FR2735133A1 - Procede de preparation d'un analogue de polypeptide a electro-transportabilite amelioree a travers la peau et son utilisation - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation d'un analogue d'un polypeptide original, tel qu'un analogue de la PTH ou un hirulogue manifestant un flux d'électrotransport accru à travers une surface corporelle. Le procédé consiste à remplacer un ou plusieurs résidus d'acides aminés du polypeptide original qui ont tendance à favoriser la formation d'hélice alpha ou de feuillet bêta par des résidus qui réduisent le potentiel de formation d'hélice alpha ou de feuillet bêta pour former le polypeptide analogue. L'invention concerne également un dispositif d'électrotransport comprenant un tel polypeptide analogue. Application au domaine pharmaceutique.

Description

L'invention concerne en général l'administration de médicaments par électrotransport. Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour accroître le flux d'électrotransport d'un polypeptide en réduisant la tendance du polypeptide à former des segments à conformation d'hélice a ou de feuillet B. L'invention concerne également des molécules qui ont été ainsi modifiées.

L'administration transdermique (c'est-à-dire à travers la peau) d'agents thérapeutiques constitue une technique confortable, commode et non-invasive pour administrer des médicaments. Cette méthode offre plusieurs avantages comparée aux modes classiques d'administration de médicaments. Par exemple, on évite les vitesses variables d'absorption et de métabolisme (par exemple hépatique) rencontrées dans le traitement oral, et d'autres inconvénients inhérents sont éliminés (par exemple une irritation gastro-intestinale ou autre) . L'administration transdermique offre également un haut degré de maîtrise des concentrations sanguines d'un médicament particulier et c'est une voie d'administration particulièrement intéressante pour les médicaments qui ont des indices thérapeutiques étroits, des demi-vies brèves et des activités puissantes.

L'administration transdermique peut être passive ou active. Beaucoup de médicaments ne se prêtent pas à l'administration transdermique passive en raison de leur taille, de leurs caractéristiques de charge ionique et de leur hydrophobie. Une méthode pour surmonter cette limitation consiste à utiliser de faibles intensités de courant électrique pour transporter activement les médicaments dans l'organisme en passant par la peau intacte. Cette technique est appelée "électrotransport" ou administration "ionophorétique" de médicaments. Cette technique constitue un moyen mieux maîtrisable que l'administration transdermique passive de médicaments, car il est facile de régler l'amplitude, le programme et la polarité du courant électrique appliqué en utilisant des composants électriques courants.A cet égard, le flux d'électrotransport d'un médicament peut varier d'une valeur inférieure de 50 % à une valeur supérieure de plusieurs ordres de grandeur au flux transdermique passif du même médicament.

Les dispositifs d'électrotransport comportent généralement au moins deux électrodes. Ces deux électrodes sont placées en contact électrique intime avec une certaine partie de la peau du corps du patient. Une électrode, appelée l'électrode active ou donneuse, est l'électrode à partir de laquelle l'agent thérapeutique est délivré à l'organisme. L'autre électrode, appelée contre-électrode ou électrode de retour, sert à fermer le circuit électrique à travers le corps. En contact avec la peau du patient, le circuit est bouclé en connectant les électrodes à une source d'énergie électrique, par exemple une pile, et habituellement à un montage électronique capable de régler le courant passant à travers le dispositif.

Selon la charge électrique de l'espèce à délivrer par voie transdermique, c'est l'anode ou la cathode qui peut être l'électrode active ou donneuse. A cet égard, si la substance ionique à introduire dans ltorganisme est chargée positivement, alors l'électrode positive (l'anode) doit être l'électrode active et l'électrode négative (la cathode) sert de contre-électrode pour boucler le circuit.

En revanche, si la substance ionique à délivrer est chargée négativement, alors l'électrode cathodique doit être l'électrode active et l'électrode anodique doit être la contre-électrode. Comme autre possibilité, l'anode et la cathode peuvent être toutes deux utilisées pour introduire des médicaments de charge appropriée dans l'organisme. Dans ce cas, les deux électrodes sont considérées comme des électrodes actives ou donneuses. En d'autres termes, l'électrode anodique peut introduire des agents chargés positivement dans l'organisme, tandis que l'électrode cathodique peut introduire des agents chargés négativement dans l'organisme.

Les dispositifs d'électrotransport existants nécessitent de plus un réservoir ou source de l'agent thérapeutique qui doit être introduit dans l'organisme.

Ces réservoirs de médicament sont reliés à l'anode ou la cathode du dispositif d'électrotransport pour offrir une source fixe ou renouvelable d'au moins une espèce ou un agent désiré. Des exemples de réservoirs et sources comprennent une poche telle que décrite dans le brevet des E.U.A. NO 4 250 878 de Jacobson, un corps de gel préformé tel que proposé dans le brevet des E.U.A.

NO 4 382 529 de Webster et un récipient en verre ou matière plastique contenant une solution liquide du médicament, tel que montré dans les figures du brevet des E.U.A.

NO 4 722 726 de Sanderson et coll.

On porte ici un intérêt particulier à l'administration transdermique par électrotransport de peptides, polypeptides et protéines en raison des problèmes rencontrés avec les voies d'administration de médicament plus courantes telles que la voie orale. Les molécules polypeptidiques et protéiques sont très sensibles à la dégradation par les enzymes protéolytiques présentes dans le tractus gastrointestinal et sont soumises à un intense métabolisme hépatique lorsqu'elles sont prises par la voie orale. Les polypeptides et les protéines nécessitent habituellement une administration parentérale pour atteindre des concentrations thérapeutiques dans le sang du patient. Les techniques d'administration parentérale les plus traditionnelles sont les injections hypodermiques et l'administration intraveineuse.Les polypeptides et les protéines ont cependant, par nature, une courte durée d'activité biologique et nécessitent des injections fréquentes, souvent plusieurs fois par jour, pour maintenir les concentrations thérapeutiques efficaces requises. Les patients trouvent souvent que ce régime de traitement est incommode et douloureux, et il s'y associe un risque, par exemple d'infection.

Beaucoup d'efforts ont été consacrés à la découverte d'autres voies (autres que les injections parentérales) pour l'administration efficace de polypeptides et protéines pharmaceutiques. Les voies d'administration offrant moins d'effets secondaires, ainsi qu'une meilleure acceptation par le patient, ont suscité un intérêt particulier. Ces autres voies ont généralement inclus l'administration orale "protégée" dans laquelle le polypeptide ou la protéine est libéré par une capsule ou autre récipient après son passage à travers le milieu à pH bas de l'estomac, l'administration à travers les tissus muqueux, par exemple les muqueuses du poumon au moyen d'inhalateurs ou les muqueuses nasales au moyen de pulvérisations nasales, et les pompes implantables. Malheureusement, ces autres voies d'administration de polypeptides/protéines n'ont rencontré qu'un succès limité.

L'administration par électrotransport transdermique de polypeptides et protéines a également rencontré des difficultés techniques. Par exemple, pour former la solution du médicament à délivrer par électrotransport, l'eau est le solvant liquide préféré en raison de son excellente biocompatibilité. La peau contient des enzymes protéolytiques qui peuvent dégrader le polypeptide/protéine lorsqu'il est administré par voie transdermique. De plus, certains polypeptides/protéines, notamment ceux qui ne sont pas originaires de l'animal soumis au traitement, peuvent provoquer des réactions cutanées, par exemple une sensibilisation ou une irritation.

Un certain nombre de chercheurs ont fait connaître l'administration par électrotransport de polypeptides et de protéines. Une étude initiale de R. Burnette et coll.,
J. Pharm. Sci. (1986) 75, 738, impliquait la perméation cutanée in vitro du facteur déclenchant la sécrétion de thyréostimuline, une petite molécule tripeptidique. Le flux d'électrotransport s'est révélé être plus élevé qu'un flux de diffusion passive. Chien et coll., J. Pharm. Sci. (1988) 78, 376, dans des études in vitro et in vivo, ont montré que l'administration transdermique de vasopressine et d'insuline était possible par électrotransport. Voir également : Maulding et coll., U.S. Statutory Invention
Registration NO H1160, qui enseigne l'administration par électrotransport de calcitonine chez des porcs nains.

Plusieurs approches ou méthodes (autres que la simple augmentation des intensités appliquées de courant d'électrotransport) ont été employées pour accroître le flux d'électrotransport transdermique de médicaments polypeptidiques et protéiques. Une méthode comporte l'utilisation d'agents accroissant le flux tels que des agents tensio-actifs ioniques. Voir, par exemple, le brevet des E.U.A. NO 4 722 726. Une autre méthode fait usage de co-solvants au lieu d'eau seule pour accroître le flux d'électrotransport. Voir, par exemple, la demande de brevet européen NO 278 473. Une autre méthode encore consiste à rompre mécaniquement la couche externe de la peau (c'est-àdire la couche cornée) avant l'administration par électrotransport à travers celle-ci.Voir, par exemple, le brevet des E.U.A. NO 5 250 023 de Lee et coll..

D'autres méthodes pour accroître le flux d'électrotransport transdermique de médicaments impliquent de créer un bioprécurseur (ou pro-médicament) ou un analogue du médicament voulu et d'effectuer l'électrotransport du bioprécurseur ou de l'analogue modifié. Par exemple, le document WO 92/12999 enseigne l'administration d'insuline sous forme d'un analogue d'insuline ayant une tendance réduite à l'auto-agrégation (il apparaît que les formes agrégées d'insuline présentes dans les compositions pharmaceutiques classiques réduisent l'apport d'insuline par voie transdermique) . Les analogues sont créés en substituant l'acide aspartique (Asp) ou l'acide glutamique (Glu) à d'autres résidus d'acides aminés se trouvant à des positions choisies le long de la chaîne polypeptidique d'insuline.Le document WO 93/25197 enseigne l'administration de médicaments peptidiques et non peptidiques sous forme de bioprécurseurs ou complexes agent pharmaceutique-modificateur, dans lesquels un modificateur chimique (par exemple un fragment chargé) est lié par covalence à l'agent pharmaceutique original. La liaison covalente est rompue après que l'agent a été introduit dans l'organisme, en libérant ainsi l'agent original.

Malgré les méthodes ci-dessus, certains polypeptides manifestent encore un faible flux d'électrotransport transdermique. En particulier, on sait que l'hydrophobie d'un peptide exerce un effet négatif sur le flux d'électrotransport in vitro. Divers paramètres contribuent à l'hydrophobie, y compris la structure primaire d'une protéine, c'est-à-dire la séquence d'acides aminés de la molécule, ainsi que la structure secondaire de la protéine, c 'est-à-dire l'arrangement récurrent régulier de la chaîne polypeptidique dans les trois dimensions. Cette conformation peut prendre la forme de structures hélicoïdales, telles qu'une hélice a, ou d'une configuration en zigzag, plus déployée, appelée la conformation ss.

L'hélice a comporte approximativement 3,6 résidus par tour d'hélice. Les groupes R des acides aminés s'étendent vers l'extérieur à partir de l'hélice et des liaisons hydrogène intracaténaires sont formées entre l'oxygène de carbonyle du squelette porté par chaque résidu et l'hydrogène du squelette attaché à l'azote électronégatif du quatrième résidu le long de la chaîne. L'unité fondamentale de la conformation ss est le brin ss qui existe sous forme d'une hélice à enroulement moins serré, ayant 2,0 résidus par tour.La conformation de brin ss n'est stable que lorsqu'elle est incorporée à un feuillet ss, où des liaisons hydrogène d'une géométrie proche de l'optimum sont formées entre les groupes peptidiques présents sur des brins ss adjacents ; les moments dipolaires des brins sont également alignés de manière favorable. Les chaînes latérales partant des résidus adjacents du même brin dépassent des faces opposées du feuillet et n'entrent pas en interaction entre eux, mais présentent d'importantes interactions avec leur squelette et avec les chaînes latérales de brins avoisinants. Pour une description générale des hélices a et des feuillets ss, voir, par exemple : T.E. Creighton,
Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993), et A.L.Lehninger, Biochemistry (Worth
Publishers, Inc., 1975).

Les paramètres de Zimm-Bragg, s et a (B.H. Zimm et
J.K. Bragg, J. Chemin. Phys. (1959), 31, 526-535), et les équations de Lifson-Roig (S. Lifson et A. Roig, J. Chemin.

Phys. (1961), 34, 1963-1974) sont classiquement utilisés pour déterminer la stabilité d'un segment hélicoïdal dans un polypeptide donné. Le paramètre s représente la constante de stabilité de l'enroulement hélicoïdal et le paramètre o est le facteur de nucléation. D'après ces paramètres, la probabilité pour que certaines régions de molécules polypeptidiques forment des hélices a et des feuillets ss peut être prédite en utilisant divers calculs et programmes d'ordinateur. Voir, par exemple, le programme "ALB" de A.V. Finkelstein pour le calcul et la prévision des structures secondaires de protéines et polypeptides (1983), déposé à Brookhaven Protein Data Bank, Upton, N.Y.

et à 1'EMBU, Heidelberg, Allemagne ; A.V. Finkelstein,
Biopolymers (1977), 16, 525-529 ; Finkelstein et code.,
Proteins: Structure, Function and Genetics (1991), 10, 287 299. En outre, les probabilités de Chou-Fasman (P.Y. Chou et G.D. Fasman, Ann. Rev. Biochem. (1978), 47, 251-276) ont été employées pour évaluer la tendance d'un résidu d'acide aminé particulier à favoriser ou à contrarier la formation d'hélice a ou de feuillet ss.

Cependant, ces principes n'ont pas été antérieurement appliqués à l'altération des propriétés hydrophobes d'un polypeptide donné afin d'accroître son flux d'électrotransport.

Selon la présente invention, le flux d'électrotransport d'un polypeptide donné est accru en démantelant sa structure secondaire. En particulier, les résidus d'acides aminés qui sont connus pour stabiliser les segments à conformation d'hélice a ou de feuillet ss peuvent être remplacés par des résidus déstabilisants et des destructeurs d'hélice connus. De cette manière, le flux du polypeptide à travers une surface corporelle (par exemple la peau) peut être accru, en permettant ainsi l'administration par électrotransport d'une large gamme de médicaments polypeptidiques à des vitesses efficaces à des fins thérapeutiques.

Ainsi, sous un aspect, l'invention concerne un procédé de préparation d'un analogue d'un polypeptide original ayant un segment à conformation d'hélice a et/ou de feuillet ss, l'analogue manifestant une aptitude à l'électrotransport améliorée/accrue à travers une surface corporelle, le procédé comprenant le remplacement d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés du polypeptide original pour former le polypeptide analogue, de manière à démanteler un ou plusieurs segments à conformation d'hélice a et/ou de feuillet ss du polypeptide original. Le polypeptide analogue manifeste un plus grand flux d'électrotransport que celui du polypeptide original.

Sous un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour administrer un agent polypeptidique à travers une surface corporelle. Le procédé comprend les étapes consistant à (a) fournir un polypeptide analogue d'un polypeptide original, le polypeptide original comprenant un segment à conformation d'hélice a et/ou de feuillet ss, le polypeptide analogue ayant un ou plusieurs résidus d'acides aminés remplacés par rapport au polypeptide original ; et
(b) administrer le polypeptide analogue à travers la surface corporelle par électrotransport.

Dans des formes de réalisation particulièrement préférées, le démantèlement est effectué en remplaçant un ou plusieurs résidus d'acides aminés du polypeptide original par un ou plusieurs résidus d'acides aminés ayant une valeur a ou pss inférieure à celle du résidu d'acide aminé original.

Sous un autre aspect, l'invention porte sur un analogue de la parathormone (PTH) comprenant la séquence d'acides aminés représentée à la Figure 1B.

Sous un autre aspect encore, l'invention porte sur un analogue de la parathormone (PTH) comprenant la séquence d'acides aminés représentée à la Figure 1C.

Ces aspects, ainsi que d'autres, de la présente invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art à l'examen de la description détaillée suivante faite en regard des dessins annexés sur lesquels
La Figure 1 montre la séquence d'acides aminés de diverses molécules de parathormone (PTH) utilisées pour illustrer l'invention. La Figure 1A montre la séquence d'acides aminés du polypeptide PTH original, type sauvage.

La Figure 1B montre la séquence d'acides aminés de l'analogue 1 de la PTH (1-35). . La Figure 1C montre la séquence d'acides aminés de l'analogue 2 de la PTH (1-35) . HSL désigne l'homosérine/lactone d'homosérine. Les résidus soulignés sur les Figures 1B et 1C indiquent les positions de remplacement.

La Figure 2 montre les séquences d'acides aminés de divers polypeptides dérivés de l'hirudine, utilisés pour illustrer l'invention. La Figure 2A montre la séquence d'acides aminés d'un polypeptide original du type hirulogue. La Figure 2B montre la séquence d'acides aminés de l'hirulogue-1. La Figure 2C montre la séquence de 1 'hirulogue-B2.

La Figure 3 est une illustration schématique d'un dispositif d'administration de médicament par électrotransport représentatif qui peut être utilisé dans le contexte de la présente invention.

La Figure 4 est un graphique représentant l'ellipti- cité résiduelle moyenne de plusieurs analogues de la parathormone, en fonction de la concentration de trifluoréthanol.

La Figure 5 est un graphique représentant ltellip- ticité résiduelle moyenne de deux polypeptides dérivés de l'hirudine, en fonction de la concentration de trifluoréthanol.

La pratique de la présente invention met en oeuvre, sauf indication contraire, des méthodes classiques de la chimie des protéines, de l'électrochimie, de la biologie moléculaire et des techniques de recombinaison d'ADN qui sont du ressort de l'homme de l'art. Ces méthodes sont bien expliquées dans la littérature. Voir, par exemple T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular
Properties (W.H. Freeman and Company, 1993) ; A.L.

Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 1975)
J.S. Newman, Electrochemical Systems (Prentice Hall, 1973) ; A.J. Bard et L.R. Faulkner, Electrochemical
Methods, Fundamentals and Applications (John Wiley & Sons, 1980) ; Sambrook et coll., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Il faut remarquer qu'au sens où on les emploie pour décrire et caractériser la présente invention, les articles singuliers "un" et "le" ou "la" n'excluent pas des objets mentionnés pluraux, sauf si le sens impose clairement le contraire. Ainsi, par exemple, la mention de "un polypeptide" couvre un mélange de deux ou plusieurs polypeptides, etc.

I. DÉFINITIONS
Dans la description de la présente invention, les termes suivants sont employés et sont considérés définis comme indiqué ci-dessous.

Les termes "électrotransport", "ionophorèse" et "ionophorétique" sont employés ici pour désigner l'administration à travers une surface corporelle (par exemple la peau) d'un ou plusieurs agents polypeptidiques pharmaceutiquement actifs au moyen d'une force électromotrice appliquée à un réservoir contenant l'agent.

L'agent peut être délivré par électromigration, électroporation, électro-osmose ou toute combinaison de ces processus. L'électro-osmose a également été dénommée électrohydrocinèse, électroconvection et osmose induite par l'électrique. En général, 1'électro-osmose d'une espèce dans un tissu résulte de la migration d'un solvant dans lequel l'espèce est contenue, provoquée par l'application d'une force électromotrice au réservoir contenant l'espèce thérapeutique, c 'est-à-dire de l'écoulement de solvant provoqué par électromigration d'une autre espèce ionique.

Pendant le processus d'électrotransport, certaines modifications ou altérations de la peau peuvent se produire, telles que la formation de pores à existence transitoire dans la peau, également appelée "électroporation". Le terme "électrotransport" tel qu'employé ici inclut également tout transport d'espèce à l'aide d'électricité qui est intensifié par des modifications ou altérations de la surface corporelle (par exemple la formation de pores dans la peau). .Ainsi, comme on les emploie ici, les termes "électrotransport", "ionophorèse" et "ionophorétique" s'appliquent à (1) l'administration d'agents chargés par électromigration, (2) l'administration d'agents non chargés par le processus d'électro-osmose, (3) l'administration d'agents chargés ou non chargés par électroporation, (4) l'administration d'agents chargés par les processus combinés d'électromigration et d'électro-osmose, et/ou (5) l'administration d'un mélange d'agents chargés et non chargés par les processus combinés d'électromigration et d'électro-osmose.

Les termes "polypeptide", "agent polypeptidique" et "médicament polypeptidique" sont employés ici de façon interchangeable pour désigner tout polymère biologiquement actif constitué de résidus d'acides aminés. Ces termes englobent les peptides, oligopeptides, dimères, multimères, etc. Ces polypeptides peuvent être d'origine naturelle ou peuvent être synthétisés ou produits par recombinaison.

Ces termes englobent également les produits formés par modification au stade postérieur à l'expression du polypeptide, par exemple par glycosylation, acétylation, phosphorylation, etc.

Un médicament ou agent polypeptidique tel que défini ici est généralement constitué des 20 acides aminés naturels Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gln
(Q), Glu (E), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Lys (K),
Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr
(Y) et Val (V) et peut également inclure n'importe lesquels des différents analogues connus d'acides aminés, qu'il s'agisse d'analogues naturels ou synthétiques, par exemple mais sans limitation : l'homo-isoleucine, l'asaleucine, la 2- < méthylènecyclopropyl) glycine, la S-méthylcystéine, la S-(prop-l-ényl)cystéine, l'homosérine, l'ornithine, la norleucine, la norvaline, l'homoarginine, la 3-(3-carboxyphényl)alanine, la cyclohexylalanine, la mimosine, l'acide pipécolique, l'acide 4-méthylglutamique, la canavanine, l'acide 2,3-diaminopropionique, etc. D'autres exemples d'agents polypeptidiques qui trouvent usage dans la présente invention sont indiqués ci-après.

Par polypeptide, agent polypeptidique ou médicament polypeptidique "original", on entend un polypeptide, tel que défini ci-dessus, qui comprend des segments à conformation d'hélice a ou de feuillet ss qui peuvent être modifiés de telle manière que le flux d'électrotransport du polypeptide soit accru. En particulier, un polypeptide original comprend généralement environ 10 à environ 50 résidus d'acides aminés, de préférence environ 10 à environ 40 résidus d'acides aminés. En outre, le polypeptide original ne doit pas être susceptible d'adopter une structure repliée tertiaire stable en solution, par exemple à cause d'une forte concentration de résidus Cys.

Le polypeptide original peut être un polypeptide naturel ou peut lui-même présenter des différences structurales avec un polypeptide naturel, telles que des remplacements, délétions ou additions d'acides aminés, ainsi que des modifications post-traductionnelles telles que décrites cidessus.

Par "analogue" de polypeptide, on entend un polypeptide tel que défini ci-dessus, qui résulte de la modification de la structure secondaire du polypeptide original. A cet égard, l'analogue diffère de la molécule originale par le remplacement d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés de telle manière qu'un ou plusieurs segments à conformation d'hélice a et/ou d'hélice ss présents dans la molécule originale soient démantelés. Des remplacements appropriés d'acides aminés sont examinés plus en détail ci-après. L'analogue peut également comporter des modifications supplémentaires qui n'affectent pas la structure secondaire, par exemple d'autres remplacements, délétions ou additions d'acides aminés, ou des modifications post-traductionnelles telles que décrites cidessus.L'analogue peut également exister sous des formes neutres ou salifiées, par exemple des sels d'addition d'acides (formés avec les groupes amino libres des polypeptides analogues) , et qui sont formées avec des acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique ou l'acide phosphorique, ou des acides organiques tels que les acides acétique, succinique, maléique, tartrique, mandélique, etc.

En outre, des sels formés à partir de groupes carboxyle libres peuvent être obtenus avec des bases minérales telles que les hydroxydes de sodium, potassium, ammonium, calcium ou ferrique, et des bases organiques telles que l'isopropylamine, la triméthylamine, le 2-éthylaminoéthanol, l'histidine, etc. L'analogue de polypeptide possède au moins une partie de l'activité biologique du polypeptide original, et il possède de préférence une activité biologique égale ou supérieure à celle de la molécule originale.

Par "accroissement du flux d'électrotransport" d'un polypeptide, on entend l'accroissement du flux d'électrotransport du polypeptide à travers la surface corporelle (par exemple la peau ou la muqueuse) comparé à celui du polypeptide original. Le flux d'électrotransport transdermique peut être déterminé en utilisant un certain nombre de méthodes in vivo ou in vitro bien connues dans la technologie. Les méthodes in vitro comprennent la fixation d'un morceau de peau d'un animal approprié (par exemple de la peau de cadavre humain) entre les compartiments donneur et récepteur d'une cuve à flux d'électrotransport, la face de couche cornée du morceau de peau étant tournée du côté du compartiment donneur.Une solution liquide ou un gel contenant le médicament à délivrer est placée au contact de la couche cornée, et un courant électrique est appliqué aux électrodes, une électrode étant présente dans chaque compartiment. Le flux transdermique est calculé en prélevant des échantillons pour déterminer la quantité de médicament dans le compartiment récepteur. Deux modèles satisfaisants qui sont utilisés en vue d'optimiser l'administration de médicament par électrotransport transdermique sont le modèle lambeau isolé de peau de porc de Riviere, M.C. Heit et coll., J. Pharm. Sci., 82, 240-243 (1993), et l'utilisation de peau sans poils isolée de rongeurs ou cobayes sans poils, par exemple. Voir : B.W.

Hadzija et coll., J. Pharm. Pharmacol., 44, 387-390 (1992).

II. MODES DE MISE EN OEUVRE DE L'INVENTION
La présente invention concerne la substitution d'acides aminés qui démantèlent les segments à conformation d'hélice a et de feuillet ss d'une molécule polypeptidique pour accroître le flux d'électrotransport de cette molécule comparativement au flux du polypeptide original. Le procédé rend donc possible l'électrotransport d'un grand nombre de substances qui ne se prêteraient pas autrement à cette technique d'administration. Sans établir un lien avec une théorie particulière, il semble que ces modifications secondaires réduisent la tendance au regroupement spatial des chaînes latérales hydrophobes qui comportent des résidus d'acides aminés tels que Leu, Phe et Trp. Ainsi, la molécule est moins apte à se lier pendant l'électrotransport à des zones hydrophobes présentes dans la peau, ce qui facilite le passage du polypeptide à travers la peau.

La présente invention a été exemplifiée en utilisant une molécule de parathormone (PTH) et un dérivé de l'hirudine comme composés originaux. La PTH est une hormone peptidique qui régule l'équilibre homéostasique du métabolisme du calcium et des phosphates et qui a été utilisée pour traiter l'ostéoporose. La PTH de type sauvage est représentée à la Figure 1A. La molécule compte 34 résidus d'acides aminés et son poids moléculaire est d' environ 4000 daltons. Comme démontré ici, la molécule a une très forte tendance à adopter la conformation d'hélice a.

L'hirulogue est un anticoagulant peptidique synthétique à base d'hirudine qui inhibe efficacement à la fois la thrombine libre et la thrombine liée à la fibrine. Il a été montré que l'hirulogue inhibe la thrombose veineuse post-opératoire chez les patients ayant subi une intervention chirurgicale orthopédique. La séquence de l'hirulogue original utilisé pour illustrer la présente invention est représentée à la Figure 2A.

Bien qu'elle soit exemplifiée et illustrée par l'utilisation des substances originales décrites ci-dessus, la présente invention trouve également usage avec une grande diversité d'autres protéines et agents polypeptidiques originaux, par exemple d'autres polypeptides provenant de sources eucaryotes, procaryotes et virales, ainsi que des peptides synthétiques. Ces polypeptides ont généralement environ 10 à environ 50 acides aminés, une structure secondaire qui se prête à une transformation et n'ont pas tendance à adopter une structure repliée tertiaire stable, par exemple à cause d'une forte concentration de résidus Cys.De tels polypeptides comprennent, sans limitation, des médicaments peptidiques qui sont des antibiotiques et agents antiviraux, des antinéoplasiques, des immunomodulateurs, des hormones peptidiques telles que ACTH, CRF, GHRH, la cholécystokinine, les dynorphines, les endorphines, l'endothéline, les fragments de fibronectine, la galanine, la gastrine, l'insulinotrophine, le glucagon, les fragments de protéine liant le GTP, la guanyline, les leucokinines, la magainine, les mastoparans, la dermaseptine, la systémine, les neuromédines, la neurotensine, la pancréastatine, le polypeptide pancréatique, la substance
P, la sécrétine, la thymosine, etc.

La structure secondaire du polypeptide original est généralement transformée en remplaçant un ou plusieurs résidus d'acides aminés originaux choisis par un ou plu sieurs résidus d'acides aminés ayant une moindre tendance à former des conformations d'hélice a et/ou de feuillet 13. A cet égard, chaque résidu d'acide aminé manifeste des préférences conformationnelles. Une mesure de la tendance relative d'un résidu particulier à s'engager dans une hélice a ou un brin ss a été définie par les paramètres Pa et Pss (P.Y. Chou et G.D. Fasman, Ann. Rev. Biochem. (1978), 47, 251-276). Une liste révisée et mise à jour des valeurs
Pa et Pss est présentée au Tableau 1.Les valeurs Pa figurant au Tableau 1 qui sont supérieures à 1,00 représentent des acides aminés qui favorisent les conformations d'hélice a et sont définies ici comme des "valeurs Pa élevées". De même, les valeurs Pss figurant au
Tableau 1 qui sont supérieures à 1,00 représentent des acides aminés qui favorisent la formation de brins ss et sont définies ici comme des "valeurs Pss élevées". Les valeurs Pa et Pss de 1,00 ou moins représentent des acides aminés qui gênent ou détruisent les conformations secondaires et sont définies ici respectivement comme des "valeurs Pa basses" et "valeurs Pss basses".

Ainsi, par exemple, les acides aminés Glu, Ala et Leu ont des valeurs Pa élevées et favorisent la formation d'hélices, tandis que Pro, Gly, Ser, Cys, Tyr et Asn ont des valeurs Pa basses et contrarient donc la formation d'hélices. De même, les résidus d'acides aminés Val, Ile et
Tyr ont des valeurs Pss élevées et favorisent la formation de brins ss, tandis que les acides aminés Pro, Asp, Asn, Glu et Gly contrarient cette formation. En combinant les valeurs a et Pss, les acides aminés qui doivent manifester la plus faible tendance à former ces types de structures secondaires sont Gly, Asn, Pro et Ser.

TABLEAU 1*

<tb> Préférences <SEP> Conformationnelles <SEP> des <SEP> Acides <SEP> Aminés
<tb> <SEP> Résidu <SEP> Hélice <SEP> a <SEP> Brin <SEP> ss <SEP>
<tb> <SEP> d'acide <SEP> aminé <SEP> (pa) <SEP> (pis) <SEP>
<tb> <SEP> Glu <SEP> 1,59 <SEP> 0,52
<tb> <SEP> Ala <SEP> 1,41 <SEP> 0,72
<tb> <SEP> Leu <SEP> 1,34 <SEP> 1,22
<tb> <SEP> Met <SEP> 1,30 <SEP> 1,14
<tb> <SEP> Gln <SEP> 1,27 <SEP> 0,98
<tb> <SEP> Lys <SEP> 1,23 <SEP> 0,69
<tb> <SEP> Arg <SEP> 1,21 <SEP> 0,84
<tb> <SEP> His <SEP> 1,05 <SEP> 0,80
<tb> <SEP> Val <SEP> 0,90 <SEP> 1,87
<tb> <SEP> Ile <SEP> 1,09 <SEP> 1,67
<tb> <SEP> Tyr <SEP> 0,74 <SEP> 1,45
<tb> <SEP> Cys <SEP> 0,66 <SEP> 1,40
<tb> <SEP> Trp <SEP> 1,02 <SEP> 1,35
<tb> <SEP> Phe <SEP> 1,16 <SEP> 1,33
<tb> <SEP> Thr <SEP> 0,76 <SEP> 1,17
<tb> <SEP> Gly <SEP> 0,43 <SEP> 0,58
<tb> <SEP> Asn <SEP> 0,76 <SEP> 0,48
<tb> <SEP> Pro <SEP> 0,34 <SEP> 0,31
<tb> <SEP> Ser <SEP> 0,57 <SEP> 0,96
<tb> <SEP> Asp <SEP> 0,99 <SEP> 0,39
<tb>
* Les valeurs portées au Tableau 1 sont extraites de
Proteins: Structures and Molecular Properties de T.E.

Creighton (W.H. Freeman and Company, 1993), page 256.

Un segment d'une structure secondaire particulière est bien plus probable lorsque plusieurs résidus adjacents favorisent cette structure. Ainsi, une hélice a peut être prévue si quatre de six résidus adjacents favorisent l'hélice et si la valeur Pa moyenne est supérieure à 1,05 et supérieure à Pss. De même, un brin ss peut être prévu si trois de cinq résidus adjacents favorisent le feuillet et si la valeur moyenne de PD est supérieure à 1,04 et supérieure à Pa. T.E. Creighton, Proteins: Structures and
Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993), pages 255-257.

Ainsi, sur la base de ces principes, des résidus d'acides aminés se trouvant dans des portions de la molécule qui sont prédisposées à la formation d'hélice a ou de feuillet ss peuvent être remplacés par les résidus trouvés au Tableau 1 qui sont défavorables à ces conformations. De préférence, un résidu ayant une valeur Pa ou Pss élevée est remplacé par un résidu ayant respectivement une valeur Pa ou pss basse.

D'autres méthodes sont également connues pour déterminer la tendance d'un polypeptide à former des segments à conformation d'hélice a et de feuillet ss. Par exemple, le potentiel de formation d'hélice a d'un polypeptide linéaire peut être estimé par les équations de Lifson-Roig
(S. Lifson et A. Roig, J. Chemin. Phys. (1961), 34, 19631974) en utilisant les valeurs déterminées pour les paramètres de formation d'hélice des résidus par conversion à partir de leurs valeurs calculées de Zimm-Bragg (B.H.

Zimm et J.K. Bragg, J. Chem. Phys. (1959), 31, 526-535) en utilisant les équations de conversion de Qian et Schellman
< H. Qian et J.A. Schellman, J. Chemin. Phys. (1992), 96, 3987-3994).

Plus particulièrement, les paramètres de Zimm-Bragg, s et , représentent respectivement la constante de stabilité d'enroulement hélicoïdal et le facteur de nucléation. Un jeu de valeurs s et a de Zimm-Bragg a été défini pour chaque résidu d'acide aminé (voir le Tableau 1 de
Finkelstein et coll., Proteins: Structure, Function and
Genetics (1991), 10, 287-299) et la probabilité pour que la chaîne polypeptidique entière (ou quelque sous-séquence définie) adopte une conformation d'hélice a peut être calculée en utilisant les équations mentionnées.

Les paramètres hélice de Lifson-Roig correspondants, u, v et w, peuvent également être utilisés pour faire une détermination similaire (S. Lifson et A. Roig, J. Chemin.

Phys. (1961), 34, 1963-1974). A cet égard, le paramètre w, qui est utilisé pour définir une unité peptidique à l'intérieur d'une séquence ininterrompue d'états hélicoïdaux, peut être calculé d'après s. Le paramètre v de Lifson-Roig définit une unité peptidique située au début ou à la fin d'une séquence ininterrompue d'états hélicoïdaux et peut être calculé d'après la racine carrée du paramètre a de
Zimm-Bragg. Le facteur u définit le poids statistique de la région d'enroulement et ne correspond pas à un paramètre de Zimm-Bragg.

En utilisant ces paramètres, il existe deux calculs généralement utilisés pour estimer le potentiel de formation d'hélice a. Le premier pose que le paramètre d'amorçage d'hélice v de Lifson-Roig est une constante égale à 0,039 (c'est-à-dire que le paramètre a de Zimm
Bragg est de 0,0013 pour tous les résidus), et le paramètre w pour chaque acide aminé est calculé d'après la valeur s de Zimm-Bragg trouvée dans le Tableau 1 de Finkelstein et coll., Proteins: Structure, Function and Genetics (1991), 10, 287-299. Le second calcul ne suppose pas que tous les résidus ont la même valeur pour le paramètre v d'amorçage d'hélice (c'est-à-dire que le paramètre a de Zimm-Bragg est spécifique à chaque résidu d'acide aminé).En utilisant cette méthode, les valeurs s et a de Zimm-Bragg pour chaque résidu peuvent être déterminées d'après le Tableau 1 de J.

Skolnick et A. Holtzer, Macromolecules (1982), 15, 812-821.

Ces méthodes sont davantage décrites ci-après dans les exemples.

Les analogues de polypeptides de la présente invention peuvent être produits par n'importe quels procédés qui sont bien connus dans la technologie. A cet égard, étant donné que les analogues sont relativement petits, c'est-à-dire d'au plus environ 50 acides aminés de longueur, ils peuvent commodément être synthétisés chimiquement par l'une quelconque de diverses techniques qui sont connues du spécialiste de la chimie des peptides. En général, ces procédés utilisent l'addition séquentielle d'un ou plusieurs acides aminés à une chaîne peptidique en croissance. Normalement, le groupe amino ou le groupe carboxyle du premier acide aminé est protégé par un groupe protecteur approprié.L'acide aminé protégé ou modifié peut alors être attaché à un support solide inerte ou être utilisé en solution par addition de l'acide aminé qui le suit dans la séquence et dont le groupe complémentaire (amino ou carboxyle) est convenablement protégé, dans des conditions qui permettent la formation d'une liaison amide.

Le groupe protecteur est ensuite enlevé du résidu d'acide aminé qui vient d'être ajouté et l'acide aminé suivant
(convenablement protégé) est ensuite ajouté, et ainsi de suite. Après que les acides aminés désirés ont été enchaînés dans la séquence correcte, tous les groupes protecteurs éventuellement restants (et tout support solide si l'on emploie des techniques de synthèse sur phase solide) sont enlevés successivement ou simultanément, pour donner le polypeptide final. Par simple modification de cette méthode générale, il est possible d'ajouter plus d'un acide aminé à la fois à une chaîne en croissance, par exemple en couplant (dans des conditions qui ne racémisent pas les centres chiraux) un tripeptide protégé avec un dipeptide convenablement protégé pour former, après enlèvement des protections, un pentapeptide. Voir, par exemple : J.M. Stewart et J.D.Young, Solid Phase Peptide
Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) et G.

Barany et R.B. Merrifield, The Peptides: Analysis,
Synthesis, Biology, dirigé par E. Gross et J. Meienhofer,
Vol. 2 (Academic Press, New York, 1980), pages 3-254 pour les techniques de synthèse de peptides sur phase solide et M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis (Springer
Verlag, Berlin, 1984), et The Peptides: Analysis,
Synthesis, Biology, Vol. 1, dirigé par E. Gross et J.

Meienhofer, pour la synthèse classique en solution.

Des groupes protecteurs représentatifs comprennent les groupes t-butyloxycarbonyle (Boc), 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc), benzyloxycarbonyle (Cbz), p-toluènesulfonyle (Tx), 2,4-dinitrophényle, benzyle (Bzl), diphénylisopropyloxycarboxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, isobornyloxycarbonyle, o-bromobenzyloxycarbonyle, cyclohexyle, isopropyle, acétyle, o-nitrophénylsulfonyle, etc.

Des supports solides représentatifs sont des supports polymères réticulés. Ils peuvent comprendre des polymères styréniques réticulés par le divinylbenzène, par exemple des copolymères divinylbenzène-hydroxyméthylstyrène, des copolymères divinylbenzène-chlorométhylstyrène et des copolymères divinylbenzène-benzhydrylaminopolystyrène.

Les analogues de polypeptides de la présente invention peuvent également être préparés chimiquement par d'autres méthodes telles que le procédé de synthèse à peptides multiples simultanés. Voir, par exemple : Houghten, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA (1985), 82, 5131-5135 ; le brevet des
E.U.A. NO 4 631 211.

En variante, les peptides peuvent être produits par des techniques de recombinaison, par exemple en synthétisant un ADN codant pour le peptide désiré et comportant un codon d'initiation ATG. La séquence nucléotidique peut être conçue avec les codons appropriés pour donner la séquence d'acides aminés particulière désirée. En général, on choisit les codons préférés pour l'hôte considéré dans lequel la séquence est exprimée. La séquence complète est généralement assemblée à partir d'oligonucléotides chevauchants préparés par des méthodes classiques et assemblés en une séquence codante complète.

Voir, par exemple : Edge, Nature (1981), 292, 756 ; Nambair et coll., Science (1984), 223, 1299 ; Jay et coll., J.

Biol. Chem. (1984), 259, 6311. Des techniques de synthèse automatique, telles que la synthèse sur phase solide à l'aide de phosphoramide, peuvent être employées pour produire la séquence nucléotidique. Voir, par exemple
S.L. Beaucage et coll., Tet. Lett. (1981), 22, 1859-1862
M.D. Matteucci et coll., J. Am. Chem. Soc. (1981), 103, 3185-3191. Ensuite, l'ADN est cloné dans un vecteur d'expression approprié, procaryote ou eucaryote, par des méthodes classiques.

Comme autre possibilité, des techniques de recombinaison peuvent être facilement employées pour cloner le gène du polypeptide original qui peut ensuite être soumis à une mutagénèse in vitro par remplacement de la ou des paires de bases appropriées pour donner le codon correspondant à l'acide aminé désiré. Une telle modification peut ne porter que sur une seule paire de bases, réalisant le changement d'un seul acide aminé, ou peut inclure le changement de plusieurs paires de bases. En variante, les mutations peuvent être effectuées en utilisant une amorce mal appariée qui s'hybride à la séquence nucléotidique originale (en général un ADNc correspondant à la séquence d'ARN), à une température inférieure à la température de fusion du duplex mal apparié. L'amorce peut être rendue spécifique en maintenant la longueur et la composition en bases de l'amorce dans des limites relativement étroites et en maintenant la base mutante en une position centrale. Zoller et Smith, Methods
Enzymol. (1983), 100, 468. L'allongement de l'amorce est effectué en utilisant l'ADN-polymérase, le produit est cloné et les clones contenant l'ADN muté, dérivé par ségrégation du brin allongé à partir de l'amorce, sont sélectionnés. La sélection peut être réalisée en utilisant l'amorce mutante comme sonde d'hybridation. Cette technique est également applicable à la génération de multiples mutations ponctuelles. Voir, par exemple : Dalbie-McFarland et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982), 79, 6409.

En utilisant les méthodes ci-dessus, on a produit un certain nombre d'analogues de polypeptides représentatifs, manifestant un flux d'électrotransport accru. En particulier, la Figure 1B montre la séquence de l'analogue 1 de la PTH. Cet analogue de la PTH diffère de la séquence originale (représentée à la Figure 1A) par les points suivants : Met8 a été remplacé par Leu ; Leu15 a été remplacé par Arg ; Met18 a été remplacé par Leu ; Clou19 a été remplacé par Arg ; Glu22 a été remplacé par Arg ; Gln29 a été remplacé par Lys ; Phe34 a été remplacé par Tyr ; et une lactone d'homosérine est présente à l'extrémité C-terminale du peptide.

L'analogue 2 de la PTH, représenté à la Figure 1C, diffère de la séquence originale (Figure 1A) par les points suivants : Met8 a été remplacé par Leu ; Leull a été remplacé par Ser ; Leu15 a été remplacé par Arg ; Leu18 a été remplacé par Ser ; Met18 a été remplacé par Ser ; Glu19 a été remplacé par Arg ; Val21 a été remplacé par Ser ; Glu22 a été remplacé par Arg ; Leu24 a été remplacé par Ser ; Leu28 a été remplacé par Ser ; Gln29 a été remplacé par Lys ; Tyr34 a été remplacé par Ser ; et une lactone d'homosérine est présente à l'extrémité C-terminale du peptide. L'ensemble de ces remplacements conduit à une structure secondaire amoindrie.

Les hirulogues sont une série d'analogues synthétiques de l'hirudine qui est un inhibiteur naturel de la thrombine. Deux de ces analogues sont représentés à la Figure 2. L'hirulogue-1, représenté à la Figure 2B, est connu d'après Maragnore et coll., Biochem. (1990), 29, 7095-7101. L'hirulogue-B2, un peptide de vingt acides aminés ayant un poids moléculaire d'environ 2186 daltons, possède la séquence que montre la Figure 2C. Comme on peut le voir, l'hirulogue-B2 diffère de l'hirulogue-1 que montre la Figure 2B en ce qu'il comporte une D-cyclohexylalanine substituée à la D-phénylalanine en première position.

L'hirulogue-B2 est décrit par Witting et coll., Biochem. J.

(1992), 287, 663-664 ; et la publication internationale NO WO 92/13952.

Une fois que l'analogue de polypeptide désiré a été préparé, il peut être administré au sujet en utilisant l'un quelconque de divers systèmes d'administration de médicaments par électrotransport et l'invention n'est pas limitée à l'utilisation d'un système particulier. Des exemples de systèmes d'administration de médicaments par électrotransport sont décrits, par exemple, dans les brevets des
E.U.A. NO 5 312 326 de Meyer et coll., 5 080 646 de
Theeuwes et coll., 5 387 189 de Gyory et coll. et 5 169 383 de Gyory et coll.

La Figure 3 montre un dispositif d'administration par électrotransport représentatif qui peut être utilisé dans le contexte du présent procédé. Le dispositif 10 comprend un boîtier supérieur 16, un montage sur carte à circuit imprimé 18, un boîtier inférieur 20, une anode 22, une cathode 24, un réservoir anodique 26, un réservoir cathodique 28 et un adhésif 30 compatible avec la peau. Le boîtier supérieur 16 comporte des ailettes latérales 15 qui aident à maintenir le dispositif 10 sur la peau du patient.

Le boîtier supérieur 16 est de préférence constitué d'un élastomère moulable par injection (par exemple un copolymère éthylène-acétate de vinyle) . Le montage sur carte à circuit imprimé 18 comprend un circuit intégré 19 connecté à des composants discrets 40 et une pile 32. Le montage sur carte à circuit imprimé 18 est attaché au boîtier 16 par des colonnettes (non représentées sur la
Figure 3) s'insérant dans des ouvertures 13a et 13b, les extrémités des colonnettes étant chauffées/fondues afin de fixer à chaud la carte à circuit imprimé 18 au boîtier 16.

Le boîtier inférieur 20 est fixé au boîtier supérieur 16 au moyen de l'adhésif 30, la surface supérieure 34 de l'adhésif 30 adhérant à la fois au boîtier inférieur 20 et au boîtier supérieur 16, y compris aux surfaces inférieures des ailettes 15.

Une pile bouton 32 est représentée (partiellement) sur la face inférieure du montage sur carte à circuit imprimé 18. D'autres types de piles ou accumulateurs peuvent également être utilisés pour alimenter le dispositif 10.

Le dispositif 10 se compose généralement de la pile 32, du circuit électronique 19,40, des électrodes 22,24 et des réservoirs de médicament/produit chimique 26,28, qui sont tous intégrés dans une unité indépendante. Les sorties (non représentées sur la Figure 3) du montage sur carte à circuit imprimé 18 sont électriquement connectées aux électrodes 24 et 22 par des ouvertures 23,23' ménagées dans des concavités 25,25' formées dans le boîtier inférieur 20, au moyen de bandes d'adhésif électriquement conducteur 42,42'. Les électrodes 22 et 24 sont elles-mêmes en contact électrique et mécanique direct avec les faces supérieures 44',44 des réservoirs de médicament 26 et 28. Les faces inférieures 46',46 des réservoirs de médicament 26,28 entrent en contact avec la peau du patient à travers des ouvertures 29',29 ménagées dans l'adhésif 30.

Le dispositif 10 comporte facultativement un moyen qui permet au patient de s'auto-administrer une dose de médicament par électrotransport. Lorsque le patient appuie sur un commutateur à bouton-poussoir 12, le montage électronique sur carte à circuit imprimé 18 délivre un courant continu prédéterminé aux électrodes/réservoirs 22,26 et 24,28 pendant une période d'administration de durée prédéterminée. Le commutateur à bouton-poussoir 12 est commodément disposé sur la face supérieure du dispositif 10 et il est facilement actionné à travers un vêtement. Pour activer le dispositif afin de délivrer le médicament, il est préférable d'employer une double pression sur le commutateur à bouton-poussoir 12, avec un court délai de temporisation, par exemple de trois secondes, pour minimiser ainsi le risque d'actionnement accidentel du dispositif 10.De préférence, le dispositif envoie à l'utilisateur une confirmation visuelle et/ou sonore du début de la période d'administration de médicament au moyen d'une diode électroluminescente 14 qui s'allume et/ou d'un générateur de bips, par exemple, qui émet un signal sonore audible. Le médicament est délivré par électrotransport à travers la peau du patient, par exemple sur le bras, durant la période d'administration prédéterminée.

L'anode 22 comprend de préférence de l'argent et la cathode 24 comprend de préférence du chlorure d'argent. Les deux réservoirs 26 et 28 comprennent de préférence des matières à base d'hydrogel de polymère. Les électrodes 22,24 et les réservoirs 26,28 sont retenus dans les concavités 25',25 formées dans le boîtier inférieur 20.

Le commutateur à bouton-poussoir 12, le montage électronique sur carte à circuit imprimé 18 et la pile 32 sont "scellés" au moyen d'adhésif entre le boîtier supérieur 16 et le boîtier inférieur 20. Le boîtier supérieur 16 est de préférence constitué de caoutchouc ou d'une autre matière élastomère. Le boîtier inférieur 20 est de préférence constitué d'une matière plastique ou élastomère en feuille (par exemple du polyéthylène) qui peut être facilement moulée pour former les concavités 25,25' et découpée pour former les ouvertures 23,23'. Le dispositif 10 assemblé est de préférence résistant à l'eau (c'est-à-dire à l'épreuve des éclaboussures) et il est très préférablement étanche à l'eau. Le système a un profil bas qui s'adapte facilement au corps, pour laisser ainsi la liberté de mouvement sur le site et au voisinage du site où il est porté.Les réservoirs 26 et 28 sont disposés sur la face du dispositif 10 qui entre en contact avec la peau et ils sont suffisamment séparés pour éviter une mise en court-circuit électrique accidentelle pendant la manipulation et l'utilisation normales.

Le dispositif 10 adhère à une surface corporelle du patient (par exemple la peau) au moyen de l'adhésif périphérique 30 qui présente une face supérieure 34 et une face 36 entrant en contact avec la peau. La face 36 de l'adhésif possède des propriétés adhésives qui assurent que le dispositif 10 reste en place sur le corps pendant l'activité normale de l'utilisateur, tout en permettant son enlèvement après une période d'utilisation prédéterminée (par exemple 24 heures). La face supérieure 34 de l'adhésif adhère au boîtier inférieur 20 et maintient ce dernier fixé au boîtier supérieur 16.

Les réservoirs 26 et 28 comprennent généralement une matrice de gel, la solution de médicament étant uniformément dispersée dans l'un au moins des réservoirs 26 et 28. On peut employer des concentrations de médicament comprises dans l'intervalle d'environ 1 x 10 N à 1,0 M ou plus, les concentrations de médicament situées dans la partie inférieure de l'intervalle étant préférées. Des polymères appropriés pour la matrice de gel peuvent comprendre essentiellement n'importe quelles matières polymères synthétiques et/ou naturelles de caractère non ionique. Une nature polaire est préférée lorsque l'agent actif est polaire et/ou capable d'ionisation polaire, afin d'augmenter la solubilité de l'agent.La matrice de gel est facultativement gonflable par l'eau. Des exemples de polymères synthétiques appropriés comprennent, sans y être limités, le poly(acrylamide), le poly(acrylate de 2hydroxyéthyle), le poly(acrylate de 2-hydroxypropyle), la poly(N-vinylpyrrolidone), le poly(N-méthylolacrylamide), le poly < diacétone-acrylamide), le poly < méthacrylate de 2hydroxyéthyle), le poly(alcool vinylique) et le poly(alcool allylique) . D'autres exemples de polymères synthétiques polaires appropriés sont des polymères de condensation à fonctionnalité hydroxyle (c'est-à-dire des polyesters, polycarbonates, polyuréthannes).Des exemples de polymères naturels polaires (ou dérivés de ceux-ci) utilisables pour la matrice de gel sont, par exemple, des éthers de cellulose, des éthers de méthylcellulose, la cellulose et la cellulose hydroxylée, la méthylcellulose et la méthylcellulose hydroxylée, des gommes telles que le guar, la gomme de caroube, le karaya, la gomme de xanthane, la gélatine et leurs dérivés. Il est possible également d'utiliser des polymères ioniques pour la matrice, à condition que les contre-ions disponibles soient des ions de médicament ou soient d'autres ions de charge opposée à celle de l'agent actif.

Ainsi, les analogues de polypeptides de la présente invention sont incorporés dans le réservoir de médicament, par exemple une matrice de gel tel que décrite ci-dessus, et administrés à un patient en utilisant un système d'administration de médicament par électrotransport, éventuellement tel que décrit en exemple ci-dessus.

L'incorporation de la solution de médicament peut être effectuée d'un certain nombre de manières, par exemple en imbibant la matrice du réservoir avec la solution, en mélangent la solution de médicament avec la matière de matrice avant la formation d'hydrogel, etc.

Bien que l'invention ait été décrite en considérant ses formes de réalisation particulières préférées, on doit comprendre que la description précédente, ainsi que les exemples qui suivent, sont destinés à illustrer et non à limiter l'invention. D'autres aspects, avantages et modifications entrant dans le cadre de l'invention apparaîtront aux spécialistes du domaine auquel l'invention s'applique.

III. PARTIE EXPÉRIMENTALE
En général, les techniques usuelles de la technologie de l'ADN recombinant sont décrites dans diverses publications, par exemple : Molecular Cloning: A Laboratory
Manual de Sambrook et coll. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) ; Current Protocols in Molecular Biology de Ausubel et coll., volumes 1 et 2 et suppléments (1987) ; et Methods in Enzymology, dirigé par Wy et Grossman, volume 53 (ADN
Recombinant, Partie D, 1987). Les enzymes de restriction, les milieux de culture pour cellules de mammifères et la lignée cellulaire E. coli DH1OB < F mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC)
F80dlacZDM15 DlacX74 deoR recAl araD139 D(ara,leu)7697 galU galK I rpsL endAl nupG) ont été achetés chez Gibco/BRL
(Gaithersburg, MD).La polymérase Taq provenait de chez
Perkin Elmer Cetus (Norwalk, CT). La résine liant His a été achetée chez Novagen (Madison, WI) et utilisée selon les instructions du fabricant. La désoxyribonucléase (DNase) et la lysozyme ont été achetées chez Boehringer Mannheim
(Indianapolis, IN). Le bromure de cyanogène a été acheté chez Aldrich (Milwaukee, WI) . Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un synthétiseur d'ADN, modèle 394, de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) en utilisant les produits chimiques de cette même firme. La parathormone humaine synthétique et la parathormone bovine synthétique ont été achetées chez Bachem (Torrance, CA).

EXEMPLE 1
Construction de vecteurs d'expression pour
les polypeptides PTH
Les vecteurs d'expression de PTH sont construits en plusieurs étapes en utilisant le plasmide pBAD18 (Guzman et coll., 1995) comme plasmide de départ. Le plasmide pBAD18 contient le promoteur araB suivi par un lieur multisite et un terminateur sous la commande du régulateur positif/négatif ara C, également spécifié par le plasmide. Le plasmide pBAD18 contient également une origine modifiée de plasmide pBR322 et le gène bla pour permettre la réplication et la sélection dans E. coli, ainsi que la région intragénique du phage M13 pour permettre le dégagement d'ADN monocaténaire. Cependant, le vecteur de clonage effectivement utilisé pour construire les vecteurs d'expression de l'invention n'est pas déterminant aux fins de la présente invention.

Par exemple, le plasmide pMC3 pourrait servir de vecteur de clonage à la place du plasmide pBAD18 dans les protocoles exposés ci-dessous. Le plasmide pMC3 est décrit dans le brevet des E.U.A. NO 5 270 170. Le plasmide pMC3 diffère du plasmide pBAD18 en ce que le plasmide pMC3 code pour un répresseur de lac à queue de dynorphine B dans la région correspondant à la région NheI-XbaI du site de clonage multiple de pBAD18 et code une séquence d'opérateur lac dans la région correspondant au fragment NdeI-ClaI du plasmide pBAD18. Étant donné que ce dernier fragment n'est pas essentiel aux fins de la présente invention, on peut facilement construire des vecteurs convenant aux fins de l'invention à partir du plasmide pMC3.Le plasmide pMC3 est disponible dans la souche ARIî6l fournie par l'American
Type Culture Collection sous le numéro de dépôt ATCC 68818.

Les vecteurs de PTH sont ensuite construits comme suit. Les deux oligonucléotides partiellement chevauchants suivants sont assemblés par annelage et la synthèse du second brin est effectuée avec la polymérase Taq
5'-GCT CGG GCT AGC TAA CTA ATG GAG GAT ACA TAA ATG AkA GCT ATC TTC
Nhe I S & séquence de tête TrpLe
GTT CTG AAA GGT TCC CTG GAC CGT GAC CCG GAG3'
3'-AC CTG GCA CTG GGC CTT AAG CAG CTG TAC TAG
Sal I Bcl I
TTG GTC TAG AGG GTG GTG GTG GTA GTG GTA ATT ATT TTC GAA GGC AGG-5'
Bgl II His6 Hind III
Le produit est digéré par NheI et HindIII et inséré aux sites correspondants de pBAD18. Le duplex contient le site d'attachement du ribosome de Shine-Dalgarno (S & ) et le peptide de tête TrpLe.Il a été antérieurement montré que cette séquence de tête de 17 acides aminés accroît l'expression des petites protéines et peut favoriser la séquestration de produits fusionnés dans des corps d'inclusion (Derynck et coll., Cell (1984), 38, 287-297 ;
Miozzari et Yanofsky, J. Bacteriol. (1978), 133, 14571466). Le peptide de tête TrpLe est séparé de la séquence
His6 par un site de clonage multiple. Le site de polyhistidine permet une purification rapide de la molécule de parathormone recombinante (PTHR) et des analogues de
PTHR par chromatographie de chélation au nickel (voir le brevet des E.U.A. NO 4 551 271). La polyhistidine est suivie par deux codons d'arrêt (TAATAA).

Un gène de PTHR (1-34) ayant la séquence suivante est conçu et synthétisé en utilisant des codons très utilisés dans E. coli 1 2 3 4 5 6 7 8
Val-Asp-Met-Ile-Asn-Met-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu
5'-GGC TGG GTC GAC ATG ATC AAC ATG TCC GTT TCC GAA ATC CAG CTG CTG
3'-CCG ACC CAG CTG TAC TAG TTG TAC AGG OAA AGG CTT TAG GTC GAC GAC
Sal I
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
His-Asn-Leu-Gly Lys-His-Leu-Asn-Ser-Leu-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu
CAC AAC CTG GGT AAA CAC CTG AAC TCC CTC GAG CGT GTT GAA TGG CTG
GTG TTG GAC CCA TTT GTG GAC TTG AGG GAG CTC GCA CAA CTT ACC GAC
25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Tyr-Met-Gln-Ile-Ser
CGT AAA AAA CTG CAG GAC GTC CAC AAC TAC ATG CAG ATC TCC CTC-3'
GCA TTT TTT GAC GTC CTG CAG GTG TTG ATG TAC GTC TAG AGG GAG-5'
BgI II
Ce gène de PTHR est digéré par SalI et BglII et inséré dans le vecteur pBAD modifié.

EXEMPLE 2
Expression et purification de polypeptides PTH
La souche E. coli DH1OB contenant le plasmide décrit ci-dessus est cultivée en croissance pendant une nuit dans du milieu LB contenant de l'ampicilline (50 à 100 Ag/ml).

On utilise 10 ml de cette culture pour ensemencer une culture de 500 ml de Superbroth (35 g/l de tryptone Bacto, 20 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCl et NaOH jusqu'à pH 7,5) contenant de l'ampicilline. Les cellules sont cultivées en croissance jusqu'à une D.O.600 d'environ 0,5 à 1,0 et l'on ajoute du L-(+)-arabinose à une concentration finale de 0,2 %. Les cellules sont cultivées en croissance pendant 3 heures de plus. Au bout de ce temps, la D.O.600 se situe entre 1,5 et 3. Les cellules sont récoltées par centrifugation et lavées successivement avec 250 ml de tampon WTEK (Tris 50mM, pH 7,5, EDTA lOmM, KCl 100mM), 250 ml de solution saline de tampon phosphate (STP) et 250 ml de Tris lOmM, pH 7,5.Les cellules sont ensuite remises en suspension dans 100 ml d'une solution constituée de Tris 10mM, pH 7,5, 0,1 mg/ml de N-tosyl-L-phénylalaninechlorométhylcétone (TPCK) comme inhibiteur de protéase, 0,1 mg/ml de N-tosyl-L-lysine-chlorométhylcétone (TLCK) comme inhibiteur de protéase, 0,1 mg/ml de fluorure de phénylméthylsulfonyle (FPMS) comme inhibiteur de protéase et 0,05 mg/ml de lysozyme. La solution résultante est mise à incuber sur glace pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite congelées-décongelées, on ajoute 1 mg de DNase aux cellules congelées-décongelées, et le mélange résultant est mis à incuber sur glace pendant 1 heure de plus.

Les corps d'inclusion provenant des cellules sont purifiés par centrifugation à 10 000 g pendant 15 minutes.

Les corps d'inclusion sont solubilisés dans du dodécylsulfate de sodium (DSS) à 10 %, mais, dans certains cas, un traitement aux ultrasons de l'échantillon est également nécessaire pour solubiliser toute la protéine. Un tampon de liaison (imidazole 5mM, NaCl 500mM et Tris 20mM, pH 7,9) est ajouté pour diluer le DSS jusqu'à une concentration de 1 %, et l'échantillon est appliqué sur une colonne contenant une résine liant His (Novagen). La colonne est ensuite lavée avec 15 volumes de colonne de tampon de liaison, et la protéine liée est ensuite éluée avec 1 volume de colonne de tampon d'élution < NaCl 500mM, EDTA 100mM et Tris 50mM, pH 7,9). On ajoute ensuite 2 volumes d'éthanol absolu pour précipiter la protéine.

Le polymère de PTH précipité est ensuite dissous dans l'acide formique à 70 % et l'on ajoute du CNBr en un excès molaire de 500 fois (un excès de 100 à 1000 fois peut être utilisé) . Une mesure de temps de clivage (conduite à différentes concentrations de CNBr pour déterminer le temps optimal), tel que contrôlé par analyse d'acides aminés, indique que le clivage complet est réalisé en 2 heures à la température ambiante. Après clivage au CNBr, les peptides sont lyophilisés et remis en suspension dans de l'eau distillée. Le peptide est remis en suspension dans du Tampon A
[0,1 % d'acide trifluoracétique (TFA)] et encore purifié par CLHP en utilisant une colonne semi-préparative Vydac C18. Une quantité d'environ 30 mg de peptide est injectée sur la colonne. Le peptide est ensuite élué avec un gradient de 20 à 40 % d'acétonitrile/TFA à 0,1 % en 40 minutes. La fraction du pic principal, s'éluant à environ 15 minutes, est recueillie et lyophilisée jusqu'à siccité.

Après isolement des corps d'inclusion et purification comme décrit ci-dessus, le peptide a une pureté supérieure à 95 %, comme déterminé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium (EGPA-DSS). Le peptide est ensuite dessalé et purifié partiellement sur une colonne Sep-Pak. Les pics individuels sont isolés et analysés par spectrométrie de masse à électropulvérisation pour déterminer la composition. Il y a deux pics secondaires qui sont la conséquence d'un clivage incomplet par le bromure de cyanogène et qui représentent le peptide
PTH-His6 et le peptide I-N-M-PTH. Le pic principal représente plus de 80 % de la protéine totale. Une comparaison de l'échantillon purifié par Sep-Pak "brut" avec une PTHR purifiée par CLHP ne révèle aucune différence importante quant au pouvoir stimulateur d'adénylatecyclase.

EXEMPLE 3
Production d'analogues de la PTH
Afin de produire les analogues de la PTH de la présente invention, le peptide PTH est substitué par les acides aminés indiqués sur les Figures 1B, 1C et 1D. Les analogues de la PTH sont produits par des techniques de recombinaison, en construisant d'une manière similaire à celle décrite ci-dessus pour le gène recombinant de PTHR-A, en opérant les remplacements des bases appropriées.

Les analogues de la PTH sont exprimés et purifiés comme décrit ci-dessus.

EXEMPLE 4
Évaluation de 1'active des analogues de la PTH
La PTH synthétique ayant la séquence du type sauvage et les analogues de la PTH recombinante (PTHR) sont examinés quant à leur aptitude à stimuler l'adénylatecyclase. Les concentrations de PTH sont déterminées par la
D.O.280 en utilisant un coefficient d'extinction de 6600 pour le peptide recombinant et de 5500 pour le peptide synthétique. La lignée cellulaire d'ostéosarcome de rat UMR106 (ATCC CRL 1661) est utilisée pour évaluer in vitro l'aptitude du peptide à activer le récepteur de la PTH.

L'activation du récepteur de la PTH entraîne une élévation intracellulaire de la concentration d'AMPc.

Les cellules UMR106 sont inoculées à raison d'environ 2,5 x 105 par puits dans une plaque à 48 puits et cultivées en croissance jusqu'à confluence. Les évaluations sont effectuées sur les cellules 3 à 5 jours après confluence.

On enlève le milieu (milieu de Eagle modifié par Dulbecco,
DMEM, avec sérum foetal de veau) et l'on applique 1 ml de milieu frais. La PTH (recombinante ou synthétique) à diverses concentrations et de la 3-isobutyl-lméthylxanthine (IBMX) à une concentration finale lmM sont ensuite ajoutées à chaque puits de la plaque, qui est ensuite mise en incubation pendant 5 minutes à la température ambiante. Le milieu est ensuite enlevé et les cellules sont lavées rapidement avec du STP glacé. Les cellules sont ensuite extraites deux fois avec 1 ml d'éthanol absolu. Les deux produits d'extraction sont rassemblés et l'éthanol est éliminé par évaporation.

L'extrait est ensuite redissous dans 1 ml de tampon pour dosage de proximité par scintillation (tampon SPA)
(Amersham, Arlington Heights, IL). La concentration d'AMPc est déterminée par dosage en utilisant un nécessaire de dosage de proximité par scintillation (SPA) disponible chez
Amersham. L'analogue 1 a une Kd (constante de dissociation) de 1,5nM et une CE50 (concentration efficace) de 0,9nM.

La PTH de type sauvage a une Kd de 8,5nM et une CE50 de 4,4nM. Les analogues 2 et 3 n'ont pas d'activité mesurable.

EXEMPLE 5
Prévision des effets des remplacements
d'acides aminés dans les analogues de la PTH
sur le potentiel de formation d'hélice a
Comme expliqué ci-dessus, le potentiel de formation d'hélice a de polypeptides linéaires peut être estimé en utilisant les équations de Lifson-Roig (S. Lifson et A.

Roig, J. Chem. Phys. (1961), 34, 1963-1974) et les valeurs déterminées pour les paramètres de formation d'hélice des résidus par conversion à partir de leurs valeurs de Zimm
Bragg (B.H. Zimm et J.K. Bragg, J. Chem. Phys. (1959), 31, 526-535) en utilisant les équations de conversion de Qian et Schellman (H. Qian et J.A. Schellman, J. Chemin. Phys.

(1992), 96, 3987-3994). Une fois qu'un couple de valeurs s et a de Zimm-Bragg est défini pour chaque résidu, la probabilité pour que la chaîne polypeptidique entière (ou quelque sous-séquence définie) adopte une conformation d'hélice a peut alors être calculée en utilisant les équations mentionnées dans les références ci-dessus.

Les deux calculs généralement utilisés pour estimer le potentiel de formation d'hélice a, décrits ci-dessus, sont appliqués aux deux analogues de la PTH produits. Le premier calcul pose que le paramètre d'amorçage d'hélice v de
Lifson-Roig est une constante égale à 0,039 (c'est-à-dire que le paramètre a de Zimm-Bragg est de 0,0013 pour tous les résidus), et le paramètre w pour chaque acide aminé est calculé d'après la valeur s de Zimm-Bragg trouvée dans le Tableau 1 de Finkelstein et coll. (Finkelstein et coll.,
Proteins: Structure, Function and Genetics (1991), 10, 287299).En appliquant les calculs aux analogues de la PTH, les valeurs s figurant dans le Tableau 1 de cette référence sont d'abord converties pour passer de leurs valeurs à 3000K aux valeurs estimées à 2730K en admettant une variation d'enthalpie de 1 kcal/mol (identique pour tous les résidus) . Pour l'analogue 1 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,41 pour que la séquence entière forme une hélice a. Pour l'analogue 2 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,18 pour que la séquence entière forme une hélice a. Pour l'analogue 3 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,15 pour que la séquence entière forme une hélice a.

Le second calcul ne suppose pas que tous les résidus ont la même valeur pour le paramètre v d'amorçage d'hélice
(c'est-à-dire que le paramètre a de Zimm-Bragg est spécifique à chaque résidu d'acide aminé) . Dans ce cas, les valeurs s et a de Zimm-Bragg pour chaque résidu (excepté pour His, Pro et Trp) sont extraites du Tableau 1 de
J. Skolnick et A. Holtzer, Macromolecules (1982), 15, 812821. Les valeurs de Zimm-Bragg pour His sont celles fournies par Sueki et coll., Macromolecules (1984), 17, 148-155. Les valeurs de Zimm-Bragg pour Pro et Trp sont celles fournies par Finkelstein et coll. Pour ce second calcul, dans chaque cas, la valeur s a été calculée à 2730K et, pour les résidus ayant des chaînes latérales ionisables, on admet la valeur s pour l'état d'ionisation qui doit prédominer à pH 7.Les valeurs s (à 2730K) et les valeurs 6 obtenues d'après Sueki et coll., et Skolnick et
Holtzer sont converties (Qian et Schellman) en leurs valeurs v et w de Lifson-Roig, puis utilisées pour calculer la probabilité pour que la chaîne polypeptidique entière (ou quelque sous-séquence) existe à l'état d'hélice a. Pour l'analogue 1 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,07 pour que la séquence entière forme une hélice a. Pour l'analogue 2 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,02 pour que la séquence entière forme une hélice a. Pour l'analogue 3 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,02 pour que la séquence entière forme une hélice a.

Considérées ensemble, ces deux séries d'hypothèses concernant la tendance des polypeptides à prendre une conformation d'hélice a laissent prévoir que l'analogue 1 doit être deux à trois fois plus susceptible d'exister sous forme d'une hélice a que l'analogue 2.

EXEMPLE 6
Estimation du potentiel de formation d'hélice a
d'après le dichroisme circulaire dans des
concentrations variables de trifluoréthanol
Les études de dichroïsme circulaire dans le trifluoréthanol (TFE) sont conduites en utilisant un spectromètre de dichroïsme circulaire, modèle 62DS, de AVIV
Associates, Inc. Les concentrations de protéine sont déterminées d'après les valeurs mesurées d'absorbance en utilisant les coefficients d'extinction calculés pour les analogues dans du tampon ionique 1OmM. Des titrages avec le
TFE sont effectués de O à 50 % de TFE, en balayant de 250 à 200 nm à 200C pour chaque échantillon contenant du TFE.

[Q]222 est calculé comme Observé à 222 R (poids de résidu moyen)/[l0(parcours optique de la cuve) (concentration de protéine)]
Les résultats des titrages avec le TFE à pH 6,5 en présence de cacodylate lOmM sont résumés ci-dessous au
Tableau 2 pour les analogues de la PTH et transcrits graphiquement sur la Figure 4. La Figure 4 montre que, lorsque la concentration du co-solvant inducteur d'hélice a, le trifluoréthanol, atteint 30 % en volume, le taux essentiellement maximal de conformation hélicoïdale est atteint pour à la fois la PTH et l'analogue 1, le taux moyen de conformation hélicoïdale étant d'environ 80 %.

Même en l'absence d'agent inducteur d'hélice, la PTH originale a environ 20 % de conformation d'hélice a.

L'analogue 2 de la PTH est essentiellement dépourvu d'hélice en l'absence du TFE inducteur d'hélice, et il a tout au plus environ 30 % de conformation d'hélice a en présence de 30 % de TFE.

L'analogue 3 de la PTH est essentiellement dépourvu d'hélice en l'absence du TFE inducteur d'hélice, et il a environ 15 % de conformation d'hélice a en présence de 30 % de TFE.

La réduction de 2 à 3 fois du taux d'hélice observé à 30 % de trifluoréthanol était prévisible d'après l'équation de Lifson-Roig et les calculs faits selon cette équation, comme exposé ci-dessus.

TABLEAU 2
Résultats de Titraqe avec le TFE

<tb> % <SEP> de <SEP> [e]222 <SEP> pour <SEP> [ & 222 <SEP> pour <SEP> [6] <SEP> 222 <SEP> pour <SEP> [e]222 <SEP> pour
<tb> TFE <SEP> hPTH <SEP> (1-34) <SEP> l'analogue <SEP> 1 <SEP> l'analogue <SEP> 2 <SEP> l'analogue <SEP> 3
<tb> <SEP> 0 <SEP> -7793 <SEP> -4205 <SEP> -2750 <SEP> -3867
<tb> 10 <SEP> -15 <SEP> 863 <SEP> -9333 <SEP> -4600 <SEP> -6479
<tb> 20 <SEP> -21 <SEP> 491 <SEP> -23 <SEP> 098 <SEP> -9065 <SEP> -12 <SEP> 329
<tb> 30 <SEP> -26 <SEP> 288 <SEP> -26 <SEP> 334 <SEP> -12 <SEP> 081 <SEP> -15 <SEP> 161
<tb> 40 <SEP> -27 <SEP> 011 <SEP> -27 <SEP> 580 <SEP> -14 <SEP> 320 <SEP> -15 <SEP> 191
<tb> 50 <SEP> ~ <SEP> <SEP> -26 <SEP> 802 <SEP> ~ <SEP> <SEP> -27 <SEP> 705 <SEP> -15 <SEP> 649 <SEP> -15 <SEP> 395
<tb>
EXEMPLE 7
Flux d'électrotransport in vitro des analogues de la PTH
Des études d'électrotransport in vitro sont effectuées dans des cuves multi-compartimentées de petit volume fabriquées à cet effet, en utilisant l'entraînement anodique. La PTH lmM dans du tampon l0mM est placée dans le compartiment donneur et une solution réceptrice ayant une force ionique finale de 25mM est placée dans le compartiment récepteur. La solution réceptrice pour la PTH native et les analogues 1 et 2 consiste en NaCl 15mM tamponné à pH 7 avec de l'imidazole lOmM, 0,1 % de sérumalbumine bovine (SAB) comme agent bloquant, du détergent
Tween 20 et de l'azoture de sodium comme bactéricide.La solution réceptrice pour l'analogue 3 de la PTH consiste en
NaCl 15mM tamponné à pH 7 avec de l'imidazole 10mM, 0,5 % de bromure de dodécyltriméthylammonium (BDTA, un agent tensio-actif) et 0,3 mg/ml de Trp-Nle-Arg-Phe-amide, un tétrapeptide utilisé comme substrat "de remplacement" pour les enzymes protéolytiques présentes dans la peau.

De la couche cornée de cadavre humain, détachée à chaud, est placée entre les compartiments donneur et récepteur, la face épidermique étant tournée vers le compartiment récepteur. Un courant continu constant de 127 RA (c'est-à-dire 0,1 mA/cm ) est appliqué. Les cuves sont maintenues à 32 C pendant les études in vitro et des échantillons de solution réceptrice sont prélevés toutes les deux heures (le volume de solution réceptrice prélevé est remplacé par un même volume de solution réceptrice "fraîche" à chaque prélèvement d'échantillon) . Les échantillons de solution réceptrice sont analysés par CLHP en phase inversée.

Les aires de pics des échantillons de solution réceptrice de PTH sont comparées à des courbes d'étalonnage du même analogue à des concentrations connues construites en même temps en utilisant une colonne de polymère analytique à un débit de 1,5 ml/min avec un gradient de 10 à 50 % de B en dix minutes pour l'élution. Le Tampon A comprend 0,1 % d'acide trifluoracétique (TFA) et 1 % d'acétonitrile ; le Tampon B comprend 0,1 % de TFA et 98,9 % d'acétonitrile. Les concentrations d'analogue sont converties en flux massique et représentées graphiquement en fonction du temps.

Pour les études d'électrotransport in vitro, les donneurs décrits contiennent les versions rétro-inverses
(c'est-à-dire que des résidus de D-acides aminés sont utilisés et sont assemblés dans l'ordre opposé à l'ordre normal) des analogues 1 et 2 de la PTH (lmM) dans des solutions aqueuses à pH 5,0. La raison en est que les analogues 1 et 2 de la PTH ne sont pas stables lorsqu'ils sont incubés avec la couche cornée détachée, sans doute à cause d'une digestion protéolytique par les protéases de la peau. L'analogue 3 de la PTH n'est pas une version rétroinverse, mais il est synthétisé par des techniques de recombinaison. Afin de protéger l'analogue 3 contre une digestion par les enzymes protéolytiques, le tétrapeptide est ajouté à la solution réceptrice. Les cuves d'électrotransport entièrement assemblées sont mises en incubation à 32 + 0,50C.La surface de contact avec la peau utile pour le transport est de 1,27 cm2. Le volume du compartiment donneur est de 200 \il ; le volume du compartiment récepteur est de 350 l. La solution réceptrice est séparée de la cathode par une membrane échangeuse d'anions (Ionacz, Electrosynthesis Co., Lancaster, NY)
Chaque cuve est connectée à une source de courant constant à une densité de courant .normale de 100 pA.cm . La chute de tension dans chaque cuve est contrôlée à intervalles d'environ 2 heures pendant la durée de l'expérience.

Des histogrammes de flux massique pour chaque point de temps sont tracés. Le flux massique médian (coefficient de sécurité de 95 %) est de 0,3 Rg.cm 2. h 1 (0,1 à 0,7) pour l'analogue 1 de la PTH, de 3,2 ptg.cm .h (2,1 à 4,2) pour l'analogue 2 de la PTH, et de 1,1 Sg.cm .h1 (0,9 à 1,7) pour l'analogue 3 de la PTH. Les valeurs de flux massique moyen + écart type pour ces analogues sont respectivement de 1,4 Ag.cm h + 2,3, de 4,1 Rg.cm h +
-2 -1 3,7 et de 1,5 g.cm h + 1,1 pour les analogues 1, 2 et 3.

EXEMPLE 8
Estimation du potentiel de formation d'hélice a
d'après le dichroisme circulaire dans des
concentrations variables de trifluoréthanol
Les études de dichroisme circulaire dans le trifluoréthanol (TFE) sont conduites en utilisant un spectromètre de dichroïsme circulaire, modèle 62DS, de AVIV
Associates, Inc. Les concentrations de protéine sont déterminées d'après les valeurs mesurées d'absorbance en utilisant les coefficients d'extinction calculés pour les analogues dans du tampon ionique 1OmM. Des titrages avec le
TFE sont effectués de O à 50 % de TFE, en balayant de 250 à 200 nm à 200C pour chaque échantillon contenant du TFE.

[Q] 222 est calculé comme Observé à 222 R (poids de résidu moyen)/[10(parcours optique de la cuve) (concentration de protéine)]
Les résultats des titrages avec le TFE à pH 6,5 en présence de cacodylate lOmM sont résumés ci-dessous au
Tableau 3 pour les analogues d'hirulogue et transcrits graphiquement sur la Figure 5. La Figure 5 montre que, lorsque la concentration du co-solvant inducteur d'hélice a, le trifluoréthanol, atteint 30 % en volume, le taux essentiellement maximal de conformation hélicoïdale est atteint tant pour l'hirulogue original que pour l'analogue
B2, le taux moyen de conformation hélicoïdale étant d'environ 10 % pour l'hirulogue original et essentiellement de O % pour l'analogue B2. L'hirulogue original et l'analogue B2 ne présentent aucune conformation d'hélice a en l'absence du TFE inducteur d'hélice.Même à des concentrations de 80 % de TFE, l'analogue B2 n'a essentiellement pas de conformation d'hélice a.

TABLEAU 3
Résultats de Titraqe avec le TFE

<tb> % <SEP> de <SEP> TFE <SEP> [e222 <SEP> pour <SEP> [e]222 <SEP> pour
<tb> <SEP> I'hiruloque <SEP> oriqinal <SEP> l'analogue <SEP> B2
<tb> <SEP> O <SEP> -1120 <SEP> -989
<tb> 10 <SEP> -3679 <SEP> -1313
<tb> 20 <SEP> -5458 <SEP> -1580
<tb> 30 <SEP> -6972 <SEP> -1848
<tb> 40 <SEP> -8365 <SEP> -1896
<tb> 50 <SEP> -8493 <SEP> -1963
<tb>
EXEMPLE 9
Flux d'électrotransport in vitro de l'hirulogue-B2
L'hirulogue-B2 est synthétisé suivant des techniques classiques. Voir, par exemple : Maraganore et coll., Thromb. Haemostasis (1991), 65, 830 ; Bode et coll., EMBO
J. (1989), 8, 3467-3475 ; et la publication internationale NO WO 92/13952.Le flux d'électrotransport transdermique de l'hirulogue-B2 est évalué en utilisant de l'épiderme humain détaché à chaud. En outre, des formulations d'hydrogel sont également étudiées en utilisant de l'épiderme humain, ainsi que l'effet de la densité de courant sur le flux transdermique de médicament. Le flux transdermique d'hirulogue-B2 est évalué en utilisant des solutions aqueuses préparées tant avec le médicament tel que reçu que le médicament dessalé, tamponnées avec du tampon acétate à une force ionique 1OmM, pH 5. Les études de flux d'hirulogue-B2 sont conduites à une densité de courant de 0,1 mA/cm2.

En utilisant du NaCl 15mM tamponné à l'acétate à pH 5 comme solution réceptrice, des flux d'électrotransport d'environ 19 CLg.h-l.cm-2 et 17 Ag.h1.cm2 en régime stable sont obtenus respectivement pour les solutions de médicament dessalé et tel que reçu.

La variabilité du flux d'hirulogue-B2 pour des échantillons de peau provenant d'un même donneur, ainsi que de plusieurs donneurs, se révèle être d'environ 15 à 40 %, ce qui entre bien dans les intervalles de variabilité observés pour les peptides et les composés protéiques.

Pour les études sur hydrogel, des disques d'hydrogel sont imbibés du médicament et assemblés dans des enveloppes de mousse. Les gels sont imbibés avec des solutions du médicament tel que reçu (hirulogue-B2 llmM dans acétate 20mM) ou du médicament dessalé (hirulogue-B2 4mM dans acétate 4mM). Un flux d'électrotransport moyen d'environ 27 Ag.h 1.cm 2 en régime stable est obtenu avec chacune des formulations d'hydrogel contenant le médicament tel que reçu ou le médicament dessalé.

En utilisant des hydrogels imbibés du médicament tel que reçu, une autre expérience est entreprise pour évaluer l'effet de la densité de courant sur le flux transdermique d'hirulogue-B2. Un accroissement de la densité de courant entraîne un accroissement correspondant du flux d'hirulogue-B2 sur l'étendue des densités de courant examinées. Dans des conditions passives (courant nul), on n'observe aucun flux mesurable d'hirulogue-B2.

EXEMPLE 10
Flux d'électrotransport in vivo d'hirulogue-B2
A. Administration intraveineuse d'hiruloaue-B2
Les porcs utilisés pour les études par administration intraveineuse (i.v.) pèsent 11 + 1 kg (n = 3) et ils sont mis à jeun pendant une nuit avant les injections d'embol.

Les injections d'embol i.v. sont faites dans la veine auriculaire ou la veine cave. L'injection i.v. est effectuée en environ 3 à 60 secondes et la dose est d'environ 0,3 mg/kg (dans 0,5 ml). Les concentrations plasmatiques d'hirulogue-B2 s'élèvent rapidement chez tous les porcs après l'injection d'embol i.v. d'hirulogue-B2, en atteignant une concentration maximale moyenne de 66 + 6 ng/ml au prélèvement d'échantillon effectué au bout de 15 minutes. Les concentrations plasmatiques d'hirulogue-B2 diminuent pour atteindre moins de 2 ng/ml au bout de 2 heures après l'injection d'embol, et restent relativement constantes de 2 à 8 heures après l'injection d'embol. La demi-vie d'élimination et la clairance calculées pour chaque porc sont indiquées au Tableau 3.Le volume apparent de distribution et la demi-vie moyenne d'élimination, calculés d'après les résultats d'injection d'embol i.v., sont respectivement de 45,4 litres et 16 minutes.

TABLEAU 4
Pharmacocinétique de l'hirulogue-B2 chez le porc

<tb> <SEP> Phase <SEP> Porc <SEP> Porc <SEP> Porc <SEP> Ecart <SEP>
<tb> <SEP> Définitive <SEP> 303 <SEP> 304 <SEP> 305 <SEP> Moyenne <SEP> type
<tb> <SEP> v. <SEP>
<tb>

P.C <SEP> [kg] <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 1
<tb> K <SEP> e <SEP> <SEP> [1/h] <SEP> 2,42 <SEP> 2,01 <SEP> 2,5 <SEP> 2,31 <SEP> 0,26
<tb> V <SEP> [#] <SEP> <SEP> 45,5 <SEP> 49,25 <SEP> 41,55 <SEP> 45,43 <SEP> 3,85
<tb> V <SEP> [e/k9] <SEP> 3,8 <SEP> 4,5 <SEP> 4,2 <SEP> 4,2 <SEP> 0,35
<tb> CL <SEP> [e/h] <SEP> 110 <SEP> 99 <SEP> 104 <SEP> 104 <SEP> 5,5
<tb> CL <SEP> [e/h/kg] <SEP> 9,2 <SEP> 9,0 <SEP> 10,4 <SEP> 9,5 <SEP> 0,76
<tb> Elimination <SEP> 17,2 <SEP> 20,72 <SEP> 16,6 <SEP> 18,2 <SEP> 2,23a
<tb> <SEP> T1 <SEP> [min] <SEP> 16b <SEP>
<tb> <SEP> s.c. <SEP>
<tb>

Élimination <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 58b <SEP> <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> T <SEP> [min] <SEP>
<tb> <SEP> 4 <SEP> ET
<tb> Élimination <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 28b <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> T; <SEP> [min]
<tb> <SEP> 38b <SEP>
<tb> Accumulation <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> T <SEP> [min]
<tb> <SEP> Phase <SEP> Porc
<tb> Préliminaire <SEP> SC-3A
<tb> <SEP> 3 <SEP> ET
<tb> Élimination <SEP> 32
<tb> <SEP> T1 <SEP> [min]
<tb> Accumulation <SEP> 33
<tb> <SEP> T, <SEP> [min]
<tb> a
Moyenne calculée d'après les déterminations individuelles
de T1.

Calculée d'après la régression linéaire de la courbe de
concentration plasmatique moyenne d' hirulogue-B2 en
fonction du temps.

B. Administration sous-cutanée d'hirulogue-B2
Des porcs sont mis à jeun pendant une nuit avant les injections sous-cutanées (s.c.). Environ 0,5 mg/kg (dans 0,5 ml) d'hirulogue-B2 est administré par voie s.c.

en une minute. Les concentrations plasmatiques d'hirulogue
B2 atteignent un maximum de 57 + 10 ng/ml dans la première heure qui suit l'injection et diminuent par la suite.

La demi-vie moyenne d'élimination après injection s.c. est de 58 minutes (Tableau 4). Les concentrations plasmatiques d'hirulogue-B2 sont d'environ 2 ng/ml vers 6 heures après l'injection s.c. et sont relativement constantes de 6 à 8 heures.

C. Électrotransport d'hirulogue-B2
Les systèmes d'électrotransport utilisés pour l'administration d'hirulogue-B2 in vivo comprennent une unité à usage unique contenant le médicament qui est électriquement connectée à un régulateur de courant réutilisable. L'unité à usage unique contenant le médicament consiste en une bande de mousse adhésive de polyéthylène stratifiée, de qualité médicale, logeant la contre-électrode anodique en feuille d'argent et une électrode cathodique en pellicule de polyisobutylène chargé de AgCl, ainsi que les gels respectifs. Le gel anodique est en contact avec l'anode en feuille d'argent. Un gel cathodique d'interface est en contact avec la cathode au
AgCl. Le gel d'interface est séparé du gel donneur contenant le médicament par une membrane échangeuse de cations.Le gel donneur est placé dans la cavité cathodique du logement de gel juste avant l'application du système.

Le jour précédant l'électrotransport, les gels donneurs sont imbibés avec l'hirulogue-B2 dans du tampon acétate (10mM, pH 5) pour établir une concentration finale 5mM du peptide. La surface de contact avec la peau est de 6 cm2 pour chaque gel de médicament. La densité de courant appliquée est de 0,1 mA/cm2.

Les systèmes d'électrotransport sont contrôlés en courant et en tension pendant l'électrotransport pour confirmer la continuité électrique du système. Les valeurs de tension sont typiques pour ce modèle animal et accusent une décroissance initiale, suivie par des valeurs assez constantes pendant toute la durée de l'étude. La demi-vie moyenne d'élimination après la fin de l'électrotransport est de 28 minutes (Tableau 4). La demi-vie moyenne d'accumulation au début de l'électrotransport est de 38 minutes. Les concentrations plasmatiques d'hirulogue-B2 atteignent un maximum de 23 i 6 ng/ml après 4 heures d'électrotransport continu. Les concentrations plasmatiques d'hirulogue-B2 restent relativement stables, à 21 i 7 ng/ml, entre 2 et 6 heures d'électrotransport, et diminuent légèrement vers 8 heures.La diminution apparente des concentrations plasmatiques d'hirulogue-B2 entre 6 et 8 heures d'électrotransport peut être due à l'appauvrissement de l'hydrogel donneur en hirulogue-B2. Une rapide diminution des concentrations plasmatiques d'hirulogue-B2 survient après la fin de l'électrotransport. Vers 2 heures après la fin de l'électrotransport, les concentrations plasmatiques d'hirulogue-B2 sont de 2 ng/ml ou à peu près.

La demi-vie moyenne d'élimination à partir des trois systèmes d'électrotransport après la fin de l'électrotransport est de 32 minutes, tandis que la demivie moyenne d'accumulation au début de l'électrotransport est de 33 minutes (Tableau 4). La concentration plasmatique d'hirulogue-B2 atteint un maximum de 9 ng/ml après 2 heures, après quoi il apparaît une lente décroissance des concentrations plasmatiques d'hirulogue-B2.

Les flux transdermiques, calculés en vitesse d'apport (Ag/h) et en flux par unité de surface (Ag/cm2.h), sont calculés en utilisant des analyses à un compartiment et non compartimentale. L'analyse non compartimentale calcule le flux transdermique de médicament d'après la concentration de médicament dans le sang de l'animal, cette concentration étant mesurée par des techniques classiques, et la vitesse connue à laquelle le médicament particulier est éliminé du sang.L'analyse à un compartiment calcule le flux transdermique de médicament d'après la concentration (mesurée) de médicament dans le sang de l'animal, et en admettant que l'absorption par l'animal de médicament administré par voie i.v. à toute vitesse particulière est la même que celle réalisée par administration par électrotransport, afin d'atteindre une concentration particulière de médicament dans le sang. Le modèle à un compartiment et le modèle non compartimental sont discutés dans Pharmacokinetics de
M. Gibaldi, 2ème édition, Marcel Dekker (1982), pages 1-5 et 319-322. Les vitesses d'apport transdermique et les flux par unité de surface calculés en utilisant ces deux analyses sont indiqués au Tableau 5.La vitesse moyenne d'apport calculée est de 1873 + 444 Ag/h et le flux moyen calculé est de 78 + 18 Rg.h .cm 2 pour quatre systèmes d'électrotransport (ET) (hirulogue-B2) en utilisant le modèle à un compartiment. En utilisant l'analyse non compartimentale, la vitesse d'apport calculée est de 1900 + 523 Ag/h et le flux calculé est de 79 + 22 Zg.h l.cm 2 pour quatre systèmes ET (hirulogue-B2) . Un flux moyen de 22 ,tLg.h l.cm 2 est calculé pour l'animal utilisé dans la
Phase Préliminaire 2 qui reçoit trois systèmes ET (hirulogue-B2).

TABLEAU 5
Vitesses d'apport et flux d'électrotransport calculés
pour l'hirulogue-B2 chez le porc

<tb> <SEP> Phase <SEP> Définitive <SEP> Porc <SEP> Porc <SEP> <SEP> Porc <SEP> Moyenne
<tb> <SEP> 303 <SEP> 304 <SEP> 305 <SEP> Moyenne <SEP> type
<tb> 4 <SEP> ET
<tb> (un <SEP> compartiment)
<tb> K <SEP> a <SEP> <SEP> t1/h] <SEP> 3,64 <SEP> 2,5 <SEP> 2,94 <SEP> 3,03 <SEP> 0,58
<tb> Vitesse <SEP> [CLg/h] <SEP> 1361 <SEP> 2096 <SEP> 2161 <SEP> 1873 <SEP> 444
<tb> Flux <SEP> [llg/cm2.h] <SEP> 56,7 <SEP> 87,3 <SEP> 90,0 <SEP> 78,0 <SEP> 18,5
<tb> 4 <SEP> ET
<tb> (non <SEP> compartimentale)
<tb> Vitesse <SEP> [ g/h] <SEP> 1396 <SEP> 1866 <SEP> 2440 <SEP> 1900 <SEP> 523
<tb> Flux <SEP> [lg/cm2.h] <SEP> <SEP> 58,2 <SEP> 77,8 <SEP> 101,7 <SEP> 79,2 <SEP> 21,8
<tb> <SEP> Porc
<tb> <SEP> Phase <SEP> Preliminaire <SEP>
<tb> <SEP> SC-3A
<tb> 3 <SEP> ET
<tb> (un <SEP> compartiment)
<tb> K <SEP> a <SEP> <SEP> [1/h] <SEP> 3,15
<tb> Vitesse <SEP> [ g/h] <SEP> 392
<tb> Flux <SEP> [llg/cm2.h] <SEP> 21,8
<tb> 3 <SEP> ET
<tb> (non <SEP> compartimentale)
<tb> Vitesse <SEP> [g/hj <SEP> 412
<tb> Flux <SEP> [ g/cm.h] <SEP> 22,9
<tb>
Ainsi, des procédés sont enseignés pour accroître le flux d'électrotransport d'agents polypeptidiques. Bien que des formes de réalisation préférées de la présente invention aient été décrites de manière assez détaillée, il est bien entendu que des modifications évidentes peuvent être apportées sans s'écarter du cadre de l'invention.

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d'un analogue d'un polypeptide original ayant un segment à conformation d'hélice a et/ou de feuillet ss, l'analogue manifestant une aptitude à l'électrotransport améliorée/accrue à travers une surface corporelle, caractérisé en ce qu'un ou plusieurs résidus d'acides aminés dudit polypeptide original sont remplacés pour former le polypeptide analogue, de manière à démanteler un ou plusieurs segments à conformation d'hélice a et/ou de feuillet ss dudit polypeptide original, si bien que ledit polypeptide analogue manifeste une aptitude à l'électrotransport améliorée/accrue par rapport à celle dudit polypeptide original.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un résidu d'acide aminé ayant une valeur Pa inférieure.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le résidu d'acide aminé ayant une valeur Pa inférieure est choisi parmi Pro, Gly et Asn.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un résidu d'acide aminé ayant une valeur Pss inférieure.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le résidu d'acide aminé ayant une valeur Pss inférieure est choisi parmi Pro, Gly et Asp.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit analogue de polylpeptide manifeste au moins à peu près la même activité biologique que le polypeptide original.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit polypeptide original est une molécule de parathormone (PTH) telle que représentée par la séquence Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly

Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys

Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit analogue de polypeptide est l'un des analogues de la PTH représentés par les séquences Ser-Val-Ser-Glu-Ile Gln-Leu-Leu-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Arg-Asn-Ser-Leu-Arg-

Arg-Val-Arg-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Lya-Asp-Val-His-Asn- Tyr-HSL, Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Asn-Ser-Gly-

Lys-His-Ara-Asn-Ser-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Trp-Ser-Arg-Lys-

Lys-Ser-Lys-Asp-Val-His-Asn-Ser-HSL et Ser-Val-Ser-Glu-Ile

Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu Arg-Pro-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Pro-Gln-Asp-Val-His-Asn-

Phe.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit polypeptide original est un hirulogue tel que représenté par la séquence

(D-Cha)-Ala-Arg-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Phe-Glu

Glu-Ile-Ala-Glu-Glu-Tyr-Leu.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit analogue de polypeptide est l'hirulogue-B2 tel que représenté par la séquence (D-Cha)-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly

Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu.

11. Procédé de fabrication d'un dispositif d'électrotransport pour administrer un agent polypeptidique par électrotransport à travers une surface corporelle, ce procédé impliquant de fournir une quantité efficace au point de vue thérapeutique de l'agent polypeptidique dans un réservoir donneur du dispositif d'électrotransport, caractérisé en ce que l'agent polypeptidique fourni dans le réservoir est un analogue d'un polypeptide original ayant un segment à conformation d'hélice a et/ou de feuillet ss, dans lequel un ou plusieurs résidus d'acides aminés du polypeptide analogue sont remplacés par rapport audit polypeptide original de manière à démanteler ledit segment à conformation d'hélice a et/ou de feuillet ss.

polypeptide original de manière à démanteler ledit segment à conformation d'hélice a et/ou de feuillet ss.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un résidu d'acide aminé ayant une valeur a inférieure.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le résidu d'acide aminé ayant une valeur Pa inférieure est choisi parmi Pro, Gly et Asn.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un résidu d'acide aminé ayant une valeur Pss inférieure.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le résidu d'acide aminé ayant une valeur Pss inférieure est choisi parmi Pro, Gly et Asp.

16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que ledit polypeptide original est une molécule de parathormone (PTH) telle que représentée par la séquence Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu

Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-

Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe.

17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit analogue de polypeptide est l'un des analogues de la PTH représentés par les séquences Ser-Val-Ser-Glu

Ile-Gln-Leu-Leu-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Ara-Asn-Ser-Leu-

Ara-Arg-Val-Ara-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Val-His- Asn-Tyr-HSL, Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Asn-Ser-

Gly-Lys-His-Asn-Asn-Ser-Arg-Ser-Arg-Trp-Ser-Arg-

Lys-Lys-Ser-Lys-Asp-Val-His-Asn-Ser-HSL et Ser-Val-Ser-Glu

Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-

Glu-Arg-Pro-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Pro-Gln-Asp-Val-His-

Asn-Phe.

18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que ledit polypeptide original est un hirulogue tel que représenté par la séquence (D-Cha)-Ala-Arg-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Phe-Glu

Glu-Ile-Ala-Glu-Glu-Tyr-Leu.

19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que ledit analogue de polypeptide est l'hirulogue-B2 tel que représenté par la séquence (D-Cha)-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly

Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu.

20. Analogue de la parathormone (PTH), caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés Ser-Val-Ser

Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Arg-Asn-Ser-

Leu-Arg-Arg-Val-Ara-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Lys-Asp-Val-

His-Asn-Tyr-HSL, Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu-His-Asn-

Ser-Gly-Lys-His-Arg-Asn-Ser-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Trp-Ser-

Arg-Lys-Lys-Ser-Lys-Asp-Val-His-Asn-Ser-HSL ou Ser-Val-Ser

Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser Met-Glu-Arg-Pro-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Pro-Gln-Asp-Val-

His-Asn-Phe.