DK149337B - Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotikum a/16686 faktor a2 samt eventuelt yderligere faktor a1 og a3 eller fysiologisk acceptable syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

i 149337

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum A/16686 faktor samt eventuelt yderligere faktor A^ og A^, eller fysiologisk acceptable syreadditionssalte deraf, alle med de senere 5 i nærværende beskrivelse angivne egenskaber.

Fra beskrivelsen til DK patentansøgning nr. 1400/80 må det anses for kendt at fremstille antibiotikum A/16686, der har en række i nævnte beskrivelse nærmere angivne egenskaber, ved at man dyrker mikroorganismestam-10 men Actinoplanes sp. ATCC 33076 under aerobe submerse betingelser i et dyrkningsmedium indeholdende en assimiler-bar kilde til kulstof, en assimilerbar kilde til nitrogen og uorganiske salte, hvorpå man udvinder antibiotiket . og om ønsket omdanner det til et farmaceutisk acceptabelt 15 syreadditionssalt deraf eller frigør antibiotiket i ba sisk form fra et dannet syreadditionssalt deraf.

Det anføres i den nævnte ansøgnings beskrivelse at antibiotikum A/16686 består af en hovedkomponent og to mindre komponenter, men der anføres intet om isole-20 ring af de enkelte komponenter og karakterisering af disse.

Det har nu vist sig at hovedkomponenten, der her betegnes faktor A2, kan isoleres, og at det desuden er muligt at isolere de to mindre komponenter, her betegnet faktor A^ og faktor A^, og at disse tre komponenter også 25 kan omdannes til syreadditionssalte deraf. Den forelig gende opfindelse angår således fremstilling af disse faktorer og isolering af i det mindste faktor A2, men eventuelt tillige af faktorerne A^ og A^.

Ifølge opfindelsen sker fraskillelsen af faktor A2 30 særlig effektivt på den i krav 2 angivne måde. Ligeledes ifølge opfindelsen er det særlig fordelagtigt at udføre adskillelsen på den i krav 3 angivne måde.

Med fysiologisk acceptable syreadditionssalte menes salte der også er farmaceutisk acceptable, dvs. salte hvor 35 toxiciteten af forbindelserne som helhed ikke forøges i forhold til ikke-saltformen. Repræsentative og hensigtsmæssige syreadditionssalte indbefatter additionssalte med organiske 2 U 9337 og uorganiske syrer såsom saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre, fosforsyre, salpetersyre, vinsyre, eddikesyre, ravsyre, mælkesyre, glutaminsyre og metansulfonsyre.

De frie baser af A/16686, faktorerne A^, A2 og A3 kan 5 fremstilles ud fra de tilsvarende syreadditionssalte, eller omvendt kan syreadditionssalte af A/16686 faktorerne A-^, A2 og A3 fremstilles ud fra de tilsvarende frie baser ved fremgangsmåder der alment anvendes på dette område. De frie baser af antibiotikum A/16686 faktor A^, A2 og A^ vindes ud 10 fra de tilsvarende syreadditionssalte fx ved behandling af en opløsning af syreadditionssaltet med bariumhydroxyd, mens omsætning af de frie baser med den valgte organiske eller uorganiske syre i opløsning i et inert opløsningsmiddel giver det tilsvarende syreadditionssalt.

15 For simpelthedens skyld vil ved diskussion af stof fernes nytte betegnelsen forbindelse A/16686 i nærværende beskrivelse blive brugt til at referere til en forbindelse udvalgt af den gruppe stoffer der består af A/16686 faktorerne A^, A2 og A3 og de tilsvarende ugiftige fysiologisk ac-20 ceptable syreadditionssalte.

Forbindelserne A/16686 inhiberer in vitro væksten af visse patogene bakterier, navnlig grampositive; desuden giver parenteral indgift af A/16686-forbindelser i høj grad beskyttelse mod experimentelle infektioner hos mus. Endvide-25 re er A/16686-forbindelser nyttige til prævention og behandling af dentalcaries.

Starrmen Actinoplanes sp. ATCC 33076 beskrives i de efterfølgende afsnit af nærværende beskrivelse.

Morfologi 30 Stammen vokser godt på forskellige medier med orange farve af substratmyceliet. Den frembringer ikke noget pigment. Luftmycelium er stedse fraværende.

Ved mikroskopisk undersøgelse viser det vegetative mycelium grenede hyfer med en diameter på ca. 1μ. Sporangier-35 ne dannes sparsomt, kun på kartoffelagar og er kugleformede med meget uregelmæssige overflader og en diameter fra 5,0- 9,0 μ. Sporangieafgivelse iagttages efter brydning af sporan-giets væg. De subsfæriske sporer er bevægelige med en diameter på 1,0-1,5μ. Analyse af cellevægskomponenterne viser 149337 3 meso-diaminopimelinsyre og sukkermønster af type D (Lechevalier et al., Chemical composition as a criterium in the classification of Actinomycetes. Adv. Applied Microbiology, 14, 1971. Academic Press, New York).

5 Kulturkarakterer

Tabel 1 viser kulturkaraktererne af Actinoplanes ATCC 33076, dyrket på forskellige standardmedier foreslået af Shirling og Gottlieb (Intern. J. system. Bact. _16, 313-340, 1966) og andre medier anbefalet af Waksman (The Actino-10 mycetes, Vol. II; The Williams and Wilkins Co. 1961). Kulturkaraktererne bestemtes efter 6-14 dages inkubering ved 30°C.

Tabel 1

Kulturkar akterer 15 Nummeret på nogle af dyrkningsmedierne refererer til de numre der er givet af Shirling og Gottlieb i Methods for characterization of Streptomyces species; Intern. J. System.

Bact. 16, 313-340, 1966.

Kulturmedium Kulturkarakterer 20 Medium nr. 2 (gærekstrakt- Rigelig vækst, rynket over- maltagar) falde, lysebrun 12 H 12

Medium nr. 3 (havremels- Sparsom vækst, tynd, lysoran- agar) ge, 9 B 6

Medium nr. 4 (uorganiske Moderat vækst, skorpet over- 25 salte-stivelsesagar) falde, orange 11 L 12

Medium nr. 5 (glycerol- Sparsom vækst, hyalin asparaginagar)

Medium nr. 6 (pepton-gær- Sparsom vækst, hyalin til ekstrakt-jernagar) lysebrun 30 Medium nr. 7 (tyrosinagar) Sparsom vækst, glat overfalde, brun 6 D 11

Havremelsagar (ifølge Rigelig vækst, rynket overfla-

Waksman) de, orange til brun 12 C 10 4 149337

Tabel 1 (fortsat)

Kulturmedium Kulturkarakterer

Hickey og Tresner's agar Rigelig vækst, skorpet over flade, orange 11 G 8 5 Czapecs glukoseagar Moderat vækst, skorpet over falde, orange 11 G 8

Glukose-asparaginagar Sparsom vækst, skorpet over flade, lyseorange 11 P 6 Næringsagar Moderat vækst, glat overflade, 10 orange 11 G 8

Kartoffelagar Rigelig vækst, rynket over flade, ravfarvet-brun 12 E 10

Bennett's agar Rigelig vækst, rynket overfla de, orange 11 G 8 15 Kalciummalatagar Moderat vækst, glat overflade, lysorange 10 C 6

Skummetmælksagar Rigelig vækst, rynket over flade, orange 9 L 2

Czapecs agar Moderat vækst, skorpet over- 20 flade, orange 10 D 7 Ægagar Moderat vækst, glat overflade, hyalin til lysorange

Pepton-glukoseagar Rigelig vækst, rynket overfla de, orange 11 G 11 25 Agar Meget sparsom vækst, glat over flade, hyalin

Loefflers serum Meget sparsom vækst, glat over flade, orange

Kartoffel Sparsom vækst, skorpet, lysebrun 30 Gelatine Sparsom vækst, lysorange

Cellulose Meget sparsom vækst, tynd, hyalin

Tal og bogstavkoderne refererer til farven bestemt ifølge

Maerz og Paul, A dictionary of color, McGraw Hill Inc., 35 New York, 1950.

5 149337

Kulstofudnyttelse

Tabel 2 viser udnyttelse af kulstofkilder undersøgt i henhold til den måde der er angivet af Pridham og Gottlieb (J. Bact. 56, 197, 1948).

5 Tabel 2

Kulstofkilder Udnyttelse

Inositol

Fruktose +

Rhammose + 10 Mannitol

Xylose +

Raffinose

Arabinose +

Cellulose 15 Sakkarose +

Glukose +

Mannose +

Laktose

Salicin + 20 + = positiv udnyttelse - = ingen vækst

Fysiologiske karakterer

Tabel 3 viser stammens fysiologiske karakterer.

Tabel 3 25 Prøve Resultater

Stivelseshydrolyse positiv

Dannelse af H2S positiv

Tyrosin-reaktion negativ

Caseinhydrolyse positiv 30 Opløseliggørelse af kalcium- malat negativ

Gelatinesmeltning positiv

Lakmusmælk, koagulering positiv

Lakmusmælk, peptonisering negativ 35 Cellulosenedbrydning negativ 6 149337

Som i tilfælde af andre organismer undergår karaktererne af den A/16686 faktor A2-producerende stamme Acti-noplanes sp. ATCC 33076 variationer. Fx kan der vindes kunstige varieteter og mutanter af stammen ATCC 33076 5 ved behandling med forskellige kendte mutagener såsom ultraviolette stråler, røntgenstråler, højfrekvensbølger, radioaktive stråler og kemikalier. Alle naturlige og kunstige varianter og mutanter af ATCC 33076 som har væsentlig sammen egenskaber som denne og derfor hører til denne 10 Actinoplanes-stamme og danner antibiotikum A/16686 faktor A2 kan bruges i henhold til den foreliggende opfindelse.

Til fremstilling af A/16686-antibiotika dyrkes stammen Actinoplanes sp. ATCC 33076 under aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium der indeholder en assimilerbar kil-15 de til kulstof, en assimilerbar kilde til nitrogen og uorganiske salte. Dette dyrkningsmedium kan være et hvilket som helst af et antal forskellige næringsmedier der sædvanligt anvendes i gæringsteknikken, men visse medier foretrækkes.

Således er foretrukne kulstofkilder glukose, fruktose, man-20 nose, sakkarose og lignende stoffer i forskellige renhedsgrader. Foretrukne nitrogenkilder er sojamel, pepton, kødekstrakt, gærekstrakt, trypton, aminosyrer og lignende stoffer.

Blandt de uorganiske salte der kan inkorporeres i dyrkningsmedierne er de sædvanlige opløselige salte med evne til at 25 frembringe ioner af sådanne grundstoffer og andre komponenter som natrium, kalium, jern, zink, kobolt, magnium, kalcium, ammonium, klorid, karbonat, sulfat og nitrat. Almindeligvis fordyrkes den antibiotikum-producerende stamme i en rystekolbe, hvorpå kulturen bruges til podning af krukkefermentorer 30 til frembringelse af væsentlige mængder A/16686-antibiotika.

Det medium der bruges til forkulturen kan være det samme som det der bruges til gæringer i større målestok, men også andre medier kan bruges.

Den A/16686-producerende stamme kan dyrkes ved tempe-35 raturer mellem ca. 20° og ca. 37° og fortrinsvis ved temperaturer på omkring 28-30°C.

149337 7

Under gæringen kan antibiotikumproduktionen følges ved analyse af udtagne prøver af gæringsmediet eller af ekstrakter af mycelie-faststoffet med hensyn til antibiotisk aktivitet.

5 Organismer der vides at være følsomme for A/16686- antibiotika er nyttige til dette formål. En særlig hensigtsmæssig prøveorganisme til formålet er Sarcina lutea ATCC 9341. Bioanalysen udføres hensigtsmæssigt ved agardiffusionsmetoden på agarplader. Maximal produktion af antibiotisk aktivitet 10 forekommer i almindelighed mellem 3. og 5. dag. De antibiotika der dannes under gæringen af stammen Actinoplanes sp. ATCC 33076 findes i hovedsagen i myceliemassen. En foretrukken fremgangsmåde til udvinding af A/16686-antibiotika består derfor i ekstraktion af det fraskilte mycelium. Ekstraktion 15 af myceliemassen udføres bedst med metanol, men andre lavere alkanoler og acetone er også egnede. A/16686-antibiotikerne udvindes fra ekstraktions-opløsningsmidlet ved rutineprocedurer til frembringelse af en blanding af A/16686-antibiotika, A/16686-komplekset. A/16686-komplekset renses videre og der-20 efter adskilles de enkelte faktorer fra hinanden. Adskillelse af A/16686-komplekset i de enkelte komponenter kan opnås ved forskellige vel anerkendte metoder som i det væsentlige indebærer kromatografiske metoder. Til optimal adskillelse af faktorerne foretrækkes reversfase HPLC. Ved en sådan HPLC-25 adskillelse er en foretrukken kolonne "μ-Bondapack C^g", og foretrukne bevægelige faser er blandinger af vandigt HC00NH4 og CH^CN i forskellige mængdeforhold. Til fraskillelse i stor målestok af antibiotikum A/16686 faktor A2 anvendes der fortrinsvis søjlekromatografi. Ved en sådan 30 kolonneadskilllelse er den foretrukne adsorbent "Amberlite" ®

XAD, og foretrukne opløsningsmiddelsystemer er blandinger af vand og acetonitril og blandinger af ammoniumformiat og aceto-nitril. Fraskillelse af de mindre faktorer A^ og Ag ved søjlekromatografi kan udføres, men fordrer påfølgende søjleadskil-35 lelse af berigede fraktioner. Også her er "Amberlite" ®XAD

den foretrukne adsorbent og blandinger af vand og acetonitril samt blandinger af ammoniumformiat og acetonitril de foretrukne opløsningsmiddelsystemer.

149*37 8 A/16686 faktor A/16686 faktor A2 er et hvidt amorft pulver som smelter under sønderdeling ved omkring 210-220°C.

A/16686 faktor A2 er opløselig i vand, dimetylforma-5 mid, vandig metanol og 0,1N HC1; den er dårligt opløselig i absolut ætanol og i n-butanol; den udfældes fra vandig opløsning ved tilsætning af en opløsning mættet med NaHCO^.

Elementæranalyse af A/16686 faktor A2, i forvejen tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære, tyder på føl-20 gende tilnærmelsesvise procentvise sammensætning (gennemsnitligt) : kulstof 54,57%, hydrogen 6,19%, nitrogen 10,88%. Kloranalyse giver følgende procent: klor 1,37%.

Det infrarøde absorptionsspektrum for A/16686 faktor A2 i nujol er vist i tegningens fig. 1. Følgende absorptions-15 maxima iagttages: 3290, 2930 og 2860 (nujol), 1765, 1635, 1510, 1455 og 1375 (nujol), 1240, 1175, 1130, 1060, 1015, 975, 840 og 815 cm-1.

Det ultraviolette absorptionsspektrum for A/16686 faktor A2, der er vist i tegningens fig. 2, udviser følgende absorptionsmaxima: 20 . 1¾ a) i neutral metanol: 234 nm (^i = 206) og 268 nm b) i metanol indeholdende 0,1N HC1: 233 nm (ET = 192) T a lem og 271 nm (ET* = 93); lem 1¾ 25 c) 1 metanol indeholdende o,lN NaOH: 251 nm (Eicm = 275) og av 300 nm (skulder).

A/16686 faktor A- giver følgende signaler i 270 MHz, 1 Δ H NMR spektrum, fig. 3, registreret i DMF-d7/D20 1:1 (rumfangsdele) opløsning (TMS som intern standard δ 0,00 ppm) 30 på et "Pulse Fourier Transform Bruker WH 270" kryospektrome-ter: i) en gruppe signaler ved 0,5-3 ppm svarende til ca. 51 alifatiske protoner, navnlig dubletter centreret ca. ved 1,53 ppm (J = 7Hz), 1,20 ppm (J = 6Hz) og 1,07 ppm (J = 5Hz); 35 ii) en gruppe signaler ved 3-6,5 ppm svarende til ca.

43 protoner af olefinisk type eller protoner af kulstof bundet til heteroatomer, navnlig en singlet ca. ved 5,62 ppm; 149337 9 iii) en gruppe signaler ved 6,5-8 ppm svarende til ca. 39 protoner af aromatisk type, navnlig dubletter centreret ca. ved 7,60 ppm (J = 8 Hz), ved 7,49 ppm (J = 8 Hz) og ved 6,46 ppm ( J = 8 Hz).

Singletterne ved 8, 2,85 og 3,01 ppm og singletten 5 ved 4,73 ppm svarer henholdsvis til DMF og HDO til stede i opløsningsmiddelblandingen.

A/16686 faktor A2 har en specifik rotation [a]D på +73 + 4° (c = 0,49 i H20).

10 R^-værdierne for A/16686 faktor A2 i forskellige pa pirkromatografiske systemer med Bacillus subtilis ATCC 6633 som opdagelsesorganisme fremgår af følgende tabel.

Tabel 4 15 Kromatografisk opførsel af A/16686 faktor A2 "Whatman" nr. 1 papir (nedløbende kromatografering; Rm = 40 cm; mængder: 50 μg af opløsningen opløst i H^/CH^CN 1:1; 2 mg/ml) .

Elueringsystem R^-værdi 20 1) n-butanol mætted med Sorensens puffer pH 6,0 0,00 2) n-butanol mættet med vand indeholden 2% p- toluensulfonsyre 0,00 3) n-butanol mættet med vand indeholdende 2% ammoniumhydroxyd 0,00 25 4) Sorensens puffer, pH 6,0, mættet med n-butanol 0,05 5) n-butanol/metanol/vand 4:1:2 0,48 6) ætylacetat mættet med vand 0,00 7) n-butanol/eddikesyre/vand 2:1:1 0,44 30 R^-værdien for A/16686 faktor A2 i forskellige tynd-lagskromatografiske systemer er anført i følgende tabel, idet betingelserne er anført under tabellen. 1

Tabel 5

Elueringssystem (volumenforhold) R^-værdi 1) Vandigt 2,5%s HCOONH4/CH3CN 65:35* 0,36 2) n-butanol/eddikesyre/vand 4:2:5 0,80 3) n-butanol/eddikesyre/vand 4:2:5 0,52 4) n-propanol/n-butanol/lN NH^OH 2:3:4 (øvre fase) 0,12 5) n-butanol/eddikesyre/vand 4:1:5 0,15 149337 ίο

Rm: ca. 140 mm Mængder: 2-5 μΐ opløsning (1 mg/ml) i CH^CN/I^O 1:1 (rumfang) Synliggørelse: a) joddampe b) ultraviolet lys ved 254 nm.

5 1,2-Silaniseret silikagal 60 ^254-P^a<^er ("Merck"): synliggørelse a,b; 3,4,5-silikagel 60 F-^-plader ("Merck"); synliggørelse a (* interne standarder: koffein Rf 0,60; corti-son 0,35; dexametason R^ 0,30).

A/16686 faktor A2 udvider følgende karakteristiske 10 reaktioner: ninhydrin (3%s ætanolisk opløsning) positiv

Molish· positiv

Biuret positiv

Milion negativ 15 1% FeCl3-l% K3Fe(CN)g, vandigt grøn farve KMn04 (surt) positiv koncentreret H2S04 negativ

Aminosyreanalyse af A/16686 faktor A2 efter sur hydrolyse med 6N saltsyre ved 110°C i 6 timer viste tilstedeværel-20 se af mindst følgende aminosyrer: alanin, leucin, glycin, asparaginsyre, fenylalanin, ornitin, p-hydroxyfenylglycin og hydroxy-, klor-substitueret fenylglycin. Analyse af et syrehydrolysat af A/16686 faktor A2 efter 2 timer i 2N H2S04 ved 100°C viser tilstedeværelse af det neutrale kul-25 hydrat D-mannose.

HPLC-analyse af antibiotikum A/16686 faktor A2 under anvendelse af en "μ-Bondapack C^g"-kolonne (3,9 mm indvendig diameter x 300 mm høj) og en blanding HCOONH^ 0,025 M/CHgCN 60:40 (rumfang) som den mobile fase med en strømningshastig-30 hed på 2 ml/min. viste at forbindelsen har en retentionstid (tR) på 4' 99/^qq" (interne standarder: antracen tR 35' 18/100*'; <*-nitronaftalen n* i^/loo"' toluen fcR 8‘ 64/ioo"} · A/16686 faktor A^ A/16686 faktor A^ er et hvidt amorft pulver som smel-35 ter under sønderdeling ved ca. 210-220°C. Det er meget op- 149337 11 løseligt i vand, dimetylformamid og vandig metanol; det er opløseligt i metanol og ætanol; men er uopløseligt i ætylæter, petroleumsæter og benzen. Elementæranalyse af A/16686 faktor i forvejen tørret ved ca. 140°C under en inert 5 atmosfære, viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kulstof 50,31%, hydrogen 6,0%, nitrogen 9,92%, rest 6,07%.

Kloranalyse af A/16686 faktor A^ giver følgende resultat: klor (totalindhold) 1,61%; kloridioner 0,90%.

10 Det infrarøde absorptionsspektrum af A/16686 faktor A^ i nujol fremgår af tegningens fig. 4.

Følgende absorptionsmaxima iagttages: 3290, 2930 og 2860 (nujol), 1765, 1630, 1510, 1455 og 1375 (nujol), 1260, 1235, 1175, 1150, 1130, 1060, 1015, 975, 840 og 810 cm"1.

15 Det ultraviolette absorptionsspektrum for A/16686 faktor A^, der fremgår af tegningens fig. 5, udviser følgende absorptionsmaxima: 1% a) i neutral metanol: 233 nm (E. = 202) og 266 nm i a lcm (ElL=106); 20 b) i metanol indeholdende 0,1N HC1: 232 nm (E7 = 219) l a 10111 og 270 nm (E^ = 110); lem ΙΑ c) i metanol indeholdende 0,1N NaOH: 251 nm (Ε!Γ = 264) lem og a/290 nm (skulder).

20 o A/16686 faktor A^ har specifik rotation [a]* på 25 +57 + 4° (c = 0,51 i H20).

R^-værdierne for A/16686 faktor i forskellige papirkromatografiske systemer med Bacillus subtilis ATCC 6633 som opdagelsesorganisme fremgår af følgende tabel.

Tabel 6 30 Kromatografisk opførsel af A/16686 faktor A1 ("Whatman" nr.

1 papir; nedløbende kromatografering; Rm = 40 cm; mængde 50 μg af forbindelsen opløst i'K^O/CH^CN 1:1 (rumfang; 2 mg/ml)).

12 149337

Elueringssystem R^-værdi 1) n-butanol mættet med Sorensens puffer pH 6,0 0,00 2) n-butanol mættet med vand indeholdende 5 2% p-toluensulfonsyre 0,00 3) n-butanol mættet med vand indeholdende 2% ammoniumhydroxyd 0,00 4) Sorensens puffer pH 6,0, mættet med n- butanol 0,05 10 5) n-butanol/metanol/vand 4:1:2 0,48 6) ætylacetat mættet med vand 0,00 7) n-butanol/eddikesyre/vand 2:1:1 0,44

Rf-værdierne for A/16686 faktor A1 i forskellige tynd-lagskromatografiske systemer er anført i følgende tabel (be-15 tingeiserne er angivet under tabellen).

Tabel 7

Elueringssystem (rumfang) R^-værdi 1) vandigt 2,5%s HCOONH4/CH3CN 65:36* 0,40 2) n-butanol/eddikesyre/vand 4:2:5 0,80 20 3) n-butanol/eddikesyre/vand 4:2:5 0,52

4) n-propanol/n-butanol/lN NH^OH

2:3:4 (øvre fase) 0,12 5) ri-butanol/eddikesyre/vand 4:1:5 0,15

Rm: ca. 140 mm.

25 Mængder:2-5 μΐ af en opløsning (1 mg/ml) i CH3CN/H20 1:1 (rumfang).

Synliggørelse: a) joddampe b) ultraviolet lys ved 254 nm.

1,2-Silaniseret silikagel 60 P254-plader ("Merck"): synliggørelse a,b; 3,4,5-silikagel 60 F254 "Merck": synlig-30 gørelse a (* interne standarder: koffein R^ 0,60; cortison Rj 0,35; dexametason R^ 0,30).

Aminosyreanalyse af A/16686 faktor A1 efter sur hydrolyse i 6N saltsyre ved 110°C i 6 timer viser tilstedeværel- 149337 13 se af mindst følgende aminosyrer: alanin, leucin, glycin, asparaginsyre, fenylalanin, ornitin, p-hydroxyfenylglycin og hydroxy, klor-substitueret fenylglycin.

Analyse af et syrehydrolysat af A/16686 faktor A^ 5 efter 2 timer i 2N HgSO^ ved 100°C viste tilstedeværelse af det neutrale kulhydrat D-mannose.

HPLC-analyse af antibiotikum A/16686 faktor A^ under anvendelse af en "μ-Bondapack C^g"-kolonne (3,9 mm indvendig diameter x 300 mm) og en blanding HCOONH^ 0,25 M/CHgCN 60/40 10 (rumfang) som den mobile fase ved en strømningshastighed på 2 ml/min. gav en tR på 3' ^/loo" (interne standarder: antracen tR 35' 18/]_oo"? a-nitronaftalen tR 11' 14/ioo"; toluen 8' 64/10Q").

A/16686 faktor Ag 15 A/16686 faktor Ag er et hvidt amorft puvler som smel ter under sønderdeling ved ca. 220°C. Det er meget opløseligt i vand, dimetylformamid og vandig metanol; det er opløseligt i metanol og ætanol men er uopløseligt i ætylæter, petroleumsæter og benzen.

20 Elementæranalyse af A/16686 faktor Ag, i forvejen tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære, viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kulstof 48,41%, hydrogen 5,84%, nitrogen 9,09%; rest 9,1%. Kloranalyse giver følgende resultater: totalt klorindhold 25 1,68%, klorioner 1,16%. Det infrarøde absorptionsspektrum af A/16686 faktor Ag i nujol fremgår af tegningens fig.

6. Følgende absorptionsmaxima er konstateret: 3290, 2930 og 2860 (nujol), 1765, 1635, 1510, 1455 og 1375 (nujol), 1260, 1240, 1175, 1100, 1060, 1020, 975, 840 og 805 cm-1.

30 Det ultraviolette absorptionsspektrum af A/16686 faktor Ag, der er vist i tegningens fig. 7, udviser følgende absorptionsmaxima: 1% a) i neutral metanol: 234 nm (Elcm = 147) og 267 nm (E?-% = 74) ; lem ..

b) i metanol indeholdende 0,1N HC1: 232 nm (ΕΓ = 132) 35 ία J-CIfl og 270 nm (Ej*m = 76); c) i metanol indeholdende 0,1N NaOH: 250 nm (E^m = 20 14 149337 202), **295 nm (skulder).

A/16686 faktor A3 har specifik rotation, [α]^ / på +50 +4° (c = 0,48 i N/100 HC1).

R^-værdierne for A/16686 faktor A^ i forskellige pa-5 pirkromatografiske systemer med Bacillus subtilis ATCC 6633 som opdagelsesorganisme fremgår af følgende tabel:

Tabel 8

Kromatografisk opførsel af A/16686 faktor A^ ("Whatman" nr.

1 papir; nedløbende kromatografering; Rm = 40 cm; mængder: 10 50 pg af forbindelsen opløst i HjO/CHjCN 1:1 (rumfang); 2 mg/ml)).

Elueringssystem Rf-værdi 1) n-butanol mættet med Sorensens puffer pH 6,0 0,00 15 2) n-butanol mættet med vand indeholdende 2% p-toluensulfonsyre 0,00 3) n-butanol mættet med vand indeholdende 2% ammoniumhydroxyd 0,00 4) Sorensens puffer pH 6,0 mættet med n-butanol 0,05 20 5) n-butanol/metanol/vand 4:1:2 0,48 6) ætylacetat mættet med vand 0,00 7) n-butanol/eddikesyre/vand 2:1:1 0,44 R^-værdien af A/16686 faktor A^ i forskellige tynd-lagskromatografiske systemer fremgår af følgende tabel (idet 25 betingelserne er angivet under tabellen).

Tabel 9

Elueringssystem R^-værdi 1) vandigt 2,5%s HCOONH4/CH3CN 65:35* 0,32 2) n-butanol/eddikesyre/vand 4:2:5 0,80 30 3) n-butanol/eddikesyre/vand 4:2:5 0,52 4) n-propanol/n-butanol/IN NH^OH 2:3:4 (øvre fase) 0,12 5) n-butanol/eddikesyre/vand 4:1:5 0,15

Rm: ca. 140 mm 149337 15 Mængder: 2-5 μΐ af en opløsning (1 mg/ml) i CH-jCN/ H^O 1:1. Synliggørelse: a) joddampe b) ultraviolet lys ved 254 nm.

1,2-Silaniseret silikagel 60 P254~plader ("Merck"): 5 synliggørelse a, b; 3,4,5-silikagel 60 F254-^a<*er ("Merck"): synliggørelse a. (* interne standarder: koffein Rf 0,60; cortison 0,35; dexametason R^ 0,30).

Aminosyreanalyse af A/16686 faktor A3 efter sur hydrolyse i 6N saltsyre ved 110°C i 6 timer viste tilstedeværelse 10 af mindst følgende aminosyrer: alanin, leucin, glycin, aspa-raginsyre, fenylalanin, ornitin, p-hydroxyfenylglycin og hydroxy, klor-substitueret fenylglycin.

Analyse af et syrehydrolysat af A/16686 faktor A3 efter 2 timer i 2N H2S04 ved 100°C viser tilstedeværelse 15 af det neutrale kulhydrat D-mannose.

HPLC-analyse af antibiotikum A/16686 faktor A3 under anvendelse af en "μ-Bondapack C^g"-kolonne (3,9 mm indvendig diameter x 300 mm) og en blanding HCOONH^ 0,025M/CH3CN 60/40 (rumfang) som den mobile fase med en strømningshastig-20 hed på 2 ml/min. gav en tR på 6' 84/^qq". (Interne standarder: antracen tR 35' 18/^qq"; α-nitronaftalen tR 11' 14/^oo"' toluen tR 8' 64/100".

Antibiotikum A/16686 faktor A2 såvel som faktorerne A^ og A3 er antimikrobielle midler og er særlig aktive mod 25 grampositive mikroorganismer. Aktivitetsspektret in vitro for A/16686-antibiotika er angivet i uddrag i nedenstående tabel 10, hvor MIC står for mindste inhiberende koncentration.

16 149337

Tabel 10 _ MIC, μg/ml

Organisme Faktor Faktor Faktor _^_^2_A3 5 S. aureus ATCC 6538 0,1 0,1 1,6 3 S. aureus Tour (inoculum 10 /ml) 0,2 0,2 1,6 tf S. aureus Tour (inoculum 10 /ml) 0,4 0,8 3,1 S. aureus Tour (+ 30% okseserum) 0,4 0,8 1,6 S. pyogenes C 203 SKF 13400 0,012 0,012 0,012 10 S. pneumoniae Felton UC 41 0,025 0,025 0,025 S. foecium ATCC 10541 0,1 0,05 0,1 E. coli SKF 12140_>100 >100 >100 A/16686-antibiotikerne har også vist at have en høj aktivitetsgrad in vivo mod forskellige patogene organismer.

15 Effektiviteten af A/16686-antibiotika fremgår tydeligt af tabel 11, der viser ED5Q-værdierne hos mus mod to forskellige mikroorganismer.

Tabel 11 ED^q mg/ml dag subkutant 20 S. pyogenes S. pneumoniae C 203 SKF 13400 Felton UC 41 A/16686

Faktor Αχ 0,041 (0,012-0,064) 0,15 (0,17-0,14) A/16686 25 Faktor A2 0,048 (0,026-0,070) 0,18 (0,20-0,16) A/16686

Faktor A3 0,14 (0,096-0,21) 0,41 (0,46-0,36) A/16686-forbindelser inhiberer også væksten af mikroorganismer som bidrager til udvikling af periodontale syg-30 domme. Denne vigtige egenskab hos A/16686-forbindelser, bestemt ved hjælp af prøver under anvendelse af et kunstigt Streptococcus mutans ATCC 25175-plaks'ystem. I disse forsøg inbiberede A/16686-forbindelserne plakdannelse ved meget lave koncentrationer. A/16686-forbindelserne kan derfor 149337 17 bruges til behandling af tilstande som skyldes organismer der er følsomme derfor. Fx kan forbindelserne bruges til behandling af Streptococ- eller Staphylococinfektioner eller til prevention og behandling af opløsningen eller des-5 integrationen af tandemaljer og dentin på tænderne på grund af dentalcaries.

Ved sådanne behandlinger kan A/16686-forbindelserne bruges som frie baser eller som de tilsvarende ugiftige, fysiologisk acceptable syreadditionssalte. Desuden kan de 10 bruges som enkelte faktorer eller i betragtning af ligheden af deres aktivitetsmønster, også i form af blandinger af to eller alle disse tre faktorer i et hvilket som helst mængdeforhold.

Til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfin-15 delsen henvises til de følgende udførelseseksempler.

Eksempel 1 Gæring med stammen Actinoplanes sp. ATCC 33076

En kultur af Actinoplanes sp. ATCC 33076 fordyrkes ved dyrkning af stammen i rystekolber indeholdende hver 20 100 ml af et vandigt næringsmedium med følgende sammensæt ning: Kødekstrakt 3 g/1 Gærekstrakt 5 g/1

Trypton 5 g/1 25 ' Opløselig stivelse 24 g/1

Glukose 1 g/1

CaC03 4 g/1

Kolberne rystes i ca. 96 timer ved 28-30°C og indholdet udhældes derefter i en krukkefermentor indeholdende 4 30 liter af samme vegetative medium og fordyrkes i 48 timer ved samme temperatur. 3 liter af denne forkultur bruges derefter til podning af en større krukkefermentor indeholdende 30 liter af samme næringsmedium som ovenfor og fordyrkes aerobt i 24 timer ved 28°C. Til slut bruges 20 liter af den-35 ne forkultur til podning af en tankfermentor indeholdende 200 liter af et vandigt næringsmedium med følgende sammensætning: 18 149337 Kødekstrakt 4 g/1

Pepton 4 g/1 Gærekstrakt 1 g/1

Natriumklorid 2,5 g/1 5. Sojamel 10 g/1

Glukose 25 g/1

CaC03 5 g/1 Gæringsmediet med indhold inkuberes derefter aerobet under omrøring ved 28-30°C. Med mellemrum bestemmes den an-10 tibiotiske aktivitet mikrobiologisk ved agardiffusionsmetoden med Sarcina lutea ATCC 9341 som testorganisme. Den maximale aktivitet opnås efter 72-120 timers gæring.

Fraskillelse af antibiotikum A/16686-komplekset 15 Hele gæringsmediet (170 liter) fremstillet som beskre vet foran afkøles til 10°C og bringes til pH 3,5 ved hjælp af 18%s HC1. Det resulterende sure medium filtreres ved hjælp af filterhjælp ("Clarcel Flow-Ma"), og mycelieka-gen vaskes med vand.

20 30 liter metanol bruges til at ekstrahere myceliemas- sen, som efter filtrering ekstraheres på ny med en blanding af metanol og vand (30 liter metanol + 5 liter vand). Det udpinte mycelium kasseres og de to metanolekstrakter koncentreres under vakuum ved en temperatur under 40°C til frembrin-25 gelse af et vandigt koncentrat (6 liter). Dette vandige koncentrat ekstraheres med 3 portioner n-butanol på hver 10 liter og derefter kombineres portionerne og koncentreres til et ringe rumfang under vakuum.

Dette koncentrat sættes til petroleumsæter og det 30 resulterende bundfald fraskilles ved dekantering og sættes til en yderligere mængde petroleumsæter. Bundfaldet fraskilles ved filtrering og tørres under vakuum ved stuetemperatur til 80 g antibiotikum A/16686-kompleks som råmateriale med en MIC (mindste inhiberende koncentration) mod S. pneumoniae 35 UC 41 på 0,1 μg/ml.

149337 19

Rensning af antibiotikum A/16686-komplekset a) 47,7 g af det rå antibiotikum A/16686-kompleks, behandledes med 1,4 liter af en blanding af 5 kloroform/ætanol/vand 4:7:2 (rumfang) og det derved dannede olieagtige produkt fraskilles fra opløsningen ved dekantering. Yderligere 70 ml af ovennævnte blanding sættes derefter til det olieagtige produkt og fraskillelsen gentages.

Ved behandling af det olieagtige produkt med 440 ml vand 10 størkner det og det fraskilles ved centrifugering eller filtrering .

Det fraskilte faste stof suspenderes i 170 ml vand, opløses ved tilsætning af 400 ml metanol og filtreres. Den vandige metanolopløsnings pH bringes til 3,5 ved tilsætning 15 af IN HC1 og derpå afdampes opløsningsmidlerne under vakuum ved tilsætning af n-butanol ved en temperatur der aldrig overstiger 35°C, hvorved der vindes et butanolkoncentrat på ca.

50 ml. Ved tilsætning af 500 ml diætylæter dannes der et bundfald som fraskilles ved filtrering og tørres under vakuum 20 ved stuetemperatur; der vindes 1,012 g temmelig rent antibiotikum A/16686-kompleks med en MIC mod S. pyogenes på 0,025 μg/ml.

b) 1,58 g antibiotikum A/16686-kompleks, vundet som beskrevet foran, opløses i 100 ml af en blanding af lige rum- 25 fangsdele acetonitril og ^0, og den resulterende opløsning anbringes på en kolonne indeholdende 430 g silikagel 60 ("Merck", 0,06-0,2 mm) tilberedt i samme blanding. Kolonnen fremkaldes først ved hjælp af samme acetonitril/vand-blanding og opsamling af 70 fraktioner på hver 20 ml, og derefter 30 ved hjælp af en blanding af lige dele acetonitril og N/100 HC1, hvorefter der opsamles yderligere 290 fraktioner på hver 20 ml.

Eluering af kolonnen overvåges ved tyndlagskromatografi på 60 silikagelplader og ved bedømmelse af fraktio- 35 nerne mod Sarcina lutea.

20 um?

Fraktionerne nr. 130-265 forenes og opløsningsmidlerne afdampes under vakuum med n-butanol til frembringelse af et koncentrat af n-butanol på 20 ml. Det resterende rumfang udhældes i en stor mængde ætylæter og det dannede bund-5 fald fraskilles ved filtrering og tørres under vakuum ved stuetemperatur over P2°5' hvorved <3er vindes 1,015 g antibiotikum A/16686-kompleks.

c) 0,67 g af ovennævnte substans opløses i 24 ml vand og 76 ml metanol. Den resulterende opløsning anbringes på 10 en 3,0 x 62,0 cm kolonne indeholdende 220 g "Sephadex" LH-20, tilberedt i metanol/vand 7:3. Kolonnen fremkaldes med samme blanding under opsamling af fraktioner på 10 ml. Fraktioner indeholdende antibiotikum A/16686-kompleks forenes og opløsningsmidlerne afdampes under vakuum ved en tempera-15 tur på under 35°C med n-butanol til et resterende butanol-rumfang på ca. 10 ml. Denne opløsning sættes til ætylæter til udfældning af rent antibiotikum A/16686-kompleks. Bundfaldet fraksilles ved filtrering, vaskes med ætylæter og tørres under vakuum over P2®5 ve<·* stuetemperatur; der vindes 20 0,26 rent antibiotikum A/16686-kompleks.

Det på denne måde vundne antibiotikum A/16686-kompleks er et hvidt, krystallinsk, svagt hygroskopisk materiale som smelter ved 224-226°C. Det er meget opløseligt i vand og dimetylformamid, opløseligt i metanol, ætanol, propanol og 25 butanol, men uopløseligt i ætylæter, petroleumsæter og benzen. Elementæranalyse af det på denne vundne A/16686-kompleks, i forvejen tørret ved 140°C under en inert atmosfære, viser følgende omtrentlige procentvise sammensætning (som gennemsnit af flere analyser): kulstof 51,73%, hydrogen 6,34%, 30 nitrogen 9,96%, rest 1%. Kloranalyse giver følgende resultater, samlet indhold af klor 5,48%, klorioner 4,74%. Det infrarøde spektrum i nujol udviser følgende absorptionsmaxima (i cm-1): 3290, 3070, 3920 og 2860 (nujol), 1765, 1630, 1510, .1455 og 1375 (nujol), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 35 980, 840 og 820.

Det ultraviolette absorptionsspektrum for antibiotikum A/16686-kompleks, udviser følgende absorptionsmaxima: 149337 21 a) i metanol 232 run (E^*m = 178) og 265 nm (E^m = 107); b) i metanol indeholdende 0,1N HC1; 231 nm <m=167> og 270 nm <m=96>' 5 c) i metanol indeholdende 0,1N NaOH: 250 nm (E^cm = 232) og 295 nm (skulder); d) i metanol indeholdende pH 7,38 puffer: 231 nm <eL- 167> °9 270 n" 1Eicm= S6)· 24

Komplekset har specifik rotation, [a]^ , på +49,7 10 (c = 0,43% i DMF) .

Rf-værdierne for antibiotikum A/16686-kompleks i forskellige papirkromatografiske systemer under anvendelse af S. aureus ATCC 6538 som detektionsorganisme fremgår af følgende tabel.

15 Tabel 12

Kromatografisk opførsel ("Whatman nr. 1" papir; nedløbende kromatografi; Rm = 40 cm; mængder: 20 μg af forbindelsen opløst i vandig metanol (2 mg/ml)) af antibiotikum A/16686-kompleks.

20 Elueringssystem R^-værdi 1) n-butanol mættet med Sorensens puffer pH 6,0 0,00 2) n-butanol mættet med vand indeholdende 2% p-toluensulfonsyre 0,00 25 3) n-butanol mættet med vand vand indeholdende 2% ammoniumhydroxyd 0,00 4) Sorensens puffer pH 6,0, mættet med n-butanol 0,05 5) n-butanol/metanol/vand 4:1:2 0,43 30 6) ætylacetat mættet med vand 0,00 7) n-butanol/eddikesyre/vand 2:1:1 0,52 8) n-butanol/pyridin/vand 4:3:7 0,87

Rf-værdierne for antibiotikum A/16686-kompleks i forskellige tyndlagskromatografiske systemer fremgår af følgen-35 de tabel (betingelserne er angivet under tabellen): 22 149337

Tabel 13

Elueringstemer (rumfangsforhold) Rf-værdier I) n-propanol/n-butanol/N ammoniumhydroxyd 2:3:4 (øvre fase) 0,15 5 2) n-butanol/eddikesyre/vand 4:2:5 0,61 3) n-butanol/ætanol/0,lN saltsyre 0,61 4) kloroform/ætanol/10%s eddikesyre 4:7:2 0,00 5) n-butanol/eddikesyre/vand 4:1:5 0,17 6) metanol/10%s vandigt ammoniumacetat/10%s 10 ammoniumhydroxyd 10:9:1 0,52 7) n-butanol/pyridin/vand/eddikesyre 6:4:3:1 0,45 8) metanol/10%s vandigt ammoniumacetat/10%s ammoniumhydroxyd 10:9:1 0,11 9) 0,25M vandigt NaH2P04/acetonitril 1:1 0,68 15 10)metanol/10%s vandigt ammoniumacetat 1:1 0,65 II) n-butanol/eddikesyre/vand 4:2:5 0,77

Rm: ca. 140 mm Mængde: 2-5 μΐ af en opløsning (1 mg/ml) af forbindelsen i acetonitril/vand 1:1 (rumfang).

20 Synliggørelse: a) bioautografi på agarplader podet med Bacillus subtilis ATCC 6633; b) karbonisering ved opvarm- ning med α-naftolsvovlsyre; c) joddamp; d) klortoluidinrea-gens; e) ultraviolet lys ved 254 nm.

1-7: silikagel 60 ^254 Plader ("Merck"); synliggørel-25 se a, b, c, d, e.

8-9: silikagel 60 ?254 silaniseret ("Merck"); synliggørelse e, 10,11: cellulose F plader ("Merck"); synliggørelse a, e.

30 HPLC-analyse af antiobiotikum A/16686-kompleks, isole ret og renset som beskrevet, viste tilstedeværelse af tre faktorer benævnt A/16686 faktor A^, A2 og A^, af hvilke hovedfaktoren, der andrager ca. 70-87%, er A/16686 faktor A2. Resultaterne af HPLC-analysen og de betingelser 35 under hvilke den gennemførtes, er nærmere belyst i følgende tabel (idet toluen, ot-nitronaftalen og antracen er blevet anvendt som interne standarder): 149337 23

Tabel 14

Top nr. tR

3' 84/io7 A2 4· 99/100" 5 A3 6· 84/100" toluen 8' 64/^0g" α-nitronaftalen 11' 14/^qq" antracen 35' 18/^qq"

Kolonne: "μ-Bondapack Clg" (3,9 mm ID x 300 mm).

10 Mobil fase: HCOONH^ 0,025M/CH3CN 60:40 (rumfang) .

Strømning: 2 ml/min.

o

Tryk: 2000 psi (140,6 kg/cm ).

Detektor: UV 254 nm.

Eksempel 2 15 Adskillelse af faktorerne A^, A2 og Ag af antibiotikum A/16686__ 169 mg A/16686-kompleks, vundet som beskrevet i eksempel 1, opløstes i 6,5 ml 0,01N saltsyre og 10,4 ml destilleret vand. Ved reversfase-HPLC (kolonne: "μ-Bondapack Clg" 20 (7,8 ml indvendig diameter x 300 mm; en silaniseret silika- gel funktionaliseret med Clg alkylgrupper), strømning 4 ml/min., tryk 140,6 kg/cm2, mobil fase: 0,025M HCOONH4/CH3CN 65:35 (rumfang)) med gentagne indsprøjtninger af 1 eller 2 ml af ovennævnte opløsning opsamledes der fraktioner indeholdende 25 de enkelte faktorer, og de kontrolleredes yderligere ved hjælp af analytisk HPLC. Fraktionerne koncentreredes under vakuum ved en temperatur på under 35°C ved tilsætning af butanol for at nedsætte skumdannelse. De tilbageværende opløsninger frysetørredes og de vundne faste stoffer blev hver 3g for sig optaget i destilleret vand og frysetørredes; der fremkom 10 mg A/16686 faktor A^, 95 mg faktor A2 og 12 mg faktor Ag. Ved frysetørring af en saltsyreopløsning af A/16686 faktor A2, vundet som netop beskrevet, vindes det tilsvarende hydroklorid som et amorft hvidt pulver der sønder-35 deles ved 250°C.

24 149337

Eksempel 3

Adskillelse af antibiotikum A/16686 faktor A^

100 mg antibiotikum A/16686-kompleks, vundet som beskrevet i eksempel 1 b) (titer:''» 40%) opløstes i 15 ml 0,1N

5 saltsyre. Den resulterende opløsning anbragtes på en kolonne (?) af "Amberlite" ^ XAD-2 (136 ml; lejets højde 60 cm; en ikke-funktionaliseret polystyrenharpiks), i forvejen vasket med CH^CN og med destilleret vand. Kolonnen fremkaldtes med en lineær gradient 0-34 rumfangs% CH^CN/vand, eluering og op-10 samling af 250 fraktioner på hver 10 ml.

vejen vasket med CH^CN og med destilleret vand. Kolonnen fremkaldtes med en lineær gradient 0-34 rumfangs% CH^CN/vand, eluering og opsamling af 250 fraktioner på hver 10 ml.

Fraktionerne nr. 185-225, der indeholdt A/16686 faktor 15 A2 alene, forenedes og koncentreredes under vakuum ved en temperatur på under 35°C ved tilsætning af butanol for at nedsætte skumdannelse. Den resulterende opløsning frysetørredes og gav 6,7 mg antibiotikum A/16686 faktor A2.

Eksempel 4 20 Fraskillelse af antibiotikum A/16686 faktor A^ 100 mg antibiotikum A/16686-kompleks, vundet som beskrevet i eksempel 1 a) (titer: 53,5%) opløstes i 10 ml

CH,CN/0,025M vandigt HCOONH. 27/73 (rumfang). Den resulteren-J

de opløsning anbragtes pa en kolonne af "Amberlite" ^ XAD-2 25 (200 ml, lejets højde 52 cm; en ikke-funktionaliseret poly styrenharpiks), i forvejen vasket med først 0,025M HCOONH^ og derpå med CH.jCN/0,025M HCOONH^ 27/73 (rumfang).

Kolonnen fremkaldtes med en lineær gradient 27-40%s CH3CN/0,025M HCOONH4 under opsamling af fraktioner på 10 30 ml op til 400 ml og derefter af fraktioner på 6 ml til et samlet rumfang elueringsmiddel på 2 liter. De eluerede fraktioner kontrolleredes ved analytisk HPLC, forenedes i henhold til faktorindholdet og tritreredes ved HPLC, hvorved følgende resultater opnåedes: 149337 25

Fraktion % A/16686 % A/16686 % A/16686 faktor A^ faktor A2 faktor A3 31-41 90,1 9,9 0 42-50 53,9 46,1 0 5 51-59 17,9 82,1 0 60-65 4,4 93,7 1,9 66-75 0 94,2 5,8 76-80 0 83,7 16,3 81-99 0 46,1 53,8 10 100-110_0_6/7_93,3

Fraktionerne nr. 60-75, der indeholdt 94% rent antibiotikum A/16686 faktor A2, koncentreredes under vakuum ved en temperatur på under 35°C ved tilsætning af butanol, og den tilbageværende opløsning frysetørredes, blev optaget 15 i destilleret vand og frysetørret på ny, hvorved der fremkom 19,7 mg A/16686 faktor A2.

Eksempel 5

Fraskillelse af antibiotikum A/16686, faktor A·^ og A^

En opløsning af 650 mg A/16686-kompleks, vundet som 20 beskrevet i eksempel 1 a) (titer 53,5%), opløses i en blanding af CH,CN/0,025M HCOONH. 26/74 (rumfang) og den dannede opløsning perkoleredes gennem en kolonne af "Amberlite" ^ XAD-2 (1900 ml, lejets højde 130 cm), i forvejen vasket med samme opløsningsmiddelblanding og med en strømningshastighed 25 på ca. 9 ml/min.

Der opsamledes et rumfang på 100 ml og derpå fremkaldtes kolonnen med samme opløsningsmiddel ved samme strømningshastighed under opsamling af 300 ml store fraktioner op til 18,3 liter og derefter 500 ml store fraktioner op til et 30 samlet rumfang på 21,3 liter. De eluerede fraktioner kontrolleredes ved analytisk HPLC, forenedes i henhold til faktorindholdet og titreredes ved HPLC, hvorved følgende resultater opnåedes: 26 149337 * * σισιυΐιΡ»ωιοωΜ(θΜ(-ιΐτ](ΐ><Ό> * ιί>Μ«)Ό^αιΙΟΟΟνΐυΐΰ4 XCH\ ' i i i i i i i ι i ro tn 3 ro h oioioi<jiiP»u>wu> to μ . p, x i5i pj O' O' ^uihcococouii-1 σι ·ρ» r+ ro in oi Hi ro (D Η· ω ri- oo ran 0 tn σι

> ft 0) 3 JU Η· Ο I

\ π» vq — % π H 3 3 0 σι r+ (δ 3 σι rt i oo < σι ro Ό

Qj pjo Μι

p) tn O' Hi dP

X ¢1 ¢1 H (U _ r+ 3 tn η·^όοοοη Pf > 03 H· OOOOOUILntOWOO Ό ft \ ι-i ro cn - -- - oh 3 ip» to oo ip» ι-i σι > 1-· pj σι N) H- Hi >00 • iq i-1 σι 3 < * η- ro

3 CL

iQ pr Hi dP

ο h j» pi§ MPOlflOlilCOUlWtO ~J >

Hi 3 oojo+oooiui-joioo h r+ \ fl) , , , , - - » - 0 I—1 3*3 oiuioovj σι oo to o Hoi ® ft ^ 01 i_i.ro >00 Q, to Ol ro (+ * 3 0 Ό

pj *13 Hi dP

hi cd o> tn oo ui to l-1 pf > < VOOllO-JOOOOOOO H ft \

fl) 3" ' ' ' ' ' OH

p ® iP U1 ID liJ σι HOI

pf t_i. oi 0 CL > oo §0) ω σι 3 H * 0) ---------- 3 CL Hi > ro η oi 3 ro \

I I I I I Η >P» «3 H CO ·Ρ» O a ?f H

(+ ,,,,,, , -(+01 Ο m co in oi to » ui +001 Ό + 1-( 00 oi 3 > ro h

CL

(-1 to 3* ιΡ» ο ω to t-> it» Hi > ® UMLOOUvlUI-ilO I OI 3 pi \ i_i. ,,,,,,,,,, , a ?ch CL (jjoioooi-joitoi-iui-1 ip» — i+ σι ro + o oi

3 * H CO

01 ro >

Hi to

CD

3 to ιΡ» Hi > co cj p υ I i i i i i i o 3 ro \ tn ,,, , q^h r+ l < to w -(+01 p> + 0 σι 3 +1+00

CL OI

ro > t+ to

CL Ό H

S H GJ p3 < LO iP»OU)GJtO ΜΗ Ip» 30 ro ΡΟΐυΐιΡΊιΡΙΟΙΟί>ΟιΡ> Ό cQ (+

* <· * Ί * * ·*«·<·«« w QJ

UiO'JOHOO <J\ VO U) (ft* H