HU180710B - Equipment for the isolation by extraction of natural terpenes active against psoriasis from leaves and rhizomes of fern and for preparing pharmaceutical compositions from the extract - Google Patents

Description

Conrad Limited, Nassau, Bahamas

Eljárás pikkelysömör ellen hatásos, természetes terpének extrakciós kinyerésére páfrányok leveléből és rizómáiból, és gyógyszerkészítmények előállítására az extraktumból

A találmány tárgya eljárás pikkelysömör (psoriasis) ellen hatásos. természetes terpének extrakciós kinyerésére Dryopteris crassirhizoma, Polypodium vulgare Linn, Polypodium leucotomos, Phiebodium decumanum J. Smith, Polypodium decumanum, Cyathea taixvaniana leveléből és rizómiáiból és Polypodium aureum Linn és Polypodium triseriale rizómáiból, oly módon, hogy

A rizómákat 2—3 cm-es csíkokra vágjuk és a rizómacs'íkokat és leveleket forgó fémszitán 70 C alatti hőmérsékleten folyamatos szárításnak vetjük alá, az ST-nál kisebb nedvcsséglartalmú szárított anyagot tárcsás malomban 2 mm-nél kisebb átmérőjű és körülbelül 0.36 g/cm³ sűrűségű részekre aprítjuk fel, a fclapriiott anyagot 1,890—9,08 dielektromos állandójú oldószerrel extraháljuk, az oldószert lepároljuk, a maradékot tisztítjuk.

A psoriasis és a yarapsoriasis a test bármely részén keletkezhet, sőt a beteg bőrét tetőtől talpig, a teljes bőrfclületen is megtámadhatja. Ezeknek a betegségeknek a súlyossága tehát attól függ, mekkora börfcluleten jelentkeznek és milyen mélyen hatolnak be a bőrbe. Bár a betegség jelei a bőrön mutatkoznak, nem szabad figyelmen kívül hagyni, hogy a psoriasis megtámadja az ízületeket és a szöveteket, például a máj és a vese szöveteit is, minek következtében a psoriasisos betegen a cukorbetegség, a reuma, sőt a betegség előrehaladott állapotában a veseclégtelenség tünetei jelennek meg cs a beteg állapota erősen leromlik.

A psoriasisban szenvedő emberek száma folyamatosan növekszik; ennek egyik fő oka a recesszív jellegű genetikai transzmisszió jelenségében rejlik. A WHO becslése szerint a népesség körülbelül l°<-a szenved a 5 psoriasis különböző klinikai formáiban.

A pikkelysömörrel kapcsolatos korábbi ismeretek ellenére a betegség gyógyítására vagy enyhítésére ezidáig gyakorlatilag alig történt kísérlet. Bizonyos citosztatikumok némiképp hatásosnak bizonyultak a betegség 10 kezelésére, de ezek a gyógyszerek nagymértékben toxikusak, ezért a betegek két alkalomnál többször nem kezelhetők velük.

Jelen pillanatban tehát a psoriasist olyan gyógyíthatatlan betegségnek tekintik, melynek tüneteit cyóeysze15 rés kezeléssel enyhítik és mely erősen korlátozza a betegeket mindennapi életükben.

Nemrégiben fedezték fel, hogy a Dryopteris crassirhizoma, a Polypodium vulgare Linn, a Polypodium leucotomos, a Phiebodium decumanum J. Smith, a Polvpo20 dium decumanum és a Cyathea taiwaniana leveléből és rizórráiból, és a Polypodium aureum Linn és a Polypodium triseriale rizómából izolált természetes terpének alkalmasak mindkét nemű és bármely korú psoriasisban vacy parapsoriasisban szenvedő betegek kezelésére. Ezek 25 a terpének fernént és izomerjeit valamint más terpéncket is tartalmaznak. 152 psoriasisos beteget kezeltek orálisan 200 mg napi adaggal; ez a kezelés 80<-uknál 1—3 hónap lünetmentességet eredményezett. Kellős vakpróbás tesztekben vizsgálva a fennen hatékonynak bizo30 nyúlt az ugyanolyan alakú és méretű kiszerelésben be180710

-1180710 ι

ίί

D; Tisztítás

a) Az extraktum félig szilárd maradékát felvesszük n-hexán: víz= 10: 4 arányú elegyében, egy éjszakán át állni hagyjuk szeparátorban, majd a sókat és a cukrokat eltávolítjuk a vizes fázissal.

b) Az n-hexános oldathoz térfogata ’/jc-ed részének megfelelő 10—20%-os etanolos kálium-hidroxid oldatot adunk, időnként keverjük, majd 6 órán keresztül állít) ni hagyjuk. Az n-hexános fázist vízzel közömbösre mossuk.

c) Bepárlás után a maradékot felvesszük térfogata háromszorosának megfelelő mennyiségű 96 _;,-os etanolban és állni hagyjuk a csapadékkiválás befejeződéséig, ami szobahőmérsékleten általában 48 órát vesz igénybe.

d· A csapadékot átlagos porozitású üvegszűrcn szűrjük és leszívásuk, 96%-os etanoliaí gyakorlatilag színtelenre mossuk és csökkentett ny omáson káliam-hidroxid vagy koncentrált kénsav felölt szárítjuk.

c) A csapadekot feloldjuk annyi n-hexánban, hogy 10 súly°ó-os oldatot kapjunk 20 C körüli szobahőmérsékleten.

f) Az oldalét 5x 100 vagy 10 : 200 cm-es. az anyag mennyiségétől függően 5G0—1000 g-os S!—60 Geduran oszlopon (0,063—0,2 mm, Merek) kromatografáljuk és n-hexánnal eluáljuk. Ha két liter elvátum jön le, a férőén az első, egy literes frakcióban van.

g) Az n-hexános oldatot körülbelül 10°„ kor.ccntrá- cióra pároljuk be, majd szobahöniétscKieten kristályosodni hagyjuk. A kristályokat szűrjük és leszívatjuk, és az anyalúgot újra bepároljuk, így egy második kristályfrakciót nyerünk.

h) Egy másik módszer szerint semleges A'₂O₃ oszlo- pót használunk 5 x100 cm-es méretben és n-hexánnal eluálunk. Ebben az esetben az eluátum Csak fernént tartalmaz.

i) Az átkristályosítást forró abszolút etanolban hajtjuk végre.

A találmány szerinti vegyületeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítményeket úgy állítjuk elő, hogy a fernént a gyógyászatban általában alkalmazott hordozóanyagokkal keverjük össze a gyógyászatban általában szokásos módszerek alkalmazásával és dózisok45 bán. Az így előállított gyógyszerkészítmények is a találmány tárgyát képezik. A hatóany ag, azaz a fernén olyan menny iségben van jelen a gyógyszerkészítményekben, mely alkalmas a megfelelő antisporiatikus hatás kifejtésére.

A találmány szerinti készítmények egységenként 1 — 100 mg találmány szerinti hatóanyagot tartalmaznak. A hordozóanyag lehet szilárd vagy folyékony. Szilárd hordozóként alkalmazhatunk például laktózt, magnezium-sziearálot, ierra a'.bát, szaccharózi, lalkumot, sztearinsavat, zselatint. ag:.'t, pekrint, gumiarábikumot, acrosilt vagy hasonló anyagokat. Folyékony hordozóként alkalmazhatunk például alkoholokat, úgymint etanolt vagy piOpiléngiil-.oI;, szoltabilizáló anyagot, úgy min·, policiiiénglikelt tartalmazó vizet, földiói? mogyorcolajal, olívaolajat vagy hasonló' anyagokat.

A hordozó- vagy hígítóanyag tartalmazhat valamely retardálószert is, például glicerin-monosztcarátot vagy glicein-disztearátot önmagukban vagy viasszal együtt. A gyógyszerkészítményeket számos kiszerelési for65 mában állíthatjuk elő. így pelaáui ha szilárd hordozót aladott placeboval szemben. A fernén különösen hatékony bármely psoriasisos vagy parapsoriasisos megbetegedés kezelésére, beleértve a tenvéren és talpon genynyes sebek alakjában jelentkező formát is.

A fernén hatását egereken cs patkányokon vizsgálva 5 azt tapasztalták, hogy nem befolyásolja a termékenységet és teratosén hatása sincs [Guidelines fór Reproduction Studies fór Safety Evaluation of Drugs fór Humán use, Food and Drus Administravion of tbc Ur.iied States, (1966)].

A fernén karcinogén hatását patkányokon vizsgálták 1 mg/testsúlykilogramm napi dózist adagolva 20 héten át, majd 7 héten keresztül figyelték a patkányokat, melyek egy részének húgyhólyagjába üvegszemcséket juttattak. Karcinogén hatást nem tapasztaltak. Az etikai- 15 mázott módszer leírása megtalálható Juli, J. kV.: Brit. J. Cancer. 5, 328 (1931); az alkalmazott statisztikai kiértékelési módszer leírását adja Arcos and Collaborators: Chemical Int'oduction of Cancer, 416. Academic Press Inc., New York (1963). 20

A fernén hatásmechanizmusa valószínüleg azzal a membrán működési zavarra! kapcsolatos, mely a sejtnövekedés szabályozásának megváltozását okozza az epidermis sejtjeinél (Orfanos. C. E., Mahrle. G.t Dermatologie, /?/, 199—215 (1976)].

A fernénnek nincs gyulladásgá'.ló vagy anabolikus szteroid hatása. Gyakorlatilag atoxikus 1 g/testsúlykilogramm menny iségig.

A tiszta férném laboratóriumi méretekben, igen kis mennyiségben Ageta és munkatársai izolálták [Tetrahedron Letters, 22. 1442—50, (1963)j.

A találmány tárgya aktív terpének előállítására szolgáló extrakciós eljárás ipari méretekben való végrehajtása, abból a célból, hogy a növények fentemlített részeiből az aktív terpéneket gyógyászati készítmények előállítására alkalmas mennyiségben nyerjük ki. Az optimális kitermelés eléréséhez a leveleket a sporangium kifejlődése után kell összegyűjteni.

A találmány szerinti eljárás a következő lépésekből áll:

A) Szárítás

A rizómákat 2—3 cm-es csíkokra vágjuk, a leveleket abban a formában szárítjuk, ahogy leszedték őket. A szárítás folyamatosan történik, az anyagot körülbelül 5 m széles és 25 m hosszú forgó femszitára adagoljuk. A szitát melegített térben forgatjuk, mely nek hőmérséklete 80 C alatt van. A forgó fémszita forgási sebességének változtatásával körülbelül fél tonna nedves anyagot száríthatunk meg óránként.

B) Granulálás

A száraz anyagot (maradék nedvességtartalom 5,'.nál kisebb) tárcsás malomban granuláljuk úgy. hogy a részecskék átmérője aprítás után 2 mm-nél kisebb (10-es ASTM szita) és sűrűségük körülbelül 0,36 g/cflP legyen.

C) Extrakció — bepárlás

Az cxtrakciót bármely oldószerrel végrehajthatjuk, melynek dielektromos állandója 1,890 és 9,08 között van. Előnyösen metanolt alkalmazunk 1:4 térfogatarányban.

-2180710

A maradékot melegítés közben feloldjuk 500 ml 96%-os etanolban, majd az oldatot 48 órán át állni hagyjuk, szűrjük és szárítjuk. Körülbelül 50 g anyagot kapunk.

A száraz csapadékot feloldjuk 1 liter n-hexánban és 100-10 cm-es Sí—60 Geduran oszlopon kromatografáljuk, 1 literes n-hexán adagokkal eluálva.

Az első 1 literes frakciót bepároljuk és a maradékot forró hexánból, benzolból vagy abszolút etanolból kris10 tálvosítjuk. A kitermelés 12 e. A kapott anyag a következő természetes terpéneket tartalmazza: fernen 7,20%, diploptén 2,4%, diokrasszol 1,8%. izofernén 1,82,,, más lerpének 3.6%.

2. példa kg szárított teljes növényt, melyet tárcsás malomban granulálva annyira aprítottunk fel, hogy 10-es 20 szitán (2,5 mrr.) álmenjen, folyamatosan extrahálunk nhexánnal szobahőmérsékleten, majd a hexános oldatot bepároíjuk körülbelül 10 liter térfogatúra és kálium-hidroxid 90%-os etanollal készített 10%-os oldatának 1 literével tisztítjuk szeparátorban egy éjszakán át. A hexános fázist vízzel semlegesre mossuk és szárazra pároljuk.

A maradékot felvesszük annyi forró benzolban, hogy telített oldatot kapjunk (körülbelül 1 liter). A csapadékot szűrjük, ehűtjük és forró benzolból vagy abszolút etanolból kristályosítjuk.

A kristályos anyagot feloldjuk 500 ml n-hexánban és 50 50 cm-es Sí—60 Geduran oszlopon (Merek— 35 Darmstadt) kromatografáljuk, fél literes oldószeradagokkal eluálva. Az eluátum első két frakcióját bepároljuk és forró hexánból, benzolból vagy abszolút etanolból kristályosttjuk. 38 g anyagot kapunk. A kapott anyag a következő természetes terpéneket tartalmazza: 40 fernén 22,80%, diploptén 7,6%, diokrasszol 5,7%, izofernén 4,5%, egyéb lerpének 11,40%.

3. példa kg száraz rizómát, melyet tárcsás malomban granulálva annyira apritóttunk fel, hogy 10-es szitán (2,5 mm) átmenjen, szobahőmérsékleten folyamatosan extraháiunk diklórmetánnal. A diklórmetános oldatot szárazra pároljuk és a maradékot felvesszük 5 liter n-hexánbar.

kalmazunk, a készítményt tablettákká alakíthatjuk, kemény zselatin kapszulába tölthetjük por vagy granulátum alakjában, vagy pasztillaként is formulázhatjuk. A szilárd hordozó mennyisége tág határok közt változhat, de előnyösen 25—250 mg. Ha folyékony hordozót 5 alkalmazunk, úgy a gyógyszerkészítményt előállíthatjuk szirup, emulzió, lágy zselatin kapszula, szuszpenziő vagy oldat formájában vagy steril injekcióként parenterális alkalmazás céljára, például ampullába töltve.

Nem soroljuk a találmány szerinti gyógyszerkészítmények szuszpenzió vagy oldat formájában kiszerelt alakjai közé azokat az egyszerű szuszpenziokat vagy oldatokat, melyek a hatóanyagból és valamely közönséges oldószerből állnak, mely nem alkalmas a szervezetbe való bejuttatásra és a kívánt fármakológiai hatás kifejtésére.

Az adagolás lehet orális vagy parenterális; előnyösen orálisan adagoljuk a találmány szerinti gyógyszerkészítményt. A hatóanyagot előnyösen ’GO—600 mg. még előnyösebben 50—300 mg napi dózisban alkalmazzuk. Előnyösen napi 1—4 ízben adagolunk azonos nagyságú dózisokat. Ezt az adagolási módot betartva a készítmény antipsoriatikus aktivitást fejt ki. 25

Mivel a psoriasis krónikus, alattomos betegség, melynek kifejlődése örökletes tényezőkre vezethető vissza, előnyös a gyógyszerkészítményt kapszula vagy tabletta formájában alkalmazni, hogy a gyógyszer koncentrációját a vérben állandó szinten tartsuk és igy a folyama- 3'3 tos hatás biztosítva legyen. Ha azonban hirtelen, súlyos formában kitört psoriasist kell kezelnünk, melyet valamely gyógyszer, például egy szteroid adagolása okozott, vagy spontán lépett fel, az intravénás injekció vagy a szérum folyamatos cseppenkénti adagolása a legcélszerűbb adagolási mód, hogy a krízist megelőzzük.

Gyermekek számára a gyógyszerkészítmény kiszerelhető cseppek vagy emulziók, olyan felnőttek számára pedig, akiknek a bélcsatorna alsó szakaszát károsító megbetegedései vannak, szuppozitóriumok formájában.

A gyógyszerkészítményeket az általános szokásos módszerek alkalmazásával állítjuk elő, például keveréssel. granulálással és préseléssel, ha az szükséges, vagy a megfelelő ható- és segédanyagok összekeverésével és oldatba vitelével. 45

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal kívánjuk szemléltetni, anélkül, hogy oltalmi körét a példákra akarnánk korlátozni.

1. példa kg granulált száraz levelet, mely 10-es szitán (2.5 mm) átmegy, 10 liter 96%-os etanollal extraháiunk 70 C hőmérsékleten 1 '/2 órán át. Az extraktumot szűrjük és a szűrőn 10 liter 96%-os etanollal mossuk. A leszűrt extraktumot enyhe vákuumban (20—30 Hgmm) szárazra pároljuk.

A maradékot felvesszük 15 liter n-hexán és 10 liter víz elegyében, cs szeparátorban állni hagyjuk egy éjszakán át. A vizes fázist eltávolítjuk és a hexános fázist kálium-hidroxid 90%-os etanollal készített 10%-os oldatának 5 literével tisztítjuk. Az így megtisztított hexártcs fázist vízzel semlegesre mossuk és szárazra pároljuk.

A hexános oldatot kálium-hidroxid 90%-os etanollal készített 10%-os oldatának 1 literével tisztítjuk egy éj55 szakán át, majd a hexános fázist vízzel semlegesre mossuk és bepároíjuk.

A maradékot felvesszük 1 liter n-hexánban és 100 x 10 cm-es Silicagel—60 oszlopon kromatografáljuk n-he60 xánnal eluálva. Az eluátum első két frakcióját bcpároljuk és a maradékot forró n-hexánból, benzolból vagy etanolból kristályosítjuk. 25 g anyagot kapunk. A kapott anyag a következő természetes terpéneket tartalmazza; fernén 15,7%, diploptén 5%. diokrasszol 3,75%, 65 izofernén 3.75%, egyéb terpének 7,50%.

-3180710 f 4. példa

I | 12 db szárított granulált egész növényt, melynek ré| szecskenagysága akkora, hogy 10-es szitán átmegy » (2,5 mm) 100 liter metanollal extraháljuk 70 C hőmér| sékleten 1 óra hosszat. Az extraktumot szűrjük és 20

I liter metanollal mossuk a szűrön.

A metanolos extraktumot bepároljuk és a maradékot Ϊ felvesszük n-hexán/víz 3 : 2elegyének 50 literében, majd í szeparátorban állni hagyjuk egy éjszakán át. A vizes fá| zist elválasztjuk és a hexános fázist kálium-hidroxid í 90%-os etanollal készített 20%-os oldatának 10 literéí vei tisztítjuk, vízzel semlegesre mossuk és szárazra pá|, roljuk, ,_: A maradékot feloldjuk 1 liter 96%-os forró etanolban ’ és szobahőmérsékleten állni hagyjuk 48 órát.

í ; A csapadékot szűrjük és csökkentett nyomáson, káI : lium-hidroxid felett szárítjuk.

| A száraz csapadékot feloldjuk 1 liter n-hexánban,

Í50x5 cm-es semleges Al₂O₃-on kromatografáljuk és n-hexánnal eluáljuk.

í f Az első öt liter eluátumot bepároljuk és a maradékot £ n-hexánból, ciklohexánból, forró benzolból vagy forró

1' ’ abszolút etanolból kristályosítjuk. 12—13 g anyagot kaI ; púnk. A kapott anyag a következő természetes terpé' ' neket tartalmazza: fernén 4,8%, diploptén 2,4%, diokrasszol 0,6%, izofernén 1,8%, egyéb terpének 0,6%. | Az 1—4. példákban kapott extraktumok fehér porok,

I amelyek olvadáspontja 300 ^CC felett van, szagtalanok és íztelenek, nem-poláros oldószerekben oldhatók és Liebermann-Burchard reagenssel pozitív reakciót adnak (analitikai tisztaságú kloroformban oldva, összerázva, ϊ (í szűrve, majd a kloroformos oldat mennyiségével azonos |i i mennyiségű Liebermann-Burchard reagensét adagoka |: rózsaszín színárnyalat jelenik meg, amely annál intenI:! zivebb, minél naa'obb a minta fernéntartalma).

h ϊ i Az IR-spektrum adatai a következők (KBr-pasztilláI i bán, Perkin—Elmer spektrofotométerrel felvéve, cm^-1):

p 1370—1390, 1450—1470, 2920—2960.

I

I 5. példa ϊ ’ A következő any agokból készítünk gyógyszerkészítI ményt:

I x Fernén 40 mg

I Laktóz 60 mg

I , Az anyagokat összekeverjük, szitáljuk és kemény

I : zselatin kapszulába töltjük. Az így kapott kapszulákból

M naponta hármat adunk a betegnek.

H'^;i i 6. példa

HÍ

H:j

A következő anyagokból készítünk gyógyszerkészitI ményt:

Fernén	60 mg
Szaccharóz	25 mg
Keményítő	20 mg
Talkum	5 mg
Sztearinsav	5 mg

A fernént és a szaccharózt összekeverjük és 10%-os zselatinoldattal granuláljuk. A granulátumot szitáljuk, szárítjuk, majd összekeverjük a kemény itö\el, a talkummal és a sztearinsavvai. Az anyagot szítáljuk és tablettákká alakítjuk.

7. példa

A következő anyagokból készítünk gyógyszerkészítményt :

Fernén 50 mg

Földimogvoróolaj 100 mg

Az anyagokat összekeverjük, lágy zselatin kapszulába töltjük.

Claims (3)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás pikkelysömör ellen hatásos, természetes terpének extrakciós kinyerésére Dryopteris crassirhizoma, Polvpodium vulgare Linn, Polypodium leucotomos, Phlebodium decumanum J. Smith, Polypodium decumanum, Cyathea taiwaniana leseiéből és rizómáiból és Polypodium aureum Linn és Polypodium triseriale rizómáiból, azzal jellemezve, hogy a rizómákat 2—3 cm-es csíkokra vágjuk és a rizómacsíkokat és levelekei forgó fémszitán 70 ^:C alatti hőmérsékleten folyamatos szárításnak vetjük alá, az 5%-nál kisebb nedsességtartalmú szárított anyagot tárcsás malomban 2 mm-nél kisebb átmérőjű és körülbelül 0,36 g/cm³ sűrűségű részekre aprítjuk fel, a felaprított anyagot 1,890—9,08 dielektromos állandójú oldószerrel extraháljuk, az oldószert lepároljuk, a maradékot tisztítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosílási módja, azzal jellemezve, hogy a maradék tisztítását a köxetkezö lépésekben végezzük:

   az extraklum félig szilárd maradékát n-hexán/víz 10:4 arányú clegyében oldjuk, szeparátorban állni hagyjuk egy éjszakán át, majd elválasztjuk a vizes fázist, az r.-hexános oldathoz térfogata egytized részének megfelelő mennyiségű 10—20%-os etanolos kálium-hidroxid oldatot adunk, az elegyet időnként keverjük, hat órán keresztül állni hagyjuk, majd vízzel semlegesre mossuk, az oldószert lepároljuk és a maradékhoz térfogata háromszorosának megfelelő mennyiségű 96%-os etanolt adunk, majd állni hagyjuk a kicsapódás befejeződéséig, a kivált csapadékot áilagos pórusméretű üvegszűrcn szűrjük, leszívatjuk, 96%-os etanollal gyakorlatilag színtelenre mossuk és csökkentett nyomáson kálium-hidroxid vagy tömény kénsav fölött szárítjuk, a csapadékot szobahőmérsékleten feloldjuk annyi n-hexánban, hogy megközelítőleg 10 súly%-os oldatot kapjunk körülbelül 20 ^rC szobahőmérsékleten, az oldatot Sí—60 Gcduran oszlopon (0,063—0,2 mm, Merek) vagy közömbös, aktivált A1₂O₃ oszlopon kromatografáljuk és n-hexánnal eluáljuk, a kapott n-hexános oldatot körülbelül 10% töménységűre bepároljuk, szobahőmérsékleten kristályosodni hagyjuk, a kristályokat szűrjük cs leszívatjuk, és az anya-4180710 lúgot bepárolva egy második kristályfrakciót is kinyerünk, a kristályokat átkristáhosítjuk forró abszolút etanolból.
3. 3. Eljárás továbbfejlesztése antisporiatikus hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az. 1. igénypont szerint előállítóit természetes terpént a gyógyászatban szokásos, nem toxikus hordozó- és segédanyagokkal kombinálva gyógyászati 5 készítménny é alakítunk.