DK168388B1 - Forbindelser i antibiotikumkompleks LL-E33288, lægemidler indeholdende disse forbindelser og mikroorganismekultur til brug ved deres fremstilling - Google Patents

Description

i DK 168388 B1

Den foreliggende opfindelse angår komponenter i et hidtil ukendt kompleks af forbindelser med antibakteriel virkning og antitumoraktivitet. De enkelte komponenter i komplekset betegnes LL-E33288/31-Br; LL-E33288/3i-I, LL-5 E33288/?2“Br, LL-E33288j82“ir LL-E33288-r1-Br, 11^33288^-1 og LL-E33288i]_-I. Komponenter med "Br" i navnet er brom-holdige, medens komponenter med "I" i navnet er iodholdige.

De enkelte komponenter er ejendommelige ved det i de kendetegnende dele af de respektive krav 1-7 angivne.

10 Opfindelsen angår endvidere lægemidler til varmblodede dyr til behandling af bakterielle infektioner, til inhibering af tumorvækst og til regression af leukæmi, hvilke lægemidler er ejendommelige ved, at de som aktiv komponent indeholder en effektiv mængde af en af ovennævnte LL-E33288-forbindel-15 ser. Forbindelserne kan f.eks. indgå i fortyndet form som rå koncentrater, som et kompleks af forskellige eller alle komponenter eller i ren form som enkelte komponenter.

Opfindelsen angår endelig en hidtil ukendt mikroorganismekultur til brug ved fremstilling af ovennævnte LL-20 -E33288-forbindelser. Den her omhandlede kultur er en kultur af Mikroorganismen Mikromonospora echinospora, undertype calichensis, NRRL 15839 eller dens mutant NRRL 15975.

De her omhandlede LL-E33288-antibiotika er nært beslægtede forbindelser, hvilket måtte forventes, da de dannes 25 i blanding ved fermentering af den her omhandlede mikroorganismekultur, og det viser sig også ved deres kemiske struktur, som formodes at være den nedenfor viste for de angivne enkeltkomponenter i komplekset.

30 P ? CH,

CHSSS-J / \ Y

TY S Y--CH) H··./' \0CK> °CH| 0¾ 0CHj qH n/ ocHj 35 DK 168388 B1 2 LL-E33288 X R R2 R4 Øl-I I Ri R3 (ch3)2ch ί 1”! I Ri R3 c2H5 5 δχ-Ι I R± R3 CH3

βχ-Br Br Rx R3 (CH3)2CH

tt 2—Br Br Ri R3 C2H5

De 7 antibiotika udvindes som nævnt ved fermentering 10 sammen med yderligere 7 komponenter, som falder uden for opfindelsens rammer, nemlig LL-E33288-a^-Br, LL-E33288-a2-Br, LL-E33288-a3-Br, LL-E33288-a4-Br, LL-E33288-a2-I, LL-E33288-α2-Ι og LL-33288-a3-I, og fås til at begynde med som en blanding, herefter betegnet enten LL-E33288-komp1ekset, 15 LL-E33288-iodkomplekset eller LL-E33288-bromkomplekset. De iodholdige komponenter i LL-E33288-komplekset (nemlig <*1-1, α2-Ι, a3-I, j8i“I, j82-I, t^-I og $i-I) dannes ved fermenteringer, hvor fermenteringsmediet indeholder kilder for uorganisk eller organisk iod, medens de bromholdige komponenter 20 (nemlig o^-Br, a2-Br, a3-Br, a4-Br, β^-Br, Br °9 ^i-Br) kun dannes ved fermenteringer, hvor fermenteringsmediet indeholder kilder for uorganisk eller organisk brom. Forholdet mellem komponenterne i det dannede LL-E33288-kompleks varierer, afhængigt af fermenteringen, og dette gælder for 25 både de brom- og de iodholdige antibiotika. LL-E3328802 0<3 LL-33288TT2 er hovedkomponenterne, der tilsammen udgør ca.

90% af det dannede kompleks. LL-E3 32 880*2 f LL-E33288a2, LL-33288a3, LL-E33288a4-Br, LL-E33288/32 og LL-E3328852“I er de mindre komponenter, der tilsammen udgør ca. 10% af det 30 dannede kompleks.

LL-E33288-Antibiotika ifølge opfindelsen er aktive mod grampositive og gramnegative bakterier. Hver af komponenterne viser sig også at være aktive ved en modifikation af den biokemiske induktionsprøve [jfr. R. Elespuru og M.

35 Yarmolinsky, Environmental Mutagenises 1, 65-78 (1979)], en prøve, der specifikt måler et middels evne til direkte eller indirekte at igangsætte DNA-skade. Ved denne prøve er både 3 DK 168388 B1 LL-E33288j8^-Br og LL-E33288or1-Br aktive i koncentrationer under 1 x 10"6 μg/ml.

Opfindelsen vil blive forklaret i forbindelse med tegningen, på hvilken 5 fig. 1 viser det ultraviolette absorptionsspektrum for 11^33288/^^, fig. 2 viser det infrarøde absorptionsspektrum for LL-E33288^1-Br, fig. 3 viser det protonmagnetiske resonansspektrum 10 for LL-E33288/31-Br, fig. 4 viser det carbon-13-magnetiske resonansspektrum for LL-E33288/3^Br, fig. 5 viser det ultraviolette absorptionsspektrum for LL-E33288-r1-Br, 15 fig. 6 viser det infrarøde absorptionsspektrum for LL-E33288Tr !-Br, fig. 7 viser det protonmagnetiske resonansspektrum for LL-E33288T^-Br, fig. 8 viser det carbon-13-magnetiske resonansspektrum 20 for LL-E33288Tr^-Br, fig. 9 viser det ultraviolette absorptionsspektrum for LL-E33288/3j-I, fig. 10 viser det infrarøde absorptionsspektrum for LL-E33288/0!-!, 25 fig. 11 viser det protonmagnetiske resonansspektrum for LL-E33288/32.-Ir fig. 12 viser det carbon-13-magnetiske resonansspektrum for LL-E3 3 2 88/3^-1, fig. 13 Viser det ultraviolette absorptionsspektrum 30 for LL-E3328872-I, fig. 14 viser det infrarøde absorptionsspektrum for 11^33288-^-1, fig. 15 viser det protonmagnetiske resonansspektrum for LL-E33288'r1-I, og 35 fig. 16 viser det carbon-13-magnetiske resonansspek trum for LL-E332887^-I.

DK 168388 Bl 4

Nedenfor beskrives de fysisk-kemiske karakteristika for LL-E33288j31-Br og LL-E33288'r1-Br.

LL-E33288j31-Br 5 - LL-E33288/31-Br har (a) en omtrentlig grundstofanalyse: C 48,6%, H 5,6%, N 2,9%, S 9,1% og Br 5,5%, (b) et smeltepunkt på 146-150°C (dekomponering), 10 (c) en specifik rotation [a]2® = -49°±10° (0,1%, ethanol), (d) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig. 1 på tegningen, (e) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig.

15 2 på tegningen, (f) et protonmagnetisk resonansspektrum som vist i fig. 3 på tegningen, (g) et carbon-13-magnetisk resonansspektrum som vist i fig. 4 på tegningen med signifikante spidser ved: 20 17,60(q) ; 17,64(q); 18,9(q); 19,7(q); 22,4(q); 22,8(q); 23,5(q); 34,3(t); 36,9 (t) ; 39,2 (t/d) ? 47,8(d); 51,7(q); 52,7(q) ; 54,6(d); 56,3(q); 57,2(q); 57,8(d); 61,0(q/d) ; 61,7(d); 62,4(t); 25 66,9(d); 68,4(d); 69,1(d); 69,7(d); 70,2(d); 71,1(d); 71,9(d); 72,l(s); 76,1(d); 81,0(d); 83,3(s); 88,2(e); 97,4(d); 99,7(d); 100,8 (s); 102,5(d); 115,l(s); 123,4(d); 124,4(d); 126,5(d); 30 130,2(s) ; 130,8(s); 144,6(s); 149,3(s); 149,5 (s); 191,7 (s); 192,4 (s); (h) følgende Rf-værdier i de anførte opløsningsmiddelsystemer ved TLC på silicagel-ark: (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt 35 kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,24, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, 5 DK 168388 B1

Rf = 0,35, og (iii) ethylacetat/methanol = 95:5, Rf = 0,36, (i) en molekylvægt på 1333/1335 for hhv. 79Br og slBr, 5 (j) et indhold af udelukkende følgende grundstoffer: C, Η, N, 0, S og Br.

LL-E33288'r1-Br 10 LL-E33288'T1-Br har (a) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig. 5 på tegningen, (b) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig.

6 på tegningen, 15 (c) et protonmagnetisk resonansspektrum som vist i fig. 7 på tegningen, (d) følgende Rf-værdier i de anførte opløsningsmiddelsystemer ved TLC på silicagel-ark: (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt 20 kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,18, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat,

Rf = 0,28, og (iii) ethylacetat/methanol = 95:5, Rf = 0,27, 25 (e) et carbon-13-magnetisk resonanspektrum som vist i fig. 8 på tegningen med signifikante spidser ved: 14,4 17,6 17,9 19,0 19,7 - 22,8 34,0 37,6 39,5 30 42,1 - 51,6 52,7 54.1 56,3 57,3 59,3 61,1 61,8 61,9 67.2 68,18 68,23 69,7 70,1 70,8 71,1 71,7 35 71,8 76,1 - 81,0 82,9 88,4 - 97,8 100,0 100,2 101,3 103,0 DK 168388 B1 6 115.3 123,0 124,9 126,9 130.4 131,1 131,8 138,0 144,7 - 149,5 149,6 155,6 192,5 192,9 5 (f) et indhold af udelukkende følgende grundstoffer: C, Η, N, O, S og Br, (g) en molekylvægt på 1319/1321 for hhv. 79Br og 81Br.

De fysisk-kemiske karakteristika for LL-E33288/3i~I 10 Gg LL-E33288^-1 er beskrevet nedenfor:

LL-E33288/3-L-I

LL-E33288j8f-I har (a) følgende Rf-værdier i de anførte opløsningsmid-15 delsystemer ved TLC på silicagel-ark: (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,24, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, 20 Rf = 0,35, (iii) ethylacetat/methanol = 95:5, Rf = 0,36, (b) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig. 9 på tegningen, (c) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i 25 fig. 10 på tegningen, (d) et protonmagnetisk resonansspektrum som vist i fig. 11 på tegningen, (e) et carbon-13-magnetisk resonanspektrum som vist i fig. 12 på tegningen med signifikante spidser ved: 30 - 17,5 17,6 18,9 22,4 22,8 23,4 25,4 34,3 36,9 39,2 47,9 51,6 52,8 54,8 56,3 57,2 57,9 35 60,9 - 61,6 62,2 67,0 68,4 68,4 69,1 69,6 70,4 71,1 71,8 7 DK 168388 B1 72.2 76,2 - 80,8 83.3 88,1 93,6 97,4 99,6 99,6 - 102,6 112,4 123,4 124,4 126,4 5-- 133,4 192,3 192,6 (f) et indhold af udelukkende følgende grundstoffer: C, Η, N, 0, S og I, og 10 (g) en molekylvægt på 1381.

LL-E33288”r χ-Ι 1^^33288^-1 har 15 (a) følgende Rf-værdier i de anførte opløsningsmid delsystemer ved TLC på silicagel-ark: (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,18, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 20 molært vandig kaliumdihydrogenphosphat,

Rf = 0,28, (iii) ethylacetat/methanol = 95:5, Rf = 0,27, (b) et indhold af udelukkende følgende grundstoffer: C, H, N, O, S og I, 25 (c) følgende omtrentlige grundstofanalyse: C 48,8%, H 5,4%, N 2,8%, S 9,0% og I 9,2%, (d) en molekylvægt på 1367, (e) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig. 13 på tegningen, 30 (f) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig. 14 på tegningen, (g) et protonmagnetisk resonansspektrum som vist i fig. 15 på tegningen, (h) et carbon-13-magnetisk resonansspektrum som 35 vist i fig. 16 på tegningen med signifikante spidser ved: 14,5(q) 17,6(q) 17,6(q) 18,9(q) 22,8(q) 8 DK 168388 B1 25,4(q) 34,l(t) 37f0(t) 39,l(t) 42,3(t/s) - 51,5(d) 52,8(q) 54,8(t) 56,3(q) 57,2(q) 60,4(d) 60,9(q) 61,3(t) 61,7(q) 5 67,0(d) 68,4(d) 68,5(d) 69,2(d) 69,7(d) 70,5(d) 71,1(d) 71,8(d) 72,1 (s) 75,7(d) 75,8(d) 80,9(d) 82,8(s) 88,l(s) 93,5(s) 97,3(d) 99,6(d) 99,7(d) 100,8(s) 102,6(d) 10 - 123,4(d) 124,4(d) 126,2(d) 130,2(s) 131,0(s) 133,4(s) 139,l(s) 143,0(s) 145,1 150,6(s) 151,5(s) 154,5 192,0(s) 192,5(s).

15 I ovenstående fysisk-kemiske karakteristika er ind holdet af grundstoffer bestemt ved ESCA (elektronspektroskopi for kemisk analyse), det ultraviolette absorptionsspektrum er optaget i de angivne opløsningsmidler, det infrarøde absorptionsspektrum er fra KBr-skive, det protonmagnetiske 20 resonansspektrum er optaget i CDC13 ved 300 MHz, og det carbon-13-magnetiske resonansspektrum (ppm fra TMS) er optaget i CDCI3 ved 75,43 MHz.

LL-E33288-komponenterne adskilles og identificeres bedst ved højtydende væskechromatografi (HPLC) og ved tyndt-25 lagschromatografi (TLC). Det er vanskeligt, men dog ikke umuligt, at adskille de tilsvarende ioderede og bromerede komponenter ved HPLC, men de kan ikke skelnes ved TLC.

Ved den foretrukne analytiske adskillelse af LL-E33299-Br-komponenterne ved hjælp af HPLC anvendes 30 følgende betingelser:

Kolonne: "Separalyt C^g 5 m", 4,6 mm x 25 cm (Analytichem International). Opløsningsm.: Acetonitril: 0,2 molær vandigt am moniumacetat (60:40) .

35 Strømningsh.: 1,5 ml/minut

Detektor: Dobbelt bølgelængde UV ved 254 nm og 280 nm.

Følsomhed: 0-0,02 A.U.F.S.

o 9 DK 168388 B1 I tabel la er anført de tilnærmelsesvise retentionstider og voluminer af LL-E332883j-Br, LL-E33288£J2-Br og LL-E33288v1-Br på disse betingelser.

5 Tabel IA

LL-E33288- Retentionstid Retentions- komponenter_(minutter)_volumen (ml) ^-Br 5/7 8/6 32-Br 7/1 10/7 10 Ύ j~Br 4,3 6,5

Den foretrukne analytiske HPLC-adskillelse af de iodholdige LL-E33288-komponenter sker ved følgende betingelser: 15 Kolonne: "NOVA-PAK Radial-Pak"-patron med "RCM-100" radialt kompressionsmodul (Millipore, Waters Chromatography Division).

*

Opløsningsm.: Acetonitril: 0,3 molær vandigt am- 20 moniumacetat (50:50).

Strømningsh.: 1,2 ml/minut

Detektor: Dobbelt bølgelængde-UV ved 254 nm og 280 nm.

Følsomhed: 0-0,02 A.U.F.S.

25 I tabel IB anføres de omtrentlige iretentionstider og voluminer for LL-E33288/J-L-I, LL-E33288j82-I, 11^33288^-I og LL-E332885^-I ved disse betingelser.

Tabel IB 30 LL-E33288 Retentionstid Retentionskomponenter (minutter) volumen (ml) Øl-I 4,4 5,3 35 /?2-I 5,0 6,0 τ^-Ι 3,6 4,3 S-L-I 2,6 3,1 o 10 DK 168388 B1 LL-E33288-komponenterne adskilles og identificeres ved hjælp af følgende TLC-systen: Ådsorbans: Silicagel 60 F254 forudovertrukne alumi niumark, 0,2 mm lagtykkelse, EM-reagenser.

5 Påvisning: Synliggjort ved undertrykkende virkning under kortbølget UV-lampe (254 nm) og bioautografi med Bacillus subtilis eller den modificerede, biokemiske induktions-10 prøve.

Opløsningsmiddel- I. Ethylacetat mættet med 0,1 molær systemer: vandigt kaliumdihydrogenphosphat.

II. 3% isopropylalkohol i ethylacetat 15 mættet med 0,1 molær vandigt ka liumdihydrogenphosphat .

III. Ethylacetat/methanol = 95:5.

I tabel II angives de omtrentlige R^-værdier 20 for LL-E33288-komponenter i disse tre systemer

Tabel II

Rf værdi 25 ___ LL-E33288 Opløsm. Opløsm. Opløsm.

komponenter System I System II System III

β2-Βτ,β2-τ 0,32 0,41 0,45 30 β^Βχ,β^Ι 0,24 0,35 0,36 ί Br, τ I 0,18 0,28 0,27 δχ-Ι 0,11 0,19

De nye antitumor- og antibakterielle midler betegnet LL-E33288j81-Br, LL-33288jS2-Br, LL-E332887^Br, LL-E33288/3-1-I, LL-E33288j32-I, ϋ-Ε33288Ύΐ-Ι og 1.1^33288^-1 dannes 35 11 DK 168388 B1 sammen med α-komponenter under dyrkning under styrede betingelser af en ny stamme af Micromonospora echinospora, undertype calichensis. Denne mikroorganisme er deponeret hos Culture Collection of the Medical Research Division, American 5 Cyanamid Company, Pearl River, New York, som kultur nr. LL-E33288. En levedygtig kultur af denne nye mikroorganisme er deponeret hos Cultur Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, den 9. august 1984 og er indgået i den permanente 10 samling. Den har ved deponeringen fået tildelt stammebeteg-nelsen NRRL 15839. Deponeringen er i overensstemmelse med bestemmelserne i Budapest-traktaten. Adgang til en sådan kultur med stammebetegnelsen NRRL 15839 skal indrømmes enhver, og alle restriktioner med hensyn til tilgængelighed 15 for offentligheden af en sådan kultur er uigenkaldeligt ophævet.

Kultur LL-E33288 er isoleret ud fra en calicheler-jordprøve fra Texas.

Den generiske tilskrivning af stammen NRRL 15839 20 til arten Mikromonospora bekræftes morfologisk og kemisk.

Stammen producerer monosporer, enten enkeltvis eller i masser på de vegetative hyfer. Der oberserveres ingen lufthyfer. Elektronmikroskopisk undersøgelse viser, at sporerne er vortede. Helcelleanalyse viser, at stammen indeholder meso-25 isomeren af diaminopimelinsyre (DAP). 3-OH-Derivatet af DAP forekommer i store (overvejende) mængder. Yderligere fremviser stammen tilstedeværelse af xylose plus spor af arabi-nose i sine helcellesukkerhydrolysater (helcellesukkermønster af type D).

30 Ud fra makromorfologiske og fysiologiske under søgelser konkluderes det, at NRRL 15839 kan betragtes som en underart af M. echinospora (den ligger nærmest M. echinospora, undertype pallida). Data om NRRL 15839's morfologi er anført i tabellerne A og B. Fysiologiske data er anført 35 i tabellerne C og D.

DK 168388 B1

O

12

Tabel A

NRRL 15839's makromorfologi (farver efter NBS-ISCC) ISP-agar Opløselige medium Sporer_Vegetativt mycelium pigmenter 5 Gær/malt - Mørk orangegul (72) (ISP 2)

Havremel - Farveløs —> bleg o- (ISP 3) rangegul (73)

Uorg. sal- Let kant af Mørk orangegul (72) Lysebrunlig 10 te/stivel. sorte spo- til lys gulbrun (76) (ISP 4) rer

Glycerol/ - Bleg orangegul (73) asparagin —> farveløs (ISP 5) 15

Tabel B

NRRL 15839's makromorfologi på forskellige agarmedier anvendt til Actinomycet-vækst (28°C, 2 uger)_

Agarmedium NRRL 15839 20 Pablum Beige veg., en smule sorte sporer.

Intet opl. pigment.

Czapeks gær Beige veg., ingen sporer.

Intet opl. pigment.

Czapek's Beige veg., en smule sorte sporei 25 - - Intet opl. pigment.

Gærdextrose Gyldenbrun veg., moderat mængde sor-ge sporer. En smule mørkt pigment. Næringsmedium Farveløs til gyldenbrun veg., en smule sorte sporer. Intet 30 opl. pigment.

Næringsmedium/ Farveløs til lysbeige veg., glycerol ingen sorte sporer.

Intet opl. pigment.

35 o 13 DK 168388 B1

Tabel B (forts.)

Agarmedium NRRL 15839

Bennett's dextrin Farveløs til beige veg. , en smule sorte sporer.

5 En smule rosabrunt pigment.

Glucose/asparagin Farveløs til lys orange- beige veg.

Ingen sporer.

Intet opl. pigment 1Q veg. = vegetative hyfer.

Tabel C

Carbonhydratudnyttelse af NRRL 15839 15 Arabinose +

Cellulose Fructose +

Glucose + 20

Inositol

Mannitol

Raffinose +

Rhamnose + 25

Saccharose +

Xylose + 30 35

O

14 DK 168388 B1

Tabel D

NRRL· 15839's fysiologiske reaktioner

Hydrolyse af

Casein + 5 Xanthin

Hypoxanthin Tyrosin +

Adenin

Gelatine +

Kart.stivelse +

Esculin + 10 Produktion af

Nitrat

Reductase +

Phosphatase W

Urease ις Vækst på

Salicin 51 NaCl Lysozym

Decarboxylering af

Acetat +

Benzoat 20 Citrat

Lactat

Malat

Mucat

Oxalat

Propionat +

Pyruvat + 25 Succinat

Tartrat

Syre ud fra Adonitol

Arabinose +

Cellobiose +

Dextrin + 30 Dulcitol

Erythritol Fructose +

Galactose V

Glucose +

Glycerol

Inositol 35 Lactose

Maltose +

Mannitol o DK 168388 B1 is

Tabel D (forts.)

Syre ud fra (forts.)

Mannose + α-methyl-D--glucosid 5 ·.- Melibiose

Raffinose +

Rhamnose +

Salicin +

Sorbitol

Saccharose +

Trehalose +

Xylose + 10 β-Methyl D-xylosidi .Vækst ved ΠΓ° 42° + 45° + 15 + = positiv - = negativ ; V = variabel; W = svag 20 Derivatisering af mutant LL-E33288-R66/ NRRL 15975 I et forsøg på at forbedre fermenteringsudbytter udstryges den oprindelige kultur LL-E33288 (NRRL 15839), og der isoleres 50 enkeltkolonier. Disse betegnes NS1-NS50 (NS = naturlig selektion).

25 Fermentering af disse isolater viser, at de med moderat sporedannelse i reglen er bedre producenter af LL-E33288-kompleks. Som repræsentativt for denne gruppe udvælges isolat NS6.

Ved hjælp af isolat NS6 som udgangskultur frem-30 stilles sporesuspensioner, som udsættes for forskellige mutagener. Enkelte kolonier isoleres ud fra en nitroso-guanidinbehandling, men ingen viser sig at være signifikant bedre producenter af LL-E33288-komplekset. Ud fra en efterfølgende serie udsættelser for ultraviolet be-35 stråling fås enkelte kolonier, hvorudfra isolat UV 610 udvælges som højtydende mutant. Derpå udstryges isolat 16 DK 168388 B1 UV 610, og der fås underisolater 1-7. Underisolat UV610(3) udvælges til yderligere oparbejdning.

På grund af LL-E33288-kompleksets stærkt potente, antibakterielle og anti-neoplastiske natur er det muligt, 5 at når først en begrænset koncentration af dette antibiotikum er biosyntetiseret i fermenteringen, kan denne blive toksisk/ inhiberende over for den producerende kultur. Derfor gøres der forsøg på at opnå isolater, der er resistente over for LL-E33288-antibiotikumkompleks.

10 Vegetativ vækst ud fra isolat UV 610(3) fremstilles som til fermentering og anvendes til at inokulere en kolbe med et medium bestående af pepton, dextrose, melasse og vand. Mediet suppleres med LL-E33288/3-j_-Br i en koncentration på 8 μg/ml. Der foretages et antal udstrygninger fra denne 15 kolbe, og der fås en resistent population på den 7. dag.

Der isoleres i alt 97 kolonier (R1-R97). Isolat R66 udvælges som en potentielt forbedret producent af LL-E33288jS1-Br.

Forløbet er gengivet skematisk nedenfor.

20 25 30 35

O

17 DK 168388 B1 E33288 (vild type)

\U

NS6 (naturlig selektion) 5 —NTG [NG1-NG120)(Nitrosoguanidin) —UV [UV1-UV200] (Ultraviolet) 10 —UV [UV201-UV400]{Ultraviolet) —UV [UV401-UV702](Ultraviolet) i UV610(3) ( underisolat 3) 20 (Ri to R97](Resistente kolonier) R66 25 Mutanten R66 er deponeret i Culture Collection of the Medical Research Division, American Cyanamid Company,

Pearl River, New York, som kultur nr. LL-E33288 R66. En levedygtig kultur af denne nye mikroorganisme er deponeret hos Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research 30 Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, den 6. juni 1985, og indgår i den permanente samling. Den har fået tildelt stammebetegnelsen NRRL 15975. Deponeringen er i overensstemmelse med bestemmelserne i Budapest-trak-taten. Adgang til kulturen med stammebetegnelsen NRRL 15975 35 under behandlingen af den foreliggende ansøgning skal tilstås enhver, og alle begrænsninger vedrørende offentlighedens adgang til denne kultur er uigenkaldeligt ophævet.

O

18 DK 168388 B1

Morfologisk danner NRRL 15975 færre sporer end NRRL 15839. En sammenligning mellem NRRL 15975 og NRRL 15839 findes i tabel DD.

5 Tabel DD

Morfologisk sammenligning mellem NRRL 15839 og NRRL 15975

Agarmedium_NRRL 15839_NRRL 15975_

Bennett's dextrin V1 Beige— gylderibrune Beige-gyldenbrune

Sp Sorte, rigelige Ingen 10 SS Intet Intet

Czapek's V Orange-gyldenbr. Orange-gyldenbrune

Sp Sorte, spor Ingen SS Intet Intet

Czapek's gærekstr. V Orange-gylden- Orange-gyldenbrune, 15 brune, flade, snoede

Sp Sorte, spor Ingen SS Intet Let gullig

Kartoffeldextrose V Meget ringe Meget ringe vækst vækst 20 „

Sp Ingen Ingen SS Intet Intet Næringsmedium/gly- V Gyldenbrune Gyldenbrune cerol Sp Sorte, sparsomme Sorte, sparsomme SS Intet Let brunligt 25 Næringsvæske V Gyldenbrune Gyldenbrune

Sp Sort, rimelige ingen SS Intet Intet 1 = V = vegetative hvfer 30

Sp = sporer SS = opløseligt pigment 35 19 DK 168388 B1

Kemisk udviser både NRRL 15839 og NRRL 15975 de samme helcelle-sukkermønstre (type D: xylose og spor af arabinose). Helcelle-diaminopimelinsyreanalysen viser, at NRRL 15975 ikke danner meso-isomeren, men kun 3-hydroxy-5 derivatet (NRRL 15839 indeholder begge forbindelser). Dette ændrer ikke den kemotaksonomiske betegnelse.

Fysiologiske prøver viser, at NRRL 15839 og NRRL 15975 kun afviger med hensyn til to fysiologiske reaktioner (jf. tabel D). NRRL 15975 er negativ for nitratreduktase og 10 positiv for udnyttelse af lactat. NRRL 15839 er svagt positiv over for begge, men er nu negativ efter at have været på skråagar i nogle få måneder. Disse karakterer bør således anses for variable i denne taksonomiske gruppe.

Det skal bemærkes, at produktion af de her om-15 handlede antitumor- og antibakterielle midler ikke er begrænset til disse særlige organismer eller til organismer, der fuldt ud svarer til ovenstående mikroskopi-vækst-karakteristika, som kun anføres som illustrerende. Mutanter fremstillet ud fra disse organismer ved hjælp af 20 forskellige midler, f.eks. udsættelse for røntgenstråling, ultraviolet stråling, Ν'-methyl-Ν'-nitro-N-nitroso-guanidin og actinofager, kan muligvis også fremstille midlerne.

LL-E33288-komponenternes antibakterielle in-vitro-25 aktivitet bestemmes over for et spektrum af gram-positive og gram-negative bakterier ved hjælp af en agarfortyndingsmetode. Der hældes Mueller-Hinton-agar indeholdende tofoldigt aftagende antibiotika-koncentrationer i petriskåle. Agaroverfladerne inokuleres med 1-5 x 10^ kolonidannende bak-30 terieenheder ved hjælp af "steers” replikeringsapparatet.

Den laveste koncentration af LL-E33288-komponent, som in-hiberer vækst af en bakteriestamme efter ca. 18 timers inkubation ved ca. 358C, noteres som den minimale inhiberende koncentration (MIC) for den stamme. Resultaterne findes i 35 tabel III.

DK 168388 B1 20

I—I

H i mmuiininoOLntNtntninc'viO'ivo

S ι-M CMCMCMCMCMmmcNrtCMCNCMrtrtO

\ ivr Λϋ,ινι^κ nnivN

tr ooooooooooooooo 3 __ V _ V““ - «· c o

-P -H

CU +> P

-P to pQ ommooooomo o u"> co -H pi incMCMinmintnmcvjm m cm cm w ^ ,jj f-H #v *%,

•Η β?“ OOOOOOOOOOr-HOOOO

•P cu Μ Ό cd I O-—-------

0 M U

-P fl)'

-H TS

> c I”4 1 m i ommoooinmo oommtn g μ i—i incMCMintnmcscstn m m cm cm cm ΙΓ_Ι Λ» CQ. ^ A ^ f* ^ Λ A Λ *. A λ

_η OOOOOOOOOr-HOOOOO

<υ ίί Η Λ Η C___________ <ΰ ·Η Η 5-1 ιΗ <ϋ cd μ,

Mjj § cQ m cm cm in cm m cm cm m cm cm id cm Π 'tl C* CMrti—ICMrtincMr-lrtU~iCNi—IrtOi—1 H q 5 CQ ooooooooooooooo

CD -P

rQ a - — td cd ..........

n m s £

C 2 CM

P i—I '•f CM r-> C-J cr> 2 i-MIOMin <r <r CM λ CO CO M OO C1 C i i-η m i r-v i <j· i cu i—i i <r i—i i <r

O rt CM <Γ Ρ-ι MT I CO 2 I cn CO ICO I

S oo cn coScocnoo'-'coooieoooon g O'-'OO oo cm oo oo 0 CJ · CJ U CJ CJ u~, u CO o M SoE-SQEOiSooS 020 1 θ2<υ<οι-Ηυ^^ιο^·--ιθΜ 00 00 CM Q) mg' n co Η ·γμ co

I P <U <U

PI co co 0) C ·π CO ·η μ3 00 1-t CO II) «1 ·Η t 3 t P C U CO C ·η P co Ό ο o co o <u c p p c · · •<t E=OPO<dc00)3Q.a.

I-M 3 ι-t CU CO tt 3 > d co n Ο Z Z CU CJ CO O 0 μ p ·Η μ

O C U OCOOCWU

aj p p ε ο CO CU co ¢0 μ 4-1 •it co p E eg t in cj

JZ I—I O i—I CJ 4J CO

CJ rt co CO I—I C a JO

•It QJ -Ω -It CU CU co O

p ·η o o 4J c Ό jo p ; cu ; ; co ; p co co ·η o : <u jz jo cu p:oC>p c CJ CU P μ μ o p *it

CO rt c (U OP ‘It O

w oj ω co So-o < 21 DK 168388 B1 cocooomcnmcocom cvjnn

OOOOOOOOOOOi-hOO

, m ooooooooor^ooo

H i cnCMOOOOOOOOOOOOO

•g- οΊι—lOOOOOOOOOOOOO

X. y- tji ooooooooooooooo _v/l VI VI VI vi VI VI V« V‘ _vl - g 1—I 1—I I—I 1—< ·—· <—1 I—< I—· ^ 1—11 o cocococococococoro cocnn •H ooooooooo O o o

Jj L, OOOOOOOOOCSJOOO

ti PQ oooooooooo^ooo

j_l i loOOOOOOOOOOOOO

I) Η r* Γ Γν Γ r· ^ *· jH ?-i ooooooooooooooo

Q) Π Vl Vi Vi V| V| V| V| V| V| V V| VI

O I

s, - i ____ o _L-—------:

^ I II—<1—II—Il-Hi—I I—IrH

m I mmcocncocococ'-ic'·) cjcocn

Ti 1 ooooooooo £ O o ^'h-4| OOOOOOOOOrHOOO .......

m i I omoooooooooroooo

2 r-tStnCMOOOOOOOOOOOOO

o i OOOOOOOOOOOOOOO

^ I v i VI VI VI VI VI VI VI VI vl VI

Λ U

s i K I ιηιπιηιΛίΛίΛιΛιΛ ιΠ ΙΠ m

+J I inNtNNNNMNNCONNN

ti <5 P i CMOOOOOOOOCOOOO

o S m mooooooooooooo m ‘^j i I mcNOOooooooooooo

w £h r—ί I

‘i! cal OOOOOOOOOOOOOOO

Η Λ I V|V|V|V|V|V|V|V|VI VI VI VI

i—l Φ Λ nJ ^

Pi CLi CO CO CO OO OJ

5* LO I—ICMOVD<rr^COCNCOi-l

s_/ OQ cOOlNCNICslinr—(OJiOCMi-H

(X, I m I I I I I (N I O O

xJ<N CMCMCNCNCNCNCOrHCOCSO

i j: co oo oo oo oo co oo i-h <*· O jj O i CJ o o i Ο-ηΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟί-ιΟ CME-Igcot-IWWWWSHSHOE-; i-tCcnco<c/icocooio<o<A-<

CO

cd S Ό «2 I co e « C co co i-· co o 3 « = r! 60 c <u X) co

p -H uzzzzzz-r* O CO

o 0£ O 3 O- 8 3 M

3 co CD .C0(U<H

p CL CP P .-H

aj co co co 3 ^ CO 3 3 « ^ " u O co 3 Λ CO o υ 3 O co 3

co O o υ o 3 CO

CO O o o o

o o o o O O CD

S r-iz:::: = »-i = 0003

o >, >1 O u u H

ό : x jz u o. o <-> 3 0. G. O O P ·Η OJ CO CO p p o o

CD 4J 4J c -P ,rH CO

d, CO C/3 U W 2 P3

O

22 DK 168388 B1

Visse in-vivo-afprøvningssystemer og protokoller er blevet udviklet af National Cancer Institute til afprøvning af forbindelse for at afgøre, om de er egnede som anti-neoplastiske midler. Disse findes anført i 5 "Cancer Chemotherapy Reports", 3. del, bd. 3 nr. 2 (1972), Geran m.fl. Disse protokoller har etableret standardiserede screeningprøver, som almindeligvis følges inden for afprøvning af antitumor-midler. Af disse systemer er lymfocytisk leukæmi P388, melanotisk melanom B16, 10 L1210-leukæmi og colon 26-adenocarcinom særlig betydningsfulde for den foreliggende opfindelse. Disse neoplasmer anvendes til afprøvning som transplanterbare tumorer hos mus. I reglen tyder signifikant antitumoraktivitet, som ses i disse protokoller ved en procentvis forøgelse af 15 den gennemsnitlige overlevelsestid for behandlede dyr (T) i forhold til kontroldyrene (C), på lignende resultater ved humane leukæmier og faste tumorer.

Lymfocytisk leukæmi-P388-prøve

Dyrene, der anvendes, er BDF^-mus, alle af sam-20 me køn, der vejer mindst 17 g,og alle inden for 3 g vægtinterval. Der er 5 eller 6 mus pr. prøvegruppe. Tumortransplantationen sker ved intraperitoneal indsprøjtning g af 0,5 ml fortyndet ascitesvæske indeholdende 10 celler af lymfocytisk leukæmi P388. LL-E33288-Antibiotika afprøves 25 i P388-systemet både som individuelle 8-^-Br-og γ^-Br-kom-ponenter og som et kompleks af alle komponenter (brom-kompleks) . Prøveforbindelserne indgives intraperitonealt i et volumen på 0,5 ml i 0,2% "Klucel" i normal saltvandsopløsning på dagene 1, 5 og 9 (i forhold til tumorinoku-30 lering) i de anførte doser. Musene vejes, og de overlevende noteres regelmæssigt i 30 dage. Middeloverlevelsestiden og forholdet mellem overlevelsestid for behandlede (T)/kontrol-(C)-dyr beregnes. Den positive kontrolforbindelse er cisplatin, der gives som intraperito- 35 neal injektion i 0,5 ml 0,2% "Klucel" på dagene 1, 5 og 9 i de anførte doser. Resultaterne ses i tabel IV.

O

Tabel IV

Lymfocytisk leukasmi-P388-prøve 23 DK 168388 B1

Dosis Middeloverlev. T/C x 100 5 Forbindelse (mg/kg) (dage) (%) LL-E33288 3.2 16,5 156 1.6 17.5 165 (brom-kompleks) o7 8 18.'5 175 0?4 19' 179 0j2 16.5 156 10

Kontrol - 1076

Positiv kontrol· 170 21,5 203 0,25 15 142 0,06 · 14,5 137 lo ' ) LL-E-332888!-Br 0,4 13 105 0.2 18 145

Ojl 19 153 0,05 17T 5 141 0.025 18 145 20 0.’ 012 14 113 )

Kontrol - 12,4

Positiv kontrol 1T0 25,5 206 25 0,4 19 153 0,06 15 121 LL-E33288vi-Br 0,2 U 113 1 Oli 21 169 0 05 19,5 157 0;025 18 145 30 0,012 14,5 117

Kontrol - 12,4

Positiv kontrol. 1,0 25,5 206 0.4 19 153 35 0106 15 121 DK 168388 Bl 24

Hvis T/C x 100 (%) er 125 eller derover, anses den afprøvede forbindelse for at have signifikant anti-tu-moraktivitet.

5 Melanotisk melanom B16

De dyr, der anvendes, er BDF^-mus, alle af samme køn, der vejer minimum 17 g, og alle inden for 3 g vægtinterval. Der er normalt 6 dyr pr. prøvegruppe. 1 g melanotisk melanom-B16-tumor homogeniseres i 10 ml kold, afbalanceret 10 saltopløsning, og en portion på 0,5 ml homogenisat implan-teres intraperitonealt i hver prøvemus. LL-E33288-Antibiotika afprøves i Bl6-systemet både som de individuelle /J^-Br- og t ^-Br-komponenter og som et kompleks af alle komponenter (bromkompleks). Prøveforbindelserne indgives intraperitonealt 15 på dagene 1-9 (i forhold til tumorinokulering) i forskellige doser. Musene vejes, og de overlevende noteres regelmæssigt i 60 dage. Middeloverlevelsestiden og forholdet mellem overlevelsestid for behandlede (T)/kontrol-(C)-dyr beregnes. De positive kontrolforbindelser er cisplatin eller adriamycin.

20 Resultaterne af denne prøve ses i tabel V. Hvis T/C x 100 (%) er 125 eller derover, anses den afprøvede forbindelse for at have signifikant anti-tumoraktivitet.

25 30 35

Tabel V

Melanotisk melanom Bl6-prøve o 25 DK 168388 B1

Middel-

Dosis overlev. T/C x 100 5 Forbindelse (mg/kg) (flage) ^ LL-E33288 0,8 30 188 i , , , 0.4 29.5 184 (arom-kompleks) Q>2 2η 169 oil 24 150 ) 10

Kontrol ” 1δ

Cisplatin 0,4 25 156 0.2 25 156

Oil 23 144 15 θ',05 21,5' 134 LL-E332888i-Br 0.05 32 168 1 0i025 33,5 176 0.0125 32 168 i 20

Kontrol ~ 19

Adriamycin 0,8 >60 > 316 0,4 >60 ^ 316 25-----~ .

LL-E332887i-Br 0,05 33,5 176 1 0025 30 159 0.0125 37 195 / 30

Kontrol - 19 35 Adriamycin 0,8 >60 > 316 0,4 ^60 >316 o '26 DK 168388 B1

Lymfocytisk leukæmi-L1210-prøve

De dyr, der anvendes, er BDF^-mus, alle af samme køn, der vejer mindst 17 g,og alle inden for 3 g vægtinterval. Der er 6 mus i hver prøvegruppe og 18 i 5 kontrolgrupper. Tumortransplanteringen sker ved intra-peritoneal injektion af 0,5 ml lymfocytisk leukæmi L1210 5 i en koncentration på 10 celler pr. mus. LL-E33288-An-tibotika afprøves i Ll210-systemet både som den enkelte β-^-Br-komponent og som et kompleks af alle komponenter 10 (brom-kompleks). Prøveforbindelserne indgives på dagene 1, 5 og 9 eller dag 1-9 (i forhold til.tumorinoku-lering) i forskellige doser. Musene vejes, og de overlevende noteres regelmæssigt i 30 dage. Middeloverlevelsestiden og forholdet mellem overlevelsestid for be-15 handlede (T)/kontrol(C)-dyr udregnes. Den positive kontrolforbindelse er 1,4-dihydroxy-5,8-bis-[[2-(2-hydroxy-ethylamino)ethyl]amino]anthraquinon-dihydrochlorid eller cisplatin, der gives intraperitonealt i den anførte dosis. Resultaterne ses i tabel VI. Hvis T/C x 100 (%) 20 er 125 eller derover, anses den afprøvede forbindelse for at have signifikant anti-tumor-aktivitet.

25 30 35 DK 168388 Bl

Tabel VI

Lymfocytisk leukæmi-L1210-prøve

O

27

Middel- 5 Dosis overlev. T/C x 100

Forbindelse (mg/kg) (^age) LL-E33288 1,5 29 174 (bromkompleks) 0?8 28r5 171 0,4 22T5 135 0,2 22.5 135 10 J ;

Kontrol - 16γ7 -

Anthraquinon· 1.6 30 180 0,8 30 180 15 0j4 30 180 LL-E33288Bi'Br 0,2 11,3 136 01 11,4 137 0 05 11 133 0,025 11.3 136 20

Kontrol - 8,3

Cisplatin 5 7,5 90 2,5 12 145 1,25 11 133 25 ----

Colon-2 6-Adenocarcinomprøve

De dyr, der anvendes, er CD2F1-hunmus, der vejer mindst 17 g, og alle inden for et vægtinterval på 3 g. Der er 5 eller 6 mus pr. prøvegruppe med tre grupper på 5 eller 30 6 dyr, der anvendes som ubehandlede kontroldyr ved hver prøve. Tumorimplanteringen sker ved intraperitoneal (eller subcutan) injektion af 0,5 ml af en 2%'s vælling af colon 26-tumor i Eagle's MEM-medium indeholdende antibiotika. LL-E33288-Antibiotika afprøves i Colon-26-systemet som et kom-35 pleks (brom-kompleks) af alle komponenter. Prøveforbindelserne indgives intraperitonealt på dagene 1, 5 og 9 (i for 28 DK 168388 B1 hold til tumorimplanteringsdoser). Musene vejes, og dødsfald noteres regelmæssigt i 30 dage. Middeloverlevelsestiderne for behandlede (T)/kontrol-(C)-dyr beregnes. Den positive kontrolforbindelse er cisplatin. Resultaterne ses i tabel 5 VII. Hvis T/C x 100 (%) er 130 eller derover, anses den afprøvede forbindelse at have signifikant anti-tumoraktivi-tet.

Tabel VII

Colon-2 6-adenocarcinomprøve

Middel-

Dosis overlev. T/C x 100

Forbindelse (mg/kg) (^age) 15 LL-E33288 1*5 39.5 212 , - .* 0.'8 32,5 175 (bromkompleks) 345 183 0*2 25.5 137 ^ i

Kontrol - 18,6 20

Positiv. 1 29 156 kontrol 0,5 38,5 207 0,25 37,5 202 25 M5076-Sarcom

Retikulær M5076-cellesarcom formeres som subcutane implantater i C57B2/6-hunmus. Ved prøverne for anti-tumorak-tivitet inokuleres BDFj-mus af begge køn intraperitonealt 30 med 0,5 ml af en 10%'s tumorvælling. LL-E331288-Antibiotika afprøves i M5076-systemet som et kompleks (brom-kompleks) af alle komponenter. Prøveforbindelserne indgives intraperitonealt på dagene 1, 5, 9, 13 og 17 i forhold til tumor-inokulering på dag 0. Middeloverlevelsestiden i dage bestem- 35 mes for hver medicindosis på dag 60, og forholdet mellem overlevelsestid for behandlede (T)/kontrol-(C)-dyr beregnes.

o 29 DK 168388 B1

Resultaterne af denne prøve ses i tabel VIII sammenlignet med de resultater, der opnås med cisplatin. Hvis T/C x 100 (%) er 125 eller derover, anses den afprøvede forbindelse for at have signifikant an-5 ti-tumoraktivitet.

Tabel VIII M5076-sarcom 10 Γ ~l

Middel-

Dosis overlev. τ/C x 100

Forbindelse (mg/kg) (%) (dage) LL-E33288 lf5 50 175 ,,, (bromkompleks); 0,8 50 175 0,4 39,5 139

Kontrol - 28,5

Cisplatin 1 30 105 20 0,5 44,5 156 0,25 45 158 På samme måde afprøves de følgende iod-kompo-25 nenter for anti-neoplås'tisk aktivitet.

30 35

O

Tabel IX

Lymfocytisk leukæmi-388-prøve 30 DK 168388 B1

Dosis tiiddel- , , T/C x 100 5 ·Forbindelse (mg/kg) overlev. (%) ° _' _ (aage) LL-E33288vi-I 0,005 >25,5 >196 (Prove 1) 0,0025 22* 169 1 ; 0,00125 18.5 142 0,0006 18; 138 0,0003 15.5 119 0,00015 15' 115 10 7

Kontrol - 13 " Novan trone^ 22,5 173 (positiv kontrol) 15 LL-E33288 γχ-Ι 0,01 11 100 0,005 18 164 (Prøve 2) 0,0025 22,5 205 0,00125 18,5 168 0,0006 16 145 0,0003 14 127 0,00015 14 · 127 20

Kontrol II

Positiv kontrol "Novantrone/^ 1,6 19 1/3 0.8 16 145 25 _ ‘__ *1,4-dihydroxy-5,8-bis -[ [2- ( 2-hydr oxye thyl amino) ethyl ] amino]anthraquinon-2HCl 30 35 o

Tabel X

Melanotisk ntelanom-B 16-prøve DK 168388 B1 3.1 _ . Middel- D0S1S - T/C x 100 5 Forbindelse (mg/kg) ° θ ________(dage)__ LL-E33288 γχ-Ι 0,0025 26.5 156 0,00125 27' 159 0,0006 42,5 250 0,0003 35,5 209 io 0,00015 3315 197 0,00007 30;5 179

Kontrol

Adriamycin 0.8 48 282 15 0,4 40 235 0,2 34;5 203 20

Tabel XI

Lymfocytisk leukaami-Ll21O-pr0ve . Middel- D0S1S , T/C x 100 25 Forbindelse (mg/kg) overlev- (¾) ___(daae)__ LL-E33288 γχ-Ι 0,01 8 89 0,005 14 156 0,0025 11 122 0,0012 10,5 117 30 0,0006 10 111

Kontrol 9

Positiv· kontrol "Novantrone'® 3,2 15 167 35 1,6 11.5 128 0;8 12' 133 0,4 11 122

O

Tabel XII

Colon-26-adenocarcinom-prøve 32 DK 168388 B1

Middel-

Dosls , T/C x 100 5 . ,, . overlev.

Forbindelse (mg/kg) ________(dage)__ LL-E33288 Yi-I 0.,01 11 59 0,005 25,5 138 0/0025 27 · 146 0/00125 22,5 122 0,0006 23,5 127 10 0,0003 20 108

Or00015 17,5 95 0,00007 17 92

Kontrol - 18 ^ 5 15 Positiv kontrol

Cisplatin 2 15,5 84 1 27,5 149 0^5 23,5 127 20 Almindel ioe fermenterinqsbetinaelser

Dyrkning af Micromonospora echinospora NRRL 15839 eller NRRL 15975 kan ske i en lang række forskellige, flydende dyrkningsmedier. Medier, der kan anvendes til fremstilling af disse nye antibakterielle og anti-tumor-midler, 25 omfatter en assimilerbar carbonkilde, f.eks. stivelse, sukker, melasse eller glycerol; en assimilerbar nitrogenkilde, f.eks. protein, proteinhydrolysat, polypeptider, aminosyrer eller majsstøbevæske; og uorganiske anioner og kationer, f.eks. kalium-, natrium-, ammonium- og calciumsulfat, 30 -carbonat, -phosphat og -chlorid; og kilder for enten brom (natriumbromid) eller iod (kaliumiodid). Sporgrundstoffer, f.eks. bor, molybden og kobber, tilføres som urenheder i andre bestanddele i medierne. Gennemluftning af tanke og kolber sker ved at tvinge steril luft gennem eller ned på 35 overfladen af det fermenterende medium. Yderligere omrøring i tanken sker med mekanisk skovlhjul. Om nødvendigt kan der tilsættes et antiskumningsmiddel, såsom silicone.

O

33 DK 168388 B1

Almen procedure ved isolering og adskillelse af antibiotika LL-E33288 LL-E33288-Antibiotika udvindes fra fermenteringsvæsken ved at ekstrahere den hele mæsk med et or-5 ganisk opløsningsmiddel, såsom ethylacetat eller dichlor-methan. Det antibiotiske kompleks, der er indeholdt i den organiske ekstrakt, renses yderligere ved selektiv fældning ud fra lavere carbonhydrider. Det rå LL-E33288--antibiotika-kompleks, der således opnås, renses yderli-10 gere og adskilles i de individuelle komponenter ved en række søjlechromatografier ved hjælp af silicagel, "Se-phadex"® LH-20"(Pharmacia Fine Chemicals) og C^g-bundet siliciumoxid.

Opfindelsen vil i det følgende blivere nærme-15 re forklaret ved hjælp af eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af podestof

Et typisk medium, der anvendes til at dyrke 20 det primære podestof, fremstilles efter følgende opskrift: OKsekødsekstrakt ca. 0,3%

Trypton ca. 0,5%

Dekstrose ca. 0,5% 25 Dekstrin ^ ca. 2,4%

Calciumcarbonat ca. 0,4% Gærekstrakt ca. 0,5%

Vand op til 100,0% 30 Mediet justeres til pH 7,0 og steriliseres derpå. 100 ml af dette sterile medium i en kolbe inoku-leres med frosset mycelium af kulturen NRRL 15839. Det inokulerede medium anbringes på en roterende ryster og bevæges kraftigt i 48 timer ved 32°C. Dette inkuberede 35

O

34 DK 168388 B1 medium anvendes derpå til at inokulere 10 liter af ovennævnte sterile medium i en 14 liters fermenteringsbeholder. Dette medium inkuberes under omrøring ved 32°C i 48 timer, hvilket giver sekundært podestof. Dette se-5 kundære podestof anvendes derpå til at inokulere 300 liter af ovennævnte sterile medium i en tank og inkuberes i 48 timer ved 30°C under omrøring med et skovlhjul, der drives ved 180-200 omdr./min., hvorved der fås et tertiært podestof.

10

Eksempel 2

Tankfermentering

Der fremstilles et fermenteringsmedium ifølge nedenstående opskrift: 15 Dextrose ca. 0,50%

Saccharose ca. 1,50%

Pepton, bakteriologisk ca. 0,20% kvalitet

Dibasisk kaliumphosphat ca. 0,01% 20 Melasse ca. 0,50%

Calciumcarbont ca. 0,50%

Brom- eller iodkilde spormængder

Vand indtil 100,00% 25 2800 liter af ovenstående medium sterilise res og inokuleres derpå med 300 liter tertiært podestof fremstillet som beskrevet i eksempel 1. Gennemluft-ning sker med en hastighed på 0,53 liter steril luft pr. liter mæsk pr. minut, og omrøring sker med et 30 skovlhjul drevet med 110 omdr./min. Temperaturen holdes på ca. 28°C, og fermenteringen afsluttes efter ca.

97 timer, hvorefter mæsken høstes.

Fermenteringen overvåges for produktion af LL-E33288-antibiotika ved antibakteriel aktivitets-, 35 biokemisk induktionsprøve, TLC- og HELC-analyser.

o 35 DK 168388 B1

Hele den høstede mæsk justeres til pH 6 og eks-traheres derpå med et halvt mæskvolumen ethylacetat. E-thylacetatekstrakten koncentreres til en sirup, som vaskes to gange med hexan og filtreres gennem diatoméjord.

5 Diatoméjordkagen blandes omhyggeligt med ethylacetat og filtreres. Filtratet koncentreres til 3 liter, tørres over overskud af vandfrit natriumsulfat og fældes derpå ved tilsætning af hexan, hvilket giver ca. 26,7 g råt LL-E33288-kompleks.

10

Eksempel 3

Adskillelse af LL-E33288a^-Br, -α^-Br, -a^-Br og -a^-Br fra LL-E33288g^-Br, -β^-Br og -γ^-Br

De ca. 26,7 g råt LL-E33288-kompleks (bromkom-15 pleks) fra eksempel 2 deles ligeligt i tre portioner og chromatograferes på tre separate 2,4 x 110 cm silicagel-kolonner ("Silica Woelm", . 32-63 m, Woelm Pharma) pakket og bragt i ligevægt med ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat. Kolonnerne elueres 20 først med det samme opløsningsmiddel med en strømningshastighed på 3 ml/min. i 18 timer, idet der opsamles fraktioner på 18 ml. Elueringsmidlet ændres til ethylace-tat/methanol = 95:5, og elueringen fortsættes i 8 timer. Endelig elueres kolonnerne med ethylacetat/methanol = 90:10 25 i 10 timer. Fraktionerne afprøves ved den modificerede biokemiske induktionsprøve (BIA). De positive fraktioner analyseres ved hjælp af TLC ved hjælp af med si-licagel 60 forud overtrukne ark og fremkaldes med et opløsningsmiddelsystem af 3% isopropanol i ethylacetat mæt-30 tet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat og påvises ved bioautografi med modificeret BIA.

Fraktioner, der indeholder LL-E33288jS2_Br, -βχ-Br og -Tr^-Br (LL-E33288/3-Br-kompleks indeholdende ττ-Br) fra de tre kolonner slås sammen, inddampes til tørhed, remanensen 35 opløses i ethylacetat og vaskes med en lille smule vand. Ethylacetatopløsningen tørres over vandfrit natriumsulfat

O

36 DK 168388 B1 og fældes som før, hvilket giver ca. 2,0 g råt LL-E33288/3-Br-kompleks indeholdende nr-Br.

5 Eksempel 4

Isolering af LL-E3328881-Br og ΕΕ-ΕΒΒΣδδγ^ΒΓ

En prøve på ca. 1,9 g af LL-E332888-Br-komplek-set indeholdende γ-Br fra eksempel 3 chromatograferes på en 25 x 10 cm " Sephadex®LH-20" -kolonne bragt i lige-1Q vægt med methanol/vand = 90:10 med en strømningshastighed på 1,2 ml/minv, idet der opsamles fraktioner på 15 ml. Fraktionerne afprøves ved BIA, og de, der er aktive, analyseres ved TLC som før. Fraktioner 21-26, der indeholder mest LL-E332888^-Br, -[^“Br og -γ^-Br, slås sam-1g men og inddampes for at fjerne methanol, og den herved fremkomne, vandige blanding lyophiliseres, hvilket giver ca. 435.mg delvist renset kompleks indeholdende ca. 10% LL-E3328831-Br, 1% LL-E33288£2-Br og 4% LL-E33288Y1-Br.

Ovenstående, delvist rensede LL-E33288β-Br-kom-20 pleks, der indeholder γ-Br, deles ligeligt og chromatograferes på to 1,5 x 100 cm silicagel-kolonner ("Kiesel Gel 60% 40-63yUm, EM Products for Chromatography) pakket og bragt i ligevægt med ethylacetat/methanol = 98:2 ved en strømningshastighed på 1 ml/min., idet der opsam-25 les fraktioner på 12 ml. Fraktionerne afprøves og analyseres med TLC som før, og de, der hovedsagelig indeholder LL-E332888^-Br, slås sammen, inddampes og fældes fra hexan, hvilket giver ca. 26 mg 80% rent LL- -E332888^-Br. De fraktioner, der indeholder LL-E33288y^-30 -Br (chromatografering lige efter LL-E33288£^-Br) slås sammen og oparbejdes, hvilket giver ca. 4,5 mg 30% rent LL-E33288v^-Br. Nogle få fraktioner, der indeholder 35

O

37 DK 168388 B1 LL-E3328832~Br (chroma tograf er ing lige før LL-E33288|3^--Br) slås sammen og oparbejdes, hvilket giver en spormængde LL-E33288P2"Br.

5 Eksempel 5

Endelig rensning af LL-E33288ft1-Br

De ca. 26 mg 80% rent LL-E33288p^~Br fra eksempel 4 slås sammen med andre LL-E33288f3^-Br-prøver med lignende renhed stammende fra andre fermenteringer, 10 der er foretaget under identiske betingelser. Ialt ca.

38 mg af dette kombinerede β^-Br renses yderligere ved præparativ omvendt-fase-TLC med "Whatman®PLKC^gFy, 100 ym forudovertrukne TLC-plader, fremkaldt med methanol/ 0,1 molær ammoniumacetatpuffer ved pH 4,0 (90:10). Bån-15 det, der indeholder LL-E332883^-Br, der chromatografe-rer ved Rf = 0,66 og gøres synligt ved undertrykkende virkning under en kortbølget UV-lampe (254 nm), udskæres, og antibiotikummet vaskes af adsorbenten med 10% isopropylalkohol i ethylacetat mættet med 0,1 molært 20 vandigt kaliumdihydrogenphosphat. Opløsningen inddampes, og remanensen opløses i ethylacetat og vaskes med en smule vand. Den organiske opløsning, der indeholder LL-E3328831~Br, oparbejdes som før, hvilket giver ca.

24,5 mg 90% rent Ll>-E33288|3^-Br. Denne prøve renses 25 yderligere ved præparativ TLC på silicagel (med "Silica

Gel GF", forud overtrukne plader, 1000 ym, Analtech) fremkaldt med 3% isopropylalkohol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat. Det undertrykkende hovedbånd under kortbølget UV-lampe (254 nm) , 30 der chromatograferer ved Rf = 0,7, udskæres, og antibiotikummet vaskes af adsorbenten med dichlormethan/me-thanol = 80:20. Den organiske opløsning, der indeholder LL-E3328831~Br, oparbejdes som før, hvilket giver ca.

18,8 mg så godt som rent LL-E332883^-Br.

35

O

38 DK 168388 B1

Eksempel 6

Endelig rensning af LL-E33288Y^-Br

De ca. 4,5 mg 30% rent LL-E33288y^-Br fra eksempel 4 kombineres med andre LL-E33288Y^-Br-prøver af 5 lignende renhed stammende fra andre fermenteringer foretaget under identiske betingelser. Ialt 18 mg af denne kombinerede prøve renses yderligere ved præparativ TLC på silicagel (beviklede,med "Silica Gel GF" forud over-trukne plader, Analtech) fremkaldt med 2% isopropylal-10 kohol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kalium-dihydrogenphosphat. Det undertrykkende hovedbånd under kortbølget UV-lampe (254 nm) , der chromatograferer ved = 0,5, udskæres og oparbejdes som før, hvilket giver ca. 4,3 mg praktisk taget rent LL-E33288v1-Br.

15 Et foretrukket fermenteringsmedium til frem stilling af LL-E33288-bromkompleks er følgende:

Bestanddel_%

Saccharose 2,0

Ferrosulfat-heptahydrat 0,01 20 Magnesiumsulf at-heptahydrat 0,02

Calciumcarbonat 0,5

Pepton 0,2

Melasse 0,5

Natriumbromid 0,05 25 Vand indtil 100

Imidlertid giver tilsætning af iod som kali-umiodid til fermenteringsmediet væsentlige forbedringer, der består i 30 (1) udpræget forøgelse af vegetativ vækst i fermenteringen, (2) forøgelse af inhiberingszoner i bioprøver mod Escherichia coli nr. 300 og Bacillus subtilis nr. 308, 35 (3) tilvejebringelse af væsentlig aktivitet ved Rf for LL-E33288(3-j-I og -γ^-Ι på bioautografien

O

39 DK 168388 B1 af TLC-plader og (4) forøgelse af andre komponenter påvist ved TLC.

Følgende to medier foretrækkes til produktion 5 af LL-E33288-iodkompleks:

Procent_

Bestanddel_Medie A Medie B

Saccharose 2,0 2,0

Ferrosulfat-heptahydrat 0,01 0,01 10 Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,02 0,02

Calciumcarbonat 0,5 0,25

Pepton 0,2 0,2

Melasse 0,5 0,5

Kaliumiodid 0,05 0,01 15 Vand indtil 100 100 jfe Mississippikalk fcfé De bedste resultater opnås med "Marcor^ bakteriologisk pepton, men andre peptoner kan anvendest og det 20 samme gælder polypeptider fra kød- og caseinhydrolysater.

Eksempel 7

Der fremstilles en mycelie-sporesuspension ved at skrabe overfladen af en skråtstillet KrR3RL15839-kultur, 25 hvortil der er blevet sat 5 ml sterilt, destilleret vand.

Denne suspension anvendes derefter til at inokulere 100 ml sterilt podemedium med følgende sammensætning: Gærekstrakt 0,5% 30 Oksekødekstrakt 0,3%

Tryptose 0,5%

Stivelse 2,4%

Dextrose 0,5%

Calciumcarbonat 0,4% 35 Vand indtil 100,0%

O

40 DK 168388 B1 i en 500 ml kolbe. Denne podekolbe inkuberes ved 28°C i en roterende ryster ved 200 omdr./min. i 3-4 dage, hvorved der produceres stadium I-podestof.

Dette stadium I-podestof anvendes til at in-5 okulere et stadium II-inokulat af det samme sterile medium, som inkuberes under de samme betingelser i 2 dage.

Derpå anvendes stadium-II-podestoffet til at inokulere 100 ml sterilt fermenteringsmedium med sammensætningen: 10 Saccharose 2,00%

Perrosulfat-heptahydrat 0,01%

Magnesiumsulf at-hepta- hydrat 0,02%

Calciumcarbonat 0,50% 15 Pepton ("Marcor") 0,20%

Melasse 0,50%

Kaliumiodid 0,05%

Vand indtil 100,00% 20 Dette medium inkuberes ved 28°C på en ryster ved 200 omdr./min. i 5 dage, hvorefter mæsken høstes.

En koncentration på 4-20/Ug/ml kaliumiodid synes at være optimal, men en koncentration på 2 mg/ml synes ikke at mindske udbytterne.

25 NRRL 15839 kan bringes til at producere LL- -Ε33288β^-Ι, når der forekommer kaliumiodid i mediet, men kun i meget lave niveauer (0,2-0,37ug/ml) mod l,5-3,5y.ug/ml for den bedre producerende NRRL 15975.

Udbytter af β^-Ι og γ^-Ι i et iodmedium 30 er 2-8 gange større end udbytter af tilsvarende bromere-de forbindelser β-^-Br og γ^-Br i et brommedium med NRRL 15975.

35 DK 168388 Bl

O

41

Eksempel 8

Adskillelse af LL-E33288a^-I, -g^-I og -g,,«-1 fra LL--E332883j-I, -&2~Ί’ "Υχ"1 ocT ~&ι~τ

Ca. 41,3 g råt LL-E33288-kompleks stammende 5 fra oparbejdning af 7500 liter af en fermentering med NRRL 15975 og et medium, der indeholder uorganisk iod, opdeles ligeligt i to portioner og chromatograferes på to separate 2,5 x 110 cm silicagelkolonner ("Silica Woelm", 32-63 pm) pakket og bragt i ligevægt med ethyl-10 acetat. Kolonnerne elueres først med ethylacetat ved en strømningshastighed på 4 ml/minut i 4 timer, idet der opsamles 20 ml fraktioner. Elueringsmidlet aindres til en konkav gradient fra ethylacetat mættet med 0,1 molær vandigt kaliumdihydrogenphosphat til 10% isopropyl-15 alkohol i ethylacetat mættet med 0,1 molær vandigt kaliumdihydrogenphosphat i løbet af 24 timer. Kolonnerne elueres til sidst med 10% isopropylalkohol i ethylacetat mættet med 0,1 molær kaliumdihydrogenphosphat natten over. Fraktionerne afprøves ved BIA, og de, der 20 er aktive, analyseres ved TLC som beskrevet i eksempel 3.

Fraktionerne 254-272, der indeholder LL-E33288j32-I og -βχ-Ι fra de to kolonner, slås sammen og oparbejdes, således at der fås et udbytte på ca. 1,2 g af en rå blanding af LL-E33288j82-I og -βχ-Ι.

25 Fraktionerne 273-302, der indeholder LL-E33288-^-1 fra de to kolonner, slås sammen og oparbejdes, hvilket giver et udbytte på ca. 1,9 g 30% rent LL-E33288t^-I.

Fraktionerne 303-340, der indeholder LL-E33288^-1 fra de to kolonner, slås sammen og oparbejdes som før, hvilket 30 giver et udbytte på ca. 1,3 g delvist renset LL-E332886i“I.

Eksempel 9

Rensning af LL-E33288y^-I

Ca. 900 mg af det 30% rene LL-E33288YJ-I fra 35 eksempel 8 chromatograferes på en 2,5 x 120 cm "Sepha-dex® LH-20"-kolonne bragt i ligevægt med ethylacetat/di-chlormethan/ethanol = 2:2:1 ved en strømningshastighed

O

42 DK 168388 B1 på 1 ml/minut, idet der opsamles fraktioner på 12 ml. Fraktionerne afprøves og analyseres ved TLC som før, og de fraktioner (24-33), der indeholder LL-E33288y^-I, slås sammen og oparbejdes, hvilket giver et udbytte på 5 428 mg 64% rent LL-E33288y^-I.

En 22 mg prøve af ovenstående chromatograferes på en 0,8 x 24 cm "Separalyt" C^g-(35-60 um, Analytichem) -kolonne bragt i ligevægt med acetonitril/0,2 molært vandigt ammoniumacetat = 55:45 ved en strømningshastig-10 hed på 2 ml/minut, idet der opsamles 12 ml fraktioner. Fraktionerne afprøves og analyseres ved TLC som før, og de, der indeholder rent LL-E33288y1~I, slås sammen og oparbejdes, hvilket som udbytte giver 7,7 mg rent LL--Ε33288γ1-Ι.

15

Eksempel 10

Rensning af LL-E33288(^-I og

Ca. 600 mg af den rå blanding af LL-E33288P2_I og -β^-Ι fra eksempel 8 chromatogrageres på en 2,5 x 20 120 cm "Sephadex® LH-20"-kolonne bragt i ligevægt med ethylacetat/dichlormethan/ethanol = 2:2:1 ved en strømningshastighed på 1 ml/minut, idet der opsamles fraktioner på 12 ml. Fraktionerne afprøves og analyseres ved TLC som før, og de, der indeholder LL-E33288|32~1 og 25 -β-j-I (23-31), slås sammen og oparbejdes, hvilket giver et udbytte på 81 mg af den delvis rensede blanding af LL-E3328882“I og -^-1.

En prøve af ovenstående chromatograferes på en 1,5 x 90 cm "Sephadex® LH-20"-kolonne bragt i lige-30 vægt med hexan/dichlormethan/ethanol = 3:1:1 ved en strømningshastighed på 0,8 ml/minut, idet der opsamles fraktioner på 12 ml. Fraktionerne afprøves og analyseres ved TLC som før, og de, der indeholder LL-E3328882-I (17-30) og LL-E332883.J-I (31-38); slås sammen hver for 35 sig og oparbejdes, hvilket giver udbytter på 31 mg delvis renset LL-E33288f32—-£ °g 20 mg 80% rent LL—E33288(3^—I.

Claims (11)

1. Antibiotisk, bromholdig forbindelse LL-E33288jØi“ -Br, kendetegnet ved, at den har (a) en omtrentlig grundstofanalyse: C 48,6%, H 5,6%,

2. Antibiotisk, bromholdig forbindelse LL-E33288/32” -Br, kendetegnet ved, at (a) den har følgende Rf-værdier i de anførte opløsningsmiddelsystemer ved TLC på silicagelark: (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt 10 kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,32, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,41, (iii) ethylacetat/methanol = 95:5, Rf = 0,45, 15 (b) den kan fremstilles ved aerob dyrkning af mikro organismen Mikromonospora echinospora, undertype calichensis, NRRL 15839 eller dens mutant NRRL 15975, i et flydende medium indeholdende assimilerbare carbon-, nitrogen- og bromkilder samt kilder for uorganiske salte.

3. Antibiotisk, bromholdig forbindelse LL-E33288TJ- -Br, kendetegnet ved, at den har (a) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig. 5 på tegningen, (b) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i 25 fig. 6 på tegningen, (c) et protonmagnetisk resonansspektrum som vist i fig. 7 på tegningen, (d) følgende Rf-værdier i de anførte opløsningsmiddelsystemer ved TLC på silicagel-ark: 30 (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,18, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,28, og 35 (iii) ethylacetat/methanol = 95:5, Rf = 0,27, (e) et carbon-13-magnet i sk resonanspektrum som vist DK 168388 B1 i fig. 8 på tegningen med signifikante spidser ved: 14,4 17,6 17,9 19,0 19,7 - 22,8 34,0 37,6 39,5 5 42,1 - 51,6 52,7 54.1 56,3 57,3 59,3 61,1 61,8 61,9 67.2 68,18 68,23 69,7 70,1 70,8 71,1 71,7 10 71,8 76,1 - 81,0 82,9 88,4 - 97,8 100,0 100,2 101,3 103,0 115.3 123,0 124,9 126,9 130.4 131,1 131,8 138,0 15 144,7 - 149,5 149,6 155,6 192,5 192,9 (f) et indhold af udelukkende følgende grundstoffer: C, Η, N, 0, S og Br, (g) en molekylvægt på 1319/1321 for hhv. 79Br og 20 81Br.

4. Antibiotisk, iodholdig forbindelse LL-E33288)02-I, kendetegnet ved, at den har (a) følgende Rf-værdier i de anførte opløsningsmiddelsystemer ved TLC på silicagel-ark: 25 (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,24, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,35, 30 (iii) ethylacetat/methanol = 95:5, Rf = 0,36, (b) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig. 9 på tegningen, (c) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig. 10 på tegningen, 35 (d) et protonmagnetisk resonansspektrum som vist i fig. 11 på tegningen, DK 168388 B1 (e) et carbon-13-magnetisk resonanspektrum som vist i fig. 12 på tegningen med signifikante spidser ved: 17,5 17,6 18,9 22,4 22,8 23,4 5 25,4 34,3 36,9 39,2 47,9 51,6 52,8 54.8 56,3 57,2 57,9 60.9 - 61,6 62,2 67,0 68,4 68,4 69,1 10 69,6 70,4 71,1 71,8 72.2 76,2 - 80,8 83.3 88,1 93,6 97,4 99,6 99,6 - 102,6 112,4 123,4 124,4 126,4 15 - - 133,4 192,3 192,6 (f) et indhold af udelukkende følgende grundstoffer: C, Η, N, 0, S og I, 20 (g) en molekylvægt på 1381.

5. Antibiotisk, iodholdig forbindelse LL-E33288j32-I, kendetegnet ved, at (a) den har følgende Rf-værdier i de anførte opløsningsmiddelsystemer ved TLC på silicagel-ark: 25 (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,32, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,41, 30 (iii) ethylacetat/methanol = 95:5, Rf = 0,45, (b) den kan fremstilles ved aerob dyrkning af mikroorganismen Mikromonospora echinospora, undertype calichensis, NRRL 15839 eller dens mutant NRRL 15975, i et flydende medium indeholdende assimilerbare carbon-, nitrogen- og iodkilder 35 samt kilder for uorganiske salte. DK 168388 B1

5 N 2,9%, S 9,1% og Br 5,5%, (b) et smeltepunkt på 146-150“C (dekomponering), (c) en specifik rotation [a]2® = -49°±10° (0,1%, ethanol), (d) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i 10 fig. l på tegningen, (e) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig. 2 på tegningen, (f) et protonmagnetisk resonansspektrum som vist i fig. 3 på tegningen, 15 (g) et carbon-13-magnetisk resonansspektrum som vist i fig. 4 på tegningen med signifikante spidser ved: 17,60(q) ; 17,64(q); 18,9(q); 19,7(q)? 22,4 (q) ; 22,8 (q) ; 23,5(q); 34,3(t); 36,9 (t); 39,2 (t/d) ; 47,8(d)? 51,7 (q); 20 52,7 (q) ; 54,6(d)? 56,3(q)? 57,2(q)? 57,8(d)? 61,0(q/d) ? 61,7(d)? 62,4(t)? 66,9(d)? 68,4(d)? 69,1(d)? 69,7(d)? 70,2(d)? 71,1(d)? 71,9(d)? 72,l(s)? 76,1(d)? 81,0(d)? 83,3(s)? 88,2(s)? 25 97,4(d)? 99,7(d)? 100,8(s)? 102,5(d)? 115,1 (s)? 123,4(d)? 124,4(d)? 126,5(d)? 130,2(8)? 130,8(S)? 144,6(s)? 149,3(s)? 149,5(s)? 191,7(s)? 192,4(s)? (h) følgende Rf-værdier i de anførte opløsningsmid-30 delsystemer ved TLC på silicagel-ark: (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,24, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat,

35 Rf = 0,35, og (iii) ethylacetat/methanol = 95:5, Rf = 0,36, DK 168388 B1 (i) en molekylvægt på 1333/1335 for hhv. 79Br og 81Br, (j) et indhold af udelukkende følgende grundstoffer: C, Η, N, 0, S og Br.

6. Antibiotisk, iodholdig forbindelse LL-E33288T]_-I# kendetegnet ved, at den har (a) følgende Rf-værdier i de anførte opløsningsmiddelsystemer ved TLC på silicagel-ark: 5 (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,18, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 molært vandig kaliumdihydrogenphosphat, Rf — 0,28, 10 (iii) ethylacetat/methanol = 95:5, Rf = 0,27, (b) et indhold af udelukkende følgende grundstoffer: C, H, N, O, S og I, (c) følgende omtrentlige grundstofanalyse: C 48,8%, H 5,4%, N 2,8%, S 9,0% og I 9,2%, 15 (d) en molekylvægt på 1367, (e) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig. 13 på tegningen, (f) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig. 14 på tegningen, 20 (g) et protonmagnetisk resonansspektrum som vist i fig. 15 på tegningen, (h) et carbon-13-magnetisk resonansspektrum som vist i fig. 16 på tegningen med signifikante spidser ved: 14,5(q) 17,6(q) 17,6(q) 18,9(q) 25 22,8(q) 25,4(q) 34,1(t) 37,0(t) 39,l(t) 42,3(t/s) - 51,5(d) 52,8(q) 54,8(t) 56,3(q) 57,2(q) 60,4(d) 60,9(q) 61,3(t) 61,7(q) 30 67,0(d) 68,4(d) 68,5(d) 69,2(d) 69,7(d) 70,5(d) 71,1(d) 71,8(d) 72,l(s) 75,7(d) 75,8(d) 80,9(d) 82,8(s) 88,1(s) 93,5(s) 97,3(d) 99,6(d) 99,7(d) 100,8(s) 102,6(d) 35 - 123,4(d) 124,4(d) 126,2(d) 130,2(s) 131,0(s) 133,4(s) 139,l(s) DK 168388 B1 143,0(s) 145,1 150,6(s) 151,5(s) 154,5 192,0(S) 192,5(s)

7. Antibiotisk, iodholdig forbindelse LL-33288<5i“I, kendetegnet ved, at 5 (a) den har følgende Rf-værdier i de anførte opløs ningsmidler ved TLC på silicagel-ark: (i) ethylacetat mættet med 0,1 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,11, (ii) 3% isopropanol i ethylacetat mættet med 0,1 10 molært vandigt kaliumdihydrogenphosphat, Rf = 0,19, (b) den kan fremstilles ved aerob dyrkning af mikroorganismen Mikromonospora echinospora, undertype calichensis, NRRL 15839 eller dens mutant NRRL 15975, i et flydende medium 15 indeholdende assimilerbare carbon-, nitrogen- og iodkilder samt kilder for uorganiske salte.

8. Middel til behandling af bakterielle infektioner hos varmblodede dyr, kendetegnet ved, at det som aktiv komponent indeholder en effektiv mængde af en forbin- 20 delse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.

9. Middel til inhibering af tumorvækst hos et pattedyr, kendetegnet ved, at det som aktiv komponent indeholder en effektiv mængde af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.

10. Middel til regression af leukæmi hos et pattedyr, kendetegnet ved, at det som aktiv komponent indeholder effektiv mængde af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.

11. Mikroorganismekultur til brug ved fremstilling 30 af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at den er en kultur af mikroorganismen Mikromonospora echinospora, undertype calichensis, NRRL 15839 eller dens mutant NRRL 15975.