FI86892B - Foerfarande foer framstaellning av antitumoer ll-e33288-antibioter och mikroorganismer, som producerar dessa. - Google Patents

Description

1 86892

Menetelmä kasvainten vastaisten LL-E33288-antibioottien valmistamiseksi ja niitä tuottavia mikro-organismeja Tämä keksintö koskee menetelmiä uusien antibakte-5 riaalisten ja kasvaimia ehkäisevien, LL-E33228e^-Br:ksi, LL-E332880Cf-I:ksi, LL-E3 3288<K2-Br : ksi , LL-E33288eC2~I: ksi, LL-E332 88p(g-Br: ksi, LL-33288o^3-I: ksi , LL-E33288/<$1-Br: ksi, LL-E33288^^-1:ksi, LL-E3 3288^2 -Br : ksi , LL-E33288/^2-I: ksi , LL-E33288 y^-Br: ksi, LL-E33288 : ksi ja LL-E33288$1-I: ksi 10 nimettyjen aineiden valmistamiseksi fermentaatioteitse.

Yhdisteet kerätään talteen ja konsentroidaan raakaliuok-sista ja puhdistetaan. Tässä kuvataan antibakteriaaliset ja kasvaimia ehkäisevät aineet laimeina, raakakonsentraat-teina, usean tai kaikkien komponenttien muodostamana 15 kompleksina, puhtaina yksittäisinä komponentteina ja uudet Micromonospora-kannat.

Keksinnön mukaisesti valmistetut LL-E33288-antibioo-tit ovat lähisukuisia yhdisteitä. Antibiootit otetaan talteen fermentaatiosta ja ne ovat aluksi seosmuodossa, josta jäl-20 jempänä käytetään joko nimitystä LL-E33288-kompleksi, LL-E33288-jodikompleksi tai LL-E33288-bromikompleksi. LL-E33288-antibioottien jodia sisältäviä komponentteja (esim. QC|-I, · °3-1/ Aj-I / /¾-1, ^1_I 3a saadaan yleensä vain fermentaatioista, joista käytetään epäorgaanista tai 25 orgaanista jodidia sisältävää alustaa, kun taas bromia sisältäviä komponentteja (esim. Cfcj-Br, o^-Br, Q^-Br, Q£j-Br, /3^-Br, /32~Br ja Y^-Br) saadaan yleensä vain fermentaatiois-- ta, joissa käytetään epäorgaanista tai orgaanista bromia sisältävää alustaa. Komponenttien suhde LL-E33288-komplek-30 sissa vaihtelee sekä bromia että jodia sisältävien antibioottien fermentaatiosta riippuen, LL-E33288/¾^ ja LL-E33288y.j ovat pääkomponentteja vastaten yhdessä noin 90 % kompleksista. LL-E33288CCJ , LL-E332880^, LL-E332880C2, LL-E33288«4-Br, LL-E33288/32 , LL-EE33288^-I ovat sivukompo-35 nentteja vastaten yhdessä noin 10 % kompleksista.

LL-E33288-antibiootit tehoavat gram-positiivisiin ja gram-negatiivisiin bakteereihin. Kaikkien komponenttien 2 86892 havaittiin olevan myös aktiivisia muunnellussa biokemiallisessa induktiokokeessa (Elespuru, R. ja Yarmolinsky, M., Environmental Mutagenesis, 1, 65-78, 1979), testissä, joka määrittää spesifisesti aineen kyvyn käynnistää suoraan tai 5 epäsuorasti DNA:n vahingoittuminen. Tässä kokeessa sekä LL-E3328fy3.j-Br että LL-E33288Yj-Br olivat aktiivisia alle 1 x 10 mcg:n/ml konsentraatioissa.

Kuvio I on LL-E33288/3.] -Br :n ultravioletti-absorptio-spektri; 10 Kuvio II on LL-E33288y3^-Br :n infrapuna-absorptio- spektri;

Kuvio III on LL-E33288/3.J -Br :n protonimagneettinen resonanssispektri;

Kuvio IV on LL-E33288/3^ -Br :n hiili-1 3-magneettinen 15 resonanssispektri;

Kuvio V on LL-E33288y1-Br:n ultravioletti-absorp-tiospektri;

Kuvio VI on LL-E33288-Br:n infrapuna-absorptio-spektri; 20 Kuvio VII on LL-E33288v^-Br:n protonimagneettinen resonanssispektri;

Kuvio VIII on LL-E33288y^-Br:n hiili—13-magneettinen resonanssispektri;

Kuvio IX on LL-E33288oi2~I :n protonimagneettinen re-25 sonanssispektri;

Kuvio X on 1,1^332880^-1^ protonimagneettinen resonanssispektri ;

Kuvio XI on LL-E33288/3^-I: n ultravioletti-absorp-tiospektri; 30 Kuvio XII on LL-E33288/3.J-I :n infrapuna-absorptio- spektri;

Kuvio XIII on LL-E33288/9l|-I: n protonimagneettinen resonanssispektri;

Kuvio XIV on LL-E33288/3^-I :n hiili-13-magneettinen 35 resonanssispektri; 86892 3

Kuvio XV on LL-E33288 Yj -I:n ultravioletti-absorptio-spektri;

Kuvio XVI on LL-E33288Yj-I:n infrapuna-absorptio-spektri; 5 Kuvio XVII on LL-E33288Y^-I:n protonimagneettinen resonanssispektri ja

Kuvio XVIII on LL-E33288Y1-I:n hiili-13-magneettinen resonanssispektri.

LL-E3 3238/3^--Br :n ja LL-E33288Y^ -Br :n fysikaaliske-10 mialliset ominaisuudet on kuvattu alla: LL-E33288/3.J -Br 1) Likimääräinen alkuaineanalyysi C 48,6; H 5,6; N 2,9; S 9,1; ja Br 5,5. (Kemiallisanalyyttisen elektroni-spektroskopiamäärityksen (ESCA) mukaan ainoastaan seuraa-15 via alkuaineita on mukana: C, H, N, O, S ja Br); 2) Sulamispiste: 146-150°C (hajoaa); 3) Spesifinen kiertokulma = -49 t 10° (0,1 %

etanoli); D

4) Ultravioletti-absorptiospektri: Esitetty kuviossa 20 I (metanoli; hapan metanoli; emäksinen metanoli); 5) Infrapuna-absorptiospektri: Esitetty kuviossa II (KBr-kiekko); 6) Protonimagneettinen spektri: Esitetty kuviossa III (300 MHz, CdCl3); 25 7) Hiili-13-magneettinen resonanssispektri: Esitet ty kuviossa IV (75,43 MHz, CDCl^, ppm TMS:stä), merkittävät piikit lueteltu alla: 17 t 60(q); 17,64(q); 18,9(q) ; r J(q> i 22 f A(q); 22,8 (q ) ; 23,5(q) ; 34,3(0: 30 3619(c); 39,2 (t/d); *7,8 (d); 51,7(qj; 52,7(q ) ; 54,6 (t/d); 36,3(q); 57,2(q); 57.8(d); 61,0 (q/d); 61,7(d); 62,4(0; 66 9(d); 68,4(d); 69,1(d); 69,7(d); 70.2(d); 71,1(d); 71,9(d); 72,1(3/0; 76,1(d); 81,0(d); 83,3(0; 88,2<s); 97,4(d); 99,7(d); 100,8(s); 02,5(d); 35 115. 1 (s) ; 123,4(d); 124,4(d); 126,5(d); 130,2(s); 130 J 8(s ) ; 144,6(s): 149,3(s); 149,5(s ) ; 191,7 (s) ; 192,4(s) ; 4 86392 8) Moolimassa: 1333/1335, vastaten paria ^Br/^Br, määritetty FAB-MS:llä; ja 9) Molekyylikaava: Cc,H7-N,071S.Br, tarkat massat 79 b6 /0 Rl 1 258,3699 ( Br) ja 1 260,3726 (ö Br) määritettiin suuren 5 erotuskyvyn FAB-MS:llä ja kaavan laskettiin olevan C55H76N3°211 2 3 4 5 62Br (M+H-CS2).

LL-E3 3288y'1-Br 1) Ultravioletti-absorptiospektri: Esitetty kuviossa V (metanoli; hapan metanoli; emäksinen metanoli);

10 2) Infrapuna-absorptiospektri: Esitetty kuviossa VI

(KBr-kiekko); 3) Protonimagneettinen resonanssispektri; Esitetty kuviossa VII (300 MHz, CDCl^); 4) Hiili-13-magneettinen resonanssispektri: Esitet-15 ty kuviossa VIII (75,43 MHz, CDCl^, ppm TMS:stä), merkittävät piikit lueteltu alla: 14.4 17.6 17,9 19,0 19 7 - 22,8 34,0 37,6 39,5 42.1 - 51,6 52,7 20 54,1 56,3 57,3 59,3 61,1 61,8 61,9 67.2 68,18 68,23 69,7 70,1 70,8 71,1 71,7 71.8 76 1 - 81,0 82.9 88,4 - 97,8 100,0 100,2 101,3 103,0 115 3 123,0 124,9 126,9 25 130,4 131,1 131,8 138,0 144,7 - 149,5 149,6 155,6 192,5 192,9

Molekyy likaava: C^j-H^N^C^^S^Br vertaamalla sen UV-, IR-, 1H-N R- ja 13C-NMR-analyysituloksia LL-E33288/3-J - 30 Br:n ja LL-E33288Y,-I:n vastaaviin; ja 7 9 8 1 2

Moolimassa: 1319/1321 vastaten paria ur/ Br, 3 laskettu molekyylikaavasta.

4 1,1,^332880^-1:^ LL-E332880^-1 :n, LL-E33288Q:3-I :n 5 ja LL-E33288/^ -I:n ja LL-E33288y^ -I:n fysikaaliskemialli- 6 35 set ominaisuudet on kuvattu alla: , 86892 5

LL-E33288<X| -I

1) Moolimassa: 1145, määritetty FAB-MS:llä. LL-E33288CX2-I

1) Sisältää seuraavia ja vain seuraavia alkuaineita 5 kemiallisanalyyttisen elektronispektroskopian (ESCA) mukaan: C, H, N, 0, S, I; 2) Moolimassa: 1131, määritetty FAB-MS:llä (myöhemmissä kokeissa todettu olevan 1207 (M-CS2)); ja 3) Protonimagneettinen resonanssispektri: Esitetty 10 kuviossa IX (300 MHz, CDClj).

LL-E33288<*3-I

1) Moolimassa: 1066, määritetty FAB-MS:llä; ja 2) protonimagneettinen resonanssispektri: Esitetty kuviossa X (300 MHz, CDCl^).

15 LL-E33288/3.J-I

1) Ultravioletti-absorptiospektri: Esitetty kuviossa XI (metanoli; hapan metanoli; emäksinen metanoli); 2) Intrapuna-absorptiospektri: Esitetty kuviossa XII (KBr-kiekko); 20 3) Protonimagneettinen resonanssispektri: Esitetty kuviossa XIII (300 MHz, CDCl3); 4) Hiili-13-magneettinen resonanssispektri: Esitet-ty kuviossa XIV (75,43 MHz, CDC13, ppm TMS:stä), merkittävät piikit lueteltu alla: 25 17.5 17,6 18,9 22,4 22; 8 23,4 25.4 34,3 36,9 39,2 47,9 51,6 52,8 54 ,‘8 56,3 57,2 57,9 60,9 61,6 62,2 - . 67,0 68,4 68,4 69,1 30 69,6 70,4 71,1 71,8 72.2 76,2 - 80,8 83.3 88,1 93,6 97,4 99,6 99,6 - 102,6 112.4 123,4 124,4 126,4 133,4 192,3 192,6 6 86892 5) Molekyylikaava: C55H7gN3°2iS4I vertaamalla sen UV-, IR-, 1H-NMR ja 13C-NMR-analyysituloksia LL-E33288/3., -Brnja LL-E33288y^-I:n vastaaviin; ja 6) Moolimassa: 1381, laskettu molekyylikaavasta.

5 LL-E33288YJ-I

1) Sisältää seuraavia ja ainoastaan seuraavia alkuaineita kemiallisanalyyttisen elektronispektroskopian (ESCA) mukaan: C, H, N, 0, S, I.

2) Likimääräinen alkuaineanalyysi: C 48,8; H 5,4; 10 N 2,8; S 9,0; I 9,2; 3) Moolimassa: 1367, määritetty FAB-MS:llä; 4) Molekyylikaava: C,. ..H^N^C^-^S^I, M+H:n tarkaksi massaksi määritettiin suuren erotuskyvyn FAB-MS:llä 1368. 3397 kaavalle ; 15 5) Ultravioletti-absorptiospektri: Esitetty kuviossa XV (metanoli; hapan metanoli; emäksinen metanoli); 6) Infrapuna-absorptiospektri: Esitetty kuviossa XV (KBr-kiekko); 7) Protonimagneettinen resonanssispektri: Esitetty 20 kuviossa XVII (300 MHz, CDCl^)? 8) Hiili-13-magneettinen resonanssispektri: Esitetty kuviossa XVIII(75,43 MHz, CDCl^» ppm TMS:stä), merkittävät piikit lueteltu alla: 25 i?r6<q> l8'9(q) 25.4(a) 34,1 (t) 37',0(t) 39,1(c) 42 3 t/s) - 5ll5(d) 52,8(q) 54 8(C) 56,3(q) 57.2(q) - 60 4(d) 60,9(q) 61,3(t) 61,7(q) 67 0(d) 68,4(d) 68.5(d) 69,2(d) 69 7(d) 705(d) 71.1(d) 71,8(d) 30 72 l(s) 75;7(d) 75.8(d) 80,9(d) 30 82 8(s) 88,l(s) 93.5(e) 97.3(d) 9916 (d) 99,7(d) 100,8(s) 10$,6(d) ! ’ 123.4(d) 124.4(d) 126[2(d) 130,2(5) 131,0(s) 133,4(5) 139,l(s) 143,0(s) 145,1 150,6(s) 151,5(s) 154,5 192,0(s) 192,5(s) 86892 7 LL-E33288-komponentit erotetaan ja identifioidaan sopivammin suurteho-nestekromatografiällä (HPLC) ja ohut-kerroskromatografiällä (TLC). On vaikeaa, vaikkakaan ei mahdotonta, erottaa vastaavat jodatut ja bromatut komponentit 5 HPLC:llä, niitä ei voida kuitenkaan erottaa TLC:llä.

LL-E33288-Br-komponenttien analyyttisessä HPLC-erotuksessa on edullista käyttää seuraavia olosuhteita:

Kolonni: "Separalyte C^g 5 m", 4,6 mmx 25 cm (Analytichem International); 10 Liuotin: Asetonitriili: 0,2 M ammoniumasetaatin ve siliuos (60:40);

Virtausnopeus: 1,5 ml/min;

Detektori: Kaksois-aallonpituus-UV, 254 nm ja 280 nm;

Herkkyys: 0 - 0,02 A.U.F.S.

15 Taulukossa IA on esitetty LL-E33288/3^ -Br :n, LL- E33288/32 -Br:n ja LL-E33288y^-Br :n likimääräiset retentio-ajat ja -tilavuudet näissä olosuhteissa.

Taulukko IA

20 LL-E33288- Retentioaika Retentio- komponent. (min) til. (ml) 6L-Br 5, 7 8,6 82-Br. 7,1 10,7 25 γχ-Br 4,3 6j 5

Jodia sisältävien LL-E33288-komponenttien analyyttisessä HPLC-erotuksessa on edullista käyttää seuraavia 30 olosuhteita:

Kolonni: NOVA-PAK Radial-PAK -patruuna ja RCM- 100 puristusmoduuli (Millipore, Waters Chromatography Division) ;

Liuotin: Asetonitriili: 0,2 M ammoniumasetaatin ve-35 siliuos (50:50);

Virtausnopeus: 1,2 ml/min; s 86892

Detektori: Kaksoisaallonpituus-UV, 254 nm ja 280 nm;

Herkkyys: 0 - 0,02 A.U.F.S.

Taulukossa IB on esitetty LL-E33288Ctj -I :n, LL-E332880^-I:n, LL-E332880^-I :n, LL-E33 288/1.J-I :n, LL-E33288/^-5 I:n, LL-E33288y^-I:n ja LL-E33283 -I:n likimääräiset re-tentioajat ja -tilavuudet näissä olosuhteissa.

Taulukko IB

LL-E33288- Retentioaika Retentions komponent. (min) til. (ml) ai-I 11,9 14,3 a2~I 9 f1 10f 9 03 -1 1,3 1,8 15 Bl-I ^ ^ 62-1 5,0 6,0 Ύ1 -1 3,6 A, 3 6rl 2,6 3,1 i 20 LL-E33288-komponentit erotetaan ja identifioidaan käyttäen seuraavaa TLC-järjestelmää:

Absorbentti: Silikageelillä 60 esipäällystetyt alumiinilevyt, 0,2 mm kerrospaksuus, EM-reagenssit; 25 Detektointi: Sammutusefektiin perustuva visuali sointi lyhytaalto-UV-lampun valossa ja bioautografia Bacillus subtilista tai muunneltua biokemiallista induk-tiokoetta käyttäen;

Liuotinjärjestelmät: I, 0,1 M kaliumdivetyfosfaa-30 tin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaatti; II, 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty isopro-pyylialkoholin 3-%:inen etyyliasetaattiliuos; III, etyyliasetaatti :metanoli (95:5).

Taulukossa II on esitetty likimääräiset LL-E33288-35 komponenttien R^-arvot näissä kolmessa järjestelmässä:

Taulukko II

9 86892 R^-arvo 5 LL-E33288- Liuotin-j Liuotin- Eiuotin-

komponentit järj . I järj. II järj. III

«Vir/M-I °'79 α 2~Βγ ,α 2~I 0; 61 0,75 0,73 10 α3~^Γ»α3~1 0,55 0,69 0,61 a6,-Br 0,49 0,64 0,54 B 2 “Br ,6 2“ I 0, 32 0,4 1 0,45 β 1 -Br ,βi“ 1 0,24 0,35 0, 36 15 γΐ-Βτ,γι-Ι 0,18 0,28 0,27 61-1 0,11 0,19 20 Uudet antibakteriaaliset ja kasvaimia ehkäisevät LL-E332880C, -Br :ksi, LL-E33288«2-Br :ksi, E£-E33288«3-Br :ksi , LL-E332880C}-Br:ksi, ££-£33288/2^-Br :ksi, LL-E33288/32~Br :ksi, LL-E33288y1-Br:ksi, LL-E33288<Xj-I :ksi , ££-Ε33288θ(^-Ι :ksi, LL-E33288<*3-I:ksi, ££-£33288/^-1^51, ££-E33288/32-I :ksi, 25 LL-E33288^-I:ksi ja EE-E33288 -I:ksi nimetyt aineet muodostuvat viljeltäessä Micromonospora echinospora ssp. calichensis’in uutta kantaa säädellyissä olosuhteissa. Tätä mikro-organismia säilytetään viljelmäkokoelmassa, joka on osoitteessa Medical Research Division, American Cyanamid 30 Company, Pearl River, New York, viljelmänumeron ollessa EE-E33288. Tämän uuden mikro-organismin elinkykyinen viljelmä on talletettu (Culture Collection Eaboratory, Morthern Regional Research Center, U.S. Department ot Agriculture, Peoria, Illinois) 9. elokuuta 1984 ja lisätty laitoksen py-35 syvään kokoelmaan. Sille on annettu tämän talletuksen yhteydessä kantanimi NRRE 15839. Tämä viljelmä on kantanimellä 86892 10 NRRL 15839 tämän hakemuksen käsittelyaikana patentti- ja tavaramerkkivaltuutetun määräämän, lakien 37 C.F.R. § 1.14 ja 35 U.S.C. § 122 siihen oikeuttaman henkilön saatavissa ja kaikki tämän viljelmän julkisen saatavuuden rajoitukset 5 poistetaan peruuttamattomasti, kun tälle hakemukselle myönnetään patentti.

Viljelmä LL-E33288 eristettiin kalkkipitoisesta sa-vimaanäytteestä, joka oli kerätty Teksasista.

Suvun Micromonospora kannan NRRL 15839 sukumääritys 10 varmistettiin morfologisesti ja kemiallisesti. Kanta tuottaa monoitiöitä joko yksittäin tai joukoittain vegetatii-visiin hyyfeihin. Ilmahyyfejä ei havaittu. Elektronimikro-skooppitarkastelu osoitti, että itiöt olivat nystyräisiä. Kokosoluanalyysi osoitti, että kanta sisälsi diaminopime-15 liinihapon (DAP) meso-isomeeriä. DAP:n 3-OH-johdannaista oli mukana suuria määriä (pääkomponentti). Lisäksi kannan kokosolu-sokerihydrolysaateissa oli havaittavissa ksyloo-sia ja pieniä määriä arabinoosia (tyypin D kokosolu-soke-rikoostumus).

20 Makromorfologisista ja fysiologisista tutkimuksista tehtiin se johtopäätös, että NRRL 15839 voidaan pitää M. echinosporan alalajina (se on lähinnä M. echinospora ssp. pallidaa). NRRL 15339:n morfologiset tiedot on esitetty taulukoissa A ja B. Fysiologiset tiedot on esitetty taulu-25 koissa C ja D.

11 86892 +>

J—u -rH

-P td a) cJ > to o) td •H g 4->

td en X

X -H a) d ft x S 05

-MI 1 d I

c a) P

.. to d

tj -H fO

u O (U

co -¾ ^ H 3 5 I -rH (Ö co P> > ffl z — I m γμ a +> d +j r- -Η to rd <d ^ to <u td d ·> to to tu tu o d d -h ,¾ d

•H d) (d td CO -H

+j ft d P -P d td H <U -H O rH P -p m d) td d) d h

:tO to -P d X (d <U

> >i rH td d rH X

~ g d) (U -H ft c M H CO d) -H d td d d id ~ to x to :0 •h a) -h td m d to -p

to c to > t·" td d d-H

o-Hto — p cd tdP

ft > d a Od) P :td o ft (d I d -η o > m -h p tu td td

p-podd-ptd d a <C o td :o -h to > td I

g x> td +j td td d) 0 O <U g ft 4-> g .—. .—. I ^ XPtdgPftgcNiotdm XXtUdXtUdr-t^tdr-· d td > +J > x -P — — > -^ Ή g

d d I

td d tu to

EH ·· -HO

σι 4-4 *0

n to O

oo d d to m g g d

r- C

d d d pi tu d) d) « d Ό p «4-» ft ft 2 :0 :td :0 td

-H I I X -H g I

4-t :td -P td

H > ft -P

— -p d

CM td -H

rH ft ft m o — to to d ^ td

td h ft to P

-P co ft td to h +J w ft d to ~ d) H to rH td to —r Id

td rH 0 ft I

! rH x d to -H

p td d id >ι I—I

td g td td rH O -—- to I -r~> to <U P m td td td p x tu I > P OX to ft ft ft d :rd P >1 to

co -H td ft :td H H

H X X 0) X to 12 86892

Taulukko B

NRRL-15839ai makromorfologia Actinomycetes-kasvatuk-siin käytetyillä agaralustoilla (28°C, 2 viikkoa)

Agaralusta NRRL 15389 5 Pablum Beige-värinen veg. Hiukan mustia itiöitä. Ei liukoista pigmenttiä Hiiva-Czapek Beige-värinen veg. Ei itiöitä.

Ei liukoista pigmenttiä.

Czapek Beige-värinen veg. Hiukan mustia 10 itiöitä. Ei liukoista pigmenttiä

Hiiva-dekstroosi Kellanruskea veg. Kohtalaisesti mustia itiöitä. Hiukan mustaa pigmenttiä.

Ravinto Veg. värittömästä kellanruskeaan.

15 Hiukan mustia itiöitä. Ei liukoista pigmenttiä

Ravinto-glyseroli Veg. värittömästä vaalean beige- väriseen. Ei mustia itiöitä. Ei liukoista pigmenttiä.

20 Bennetin dekstriini Veg. värittömästä beige-väriseen.

Hiukan mustia itiöitä. Hiukan ruu-sunpunertavanruskeaa pigmenttiä Glukoosi-asparagiini Veg. värittömästä vaalean oranssin- beige-väriseen. Ei itiöitä. Ei liu-25 koista pigmenttiä.

Veg. = vegetatiivinen rihmasto Taulukko C

NRRL-15839:n hiilihydraattien käyttö Arabinoosi + 30 Selluloosa

Fruktoosi +

Glukoosi +

Inositoli

Mannitoli 35 Raffinoosi ±

Ramnoosi + 13 86892

Sakkaroosi +

Ksyloosi +

Taulukko D

NRRL-15839:n fysiologiset reaktiot 5 Hydrolyysi:

Kaseiini +

Ksantiini

Hypoksantiini

Tyrosiini + 10 Adeniini

Gelatiini +

Perunatärkkelys +

Eskuliini +

Tuotto: 15 Nitraattireduktaasi +

Fosfataasi H

Ureaasi

Kasvu:

Salisiini 20 5 % NaCl

Lysotsyymiliemi Dekarboksylaatio:

Asetaatti +

Bentsoaatti 25 Sitraatti

Laktaatti Malaatti Mukaatti Oksalaatti 30 Propionaatti +

Pyruvaatti +

Sukkinaatti

Tartraatti 1 4 86892

Hapontuotto;

Adonitoli

Arabinoosi +

Sellobioosi + 5 Dekstriini +

Dulsitoli

Erytritoli

Fruktoosi +

Galaktoosi V

10 Glukoosi +

Glyseroli

Inositoli

Laktoosi

Maltoosi + 15 Mannitoli

Mannoosi + Q(-metyy li-D-glukosidi Melibioosi

Raffinoosi + 20 Ramnoosi +

Salisiini +

Sorbitoli

Sakkaroosi +

Trehaloosi + 25 Ksyloosi + /$-metyyli-D~ksylosidi Kasvu:

10°C

42°C + 30 45°C + + = positiivinen; - = negatiivinen; V = vaihteleva; H = heikko

Mutantin LL-E33288-R66, NRRL-15975:n johtaminen Pyrittäessä parantamaan fermentaatiosaantoja, alku-35 peräinen viljelmä LL-E33288 (NRRL 15839) maljattiin ja 50 is S 6 S 9 2 yksittäistä pesäkettä eristettiin. Nämä nimettiin NS1:stä NS50:een (NS = natural selection (luonnollinen valinta)).

Näiden eristettyjen kasvustojen fermentointi osoitti, että ne, jotka itiöivät kohtalaisesti, tuottivat parem-5 min LL-E33288-kompleksia. Tämän ryhmän edustajaksi valittiin eristetty kasvusto NS6.

Käyttäen eristettyä kasvustoa NS6, aloitusviljelmä-nä valmistettiin itiösuspensiot ja annettiin erilaisten mutageenien vaikuttaa niihin. Yksittäisiä pesäkkeitä eris-10 tettiin nitrosoguanidiinilla käsitellystä näytteestä, mutta minkään LL-E33288-kompleksin tuottokyky ei osoittautunut merkittävästi parantuneen. Seuranneesta ultravioletti-säteilykäsittelyn sarjasta saatiin yksittäisiä pesäkkeitä, joista eristetty kasvusto UV 610 valittiin suurisaantoise-15 na mutanttina. Eristetystä kasvustosta UV 610 tehtiin si-velyviljelmä ja siitä eristettiin edelleen kasvustot 1-7. Eristetty kasvusto UV 610(3) valittiin jatkotyöskentelyyn.

LL-E33288-kompleksin erittäin tehokkaiden antibak-teriaalisten ja antineoplastisten ominaisuuksien takia 20 on mahdollista, että kun tietty konsentraatio antibioottia on biosyntetoitu fermentaatiossa, se saattaa tulla tuottavalle viljelmälle toksiseksi/sitä inhiboivaksi. Siksi yritettiin eristää LL-E-33288-antibioottikompleksille resistenttejä kasvustoja.

25 UV(610(3):sta valmistettiin vegetatiivista kasvus toa käytettäväksi fermentaatiossa ja sitä siirrostettiin pulloon peptonia, dekstroosia, melassia ja vettä sisältävään alustaan. Alustaan lisättiin LL-E33288/3-| -Br konsentraatioon 8 ^rug/ml. Joukko maljauksia tehtiin tästä pullosta ja re-30 sistentti populaatio saatiin seitsemäntenä päivänä. Kaikkiaan 97 pesäkettä (Rl:stä R97:ään) eristettiin. Eristetty kasvusto R66 valittiin LL-E33288/¾^ -Br :n potentiaalisesti kehittyneenä tuottajana.

35 1, 86892 1 6

Mutatointivaiheet on esitetty kaavamaisesti alla.

E33288 (villi tyyppi) 5 I\1S6 (luonnollinen valinta) -NTG /1\JG1-NG12Q7 (nitrosoguanidiini) ^ q __—U\/ /LIV1-UV20Q7 (ultraviolettisäteily) -UV /UV201-UV40Q7 (ultraviolettisäteily) -UV /LIV401 -UV702f (ultraviolettisäteily) 15 i UV610(3) (edelleen eristetty kasvusto 3) ^Rlrstä R97:ään7 (resistentit pesäkkeet) 20 J, R66

Mutanttia R66 säilytetään viljelmäkokoelmassa, joka on osoitteessa Medical Research Division, American Cyanamid 25 Company, Pearl River, New York, viljelmänumeron ollessa LL-E33288 R66. Tämän uuden mikro-organismin elinkykyinen viljelmä on talletettu (Culture Collection Laboratory Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois) 6. kesäkuuta 1985 ja lisätty laitoksen 30 pysyvään kokoelmaan. Sille on annettu tämän talletuksen yhteydessä kantanimi NRRL 15975. Tämä viljelmä on kanta-nimellä NRRL 15975 tämän hakemuksen käsittelyaikana patentti- ja tavaramerkkivaltuutetun määräämän, lakien C.F.R. § 1.14 ja 35 U.S.C. § 122 siihen oikeuttaman henki-35 lön saatavissa ja kaikki tämän viljelmän julkisen saatavuuden 17 86892 rajoitukset poistetaan peruuttamattomasti, kun tälle hakemukselle myönnetään patentti.

Mitä morfologiaan tulee, NRRL-15975 muodostaa vähemmän itiöitä kuin NRRL-15839. MRRL-15975:n ja NRRL-15839:n 5 välinen vertailu on esitetty taulukossa DD.

NRRL-15839:llä ja NRRL-15975:llä on kemiallisesti sama kokosolu-sokerikoostumus (D-tyyppi; ksyloosia ja pieniä määriä arabinoosia). Kokosolun diaminopimeliinihappo-analyysi osoittaa, että 15975 ei muodosta meso-isomeeriä, 10 vaan ainoastaan 3-hydroksijohdannaista (NRRL-15839:ssä on molempia yhdisteitä). Tämä ei muuta kemotaksonomista määritystä .

Fysiologiset kokeet osoittavat, että NRRL-15839 ja NRRL-15975 poikkeavat toisistaan vain kahdessa fysiolo-15 gisessa reaktiossa (katso taulukkoa D). NRRL-15975 ei tuota nitraattireduktaasia ja käyttää laktaattia. NRRL-15839:n reaktiot olivat molemmissa kokeissa heikosti positiiviset, mutta se reagoi nyt negatiivisesti, kun sitä on säilytetty vinopinnoilla muutaman kuukauden ajan. Näitä ominaisuuksia 20 tulisi siten pitää tämän taksonomisen ryhmän osalta vaih-televina.

18 66892 e φ β *ηί e •Η ο Λ <0 (0 ο) φ x λ; β tn ιη β 0) β β :β > :β 0 X Μ Μ > ιη -Η > Μ ιη β β :β β -Μ :π3 •Η β β β -Ρ Λί ιη -Ρ

(OM «Η I—I M (0 M

Ρ β i—I Μ φ Ο β Pi Φ β Μ β α) φ μ ,* φ β μ φ Φ ιΠ Μ Λί Λί Μ Λί Pd-HrH^ > Μ φ Μ β β φ Μ -Η en φ β β^Φ 0X0 -Ρ βιη>ί ·Η Μ αχ: Μ * β Μ -Ρ φτ-ι tn en nj β(0π5β β β Φ tn tn φ β β μ φ β Φ

-Η β) θ' β β M M H 4J H H S

tn cd μ β (0 β > m tn β μ 5¾ ο (¾ φ -Η -Μ Μ -Η -Μ Μ -Η (0 >1 -Μ Μ φ β Φ φ -Η Μ Μ η 2 ΛΦΦ0ΦΦ0Φ>ΛΦΦ^ε>^ΦΦ ft 0 e ‘M g β M ϊ Φ O .3 β

Q Ε 2 O

Ω 5 8 3 o m ·Η X t"· - .Η X σ\ (0 Φ β m φ φ β ιι Μ τ- ,¾ χ ο 0 β tn tn β ·η en β ιΡ φ β β > ι—ι tn ξτ< Κ X M M tn ·η β « ιη β β β -Ρ ft ·* 2 β β (0 to X en -Ρ Μ Ο ι—I β Μ β β Ο ·0 (0 β -η Μ :β Μ :<0 Ο (0 ^ (0 X -Η -Γ-Ι (0 Μ φ Γβ φ,β Λί φβ ΦΜ -Ρ Μ (0 X :(0 X :<0 X X Μ ^ Φ -Μ β Μ ft > >-Η ιηβΐηβ

·· Φ β β Φ β Ρ II

m οι ^ ^ M -H·* X Μ - Μ M M I β tniO Dl Ο β β β β ft e» co Φ -h tn ·η ω -h β β ·η ίο -h en m in tn -p β-Ρ β-Ρ ·η μ-p μ -p r- τ— ή tn (dtn β tn > Min Mtn

φ β M M 0 M M β M >, M M φ β M φ β -H O

p j ΛεΦο£ΦοεΦ^α)ΦΛ;εο>Α:Εθ) -p «K tn « ps fttn fttn fttn fttn fttn fttn β

2 2 >intn>intn>tntn>tntn>cntn>tntn E

H

*H M

M β M M ·Η Φ M x tn m β

-Ρ Φ O O M

tn ft O M >

X ro M Φ M

Φ N -P tn M

t) u m >1 -p β ι x M (0 -Ρ β φ Φ tn -p tn m -p Ό ι Φ β -Ρ β I o o tn M -Ρ X 0 (0 -Ρ -Ρ Φ (0ΦΦ (Οβββ > M β ft > β M ·Η (0 β β Μ Μ > > ιι tn Φ ν ·η Φ β β emu-β ftp μ > 19 86892

Keksinnön mukaiselle menetelmälle LL-E33288-anti-bioottien valmistamiseksi on tunnusomaista, että fermentoi-daan aerobisesti mikro-organismia Micromonospora echinospora ssp. calichensis NRRL 15839 tai NRRL 15975 nestemäisessä 5 alustassa, jossa on assimiloituvia hiili-, typpi- ja bromi-tai jodilähteitä ja epäorgaanisia suoloja 24-32 °C:n lämpötilassa noin 90-200 tunnin ajan, kunnes alustan antibioot-tiaktiivisuus on huomattava ja kerätään liemi talteen ja erotetaan antibiootit kromatografisesti.

LL-E33288-komponenttien in vitro -antibakteriaalinen aktiivisuus määritettiin joukkoa gram-positiivisia ja gram-negatiivisia bakteereja vastaan normaalia agarlaimennus-menetelmää käyttäen. Puoliintuvin konsentraatioin antibiootteja sisältävää Mueller-Hinton-agaria kaadettiin pet- 1 c 4 -1-5 rimaljoille. Agarpinnoille siirrostettiin 1-5 x 10 pesäkettä muodostavaa bakteeriyksikköä "ohjaus"-replikaattoria käyttäen. LL-E33288 -komponentin pienin konsentraatio, joka inhiboi bakteerikannan kasvua noin 18 tunnin inkuboinnin jälkeen noin 35°C:ssa, merkittiin sen kannan minimi-inhibi-20 tiokonsentraatioksi (MIC). Tulosten yhteenveto on esitetty taulukossa III.

·—I

20 86892

I urtmLnurturtOOtncNmtrimcNCNO

ω Γ-1 CNCNCNCNCNcnirtiCNi—cCNCNCNi—ci-cO

^ ^ OOOOOOOOOOOOOOO

cn \_______ •h tr> , > υ η ε

•H

-*-1 "· tj ^ O oQ OcAinOOOOOurtO o urt tn urt

•Ο ·Η I mCNCNmmtnmmCNin U~> CN CN CN

C. 5 >~ OOOOOOOOOOOOOOO

a) o

β M

•H -U

Ή β____

rt) <D

rd cn •H β >-l o 0) M I-* -P O l OurttnoOOcntno o O to tn m M -rt ι-h tncNCNtninincNCNtn m tn cn cn cn Π} 4-) CQ — — - -..-1.1. —

Λ Ή OOOOOOOOOoOOOOO

•H Λ -P -rt β X,____— cd β---- ~ ’

M l -H

H 1

HO H

V) rt l_i O -P -H (O in cn cn m cn m cn cn m n cm cm -rt β 1 CN.—li—icni—itncNi—1«—itncNi—ΐι-ιο·—<

Ai > -H i-ι

β g cn OOOOOOOOOOOOOOO

Γ-Ι β I

β -H - EH β 0)

•H

-P C" JJ Oi rt Σ cn Q) O Ό CN P*. CN O' rt i—i i σ' ό <r <r cn ό oo oo m oo σ'

O I »O tO 1 / s | —J" I Oi rrt I —C t—ι I

o. >T<-HCN<rOiO‘icoSicoooirt'i g oo cn ooSoomoo-—'mooimooco n U'-'cxo oo cn oo oo

H CJ-CJUOCJtnOooO

7 ςοηςος:οςοοος οςο oJj CJZ<<_><U<-cCJUi-rtC>A2 — CJ>-< oo

CN

O

ro W cn Λ π <υ <u H rt Cd (U C -rt w -rt C *r-4 QJ C/5 · rH »pH ^ 5 β O 0C C -rt 4_l CO Ό rt o !0 O <U C U ρ C · · β -rt s : O P CJ 00030.0.

fd .—c O I—C CU 01 öC 3 > OI CO CO

cn o : : <u uoaj: i-14-i ti t_i *-< CJ C CJ O CO TJ cm p O o| o p ε ai

O CU O O P 4J

rt o 4J E O 'rt <U CJ

JZ r—i CJ I—C CJ Aj o

CJ r—c O O ·—' C CJ jQ

•rt CU JO -rt CU CU O O

P -rt 0:4-1 COJ3 4-1 ;

<U : : c/i: p o o ·ρ o : OJ

-C -O cu o : oc > p c CJ <U 4-1 p t. O 4-1 -rt co .—e c ai op ^ o w ^2 ω co s: &. o < 21 86892

γΗρ-Ηγ-Ηγ—«ι—tr—rH f-H

cocococococorocoeo n n rt

OOOOOOOOOOOi—lOO i_ OOOOOOOOOrt-OOO

l mcMOOOOOOOOOOOOO

f-t csji—iOOOOOOOOOOOOO

ooooooooooooooo 'g _VI VI VI vl vl VI VI V1 vl_—ϋ!-

tn r—It—II—I »—IrHi—It—li—If—I p—li—Ir—I

ϋ corocotocococococo co co co g ooooooooo o o o

μ I OOOOOOOOOCNiOOO

a ] οοοοοοοσοονοοοο

o I I urtOOOOOOOOOOOOO

•H f-H — - «- - - *-

_p I-IOOOOOOOOOOOOOO

(Ö V|V|V|V|V|V|V|V|V| v v i v i Π3 M , _ -P_________ d

n] i-^ l-H p—I 1-^ l-H I—I i—I I—I Γ-H r—I f—I

m cocococococorocoeo m rt rt

d OOOOOOOOO 1-hOO

o ' l-ι OOOOOOOOOriOOO

M l ourtOOOOOOOOOrOOOO

o »-h incNOOOOOOOOOOOOO

I CD.

4J OOOOOOOOOOOOOOO

Vi VI VI VI VI VI vl Vl vl VI VI

— Λ (Ö -H _____— o x;----- .5 ιηιηιηιηιηιηυ-ιιη mmm

Il , ιλννννννννοονιμν

,Ζ, ' u CNOOOOOOOOmOOO

Ξ aa mooooooooooooo

.q | mc>JOOOOOOOOOOOOO

h -H “ o" O o" OOOOOOOOOOOO

H g V|V|V|V|V|V|V|V|V| vivivi O , li I...I 111 λ; d

2 o, crt CO CO oo CNI

S Svn r-tCVIOtO<J-p^COCMCOi—I

H w 00 (OOiNMNrtHNinNH

* I tn.....CM I ON O

; nJIN CNCNCSCSCMCvICOi—ICOCSIO

I JZ 00 00 00 OO OO OO OO I—I

<r o jj CJ i O O O

ιο-ουοοουοοουοι-'ο esi h Ecnf-cncnooen^HSHcjH

rHCCDCO<COCOCOCOCJ<0<&,< en

•rH

•o Ή ·γη S «o E vi

CO co C/} U

H 0 3 O) I *-H

C C<U Ό CO

rö ·ιη μιίΐιιι;··-' O en Öi ÖC I 3 Q. QJ D C/l

Di 3 ca <u . co ai •o

O n Q, U-l iJ i—I

4i en co en 3 **-* CO 3 3 C/5 I—I J-l

O ej en 3 -O

en υ υ 3 υ en 3 eo o o u cj 3 tn cu u u O u OO o o o o tn g .—i:;:;::·—·: ej O O 3 O >\ >1 O -CJ CJ I—' T3 Z JC JZ U Ci. O <—1

O Q. Q. CU β) P ,|H

<U CO CO 4-1 U U O

en 4_) 4-1 e J-1 · O eo

ei* en en cu en Σ cQ

22 86892

Eräät yhdisteiden kasvaintenvastaiseen käyttöön soveltuvuutta testaavat in vivo -koejärjestelmät ja -käytännöt on kehittänyt National Cancer Institute. Ne on selostettu sarjassa "Cancer Chemotherapy Reports", Part III, Voi.

5 3, nro 2 (1972), Geran et ai. Nämä menetelmät ovat vakiin nuttaneet standardoidut seulontatestit, joita noudatetaan yleisesti kasvaimia ehkäiseviä aineita testattaessa. Näistä järjestelmistä lymfosyyttileukemia P388, melanoottinen melanooma B16, leukemia L1210 ja paksunsuolen rauhassyöpä 10 26 ovat erityisen merkittäviä tämän keksinnön kannalta.

Näitä kasvaimia käytetään testauksessa hiirten siirrettävinä kasvaimina. Merkittävä kasvaimia ehkäisevä aktiivisuus, joka esitetään näissä menetelmissä käsiteltyjen eläinten keskimääräisen elinajan prosentuaalisena kasvuna kont-15 rollieläimiin (C) verrattuna, viittaa yleensä samanlaisiin tuloksiin ihmisen leukemioiden ja kiinteiden kasvainten hoidossa.

Lymfosyyttileukemia P388 -testi

Kokeessa käytetyt eläimet olivat kaikki samaa suku-20 puolta olevia BDF^-hiiriä, jotka painoivat vähintään 17 g ja joiden painon vaihteluväli oli 3 g. Testiryhmässä oli viisi tai kuusi hiirtä. Kasvain siirrettiin injektoimalla g 0,5 ml 10 lymfosyyttileukemia P388 -solua sisältävää laimeaa vesivatsanestettä intraperitoneaalitilaan. LL-E33288-25 antibiootteja testattiin P388-järjestelmässä käyttämällä sekä yksittäisiä /^-Br ja -Br-komponentteja että kaikkien komponenttien muodostamaa kompleksia (bromikompleksia). Testattavia yhdisteitä annettiin intraperitoneaalisesti 0,5 ml tilavuisina annoksina liuotettuna normaaliin suola-30 liuokseen, jossa oli 0,2 % Klucel'ia 1., 5. ja 9. päivänä (kasvaimen siirtämisestä laskettuna) esitettyä annostusta käyttäen. Hiiret punnittiin ja henkiinjääneet merkittiin muistiin säännöllisesti 30 päivän ajan. Elossapysymisajan mediaani ja käsiteltyjen eläinten (T) ja vertailueläinten 35 (c) elossapysymisajan välinen suhde laskettiin. Positii vinen kontrolliyhdiste oli Cisplatin, jota annettiin 23 86892 injektoimalla intraperitoneaalisesti 0,5 ml liuosta, jossa oli 0,2 % Klucel'ia ja esitettyjä annoksia kontrolliyhdistettä 1., 5. ja 9. päivänä. Tulokset ovat taulukossa IV.

5 Jos T/C X 100 % on 125 tai suurempi, testatulla yh disteellä katsotaan olevan merkittävä kasvaimia ehkäisevä vaikutus.

Taulukko IV

Lymfosyyttileukemia P388 -testi 10 -----

Elossapv

Annos sym.ajan T/c χ lQ0

YhJi<5l. mediaani x tuu

Yhdiste (mg/kg) (pv) (%) LL-E33288 3,2 16,5 156 (bromikomoleksi) 1»6 17.5 165 15 ‘ 0,8 18 5 175 0,4 19 179 0,2 16,5 156

Kontrolli ~ 10,6 20 ...

Positiivinen 1,0 21,5 203 kontrolli 0,25 15 142 0,06 14,5 137 LL-E-33288S1-Br 0,4 13 105 0,2 18 145 25 0,1 19 153 0,05 17 5 141 0,025 18 145 0,012 14 113

Kontrolli - 12,4 30

Positiivinen 1,0 25,5 206 kontrolli 0,4 19 153 0,06 15 121 24 86892

Taulukko IV (jatkoa)

Elossapy -

Yhdiste Annos sym.ajan x iqO

(mg/kg) mediaani (%) 5___(pv)___ LL-E33288vn-Br 0,2 L4 113 01 21 169 0,05 19,5 157 0,025 18 145 0,012 14,5 117 10

Kontrolli _ L2 4

Positiivinen 1,0 25,5 206 kontrolli 0,4 19 153 0,06 15 121 15 ____

Melanoottinen melanooma B16

Kokeessa käytetyt eläimet olivat kaikki samaa sukupuolta olevia BDF^-hiiriä, jotka painoivat vähintään 17 g 20 ja joiden painon vaihteluväli oli 3 g. Testiryhmässä on tavallisesti kuusi eläintä. 1 g melanoottista melanooma B16 -kasvainta homogenoitiin 10 ml:aan kylmää tasapainotettua suolaliuosta ja 0,5 ml annos homogenaattia siirrettiin intraperitoneaalisesti kaikkiin koehiiriin. LL-E33288-25 antibiootteja testattiin B16-järjestelmässä käyttämällä sekä yksittäisiä /3^-Br- ja -Br-komponentteja että kaikkien komponenttien muodostamaa kompleksia (bromikomplek-sia). Testattavia yhdisteitä annettiin intraperitoneaalisesti päivittäin ensimmäisestä yhdeksänteen päivään (kas-30 vaimen siirtämisestä laskettuna) eri annoksia. Hiiret punnittiin ja henkiinjääneet merkittiin muistiin säännöllisesti 60 päivän ajan. Elossapysymisajan mediaani ja käsiteltyjen eläinten (T) ja vertailueläinten (C) elossapysymisajan välinen suhde laskettiin. Positiiviset kontrolli-35 yhdisteet olivat Cisplatin ja Adriamycin. Tämän testin tulokset ovat taulukossa V. Jos T/C X 100 (%) on 125 tai 25 86892 tai suurempi, testatulla yhdisteellä katsotaan olevan merkittävä kasvaimia ehkäisevä vaikutus.

Taulukko V

Melanoottinen melanooma B16 -testi 5 ------

Elossapy -

Yhdiste Annos sym.ajan T/c χ 100 (mg/kg) (%) LL-E33288 0,8 30 188 10 (bromikompleksi) 0,4 29.5 184 0,2 27 169 °,1 24 150

Kontrolli ., 1 o — 15 Cisplatin 0 4 25 156 °T2 25 156 0,1 23 144 0,05 21,5 134 LL-E332886!-Br 0,05 32 168 20 0,025 33,5 176 0,0125 32 168

Kontrolli _ 25

Adriamycin 0,8 >60 > 316 0,4 >60 7 316 30 ________ 26 86892

Taulukko v (jatkoa)

Elossapyl-

Annos sym.ajanT/c χ 100 (mg/kg) mediaani (%) 5___________ LL-E3 32HBM-Br 0 05 33,5 176 0,025 | 30 159 0,0125! 37 195 10

Kontrolli - 19 15

Adriamycin 0,8 >60 > 316 0,4 >· 60 >316 20

Lymfosyyttileukemia L1210 -testi

Kokeessa käytetyt eläimet olivat kaikki samaa sukupuolta olevia BDF^-hiiriä, jotka painoivat vähintään 17 g ja joiden painon vaihteluväli oli 3 g. Kussakin testiryh-25 mässä oli kuusi hiirtä ja kontrolliryhmissä 18. Kasvain siirrettiin injektoimalla intraperitoneaalisesti 0,5 ml 10 lymfosyyttileukemia Ll210-solua sisältävää liuosta kuhunkin hiireen. LL-E33288-antibiootteja testattiin L1210-jär jestelmässä käyttämällä sekä yksittäistä /3^-Br-kompo-nenttia että kaikkien komponenttien muodostamaa kompleksia (bromikompleksia). Testattavia yhdisteitä annettiin 1., 5. ja 9. päivänä tai päivittäin yhdestä yhdeksänteen päivään (kasvaimen siirtämisestä laskettuna) eri annoksia. Hiiret punnittiin ja henkiinjääneet merkittiin muistiin säännölli-35 sesti 30 päivän ajan. Elossapysymisajän mediaani ja käsiteltyjen eläinten (T) ja vertailueläinten elossapysymisajän 27 86892

välinen suhde laskettiin. Positiivinen kontrolliyhdiste oli 1 ,4 dihydroksi-5, 8-bis//2-(2-hydroksietyyliamino) etyylijami-noj antrakinonidihydrokloridi tai "Cisplatin", joita annettiin esitettyjä annoksia. Tulokset ovat taulukossa VI. Jos 5 T/C X 100 (%) on 125 tai suurempi, testatulla yhdisteellä katsotaan olevan merkittävä kasvaimia ehkäisevä vaikutus. Taulukko VI

Lymfosyyttileukemia L1210 -testi 10 Elossapy-[

Annos syn.ajan

Yhdiste . .. , mediaani ' , (mg/kg) (pv) (%) LL-E33288 1.5 29 174 -1 3 0 8 28,5 171 15 (bromikorr.pl.) „<, 22 5 135 0,2 22,5 135

Kontrolli - 16,7

Antrakinoni 1.6 30 180 20 0.8 30 180 0,4 30 180 LL-E33288gi-Br 0,2 11,3 136 0,1 11,4 137 0 05 11 133 25 0,025 nr3 136

Kontrolli - 8,3

Cisplatin 5 7,5 90 ,rt 2,5 12 145 30 1,25 11 133 28 8 6 8 9 2

Paksusuolen rauhassyöpä 26 -testi

Kokeessa käytetyt eläimet olivat CD2F^-naarasrottia, jotka painoivat vähintään 17 g ja joiden painon vaihteluväli oli 3 g. Testiryhmässä oli viisi tai kuusi hiirtä ja 5 kussakin kokeessa kolme viiden tai kuuden eläimen ryhmää, joita käytettiin käsittelemättöminä vertailuryhminä. Kasvain siirrettiin intraperitoneaalisesti (tai ihonalaisesti) injektoimalla 0,5 ml liuosta, jossa oli 2 % paksunsuolen kasvaimen 26 kudosta ja antibiootteja Eaglen MEM-mediumis-10 sa. LL-E33288-antibiootteja testattiin paksusuoli 26 -järjestelmässä käyttämällä kaikkien komponenttien muodostamaa kompleksia (bromikompleksia). Testattavia yhdisteitä annettiin intraperitoneaalisesti 1., 5. ja 9. päivänä (kasvaimen siirtämisestä laskettuna). Hiiret punnittiin ja kuolleet 15 kirjattiin säännöllisesti 30 päivän ajan. Elossapysymisajan mediaani laskettiin käsitellyille (T) ja kontrollieläimille (C). Positiivinen kontrolliyhdiste oli Cisplatin. Tulokset ovat taulukossa VII. Jos T/C X 100 {%) on 130 tai suurempi, testatulla yhdisteellä katsotaan olevan merkittävä kasvai-20 mia ehkäisevä vaikutus.

Taulukko VII

Paksunsuolen rauhassyöpä 26 -testi

Elossapy- sym.ajan .·. 25 Yhdiste Annos mediaani T/C * 100 ; (mg/kg) (pv) ( l) LL-E3 3288 1,5 39,5 212 •' (bromikompl.) ® r ® 3 ^, 5 ^ 7 ^ ^ 0,4 34 183 0,2 25,5 137 30 ' }

Kontrolli - 18,6

Positiivinen 1 29 156 kontrolli 0,5 38,5 207 35 0,25 I 37,5 202 29 86892

Sarkooma M5076

Retikulaarisolusarkoomaa M5076 levitetään ihonalaisina siirroksina C57B2/6-naarasrottiin. Kasvaimia ehkäisevää vaikutusta tutkittaessa jompaakumpaa sukupuolta ole-5 viin BDF-hiiriin siirrostettiin intraperitoneaalisesti 0,5 ml liuosta, jossa oli 10 % kasvainkudosta. LL-33288-antibiootteja testattiin M5076-järjestelmässä käyttämällä kaikkien komponenttien muodostamaa kompleksia (bromikomp-leksia). Testattavia yhdisteitä annettiin intraperitoneaa-10 lisesti 1., 5., 9., 13. ja 17. päivänä kasvaimen siirrosta (päivänä nolla) lukien. Kutakin lääkeannosta vastaava elossapysymisajän mediaani määritettiin ja käsiteltyjen eläinten (T) ja kontrollieläinten (C) elossapysymisajan välinen suhde laskettiin.

15 Tämän testin tulokset ovat taulukossa VIII, vertai luna Cisplatin1illa saadut tulokset. Jos T/C X 100 (%) on 125 tai suurempi, testatulla yhdisteellä katsotaan olevan merkittävä kasvaimia ehkäisevä vaikutus.

Taulukko VIII 20 Sarkooma M5076

Elossapy- " * sym.ajan , ,

Yhdiste ^nno® mediaani T/c x 100 (mg/kg) (pv) (%) - 25 LL-E3 3288 1 , 5 50 175 (bromikompl.) I ^ l·75 I 0)4 39,5 139

Kontrolli I 28 5 30

Cisplatin I 30 105 0?5 44,5 156 0,25 45 ; 158 _I_L__i_ 3o 86892

Seuraavien jodikomponenttien antineoplastinen aktiivisuus testattiin samalla tavoin.

Taulukko IX

Lymfosyyttileukemia P388 -testi 5 __[___

Elossapy-

Annos sym.ajan If/c x 100 Yhdiste (mg/kg) mediaani (%) ___(pv)__ LL-E33288 γΐ-1 r005 >25r5 >196 ,λ 4. 4.·, ,0025 22 169 1° (1. testi) 00125 18.5 142 ,0006 18' 138 ,0003 15.5 119 ,00015 15 115

Kontrolli - 13 15

Positiivinen kontrolli

Novantrone®1 1,6 22,5 173 20 LL-E33288 y\-I ,01 11 100 (2 testi) ’°05 18 164 ' 1 ' ,0025 22,5 205 ,00125 18,5 168 25 ,0006 16 145 ,0003 14 127 ,00015 14 127

Kontrolli 11 30 Positiivinen kontrolli

Novantrone® 1,6 19 173 0,8 16 145 1,4 -dihydroksi-5,8-bis4.V2- (2-hydroksietyyliamino) etyy-li_7amino7 antrakinoni-2HCl 35

Taulukko X

Melanoottinen melanooma B16 -testi 31 86892

Elossapy-

Annos sym.ajan T/C x 100 5 Yhdiste (mg/kg) mediaani (¾) ___(pv)__ LL-E33288 γi-I ,0025 26,5 156 ,00125 27 159 ,0006 42,5 250 ,0003 35,5 209 10 ,00015 33,5 197 ,00007 30,5 179

Kontrolli

Adriamycin 0,8 48 282 15 04 40 235 0,2 34f 5 203

Taulukko XI

Lymfosyyttileukemia L1210 -testi 32 86 8 9 2

Elossapy- 5 ν}ΐί1.·ς1.ρ Annos syin. a jän T/C x 100 (mg/kg) mediaani (%) _____(pv)__ LL-E33288 γ^Ι 01 8 89 ,005 14 156 ,0025 11 122 in ,0012 10,5 117 Ίυ ,0006 10 111

Kontrolli _ 9

Positiivinen kontrolli 15 Novantrone® 3,2 15 167 1,6 11 5 128 0,8 12 133 0,4 11 122 20

Taulukko XII

Paksusuolen rauhassyöpä 26 -testi 33 86892

Elossapy-

Annos sym.ajan t/C x 100 5 Yndiste (mg/kg) mediaani (%) _________(pv)__ LL-E33288 ϊ}-1 ,01 11 59 ,005 25,5 138 ,0025 27 146 ,00125 22,5 122 \0006 23,5 127 10 0003 20 108 ,00015 17 5 95 ,00007 17 92

Kontrolli - 18,5

Positiivinen kontrolli

Cisplatin 2 15,5 84 1 27,5 149 0,5 23,5 127 20 Yleiset fermentaatio-olosuhteet

Micromonospora echinospora NRRL 15839:ää tai NRRL 15975:ttä voidaan kasvattaa useissa erilaisissa nestemäisissä viljelyalustoissa. Alustoissa, jotka ovat käyttökel-poisia näiden uusien antibakteriaalisten ja kasvaimia eh-25 käisevien aineiden tuottamiseen, on assimiloituvaa hiili-lähdettä, kuten esimerkiksi tärkkelystä, sokeria, melassia, : ' glyserolia jne.; assimiloituvaa typpilähdettä, kuten esi merkiksi proteiinia, proteiinihydrolysaattia, polypeptide-jä, aminohappoja, maissin liotusvettä jne.; ja epäorgaani-30 siä anioneja ja kationeja, kuten esimerkiksi kalium-, natrium-, ammonium-, kalsium-, sulfaatti-, karbonaatti-, fosfaatti-, kloridi-ioneja jne.; ja joko bromi- (natriumbro-: : midia) tai jodilähdettä (kaliumjodidia). Hivenaineita, ku- ten esimerkiksi booria, molybdeeniä, kuparia jne. tulee mu-35 kaan alustojen muiden aineosien epäpuhtauksina. Säiliöitä ja pulloja ilmastetaan pakottamalla steriiliä ilmaa 34 ö 6 8 9 2 fermentaatioliemen pinnalle tai sen läpi. Säiliöitä sekoitetaan lisäksi mekaanisesti. Vaahdonestoainetta, kuten esimerkiksi silikonia, voidaan lisätä tarpeen mukaan.

Yleinen menettelytapa LL-E33288-antibioottien eris- 5 tämiseksi ja erottamiseksi_ LL-E33288-antibiootit kerätään talteen fermentaatio-liemestä uuttamalla sitä orgaanisella liuottimena, kuten esimerkiksi etyyliasetaatilla tai dikloorimetaanilla. Orgaanisessa uutteessa olevaa antibioottikompleksia puhdistetaan 10 edelleen keveissä hiilivedyissä tehtävän selektiivisen saostuksen avulla. Siten saatua raakaa LL-E33288-antibioot-tikompleksia puhdistetaan edelleen ja se jaetaan yksittäisiin komponentteihinsa sarjalla pylväskromatografia-ajoja, joissa käytetään silikageeliä, Sephadex®LH-20:ta (Pharmacia 15 Fine Chemicals) ja C^g-sidottua silikaa.

Keksintöä kuvaillaan yksityiskohtaisemmin seuraavien ei-rajoittavien spesifisten esimerkkien yhteydessä.

Esimerkki 1 Siirroksen valmistus 20 Tyypillinen primäärisiirroksen kasvatukseen käytetty alusta valmistettiin seuraavan kaavan mukaisesti: Naudanlihauute noin 0,3 %

Tryptoni noin 0,5 %

Dekstroosi noin 0,5 % 25 Dekstriini noin 2,4 %

Kalsiumkarbonaatti noin 0,4 %

Hiivauute noin 0,5 %

Vesi qs 100 %:iin Tämän alustan pH säädettiin 7,0:aan ja steriloitiin 30 sen jälkeen. Pulloon, jossa oli 100 ml erä tätä steriiliä alustaa, siirrostettiin NRRL 15839 -viljelmän pakastettua myseeliä. Siirrostuksen jälkeen liemi pantiin pyörivään ravistelijaan ja sitä sekoitettiin tehokkaasti 48 tunnin ajan 32°C:ssa. Tämä inkuboitu alusta siirrostettiin sitten 35 14 1 fermentoriin 10 litraan yllä esitettyä steriiliä alus taa. Tätä alustaa inkuboitiin sekoittaen 32°C:ssa ,κ 86892 όο 48 tunnin ajan ja näin saatiin sekundäärisiirros. Tämä se-kundäärisiirros siirrettiin sitten säiliöön 300 litraan yllä esitettyä steriiliä alustaa, jota inkuboitiin 48 tuntia 30°C:ssa sekoittaen sekoittimen kierrosnopeuden ollessa -1 5 180-200 min ja näin saatiin tertiääri- eli siemensnrros.

Esimerkki 2 Säiliöfermentaatio

Fermentaatioalusta valmistettiin seuraavan kaavion mukaisesti: 10 Dekstroosi noin 0,5 %

Sakkaroosi noin 1,5 %

Peptoni, bakteriologista laatua noin 0,2 %

Dikaliumvetyfosfaatti noin 0,01 %

Melassi noin 0,5 % 15 Kalsiumkarbonaatti noin 0,5 %

Bromi- tai jodilähde vähäisiä määriä

Vesi qs 100 %:iin 2 800 1 erä yllä esitettyä alustaa steriloitiin ja siihen siirrostettiin 30 litraa tertiääri-(siemen-)siirros-20 ta, joka oli valmistettu esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Lientä ilmastettiin steriilin ilman syöttönopeuden ollessa 0,53 1/1 lientä ja sekoitettiin sekoittimen kierrosnopeuden ollessa 110 min . Lämpötila pidettiin noin 28°C:ssa ja fermentaatio päätettiin noin 97 tunnin kuluttua, jolloin 25 liemi kerättiin talteen.

LL-E33288-antibioottien tuottoa fermentaation aikana tarkkailtiin määrittämällä antibakteriaalinen aktiivisuus, tekemällä biokemiallisia induktiokokeita ja TLC- ja HPLC-analyysejä.

30 Koko talteen kerätyn liemen pH säädettiin kuuteen ja sitä uutettiin sitten etyyliasetaatilla, jota oli puolet liemen tilavuudesta. Etyyliasetaattiuute konsentroitiin siirapiksi, jota pestiin kahdesti heksaanilla ja suodatettiin piimään läpi. Piimaakakku sekoitettiin perusteellises-35 ti etyyliasetaatilla ja seos suodatettiin. Suodos konsentroitiin 3 1 tilavuuteen, kuivattiin vedettömän natriumsulfaat- 36 86892 tiylimäärän päällä ja saostettiin sitten lisäämällä heksaa-nia, jolloin saatiin noin 26,7 g raakaa LL-E33288-komplek-sia.

Esimerkki 3 5 LL-E33288ctj-Br :n, O^-Brin, OC3~Br:n jaO(4~Br:n erot taminen LL-E33288/3.J-Br:stä, /^-Bristä jay^-Brcstä

Esimerkin 2 noin 26,7 g painava raaka LL-E33288-kompleksi (bromikompleksi) jaettiin tasan kolmeen erään ja kromatografoitiin kolmella erillisellä 2,4 x 110 cm:n si-10 likageelikolonnilla (Silica Woelm^, 32-63 ^um, Woelm

Pharma), joka oli pakattu ja tasapainotettu 0,1 M kaliumdi-vetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetyllä etyyliasetaatilla. Kolonneja eluoitiin ensin samalla liuottimena virtausnopeuden ollessa 3 ml/min 18 tunnin ajan ja kerättiin 18 15 ml:n fraktioita. Eluentti vaihdettiin asetaattirmetanoli-seokseksi (95:5) ja eluointia jatkettiin kahdeksan tunnin ajan. Fraktiot analysoitiin modifioitua biokemiallista in-duktiokoetta (BIA) käyttäen. Positiiviset fraktiot analysoitiin TLCrllä käyttäen silikageeli 60:llä esipäällystet-20 tyjä levyjä ja kehitettiin liuotinjärjestelmällä, jossa oli 3 % isopropanolia 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetyssä etyyliasetaatissa ja detektoitiin bioauto-grafisesti modifioitua BIA:ta käyttäen.

Kolmesta kolonnista saadut LL-E33288cC|-Br, Q^-Br, 25 O^-Br ja OC^-Br sisältävät fraktiot (LL-E332880C-Br-komplek-sit) yhdistettiin, konsentroitiin kuiviin ja jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin pienellä verimäärällä. Etyyliasetaattiliuos kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja saostettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin 30 saatiin noin 4,2 g raakaa LL-E3328806-Br-kompleksia.

Kolmesta kolonnista saadut LL-E33288/Jj-Br, /^-Br ja r^Br sisältävät fraktiot (/*-Br:n sisältävä LL-E33288^-Br-kompleksi) yhdistettiin ja niitä käsiteltiin yllä esitetyllä tavalla, jolloin saatiin noin 2,0 g raakaa Y^-Br:n si-35 sältavää LL-E33288//J-Br-kompleksia.

86892

Esimerkki 4 LL-E33288/J.J -Br :n ja LL-E33288yi-Br :n eristäminen

Noin 1,9 gai näyte esimerkin 3 Y-Br sisältävää LL-E33288/J-Br-kompleksia kromatografoitiin 25 x 10 cm 5 Sephadex®LH-20-kolonnilla, joka oli tasapainotettu meta-noli:vesi-seoksella (90:10) virtausnopeuden ollessa 1,2 ml/ min ja kerättiin 15 ml:n fraktioita. Fraktiot analysoitiin BIA:ta käyttäen ja aktiiviset näytteet analysoitiin TLC:llä edellä esitettyyn tapaan. Fraktiot 21-26, jotka sisälsivät 10 suurimman osan LL-E33288/3i|-Br: stä, /3^-Brrstä ja y^-Brrstä, yhdistettiin ja konsentroitiin metanolin poistamiseksi ja saatu vesiseos lyofilisoitiin, jolloin saatiin noin 435 mg osittain puhdistettua kompleksia, jossa oli noin 10 % LL-E33288/31-Br:sta, 1 % LL-E33288/32~Br: sta ja 4 % LL-E33288y1-15 Br:sta.

Yllä mainittu osittain puhdistettu γ-Br sisältävä LL-E33288/3~Br-kompleksi jaettiin tasan kahteen osaan ja kromatografoitiin kahdella 1,5 - 100 cm silikageelikolon-nilla (Kiesel Gel 60, 40-63^um, EM Products for chromato-20 graphy), joka oli pakattu ja tasapainotettu etyyliasetaatti :metanoli-seoksella (98:2) virtausnopeuden ollessa 1 ml/ min ja kerättiin 12 ml:n fraktioita. Fraktiot tutkittiin ja analysoitiin TLC:llä edellä esitettyyn tapaan ja pääasiassa LL-E33288/J^-Br sisältävät yhdistettiin, konsentroitiin ja 25 saostettiin heksaanista, jolloin saatiin noin 26 mg 80-%:isesti puhdasta LL-E33288/S^-Br. LL-E33288y1-Br sisältävät fraktiot (jotka erottuvat juuri LL-E33288/3^-Br:n jälkeen) yhdistettiin ja käsiteltiin, jolloin saatiin noin 4,5 mg 30-%risesti puhdasta LL-E33288y1-Br. Joitakin LL-30 E33288/&2-Br sisältäviä fraktioita (jotka erottuvat juuri ennen LL-E33288/3^-Br) yhdistettiin ja käsiteltiin, jolloin saatiin vähäinen määrä LL-E3 3 2 8 8/32-Br.

Esimerkki 5 LL-E33288/3^-Br :n lopullinen puhdistus 35 Esimerkin 4 noin 26 mg painava erä 80-%risesti puh dasta LL-E33288/3^-Br yhdistettiin muiden muista samanlai- 86892 38 sissa olosuhteissa toteutetuista fermentaatioista saatujen yhtä puhtaiden LL-E33288/J^-Br-näytteiden kanssa. Noin 38 mg kokonaismäärä tätä yhdistelmä-^ “Br puhdistettiin edelleen preparatiivisella käänteisfaasi-TLC:llä käyttäen Whatman 5 PLKC^gF-, 100 yum:n esipäällystettyjä TLC-levyjä, jotka kehitettiin metanoli:0,1 M ammoniumasetaattipuskuri -seoksella pH 4,0:ssa (90:10). LL-E33288/3^-Br sisältävä juova, joka kromatografoituu R^-arvoa 0,66 vastaavaan kohtaan ja joka tehtiin näkyväksi sammutusefektin avulla lyhytaalto-10 UV-lampun (254 nm) valossa, poistettiin ja antibiootti erotettiin adsorbentistä pesemällä isopropyylialkoholin 10-%:isella etyyliasetaattiliuoksella, joka oli kyllästetty 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella. Liuos konsentroitiin ja jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja 15 pestiin pienellä vesimäärällä. LL-E33288^-Br sisältävä orgaaninen liuos käsiteltiin edellä esitetyllä tavalla, jolloin saatiin noin 24,5 mg 90-%risesti puhdasta LL-E33288/3^-Br. Tätä näytettä puhdistettiin edelleen preparatiivisella silikageeli-TLC:llä (Silica Gel GFrllä esipääl-20 lystetyt levyt, 1 000 ^um, Analtech), jotka kehitettiin isopropyylialkoholin 3-%:isella etyyliasetaattiliuoksella, joka oli kyllästetty 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella. Tärkein lyhytaalto-UV-lampun valossa (254 nm) näkyvä sammutusjuova, joka kromatografoituu Rf-arvoa 0,7 vas-25 taavaan kohtaan, poistettiin ja antibiootti erotettiin adsorbentistä dikloorimetaani:metanoli-seoksella (80:20). LL-E33288/^-Br sisältävää orgaanista liuosta käsiteltiin edellä esitetyllä tavalla, jolloin saatiin noin 18,8 mg olennaisesti puhdasta LL-E33288^ -Br.

30 Esimerkki 6 LL-E33288y^ -Br:n lopullinen puhdistaminen Esimerkin 4 noin 4,5 mg painava erä 30-%risesti puhdasta LL-E33288V1-Br yhdistettiin muiden muista samanlaisissa olosuhteissa toteutetuista fermentaatioista saatujen yh-35 tä puhtaiden LL-E33288y^-Br-näytteiden kanssa. 18 mg kokonaismäärä tätä yhdistenäytettä puhdistettiin edelleen 39 86892 preparatiivisella silikageeli-TLC:llä (Silica Gel GF:llä esipäällystetyt kartiolevyt, Analtech), joka kehitettiin isopropyylialkoholin 2-%:isella etyyliasetaattiliuoksella, joka oli kyllästetty 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuok-5 sella. Tärkein lyhytaalto-UV-lampun valossa (254 nm) näkyvä sammutusjuova, joka kromatografoituu R^-arvoa 0,5 vastaavaan kohtaan, poistettiin ja sitä käsiteltiin edellä esitettyyn tapaan, jolloin saatiin noin 4,3 g olennaisesti puhdasta LL-E3 3288y^ -Br.

10 Edullinen fermentaatioalusta LL-E33288-bromikomplek- sin tuottamiseen on seuraava:

Aineosa Prosenttia

Sakkaroosi 2,0

Rautasulfaattiheptahydraatti 0,01 15 Magnesiumsulfaattiheptahydraatti 0,02

Kalsiumkarbonaatti 0,5

Peptoni 0,2

Melassi 0,5

Natriumbromidi 0,05 20 Vesi qs 100:aan

Jodin lisääminen fermentaatioon kaliumjodidina tuotti kuitenkin olennaisia parannuksia: 1) edistämällä huomattavasti vegetatiivista kasvua fermentaatiossa; 25 2) kasvattamalla inhibitiovyöhykkeitä Escherichia colia # 300 ja Bacillus subtilista # 308 vastaan tehdyissä biotesteissä; 3) Tuottamalla huomattavaa aktiivisuutta LL-E3 3288/3^ -Br ja y-I vastaaville R^-kohdille TLC-levyillä tehdyssä bio- 30 autografiässä; ja 4) edistämällä muiden komponenttien TLC:llä detek-toitua tuottoa.

Seuraavat kaksi alustaa ovat edullisia LL-E33288-jo-dikompleksin tuottoon: 40 86392 %

Aineosa Alusta A Alusta B

Sakkaroosi 2,0 2,0

Rautasulfaattiheptahydraatti 0,01 0,01 5 Magnesiumsulfaattiheptahydraatti 0,02 0,02

Kalsiumkarbonaatti* 0,5 0,25

Peptoni** 0,2 0,2

Melassi 0,5 0,5

Kaliumjodidi 0,05 0,01 10 Vesi qs 100:aan 100:aan * Mississippi-kalkkia **Parhaat tulokset saatiin bakteriologista peptonia MARCOR® käyttäen, mutta muut peptonit ja myös liha- ja kaseiinihydrolysaateista saadut polypeptidit ovat käyttö-15 kelpoisia.

Esimerkki 7

Myseeli-itiösuspensio valmistettiin raaputtamalla NRRL-15839-vinopintaviljelmän pintaa, johon oli lisätty 5 ml steriiliä tislattua vettä. Tämä suspensio siirrostettiin 20 sitten 500 ml pulloon 100 ml:aan steriiliä siemenalustaa, jolla oli seuraava koostumus:

Hiivauute 0,5 %

Naudanlihauute 0,3 %

Tryptoni 0,5 % 25 Tärkkelys 2,4 %

Dekstroosi 0,5 %

Kalsiumkarbonaatti 0,4 %

Vesi qs 100,0 %:iin Tätä siemenpulloa inkuboitiin 28°C:ssa 200 kierros-30 ta/rain pyörivässä ravistelijassa 3-4 päivän ajan ja saatiin vaiheen I siirros.

Vaiheen I siirros siirrostettiin vaiheen II siirrokseen, jossa käytettiin samaa steriiliä alustaa ja jota inkuboitiin samoissa olosuhteissa kahden päivän ajan.

35 Vaiheen II siirros siirrostettiin sitten 100 ml:aan steriiliä fermentaatioalustaa, jonka koostumus oli: 4i 86892

Sakkaroosi 2,0 %

Ferrosulfaattiheptahydraatti 0,01 %

Magnesiumsulfaattiheptahydraatti 0,02 %

Kalsiumkarbonaatti 0,05 % 5 Peptoni (MARCOR®) 0,2 %

Melassi 0,5 %

Kaliumjodidi 0,05 %

Vesi qs 100,0 %:iin Tätä alustaa inkuboitiin 28°C:ssa ravistelijassa 10 kierrosnopeuden ollessa 200 min viiden päivän ajan, jonka kuluttua liemi kerättiin talteen.

Kaliumjodidikonsentraatio 4-20 ^ug/ml vaikuttaa optimaaliselta, mutta 2 mg/ml konsentraatiot eivät nähtävästi pienennä saantoja.

15 NRRL-15839 voidaan indusoida tuottamaan LL-E33288y3^ -I

kun kaliumjodidia on mukana alustassa, mutta vain pieniä määriä (0,2 - 0,3 ^ug/ml), kun sitä vastoin parempituottoista NRRL-15975:ttä käytettäessä konsentraatio on 1,5 - 3,5 ^ug/ml.

20 /3^-1:n ja y^-I:n saannot jodia sisältävässä alustas sa ovat 2-8 kertaa suuremmat kuin vastaavien bromiyhdistei-den /3-j ~Br ja Yj-Br saannot bromia sisältävässä alustassa NRRL-15975:ttä käytettäessä.

Esimerkki 8 25 LL-E33288oCj-I:n, O^-Itn ja Q£g-I:n erottaminen LL- E33288/31-I: stä, y^-Itstä, γ^-Isstä ja ^^-Iistä

Noin 41,3 g raakaa LL-E33288-kompleksia, joka oli saatu käsittelemällä 7 500 1 NRRL-15975:llä fermentoitua epäorgaanista jodidia sisältävää alustaa, jaettiin tasan 30 kahteen erään ja kromatografoitiin kahdella erillisellä 2,5 x 110 cm silikageelikolonnilla (Silica Woelm, 32-63 ^um), jotka oli pakattu ja tasapainotettu etyyliasetaatilla. Ko-lonneja eluoitiin ensin etyyliasetaatilla virtausnopeudella 4 ml/rain neljän tunnin ajan ja kerättiin 20 ml:n fraktioita.

35 Eluentti vaihdettiin koveralla gradientilla 0,1 M kaliumdi-vetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetystä etyyliasetaatista 42 86892 isopropyylialkoholin 10-%:iseen 0,1 M kaliumdivetyfosfaa-tin vesiliuoksella kyllästettyyn etyyliasetaattiliuokseen 24 tunnissa. Kolonneja eluoitiin lopuksi isopropyylialkoholin 10-%:isella 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksel-5 la kyllästetyllä etyyliasetaattiliuoksella yli yön. Fraktiot tutkittiin BIA:lla ja aktiiviset näytteet analysoitiin TLCrllä esimerkissä 3 kuvattuun tapaan.

Kahdesta kolonnista saadut LL-E33288C<^-I sisältävät fraktiot (86-107) yhdistettiin ja niitä käsiteltiin edellä 10 esitettyyn tapaan, jolloin saatiin noin 2,1 g raakaa LL-E33288c(3-I .

Kahdesta kolonnista saadut LL-E332880CJ-I ja C^-I sisältävät fraktiot (182-253) yhdistettiin ja niitä käsiteltiin, jolloin saatiin noin 4,2 g raakaa LL-E332880Cj-I:n ja 15 Q^-I:n seosta.

Kahdesta kolonnista saadut LL-E3 3 2 8 8/52-I ja /ij -I sisältävät fraktiot (254-272) yhdistettiin ja niitä käsiteltiin, jolloin saatiin noin 1,2 g raakaa LL-E33288/32~I :n ja /3-] —I:n seosta.

20 Kahdesta kolonnista saadut LL-E33288y^-I sisältävät fraktiot (273-302) yhdistettiin ja niitä käsiteltiin, jolloin saatiin noin 1,9 g 30-%:isesti puhdasta LL-E33288j<|-I.

Kahdesta kolonnista saadut LL-E33288-I sisältävät fraktiot (303-340) sisältävät fraktiot yhdistettiin ja nii-25 tä käsiteltiin, jolloin saatiin noin 1,3 g osittain puhdistettua LL-E33288 5·| “I ·

Esimerkki 9 LL-E33288Y.J -I :n puhdistus

Noin 900 mg esimerkin 8 30-%:isesti puhdasta LL-30 Ε33288γ^-Ι kromatografoitiin 2,5 x 120 cm Sephadex LH-20 -ko lonnilla, joka oli tasapainotettu seoksella etyyliasetaatti, dikloorimetaani:etanoli (2:2:1) virtausnopeuden ollessa 1 ml/min ja kerättiin 12 ml:n fraktioita. Fraktiot tutkittiin ja analysoitiin TLC:llä edellä esitetyllä tavalla ja 35 lt,-E33288Y1-I sisältävät fraktiot (24-33) yhdistettiin ja niitä käsiteltiin, jolloin saatiin 428 mg 64-%:isesti puhdasta LL-E33288 Yj-I.

43 86892 22 mg näyte yllä saadusta tuotteesta kromatografoi-tiin 0,8 x 24 cm Sepralyte C^g (35-60 ^um, Analytichem) kolonnilla, joka oli tasapainotettu seoksella asetonitrii-li:0,2 M ammoniumasetaatin vesiliuos (55:45) virtausnopeu-5 della 2 ml/min ja kerättiin 12 ml:n fraktioita. Fraktiot tutkittiin ja analysoitiin TLC:llä edellä esitetyllä tavalla ja puhdasta LL-E33288y^-I sisältävät fraktiot yhdistettiin ja niitä käsiteltiin, jolloin saatiin 7,7 mg puhdasta LI.-E33288y.j-I.

10 Esimerkki 1 0 LL-E33288/3j-I :n ja /9^-1: n puhdistaminen Noin 600 mg esimerkin 8 raakaa LL-E33288/32~I :n seosta kromatografoitiin 2,5 x 120 cm Sephadex LH-20 -kolonnilla, joka oli tasapainotettu seoksella etyyliasetaatti:di-15 kloorimetaani:etanoli (2:2:1) virtausnopeudella 1 ml/min ja kerättiin 12 ml:n fraktioita. Fraktiot tutkittiin ja analysoitiin TLC:llä edellä esitetyllä tavalla ja LL-E3328^J2-1 ja LL-E33288y3j-I sisältävät fraktiot (23-31) yhdistettiin ja niitä käsiteltiin, jolloin saatiin 81 mg osittain puhdis-20 tettua LL-E33288/32"1 :n ja seosta.

Edellä saatua näytettä kromatografoitiin 1,5 x 90 cm Sephadex LH-20 -kolonnilla, joka oli tasapainotettu seoksella heksaani:dikloorimetaani:etanoli (3:1:1) virtausnopeudella 0,8 ml/min ja kerättiin 12 ml:n fraktioita. Frak-25 tiot tutkittiin ja analysoitiin TLC:llä edellä esitetyllä tavalla ja LL-E33288/32~I sisältävät fraktiot (17-30) ja LL-E33288/3j-I sisältävät fraktiot (31-38) yhdistettiin kahdeksi erilliseksi seokseksi ja niitä käsiteltiin, jolloin saatiin 31 mg osittain puhdistettua LL-E33288/3^-1 ja 20 mg 30 80-%:isesti puhdasta LL-E33288/3^-I·

Claims (3)

44 86892

1. Menetelmä antibioottiyhdisteiden LL-E33288a.,-Br, cr2-Br, a3-Br, B,-Br, B2-Br, Br, α,-Ι, α2-Ι, α3-Ι, 5 β,-Ι, B2“I, /^-1 ja ^-1 valmistamiseksi, jolloin: - yhdisteellä LL-E33288a1-Br on seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjestelmissä silikageeliohutlevy-kromatograf iässä: a) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyl- 10 lästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,67; b) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos, Rf = 0,80; ja c) etyyliasetaatti:metanoli (95:5), Rf = 0,79; 15 ja kaava: HO .J jf CH, o NH n F''· “ .....

25 C2H5 3 - yhdisteellä LL-E33288a2-Br on seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjestelmissä silikageeliohutlevy-kromatografiässä: 30 a) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyl lästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,61; b) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos, Rf = 0,75; ja 35 c) etyyliasetaatti:metanoli (95:5), Rf = 0,73; 45 86892 ja kaava HO f CH3 o O vym^. “cfTSh Γ “>! °» ...... OCH3 o / OCH- CH3CH2 3 - yhdisteellä LL-E33288a3-Br on seuraavat Rf-arvot 15 mainituissa liuotinjärjestelmissä silikageeliohutlevy- kromatograf iässä: a) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,55; b) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfos-20 faatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos, Rf = 0,69; ja c) etyyliasetaattirmetanoli (95:5), Rf = 0,61; ja kaava 25 Γ^° CHs O HO-7/ T _ I CHi NH n Brv A Λ xr-T;3__o jC0^ l CHa-r-O-y 00)1 ho

30 HO——V οοη,^η - yhdisteen LL-E33288fi1-Br, a) likimääräinen alkuainekoostumus on:

35 C 48,6; H 5,6; N 2,9; S 9,1 ja Br 5,5; 46 86892 b) sulamispiste on 146-150 °C (hajoaa); c) spesifinen kiertokulma on [a]^6 = -49 ± 10° (0,1 %, etanoli); d) sillä on kuviossa I esitetty ultravioletti- 5 absorptiospektri; e) sillä on kuviossa II esitetty infrapuna-absorptiospektri; f) sillä on kuviossa III esitetty protonimagneet-tinen resonanssispektri; 10 g) sillä on kuviossa IV esitetty hiili-13-mag- neettinen resonanssispektri, jonka merkittävät piikit ovat seuraavissa kohdissa: 17,60(q); 17,64(q); 18,9(q); 19,7(q); 15 22,4(q); 22;8(q); 23,5(q); 34,3(t); 36,9(t); 39,2(t/d); 47,8(q); 51,7(q); 52,7(q ); 54,6(d) 56,3(q): 57,2(q); 57,8(d); 61,0(q/d); 61,7(d); 62,4(t); 66,9(d); 68,4(d); 69,1(d): 69,7(d); 20 70,2(d); 71,1(d); 71,9(d); 72,l(s); 76,1(d); 81,0(d); 83,3(s); 88,2(s); 97,4(d); 99,7(d); 100,8(s); 102,5(d); 115,l(s); 123,4(d); 124,4(d); 126,5(d); ·' 130,2(s); 130,8(s); 144,6(s); 149,3(s); 25 149,5(s); 191,7(s): 192,4(s); ja h) sillä on seuraavat Rf-arvot mainituissa liuo-tinjärjestelmissä silikageeliohutlevykromatografiässä: i) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyl- 30 lästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,24; ii) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos, Rf = 0,35; iii) etyyliasetaatti:metanoli (95:5), Rf = 0,36; 35 i) sen molekyylipaino on 1333/1335, vastaten 47 86 8 92 79Br/81Br; j) sen molekyylikaava on C56H76N3021S4Br; ja sillä on kaava 5 ?Ha ° μ X T s VXT \ o CHjSss T \ ΊΓ Jl J Y----CHj X \ °°Ha

9 T^ch, iH j J 0CHa ΗοΛ-^-7 ^ ch3*7 -o"7 3 o _ I

10 OOHj OH jl/^7 (CH3) 2CH °°h3 - yhdisteellä LL-E33288B2-Br on seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjestelmissä silikageeli- 15 ohutlevykromatografiässä: a) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,32; b) isopropanolin 0,3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos,

20 Rf = 0,41; ja c) etyyliasetaatti:metanoli (95:5), Rf = 0,45; ja retentioaika 7,1 min. ja retentiotilavuus 10,7 ml HPLC-analyysissä, jossa käytetään C18-kolonnia, 4,6 mm x 25 cm, liuottimena asetonitriili : 0,2 M ammoniumase- 25 taatin vesiliuosta (60:40), virtausnopeutta 1,5 ml/min., kaksoisdetektointia aallonpituuksilla 254 ja 280 nm ja herkkyyttä 0 - 0,02 A.U.F.S.; - yhdisteellä LL-E33288)T^-Br on a) kuviossa V esitetty ultraviolettiabsorptio- 30 spektri; b) kuviossa VI esitetty infrapuna-absorptio- spektri; c) kuviossa VII esitetty protonimagneettinen reso-nanssispektri; ja 35 d) seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjes- 48 86892 telmissä silikageeliohutlevykroinatografiässä: i) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,18; ii) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfos-5 faatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos, R# = 0,28; iii) etyyliasetaattiimetanoli (95:5), Rf = 0,27; e) kuviossa VIII esitetty hiili-13-magneettinen resonanssispektri, jonka merkittävät piikit ovat seuraa- 10 vissa kohdissa: 14,4 17,6 17,9 19,0 19,7 - 22,8 34,0 37,6 39,5 15 42,1 - 51,6 52,7 54.1 56,3 57,3 59,3 61,1 61,8 61,9 67.2 68,18 68,23 69,7 70,1 70,8 71,1 71,7 20 71,8 76,1 - 81,0 82,9 88,4 - 97,8 100,0 100,2 101,3 103,0 115.3 123,0 124,9 126,9 130.4 131,1 131,8 138,0 25 144,7 - 149,5 149,6 155,6 192,5 192,9 f) molekyylikaava C55H74N3021S4Br; g) molekyylipaino 1319/1321, vastaten ^Br/^Br; 30 ja kaava /„<>^ 0 ?HJ O HO -A/ ΒΓ rS* O /-(Υ-ΝΗ O T 1 S VTl \ n CHjSSS-J /V ΊΓ 11 Γ^'Χ CH* o X Λ °°η3 CH3CH2 °CHj 49 86892 - yhdisteellä 1^^33288^-1 on a) seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjes-telmissä silikageeliohutlevykromatografiassa: i) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyl-5 lästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,67; ii) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos, Rf = 0,80; ja iii) etyyliasetaatti:metanoli (95:5), Rf = 0,79; 10 b) molekyylipaino 1145; ja retentioaika 11,9 min. ja retentiotilavuus 14,3 ml HPLC-analyysissä, jossa kolonnina käytetään C16-radiaali-patruunaa radiaalipuristusmoduulilla, liuottimena aseto-nitriili : 0,2 M ammoniumasetaatin vesiliuosta (50:50), 15 virtausnopeutta 1,2 ml/min., kaksoisdetektointia aallonpituuksina 254 ja 280 nm ja herkkyyttä 0 - 0,2 A.U.F.S.; - yhdisteellä LL-E33288e2-I on a) seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjes-telmissä silikageeliohutlevykromatografiassa: 20 i) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyl lästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,61; ii) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos, Rf = 0,75; ja 25 iii) etyyliasetaatti:metanoli (95:5), Rf = 0,73; b) se sisältää vain seuraavia alkuaineita: C, H, N, 0, S ja I; ja c) sillä on kuviossa IX esitetty protoni-magneettinen resonanssispektri ja kaava 30 ch T ί s VTT \ o cHjSss^/ / \ r i 1 ------- ch3 X \ OCH, H0'UT* L CH3CH2 so 86892 - yhdisteellä LL-E33288a3-I on a) seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjes-telmissä silikageeliohutlevykromatografiässä: i) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyl-5 lästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,55; ii) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,69; ja iii) etyyliasetaatti:metanoli (95:5), Rf = 0,61; 10 b) molekyylipaino 1066; ja c) kuviossa X esitetty protonimagneettinen reso-nanssispektri; ja kaava

15 CHj o Jk O /*=ντΗΗν° YY s o CHjSss*J /\ ΊΓ j X \ chj Λ / \ OCHj J OCH, h ^"3 * 20 °°Ηι OH - yhdisteellä LL-E33288ft.,-I on a) seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjes- 25 telmissä silikageeliohutlevykromatografiässä: i) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,24; ii) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos,

30 Rf = 0,35; ja iii) etyyliasetaatti:metanoli (95:5), Rf = 0,36; b) kuviossa XI esitetty ultravioletti-absorptio-spektri; c) kuviossa XII esitetty infrapuna-absorptio- 35 spektri; 86892 d) kuviossa XIII esitetty protoni-magneettinen re-sonanssispektri; e) kuviossa XIV esitetty hiili-13-magneettinen re-sonanssispektri, jonka merkittävät piikit ovat seuraavis- 5 sa kohdissa: 17,5 17,6 18,9 22,4 22,8 23,4 25,4 34,3 36,9 39,2 10 - 47,9 51,6 52,8 54.8 56,3 57,2 57,9 60.9 61,6 62,2 67,0 68,4 68,4 69,1 69.6 70,4 71,1 71,8 15 72,2 76,2 - 80,8 83,3 88,1 93,6 97,4 99.6 99,6 - 102,6 112,4 123,4 124,4 126,4 133,4 20 - 192,3 192,6 f) molekyylikaava c56H76N3021s,l; ja g) molekyylipaino 1381; ja kaava 25 p*» o Ho—Ty00 /«-0<rNV o T ΊΓ s vzXa cHjsss-^y r \ r JL J. 1----\ CHj Λ X \ OCHj °°^ OH (CH3) 2CH^ OCHj 35 52 86092 - yhdisteellä LL-E33288e2-I on seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjestelmissä silikageeli-ohutlevykromatografiässä: a) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyl-5 lästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,32; b) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos, Rf = 0,41; ja c) etyyliasetaatti:metanoli (95:5), Rf = 0,45 10 ja retentioaika 5,0 min. ja retentiotilavuus 6,0 ml HPLC-analyysissa, jossa kolonninna käytetään C16-radiaali-patruunaa radiaalipuristusmoduulilla, liuottimena aseto-nitriili : 0,2 M ammoniumasetaatin vesiliuosta (50:50), virtausnopeutta 1,2 ml/min., kaksoisdetektointia aallon- 15 pituuksina 254 ja 280 nm ja herkkyyttä 0 - 0,2 A.U.F.S.; - yhdisteellä 1,1^33288)^-1 on a) seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjestelmissä silikageeliohutlevykromatografiässä: i) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyl- 20 lästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,18; ii) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfos- ... faatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos, Rf = 0,28; ja : iii) etyyliasetaatti:metanoli (95:5), Rf = 0,27; 25 b) se sisältää vain seuraavia alkuaineita: C, H, N, 0, S ja I; c) sen likimääräinen alkuainekoostumus on: C 48,8; H 5,4; N 2,8; S 9,0 ; ja I 9,2; d) sen molekyylipaino on 1367; ; 30 e) sen molekyylikaava on C55H74N3°21S4l; f) sillä on kuviossa XV esitetty ultravioletti-absorptiospektri; g) kuviossa XVI esitetty infrapuna-absorptio-spektri; 35 h) kuviossa XVII esitetty protonimagneettinen re- 53 86892 sonanssispektri; ja i) kuviossa XVIII esitetty hiili-13-magneettinen resonanssispektri, jonka merkittävät piikit ovat seuraa-vissa kohdissa: 5 14,5(q) 17,6(q) 17,6(q) 18,9(q) 22,8(q) 25,4(q) 34,1(t) 37,0(t) 39,l(t) 42,3(t/s) - 51,5(d) 52,8(q) 10 54,8(t) 56,3(q) 57,2(q) 60,4(d) 60,9(q) 61,3(t) 61,7(q) 67,0(d) 68,4(d) 68,5(d) 69,2(d) 69,7(d) 70,5(d) 71,1(d) 71,8(d) 72,1(s) 75,7(d) 75,8(d) 80,9(d) 15 82,8(s) 88,1(s) 93,5(s) 97,3(d) 99,6(d) 99,7(d) 100,8(s) 102,6(d) 123,4(d) 124,4(d) 126,2(d) 130,2(s) 131,0(s) 133,4(s) 139,l(s) 143,0(s) 145,1 150,6(s) 151,5(s) 20 154,5 192,0(S) 192,5(s) ja kaava ?Ha o

25 B ΊΓ S VTL \ o CHjSSS^y / \ I

11 V—ch, X \ °°η3 HO -----/ _ J

30 CH3CH2 °°Η’ - ja yhdisteellä LL-E332885J-I on seuraavat Rf-arvot mainituissa liuotinjärjestelmissä silikageeli-ohutlevykromatografiässä: 35 a) 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyl- 86892 lästetty etyyliasetaatti, Rf = 0,11; ja b) isopropanolin 3-%:inen 0,1 M kaliumdivetyfosfaatin vesiliuoksella kyllästetty etyyliasetaattiliuos, Rf = 0,19; ja kaava ® CH I 3 0 ho-?( T f Y^OCH, Γ HN-V~^0.. XOj ’ CHi^r-0J OOH, ho I

10 OCHa oh ch/ tunnettu siitä, että fermentoidaan aerobisesti mikro-organismia Micromonospora echinospora ssp. cali-15 chensis NRRL 15839 tai NRRL 15975 nestemäisessä alustassa, jossa on assimiloituvia hiili-, typpi- ja bromi-tai jodilähteitä ja epäorgaanisia suoloja 24-32 °C:n lämpötilassa noin 90-200 tunnin ajan, kunnes alustan anti-bioottiaktiivisuus on huomattava ja kerätään liemi tal-20 teen ja erotetaan antibiootit kromatografisesti.

2. Mikro-organismin Micromonospora echinospora ssp. calichensis NRRL 15839 viljelmä.

3. Mikro-organismin Micromonospora echinospora ssp. calichensis NRRL 15975 viljelmä. 25 55 86892