL-E33288oC2-Br, | βι-Br és ji-Br | <7- |
-Br-t tartalmazó LL-E332880-Br komplex) tartalmú frakciókat a három oszlopról öszszegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb. 2.0 g nyers LL-E33288/}-Br komplexet kapunk, amely -j-Br-t is tartalmaz.
4. példa
LL-E332880i-Br és LL-E33288jl-Br izolálása
Kb. 1,9 g, a 3. példa szerint előállított, •j-Br-t is tartalmazó LI.-E33288ű-Br komplexet 90 : 10 arányú metanol-νίζ eleggyel egyensúlyba hozott, 2 x 10 cm nagyságú Sephadex LH-20 oszlopon, 1,2 ml/perc áthaladási sebességgel kromatografáljuk és 15 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. A frakciókat BIA segítségével megvizsgáljuk és az aktívnak talált frakciókat a fentiekben ismertetett TLC módszerrel analizáljuk. Az LL-E33288/ii-Br, /52-Br és 71-Br nagy részét tartalmazó 21-25. frakciókat összegyűjtjük és a metanol nagy részét eltávolítva bepároljuk. A kapott vizes elegyet liofolizéljuk. Kb. 435 mg, részben tisztított komplexet kapunk, amely kb. 10% 11-Ε33288β i-BR-t, 1% LL-E33288á2-Br-t és 4% LL-E332887i-Br-t tartalmaz.
A fenti, részben tisztított LL-E33288/Í-Br komplexet (amely 7-Br-t is tartalmaz) két egyenlő részre osztjuk és két 1,5 x 100 cm nagyságú, töltött (kovasavgél 60, 40-63 um, EM) és 98 : 2 arányú etil-acetát) metanol eleggyel egyensúlyba hozott szilikagéloszlopon, 1 ml/perc áthaladási sebességgel kromatografáljuk, 12 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. A frakciókat a biológiai aktivitásra meghatározzuk és a fentiekben ismertetett TLC analízisnek vetjük alá. A primer módon LL-E33288ö ι-Br-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk és hexánnat kicsapjuk. 26 mg 80% tisztaságú
LL-E332883i-Br-t kapunk. Az LL-E33288-ji-Br-t tartalmazó frakciókat (kromatografálásnál közvetlenül az LL-E332880 ι-Br után jelentkezik) összegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb. 4,5 g 30 % tisztaságú LL-E33288yi-Br-t kapunk. Néhány, LL-E332880s-Br-t tartalmazó frakciókat (kromatografálásnál közvetlenül az LL-E33288a ι-Br előtt jelentkezik) összegyűjtünk és feldolgozunk. Nyomnyi mennyiségben Lb-E3328R/i2-Br-t kapunk.
5. példa
l.i.-E33288ji-Bv végső tisztítása
A 4. példa szerint kapott, kb. 26 mg 80% tisztaságú LL-E33288/}i-Br-t egyéb, hasonló tisztaságú LL-E332883 ι-Br mintákkal egyesítjük, amelyeket azonos körülmények mellett végrehajtott, más fermentációs folyamatoknál nyertünk. Összesen kb. 38 mg egyesítettjji-Br-t fordított fázisú preparatív TLC segítségével tovább tisztítunk; Whatman PLKCieF, előre bevont, 90 : 10 arányú metanol/0.1 mólos pH 4.0 értékű ammónium-acetát puffer eleggyel előhívott TLC lemezeket alkalmazunk. Az LL-E33288^ι-Br-t tartalmazó sávot [Rí = 0.66; rövidhullámhosszú (254 nm) UV lámpa alatt a kioltó hatás segítségével láthatóvá téve) kivágjuk és az antibiotikumot az adszorbensről 0.1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfát-oldaltal telített, 10% izopropilalkoholt. tartalmazó etil-acetáttal lemossuk. Az oldatot bepároljuk, a maradék etil-acetátban oldjuk és kevés vízzel mossuk. Az LL-E33288/) ι-Br-t tartalmazó szerves oldatot feldolgozzuk. Kb. 24,5 mg 90%-os tisztaságú LL-E332880i-Br-t kapunk. A mintát preparatív TLC segítségével szilikagél (szilikagél GE előre bevont lemezek, 1000 m, Analtech) tisztítjuk, az előhívást 0.1 mólos vizes kálium-foszfáttal telített, 3% izopropanol-alkoholt tartalmazó etil-acetáttal végezzük el. A rövidhullámhosszú (254 nm) UVlámpán mutatott fő kioltó sávot (kromatografálss Rr = 0.7) kivágjuk és az antibiotikumot az adszorbensről 80 : 20 arányú diklór-metán/metanol eleggyel lemossuk. Az LL-Ε33288β ι-Br-t tartalmazó szerves oldatot feldolgozzuk. Kb. 18,8 g gyakorlatilag tiszta LL-E33288í ι-Br-t kapunk.
6. példa
LL-E33288xil-Br végső tisztítása
Kb. 4,5 mg 30% tisztaságú, a 4. példa szerint előállított LL-E33288-ji-Br-t azonos körülmények között végzett más fermentációkból származó, hasonló tisztaságú más LL-E332887i-Br mintákkal egyesítünk. Összesen 18 mg egyesített mintát preparatív vékonyréteg kromatográfiával szilikagélen (szilikagél
-1734
GF előre bevont lemezek, Analtech) tovább tisztítunk; az előhívást 0.1 mólos vizes kalium-dihiiOgén-foszfáttal telített., 2% izopropilalkoholt tartalmazó etil-acetáttal végezzük el. A rövidhullámhosszü (254 nin) IJV-láinpa alatt fö kioltást mutató sávot (kroniatográfiálisan Rr - 0,5) kivágjuk és feldolgozuk. Kb. 4,3 mg gyakorlatilag tiszta 1.1,-E33288jí-Br-t kapunk.
Az L1.-E33288 bróm-komplex termeléséhez előnyösen az alábbi összetételű fermentációs tápközeget alkalmazhatunk:
| Komponens | % |
| szaccharóz | 2.0 |
| vas(ll) szulfát-hepta- | |
| -hidrót | 0.01 |
| magnézium-szulfát-he pia | |
| -hidrát | 0.02 |
| kalcium-karbonát | 0.5 |
| pepton | 0.2 |
Komponens
Szaccharóz vas (II )szulfát-hep tahid rát. magnézium-szulfát-heptahidrál kalcium-karbonát·' pepton** melasz kálium-jodid víz qs x = Mississippi anyag xx- legjobb eredményeket MARC0RR bakteriológiai peptonnal kapjuk, azonban más peptonokat is alkalmazhatunk, továbbá hús- és kszeinhidrolizálumból nyert polipeptideket..
7. példa
Micélium-spóra szuszpenziót készítünk oly módon, hogy NRRL-15839 ferde tenyészetének felszínét lekaparjuk és 5 ml steril desztillált vizet adunk hozzá. A szuszpenzióval 500 ml-es lombikban levő alábbi összetételű steril beoltó tápkózeget inokulálunk:
| élesztőextrakt | 0.5% |
| marhahúscxtrakt | 0.3% |
| triptóz | 0.5% |
| keményítő | 2.4 |
| dextróz | 0.5% |
| kalcium-karbonát | 0.4% |
| viz qs | 100%-ra' |
| A beoltó lombikot 28 °C- | on forgó róza- |
| tógépen percenként,)' 200 ford | ulat mellett 3-4 |
| napon ót inkubáljuk. Az „I. | fokozatú ino- |
| kulumot kapjuk. | |
| Az „I. fokozatú” inokulumot használjuk | |
| fel az azonos összetételű, a | fenti körűimé- |
nyék között 2 napon át inkubált steril közeg - a „II. fokozatú inokulum - inokulálására.
melasz 0.5 nátrium-bromid 0.05 viz 100-ra
A fermentációs tápközeghez (pl. káliumς -jodidot) adva az alábhi előnyök biztosíthatók:
1) ?\ fermentáció során jelentősen nagyobb vegetatív növekedés.
2) Escherichia coli 11 300 és Bacillus
IQ subtilis 11 308 törzsekkel szemben a biokísérieti vizsgálat szerint nagyobb gótlási zóna.
3) TLC lemezek bioautográfiá ja során az
l.L-E33288ű ι-J és -ji-J antibiotikumoknak megfelelő Rf helyeken jelentős aktivitás.
4) TLC meghatározás szerint más komponensek termelésének növelésére.
Az LI.-E33288 jód-komplex termelésénél előnyösen az alábbi két tápközeget alkalmaz20 hatjuk:
.B’közeg (%)
2.0 0.01 0.02 0.25 0.2 0.5 0.01 100-ra .A közeg (%) 2.0 0.01 0.02 0.5 0.2 0.5 0.05 100-ra
A „1T. fokozatú inokulummal ezúton
| 35 | 100 ml, alábbi összetételű steril Fermentációs tápközeget inokulálunk: | |
| szaccharóz vas (Il)szulfé t-hep tahid rát magnézium-szulfát-hepta- | 2.0% 0.01% | |
| 40 | hidr. | 0.02% |
| kalcium-karbonát | 0.5% | |
| pepton (MARCORR) | 0.2% | |
| melasz | 0.5% | |
| kalcium-jodid | 0.05% | |
| 45 | víz qs | 100.00%-ig |
| A fenti tápközeget 28 °C- | -on rázógópen |
percenkénti 200 fordulat mellett 5 napon át irkubáljuk majd a fermentlevet feldolgozzuk.
4-20 jug/ml kálium-jodid koncentráció az 50 optimális, azonban a kitermelés 2 mg/ml koncentrációig nem csökken.
Az NRRL-15839 fermentációval is termelhető LL-E33288A ι-J, ha a tápközeghez kálium-jodidot adunk, azonban csak nagyon kis mennyiségben (0,2-0,3 pg/ml) szemben a jobban termelő NRRL-15975 törzs esetében a lka mázott 1,5-3,5 ug/ml értékkel.
A^i-J és p-J hozama jódozott tápközegben 2-8-szor nagyobb, mint a megfelelő θθ A:-Br és -ji-Br bróm-vegyülete hozama brómtfirtalmú tápközegben, az NRRL-15975 törzs felhasználása esetén.
-1836
8. példa
LI,-E33288.\-i-J, o-J és .n-J elválasztása nz LL-K33288ji-J, &t-J és éi-J anyagoktól
Kb. 41.3 g nyers LL-E33288 komplexet, (amelyet NRRL-15975 segítségével, szervetlen jódot tartalmazó táptalaj felhasználásával nyert 7500 liter fermentáció feldolgozásával nyertünk az 1. és 2. példa szerinti eljárással két egyenlő részre osztunk és két külön szilikagél-oszlopon (2,5 x 110 cm nyagsügú ; Silica Woelm, 32-36 um töltött; el il-acetáttal egyensúlyba hozott) kromatografalunk. Az oszlopokat előbb etil-acetáttal 4 órán át. 4 ml/perc áthaladási sebességgel eluáljuk, és 20 τηΐ-es frakciókat gyűjtünk össze. Az eluálószert ezután konkáv gradiens szerint 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáltal telitett etil-acetát!ól 0,1 mólos vizes kálium— -dihidrogén-foszfúttal telített, 10% izopropil-alkoholt tartalmazó etil-acelátig terjedő oldószer-elegyekre cseréljük le cs 24 órán át eluáljuk. Az oszlopokat végül 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 10% izopropilalkoholt tartalmazó etil-acetáttal egy éjszakán át eluáljuk. Λ frakciókat ΒΙΛ teszttel megvizsgáljuk és a biológiailag aktív frakciókat vékonyréteg kromatográfiás úton, a 3. példában leírtak szerint megelemezzük.
A két oszlopról nyert, LL-E33288(í3-J tartalmú frakciókat (86-107. frakció) összegyűjtjük és a fenti módon feldolgozzuk. Kb. 2,1 g nyers LL-E33288,«-.l-t kapunk.
A két oszlopról nyert, LL-E33288cci-J-t és cC2-J-t tartalmazó frakciókat (182-253. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb.
4.2 mg nyers keveréket kapunk, amely LL— E33288.-fi-J-t és co-J-t tartalmaz.
A két oszlopról nyert, LL-E33288/S2-.J-1 és 0i-J-t tartalmazó frakciókat (254-272. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb.
1.2 nyers LL-E33288j52-.l-t és βι-.)-1 tartalmazó keveréket kapunk.
Az LL-E33288jι-J-t tartalmazó és a két oszlopról nyert frakciókat (273-302. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb. 1,9 g 30% tisztaságú Ll,-E33288-$i-J-t kapunk.
A két oszlopról nyert, LL-E33288éi-J-t tartalmazó frakciókat (303-340. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb. 1,3 g részlegesen tisztított LL-E33288ái-J-t kapunk.
9. példa
I. L-E33288 vi - J tisztítása
Kb. 900 mg, a 8. példa szerint nyert, 30% tisztaságú Ll.-E33288-ji-.7-l 2,5 x 120 cm nagyságú, 2:2:1 arányú metil-aceLát/diklói—metán/etanol eleggyel egyensúlyba hozott Sephadex 1 ml/perc áthaladási sebességgel kromatografálunk és 12 ml-es frakciókai gyűjtünk össze. A frakciókat biológiai aktivitásra meghatározzuk és a fenti módon vékonyréteg-kromatográfiás elemzésnek véljük alá. Az LL-E33288-ji-J-t tartalmazó frakciókat (24-33. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. 428 mg 64%-os tisztaságú LL-E3.3288-ji-.I-t nyerünk.
A fenti termék 22 mg-os mintáját 0,8 x 24 c.in nagyságú 55 : 45 arányú acetonotril/0,2 mólos vizes ammónium-acetát elegygyel egyensúlyba hozott Sepralyte oszlopon 2 ml/perc álhaladási sebességgel kromatografálunk és 12 ml-es frakciókat gyűjtünk őszsze. A frakciókat biológiailag aktivitásra meghatározzuk és a fentiekben leírt vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel megelemezzük. A tiszta LL-E33288 ji-J-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és feldolgozzuk.
7,7 g tiszta LL-E33288-ji-J-t kapunk.
példa
i.i.-E33288ji-J és 32-J tisztítása
Kb. 600 mg a 8. példa szerint előállított nyers LL-E33288/J 2-J és (,ι-J keveréket 2,5 x 120 cm nyagyságú, 2:2:1 arányú etil-ac.etát/ /diklór-metán/etanol eleggyel egyensúlyba hozott Sephadex LII-20 oszlopon 1 ml/perc. áthaladási sebességgel kromatografálunk és 12 inl-es frakciókat gyűjtünk öszszc, A frakciókat a fentiekben leírt módon biológiai aktivitásra meghatározzuk és vékonyréteg-kromatográfiás elemzésnek vetjük alá. Az l.L-E33288/j2-J-t és βι-J-t tartalmazó frakciókat (23-31. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. 81 mg részlegesen tisztított LL-E3288/lz-J-l és jli-J-t tartalmazó keveréket kapunk.
A kapott mintái 1,5 x 90 cm nagyságú, 3:1:1 arányú hexán/diklór-metán /etanol eleggyel egyensúlyba hozott Sephadex Lfl-20 oszlopon 0,8 ml/perc áthaladási sebességgel kromatografáljuk és 12 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. A frakciókat a fentiekben leírt módon biológiai aktivitásra meghatározzuk és vékonyréteg-kromatográfiás elemzésnek vetjük alá. Az LL-E3328802-J-t (17-30. frakció) és LL-E33288/5 í-J-t (31-38. frakció) tartalmazó frakciókat külön összegyűjtjük és feldolgozzuk. 31 mg részlegesen tisztított LL-E3328802-J-t és 20 mg 80% tisztaságú LL-E33288ü ι-J-t kapunk.
11. példa
I.L-E33288 komplex la bora Ló fin mi előállítása Ll-E33288-UV 784. (NRRL-181491-ből
Spórákat és micéliumokat tartalmazó szuszpenziót állítunk elő Micromonospora achinospora ssp. calic.hensis, LL-E33288-UV 784 (NRRI,-18149) ferde tenyészetből úgy,
-1938
195853 hogy 5-8 ml vizet adunk hozzá és a tenyészet felületét lekaparjuk. A szuszpenzióval beoltunk 50 ml következő összetételű steril közeget:
| élesztő | 0.5% |
| marha extraktum | 0.3% |
| triptóz | 0.5% |
| dextrin | 2.4% |
| dextróz | 0.5% |
| kalcim-karbonát | 0.4% |
| viz | 100%-ig |
| A fenti 250 ml-es | Erlenmexer lombikban |
| lévő táptalajt 28 “C-on | rotációs rázóberende- |
| zésen inkubáljuk 200 | percenkénti fordulut- |
| szám mellett 3-4 napig | és igy kapjuk az 1 |
| fokú inokulumot. Ezzel beoltunk 50 ml | |
| ugyanilyen összetételű steril táptalajt | |
| 250 ml-es lombiakban 2 | napig és így egy 11 |
fázisú inokulumot kapunk.
A II fázisú oltóanyagot a következő összetételű 100 ml steril fermentációs táptalaj beoltására használjuk:
| szacharóz | 2.0% |
| vas-szulfál-hepta- | |
| -hidrát | 0.01% |
| magnézium-szulfál-hepta- | |
| -hidrat | 0.02% |
| kalcium-karbonát | 0.25% |
| pepton | 0.4% |
| melasz | 0.25% |
| kálium-jodid x | 0.01% |
viz 100-ig 1 bróm analógok előállítására kálium-broinidot használunk.
500 ml-es lombikokban 28-30 “C-on in- 35 kubaijuk a fenti táptalajt rotációs rázóberendezésen 250 percenkénti fordulatszám mellett 6 és napig ezalatt összegyűjtjük a fermentlevet.
LL-E33288-UV 784 alkalmazásával l.b- 40
-E33288 komplex nagyüzemi fermentációs előállítása.
Egy háromlépcsős inokulumot állítunk elő LL-E33288-UV 784 (NRRL-1849) tenyészetből. Az oltóanyag táptalaj összetétele a következő:
Komponensek: literenként kalcim-karbonát 4 g
Hodag Pl) 82 * 1 ml dextrin 24 g glükóz 5 g élesztő extraktum 5 g tripton 5 g marhaextraktum 3 g víz 1-1-re kiegészítve ’ a Hodag8 FD 82 szilikon habzásgátló szer.
Az első lépcső 100 ml fenti steril táptalajból áll 500 ml-es lombikba, melyet 32 °-C-on 2 napig inkubálunk 200 percenkénti fordulatszám mellett. Ezt az első terméket használjuk azután a második lépés beoltására, amely 10 1 fenti steril táptalajból áll, melyei 2 napig tenyésztjük 32 °C-on és 450 percenkénti fordulatszám mellett egy kis fermentorbán steril légáramlás mellett. A légáramlás az elegy térfogatára vonatkoztatva 1 térfogat levegőt jelent percenként (VVM). Ezt a mósouik fázisban kapott terméket használjuk a harmadik lépés beoltására, amely 2 napig '·’ 32 “C-on 200-250 percenkénti fordulaíszárn mellett tenyésztett 300 1 steril táptalajból éti. A tenyésztés 0,67 VVM steril levegöáramlás mellett történt tankfermentorban.
A III. lépcsőből 300 litert használunk steril 1500 liter fermentációs táptalaj beoltására, amelynek összetétele a következő: Komponensek:
szacharóz 20.0 g vas-szulfát-heplahidrát 0.1 g in agnéz.ium-szül fát-heptahidrát 0.2 g pf-pl.on 5.0 g ?Q melasz 5.0 g kálium-jodid * 0.5 g kalcium-karbonát 5.0 g
Hcdag* PD 82 5.0 ml tetszés szerinti viz ’ bróm analógok előállítására káüum-bromidot használunk.
A fermentálást 30 °C-on végezzük 0,75 VVM steril levegőáramlás mellett, a hátsó nyomás 5,51 10’ Pa és percenként 120 fordulatszámú terelőlapáttal hajtott keverést hajtunk végre 5-6 napig, és ezalatt összegyűjtjük a fermentlevet.
13, példa
LL- E33288«3-I, LL-E33288flt-I, LL~E33288-p-I és LL-E33288Si-I izolálása LL-E33288-UV 784 (NRRL-18149) fermentációjából
12,4 g LL-E33288i>-I és 10,5 g LL-E33288ái-T~t tartalmazó 1500 literes adagot alaposan összekeverünk 1500 1 etil-acetáttal 3 óra hosszal, majd szűrési segédanyagot adunk hozzá és az elegyet leszűrjük. A szerves fázist elkülönítjük és 100 1-re koncentráljuk, a pH-t 2n nátriumhidroxid hozzáadásával 6-7-re állítjuk, és a vizes fázist eltávolítjuk. A szerves fázist tovább kon50 centráljuk 20 1-re és a vizes fázist bármilyen közbenső zsírokat eltávolítjuk. A szerves fázist végül aranyszínű sárga sziruppá koncentráljuk, ezt lassan 7-8-szoros térfogatú gyorsan kevert hexánba öntjük. A hexán oldhatatlan gumiszerű anyag, amely LL-B33288 antibiotikumokat tartalmaz. Ezt elkülönítjük, újra feloldjuk 3 1 etil-acetátban és vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk. A szárított etil-acetát oldatot kis térfogatra koncentráljuk, és éter és hexán hozzáadásával kicsapjuk. 53 g nyers LL-E33288 komplexet kapunk, umety 4,9 g -ji-l-t, 2,8 g á-I-t és kis mennyiségű «3-I-t és őt—I—t tartalmaz.
-2010 •11
14. példa
L.L-E33288 βι-Ι, χι-1 és «3—1 elkülönítése
A 13. példa szerinti nyers 1.1.-E3328R komplexből 7,2 g adagot két Seprűibe C-18 (35-65 m-es) oszlopon (2,5 x 23 cm) kromatografálurik, és acetonitril és 0,2 mól vizes aminónium-acetát 45 : 55 arányú elegyével eluáljuk 12 ml/perc áramlási sebességnél, és 60 24 ml-es frakciót gyűjtünk össze mindegyik oszlopról. Az egyes frakciókat vékonyrétegkroinatográfiásan analizáljuk (EM szilikagél 60 F'254 előre bevont alumínium-lemezek, 3 % izopropanol, 0,1 mól káliurn-dihidro-foszfáltal telített etil-acetátban eluáljuk, és UV25<nni mellett mulatjuk ki, é;s bíoautográfiát végzünk BIA-n keresztül. A ji-I-l tartalmazó frakciókat összeöntjük, rotációs bepárolva az acetonitrilt eltávolítjuk. A vizes elegyel kétszer extraháljuk egyenlő térfogatú etil-acetáttal, az etil-acetát oldatot vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, bepároljuk és hexán hozzáadásával kicsapjuk. 504 mg részben tisztított 60%-os tisztaságú LL-E33288 χι-1-t kapunk, amely j-l-t is tartalmaz. Az cC3-1-1 és βι-1-t tartalmazó frakciókat, amelyek az oszlopról eluálódnak a 71-I előtt, külön-külőii összeönLjük ós feldolgozva 812 mg részben tisztított 12%-os tisztaságú cf3-1-1 kapunk, valamint 1335 mg 22%é 1-1-1 és 20% -ji-I-t tartalmazó elegyet is kapunk.
15. példa
I.L-E332887i-I-t tisztítása
309 mg 66%-os tiszlaságú részben tisztított χι-1-t Sephadex l.H-20 oszlopon kromatografálunk (hidroxi-propilezeLt dextrán) (1,5 x 90 cm) és hexán, diklórmetán és etanol 2:1:1 arányú elegyével egyensúlyozzuk ki. Az oszlopot ugyanezzel az oldószerrel eluáljuk 1,5 ml/perc áramlási sebességgel és 25 20 ml-es frakciókat gyűjtünk össze és a fenti módon analizáljuk. A tiszta χι-Ι-t tartalmazó frakciókat összeöntjük és az előzőekben leirt módon koncentrálva világossárga maradékot kapunk. Ezt etil-acetátban ismét feloldjuk és hexán hozzáadásával kicsapjuk. 194 mg tiszta LL-E33288 -ji-I-t kapunk.
IS. példa
LL-E33288 βι-l liszt.]tása
61% 71-I-I éb lOpi—3—t tartalmazó részben tisztított elegyből 1,05 g-ot Woelm szilícium-dioxid oszlopon kromatografálunk (32-63 μ és 1,5 x 45 cm). Az oszlop etilacetáttal van töltve és egyensúlyozva. Az oszlopót 3,6 ml/perc, sebességgel 1 óra hosszat eluáljuk etil-acetáttal, majd az eluálószerl etil-acetát és metanol 97 : 3 arányú elegyére változtatjuk és még 2 óra hosszal eluáljuk. 18 ml-es frakciókai gyűjtünk össze az egész eluálás alatt. Minden frakciót a fent leirt módon analizáljuk és a β ι-1-1 tartalmazó frakciókat összeöntjük és feldolgozzuk. 56 mg 86%-os tisztaságú LL-E33288 i-I-t kapunk. A 71 frakciókat is feldolgozzuk és igy 385 mg 74%-os tisztaságú LL-E33288 χι-Ι keletkezik.
17. példa
L.L-E33288 ái-I tisztítása
1,8 g, 648 mg ίι-1-t és 540 mg χι-1-t tartalmazó részben tisztított elegyet Woelm szilícium-dioxid oszlopon kromatografálunk (32-63 p és 1,5 x 45 cm). Az oszlop etil-acetáttal van töltve és egyensúlyozva. Az oszlopot 3 ml/perc óránkénti sebesség mellett etil-acetáttal eluáljuk, majd az eluálószert etil-acetát és metanol 97 : 3 arányú elegyére változtatjuk és még 2 óra hosszat eluáljuk. 15 ml-es frakaciókat gyűjtünk. Az egyes frakciókat a fent leírt módon analizáljuk és a tiszta ői—1—t tartalmazó frakciókat összeöntjúk és feldolgozzuk. 367 mg tiszta LL-E33288 i-I-t kapunk. A χ-Ι-t tartalmazó frakciókat is feldolgozzuk és igy 574 mg 65%-os tisztaságú LL-E33288 71-I-t kapunk.
18. példa
LL-E33288 0:3-! tisztítása
1,8 g, 310 mg «-Ι-1 tartalmazó részben tisztított mintát Sephadex LH-20
1,5 x 90 cm-es oszlopon kromatografálunk, amelyet hexán és diklór-metán és etanol 2:1:1 arányú elegyével egyensúlyozzuk. Az oszlopot is ezzel az oldószer rendszerrel eluáljuk 4 ml/perc sebességgel és 45 20 mles frakciókat gyűjtünk össze és a fent leirl módon analizáljuk. A tiszta (O-I-t tartalmazó farkciókat összeöntjük és bepároljuk. Világossárga maradékot kapunk, melyet etilacetátban isinél feloldunk és hexán hozzáadásával kicsapunk. 289 mg tiszta LLE33288 «-I-t kapunk.
19. példa
L1.-E33288 0:2-I előállítása LL-E33288 71-I-böl
60%-os tisztaságú 300 mg részben tisztított 71-I-t feloldunk 60 ml 2% sósavat tartalmazó metanolban és az oldatot szobahőmérsékleten 6 óra hosszat hagyjuk állni. Az elegye). ezután kálium-karbonát telített metanolos oldatával semlegesítjük. A kicsapódott
-2142 kálium-kloridot leszűrjük és az oldatot szárazra pároljuk. Az etil-acetátban oldódó maradékot koncentráljuk és hexánból kicsapjuk. 135 mg nyers LL-E33288.r'j-l-t. kapunk.
Ezt a nyers «2-1-t kromatográfiásan tisztítjuk 20-40 μ 1,5 x 20 cm-es Bio-SJLB oszlopon. Diklór-metán ós metanol 96 : 4 arányú elegycvel eluáljuk és 34 mg analitikai tisztaságú Ll.-E33288cc2-l-t kapunk. Az LL-E33288«2-I kis mennyiségeit előzőleg izoláljuk az NRRL-15839 fermentációjából és az anyagot ezen példa szerint előállított L.L-E33288oC2-I-vel azonosítjuk vékonyréteg és nagynyomású folyadékkromatográfiás analízisekkel.
Claims (6)
1) LU-E33288«i-Br vegyület, amely az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagéllemezeken, vékony réteg kromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rf értékeket mutatja:
a) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített etil-acetátban, Rf = 0,67;
b) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban, Rf = 0,80; és
c) etilacetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében, Rf = 0,79,
1) LL-E33288<xi-Br vegyület, amely az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagcl-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rr értékeket mutatja:
a) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogőn-foszfáttal telített etil-acetátban, Rt = 0,67;
b) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etilacetátban, Rt = 0,80; és
c) etil-acetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rt - 0,79;
1. Eljárás az alábbi komponensekből álló L1.-E33288 jelű antibiotikum kompjex
2) LL-E33288u«-Br vegyület, amely az alábbi oldószer-rendszerek ben, szilikagél-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rt értékeket mutatja:
a) 0,1 mólos vizes kálium-didhirogén-foszfáttal telített etil-acetátban, Rf = 0,61;
b) 0,1 mólos vizes kálium-dibidrogén-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban, Rf = 0,75; és
c) etilacetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében, Rf = 0,73,
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Micromonospora echinospora ssp. calichensi NRRL-15839 mikroorganizmus vagy valamely mutánsa - beleértve az NRRL 15975 jelű mutáns életképes tenyészetével inokulált, asszimilálható szén-, nitrogén-, jód és/vagy bróm-forrást és szervetlen sókat tartalmazó folyékony tápközeget aerob körülmények között fermentálunk, a fermentációt 24-32 °C-os hőmérsékleten 90-200 órán át folytatjuk, a fermentlevet öszegyűjtjük, ós kívánt esetben a 2, 3, 5-7 és 9-14 pontok alatt megadott antibiotikumokat elválasztjuk és izoláljuk.
Ildőbbsége: 1985. 10. 17.
2) LL-E33288íC2-Br vegyület, amely az alábbi oldószer-rendszerekben szilikagél-lemczeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rt értékeket mutatja:
a) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített etil-acetátban Rr = 0,61;
b) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban Rr = 0,75; és
c.) etil-acetát ós metanol 95 : 5 arányú elegyében Rt = 0,71;
3) LL-E33288icj-Br vegyület, amely az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagél-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Iü értékeket mutatja:
a) 0,1 mólos vizes káliuin-dihidrogén-
-foszfáttal telített etilacetátban, Rf = 0,24;
ii) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttol telített 3% izopropanolt tartalmazó etilacetátban, Rf - 0,35; és iii) etilacetát és metanol 35 : 5 arányú elegyében, Rf = 0,36,
i) molekulatömeg: 1333 illetve 1335 ”Br illetve/81/llr-re, és
j) összegképlet: C54HS4N3O22S4B1’,
6) LI,-E33288u-Br vegyület, amely az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagél-lemezeken, vékonyrélegkroniatográfiás meghaetilacetótban, Rt = 0,69; és
c) etilacetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rr = 0,61,
3. Eljárás az alábbi komponensekből álló I L-E33288 antibiotikum komplex
-2448
3) LL-E33288<<3-Br vegyület, amely az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagél lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rr értékekei mutatja:
a) 0,1 mólos vizes kélium-dihidrogén-foszfáttal telített etil-acetátban , Rt = 0,55;
b) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogón-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban, Rt = 0,69; és
c) etil-acetát ós metanol 95 : 5 arányú elegyében Rt = 0,61,
4) LL-E33288cr«-Br vegyület, amely ez 5 alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagél-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rf értékeket mutatja:
a) 0,1 mólos vizes kálium-dihdirogén10 -foszfáttal telített etilacetátban, Rf = 0,49;
b) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etilacetátban, Rf = 0,64; és
c) etilacetát és metanol 95 : 5 arányú 15 elegyében Rf = 0,54,
4. ábrán megadott az alábbi szignifikáns csúcsokkal:
h) az alábbi oldószer-rendszerben, szilika gél-le meze ken, vékony rétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rt értékeket, mutatja:
i) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogcrt-foszfáttal telített etil-acetátban, Rt = 0,24;
ii) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó ctil-ac.eLátban, Rr = 0,35; és iii) etil-acetát. és melanol 95 : 5 arányú elegyében Rr - 0,36.
i) molekulatömeg: 1333 illetve 1335 ”Br illetve e,Br-re, és
j) összegképlete; CstHsiNsC^SfBr,
-2244
6) LI.-E33288/) 2-Br vegyület, amely az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagél-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rr értékeket mutatja:
a) 0,1 mólos vizes kálium-dihdirogéri-foszfállal telített etil-acetátban, Rr = 0,32;
b) 0,1 módos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban, Rr - 0,41; és
c) etil-acetát és metanol 95 : 5 arányéi elegyében Rt - 0,45;
7) l.L-E33288ji-Br vegyület, amelynek jellemző fizikai-kémiai állandói az alábbiak:
a) UV adszorpciós spektrum az 5. ábrán megadott;
f) összegképlete: CsaHsaNaChzSiBr és
g) molekulatömeg 1319 illetve 1321, ,9Br illetve 8IBr-re,
8) LL-E33288oci-J vegyület, amelynek jellemző fizikai-kémiai állandói az alábbiak:
a) az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagél-lemezeken, vékony réteg kromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rr értékeket mulatja:
i) 0,1 mólos viz.es kélium-dihidrogén-foszfáttal telített etil-acetátban, Rr c 0,67;
ii) 0,1 mólos vizes káliuni-dihidrogén-foszféttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban, Rr = 0,80 és iii) etil-acetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rr - 0,80 és
b) molekulatömege 1145,
9) I,L-E33288űC2-J vegyület, amelynek jellemző fizikai-kémiai állandói az alábbiak:
a) az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagél-lemezcken, vékony rétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rr értékeket mutatja:
i) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszféttol telített etil-acetátban, Rf = 0,6l;
ii) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban, Rr = 0,75; és iii) etil-acetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rr - 0,73.
b) csak az alábbi elemekei tartalmazza:
0, Η, N, C, S és J.
c) molekulatömeg 1131 és
d) proton mágneses rezonancia spektruma a 9. ábrán megadott,
10) LL-E33288co-J vegyület, amelynek jellemző fizikai-kémiai állandói az alábbiak:
a) az alábbi oldószer-rendzserekben, szilikagél-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rr értékeket mutatja:
i) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telítet etil-acetátban, Rr c 0,55;
11) 0,1 mólos vizes kálium-dibidrogén-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban, Rr = 0,69; és iii) etil-acetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rr z 0,61,
b) molekulatömege 1066 és
c) proton mágneses rezonancia spektruma a 10, ábrán megadott,
11) LL-E332880 ι-J vegyület, amelynek jellemzői fizikai-kémiai állandói az alábbiak:
a) az alábbi oldószerekben, szilikagél-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rt értékeket mulatja:
i) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített etil-acetátban, Rr = 0,24;
ii) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban, Rt = 0,35; és iii) etil-acetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rf : 0,36.
b) UV adszorpciós spektruma a 11. ábrán megadott;
c) IR adszorpciós spektruma a 12. ábrán megadott;
d) proton mágneses rezonancia spektruma a 13. ábrán megadott;
-2346
alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagcl-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rf értékeket mutatja:
a) 0,1 mólos vizes kálium-dibidrogén-foszfáttal telített etilacetátban, Rf = 0,32;
b) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfóttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etilacetátban, Rf - 0,41; és
c) etilacetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rf - 0,45,
13) LL-E33288-J1-J vegyület, amelynek jellemzői fizikai-kémiai állandói az alábbiak:
a) az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagél-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rí értékeket mutatja:
i) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített etil-acetátban, Rí = 0,18;
ii) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó eíil-acetötban, Rf - 0,28; és iii) etil-acetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rf = 0,27;
b) csak az alábbi elemeket tartalmazza:
C, Η, N, 0, S és J;
c.) elemanalízis hozzávetőlegesen a következő:
C% - 48,8; 11% = 5,4; N% = 2,8; S% - 9,0; és J’4 = 9,2.
d) molekulatömege :1367;
e) ósszképlete: CsaHejNaOaaSíJ;
f) UV adszorpciós spektruma a 15. ábrán megadott;
g) IR spektruma a 16. ábrán megadott;
h) proton mágneses rezonancia spektruma a 17. ábrán megadott és
i) I3C mágneses rezonancia spektruma a 13. ábrán megadott, és szignifikáns csúcsai
14) LL-E33288áj-J vegyület, amely az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikngél-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rf értékeket mutatja:
a) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített etil-acetátban Rf = 0,11 és
b) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban Rf = 0,19 - és a 2, 3, 4, 5-7 és 9-14 pont alatti komponensek előállítására, azzal jellemezve, hogy a Micromonospora echonospora ssp. calichensis NRRL-15839 törzset vagy valamely mutánsát - beleértve az NRRL-15975 jelű mutánst - asszimilálható szén-, nitrogén-, jód- és/vagy bróm-forrást és szervetlen sókat tartalmazó folyékony tápközegben aerob körülmények között fermentálunk, majd kívánt esetben a 2, 3, 5-7 és 9-14 pontokban megadott antibiotikumokat elválasztjuk és izoláljuk.
Elsőbbsége: 1985.10.17.
4) LL-E33288<r4-Br vegyület, amely az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagél-lemozeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rt értékeket mulatja:
a) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített etil-acetátban, Rf - 0,49;
b) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttnl telitett, 3% izopropanolt tartalmazó etil-acetátban, Rt = 0,64; és
c) etil-acetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rt c 0,54;
5. Eljárás gyógyszerkészítmények
25 előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1.
igénypont szerint előállított vegyületek valamelyikét gyógyászati segédanyagokkal összekeverjük és gyógyszerkészítménnyé elakítjuk.
30 Elsőbbsége: 1985. 10. 17
5) LL-E3328Ö0i-Br vegyület, amelynek jellemző fizikai-kémiai állandói az alábbiak:
hozzávetőleges elemanalízis:
= 48.6; 11% = 5.6; N% = 2.9;
= 9.1; Br% = 5.5;
op.: 146-150 °C (bomlás) fajlagos forgatóképesség [k]!6d =
-49 t 10 0 (c = 0.1, etanol),
d) UV adszorpciós spektrum az 1. ábrán megadott:
e) IR adszorpciós spektrum a 2. ábrán megadott;
f) proton mágneses rezonancia spektrum a 3. ábrán megadott;
g) 13C mágneses rezonancia spektrum a
a)
C% 20 s%
b)
c)
-foszfáttal telített, 3% izopropanolt tartalmazó etilacetátban, Rf = 0,41, és
55 c) etilacetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rf = 0,45,
7) LL-E33288-ji-Br vegyület, amelynek jellemző fizikai-kémiai állandói az alábbiak:
a) UV adszorpciós spektrum az 5. ábrán G0 megadott;
b) ÍR adszorpciós spektrum a 4. ábrán megadott;
c) proLonmágneses rezonancia spektrum n 7. ábrán megadott;
-2550
d) az alábbi oldószer-rendszerekben, szilikagél-lemezeken, vékonyrétegkromatográfiás meghatározás szerint az alábbi Rr értékeket mutatja:
i) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített etilacetátban, Rf = 0,18, ii) 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített 3% izopropanolt tartalmazó etilacetátban, Rf = 0,28; és iii) etilacetát és metanol 95 : 5 arányú elegyében Rf = 0,27,
e) 13 C mágneses rezonancia spektrum a 8. ábrán megadott és szignifikáns csúcsai az alábbiak:
és a 2, 3, 5, 6, és 7. pontban megadott komponensek előállítására, azzal jellemezve, hogy n Micromonospora echinosporá spp. calichens's NRRL-15839 mikroorganizmust vagy valamely mutánsát asszimilálható szén-, nitrogén—és bróm-forrást és szervetlen sókat tarlal5 inazó folyékony tápközegben aerob körülmények között fermentáljuk, majd kívánt esetben a 2, 3, 5, 5 és 7 pontokban megadott antibiotikumokat elválasztjuk és izoláljuk. Elsőbbsége: 1984. 11. 16.
10 , . 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Micromonospora echinospora ssp. calichensis NRRL-15839 mikroorganizmus vagy valamely mutánsa életképes tenyészetével inokulált, asszimilálható szén-,
15 nitrogén- és bróm-forrást és szervetlen sókat tartalmazó folyékony tápközeget aerob körülmények között fermentálunk, a fermentációt 24-32 °C-os hőmérsékleten 90-200 órán át folytatjuk, a fermentlevet összegyűjtjük
20 és kívánt esetben a 2, 3, 5, 6. és 7. pont alatti antibiotikumokat elválasztjuk és izoláljuk.
Elsőbbsége: 1984. 11. 16.
5) LL-E332883ι-Br vegyület, amelynek jellemző fizikai-kémiai állandó az alábbiak:
a) hozzávetőleges elemanalízis:
C% = 48,6; 11% = 5,6; N% = 2,9; S% = 9,1;
Br% = 5,5;
b) op.: 146-150 ’C (bomlás)
c) fajlagos forgatókópesség [oc]j6d - -49 ± 10 ’ (c = 0,1 %, etanol);
d) UV adszorpciós spektrum az 1. ábrán megadott;
e) ÍR adszorpciós spektrum a 2. ábrán megadott;
f) proton mágneses rezonancia spektrum a 3. ábrán megadott;
g) 13C mágneses rezonancia spektrum a
6. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerint előállított vegyületek valamelyikét gyógyászati segédanyagokkal összeke33 verjük és gyógyszerkészítménnyé alakítjuk. Elsőbbsége: 1984. 11. 16.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US67203184A | 1984-11-16 | 1984-11-16 | |
| US78706685A | 1985-10-17 | 1985-10-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT41839A HUT41839A (en) | 1987-05-28 |
| HU195855B true HU195855B (en) | 1988-07-28 |
Family
ID=27100668
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU854365A HU195855B (en) | 1984-11-16 | 1985-11-15 | Process for production of ll-e 33288-marked antibioticumkomplex and its components with antitumor effect and medical compositions containing them |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0182152B1 (hu) |
| JP (1) | JPH0774228B2 (hu) |
| KR (1) | KR890001289B1 (hu) |
| AT (1) | ATE180513T1 (hu) |
| AU (1) | AU589918B2 (hu) |
| CA (1) | CA1291054C (hu) |
| DE (1) | DE3588213T2 (hu) |
| DK (1) | DK168388B1 (hu) |
| EG (1) | EG17709A (hu) |
| ES (1) | ES8703160A1 (hu) |
| FI (1) | FI86892C (hu) |
| GR (1) | GR852725B (hu) |
| HK (1) | HK1011385A1 (hu) |
| HU (1) | HU195855B (hu) |
| IL (7) | IL76878A (hu) |
| LV (1) | LV12523B (hu) |
| MX (1) | MX9203146A (hu) |
| NO (1) | NO163574C (hu) |
| NZ (1) | NZ214114A (hu) |
| PT (1) | PT81493B (hu) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3440423A1 (de) * | 1984-11-06 | 1986-05-07 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | Antibiotisches polypeptid, verfahren zu seiner herstellung, dieses polypeptid erzeugender stamm von staphylococcus epidermidis, dieses polypeptid enthaltende zubereitungsformen und seine verwendung zur bekaempfung infektioeser erkrankungen |
| US5024948A (en) * | 1985-10-17 | 1991-06-18 | American Cyanamid Company | Genetic system for micromonospora |
| ATE219096T1 (de) * | 1987-01-30 | 2002-06-15 | American Cyanamid Co | Dihydroderivate der antibiotika vom typ ll-e33288 |
| US4980297A (en) * | 1987-02-27 | 1990-12-25 | Becton, Dickinson And Company | Device for the membrane separation of the components of a liquid sample |
| ATE112172T1 (de) * | 1987-10-30 | 1994-10-15 | American Cyanamid Co | Targetformer von antitumor-methyltrithioagenzien. |
| US4978748A (en) * | 1988-02-29 | 1990-12-18 | American Cyanamid Company | Intermediate and process for producing the antibacterial and antitumor agents LL-E33288ε-I and LL-E33288Epsilon-Br |
| EP0330874A3 (en) * | 1988-02-29 | 1989-10-18 | American Cyanamid Company | Antibacterial and antitumor agents LL-E33288 epsilon-I and LL-E33288-epsilonBr, with processes and intermediates for producing said agents |
| US4996305A (en) * | 1988-02-29 | 1991-02-26 | American Cyanamid Company | Process for producing the antibiotic and antitumor agents LL-E33288.epsilon.ε-Br |
| US4977143A (en) * | 1988-02-29 | 1990-12-11 | American Cyanamid Company | Antibacterial and antitumor agents LL-E33288EPSILON-I and LL-E33288EPSILON-BR |
| EP0342341A3 (en) * | 1988-05-17 | 1991-07-24 | American Cyanamid Company | Process for producing antitumor antibiotic ll-e33288gamma2 |
| EP0405151A1 (en) * | 1989-06-29 | 1991-01-02 | American Cyanamid Company | Antibiotic LL-E19085 |
| CN109553646A (zh) * | 2019-01-21 | 2019-04-02 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种纯化卡里奇霉素的制备方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU515150B2 (en) * | 1975-02-18 | 1981-03-19 | Sterling Drug Inc. | Preparation of aminocyclitol antibiotics |
| US4692333A (en) * | 1982-08-26 | 1987-09-08 | Gruppo Lepetit S.P.A. | Antimicrobial and antitumor antibiotic M 9026 and its pure individual factors 1, 2, and 3 and microbial process for production thereof |
| JPS6024195A (ja) * | 1983-07-18 | 1985-02-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | サイコフラニンの製造法 |
| US4843008A (en) * | 1984-12-24 | 1989-06-27 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Novel microorganisms and a novel process for producing antibiotics |
-
1985
- 1985-10-29 DE DE3588213T patent/DE3588213T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-29 IL IL76878A patent/IL76878A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-10-29 AT AT85113751T patent/ATE180513T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-10-29 EP EP85113751A patent/EP0182152B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-08 NZ NZ214114A patent/NZ214114A/xx unknown
- 1985-11-11 GR GR852725A patent/GR852725B/el unknown
- 1985-11-14 PT PT81493A patent/PT81493B/pt unknown
- 1985-11-14 CA CA000495303A patent/CA1291054C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-15 ES ES548953A patent/ES8703160A1/es not_active Expired
- 1985-11-15 DK DK529685A patent/DK168388B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-11-15 AU AU49957/85A patent/AU589918B2/en not_active Expired
- 1985-11-15 JP JP60255157A patent/JPH0774228B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-15 FI FI854510A patent/FI86892C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-11-15 KR KR1019850008548A patent/KR890001289B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1985-11-15 NO NO854578A patent/NO163574C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-11-15 HU HU854365A patent/HU195855B/hu unknown
- 1985-11-17 EG EG731/85A patent/EG17709A/xx active
-
1990
- 1990-02-16 IL IL93416A patent/IL93416A0/xx unknown
- 1990-02-16 IL IL93420A patent/IL93420A0/xx unknown
- 1990-02-16 IL IL93418A patent/IL93418A0/xx unknown
- 1990-02-16 IL IL93417A patent/IL93417A0/xx unknown
- 1990-02-16 IL IL93419A patent/IL93419A0/xx unknown
- 1990-02-16 IL IL93421A patent/IL93421A0/xx unknown
-
1992
- 1992-06-23 MX MX9203146A patent/MX9203146A/es unknown
-
1998
- 1998-11-24 HK HK98112285A patent/HK1011385A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-05-19 LV LVP-00-64A patent/LV12523B/lv unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4970198A (en) | Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex) | |
| US5108912A (en) | Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex) | |
| NL8001982A (nl) | Antibiotisch werkzame stof en werkwijze ter bereiding en toepassing van deze stof en farmaceutisch preparaat, dat deze stof bevat. | |
| HU195855B (en) | Process for production of ll-e 33288-marked antibioticumkomplex and its components with antitumor effect and medical compositions containing them | |
| JPH0641182A (ja) | Ｂｂｍ−２４７８ｂ抗生物質 | |
| DE69735099T2 (de) | Antibiotika rk-1061 und verfahren zu ihrer herstellung | |
| US4764602A (en) | Antibiotics, and their production | |
| JPH07102128B2 (ja) | ストレプトミセス・サンダエンシスの生物学的純粋培養物 | |
| US4626503A (en) | Antitumor agents LL-D49194α1, LL-D49194β1, LL-D49194β2, LL-D49194β3, LL-D49194γ, LL-D49194δ, LL-D49194ε, LL-D49194ξ, LL-D49194η, LL-D49194ω1, LL-D49194ω2, and LL-D49194ω3 | |
| JP2504450B2 (ja) | ダウノルビシンに関連した新規生合成アントラサイクリン | |
| EP0702691B1 (en) | New thiodepsipeptide isolated from a marine actinomycete | |
| JP3048513B2 (ja) | ２， ２’ −ビピリジン誘導体、その製造方法及び該誘導体を含有する抗腫瘍剤 | |
| US5281417A (en) | Antitumor process employing novel fermentate of an Actinomadura strain | |
| EP0413967B1 (en) | Novel antibiotic | |
| US5096817A (en) | Process for producing antibiotics BU-3608 D and BU-3608 E | |
| AU616946B2 (en) | Antibacterial and antitumor agents ll-e33288epsilon-i and ll-e33288-epsilonbr, with processes and intermediates for producing said agents | |
| EP0157203A2 (en) | Antitumor agents LL-D49194 alpha 1, LL-D49194 beta, LL-D49194 beta 2, LL-D49194 upsilon, LL-D49194 delta, LL-D49194 epsilon, LL-D49194 zeta, and LL-D49194 eta | |
| US4298599A (en) | Novel antibiotic BN-235 substance, and process for the production thereof | |
| US4248970A (en) | Antibiotic complex producing bacterial culture | |
| US4650765A (en) | Biologically pure culture of Streptoverticillium stramineum sp. nov. | |
| JP2576883B2 (ja) | Ｓ−６３２−ｂ▲下１▼およびｓ−６３２−ｂ▲下２▼物質 | |
| US4316957A (en) | Process for the production of 7-deazaadenosine and 7-deazainosine | |
| JPS63146784A (ja) | 新菌種ストレプトマイセス・ルブロパープレウス | |
| JPH023694A (ja) | 抗生物質６１０８類、それらの製造法及びその用途 | |
| JPH06189747A (ja) | 新規微生物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 |