KR890001289B1

KR890001289B1 - 항종양 항생제(ll-e33288 복합체) 및 그의 제법

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Publication number: KR890001289B1
Application number: KR1019850008548A
Authority: KR
Inventors: 딘-밍 리이 메이; 그린스 타인 마이클; 폴 레이비다 데이빗드
Original assignee: 아메리칸 사이아나밋드 캄파니; 죤 제이 헤이간
Priority date: 1984-11-16
Filing date: 1985-11-15
Publication date: 1989-04-28
Also published as: ATE180513T1; EP0182152B1; AU589918B2; CA1291054C; DK529685D0; IL93421A0; FI854510A; HUT41839A; PT81493A; IL76878A; KR870004144A; JPS61158928A; IL93419A0; PT81493B; JPH0774228B2; NO854578L; LV12523A; IL93420A0; ES8703160A1; EG17709A

Abstract

내용 없음.

Description

항종양 항생제(LL-E33288 복합체) 및 그의 제조방법

제1도는 LL-E33288β₁-Br의 자외선 흡수 스펙트럼이다.

제2도는 LL-E33288β₁-Br의 적외선 흡수 스펙트럼이다.

제3도는 LL-E33288β₁-Br의 양성자 자기 공명 스펙트럼이다.

제4도는 LL-E33288β₁-Br의 C₁₃자기 공명 스펙트럼이다.

제5도는 LL-E33288γ₁-Br의 자외선 흡수 스펙트럼이다.

제6도는 LL-E33288γ₁-Br의 적외선 흡수 스펙트럼이다.

제7도는 LL-E33288γ₁-Br의 양성자 자기 공명 스펙트럼이다.

제8도는 LL-E33288γ₁-Br의 C₁₃자기 공명 스펙트럼이다.

제9도는 LL-E33288α₂-I의 양성자 자기 공명 스펙트럼이다.

제10도는 LL-E33288α₃-I의 양성자 자기 공명 스펙트럼이다.

제11도는 LL-E33288β₁-I의 자외선 홉수 스펙트럼이다.

제12도는 LL-E33288β₁-I의 적외선 흡수 스펙트럼이다.

제13도는 LL-E33288β₁-I의 양성자 자기 공명 스펙트럼이다.

제14도는 LL-E33288β₁-I의 C₁₃자기 공명 스펙트럼이다.

제15도는 LL-E33288γ₁-I의 자외선 흡수 스펙트럼이다.

제16도는 LL-E33288γ₁-I의 적외선 흡수 스펙트럼이다.

제17도는 LL-E33288γ₁-I의 양성자 자기 공명 스펙트럼이다.

제18도는 LL-E33288γ₁-I의 C₁₃자기 공명 스펙트럼이다.

본 발명은 LL-E33288α₁-Br, LL-E33288α₁-1, LL-E33288α₁-Br, LL -E33288α₂-I, LL-E33288α₃-Br, LL-E33288α₃-I, LL-E33288α₄-Br, LL-E 33288β₁-Br, LL-E33288β₁-I, LL-E33288β₂-Br, LL-E33288β₂-I, LL-E 33288γ₁-Br, LL-E33288γ₁-I 및 LL-E33288δ₁-I로 표시되는 신규한 항생 및 항종양제와 발효에 의한 그들의 제법, 불순한 용액으로 부터 그들을 회수하여 농축시키는 방법 및 그들의 정제법에 관한 것이다. 본 발명은 불순한 농축물, 각종 또는 모든 성분들의 복합체 같은 희석된 형태 및 개개 성분들 및 마이크로모노스포라(Micr omonospora)의 신규 균주들과 같은 정제형태의 항균 및 항종양제를 모두 그 범주내 포함한다.

본 발명의 LL-E33288 항생제는 밀접하게 관련된 화합물들이다. 14번째 항생제는 발효로부터 회수되며 초기엔 혼합물로서 얻어지나 후에 LL-E33288 복합체중 하나 즉 LL-E33288 요도-복합체나 LL-E33288브로모-복합체로서 얻어진다. 일반적으로 LL-E33288 항생제들중 요드함유 성분들(예 : α₁-I,α₂-I,α₃-I,β₁-I,β₂-I,γ₁-I 및 δ₁-I)은 무기 또는 유기 요드화물을 함유하는 배지를 사용한 발효에서만 발견되는 반면, 브롬함유 성분들(예 α₁-Br, α₂-Br, α₃-Br, α₄-Br, β₁-Br, β₂-Br 및 γ₁-Br)은 오직 무기 또는 유기 브롬화물을 함유하는 배지를 사용한 발효에서만 발견된다. LL-E33288 복합체중 성분들의 비는 브롬 및 요드함유 항생제둘다의 발효에 따라 달라지며 LL-E33288β₁과 LL-E33288γ₁이 주요성분들로서 이들이 복합체의 약 90%를 차지한다. LL-E33288α₁, LL-E33288α₂, LL-E33288α₃, LL- E33288 α₄-Br, LL-E33288β₂및 LL-E33288δ₁-I는 미량성분들로서 함께 복합체의 약 10%를 차지한다. LL-E33288 항생제는 그 람양성균 및 음성균에 대해 활성이 있다. 성분들 각각은 또 DNA 손상을 직접 또는 간접적으로 개시하는 약제의 능력을 특수하게 측정하는 시험인 생화학 유도 검정법 (Biochemical Induction Assay) (Elespuru, R.and Yarmolinsky, M., Environmental Mutagenesis, 1 65-78 1979)의 변법에서, 활성이 있는 것으로 밝혀겼다. 이 검정시험에서 LL-E33288β₁-Br과 LL-E33288γ₁-Br은 모두 1×10^-6mcg/ml 이하의 농도에서 활성이 있었다.

LL-E33288β₁-Br과 LL-E33288γ₁-Br의 물리-화학적 특성을 하기에 나타냈다.

LL-E33288β ₁ -Br

1) 대략적인 원소 분석치 : C ,48.6, H ; 5.6, N ; 2.9, S ; 9.1 :및 Br 5.5(전자분광분석법으로 화학분석(ESCA)했을때 하기 원소들만이 존재하는 것으로 나타났다 : C,H,N,O,S 및 Br) 2) 융점 : 146-150℃(분해) 3) 비선광도 : [α]_D ²⁶=-49±10° (0.1% 에탄올) ; 4) 자외선 흡수 스펙트럼 : 제1도에 나타난 바와같음(메탄올 : 산성 메탄올 : 염기성 매탄올) , 5) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제2도에 나타난 바와 같음(KBr디스크) 6) 양성자 자기 공명 스펙트럼 : 제3도에 나타난 바와 같음(300MHz,CDCl₃) 7) C-13 자기 공명 스펙트럼 :제4도에 나타난 바와 같음(75.43MHz,CDC1₃,TMS를 표준으로 한 ppm) 유의한 피이크는 하기에 기재된 바와 같다.

17.60(q); 17.64(q); 18.9(q); 19.7(q);

22.4(q); 22.8(q); 2.35(q); 34.3(t);

36.9(t); 39.2(t/d); 47.8(d); 51.7(q);

52.7(q); 54.6(t/d); 56.3(q); 57.2(q);

57.8(d); 61.0(q/d); 61.7(d); 62.4(t);

66.9(d); 68.4(d); 69.1(d); 69.7(d);

70.2(d); 71.1(d); 71.9(d); 72.1(s/t);

76.1(d); 81.0(d); 83.3(s); 88.2(s);

97.4(d); 99.7(d); 100.8(s); 102.5(d);

115.1(s); 123.4(d); 124.4(d); 126.5(d);

130.2(s); 130.8(s); 144.6(s); 149.3(s);

149.5(s); 191.7(s); 192.4(s);

8) 분자량 : FAB-MS로 측정시 79Br/81Br에서 각기 1333/1335 9) 분자식 : C₅₄H₈₄N₃O₂₂S₄Br, 고분해능 FAB-MS에 의해 정확한 분자량이 1258, 3699(79Br) 및 1260, 3726(81Br)인 것으로 측정되어 C₅₂H₈₁N₃O₂₁S₃Br(M+H-C₂H₄OS)인 것으로 계산되었다.

LL-E33288γ ₁ -Br

1) 자외선 흡수 스펙트럼 : 제5도에 나타난 바와 같음(메탄올 : 산성 메탄올 : 염기성 메탄올) 2) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제6도에 나타난 바와 같음(KBr디스크) 3) 양성자 자기 공명 스펙트럼 . 제7도에 나타난 바와 같음 (300MHz,CDC1₃) 4) C₁₃자기 공명 스펙트럼 제8도에 나타난 바와 같음 (75.43MHz,CDC1₃,TMS표준으로 한 ppm) 유의한 피크를 하기에 기재했다.

14.4 17.6 17.9 19.0

19.7 - 22.8 -

- 34.0 37.6 39.5

42.1 - 51.6 52.7

54.1 56.3 57.3 -

59.3 61.1 61.8 61.9

67.2 68.18 68.23 69.7

70.1 70.8 71.1 71.7

71.8 76.1 - 81.0

82.9 88.4 - 97.8

100.0 100.2 101.3 103.0

115.3 123.0 124.9 126.9

130.4 131.1 131.8 138.0

144.7 - 149.5 149.6

155.6 192.5 192.9

5) 분자식 : 그의 UV, IR,'H NMR 및 13CNMR데이타를 LL-E33288β₁-Br 및 LL-E33288γ₁-I의 것과 비교했을때 C₅₃H₈₂N₃O₂₂S₄Br 6) 분자량 : 그 분자식으로 부터 계산시 79Br/81Br에서 각기 1319/1321

LL-E33288α ₁ -I

1)분자량 1145(FAB-MS로 측정)

LL-E33288α ₂ -I

1) 전자분광법으로 화학분석(ESCA)시 오직 하기 원소만을 함유함. C,H,N.O, S,I; 2) 분자량 : 1131(FAB-MS로 측정) 3) 양성자 자기 공명 스펙트럼 제9도에 나타난 바와 같음(300MHz,CDC1₃)

LL- E33288α ₃ -I

1) 분자량 : 1066(FAB-MS로 측정) 2) 양성자 자기 공명 스펙트럼 제10도에 나타난 바와 같음(300 MHz, CDCl₃)

LL-E33288β ₁ -I

1) 자외선 흡수 스펙트럼 : 제11도에 나탄난 바와 같음(메탄올 : 산성 메탄올 : 염기성 메탄올) 2) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제12도에 나타난 바와 같음(KBr 디스크) 3) 양성자 자기 공명 스펙트럼 : 제13도에 나타난 바와 같음(300MHz,CDC1₃) 4) C₁₃자기 공명 스펙트럼 : 제14도에 나타난 바와 같음(75.43MHz,CDC1₃,TMS를 표준으로 한 ppm) 유의한 피크들을 하기에 기재했다.

- 17.5 17.6 18.9

- 22.4 22.8 23.4

25.4 34.3 36.9 39.2

- 47.9 51.6 52.8

54.8 56.3 57.2 57.9

60.9 61.6 62.2

67.0 68.4 68.4 69.1

69.6 70.4 71.1 71.8

72.2 76.2 - 80.8

83.3 88.1 93.6 97.4

99.6 99.6 - 102.6

112.4 123.4 124.4 126.4

- - 133.4 -

- - - -

- 192.3 192.6 -

5) 분자식 : 그의 UV, IR,'H NMR 및 13CNMR데이타를 LL-E33288β₁-Br및 LL-E33288γ₁-I의 것과 비교했을때 C₅₄H₈₄N₃O₂₂S₄I6) 분자량 : 분자식으로 부터 계산시 1381

LL-E33288γ ₁ -I

1) 하기 성분들을 함유하며 전자분광법으로 화학분석(ESCA)시 오직 하기 성분들만을 함유함 ; C, H, N, O, S, I ; 2) 대략적인 원소분석치 : C ; 48.8, H ; 5.4, N ; 2.8, S ; 9.0, I;92; 3) 분자량 ; 1367(FAB-MS로 측정) 4) 분자식 : C₅₃H₈₂N₃O₂₂S₄I, 고분해능 FAB-MS로 측정된 M+H의 정확한 질량은 C₅₃H₈₃N₃O₂₂S₄I에 해당하는 1368, 3397였다. 5) 자외선 흡수 스펙트럼 : 제15도에 나타난 바와 같음(메탄올 : 산성 메탄올 : 염기성 메탄올) 6) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제16도에 나타난 바와 같음 (KBr 디스크) 7) 양성자 자기 공명 스펙트럼 : 제17도에 나타난 바와 같음(300MHz, CDC1₃) 8) C₁₃자기 공명 스펙트럼 :제18도에 나타난 바와 같음 (75.43MHz,CDCl₃, TMS을 표준으로 한 ppm) 유의한 피크는 하기 기재된 바와 같다.

14.5(q) 17.6(q) 17.6(q) 18.9(q)

- - 22.8(q) -

25.4(q) 34.1(t) 37.0(t) 39.1(t)

42.3(t/s) - 51.5(d) 52.8(q)

54.8(t) 56.3(q) 57.2(q) -

60.4(d) 60.9(q) 61.3(t) 61.7(q)

67.0(d) 68.4(d) 68.5(d) 69.2(d)

69.7(d) 70.5(d) 71.1(d) 71.8(d)

72.1(s) 75.7(d) 75.8(d) 80.9(d)

82.8(s) 88.1(s) 93.5(s) 97.3(d)

99.6(d) 99.7(d) 100.8(s) 102.6(d)

- 123.4(d) 124.4(d) 126.2(d)

130.2(s) 131.0(s) 133.4(s) 139.1(s)

143.0(s) 145.1 150.6(s) 151.5(s)

154.5 192.0(s) 192.5(s)

LL-E33288 성분들은 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC) 및 박층크로마토그라피(TLC)에 의해 가장 편리하게 분리되며 확인된다. 상응하는 요드화 및 브롬화 성분들을 HPLC로 분리하는 것은 불가능한 것은 아니나 힘들며 그들은 TLC에 의해 분류될 수 없다.

LL-E33288-Br 성분들의 HPLC에 의한 바람직한 분석 분리에 하기 조건들을 사용했다.

컬럼 : “세파랄라이트 C₁₈5m,”4.6mm×25cm(Analytichem Internatio nal) ; 용매 아세토니트릴 ; 0.2M수성 초산암모늄(60 : 40) 유속 : 1.5m1/분,검출기 : 254nm 및 280nm에서 이중 파장 UV 감도 : 0-0.02 A.U.F.S.

표IA에 이들 조건하에서 LL-E33288β₁-Br, LL-E33288β₂-Br 및 LL-E33288γ₁-Br의 대략적인 재류 시간 및 용량을 나타냈다.

[표 IA]

요드함유 LL-E33288 성분들의 바람직한 HPLC 분석 분리에는 하기 조건을 사용했다 : 컬럼 : RCM-100레이디알 압축 모듈을(Radial Compression Module) 갖고 있는 NOVA-PAK C₁₆카트리지 (밀리포어, 워터스 크로마토그라피 디비죤) 용매 : 아세토니트릴 : 0.2M 수성초산암모늄(50 : 50) 유속 : 1.2ml/분 검출기 : 254nm 및 280nm에서 이중 파장 UV 감도 : 0-0.02 A.U.F.S.

표IB는 이런 조건들 하에서 LL-E33288α₁-I, LL-E33288α₂-I, LL-E33288α₃-I, LL-E33288β₁-I, LL-E33288β₂-I, LL-E33288γ₁-I 및 LL-E33288δ₁-I의 대략적인 재류 시간 및 용량들을 나타낸 것이다.

[표 IB]

LL-E33288을 하기 TLC시스템에 의해 분리하고 확인했다.

흡착제 : 실리카겔 60 F₂₅₄이 미리 피복된 알루미늄 박판, 0.2mm층 두께, EM시약 검출 : 단파장 UV 램프(254nm)하에서의 소진 효과 및 고초균(Bacillus subtilis)를 이용한 생물학적 자기 묘사법을 보거나 개질된 생화학적 유도검정법으로 함. 용매계 : I, 0.1M 수성 인산이 수소칼륨으로 포화된 초산에틸. II, 0.1M 수성 인산이 수소칼륨으로 포화된 초산에틸중 3% 이소프로필 알콜 III, 초산에틸 : 매탄올(95 : 5)

표II는 이들 세가지 용매계에서 LL-E33288 성분들의 대략적인 Rf치를 나타낸 것이다.

[표 II ]

LL-E33288α₁-Br, LL-E33288α₂-Br, LL-E33288α₃-Br, LL-E33288α₄-Br, LL-E33288β₁-Br, LL-E33288β₂-Br, LL-E33288γ₁-Br, LL-E33288α₁-I, LL-E33288α₂-I, LL-E33288α₃-I, LL-E33288β₁-I, LL-E33288β₂-I, LL-E33288γ₁-I 및 LL-E33288δ₁-I로 표시되는 신규한 항균및 항종양제는 마이크로모노스포라 에키노스포라 아종 칼리켄시스(Micromonospora echinospora ssp. calichensis)의 신규 균주를 조절된 조건하에서 배양하는 도중, 생성되었다. 이 미생물은 아메리칸 시아나미드 컴패니(Pearl River, New York) 메디칼 리써치 디비죤의 배양물 보관소에 배양번호 LL-E33288로서 보관되어 있다. 이 신규 미생물의 생육 배양물이 1984년 8월 9일 미국 농무성 산하가관인 컬쳐 콜렉션래보라토리, 북부 연구센타에 기탁되어 그 영구 수집물중에 첨가되었다. 이것은 균주 명칭 NRRL 15839로 이 보관소에 의해 명명되었다. 본 출원 계류중 균주 명칭 NRRL 15839하에 있는 이런 배양물의 접근은 특허청에 의해 37 C.F.R. 1.14 및 35 U.S.C. 122, 하에 권리가 부여되도록 결정된 자에게만 가능하며, 이런 배양물의 일반에 대한 이용의 모든 제한은 본 출원에 특허가 인정될때 최종적으로 제거될 것이다.

배양물 LL-E33288은 텍사스에서 수집된 칠례초석을 함유한 광층(caliche) 점토 샘플로 부터 단리되었다.

균주 NRRL 15839가 마이크로모노스포라 속에 속한다는 것은 행태학적 및 화학적으로 확인되었다. 균주는 영양 균사상에 집단적인 또는 단일의 단포자를 생성한다. 어떤 호기성 균사도 관찰되지 않았다. 전자 현미경으로 검사한 결과 포자가 우상(

狀)인 것으로 나타났다. 전세포를 분석한 결과 균주가 디아미노피멜산(DAP)의 메조 이성체를 함유하는 것으로 나타났다. DAP의 3-OH 유도체가 다량(대부분량)으로 존재했다. 또한 균주에 그 전세포 서당가수분해물(전세포서당 형태는 D형임) 중에 미량의 아라비노즈와 크실로즈가 존재하는 것으로 나타났다.

형태학 및 생리학적 연구결과 NRRL 15839가 M. 에키노스포라 아종(M.에키노스포라 아종 팰리다)으로 간주할 수 있다는 결론을 얻었다. NRRL 15839의 형태학상의 데이터를 하기 표 A 및 B에 나타냈으며 생리적 데이타를 하기표 C 및 D에 나타냈다.

[표A]

NRRL 15839의 형태학적 고찰(색상은 NBS-ISCC)

[표B]

방선균류 성장을 위해 사용된 각종 한천 배지상에서 NRRL 15839의 형태학적 고찰

[표C]

NRRL 15839의 탄산수소 이용

[표D]

NRRL 15839의 생리적 반응

+=양성 ; -=음성 ; V=가변성 ; W=약함.

돌연변이체 LL-E33288-R66, NRRL-15975의 유도

발효수율을 개선시키기 위한 노력으로 원배양물 LL-E33288(NRRL-15839)을 평판배양한 후 50개의 단일집락을 단리했다. 이들을 NSI-NS50으로 표시했다(NS=자연선택) . 이들 분리물을 발효한결과 중정도포자형성을 가진것들이 일반적으로 LL-E33288 복합체를 더 잘 만들어내는 것으로 나타났다. 분리물 NS6을 이들군의 대표로 선택했다.

분리물 NS6를 출발배양물로 사용하여 포자현탁액을 제조하고 각종 변이유발인자에 노출시켰다. 니트로소구아니딘 처리로부터 단일집락을 단리시켰으나 어느것도 LL-E33288 복합체의 유의하게 개질된 제조자인 것으로 입증된 것이 없다. 일련의 물질들의 자외선에 조사시켜 그로부터 분리물 UV 610이 고수율 돌연변이체로서 선택되는 단일집락을 얻었다. 분리물 UV 610의 스트링킹한 후 하위 분리물 1-7을 얻었다. 하위-불리물 UV 610(3)을 다음 조작을 위해 선택했다.

LL-E33288 복합체가 아주 강력한 항균 및 신생물 형성억제작용을 갖고있기 때문에 일단 제한된 농도의 항생제를 발효로 생합성 하게되면 이것은 생성된 배양물에 독성/저지성이 될 수 있다. 따라서 LL-E33288 항생제복합체에 저항성인 분리물을 얻기위해 노력하였다.

분리물 UV 610(3)로부터 영양생장물을 발효에 사용하기 위해 제조한 후, 펩톤, 덱스트로즈, 당밀 및 물로 구성된 배지플라스크를 접종하는데 사용했다. 배지에 8㎍/m농도로 LL-E33288β₁-Br을 보충했다. 이 플라스크로부터 평판배양을 수없이 행한후 7일째 되는날 저항성집단을 얻었다. 총 97개와 집락(Rl-R97)을 분리시켰다. 분리물 R66을 LL-E33288β₁-Br의 강력하게 개선된 제조자로서 선택했다.

이 과정을 하기에 도식으로 나타냈다.

돌연변이균주 R66을 배양물번호 LL-E33288 R66으로 아메리칸 시아나미드, 메디칼 리써어치 디비죤의 배양물 보관소에 보존했다. 이 신규 미생물의 생육배양물이 1985년 6월 6일 미국 농무성 산하기관인 북부연구 센타 배양물보관실험소에 기탁되어 그 영구 수집물에 첨가되었다. 이것은 이 보관소에 의해 NRRL15975로 명명되었다. 본 출원 계류중 균주명칭 NNRL 15975하에 있는 이런 배양물의 접근은 특허청에 의해 C.F.R.ξ 1.14 및 35 U.S.C.ξ 122하에 권리가 부여되도록 결정된 자에게만 가능하며 이런 배양물의 일반에 대한 이용의 모든 제한은 본 출원에 특허가 인정될때 최종적으로 제거될 것이다.

형태학적으로, NRRL-15975는 NRRL-15839보다 더 적은 포자를 형성한다. NRRL-15975를 NRRL-15839와 비교한 것을 하기표DD에 나타냈다.

화학적으로 NRRL-15839와 NRRL-15975는 동일한 전세포서당패턴을 나타낸다(D형 :크실로즈와 미량의 아라비노즈). 전세포 디아미노피멜산을 분석한 결과 15975가 메조이성체를 형성하지 않으며 단지 3-하이드록시유도체만을 형성하는 것으로 밝혀졌다. (NRRL-15839는 두 화합물을 모두 함유함) 이것은 화학-계통적 소속을 변경시키지 않는다.

본원 발명에 사용된 상기 미생물 NRRL-15839와 NRRL-15975는 한국종균협회로부터 각각 KFCC-70003 및 KFCC-70004라는 번호하에 입수가능하다.

생리적시험결과 NRRL-15839와 NRRL-15975가 오직 두개의 생리적반응에서만 상이한 것으로 나타났다(표 D참조). NRRL-15975는 질산염환원효소에 대해 음성이며 젖산염이용에 대해선 양성이다. NRRL-15839는 둘다에 대해 약하게 양성이나 사면배지상에서 수개월 보존한 후엔 음성이 된다. 따라서, 이들 특성은 이 분류군에서 가변성인것으로 간주해야 한다.

[표 DD]

NRRL-15839와 NRRL 15975의 형태학적 비교

1=V=영양균사 ; Sp=포자 ; SS=가용성색소

이들 신규한 항균 및 항종양제를 제조하는데 있어 본 발명이 이 특정 미생물이나 여기서 예시의 목적으로 제공한 상기한 현미경적 성장 특성이 일치하는 미생물들에 한정되지 않음을 이해해야 한다. 사실 X-선조사, 자외선조사, N'-메틸-N'-니트로-N -니트로소구아니딘, 악티노파지 같은것에 노출시키는 것과 같은 각종 방법에 의해 이들 미생물로부터 생성된 돌연변이균주의 사용을 포함시키는 것이 바람직하다.

LL-E33288 성분의 시험관내 항균활성을 표준한천희석법으로 그림양성 및 음성균에 대해 측정했다. 2배감소된 농도의 항생제를 함유하는 뮐러-힌톤한천을 페트리접시에 부었다. 한천표면에 1-5×10⁴집락형성 세균단위를 접종했다. 35℃에서 접종 약 18시간 후 세균균주의 성장을 억제하는 LL-E33288 성분의 최저농도를 그 균주의 최소저지농도(MIC)로 기록했다. 결과를 하기표III에 요약했다.

[표 III]

LL-E33288 성분의 시험관내 항균활성

몇몇 생체내 시험시스템 및 약물시험기록표가 시험화합물들의 신생물 억제제로서의 그들의 적합성을 결정하기 위해 국립암연구소에 의해 개발되었다. 이들이 문헌에 보고되어 있다(“Cancer Chemotherapy Reports”, Part III, Vol,3,No.2(1972), Geran,et al.). 이들 약물시험기록표는 항종양제의 시험영역에서 일반적으로 따르는 표준 스크리닝테스트를 기초로 했다. 이들 시스템중, 임파성 백혈병 P388, 흑색종 Bl6, L1210 백혈병 및 결장 26 선암은 본 발명에 특히 의미가 있다. 이들 신생물은 생쥐에서 이식성종양으로 시험하는데 이용했다. 일반적으로 대조 동물(C)에 대한 처리된 동물(T)의 생존일수 중앙치의 증가율에 의해 이 시험기록표에서 나타난 유의한 항종양활성은 인간백혈병 및 충실성 종양에서 유사한 결과를 암시해 준다.

임파성 백혈병 P388시험

사용된 동물은 BDF₁생쥐로서 모두 동일한 성(性)으로서 체중 최저 17g으로 모두 3g이내의 체중 범위를 갖는다. 시험군당 생쥐는 5 또는 6마리이다. 임파성 백혈병 P388 세포 10⁶을 함유하는 묽은 복수(腹水)액0.5ml를 복강내 주입하여 종양을 이식했다. LL-E33288항생제는 β₁-Br 및 γ₁-Br 개개성분 및 모든성분의 복합체 (브로모-복합체)로서 P388시스템에서 시험되었다. 시험화합물은 지시된 용량으로 1,5 및 9일(종양 접종에 대해)째 표준식염수중 0.2%클루셀 (Klucel)중 0.5ml용량으로 복강내 투여했다. 생쥐의 중량을 달고, 생존수를 30일동안 정규적으로 기록했다. 처리(T)/대조(C) 동물에서 생존시간 중앙치 및 생존시간의비를 계산했다. 양성대조화합물은 시스플라틴으로 1,5 및 9일째 지시된 용량하에 0.2%클루셀 0.5ml용량으로 복강내 주사된다. 결과를 하기 표 IV에 나타냈다.

만일 T/C×100(%)가 125또는 그 이상이면 시험화합물은 유의한 항종양활성을 갖는 것으로 간주한다.

[표 IV]

임파성 백혈병 P388시험

흑색종 Bl6(Melanotic melanoma Bl6)

사용된 동물은, BDF₁생쥐로서 모두 동일성별을 가지며 체중은 최저 17g으로모두 3g이내의 체중 범위를 갖는다. 시험군당 동물수는 보통 6마리이다. 흑색종 B₁₆종양 1g을 차거운 평형 식염수 10ml중에 넣고 균질화하고 균등질 0.5ml를 시험 생쥐 각각에 복강내로 이식했다. LL-E33288항생제는 β₁-Br 및 γ₁-Br개개 성분으로서 및 모든 성분들의 복합체로서 B₁₆시스템에서 시험되었다. 시험화합물은 1-9일간 (종양접종에 대해) 각종 용량으로 복강내 투여했다. 생쥐의 중량을 달고 60일간 정극적으로 생존수를 기록했다. 생존시간 중앙치 및 처리(T)/대조 (C)동물의 생존시간의 비를 계산했다. 양성대조화합물은 시스플라틴이나 아드리아미이신이다. 이 시험결과를 표 V에 나타냈다. 만일 T/C×100(%)가 125 또는 그 이상이 되는 경우 시험화합물은 유의한 항-종양성을 갖는 것으르 간주한다.

[표 V]

흑색종 B₁₆시험

임파성 백헐병 L1210 시험

사용된 동물은 BDF₁생쥐로서 모두 동일성별을 가지며 체중은 최저 17g으로 모두 3g이내의 체중범위를 갖는다. 각 시험군당 동물수는 6마리이며, 대조군은 18마리이다. 생쥐는 10⁵세포 농도의 임파성 백혈병 L1210 0.5ml를 복강내 주사하여 종양을 이식했다. LL-E33288 항생제는 β₁-Br성분으로서 및 모든 성분들이 복합체 (브로모-복합체)로서 L1210시스템에서 시험되었다. 시험화합물은 각종 용량으로 1,5 및 9일 또는 1-9일간 (종양접종에 대해)투여했다. 생쥐와 중량을 달고, 30일간 정규적으로 생존수를 기록했다. 생존기간중앙치 및 처리(T)/대조(C)동물의 생존시간의 비를 계산했다. 양성대조화합물은 1,4-디하이드록시-5,8-비스[[2-(2-하이드록시 에틸아미노)에틸]아미노]안트라퀴논, 2염산염 또는 시스플란틴으로서 지시된 용량으로 복강내 주사했다. 결가를 표 Vl에 나타냈다.

[표 Vl]

임파성 백헐병 L1210 시험

결장 26선암(腺癌)시험

사용된 동물은 체중 최저 17g이며 모두 3g이내 체중범위에 있는 CD₂F₁암컷생쥐이다. 시험군당 동물수는 5 또는 6마리이며, 5 또는 6마리로된 3군을 각 시험에서 미처리대조로 사용했다. 종양 이식은 항생제를 함유하는 이글스 MEM 배지중 2% 결장 26 종양브라이(brei) 0.5ml를 복강내(또는 피하내)주사하여 했다. LL-E33288 항생제는 모든 성분의 복합체 (브로모-복합체)로서 결장 26시스템에서 시험되었다. 시험화합물을 1,5 및 9일째 (종양이식 용량에 대해) 복강내 투여했다. 생쥐의 중량을 달고 30일간 정규적으로 사망수를 기록했다. 처리(T)/대조(C)동물의 생존시간 중앙치를 계산했다. 양성대조화합물은 시스플라틴이었다. 결과를 표 VII에 나타냈다. 만일 T/C× 100(%)가 130 또는 그 이상이 되는 경우 시험된 화합물은 유의한 항종양활성을 가진 것으로 간주된다.

[표 VII]

결장 26 선암시험

M5076 육종

M5076 망상세포육종을 C57B2/6 암컷생쥐에 피하이식하여 증식시켰다. 항종양활성을 검정하기 위해 각 성별의 BDF₁생쥐에 10%종양브라이 0.5ml를 복강내 접종시켰다. LL-E33288 항생제를 모든 성분들의 복합체(브로모-복합체)로서 M5076신스템에서 검사했다. 시험화합물을 종양접종일을 0일로하여 1,5,9,13 및17일에 복강내 투여했다. 생존시간 중앙치를 60일간 사용된 각 약용량에 대해 측정하고 처리(T)/ 대조(C)동물의 생존시간 비를 계산했다.

이 시험결과를 시스플라틴에서 얻어진 결과와 비교하여 표 VIII에 나타냈다. 만일 T/C×100(%)가 125를넘는 경우 시험화합물을 유의한 항-종양활성을 갖고 있는 것으로 간주한다.

[표 VIII]

M5076 육종

유사한 방식으로 하기 요드-성분의 신생물 억제활성을 시험했다.

[표 IX]

임파성 백혈병 P388 시험

* 1,4-디하이드록시-5,-8-비스[[2-(2-하이드록시에틸아미노)에틸]아미노 ]안트라퀴논-2HCl

[표 X]

흑색종 B₁₆시험

[표 XI]

임파성 백혈병 L1210시험

[표 XII]

결장 26 선암 시험

일반적인 발효조건

마이크로모노스포라 에키노스포라 NRRL 15839 또는 NRRL 15975의 배양은 각종 광범위한 액체배향 배지중에서 수행될 수 있다. 이들 신규 항균 항종양제를 생성하는데 유용한 배지에는 전분, 서당, 당밀, 글리세롤등과 같은 동화성 탄소원; 단백질, 단백질가수분해물, 폴리펩티드, 아미노산, 옥수수담금액등과 같은 동화성 질소원; 칼륨, 나트륨, 암모늄, 칼슘, 설페이트, 카보네이트, 포스네이트, 클로라이드등과 같은 무기이온 및 양이온과 ; 브롬(브롬화나트륨) 또는 요드(요드화칼륨)의 공급원이 포함된다. 붕소, 몰리브덴,구리등과 같은 미량원소들이 배지의 다른 성분들의 불순물로서 공급된다. 탱크 및 병에의 공기주입은 멸균공기를 발효배지 표면을 통해 보냄으로써 공급된다. 탱크내에서의 교반은 기계식임펠러에 의해 제공된다.실리콘같은 소포제를 필요에 따라 첨가해줄 수 있다.

항생제 -LL-E를 단리 및 분리하는 일반적인 방법

LL-E33288항생제는 매시전체를 초산에틸 또는 디클로로메탄같은 유기용매로 추출해줌으로써 발효액으로부터 회수된다. 유기추출물중에 함유된 항생제복합체는 저급탄화수소로부터 선택적으로 침전시켜 더 정제한다. 이렇게 얻은 불순한 LL-E-33288 항생제복합체를 실리카겔, 세파텍스

LH-20(pharmacia Fine Chemicals) 및 C₁₈결합 실리카를 사용한 일련의 컬럼크로마토그라피에 의해 더 정제하고 개개성분으로 분리시켰다.

본 발명은 하기 비-한정적 특수 예들에 의해 더 상세히 설명될 것이다.

[실시예 1]

접종물 제조

1차 접종물을 성장시키는데 사용되는 전형적인 배지를 하기 조성에 따라 제조했다.

쇠고기 추출물 약0.3%

트립톤 약0.5%

덱스트로즈 약 0.5%

덱스트린 약 2.4%

탄산칼슘 약 0.4%

이스트추출물 약 0.5%

물 100% 될때까지 적량

이 배지를 pH 7.0으로 조절한 후 멸균했다. 이 멸균배지 100ml를 플라스크에 넣고 배양물 NRRL 1583의 냉동 균사체로 접종시켰다. 접종된 배지를 회전진탕기에 놓고 32℃에서 48시간 맹렬히 교반했다. 이어 이 접종된 배지를 14l 발효기내에서 상기한 멸균배지 10l를 접종시키는데 사용했다. 이 배지를 진탕하면서 32℃에서 48시간 배양하여 2차 접종물을 얻었다. 이 2차 접종물을 이어 탱크중에서 상기한 멸균배지 300m1를 접종시키는데 사용했으며 이어 이것을 30℃에서 180-200rpm임펠러로 진탕하면서 48시간 배양하여 3차 또는 종자접종물을 얻었다.

[실시예 2]

탱크 발효

하기 조성에 따라 발효배지를 제조했다.

덱스트로즈 약 0.5%

서당 약 1.5%

펩톤, 세균 배양용 약 0.2%

인산제 2칼륨 약 0.01%

당밀 약 0.5%

탄산칼슘 약 0.5%

브롬 또는 요드공급원 미량

물 적량 100%될때가지

상기한 배지 2800l를 멸균한 후 실시예 1에서와 같이 제조된 3차(종자)접종물 300m1로 접종시켰다. 일분당 매시(mash)1당 0.53l의 속도로 멸균공기를 공급해 주었다. 온도를 약 28℃에서 유지시킨후 약 97시간후 발효를 끝내고 매시를 수확했다.

항균활성, 생화학적 유도검정법, TLC 및 HPLC 분석법으로 LL-E33288항생제가 생성되었나를 보아 발효과정을 감시한다.

전체 수확된 맥아즙의 pH를 6으로 조절한 후 매시용량의1/2되는 초산에틸로 추출했다. 초산에틸 추출물을 시럽이되도록 농축하고 헥산으로 2회 세척하고 규조토를 통해 여과했다. 규조토케이크를 초산에틸과 완전히 혼합해준 후 여과했다. 여액을 3l로 농축하고 과량의 무수황산나트륨 상에서 건조하고 헥산첨가로 침전시켜 불순한 LL-E33288복합체 약 26.7g을 얻었다.

[실시예 3]

LL-E33288β₁Br, β₂-Br및 γ₁-Br로부터 LL-E33288α₁-Br, α₂-Br, α₃-Br 및 α₄-Br의분리

실시예 2로부터 얻은 불순한 LL-E33288복합체(브로모-복합체) 약 26.7g을 3부분으로 균등히 분배한후 0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸로 평형으로한 충전된 2.4×110cm 실리카겔컬럼(Silica Woelm

, 32-63m, Woelm Pharma) 3개 상에서 각기 크로마토그라피했다. 우선 컬럼을 3m/분의 유속하에 18시간동안 동일 용매로 용출시켜 18ml분획물들을 수거했다. 용출액으로 초산에틸 : 메탄올(95 : 5)로변경시켜 용출을 8시간 계속했다. 최종적으로 컬럼을 초산에틸 :메탄올(90 : 10)으로 10시간 용출시켰다. 분획물을 생화학유도검정법 (BIA)변법으로 검정했다. 양성분획물들은 실리카겔 60으로 미리 코팅한 박판을 사용한 TLC로 분석하고 0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸중 3% 이소프로판올로 된 용매계로전개시켜 BIA변법을 사용하여 생물학적자기 묘사법으로 검출했다.

3개 컬럼으로부터 LL-E33288α₁-Br, α₂-Br, α₃-Br 및 α₄-Br(LL-E33288α-Br복합체)를 함유하는 분획물을 모아 농축건조하고 잔사를 초산에틸에 용해시키고 소량의 물로 세척했다. 초산에틸 용액을 무수황산나트륨 상에서 건조하여 상기한 바와같이 침전시켜 불순한 LL-E33288α-Br복합체 약 4.2g을 수득했다.

LL-E33288β₂-Br, β₁-Br 및 γ₁-Br(γ -Br을 함유하는 LL-E33288β -Br 복합체)를 함유하는 분획물을 3개 컬럼으로부터 모아 상기한 바와같이 조작하여 γ-Br을 함유하는 불순한 LL-E33288β -Br 복합체 약 2.0g을 얻었다.

[실시예 4]

LL-E33288β₁-Br 및 LL-E33288γ₁-Br의 단리

실시예 3으로부터 얻은 γ-Br을 함유하는 LL-E33288β-Br복합체 샘플 약 1.9g을 1.2ml/분의 이속하에 메탄올 : 물(90 : 10)으로 평형으로한 25×10cm 세파덱스

LH-20컬럼상에서 크로마토그라피하여 15m1씩 분획물을 모았다. 분획물들을 BIA로 검정하고 활성인 것들을 상기한 바와같이 TLC로 분석했다.

LL-E33288β₁-Br,β₂-Br 및 γ₁-Br 대부분을 함유하고 있는 분획물 21-26을 모아 농축시켜 메탄올을 제거하고 결과생성된 수성혼합물을 동결건조시켜 약 10%의 LL-E33288β₂-Br, 1%의 E33288β₂-Br및 4%의 LL-233288γ₁-Br을 함유하는 부분적으로 절제된 복합체 약 435mg을 수득했다.

상기한 γ-Br을 함유하는 부분적으로 절제된 LL-E33288β -Br복합체를 1ml/분의 유속하에 초산에틸 :메탄올(98 : 2)로 평형으로한 충전된 두개의 1.5×100cm 실리카겔컬럼 (Kiesel Gel 60, 40-63㎛, EM 제품, 크로마토그라피용) 상에서 크로마토그라피하여 12m1씩 분획물을 모았다. 분획물을 검정하고 상기한 바와같이 TLC로 분석한후 1차적으로 LL-E33288β₁-Br을 함유하는 것을 모아 농축하고 헥산으로부터 침전시켜 80%순도의 LL-E33288β₁-Br약 26mg을 수득했다. LL-E33288γ₁-Br (LL-E33288β₁-Br직후 크로마트그라피된 것)을 함유하는 분획물을 모아 조작하여 30%순도의 LL-E33288γ₁-Br 약 4.5mg을 수득했다. LL-E33288β₂을 함유하는 소량의 분획물을 모아 (LL-E33288β₁-Br직후 크로마토그라피된 것) 조작하여 미량의 LL-E33288β₂-Br을 수득했다.

[실시예 5]

LL-E33288β₁- Br의 최종정제

실시예 4로부터 얻은 80%순도의 LL-E33288β₁-Br 약 26mg을 동일건조하에 수행된 다른 발효로부터 얻어진 유사한 순도의 다른 LL-E33288β₁-Br샘플과 합했다. 이 합한 β₁-Br 약 38mg 전체를 왓트만PLKC₁₈F, l00m 미리코팅된 TLC 판을 사용하여 메탄을 : 0.1M 초산암모늄완충액 (pH 4.0) (90 : 10)으로 전개시키면서 역상예비 TLC로 더 정제했다. 단판장 UV램프(254nm)에서 소진효과로 확인된 Rf=0.66인 LL-E33288β₁-Br함유 밴드를 절제한후 0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산 에틸중 10%이소프로필알콜로 항생제의 흡착제를 세척제거했다. 용액을 농축시키고 잔사를 초산에틸에 용해시키고 소량의 물로 세척했다. LL-E33288β₁-Br을 함유하는 유기용액을 상기한 바와같이 조작하여 90%순도의 LL-E33288β₁-Br 약 24.5mg을 수득했다. 이 샘플을 0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포하된 초산에틸중 3%이소프로필알콜로 전개시킨 실리카겔상 (실리카겔 GF 예비코팅박판, 1000m, Analtech) 예비 TLC로 더 정제했다. 크로마토그라피의 R_f=0.7에 해당하는 단파장 UV램프(254nm)하에서 주요 소진밴드를 절제한후 디클로로메탄 : 메탄올(80 : 20)을 사용하여 항생제의 흡착제를 세척제거했다. LL-E33288β₁-Br을 함유하는 유기용액을 상기한 바와같이 조작하여 실질적으로 순수한 LL-E33288β₁Br약 18.8mg을 수득했다.

[실시예 6]

LL- E33288β₁- Br의 최종정제

실시예 4로부터 얻은 30%순도의 LL-E33288γ₁-Br 약 4.5mg을 동일조건하에서 수행된 다른 발효로부터 얻은 유사한 순도의 다른 LL-E33288γ₁-Br샘플과 합했다. 이 합한 샘플 총 18mg을 0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화시킨 초산에틸중 2% 이소프로필알콜로 전개시킨 실리카겔상 예비 TLC로 더 정제했다(실리카겔 GF로 미리코팅한 끝이 뾰족한 판, Analtech). 크로마토그라피 R_f치 0.5인 단파장 UV램프하에서의 주 소진밴드(254nm)를 절제하고 상기한 바와같이 조작하여 거의 순수한 LL-E33288γ₁-Br 약 4.3mg을 수득했다.

LL-E33288 브로모-복합체 생성을 위한 바람직한 발효배지는 하기와 거의 같다.

성분 %

서당 2.0

황산제일철 · 7수화물 0.01

황산마그네슘 · 7수화물 0.02

탄산칼슘 0.5

펩톤 0.2

당밀 0.5

브롬화나트륨 0.05

물 100ml 될때까지 적량

그러나, 요드화칼륨으로서 요드를 발효배지에 첨가해주면 하기 1)-4)와 같은 개선점이 얻어진다.

1) 발효중 영양체성장이 크게 향상됨.

2) 대장균 #300 및 고초균#308에 대한 생화학 검정시 저지대역이 증가함.

3)TLC판의 생물학적 자기묘사로 관찰시 Lt-E33288β₁-I 및 γ₁-I의 R_f치에 상당한 활성을 나타냄.

4) TLC로 검출시 다른 성분들이 증대됨.

하기 두종의 배지는 LL-E33288 요드-복합체 제조에 바람직하다.

성분 %

배지A 배지B

서당 2.0 2.0

황산제일철 · 7수화물 0.01 0.01

황산마과네슘 · 7수화물 0.02 0.02

탄산칼슘^*0.5 0.25

펩톤^**0.2 0.2

당밀 0.5 0.25

요드화칼륨 0.05 0.01

물 100m1될때까지 적량 100m1될때까지 적량

^*미시시피석회

^**MARCOR

세균용 펩톤에 의해 최상의 결과가 얻어지는 다른 펩톤도 유용하며, 고기로부터 얻은 폴리펩티드 및 카제인 가수분해도 유용함.

[실시예 7]

멸균증류수 5ml를 첨가한 배양물 NRRL-15839사면배지 표면을 긁어서 균사 -포자현탁액을 제조했다. 이어 이 현탁액을 500m1플라스크내에서 하기 조성을 가진 멸균 시이드 배지 100m1를 접종하는데 사용했다.

이스트추출물 0.5%

소고기추출물 0.3%

트립토스 0.5%

전분 2.4%

덱스트로즈 0.5%

탄산칼슘 0.4%

물 100.0% 될때까지 적량

이 시이드 플라스크를 200rpm 회전진탕기 상에서 3-4일간 28℃에서 배양하여 단계 I접종물을 얻었다.

단계 I접종물을 동일한 멸균 배지로된 단계 II접종물을 접종하는데 사용하고 동일조건하에서 2일간 배양시켰다.

이어 단계 II접종물을 하기 조성물을 가진 멸균발효배지 100m1를 접종하는데 사용했다.

서당 2.0%

황상제 일철 ·7수화물 0.01%

황산마그네슘 ·7수화물 0.02%

탄산칼슘 0.5%

펩톤(MARCOR

0.2%

당밀 0.5%

요드화칼륨 0.05%

물 100.0%가 될 때까지 적량

이 배지를 200rpm 진탕기상 28℃에서 5일간 배양한 후 매시를 수확했다.

4-20㎍/ml의 요드화칼륨농도가 적당한 것으로 나타났으나 2mg/ml농도가 수율을 저하시키는 것으론 나타나지 않았다.

NRRL-15839는 요드화칼륨이 배지중에 존재할때 비록 NRRL-15975가 1.5-3.5㎍/ml를 생성하는데 비하면 아주 낮은 용량(0.2-0.3㎍/ml)이긴 하나 LL-E33288β₁-I의 생성을 유도할 수 있다.

요드배지중 β₁-I 과 γ₁-I의 수율은 NRRL-15975를 사용한 브롬배지중 상응하는 브롬화 화합물 β1-Br 및 γ₁-Br의 수율보다 2-8배나 더 크다.

[실시예 8]

LL--E33288β₁-1,β₂-1, γ₁-I 및 δ₁-I로부터 LL-E33288α₁-I,α₂-I 및 α₃-I 의 분리

무기요드화물을 함유하는 배지와 NRRL-15975를 사용하여 75001를 발효가공하여 얻은 약 41.3g의 조제의 LL-E33288 복합체를 2부분으로 똑같이 나누어 초산에틸로 평형으로된 충전된 2개의 2.5×110cm실리카켈 컬럼 (Silica Woelm, 32-63um)상에서 크로마토그라피했다. 컬럼을 우선 4m1/분의 유속하에 초산에틸로 4시간 용출시켜 분획물을 20ml씩 모았다. 용출액을 0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸로부터 0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸10% 이소프로필알콜로 24시간에 걸쳐 오목경사적으로 서서히 변경시켰다. 최종적으로 컬럼을 0.1M 수성인 산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸중10% 이소프로필알콜로 하룻밤 용출시켰다. 분획물들을 BIA로 검정하고 활성성분을 실시예 3에 기재된 바와 같이 TLC로 분석하였다.

두개의 컬럼으로 부터 LL-E33288α₃-I를 함유하는 분획물(86-107)들을 모아 상기한 바와같이 조작하여 조제의 LL-E33288α₃-I 약 2.1g을 수득했다.

두개의 컬럼으로부터 LL-E33288α₁-I 및 α₂-I를 함규하는 분획물(182-253)들을 모아 조작하여 조제의 LL--E33288α₁-I와 α₂-I의 혼합물 약 4.2g을 얻었다.

두개의 컬럼으로부터 LL-E33288β₂-I와 β₁-I를 함유하는 분획물(254-272)들을 모아 조작하여 조제의 LL-E33288β₂-I와 β₂-I의 혼합물 약 1.2g을수득했다.

2개의 컬럼으로부터 LL-E33288γ₁-I를 함유하는 분획물(273-302)들을 모아 조작하여 30%순도의 LL-E33288γ₁-I 약 1.9g을 수득했다.

2개의 컬럼으로부터 LL-E33288δ₁-I를 함유하는 분획물(303-340)들을 모아 조작하여 부분정제된 LL-E33288δ₁-I약 1.3g을 수득했다.

[실시예 9]

LL- E33288γ₁-I의 정제

실시예 8로부터 얻은 30% 순도의 LL-E33288γ₁-I 약 900mg을 초산에틸 : 디클로로메탄 : 에탄올(2 :2 : 1)로 평형으로 한2.5×120cm세파덱스 LH-20컬럼상에서 1ml/분의 유속으로 크로마토그라피한 후 분획물을 12m1씩 수거했다. 분획물을 검정하고 상기한 바와같이 TLC로 분석하고 LL-E33288γ₁-I (분획물24-33)을 함유하는 것들을 모아 조작하여 64%순도의 LL-E33288γ₁-I 428mg을 수득했다.

상기한 샘플 22mg을 아세토니트릴 : 0.2M 수성초산암모늄(55 : 45)로 평형으로 한 0.8×24 cm 세프랄라이트 C₁₈(35-60um, Analytichem)컬럴상에서 2m1/분의 유속으로 크로마토그라피하여 분획을 12m1씩 수거했다. 분획물을 검정하고 상기한 바와 같이 TLC로 분석하여 순수한 LL-E33288γ₁-I를 함유하는 것들을 모아 조작하여 순수한 LL-E33288γ₁-I 7.7mg을 수득했다

[실시예 10]

LL-E33288β₁-I 및 β₂-I의 정제

실시예 8로부터 얻은 LL-E33288β₂-I과 β₁-I의 조제의 혼합물 약 600mg을 초산에틸 : 디클로로메탄 :에탄올 (2:2:1)로 평형으로 한 2.5×120cm 세파덱스 LH-20컬럼상에서 1ml/분의 유속하에 크로마토그라피하여 분획물을 12m1씩 모았다. 분획물을 검정하고 상기한 바와 같이 TLC로 분석하여 LL-E33288β₂-I 과 LL-E33288β₁-I를 함유하는 것들(분획물 23-31)을 모아 조작하여 부분정제된 LL-E33288 β₂-I 과 β₁-I의 혼합물 81mg을 수득했다.

상기한 샘플을 헥산 : 디클로로메탄 :에탄올(3:1:1)로 평형으로한 1.5×90cm세파덱스 LH-20 컬럼상에서 0.8ml/분의 유속하에 크로마토그라피하여 분획물을 12ml씩 모았다. 분획물들을 검정하고 상기한 바와같이 TLC로 분석하여 LL-E33288β₂-I(분획물 17-30) 및 LL-E33288β₁-I(분획물 31-38)을 함유하는 것들을 각기 모은 후 조작하여 부분정제된 LL-E33288β₂-I 31mg 과 80%순도의 LL-E33288β₁-I20mg을 수득했다.

Claims

미생물 마이크로모노스포라 에키노스포라 아종 칼리켄시스 NRRL 15839 (Micromonospora echinospora ssp.Calichensis) 또는 NRRL 15975를 포함하는 그의 돌연변이 균주를 동화성 탄소, 질소, 브롬 및 무기염 공급원을 함유하는 액체 배지 중에서 실질적인 항생제활성이 상기 배지에 부여될때까지 호기성 발효를 시킨후 그로부터 항생제를 회수하는 것으로 구성된, 항생제 LL-E33288α₁-Br ; LL-E33288α₂-Br ; LL-E33288α₃-Br ; LL-E33288α₄-Br ; LL-E33288β₁-Br ; LL-E33288 β₂-Br ; 및 LL-E33288γ₁-Br을 제조하는 방법.
미생물 마이크로모노스포라 에키노스포라 아종 칼리켄시스 NRRL 15839 또는 NRRL 15975를 포함하는 그의 돌연변이균주의 생육 배양물로 접종된 동화성 탄소, 질소, 브롬 및 무기염 공급원을 함유하는 액체 배지를 호기성 발효시키고; 상기 발효 배양물을 약 24-32℃온도에서 약 90-200시간 유지시킨 후 ; 매시(mash)를 수확하고 ; 항생제를 추출하는 것으로 구성된 항생제 LL-E33288α₁-Br ; LL-E33288α₂-Br ; LL-E33288α₃-Br ; LL-E33288α₄-Br ; LL-E33288β₁-Br ; LL-E33288 β₂-Br ; 및 LL-E33288γ₁-Br을 제조하는 방법.
미생물 마이크로모노스포라 에키노스포라 아종 칼리켄시스 NRRL 15839 또는 NRRL 15975를 포함하는 그의 돌연변이균주를 동화성 탄소, 질소, 요드 및 무기염의 공급원들을 함유하는 액체 배지중에서, 실질적인항생제 활성이 상기 배지에 부여될때까지 호기성 발효를 시킨후 그로부터 항생제를 회수 하는 것으로 구성된, 항생제 LL-E33288α₁-I ; LL-E33288α₂-I ; LL-E33288α₃-I ; LL-E33288β₁-I ; LL-E33288β₂-1 , LL-E33288γ₁-I ; 및 LL-E33288δ₁-I를 제조하는 방법.
미생물 마이크로모노스포라 에키노스포라 아종 칼리켄시스 NRRL 15839 또는 NRRL15975를 포함하는 그의 돌연변이균주의 생육 배양물로 접종된 동화성 탄소, 질소, 요드 및 무기염 공급원을 함유하는 액체배지를 호기성 발효시킨 후 상기 발효배양물을 약 24-32℃온도에서 약 90-200시간 유지시키고 ; 매시를 수확하고 ; 항생제를 추출하는 것으로 구성된 : 항생제 LL-E33288α₁-I ; LL-E33288α₂-I ; LL-E33288α₃-I ; LL-E33288β₁-I ; LL-E33288β₂-I : LL-E33288γ₁-I ; LL-E33288δ₁-I를 제조하는 방법.
a)-j)로 나타내어지는 화합물 LL-E33288β₁-Br : a)대략적인 원소 분석치 : C48.6 : H5.6 : N2.9 :S9.1 : 및 Br 5.5 ; b) 융점 : 146-150℃(분해) ; c) 비선광도 : [α]_D ²⁶=-49±10° (0.1%에탄올) ; d)자외선 흡수 스펙트럼 : 제1도에 나타난 바와 같음 ; e)적외선 흡수 스펙트럼 : 제2도에 나타난 바와 같음 ;f) 양성자 자기 공명 스펙트럼 : 제3도에 나타난 바와 같음 ; g) C-13자기 공명 스펙트럼 : 제4도에 나타난 바와 같고, 유익한 피이크는 하기에 기재된 바와 같음 :

17.60(q); 17.64(q); 18.9(q); 19.7(q);

22.4(q); 22.8(q); 23.5(q); 34.3(t);

36.9(t); 39.2(t/d); 47.8(d); 51.7(q);

5.7(q); 54.6(d); 56.3(q); 57.2(q);

57.8(d); 61.0(q/d); 61.7(d); 62.4(t);

66.9(d); 68.4(d); 69.1(d); 69.7(d);

70.2(d); 71.1(d); 71.9(d); 72.1(s);

76.1(d); 81.0(d); 83.3(s); 88.2(s);

97.4(d); 99.7(d); 100.8(s); 102.5(d);

115.1(s); 123.4(d); 124.4(d); 126.5(d);

130.2(s); 130.8(s); 144.6(s); 149.3(s);

149.5(s); 191.7(s); 192.4(s); 및

h) 실리카겔 판상의 TLC에 의한 지시된 용매계에서의 하기 i)-iii)의 R_f치 : i) 0.1M 수성인산이 수소칼륨으로 포화된 초산에틸에서, R_f=0.24 ; ii)0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸중 3% 이소프로파놀에서, R_f=0.35 ; iii)초산에틸 : 메탄올(95 : 5)에서, R_f=O.36 ; i) 분자량 : 79Br/81Br에서 각기1333/1335 ; j) 분자식 : C₅₄H₈₄N₃O₂₂S₄Br.
하기 a)-g)로 나타내어지는 화합물 LL-E33288γ₁-Br : a)자외선 흡수 스펙트럼 :제5도에 나타난 바와 같음 ; b) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제6도에 나타난 바와 같음 ; c) 양성자 자기 공명 스펙트럼 :제7도에 나타난 바와 같음 d) 실리카겔 판상의 TLC에 의한 지시된 용매계에서의 하기 i)-iii)의 R_f치 : i)0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸에서, R_f=0.18 ; ii)0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸중 3%이소프로파놀에서, R_f=0.28 ; iii)초산에틸 : 메탄올(95 : 5)에서, R_f=0.27 ; e) C₁₃자기공명 스펙트럼 : 제8도에 나타난 바와 같고, 유익한 피크를 하기에 기재함 :

14.4 17.6 17.9 19.0

19.7 - 22.8 -

- 34.0 37.6 39.5

42.1 - 51.6 52.7

54.1 56.3 57.3 -

59.3 61.1 61.8 61.9

67.2 68.18 68.23 69.7

70.1 70.8 71.1 71.7

71.8 76.1 - 81.0

82.9 88.4 - 97.8

100.0 100.2 101.3 103.0

115.3 123.0 124.9 126.9

130.4 131.1 131.8 138.0

144.7 - 149.5 149.6

155.6 192.5 192.9

f) 분자식 : C₅₃H₈₂N₃O₂₂S₄Br ; 및 9) 분자량 : 79Br/81Br에서 각기 1319/1321.
하기 a)-g)로 나타내어지는 화합물 LL-E33288β₁-I : a) 실리카겔 판상의 TLC에 의한 지시된 용매계에서의 하기 i)-iii)의 R_f치 : i) 0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸에서, R_f=0.24 ; ii)0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸중 3% 이소프로파놀에서, R_f=0.35 ; 및 iii)초산에틸 : 메탄올(95:5)에서, R_f=0.36 ; b)자외선 흡수 스펙트럼 : 제 11도에 나타난 바와같음 ; c) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제 12도에 나타난 바와같음;d) 양성자 자기 공명 스펙트럼 : 제13도에 나타난 바와 같음 ; e) C₁₃자기 공명 스펙트럼 : 제14도에 나타난 바와같고, 유익한 피크들을 하기에 기재했음 :

- 17.5 17.6 18.9

- 22.4 22.8 23.4

25.4 34.3 36.9 39.2

- 47.9 51.6 52.8

54.8 56.3 57.2 57.9

60.9 61.6 62.2

67.0 68.4 68.4 69.1

69.6 70.4 71.1 71.8

72.2 76.2 - 80.8

83.3 88.1 93.6 97.4

99.6 99.6 - 102.6

112.4 123.4 124.4 126.4

- - 133.4 -

- - - -

- 192.3 192.6 -

f) 분자식 : C₅₄H₈₄N₃O₂₂S₄I ; 및 g) 분자량 : 1381.
하기 a)-i)로 나타내어지는 화합물 LL-E33288γ₁-I : a) 실리카켈 판상의 TLC에 의한 지시된 용매계에서의 하기 i)-iii)의 R_f치 ; i) 0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸에서, R_f=0.18 ; ii)0.1M 수성인산이수소칼륨으로 포화된 초산에틸중 3% 이소프로파놀에서, R_f=0 28 ; 및 iii) 초산에틸 : 메탄올(95 : 5)에서, Rf=0.27 ; b)오직 다음 성분들만을 함유함 ; C,H,N,O,S,I; c) 대략적인 원소분석치 , C 48.8 ; H5.4 ; N2.8 ; S9.0 및 I9.2 ; d) 분자량 1367 ; e) 분자식 : C₅₃H₈₂N₃O₂₂S₄I ; f) 자외선흡수 스펙트럼 :제15도에 나타난 바와 같음 ; g) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제16도에 나타난 바와 같음 ; h) 양성자 자기 공명 스펙트럼 : 제17도에 나타난 바와 같음 ; i) C₁₃자기공명 스펙트럼 제18도에 나타난 바와 같고, 유익한 피크는 하기 기재된 바와같음 :

14.5 (q) 17.6(q) 17.6(q) 18.9(q)

- - 22.8(q) -

25.4(q) 34.1(t) 37.0(t) 39.1(t)

42.3(t/s) - 51.5(d) 52.8(q)

54.8(t) 56.3(q) 57.2(q) -

60.4(d) 60.9(q) 61.3(t) 61.7(q)

67.0(d) 68.4(d) 68.5(d) 69.2(d)

69.7(d) 70.5(d) 71.1(d) 71.8(d)

72.1(s) 75.7(d) 75.8(d) 80.9(d)

82.8(s) 88.1(s) 93.5(s) 97.3(d)

99.6(d) 99.7(d) 100.8(s) 102.6(d)

- 123.4(d) 124.4(d) 126.2(d)

130.2(s) 131.0(s) 133.4(s) 139.1(s)

143.0(s) 145.1 150.6(s) 151.5(s)

154.5 192.0(s) 192.5(s)