NL1003284C2 - Werkwijze voor het vergroten van de elektrotransport-flux van polypeptiden. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het vergroten van de elektrotransoort-flux van polv-peptiden

De uitvinding heeft in het algemeen betrekking op de elektro-5 transport-afgifte van geneesmiddelen. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het vergroten van de elek-trotransport-flux van een polypeptide, doordat het vermogen van het polypeptide om a-helix- of fi-plaat-segmenten te vormen wordt verminderd. Tevens heeft de uitvinding betrekking op aldus gemodificeerde 10 moleculen.

De transdermale afgifte (d.w.z. door de huid) van therapeutische middelen verschaft een gemakkelijke, eenvoudige en niet-invasieve techniek voor het toedienen van geneesmiddelen. Bijvoorbeeld worden variabele absorptiesnelheden en het (b.v. hepatische) metabolisme, dat 15 men tegenkomt bij de orale behandeling, vermeden en worden andere ongemakken — b.v. irritatie van het maagdarmkanaal en dergelijke — geëlimineerd. De transdermale afgifte maakt tevens een grote mate van controle over bloedconcentraties van een bepaald geneesmiddel mogelijk en is een bijzonder aantrekkelijke toedieningsroute voor geneesmidde-20 len met smalle therapeutische indices, korte halveringstijden en een krachtige werking.

De transdermale afgifte kan ofwel passief ofwel actief zijn. Veel geneesmiddelen zijn, vanwege hun grootte, ionogene ladingseigenschap-pen en hydrofobiciteit, niet geschikt voor passieve transdermale ge- 25 neesmiddel-afgifte. Een werkwijze die deze beperking overwint is de toepassing van kleine hoeveelheden elektrische stroom voor het actief transporteren van geneesmiddelen in het lichaam door de intacte huid. Deze techniek staat bekend als "elektrotransport" of "iontoforetische" geneesmiddel-afgifte. De techniek verschaft een beter regelbaar proces 30 dan de passieve transdermale geneesmiddel-afgifte, daar de amplitude, de tijdsturing en de polariteit van de toegevoerde elektrische stroom gemakkelijk kan worden geregeld met behulp van standaard elektrische componenten. In dit opzicht kan de elektrotransport-geneesmiddelflux 30% tot verscheidene ordes van grootte groter zijn dan de passieve 35 transdermale flux van hetzelfde geneesmiddel.

Bij elektrotransport-inrichtingen worden in het algemeen ten minste twee elektroden gebruikt. Beide elektroden staan in innig contact met enig gedeelte van de huid van het lichaam. Een elektrode, de 1003284 2 actieve of donorelektrode genoemd, is de elektrode waaruit het therapeutische middel wordt afgegeven aan het lichaam. De andere elektrode, de tegen- of terugvoerelektrode genoemd, dient voor het sluiten van het elektrische circuit door het lichaam. Samen met de huid van de 5 patiënt wordt het circuit voltooid door de elektroden met een bron van elektrische energie, b.v. een batterij, en gewoonlijk met een schakeling die in staat is tot het regelen van de stroom die door de inrichting passeert, te verbinden.

Afhankelijk van de elektrische lading van de transdermaal af te 10 geven stof kan ofwel de anode ofwel de kathode de actieve of donorelektrode zijn. In dit opzicht zal, als de in het lichaam af te geven ionogene stof positief geladen is, de positieve elektrode (de anode) de actieve elektrode zijn en dient de negatieve elektrode (de kathode) als tegenelektrode, die het circuit voltooid. Als de af te geven iono-15 gene stof anderzijds negatief geladen is, zal de kathode de actieve elektrode zijn en zal de anode de tegenelektrode zijn. Daarnaast kunnen zowel de anode als de kathode worden gebruikt voor het afgeven van geneesmiddelen met de juiste lading aan het lichaam. In een dergelijk geval worden beide elektroden als actieve of donorelektroden be-20 schouwd. Dat wil zeggen dat de anode positief geladen middelen aan het lichaam kan afgeven, terwijl de kathode negatief geladen middelen aan het lichaam kan afgeven.

Bestaande elektrotransport-inrichtingen vereisen bovendien een reservoir of bron van het aan het lichaam af te geven therapeutische 25 middel. Dergelijke geneesmiddel-reservoirs worden verbonden met de anode of de kathode van de elektrotransport-inrichting en verschaffen een vaste of vernieuwbare bron van een of meer gewenste species of middelen. Voorbeelden van dergelijke reservoirs en bronnen omvatten een zakje, zoals beschreven in het U.S. octrooischrift 4.250.878 van 30 Jacobsen; een voorgevormd gellichaam, zoals beschreven in het U.S. octrooischrift 4.382.529 van Webster; en een houder van glas of kunststof, die een vloeibare oplossing van het geneesmiddel bevat, zoals beschreven in de figuren van het U.S. octrooischrift 4.722.726 van Sanderson et al. ,

35 Van bijzonder belang hierbij is de transdermale afgifte van pep- I

tiden, polypeptiden en eiwitten, vanwege de problemen die men tegenkomt bij de meer gebruikelijke geneesmiddel-toedieningsroutes zoals orale afgifte. Polypeptide- en eiwit-moleculen zijn uitermate gevoelig 1003284 3 voor afbraak door proteolytische enzymen in het maagdarmkanaal en zijn onderhevig aan een uitgebreid levermetabolisme als ze oraal worden ingenomen. Polypeptiden en eiwitten vereisen gewoonlijk een parente-rale toediening teneinde therapeutische spiegels in het bloed van de 5 patiënt te verkrijgen. De meest gebruikelijke parenterale toedienings-technieken zijn hypodermale injecties en intraveneuze toediening. Polypeptiden en eiwitten zijn echter inherent kortwerkend qua biologische activiteit en vereisen frequente injecties, vaak verscheidene malen per dag, om de vereiste, therapeutisch werkzame spiegels in 10 stand te houden. Patiënten vinden dit behandelingsregime vaak ongemakkelijk, pijnlijk en met een bijkomend risico van b.v. infecties.

Er is veel onderzoek gedaan naar andere routes (anders dan parenterale injecties) voor de effectieve toediening van farmaceutische polypeptiden en eiwitten. Toedieningsroutes met minder bijwerkingen 15 alsook met een betere verdraagbaarheid voor de patiënt zijn van bijzonder belang. Dergelijke alternatieve routes omvatten in het algemeen de "afgeschermde" orale toediening, waarbij het polypeptide/eiwit wordt af gegeven uit een capsule of een andere houder nadat deze het maag-milieu met een lage pH is gepasseerd, afgifte door het slijm-20 vliesweefsel, b.v. het slijmvliesweefsel van de longen met inhalers of de slijmvliesweefsels van de neus met neussprays, en implanteerbare pompjes. Ongelukkigerwijs hebben deze alternatieve routes voor de afgifte van polypeptiden/eiwitten tot nu toe slechts een beperkt succes gehad.

25 De elektrotransport-afgifte van polypeptiden en eiwitten stuit ook op technische problemen. Water is, vanwege de uitstekende biologische verdraagbaarheid daarvan, bijvoorbeeld het vloeibare oplosmiddel dat de voorkeur heeft voor het vormen van de oplossing van het geneesmiddel dat wordt afgegeven via elektrotransport. De huid bevat proteo-30 lytische enzymen, die het polypeptide/eiwit kunnen afbreken als dit transdermaal wordt afgegeven. Daarnaast kunnen bepaalde polypeptiden/eiwitten, in het bijzonder die, welke niet eigen zijn aan het te behandelen dier, huidreacties, b.v. overgevoeligheid of irritatie, veroorzaken.

35 Een aantal onderzoekers heeft de elektrotransport-afgifte van polypeptiden en eiwitten beschreven. Een vroeg onderzoek van R. Burnette et al., J. Phar. Sci., (1986) 25:738, omvatte de in vitro huid-permeatie van een thyrotropine afgevend hormoon, een kleine tripepti- 1003284 4 de-molecule. Er werd gevonden dat de elektrotransport-flux groter was dan de passieve diffusie-flux. Chien et al., J. Pharm. Sci., (1988) 28:376, hebben in zowel in vitro als in vivo onderzoeken aangetoond, dat de transdermale afgifte van vasopressine en insuline via elektro-5 transport mogelijk was. Zie tevens Haulding et al., U.S. Statutory Invention Registration nr. H1160, waarin de elektrotransport-afgifte van calcitonine in dwergvarkens wordt beschreven.

Er is een aantal benaderingen (anders dan het gewoonweg verhogen van het niveau van de toegevoerde elektrotransport-stroom) toegepast 10 om de transdermale elektrotransport-flux van polypeptide- en eiwit-geneesmiddelen te vergroten. Een benadering is de toepassing van flux-versterkers, zoals ionogene oppervlakte-actieve stoffen. Zie b.v. Sanderson et al., U.S. octrooischrift *4.722.726. Een andere benadering betreft het gebruik van hulp-oplosmiddelen, einders dan alleen water, 15 om de elektrotransport-flux te vergroten. Zie b.v. de Europese octrooiaanvrage 0.278.^73· Nog een andere benadering is het mecheinisch verstoren van de buitenste laag (d.w.z. het stratum corneum) van de huid vóór de elektrotransport-afgifte daardoor. Zie b.v. Lee et al., U.S. octrooischrift 5*250.023· 20 Verdere benaderingen voor het vergroten van de transdermale elek trotransport-flux van geneesmiddelen omvatten het vormen van een ge-neesmiddelvoorloper of een analoog van het geneesmiddel dat van belang is en het elektrotransporteren van de geneesmiddelvoorloper of het gemodificeerde analoog. In WO 92/12999 wordt bijvoorbeeld de afgifte van 25 insuline als insuline-analoog met een verminderde neiging tot zelf-associatie (schijnbaar geassocieerde vormen vein insuline die aanwezig zijn in gebruikelijke farmaceutische samenstellingen verminderen de transdermale afgifte van insuline) beschreven. De analogen worden gevormd door het substitueren van asparaginezuur (Asp) of glutamine-30 zuur (Glu) voor andere aminozuurresten op geselecteerde plaatsen langs de insuline-polypeptideketen. In WO 93/25197 wordt de afgifte beschreven van zowel peptide- als niet-peptide-geneesmiddelen als modificeer-complexen of geneesmiddelvoorlopers voor farmaceutische middelen, waarbij een chemisch modificeermiddel (b.v. een geladen groep) cova-35 lent wordt gebonden aan het oorspronkelijke farmaceutische middel. De covalente binding wordt verbroken nadat het middel wordt afgegeven in het lichaam, waarbij het oorspronkelijke middel wordt afgegeven.

Ondanks de bovenstaande benaderingen vertonen enkele polypeptiden 1003284 5 nog steeds een slechte transdermale elektrotransport-flux. Het is bekend dat in het bijzonder de hydrofobiciteit van het peptide de in vitro elektrotransport-flux negatief behandeld. Er zijn verschillende parameters die bijdragen aan de hydrofobiciteit, zoals de primaire 5 structuur van een eiwit, d.w.z. de aminozuursequentie van de molecule, alsook de secundaire structuur van het eiwit, namelijk de regelmatige, zich herhalende rangschikking van de polypeptide-keten langs drie dimensies. Een dergelijke conformatie kan de vorm hebben van helix-structuren, zoals een a-helix, of een meer gestrekte zigzag-confor-10 matie, bekend als de β-conformatie.

De a-helix heeft ongeveer 3.6 aminozuurresten per winding van de helix. De R-groepen van de aminozuren strekken zich uit vanaf de helix en er worden binnen de keten waterstofbindingen gevormd tussen de carbonyl-zuurstof van het skelet van elke groep en het waterstofatoom 15 vein het skelet dat is bevestigd aan de elektronegatieve stikstof van de vierde rest langs de keten. De basiseenheid van de β-conformatie is de β-streng, die bestaat als een nauw opgewonden helix, met 2,0 aminozuurresten per winding. De β-streng-conformatie is alleen stabiel als deze is opgenomen in een β-plaat, waar waters tof bindingen met een 20 vrijwel optimale geometrie worden gevormd tussen de peptide-groepen vein naburige β-strengen; de dipoolmomenten van de strengen worden eveneens gunstig in dezelfde richting gericht. Zijketens van naburige groepen van dezelfde streng steken uit vanaf de tegenoverliggende kant van de plaat en gaan geen interactie met elkaar aan, maar hebben sig-25 nificante interacties met hun skelet en met de zijketens van naburige strengen. Voor een algemene beschrijving van α-helices en β-platen zie b.v. T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); en A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 1975)· 30 Gewoonlijk worden de Zimm-Bragg-parameters, s en a (B.H. Zimm en J.K. Bragg, J. Chem. Phys. (1959) 31:526-535). en de Lifson-Roig-ver-gelijkingen (S. Lifson en A. Roig, J. Chem. Phys. (1961) 3*1:1963-197*1) gebruikt om de stabiliteit van een helix-segment in een gegeven polypeptide te bepalen. S is de stabiliteitsconstante van de helix-winding 35 en σ is de nucleëringsfactor. Op basis van deze parameters kan, met behulp van verschillende berekeningen en computerprogramma's, de waarschijnlijkheid worden voorspeld dat bepaalde gebieden van de polypep-tide-moleculen α-helices en β-platen vormen. Zie b.v. Finkelstein, 1003284 * 6 A.V., Program "ALB" for protein and polypeptide secondary structure calculation and prediction (1983)· Gedeponeerd bij de Brookhaven Protein Data Bank, Upton, N.Y. en bij het EMBL, Heidelberg, Duitsland; Finkelstein, A.V., Biopolymers (1977) ΐ£:525_529; Finkelstein et al., 5 Proteins: Structure, Function and Genetics (1991) 1β:2δ7-299· Verder zijn Chou-Fasman-waarschijnlijkheden (Chou, P.Y. en Pasman, G.D., Ann. Rev. Biochem. (1978) *17:251-276) toegepast, om de neiging van een bepaald aminozuur te bepalen om een voorkeur of een afkeer te hebben van de vorming van een a-helix en een β-plaat.

10 Deze principes zijn echter niet eerder toegepast voor het veran deren van de hydrofobe eigenschappen van een gegeven polypeptide, teneinde de elektrotransport-flux daarvan te vergroten.

Volgens de onderhavige uitvinding wordt de elektrotransport-flux van een gegeven polypeptide vergroot door de secondaire structuur 15 daarvan te verstoren. In het bijzonder kunnen aminozuurresten, waarvan bekend is dat deze de α-helix- en de β-plaat-segmenten stabiliseren, worden vervangen door destabiliserende groepen en bekende middelen die de helix verbreken. OP deze wijze kan de flux van het polypeptide door een lichaamsoppervlak (b.v. de huid) worden vergroot, waardoor de 20 elektrotransport-afgifte van een grotere reeks van polypeptide-genees-middelen in therapeutisch effectieve snelheden mogelijk is.

Dienovereenkomstig heeft de uitvinding, in een uitvoeringsvorm, betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een analoog van een oorspronkelijk polypeptide met een α-helix- en/of een β-plaat-segment, 25 waarbij het analoog een beter of toegenomen elektrotransport-vermogen door een lichaamsoppervlak vertoont, waarbij de werkwijze het substitueren van een of meer aminozuurresten van het oorspronkelijke polypeptide in het polypeptide-analoog omvat, teneinde een of meer a-he-lix-en/of β-plaat-segmenten van het oorspronkelijke polypeptide te 30 verstoren met dien verstande dat het polypeptide-analoog niet de ami-nozuursequentie heeft die is aangegeven in figuur 1B. Het polypeptide-analoog vertoont, vergeleken met het oorspronkelijke peptide, een toegenomen elektrotransport.

In een verdere uitvoeringsvorm heeft de uitvinding betrekking op 35 een werkwijze voor het af geven van een polypeptide-middel door een lichaamsoppervlak. De werkwijze omvat (a) het verschaffen van een analoog van een oorspronkelijk polypeptide, waarbij het oorspronkelijke polypeptide een α-helix- en/of een β-plaat-segment omvat, waarbij 1003284 7 het polypeptide-analoog een of meer aminozuurresten bevat, die ten opzichte van het oorspronkelijke polypeptide zijn gesubstitueerd; en (b) het door middel van elektrotransport afgeven van het polypeptide-analoog door het lichaamsoppervlak.

5 In uitvoeringsvormen die een bijzondere voorkeur hebben wordt het verstoren gedaan door het vervangen van een of meer aminozuurresten van het oorspronkelijke polypeptide door een of meer aminozuurresten met een lagere Pa- of PB-waarde dan de oorspronkelijke aminozuurrest.

In nog een andere uitvoeringsvorm heeft de uitvinding betrekking 10 op een analoog van het parathyroïde-hormoon (PTH), dat de aminozuur-sequentie heeft die is aangegeven in figuur 1C.

Deze en andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding zullen, in het kader van deze beschrijving, duidelijk zijn voor deskundigen .

15 Figuur 1 toont de aminozuursequentie van verscheidene para- thyroïde-hormoon-moleculen ("PTH"), die worden gebruikt voor het toelichten van de uitvinding. Figuur IA toont de aminozuursequentie van het wild-type, oorspronkelijke PTH-polypeptide. Figuur 1B toont de aminozuursequentie van PTH-analoog 1 (1-35)· Figuur 1C toont de amino-20 zuursequentie van PTH-analoog 2 (1-35). HSL geeft homoserine/homo- serinelacton aan. De onderstreepte groepen in de figuren 1B en 1C geven de substitutieplaatsen aan.

Figuur 2 toont de aminozuursequenties van verschillende, van hirudine afgeleide polypeptiden, die worden gebruikt voor het toelich-25 ten van de uitvinding. Figuur 2A toont de aminozuursequentie vein een hiruloog oorspronkelijk polypeptide. Figuur 2B toont de aminozuursequentie van hiruloog-1. Figuur 2C toont de sequentie van hiruloog-B 2.

Figuur 3 is een schematisch aanzicht van een elektrotransport-30 geneesmiddel-afgifte-inrichting, die kan worden toegepast bij de onderhavige uitvinding.

Figuur k is een grafiek van de gemiddelde ellipticiteit van een groep van verscheidene parathyroïde-hormoon-analogen versus de tri-fluorethanol-concentratie.

35 Figuur 5 is een grafiek van de gemiddelde ellipticiteit van een groep van twee met hirudine gederivatiseerde polypeptiden versus de trifluorethanol-concentratie.

1003284 8

Bij de uitvoering van de onderhavige uitvinding worden, tenzij anders aangegeven, de gebruikelijke werkwijzen van de eiwit-chemie, elektrochemie, moleculaire biologie en recombinant-DNA-technieken uit de stand der techniek toegepast. Dergelijke technieken worden volledig 5 in de literatuur toegelicht. Zie b.v. T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 1975); J-S. Newman, Electrochemical Systems (Prentice Hall, 1973); A.J. Bard en L.R. Faulkner, Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications (John 10 Wiley & Sons, 1980); Sambrook et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)·

Er dient te worden opgemerkt dat, zoals gebruikt in deze beschrijving en de bijgevoegde conclusies, de enkelvoudsvormen "een" en "de" meervoudsvormen omvatten, tenzij duidelijk anders blijkt uit de 15 inhoud. Aldus omvat de verwijzing naar bijvoorbeeld "een polypeptide" een mengsel van twee of meer polypeptiden en dergelijke.

Bij de beschrijving van de onderhavige uitvinding worden de volgende uitdrukkingen gebruikt, en deze worden gedefinieerd zoals hierna wordt weergegeven.

20 Hierin worden de uitdrukkingen "elektrotransport", "iontoforese" en "iontoforetisch" gebruikt om te verwijzen naar de afgifte van een of meer farmaceutisch werkzame polypeptide-middelen door een lichaamsoppervlak (b.v. de huid), door middel van een elektromotorische kracht die wordt uitgeoefend op het reservoir dat het middel bevat. Het mid-25 del kan worden afgegeven door middel van elektromigratie, elektropora-tie, elektro-osmose of elke combinatie daarvan. Elektro-osmose is ook aangeduid als elektrohydrokinese, elektro-convectie en elektrisch geïnduceerde osmose. In het algemeen is de elektro-osmose van een species in een weefsel het gevolg van de migratie van een oplosmiddel 30 waarin de species aanwezig is, als gevolg van het uitoefenen van een elektromotorische kracht op het reservoir van de therapeutische species, d.w.z. een oplosmiddelstroming die wordt geïnduceerd door de elektromigratie van andere ionogene species. Tijdens het elektrotrans-port-proces kunnen bepaalde modificaties of veranderingen van de huid 35 optreden, zoals de vorming van tijdelijk bestaande poriën in de huid, ook aangeduid als "elektroporatie". Elk elektrisch ondersteund transport van species, versterkt door modificaties of veranderingen aan het lichaamsoppervlak (b.v. de vorming van poriën in de huid), wordt ook 1003284 9 omvat door de uitdrukking "elektrotransport", zoals deze hierin wordt gebruikt. Dus zoals hierin gebruikt hebben de uitdrukkingen "elektrotransport", "iontoforese" en "iontoforetisch" betrekking op (1) de afgifte van geladen middelen door middel van elektromigratie, (2) de 5 afgifte van ongeladen middelen volgens het proces van de elektro-os-mose, (3) de afgifte van geladen of ongeladen middelen door middel van elektroporatie, (4) de afgifte van geladen middelen volgens de gecombineerde processen van elektromigratie en elektro-osmose en/of 95) de afgifte van een mengsel van geladen en ongeladen middelen volgens de 10 gecombineerde processen van elektromigratie en elektro-osmose.

De uitdrukkingen "polypeptide", "polypeptide-middel" en "poly-peptide-geneesmiddel" worden hierin onderling uitwisselbaar toegepast en geven elk biologisch actief polymeer met aminozuurresten aan. De uitdrukkingen omvatten peptiden, oligopeptiden, dimeren, multimeren en 15 dergelijke. Dergelijke polypeptiden kunnen worden verkregen uit natuurlijke bronnen of kunnen worden gesynthetiseerd of door recombina-tie worden geproduceerd. De uitdrukkingen omvatten tevens post-expres-sie-modificaties van het polypeptide, zoals bijvoorbeeld glycosy-lering, acetylering, fosforylering, enz.

20 Een polypeptide, zoals hierin gedefinieerd, bestaat in het alge meen uit de 20 natuurlijke aminozuren Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gin (Q), Glu (E), Gly (G), His (H), He (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W). Tyr (Y) en Val (V) en kan tevens elk van de bekende aminozuur-analogen, zowel 25 van nature voorkomende als synthetische analogen, omvatten, zoals, maar niet beperkt tot, homoisoleucine, asaleucine, 2-(methyleencyclo-propyl)glycine, S-methylcysteïne, S-(l-propenyl)cysteïne, homoserine, ornithine, norleucine, norvaline, homoarginine, 3-(3~carboxyfenyl)alanine, cyclohexylalanine, mimosine, pipecolinezuur, 4-methylglutamine-30 zuur, canavanine, 2,3~diaminopropionzuur en dergelijke. Verdere voorbeelden van polypeptide-middelen, die worden toegepast in de onderhavige uitvinding, worden hieronder weergegeven.

Met "oorspronkelijk" polypeptide, polypeptide-middel of poly-peptide-geneesmiddel bedoelt men een polypeptide zoals hierboven gede-35 finieerd, dat een α-helix- of β-plaat-segment omvat, dat zodanig kan worden gemodificeerd, dat de elektrotransport-flux van het polypeptide wordt vergroot. In het bijzonder omvat een oorspronkelijk polypeptide in het algemeen ongeveer 10 tot ongeveer 50 aminozuurresten, met meer 1003284 10 voorkeur ongeveer 10 tot ongeveer 40 aminozuurresten. Verder is het oorspronkelijke polypeptide een polypeptide dat niet de neiging heeft om in een oplossing een stabiele tertiaire opgevouwen structuur aan te nemen, b.v. als gevolg van een grote concentratie aan Cys-groepen. Het 5 oorspronkelijke polypeptide kan een van nature voorkomend polypeptide zijn, of het kan zelf structuurverschillen ten opzichte van een van nature voorkomend polypeptide hebben, zoals substituties, deleties of addities van aminozuren alsook post-translatie-modificaties, zoals hierboven beschreven.

10 Met polypeptide-"analoog" bedoelt men een polypeptide zoals hier boven gedefinieerd, dat het resultaat is van de modificatie van de secundaire structuur van het oorspronkelijke polypeptide. In dit opzicht verschilt het analoog van het oorspronkelijke polypeptide door middel van een zodanige substitutie van een of meer aminozuurresten, 15 dat een of meer a-helix- en/of β-helix-segmenten, die aanwezig zijn in de oorspronkelijke molecule, worden verstoord. Geschikte aminozuur-substituties worden hieronder uitgebreider besproken. Het analoog kan ook extra modificaties bevatten die de secundaire structuur niet beïnvloeden, zoals extra substituties, deleties of addities van amino-20 zuren, of post-translatie-modificaties, zoals hierboven beschreven. Het analoog kan ook in neutrale vorm of in zout-vorm bestaan, b.v. zuur-additiezouten (gevormd met de vrije aminogroepen van de polypep-tide-analogen), die worden gevormd met anorganische zuren, zoals bijvoorbeeld zoutzuur of fosforzuur, of organische zuren, zoals azijn-25 zuur, barnsteenzuur, maleïnezuur, wijnsteenzuur, amandelzuur en dergelijke. Zouten die worden gevormd uit vrije carboxylgroepen kunnen ook zijn verkregen van anorganische basen, zoals bijvoorbeeld natrium-, kalium-, ammonium-, calcium- of ijzerhydroxide, en organische basen zoals isopropylamine, trimethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine 30 en dergelijke. Het polypeptide-analoog bezit ten minste enige biologische activiteit van het oorspronkelijke polypeptide en heeft bij voorkeur dezelfde of een grotere biologische activiteit dan de oorspronkelijke molecule.

Met "vergroten van het elektrotransport" van een polypeptide 35 bedoelt men het vergroten van de elektrotransport-flux van het polypeptide door het lichaamsoppervlak (b.v. de huid of slijmvliezen), vergeleken met het oorspronkelijke polypeptide. De transdermale elektrotransport-flux kan met behulp van een aantal, uit de stand der 1003284 11 techniek bekende, in vivo of in vitro werkwijzen worden bepaald. In vitro werkwijzen omvatten het tussen de donor- en receptor-comparti-menten van een elektrotransport-flux-cel klemmen van een stuk huid van een geschikt dier (b.v. huid van een menselijk lijk), met de stratum 5 corneum-kant van het stuk huid in de richting van het donor-comparti-ment. Een vloeibare oplossing of gel, die het af te geven geneesmiddel bevat, wordt in contact geplaatst met het stratum corneum en er wordt een elektrische stroom toegevoerd aan de elektroden, een elektrode in elk compartiment. De transdermale flux wordt berekend door het bepalen 10 van de hoeveelheid geneesmiddel in het receptor-compartiment. Twee succesvolle modellen, die zijn gebruikt voor het optimaliseren van de transdermale elektrotransport-geneesmiddel-afgifte, zijn het geïsoleerde varkenshuidflap-model van Riviere, M.C. Heit et al., J. Pharm. Sci., 82, 240-243 (1993) en de toepassing van bijvoorbeeld geïsoleerde 15 haarloze huid van haarloze knaagdieren of proefkonijnen. Zie B.W. Hadzija et al., J. Pharm. Pharmacol., 44, 3Ö7“390 (1992).

De uitvinding heeft betrekking op de substitutie vein aminozuren die de a-helix- en |J-plaat-segmenten van een polypeptide-molecule verstoren, teneinde de elektrotransport-flux van de molecule, verge-20 leken met de flux van het oorspronkelijke polypeptide, te vergroten. De werkwijze maakt derhalve het elektrotransport van een groot aantal stoffen mogelijk, die anders niet geschikt zijn voor een dergelijke afgifte. Zonder dat een bepaalde theorie wordt vastgehouden, schijnt het dat dergelijke secundaire veranderingen de neiging van de hydro-25 fobe zijketens van aminozuurresten zoals Leu, Phe en Trp om ruimtelijk verstrikt te raken verlagen. Aldus wordt het vermogen van de molecule om aan hydrofobe gebieden in de huid te binden tijdens het elektrotransport verlaagd, waardoor de doorgang van het polypeptide door de huid wordt vereenvoudigd.

30 De onderhavige uitvinding wordt toegelicht met behulp van een parathyroïde-hormoon-molecule (PTH) en een hirudine-derivaat als oorspronkelijke verbindingen. PTH is een peptide-hormoon dat de homeosta-tische controle van het calcium- en fosfaat-metabolisme reguleert en wordt gebruikt voor het behandelen van osteoporose. Wild-type PTH 35 wordt getoond in figuur IA. De molecule bevat 34 aminozuurresten en heeft een molecuulgewicht van ongeveer 4000 dalton. Zoal hierin wordt getoond bezit de molecule een zeer grote neiging tot het aannemen van de a-helix-vorm.

1003284 12

Hiruloog is een op hirudine gebaseerd synthetisch peptide-anti-coagulans, dat effectief zowel vrij als aan fibrine gebonden trombine remt. Er is aangetoond dat hiruloog de veneuze trombose na een operatie, bij patiënten die een orthopedische operatie ondergaan, remt. De 5 sequentie van de oorspronkelijke hiruloog-verbinding, die wordt gebruikt voor het toelichten van de onderhavige uitvinding, wordt getoond in figuur 2A.

Hoewel de uitvinding wordt toegelicht met behulp van de hierboven beschreven oorspronkelijke verbindingen, kan de uitvinding ook worden 10 toegepast met een grote verscheidenheid aan andere oorspronkelijke eiwitten en polypeptide-middelen, zoals andere polypeptiden die zijn verkregen uit eukaryote, prokaryote en virale bronnen, alsook synthetische peptiden. Dergelijke polypeptiden bevatten in het algemeen ongeveer 10 tot ongeveer 50 aminozuren, hebben een secundaire struc-15 tuur die geschikt is voor manipulatie en hebben niet de neiging om een stabiele tertiaire opgevouwen structuur aan te nemen, b.v. als gevolg van een hoge concentratie van Cys-groepen. Dergelijke polypeptiden omvatten, zonder beperking, peptide-geneesmiddelen, die antibiotica en antivirale middelen zijn, antineoplastica, immunodulatoren, peptide-20 hormonen zoals ACTH, CRF, GHRH, cholecystokinine, dynorfinen, endor-finen, endotheline, fibronectine-fragmenten, galanine, gastrine, insu-linotropine, glucagon, GTP-bindende eiwitfragmenten, guanyline, de leukokininen, magaïnine, mastoparanen, dermaseptine, systemine, neuro-medinen, neurotensine, pancreastatine, pancreatisch polypeptide, stof 25 P, secretine, thymosine en dergelijke.

De secundaire structuur van het oorspronkelijke polypeptide wordt in het algemeen gemanipuleerd door een of meer uitgekozen oorspronkelijke aminozuurresten te vervangen door een of meer aminozuurresten met een lagere neiging tot het vormen van a-helix- en/of β-plaat-con-30 formaties. In dit opzicht demonstreert elke aminozuurrest conformatie-voorkeuren. Een maat voor de relatieve neiging van een bepaalde groep om betrokken te raken bij een a-helix of een β-streng wordt gedefinieerd door de parameters Pa en Ρβ (Chou, P.Y. en Pasman, G.D., Ann. Rev. Biochem. (1978) 4Z: 251*276). Een bijgewerkte en herziene lijst 35 met Pa- en Ρβ-waarden wordt weergegeven in tabel A. De Pa-waarden in tabel A die groter zijn dan 1,00 vertegenwoordigen aminozuren die de voorkeur hebben voor α-helix-conformaties en worden hierin gedefinieerd als "hoge Pa-waarden". Op overeenkomstige wijze vertegenwoor- 1003284 13 digen de Ρβ-waarden in tabel A die groter zijn dan 1,00 aminozuren die de voorkeur hebben voor de vorming van een β-streng en worden deze hierin gedefinieerd als "hoge Ρβ-waarden". De aminozuren met Pa- en Ρβ-waarden van 1,00 of minder hebben een afkeer van secundaire confor-5 maties of breken deze af en worden hierin respectievelijk gedefinieerd als "lage Ρα-waarden" en "lage Ρβ-waarden".

De aminozuren Glu, Ala en Leu hebben bijvoorbeeld een hoge Pa-waarde en hebben dus een voorkeur voor de vorming van een helix, terwijl Pro, Gly, Ser, Cys, Tyr en Asn een lage Pa-waarde hebben en der-10 halve een afkeer hebben van de vorming van een helix. Op overeenkomstige wijze hebben de aminozuurresten Val, Ile en Tyr een hoge Ρβ-waarde en dus een voorkeur voor de vorming van een β-streng, terwijl de aminozuren Pro, Asp, Asn, Glu en Gly een afkeer hebben van een dergelijke vorming. Als men deze Pa- en Ρβ-waarden combineert, zouden 15 de aminozuren met de laagste neiging tot het vormen van dit soort secundaire structuren Gly, Asn, Pro en Ser moeten zijn.

t 1003284 m

Tabel A*

Conformatie-voorkeuren van de aminozuren Aminozuur- α-helix (J-streng groep_ (Pb)_ lEfD_ 5

Glu 1,59 0,52

Ala Ml 0,72

Leu 1,3^ 1.22

Met 1,30 1,14 10 Gin 1,27 0,98

Lys 1,23 0,69

Arg 1,21 0,84

His 1,05 0,80 15 Val 0,90 1,87

He 1,09 I.67

Tyr 0.74 1.45

Cys 0,66 1,40

Trp 1,02 1.35 20 Phe 1,16 1,33

Thr 0,76 1,17

Gly Ο.43 0.58

Asn 0,76 0,48

25 Pro 0,34 O.3I

Ser 0,57 0,96

Asp 0,99 0,39 30 * De gegevens in tabel A komen uit T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993). biz. 256.

Een segment met een bepaalde secundaire structuur is veel waarschijnlijker als verscheidene naburige aminozuren de voorkeur hebben 35 voor die structuur. Een α-helix kan dus worden voorspeld als vier van de zes naburige aminozuren een voorkeur hebben voor een helix en als de gemiddelde Ρα-waarde groter is dan 1,05 en groter dan Ρβ. Op overeenkomstige wijze wordt een β-streng voorspeld als drie van de vijf 1003284 15 naburige aminozuren een voorkeur hebben voor een plaat en als de gemiddelde waarde van Ρβ groter is dan 1,04 en groter dan Ρσ. T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993). biz. 255*257· 5 Met behulp van deze principes kunnen aminozuurresten in delen van de molecule, die de voorkeur hebben tot het vormen van een a-helix en een β-plaat, dus worden vervangen door die aminozuren uit tabel A, die een afkeer hebben van dergelijke conformaties. Bij voorkeur wordt een aminozuur met een hoge Pa- of Ρβ-waarde vervangen door een aminozuur 10 met respectievelijk een lage Pa- of Ρβ-waarde.

Er zijn ook andere werkwijzen bekend om de neiging van een polypeptide tot het vormen van a-helix- en fi-plaat-segmenten te bepalen. Bijvoorbeeld kan de α-helix-potentiaal van een lineair polypeptide worden bepaald met behulp van b.v. de Lifson-Roig-vergelijkingen (S. 15 Lifson en A. Roig, J. Chem. Phys. (1961) 34:1963*1974)· oet behulp van waarden voor de helix-vormingsparameters van de groepen, die zijn omgezet uit de daarvoor berekende Zimm-Bragg-waarden (Zimm, B.H. en Bragg, J.K., J. Chem Phys. (1959) 31:526-535). met behulp van de con-versie-vergelijkingen van Qian en Schellman (Qian, H. en Schellman» 20 J.A., J. Chem. Phys. (1992) 26:3987*3994).

Meer in het bijzonder vertegenwoordigen de Zimm-Bragg-parameters, s en o, respectievelijk de stabiliteitsconstante vein de helix-spoel en de nucleëringsfactor. Voor elke aminozuurrest is een paar Zimm-Bragg-s- en -onwaarden gedefinieerd (zie tabel 1 vam Finkelstein et al.» 25 Proteins: Structure, Function and Genetics (1991) 12:287-299) en de waarschijnlijkheid dat de hele polypeptide-keten (of een gedefinieerde sub-sequentie daarvan) een α-helix vormt kan worden berekend met behulp van de vermelde vergelijkingen.

De overeenkomende Lifson-Roig-helixparameters, u, v en w, kunnen 30 ook worden gebruikt voor het uitvoeren van een overeenkomstige bepaling (Lifson, S en Roig, A.J., J. Chem. Phys. (1961) 34:1963*1974). In dit opzicht kan w, die wordt gebruikt voor het definiëren van een peptide-eenheid in het inwendige van een ononderbroken sequentie van helix-toestanden, worden berekend uit s. V van Lifson-Roig definieert 35 een peptide-eenheid aan het begin of aan het einde van een ononderbroken sequentie van helix-toestanden en kan worden berekend uit de Zimm-Bragg-parameter o1/2. De factor u definieert het statische gewicht van het spoel-gebied en komt niet overeen met een Zimm-Bragg-parameter.

1003284 16

Met behulp van deze parameters worden in het algemeen twee berekeningen uitgevoerd om de α-helix-potentiaal te bepalen. De eerste neemt aan dat de Lifson-Roig-helix-initiatie-parameter v een constante van 0,039 is (d.w.z. dat de Zimm-Bragg-o-parameter voor alle groepen 5 0,0013 is), waarbij de parameter w voor elk aminozuur wordt berekend uit de Zimm-Bragg-s-waarde, die wordt gegeven in tabel 1 van Finkel-stein et al.. Proteins: Structure, Function and Genetics (1991) 10:287-299· De tweede berekening gaat niet uit van de aanname dat alle groepen dezelfde waarde van de helix-initiatie-parameter v hebben 10 (d.w.z. dat de Zimm-Bragg-o-parameter voor elke aminozuurrest uniek is). Met behulp van deze werkwijze kunnen de Zimm-Bragg-s- en -o-waar-den van elke groep uit tabel 1 van Skolnick, J. en Holtzer, A., macro-molecules (1982) 15:812-821. worden bepaald. Deze werkwijzen worden hierna in de voorbeelden verder beschreven.

15 De polypeptide-analogen volgens de onderhavige uitvinding kunnen op elke manier, die bekend is uit de stand der techniek, worden geproduceerd. In dit opzicht kunnen ze, daar de analogen betrekkelijk klein zijn, d.w.z. met een lengte tot ongeveer 50 aminozuren, eenvoudig chemisch worden gesynthetiseerd, aan de hand van verscheidene technie-20 ken die bekend zijn bij deskundigen op het gebied peptiden. In het algemeen worden bij deze werkwijzen het na elkaar toevoegen van een of meer aminozuren aan een groeiende peptide-keten toegepast. Gewoonlijk wordt ofwel de aminogroep ofwel de carboxylgroep van het eerste aminozuur met een geschikte beschermende groep beschermd. Het beschermde of 25 gederivatiseerde aminozuur kan vervolgens ofwel aan een inerte vaste drager worden bevestigd ofwel worden toegepast in een oplossing, door toevoeging van het volgende aminozuur in de sequentie, waarbij de complementaire (amino of carboxyl)groep geschikt wordt beschermd, onder omstandigheden die de vorming van een amide-binding mogelijk 30 maken. Vervolgens wordt de beschermende groep van de nieuw toegevoegde aminozuurrest verwijderd en daarna wordt het volgende aminozuur (geschikt beschermd) toegevoegd, enzovoort. Nadat de gewenste aminozuren in de juiste sequentie zijn verbonden, worden de resterende beschermende groepen (en de vaste drager, als vaste-fase-synthese-technieken 35 worden toegepast) na elkaar of tegelijk verwijderd, waarbij het uiteindelijke polypeptide wordt verkregen. Door een eenvoudige modificatie van deze algemene werkwijze is het mogelijk om meer dan een aminozuur per keer aan de groeiende keten toe te voegen, bijvoorbeeld door 1003284 17 koppelen (onder omstandigheden waarbij chirale centra niet racemi-seren) van een beschermd tripeptide met een geschikt beschermd di-peptide onder vorming, na verwijdering van de beschermende groepen, van een pentapeptide. Zie b.v. J.M. Stewart en J.D. Young, Solid Phase 5 Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford IL 1984) en G. Barany en R.B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, samenstellers E. Gross en J. Meienhofer, deel 2, (Academic Press, New York, I98O), biz. 3-254, voor peptide-synthese-technieken in de vaste fase; en M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, 10 Berlijn 1984) en E. Gross en J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, deel 1, voor de klassieke synthese in oplossing.

Gebruikelijke beschermende groepen zijn ondermeer tert-butyl-oxycarbonyl (Boe), 9~fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), benzyloxycarbo-15 nyl (Cbz), p-tolueensulfonyl (Tx), 2,4-dinitrofenyl, benzyl (Bzl), bifenylisopropyloxycarboxycarbonyl, tert-amyloxycarbonyl, isobornyl-oxycarbonyl, o-broombenzyloxycarbonyl, cyclohexyl, isopropyl, acetyl, o-nitrofenylsulfonyl en dergelijke.

Gebruikelijke vaste dragers zijn verknoopte polymeerdragers. Deze 20 kunnen polymeren op basis van divinylbenzeen-verknoopt styreen omvatten, zoals bijvoorbeeld divinylbenzeen-hydroxymethylstyreen-copoly-meren, divinylbenzeen-chloormethylstyreen-copolymeren en divinyl-benzeen-benzhydrylaminopolystyreen-copolymeren.

De polypeptide-analogen volgens de uitvinding kunnen ook che-25 misch, aan de hand van andere werkwijzen, worden bereid, zoals volgens de werkwijze van de gelijktijdige meervoudige peptide-synthese. Zie b.v. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) fi2:5131-5135; U.S. octrooischrift 4.631.211.

Daarnaast kunnen de peptiden ook worden geproduceerd aan de hand 30 van recombinant-technieken, b.v. door het synthetiseren van DNA dat codeert voor het gewenste peptide, samen met een ATG-initiatie-codon. De nucleotide-sequentie kan worden ontworpen met de juiste codons voor een bepaalde aminozuursequentie die wordt gewenst. In het algemeen selecteert men voorkeurscodons voor de beoogde gastheer waarin de 35 sequentie tot expressie wordt gebracht. De volledige sequentie wordt in het algemeen samengesteld uit overlappende oligonucleotiden, bereid aan de hand van standaardwerkwijzen en samengesteld tot een volledige codeersequentie. Zie b.v. Edge, Nature {1981) 292:756; Nambair et al., 1003284 18

Science (1984) 223:1299; Jay et al.. J. Biol. Chem. (1984) 252:6311. Geautomatiseerde synthetische technieken, zoals fosforamide-vaste-fase-synthese, kunnen worden toegepast voor het produceren van de nucleotide-sequentie. Zie b.v. Beaucage, S.L. et al., Tet. Lett.

5 (1981) 22:1859-1862; Matteuci, M.D. et al., J. Am. Chem. Soc. (1981) 1123:3185-3191. Vervolgens wordt het DNA met behulp van gebruikelijke werkwijzen in een geschikte expressievector, ofwel prokaryoot ofwel eukaryoot, gekloneerd.

Daarnaast kunnen eenvoudig recombinant-technieken worden gebruikt 10 voor het kloneren van het oorspronkelijke polypeptide-gen, dat vervolgens in vitro kan worden gemutageniseerd door de vervanging van het desbetreffende basepaar/baseparen, hetgeen resulteert in het codon voor het gewenste aminozuur. Een dergelijke verandering kan slechts een basepaar omvatten, waardoor een verandering in een enkel aminozuur 15 tot stand wordt gebracht, of kan veranderingen in verscheidene base-paren omvatten. Als alternatief kunnen de mutaties tot stand worden gebracht met behulp van een primer met een ontbrekende overeenstemming, welke tot de oorspronkelijke nucleotide-sequentie hybridiseert (in het algemeen cDNA dat overeenkomt met de RNA-sequentie), bij een 20 temperatuur lager dan de smelttemperatuur van de duplex met ontbrekende overeenstemming. De primer kan specifiek worden gemaakt, door de lengte van de primer en de base-samenstelling binnen betrekkelijk nauwe grenzen te houden en door de mutant-base op een centrale plaats te houden. Zoller en Smith, Methods Enzymol. (1983) 100:468. De primer 25 wordt verlengd met behulp van DNA-polymerase, het produkt wordt gekloneerd en de klonen die het gemuteerde DNA bevatten, verkregen door afscheiding van de verlengde primer-streng, worden geselecteerd. De selectie kan worden uitgevoerd met behulp van de mutant-primer als hybridisatie-probe. De techniek kan ook worden toegepast voor het tot 30 stand brengen van meerde puntmutaties. Zie b.v. Balbie-McFarland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 19:6409-

Met behulp van de bovenstaande werkwijzen is een aantal representatieve polypeptide-analogen, die een verbeterde elektrotransport-flux vertonen, bereid. In het bijzonder wordt in figuur 1B de sequentie van 35 PTH-analoog 1 weergegeven. Dit PTH-analoog verschilt als volgt van de oorspronkelijke sequentie (weergegeven in figuur IA): Met8 is vervangen door Leu; Leu15 is vervangen door Arg; Metl8 is vervangen door Leu; GluJ9 is vervangen door Arg; Glu22 is vervangen door Arg; Gln29 is ver- 1003284 19 vangen door Lys; Phe34 is vervangen door Tyr; en aan het C-uiteinde van het peptide is een homoserinelacton aanwezig.

PTH-analoog 2, weergegeven in figuur 1C, verschilt als volg van de oorspronkelijke sequentie (figuur IA): Met8 is vervangen door Leu; 5 Leun is vervangen door Ser; Leu15 is vervangen door Arg; Leul8 is vervangen door Ser; Metl8 is vervangen door Ser; Glu19 is vervangen door Arg; Val2i is vervangen door Ser; Glu22 is vervangen door Arg; Leu24 is vervangen door Ser; Leu28 is vervangen door Ser; Gln29 is vervangen door Lys; Tyr3il is vervangen door Ser; en aan het C-uiteinde van het 10 peptide is een homoserinelacton aanwezig. Bij elkaar resulteren deze substituties in een afgenomen secundaire structuur.

De hirulogen zijn een reeks van synthetische analogen van hirudi-ne, een natuurlijke trombine-remmer. Twee van deze analogen worden getoond in figuur 2. Hiruloog-1, getoond in figuur 2B, wordt beschre-15 ven in Maragnore et al., Biochem (1990) 29: 7095"7101. Hiroloog-B2, een peptide van twintig aminozuren met een molecuulgewicht van ongeveer 2186 dalton, heeft de sequentie van figuur 2C. Zoals blijkt verschilt het in figuur 2C getoonde hiruloog-B2-analoog van het hiruloog-1-analoog doordat D-cyclohexylalanine op de eerste plaats is gesubsti-20 tueerd voor D-fenylalanine. Hiruloog-B2 wordt beschreven in Witting et al., Biochem. J. (1992) 287:663-669: en de Internationale octrooiaanvrage wo 92/13952.

Zodra het gewenste polypeptide-analoog is bereid, kan dit met behulp van elk elektrotransport-geneesmiddel-afgiftesysteem aan een 25 persoon worden toegediend, en wordt dit niet beperkt tot de toepassing van een bepaald systeem. Voorbeelden van elektrotransport-geneesmid-del-afgiftesystemen worden bijvoorbeeld beschreven in de U.S. octrooi-schriften 5-312.326 van Myers et al., 5-080.696 van Theeuwes et al., 5-387-189 van Gyory et al., en 5-169-383 van Gyory et al., waarvan de 30 beschrijvingen hierin als ingelast dienen te worden beschouwd.

Figuur 3 illustreert een representatieve elektrotransport-afgif-te-inrichting, welke bij de onderhavige uitvinding kan worden gebruikt. Inrichting 10 omvat een bovenste behuizing 16, een schakel-bord-samenstel 18, een onderste behuizing 20, een anode-elektrode 22» 35 een kathode-elektrode 24, een anode-reservoir 26, een kathode-reservoir 28 en een met de huid verenigbaar hechtmiddel 30. De bovenste behuizing 16 heeft laterale vleugels 15» die behulpzaam zijn bij het op de huid van de patiënt houden van inrichting 10. De bovenste behui- 1003284 20 zing 16 bestaat bij voorkeur uit een spuitgegoten elastomeer (b.v. ethyleenvinylacetaat). Het bedrukte schakelbord-samenstel 18 omvat een geïntegreerde schakeling 19, die is verbonden met discrete componenten 40 en een batterij 32. Het schakelbord-samenstel 18 wordt aan de be-5 huizing 16 bevestigd door middel van staafjes (niet getoond in figuur 3), die door de openingen 13a en 13b gaan, waarbij de uiteinden van de staafjes worden verhit/gesmolten, teneinde het schakelbord-samenstel 18 door middel van verhitten aan de behuizing 16 te bevestigen. De onderste behuizing 20 wordt door middel van hechtmiddel 30 aan de 10 bovenste behuizing 16 bevestigd, waarbij de bovenkant 34 van hechtmiddel 30 zowel aan de onderste behuizing 20 als de bovenste behuizing 16, inclusief de onderkant van vleugels 15. hecht.

Aan de onderkant van het schakelbord-samenstel 18 wordt (gedeeltelijk) een knoopcel-batterij 32 getoond. Voor het aandrijven van 15 inrichting 10 kunnen andere soorten batterijen worden gebruikt.

De inrichting 10 bestaat in het algemeen uit een batterij 32, de elektrische schakelingen 19, 40, de elektroden 22, 24 en de reservoirs 26, 28 voor geneesmiddelen/chemicaliën, die alle zijn geïntegreerd in een zelfdragende eenheid. De uitgangen (niet getoond in figuur 3) van 20 het schakelbord-samenstel 18 maken, door middel van elektrisch geleidende hechtstroken 42, 42', via de openingen 23, 23' in de uitsparingen 25. 25', die in de onderste behuizing 20 zijn gevormd, elektrisch contact met de elektroden 24 en 22. De elektroden 22 en 24 staan op hun beurt in direkt mechanisch en elektrisch contact met de bovenkan-25 ten 44', 44 van de geneesmiddel-reservoirs 26 en 28. De onderkanten 46’ , 46 van de geneesmiddel-reservoirs 26, 28 staan via de openingen 29', 29 in hechtmiddel 30 in contact met de huid van de patiënt.

De inrichting 10 bevat eventueel een middel dat de patiënt in staat stelt om zichzelf, door middel van elektrotransport, een dosis 30 van het geneesmiddel toe te dienen. Bij indrukken van de drukschake-laar 12 geeft de elektronische schakeling op het schakelbord-samenstel l8 een vooraf bepaalde gelijkstroom af aan de elektroden/reservoirs 22, 26 en 24, 28 gedurende een afgifte-interval van vooraf bepaalde lengte. De drukschakelaar 12 bevindt zich aan de bovenkant van de 35 inrichting 10 en wordt eenvoudig aangezet door de kleding. Bij voorkeur wordt de drukschakelaar 12 twee keer binnen een korte tijdsperiode, b.v. drie seconden, ingedrukt om de inrichting te activeren voor het afgeven van het geneesmiddel, zodat de waarschijnlijk van het per 1003284 21 ongeluk inschakelen van de inrichting 10 wordt geminimaliseerd. Bij voorkeur geeft de inrichting een zichtbare en/of hoorbare bevestiging, door middel van een LED 14 dat oplicht en/of een hoorbaar geluidssignaal, b.v. in de vorm van een "piep", van het begin van het genees-5 middel-afgifte-interval aan de gebruiker. Het geneesmiddel wordt gedurende het vooraf bepaalde afgifte-interval door middel van elektro-transport door de huid van de patiënt, b.v. op de arm, afgegeven.

De anode 22 bestaat bij voorkeur uit zilver en de kathode 2H bestaat bij voorkeur uit zilverchloride. Beide reservoirs 26 en 28 10 bestaan bij voorkeur uit polymere hydrogelmaterialen. De elektroden 22, 2k en de reservoirs 26, 28 bevinden zich in de uitsparingen 25'. 25 in de onderste behuizing 20.

De drukschakelaar 12, de elektronische schakeling op het schakel-bord-samenstel 18 en de batterij 32 worden hechtend "afgesloten" tus-15 sen de bovenste behuizing 16 en de onderste behuizing 20. De bovenste behuizing 16 bestaat bij voorkeur uit rubber of een ander elastomeer materiaal. De onderste behuizing 20 bestaat bij voorkeur uit een kunststof of een elastomeer velmateriaal (b.v. polyetheen), dat eenvoudig kan worden gegoten voor het vormen van de uitsparingen 25, 25’ 20 en kan worden uitgesneden voor het vormen van de openingen 23, 23’. De samengestelde inrichting 10 is bij voorkeur waterbestendig (d.w.z. bestand tegen sputteren) en met de meeste voorkeur waterdicht. Het systeem heeft een laag profiel, dat zich eenvoudig aanpast aan het lichaam, waarbij men zich op en rond de plaats van het dragen vrij kan 25 bewegen. De reservoirs 26 en 28 bevinden zich aan de met de huid in contact staande zijde van de inrichting 10 en zijn voldoende van elkaar gescheiden, om een niet bedoelde elektrische kortsluiting tijdens het normaal hanteren en gebruik te voorkomen.

De inrichting 10 hecht door middel van een periferaal hechtmiddel 30 30, dat een bovenkant 3^ en een met de huid in contact staande kant 36 heeft, aan het lichaamsoppervlak (b.v. de huid) van de patiënt. De hechtkant 36 heeft hechteigenschappen die waarborgen dat de inrichting 10 op zijn plaats blijft op het lichaam tijdens de normale activiteit van de gebruiker en maakt toch een redelijke verwijdering na de vooraf 35 bepaalde draagperiode (b.v 2k uur) mogelijk. De bovenste hechtkant 3^ hecht aan de onderste behuizing 20 en zorgt ervoor dat de onderste behuizing 20 bevestigd blijft aan de bovenste behuizing 16.

De reservoirs 26 en 28 omvatten in het algemeen een gelmatrix, 1 0 0 3 284 22 waarbij de geneesmiddel-oplossing uniform is gedispergeerd in ten minste een van de reservoirs 26 en 28. Er kunnen geneesmiddel-concen-traties in het traject van ongeveer 1 x 10'4 M tot 1,0 M of meer worden gebruikt, waarbij geneesmiddel-concentraties in het onderste gedeelte 5 van het traject de voorkeur hebben. Geschikte polymeren voor de gel-matrix omvatten in hoofdzaak alle niet-ionogene synthetische en/of van nature voorkomende polymeermaterialen. Een polaire aard heeft de voorkeur als het actieve middel polair is en/of in staat is te ioniseren, zodat de oplosbaarheid van het middel wordt verbeterd. De gelmatrix 10 kan eventueel in water opzwellend zijn. Voorbeelden van geschikte synthetische polymeren omvatten, maar zijn niet beperkt tot, polyacrylamide , poly-2-hydroxyethylacrylaat, poly-2-hydroxypropylacrylaat, poly-N-vinyl-2-pyrrolidon, poly-N-methylolacrylamide, polydiaceton-acrylamide, poly-2-hydroxyethylmethacrylaat, polyvinylalcohol en poly-15 allylalcohol. Hydroxyl-functionele condensatiepolymeren (d.w.z. polyesters, polycarbonaten, polyurethanen) zijn ook voorbeelden van geschikte polaire synthetische polymeren. Polaire, van nature voorkomende polymeren (of derivaten daarvan), die geschikt zijn voor gebruik als gelmatrix, zijn bijvoorbeeld cellulose-ethers, methylcellulose-20 ethers, cellulose en gehydroxyleerde cellulose, methylcellulose en gehydroxyleerde methylcellulose, gomsoorten, zoals guar, acacia, karaya, xanthaan, gelatine, en derivaten daarvan. Voor de matrix kunnen ook ionogene polymeren worden gebruikt, vooropgesteld dat de beschikbare tegenionen ofwel geneesmiddel-ionen ofwel andere ionen, die 25 een tegengestelde lading hebben ten opzichte van het actieve middel, zijn.

Aldus worden de polypeptide-analogen volgens de onderhavige uitvinding opgenomen in een geneesmiddel-reservoir, b.v. een zojuist beschreven gelmatrix, en met behulp van een elektrotransport-genees-30 middel-afgifte-inrichting, eventueel zoals hiervoor toegelicht, aan de patiënt toegediend. Het opnemen van de geneesmiddel-oplossing kan op iedere manier gebeuren, b.v. door absorberen van de oplossing in de reservoir-matrix, door mengen van de geneesmiddel-oplossing met het matrix-materiaal vóór het vormen van de hydrogel of dergelijke.

35 Hoewel de uitvinding in verband met de specifieke voorkeurs uitvoeringsvormen daarvan is beschreven, zal het duidelijk zijn dat de voorgaande beschrijving, alsook de volgende voorbeelden, bedoelt zijn voor het illustreren en niet voor het beperken van de omvang van de 1003284 23 uitvinding. Andere aspecten, voordelen en modificaties binnen de omvang van de uitvinding zullen duidelijk zijn voor deskundigen op het gebied waarop de uitvinding betrekking heeft.

5 Standaardtechnieken voor recombinant-DNA-technologie worden in het algemeen in verschillende publikaties beschreven, b.v. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology, delen 1 en 2 en aanvullingen (1987); en Wu en Grossman (eds.), Methods 10 in Enzymology, deel 53 (Recombinant-DNA deel D, 1987). Restrictie-enzymen, kweekmedia voor zoogdiercellen en E. coli cellijn DH10B (F-mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) F80dlacZDM15 DlacX74 deoR recAl araD139 D(ara,leu)7697 galU galK I-rpsL endAl nupG) werden verkregen van Gib-co/BRL (Gaithersburg, MD). Taq-polymerase is afkomstig van Perkin 15 Elmer Cetus (Norwalk, CT). His-bind hars werd verkregen bij Novagen (Madison, WI) en werd toegepast volgens de instructies van de leverancier. DNase en lysozyme werden verkregen bij Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). Cyaanbromide werd verkregen bij Aldrich (Milwaukee, WI). Oligonucleotiden werden met behulp van ABI-chemicaliën op een 20 Model 39^ DNA-synthetiseerinrichting van Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) gesynthetiseerd. Synthetisch menselijk parathyroïde-hormoon en synthetisch runder-parathyroïde-hormoon werden verkregen bij Bachem (Torrance, CA).

25 Voorbeeld I

Constructie van expressievectoren voor de PTH-Polvpeptiden

De PTH-expressievectoren werden in verscheidene stappen, met behulp van plasmide pBADl8 (Guzman et al., 1995) als het uitgangs-30 plasmide, geconstrueerd. Plasmide pBADl8 de araB-promoter, gevolgd door een polykoppelaar en een terminator onder de controle van de positief/negatief-regulator araC. eveneens gespecificeerd door het plasmide. Plasmide pBAD 18 bevat ook een gemodificeerde oorsprong van plasmide pBR322 en het bla-gen om replicatie en selectie in E. coli 35 mogelijk te maken, alsook het intragene gebied van faag M13 om het winnen van enkelstrengs-DNA mogelijk te maken. Voor de doeleinden van de onderhavige uitvinding is de werkelijke kloneervector, die wordt gebruikt voor het construeren van de expressievectoren volgens de 1003284 24 uitvinding, echter niet kritiek.

Bijvoorbeeld kan plasmide pMC3 in plaats van plasmide pBADl8 in de onderstaande protocols als kloneervector dienen. Plasmide pMC3 wordt beschreven in U.S. octrooischrift 5*270.170. Plasmide pMC3 ver-5 schilt van plasmide pBADl8, doordat plasmide pMC3 codeert voor een lflC.-repressor met een dynorfine B-staart in het gebied dat overeenkomt met het Nhel-Xbal-gebied van de meervoudige kloneerplaats van pBADl8 en codeert voor een Iac-operatorseauentie in het gebied dat overeenkomt met het Ndel-Clal-fragment van plasmide pBADl8. Daar dit laatste 10 fragment niet belangrijk is voor de doeleinden van de onderhavige uitvinding, kan men eenvoudig geschikte vectoren voor de doeleinden van de onderhavige uitvinding uit plasmide pMC3 construeren. Plasmide pMC3 is bij de American Type Culture Collection onder toegangsnummer ATCC 688l8 in stam ARll6l verkrijgbaar.

15 Vervolgens werden de PTH-vectoren als volgt geconstrueerd. Het volgende paar van gedeeltelijk overlappende oligonucleotiden werd met elkaar versmolten en met Taa-polvmerase werd een tweede streng gesynthetiseerd:

20 51-GCT CG6 GCT AGC TAA CTA ATG GAG GAT ACA TAA ATG AAA GCT ATC TTC

Nhe I S&D TrpLe leader GTT CTG AAA GGT TCC CTG GAC CGT GAC CCG GA-3'

3'-AC CTG GCA CTG GGC CTT AAG GAG CTG TAC TAG

Sal I Bel I

TTG GTC TAG AGG GTG GTG GTG GTA GTG GTA ATT ATT TTC GAA GGC AGG-5'

25 ~ Bgl II Hiss Hind III

Het produkt werd aan digestie onderworpen met Nhel en HinDIII en ingevoegd op de overeenkomstige plaatsen van pBADl8. De duplex bevat de Shine-Dalgarno-ribosoom-bindingsplaats (S&D) en het TrpLE-leader-30 peptide. Voorheen is reeds aangetoond dat deze leader-sequentie van 17 aminozuren de expressie van kleine eiwitten bevordert en de afscheiding van fusies in insluitingslichamen kan bevorderen (Derynck et al.. Cell (1984) 38:287-297; Miozzari en Yanofsky, J. Bacteriol. (1978) 133:1457-1466). Het TrpLe-leader-peptide wordt door een meervoudige 35 kloneringsplaats van de His^-sequentie gescheiden. De polyhistidine-plaats maakt een snelle zuivering van de recombinant-parathyroi'de-hormoon-molecule (RPTH) en RPTH-analogen mogelijk door middel van nikkel-cheleringschromatografie (zie U.S. octrooischrift 4.551.271).

1003284 5 25

Twee stopcodons (TAATAA) volgen op het polyhistidine.

Een RPTH(1-3*0-gen met de volgende sequentie werd ontworpen en gesynthetiseerd met behulp van door E. coli veel gebruikte codons: 12345678 Val-Asp-Met-Ile-Asn-Met-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Leu

5'-GGC TGG GTC GAC ATG ATC AAC ATG TCC GTT TCC GAA ATC CAG CTG CTG 3'-CCG ACC CAG CTG TAC TAG TTG TAC AGG CAA AGG CTT TAG GTC GAC GAC Sal I

10 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

His-Asn-Leu-Gly Lys-His-Leu-Asn-Ser-Leu-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu CAC AAC CTG GGT AAA CAC CTG AAC TCC CTC GAG CGT GTT GAA TGG CTG

GTG TTG GAC CCA TTT GTG GAC TTG AGG GAG CTC GCA CAA CTT ACC GAC

15 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Tyr-Met-Gln-Ile-Ser CGT AAA AAA CTG CAG GAC GTC CAC AAC TAC ATG CAG ATC TCC CTC-3' GCA TTT TTT GAC GTC CTG CAG GTG TTG ATG TAC GTC TAG AGG GAG-5'

Bgl II

20

Dit RPTH-gen werd aan digestie onderworpen met Sal en BglII en ingevoegd in de gemodificeerde pBAD-vector.

25 Voorbeeld II

Expressie en zuivering van PTH-polvpeptiden E. coli DH10B, dat het hierboven beschreven plasmide bevat, werd een nacht in LB-medium met ampicilline (50 tot 100 pg/ml) gekweekt. 30 Tien ml van deze kweek werd gebruikt voor inoculeren van een kweek van 500 ml Superbroth (35 g/1 Bactotryton, 20 g/1 gistextract, 5 g/1 NaCl en NaOH tot pH = 7.5) met ampicilline. Men liet de cellen groeien tot een 0D6oo van ongeveer 0,5 tot 1,0 en er werd L-( + )-arabinose tot een uiteindelijke concentratie van 0,2Jt toegevoegd, men liet de cellen nog 35 3 uur groeien. Daarna lag de OD6oo tussen 1,5 en 3· De cellen werden geoogst door middel van centrifugeren en achtereenvolgens gewassen met 250 ml WTEK-buffer (50 mM Tris, pH = 7.5. 10 mM EDTA, 100 mM KC1); 250 ml PBSj en 250 ml 10 mM Tris, pH = 7.5· Daarna werden de cellen ge- 1003284 26 hersuspendeerd in 100 ml van een oplossing die bestaat uit 10 mM Tris, pH = 7.5; 0,1 mg/ml protease-inhibitor N-tosyl-L-fenylalaninechloor-methylketon (TPCK); 0,1 mg/ml protease-inhibitor N-tosyl-L-lysine- chloormethylketon (TLCK); 0,1 mg/ml protease-inhibitor fenylmethyl-5 sulfonylfluoride (PMSF); en 0,05 mg/ml lysozyme), de verkregen oplossing werd 1 uur op ijs geïncubeerd. Vervolgens werden de cellen uitgevroren; werd 1 mg DNAse aan de uitgevroren cellen toegevoegd; en werd het verkregen mengsel nog een uur op ijs geïncubeerd.

Insluitingslichamen van de cellen werden 15 minuten door centri-10 fugeren bij 10.000 x g gezuiverd. De insluitingslichamen werden opgelost in 10% SDS, maar in sommige gevallen was tevens sonificatie van het monster noodzakelijk om alle eiwitten op te lossen. Er werd bin-dingsbuffer (5 mM imidazool, 500 mM NaCl en 20 mM Tris, pH = 7,9) toegevoegd om de SDS-concentratie tot 1% te verdunnen en het monster 15 werd in een kolom met His-bind hars (Novagen) geladen. Daarna werd de kolom met 15 kolomvolumes bindingsbuffer gewassen en werd het gebonden eiwit met 1 kolomvolume elutie-buffer (500 mM NaCl, 100 mM EDTA en 50 mM Tris, pH = 7.9) geëlueerd. Vervolgens werden twee volumes absolute ethanol toegevoegd teneinde het eiwit te precipiteren.

20 Daarna werd het geprecipiteerde PTH-polymeer opgelost in 70% mierezuur en werd een 500-voudige (een 100 tot 1000-voudige overmaat kan worden toegepast) molaire overmaat CNBr toegevoegd. Het tijdsverloop van het splitsen (uitgevoerd bij verschillende CNBr-concentra-ties om de optimale tijd te bepalen), zoals bepaald door middel van 25 aminozuur-analyse, gaf aan dat een volledige splitsing bij kamertemperatuur in 2 uur werd bereikt. Na het splitsen met CNBr werden de peptiden gelyofiliseerd en gehersuspendeerd in gedestilleerd water. Het peptide werd gehersuspendeerd in Buffer A (0,1% TFA) e verder gezuiverd door middel van HPLC onder toepassing van een VYDAC C-l8 semi-30 preparatieve kolom. Er werd ongeveer 30 mg peptide in de kolom geïnjecteerd. Vervolgens werd het peptide in 40 minuten met een gradiënt van 20-40% acetonitril/0,1% TFA geëlueerd. De grootste piek, die na ongeveer 15 minuten elueert, werd verzameld en gelyofiliseerd tot droogte.

35 Na isolatie van de insluitingslichamen en zuivering, zoals hier boven beschreven, was het peptide voor meer dan 95/*> zuiver, zoals bepaald aan de hand van SDS-PAGE. Vervolgens werd het peptide ontzou-ten en gedeeltelijk gezuiverd over een SepPak-kolom. De afzonderlijke 1003284 27 pieken werden geïsoleerd en geanalyseerd door middel van elektrospray-massaspectrometrie, teneinde de samenstelling te bepalen. Er waren twee kleine pieken aanwezig, die het resultaat zijn van een onvolledige splitsing met cyaanbromide en deze vertegenwoordigen het PTH-His^-5 peptide en het I-N-M-PTH-peptide. De grootste piek omvatte meer dan 80# van het totale eiwit. Vergelijking van het ’’ruwe", met SepPak gezuiverde monster met een door middel van HPLC gezuiverd RPTH toonde geen significant verschil in het adenylaatcyclase stimulerende vermogen.

10

Voorbeeld III

Produktie van PTH-analogen

Teneinde de PTH-analogen volgens de onderhavige uitvinding te 15 produceren, werd het PTH-peptide gesubstitueerd met de aminozuren die zijn aangegeven in figuur IB, 1C en 1D. De PTH-analogen werden recombinant geproduceerd en geconstrueerd op een wijze die overeenkomt met de manier die hierboven is beschreven voor het recombinante RPTH-A-gen, door substitutie van de juiste basen. De PTH-analogen werden, 20 zoals hierboven beschreven, tot expressie gebracht en gezuiverd.

Voorbeeld IV

Assay voor de activiteit van het PTH-analoog 25 Synthetisch PTH met de wild-type-sequentie en de recombinante PTH-analogen (RPTH) werden onderzocht op hun vermogen tot het stimuleren van adenylaatcyclase. De PTH-concentraties werden bepaald aan de hand van OD28o* onder toepassing van een extinctiecoëfficiënt van 6600 voor het recombinante peptide en 5500 voor het synthetische peptide. 30 De osteosarcoma-cellijn UMR106 (ATCC CRL 1661) van de rat werd gebruikt voor het in vitro testen van het vermogen van het peptide tot het activeren van de PTH-receptor. Activering van de PTH-receptor leidt tot een intracellulaire stijging van de cAMP-concentratie.

De UMRIOö-cellen werden in ongeveer 2,5 x 10® per putje op een 35 plaat met 48 putjes gezaaid en men liet ze tot confluentie groeien. 3-5 dagen na de confluentie werden assays op de cellen uitgevoerd. Het medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle’s medium, DMEM, met foetaal kalfsserum) werd verwijderd en er werd 1 ml vers medium toegevoegd.

f003284 28

Vervolgens werden aan elk putje van de plaat PTH (recombinant of synthetisch) in verschillende concentraties en 3~isobutyl-l-methylxanthine (IBMX) in een uiteindelijke concentratie van 1 mM toegevoegd, waarna de plaat 5 minuten bij kamertemperatuur werd geïncubeerd. Daarna 5 werd het medium verwijderd en werden de cellen snel met ijskoud PBS gewassen. Vervolgens werden de cellen twee keer met 1 ml absolute ethanol geëxtraheerd. De twee extracties werden samengevoegd en het ethanol werd verwijderd door middel van verdampen. Daarna werd het extract opnieuw opgelost in 1 ml scintillatie-naderingsbuffer (SPA-10 buffer) (Amersham, Arlington Heights, IL). De cAMP-concentratie werd bepaald met behulp van een assay onder toepassing van een scintilla-tie-naderingsassay-kit (SPA-kit), die verkrijgbaar is bij Amersham. Analoog 1 had een Kd (dissociatie-constante) van 1,5 nM en een EC-50 (effectieve concentratie) van 0,9 nM. Wild-type PTH had een Kd van 8,5 15 nM en een EC-50 van 4,4 nM. De analogen 2 en 3 hebben geen meetbare activiteit.

Voorbeeld V

Voorspelling van de effecten van aminozuur-substituties in de PTH-20 analogen op de a-helix-potentiaal

Zoals hierboven is toegelicht kan de a-helix-potentiaal van lineaire polypeptiden worden geschat met behulp van de Lifson-Roig-verge-lijkingen (Lifson, S en Roig, A., J. Chem. Phys. (1961) 34:1963-1074) 25 en de waarden van de parameters voor de helix-vorming van de groep die zijn omgezet uit hun Zimm-Bragg-waarden (Zimm, B.H. en Bragg, J.K., J. Chem. Phys. (1959) 21:526-535). onder toepassing van de omzettings-vergelijkingen van Qian en Schellman (Qian, H. en Schellman, J.A., J. Chem. Phys. (1992) 96:3987”3994). Zodra voor elke groep een paar Zimm-30 Bragg-s- en -σ-waarden zijn gedefinieerd, kan de mogelijkheid, dat de gehele polypeptide-keten (of een gedefinieerde subsequentie) een a-helix aanneemt, met behulp van de vergelijkingen in de bovengenoemde referenties worden berekend.

Er werden twee berekeningen, die in het algemeen, zoals hierboven 35 beschreven, worden gebruikt voor het schatten van de a-helix-potentiaal, toegepast op de twee geproduceerde PTH-analogen. Bij de eerste berekening wordt aangenomen dat de Lifson-Roig-helix-initiatie-para-meter v een constante is van 0,039 (d.w.z. dat de Zimm-Bragg-o-para- 1003264 29 meter voor alle groepen 0,0013 is), waarbij de w-parameter voor elk aminozuur wordt berekend uit de Zimm-Bragg-s-waarde, die wordt gevonden in tabel 1 van Finkelstein et al. (Finkelstein et al.. Proteins: Structure, Function and Genetics (1991) 10:287-299). Bij de toepassing 5 van de berekeningen voor de PTH-analogen werden de s-waarden uit tabel 1 van deze referentie eerst omgezet van hun waarden bij 300 K naar de geschatte waarden bij 273 K, onder toepassing van een aangenomen en-thalpie-verandering van 1 kcal/mol (hetzelfde voor alle groepen). Voor PTH-analoog 1 geeft deze berekening een waarschijnlijkheid van 0,41 10 dat de gehele sequentie een α-helix is. Voor PTH-analoog 2 geeft deze berekening een waarschijnlijkheid van 0,18 dat de gehele sequentie een α-helix is. Voor PTH-analoog 3 geeft deze berekening een waarschijnlijkheid van 0,15 dat de gehele sequentie een α-helix is.

De tweede berekening gaat niet uit van de aanname dat alle groe-15 pen dezelfde waarde hebben van de helix-initiatie-parameter v (d.w.z. dat de Zimm-Bragg-o-parameter voor elke aminozuurrest uniek is). In dit geval werden de Zimm-Bragg-s- en -σ-waarden voor elke groep (behalve voor His, Pro en Trp) uit tabel 1 van Skolnick, J. en Holtzer, A., Macromolecules (1982) 15:812-821, genomen. De Zimm-Bragg-waarden 20 voor His werden uit Sueki et al., Macromolecules (1984) 17:148-155 gehaald. De Zimm-Bragg-waarden voor Pro en Trp werden uit Finkelstein et al. gehaald. Voor deze tweede, alternatieve berekening werden de s-waarden in elk geval bij 273 K berekend en voor de groepen met ioni-seerbare zijketens werd de s-waarde voor de ionisatie-toestand, die 25 bij pH 7 overheerst, aangenomen. De s-waarden (bij 273 K) en de σ-waarden, verkregen uit Sueki et al. en Skolnick en Holtzer, werden omgezet (Qian en Schellman) in de desbetreffende Lifson-Roig-v- en -w-waarden en vervolgens gebruikt voor het berekenen van de waarschijnlijkheid dat de gehele polypeptide-keten (of een subsequentie) de a-30 helix-toestand heeft. Voor PTH-analoog 1 geeft deze berekening een waarschijnlijkheid van 0,07 dat de gehele sequentie een α-helix is. Voor PTH-analoog 2 geeft deze berekening een waarschijnlijkheid van 0,02 dat de gehele sequentie een α-helix is. Voor PTH-analoog 3 geeft deze berekening een waarschijnlijkheid van 0,02 dat de gehele sequen-35 tie een α-helix is.

Wanneer men beide reeksen van aannamen, met betrekking tot de neiging van de polypeptiden om een a-helix-conformatie aan te nemen, beschouwd, wordt voorspeld dat de waarschijnlijkheid dat analoog 1 als 1003284 30 α-helix bestaat twee tot drie keer zo groot is als die waarschijnlijkheid voor analoog 2.

Voorbeeld VI

5 Schatten van de α-helix-potentiaal uit circulair dichroïsme in verschillende trifluorethanol-concentraties

De circulaire dichroïsme-onderzoeken in trifluorethanol (TFE) werden uitgevoerd met behulp van een AVIV Associates, Ine. Model 62DS 10 Circular Dichroism Spectrometer. De eiwit-concentraties werden bepaald uit de absorpties, onder toepassing van berekende extinctie-coëffi-ciënten voor de analogen in 10 mM ionogene buffer. TFE-titraties werden uitgevoerd met 0 tot 50# TFE, waarbij elk TFE-monster bij 20°C van 250 tot 200 nm wordt onderzocht. [θ]222 werd berekend uit: 15 ®waargenomen bij 222*(gemiddeld gewicht van de groep)/(10(weglengte van de cel)(eiwit-concentratie)).

Gegevens van de TFE-titraties bij pH 6,5, 10 mM cacodylaat, worden, voor de PTH-analogen, samengevat in de onderstaande tabel B en uitgezet in figuur 4. Figuur k demonstreert dat wanneer het a-helix 20 inducerende co-oplosmiddel, trifluorethanol, een concentratie van 30# (vol/vol) bereikt, voor zowel PTH als analoog 1 in hoofdzaak de maximale hoeveelheid helix wordt gevormd, waarbij de gemiddelde hoeveelheid aan helix ongeveer 80# bedraagt. Het oorspronkelijke PTH, zelfs bij afwezigheid van het helix-inducerende middel, bestaat voor onge-25 veer 20 uit a-helix.

PTH-analoog 2 is bij afwezigheid van het helix-inducerende TFE vrijwel vrij van helix en bij 30# TFE is hooguit ongeveer 30# een a-helix.

PTH-analoog 3 is bij afwezigheid van het helix-inducerende TFE 30 vrijwel vrij van helix en bij 30# TFE is ongeveer 15# een a-helix.

Deze 2-3-voudige afname in het waargenomen helix-gehalte bij 30# trifluorethanol was voorspelbaar op basis van de Lifson-Roig-vergelij-king en daarvan afgeleide berekeningen, zoals hierboven beschreven.

1003284 31

Tabel B

TFE-1i tratie-gegevens [_]222 voor [_]j22 voor [_]222 VOOr [_^222 νΟΟΓ % TFE hPTH(l-34) analoog 1 analoog 2 analoog 3 50 - 7-793 - 4.205 - 2.750 - 3-867 10 -15.863 - 9-333 - 4.600 - 6.479 20 -21.491 -23.098 - 9.Ο65 ^12.329 30 -26.288 -26.334 -12.081 -15.161 40 -27.OII -27.580 -14.320 -15.191 10 50 -26.802 -27.705 -15-649 -15-395

Voorbeeld VII

In vitro elektrotransport-flux van de PTH-analogen 15 Er werden in vitro elektrotransport-onderzoeken uitgevoerd in op maat gemaakte, kleine cellen met meerdere compartimenten, onder toepassing van een anodische drijvende kracht. 1 mM PTH in 10 mM buffer werd in het donorcompartiment geplaatst en een receptor met een uiteindelijke ion-sterkte van 25 mM werd in het receptorcompartiment 20 geplaatst. De receptor-oplossing voor het natuurlijk PTH en de ana-logen 1 en 2 was 15 mM NaCl, met 10 mM imidazool op pH 7 gebufferd, 0,1% runderserum-albumine (BSA) als blokkeermiddel, Tween 20 detergens en natriumazide als bactericide. De receptor-oplossing voor PTH-ana-loog 3 was 15 mM NaCl, met 10 mM imidazool op pH 7 gebufferd, 0,5% 25 dodecyltrimethylammoniumbromide (DTAB, een oppervlakte-actieve stof) en 0,3 mg/ml Trp-Nle-Arg-Phe-amide, een tetrapeptide dat wordt gebruikt als "ander" substraat voor proteolytische enzymen die aanwezig zijn in de huid.

Onder verhitten afgestripte stratum corneum van een menselijk 30 lijk werd tussen de donor- en receptorcompartimenten geplaatst, met de epidermis-kant naar het receptorcompartiment. Er werd een constante gelijkstroom van 127 μΑ mA (d.w.z. 0,1 mA/cm2) aangelegd. De cellen werden tijdens de in vitro onderzoeken op 32eC gehouden, waarbij elke 2 uur receptor-monsters werden genomen (bij elke monsterneming werd 35 een hoeveelheid receptor verwijderd en vervangen door "verse" receptor) . De receptor-monsters werden geanalyseerd door middel van omge- * keerde-fase-HPLC.

De piekoppervlakken van de PTH-receptormonsters werden vergeleken 1 0 0 3284 32 met standaardkrommen van hetzelfde analoog met bekende concentraties, die tegelijkertijd onder toepassing van een analytische polymeerkolom, bij ee stroomsnelheid van 1,5 ml/min met en gradiënt van 10-502 B in tien minuten voor de elutie, werden bepaald. Buffer A was 0,12 tri-5 fluorazijnzuur (TFA), 12 acetonitril; Buffer B was 0,12 TFA, 98,92 acetonitril. De concentraties van de analogen werden omgezet in massaflux en uitgezet tegen de tijdvoor de in vitro elektrotransport-onderzoeken bevatten de beschreven donors de retro-inverso-versies (d.w.z. dat D-aminozuurresten 10 werden gebruikt en dat deze in de omgekeerde volgorde als normaal werden samengesteld) van de PTH-analogen 1 en 2 (1 mM) in waterige oplossingen bij pH 5.0. Dit was omdat de PTH-analogen 1 en 2 niet stabiel waren wanneer ze werden geïncubeerd met gestript stratum cor-neum, waarschijnlijk als gevolg van de proteolytische digestie door 15 huid-proteasen. PTH-analoog 3 was geen retro-inverso-versie, maar was in plaats daarvan recombinant gesynthetiseerd. Om analoog 3 tegen digestie door proteolytische enzymen te beschermen werd het tetra-peptide aan de receptor-oplossing toegevoegd. De volledig samengestelde elektrotransport-cellen werden bij 32 ± 0,5°C geïncubeerd. Het 20 huidcontactoppervlak, dat beschikbaar is voor transport, bedroeg 1,27 cm2. Het volume van het donorcompartiment bedroeg 200 μΐ; het volume van het receptorcompartiment was 350 μΐ. De receptor-oplossing werd gescheiden van de kathode door middel van een anionenuitwisselings-membraan (Ionac®, Eletrosynthesis Co., Lancaster, NY). Elke cel werd 25 verbonden met een bron met constante stroom, bij een standaard stroom-dichtheid van 100 pA.cnf2. De spanningsdaling over elke cel werd gedurende de duur van het experiment in intervallen van ongeveer 2 uur gevolgd.

Er werden histogrammen van de massaflux voor elk punt in de tijd 30 uitgezet. De gemiddelde massaflux (952 betrouwbaarheidsinterval) voor PTH-analoog 1 bedroeg 0,3 pg.cm^.uur'1 (0,1 tot 0,7), voor PTH-analoog 2 3,2 pg.cm'2.uur*1 (2,1 tot 4,2) en voor PTH-analoog 3 1,1 pg.cm^.uur'1 (0,9 tot 1,7). De gemiddelde waarden van de massaflux ± sd voor deze analogen waren 1,4 pg.cm^.uur*1 ± 2,3; 4,1 pg.cm^.uur"1 * 3,7; en 1,5 35 pg.cm'2.uur'1 ± 1,1, voor respectievelijk de analogen 1, 2 en 3.

1003284 33

Voorbeeld VIII

Schatten van de g-helix-potentiaal uit circulair dichroïsme in verschillende trifluorethanol-concentraties 5 De circulaire dichroïsme-onderzoeken in trifluorethanol (TFE) werden uitgevoerd met behulp van een AVIV Associates, Ine. Model 62DS Circular Dichroism Spectrometer. De eiwit-concentraties werden bepaald uit de absorpties, onder toepassing van berekende extinctie-coëffi-ciënten voor de analogen in 10 mM ionogene buffer. TFE-titraties wer-10 den uitgevoerd met 0 tot 50% TFE, waarbij elk TFE-monster bij 20eC van 250 tot 200 nm wordt onderzocht. [θ]222 werd berekend uit: ^waargenomen bij 222*(gemiddeld gewicht van de groep)/(10(weglengte van de cel)(eiwit-concentratie)).

Gegevens van de TFE-titraties bij pH 6,5, 10 mM cacodylaat, wor-15 ' den, voor de hiruloog-analogen, samengevat in de onderstaande tabel C en uitgezet in figuur 5· Figuur 5 demonstreert dat wanneer het a-helix inducerende co-oplosmiddel, trifluorethanol, een concentratie van 30% (vol/vol) bereikt, voor zowel het oorspronkelijk hiruloog als analoog B2 in hoofdzaak de maximale hoeveelheid helix wordt gevormd, waarbij 20 de gemiddelde hoeveelheid aan helix voor het oorspronkelijke hiruloog ongeveer 10% en voor het analoog B2 in hoofdzaak 0% bedraagt. Het oorspronkelijke hiruloog en het analoog B2 vertonen geen a-helix-vor-ming bij afwezigheid van het helix-inducerende TFE. Het hiruloog-ana-loog B2 heeft vrijwel geen a-helix, zelfs niet bij TFE-concentraties 25 van 80%.

1003284 34

Tabel C

TFE-titratie-gegevens % TFE [_]222 voor oorspronkelijk [_]222 voor analoog B2 5 hiruloog 0 -1120 - 989 10 -3679 -1313 10---

20 -5458 -I58O

30 -6972 -1848 15 40 -8365 -1896 50 -8493 -1963

20 Voorbeeld IX

In vitro elektrotransport-flux van hirulooe-B2

Hiruloog-B2 werd gesynthetiseerd met behulp van standaardwerkwijzen. Zie b.v. Maraganore et al., Thromb. Haemostasis. (1991) 65:8λ0: 25 Bode et al., ΕΜΒ0 J. (1989) fi:3467-3475; en de Internationale publika-tie WO 92/13952. De transdermale elektrotransport-flux van hiruloog-B2 werd geëvalueerd met behulp van onder verhitten afgescheiden menselijke epidermis. Daarnaast werden ook hydrogelformuleringen met behulp van de menselijke epidermis onderzocht, alsook het effect van de 30 stroomdichtheid op de transdermale geneesmiddel-flux. De transdermale hiruloog-B2-flux werd bepaald met behulp van waterige oplossingen, bereid met zowel als zodanig ontvangen alsook ontzouten geneesmiddelen, met acetaatbuffer met een ionsterkte van 10 mM gebufferd, pH 5. De onderzoeken naar de hiruloog-B2-flux werden uitgevoerd bij een 35 stroomdichtheid van 0,1 mA/cm2. Met behulp van 15 mM NaCl, met acetaat op pH 5 gebufferd, als de receptor-oplossing werd een elektrotransport-flux in de stationaire toestand van ongeveer 19 pg.uur'1 .cm'2 en 17 pg.uur*1 .cm"2 verkregen voor respectievelijk de ontzouten en als zodanig ontvangen geneesmiddel-oplossingen.

40 De variatie in de hiruloog-B2-flux voor huidmonsters van een enkele donor, alsook van meerdere donoren, scheen ongeveer 15 tot 40% te zijn, hetgeen binnen de variatie-trajecten ligt die zijn waargenomen voor peptiden en eiwitverbindingen.

1003264 35

Voor de hydrogel-onderzoeken werden geneesmiddelen in de hydrogel -schijf jes geabsorbeerd en werden de schijfjes samengesteld in behuizingen van schuimstof. Geneesmiddel-oplossingen werden ofwel zoals ontvangen (11 mM hiruloog-B2 in 20 mM acetaat) ofwel ontzout (4 5 mM hiruloog-B2 in 4 mM acetaat) in de gels geabsorbeerd. Er werd een gemiddelde elektrotransport-flux in de stationaire toestand van ongeveer 27 pg.uur_1.cm'2 verkregen met de hydrogel-formuleringen, die ofwel het als zodanig ontvangen ofwel het ontzoutte geneesmiddel bevatten.

10 Met behulp van hydrogels, waarin als zodanig ontvangen genees middelen zijn geabsorbeerd, werd een ander experiment uitgevoerd, teneinde het effect van de stroomdichtheid op de transdermale hiru-loog-B2-flux te evalueren. Een toename van de stroomdichtheid resulteerde over het traject van de onderzochte stroomdichtheden in een 15 overeenkomstige toename van de hiruloog-B2-flux. Onder passieve omstandigheden (geen stroom) werd geen meetbare hiruloog-B2-flux waargenomen .

Voorbeeld X

20 In vivo elektrotransport-flux van hiruloog-B2 A. Intraveneuze toediening van hiruloog-B2

De varkens, die werden gebruikt voor de intraveneuze (IV) onderzoeken, wogen ll±lkg(n = 3)en werden de nacht vóór de bolus-in-25 jecties niet gevoerd. De IV-bolus-injecties werden toegediend in de oor-ader of de vena cava. De IV-injectie werd in ongeveer 30 tot 60 seconden toegediend en de dosis bedroeg ongeveer 0,3 mg/kg (in 0,5 ml). Bij alle varkens namen de plasma-hiruloog-B2-spiegels, na de IV-bolus-injectie met hiruloog-B2, snel toe en bereikten, op het monster-30 punt van 15 minuten, een gemiddeld piekniveau van 66 ± 6 ng/ml. 2 uur na de bolus-injectie waren de plasma-hiruloog-B2-spiegels gedaald tot minder dan 2 ng/ml en deze bleven gedurende 2 tot 8 uur na de bolusinjectie betrekkelijk constant. De eliminatie-halveringstijd en de verwijdering, berekend voor elk varken, worden getoond in tabel D. Uit 35 de IV-bolus-gegevens werd berekend dat de schijnbare volume van de verdeling en de gemiddelde eliminatie-halveringstijd respectievelijk 45,4 1 en 16 minuten bedroegen.

1003284 36

Tabel D

Farmacokinetica van hiruloog-B2 bij varkens

Definitieve Varken Varken Varken Gemiddeld SD

5 Fase 303 304 305

IV

BW [kg] 12 11 10 11 1

Ke [1/uur] 2,42 2,01 2,5 2,31 0.26 10 V [1] 45,5 49,25 41,55 45,43 3.85 V [l/kg] 3.8 4,5 4,2 4,2 0,35 CL [1/uur] 110 99 104 104 5.5 CL [1/uur/kg] 9.2 9.0 10,4 9,5 0,76

Eliminatie 17,2 20,72 16,6 l8,2a 2,23a 15 T1/2 [min] l6b

SC

Eliminatie -- — — 58b T1/2 [min] 20------

4-ETS

Eliminatie — — -- 28b T1/2 [min]

Accumulatie — -- — 38b 25 T1/2 [min]

Onderzoeks- Varken

fase SC-3A

30 3“ETS

Eliminatie 32 T1/2 [min]

Accumulatie 33

Ti/2 [min] 35 --- 8 Gemiddelde berekend uit de afzonderlijke T1/2-bepalingen. b Berekend uit de lineaire regressie van de kromme van de gemiddelde hiruloog-B2-plasma-concentratie versus de tijd.

40 B. Subcutane toediening van hiruloog-B2 Vóór de subcutane (SC) injecties werden de varkens een nacht niet gevoerd. In een minuut werd ongeveer 0,5 mg/kg (in 0,5 ml) hiruloog-B2 SC toegediend. Plasma-hiruloog-B2-spiegels piekten in het eerste uur na de toediening op 57 ± 10 ng/ml en namen daarna af. De gemiddelde 45 eliminatie-halveringstijd na de SC-injectie bedroeg 58 minuten (tabel D). 6 uur na de SC-injectie bedroegen de plasma-hiruloog-B2-spiegels ongeveer 2 ng/ml en deze waren betrekkelijk constant gedurende 6 tot 8 uur.

1003284 37 C. Elektrotransport van hiruloog-B2

Het elektrotransport-systeem dat werd gebruikt voor de in vivo afgifte van hiruloog-B2 omvatten een geneesmiddel-bevattende eenheid die kan worden weggegooid, die in elektrisch contact staat met een 5 opnieuw te gebruiken stroomregelingsinrichting. De geneesmiddel bevattende eenheid die kan worden weggegooid bestond uit een gelamineerde hechtschuimband van polyetheen van medische kwaliteit, die zowel de anodische tegenelektrode van zilverfoelie als de kathodische elektrode van een met AgCl geladen polyisobu teen-foei ie en de respectievelijke 10 gels bevat. De anode-gel maakte contact met de zilverfoelie-anode. De kathodische grensvlak-gel maakte contact met de kathodische elektrode van AgCl. De grensvlakgel was door een kationenuitwisselingsmembraan van de geneesmiddel bevattende donorgel gescheiden. De donorgel werd net vóór de toepassing van het systeem in de kathode-uitsparing van de 15 gelbehuizing geplaatst.

De geneesmiddel-gels werden de dag vóór het elektrotransport met hiruloog-B2 in acetaatbuffer (10 mM, pH 5) geabsorbeerd, waarbij een uiteindelijke concentratie van 5 ®M peptide werd verkregen. Het contactoppervlak met de huid bedroeg voor elke geneesmiddel-gel 6 cm2. De 20 toegepaste stroomdichtheid bedroeg 0,1 mA/cm2.

De elektrotransport-systemen werden onderzocht op stroom en spanning tijdens het elektrotransport, teneinde de elektrische continuïteit van het systeem te waarborgen. De waarden van de spanning waren kenmerkend voor dit diermodel en gaven een aanvankelijke afname aan, 25 gevolgd door betrekkelijk constante waarden over de duur van het onderzoek. De gemiddelde eliminatie-halveringstijd na het beëindigen van het elektrotransport bedroeg 28 minuten (tabel E). De gemiddelde accu-mulatie-halveringstijd bij het begin van het elektrotransport bedroeg 38 minuten. Plasma-hiruloog-B2-spiegels piekten na *4 uur van continu 30 elektrotransport met 23 ± 6 ng/ml. De plasma-hiruloog-B2-spiegels bleven betrekkelijk stabiel, bij 21 ± 7 ng/ml, gedurende 2 tot 6 uur elektrotransport en namen een weinig af na 8 uur. De schijnbare afname van de plasma-hiruloog-B2-spiegels na 6 tot 8 uur van elektrotransport kan het gevolg zijn van hiruloog-B2-depletie in de donor-hydrogel. Een 35 snelle afname van de plasma-hiruloog-B2-spiegels trad op na het beëindigen van het elektrotransport. 2 uur na het beëindigen van het elektrotransport bedroegen de hiruloog-B2-plasma-spiegels ongeveer 2 ng/ml.

1003284 38

De gemiddelde eliminatie uit de drie elektrotransportsystemen na de beëindiging van het elektrotransport bedroeg 32 minuten, terwijl de gemiddelde accumulatie-halveringstijd aan het begin van het elektrotransport 33 minuten bedroeg (tabel E). De plasma-hiruloog-B2-spiegel 5 piekte na 2 uur van elektrotransport met 9 ng/ml, waarna er een langzame afname van de plasma-hiruloog-B2-spiegels optrad.

De transdermale fluxsnelheden, berekend als zowel een toevoer-snelheid (pg/uur) als een flux per oppervlakte-eenheid (pg/cm2uur), werden berekend onder toepassing van zowel een-compartiment- als non-10 compartiment-analyses. Bij de non-compartiment-analyse wordt de transdermale geneesmiddel-flux berekend uit de concentratie van het geneesmiddel in het bloed van het dier, waarbij de concentratie met behulp van standaardwerkwijzen wordt gemeten, en de bekende snelheid waarmee het desbetreffende geneesmiddel uit het bloed wordt verwijderd. Bij de 15 een-compartiment-analyse wordt de transdermale geneesmiddel-flux berekend uit de (gemeten) concentratie van het geneesmiddel in het bloed van het dier, onder de aanname dat de absorptie van het geneesmiddel, toegediend door middel van IV-afgifte, door het dier bij elke snelheid hetzelfde is als wordt bereikt door middel van elektrotransport-toe-20 diening, teneinde een bepaalde concentratie van het geneesmiddel in het bloed te verkrijgen. De een-compartiment- en non-compartiment-modellen worden besproken in Pharmacokinetics, M. Gibaldi, 2e uitgave.

Marcel Dekker (1982), blz. 1-5 en 319~322. De transdermale toevoerflux en de flux per oppervlakte-eenheid, onder toepassing van beide analy-25 ses, worden getoond in tabel E. Er werd berekend dat de gemiddelde toevoersnelheid 1873 * pg/uur en dat de flux 78 ± 18 pg.uur'1 .cm'2 bedroeg, voor vier ETS-(hiruloog-B2)-systemen, onder toepassing van het een-component-model. Met behulp van non-compartiment-analyse werd berekend dat de toevoersnelheid 1900 523 pg/uur en de flux 79 * 22 30 pg.uur*1 .cm"2 bedroeg, voor vier ETS-(hiruloog-B2)-systemen. Voor het dier in onderzoeksfase 2, dat drie ETS-(hiruloog-B2)-systemen kreeg, werd een gemiddelde flux van 22 pg.uur"1 .cm'2 berekend.

1003284 39

Tabel E

Berekende elektrotransport-toevoersnelheden en -flux voor hiruloog-B2 in varkens

5 Definitieve Varken Varken Varken Gemiddeld SD

Fase 303 304 305 4-ETS (een-compartiment) 10 Ka [1/uur] 3.64 2,5 2,94 3.03 0,58

Snelheid [pg/uur] 1361 2096 2161 1873 444

Flux [pg/cm2uur] 56,7 87,3 90,0 78,0 18,5 4-ETS (non-15 compartiment)

Snelheid [pg/uur] 1396 1866 2440 1900 523

Flux [pg/cm2uur] 58,2 77.8 101,7 79.2 21,8

Onderzoeks- Varken

20 fase SC-3A

3-ETS (een-compartiment)

Ka [1/uur] 3,15 25 Snelheid [pg/uur] 392

Flux [pg/cm2uur] 21,8 3-ETS (non-compartiment) 30 Snelheid [pg/uur] 412

Flux [pg/cm2uur] 22,9 i 1003284

Claims (12)

1. Werkwijze voor de bereiding van een analoog van een oorspronkelijk polypeptide met een a-helix- en/of een β-plaat-segment, met het 5 kenmerk, dat men: een of meer aminozuurresten van het oorspronkelijke polypeptide door een andere aminozuurrest vervangt, waardoor een of meer a-helix-en/of β-plaat-segmenten van het oorspronkelijke polypeptide worden verstoord, waarbij het polypeptide-analoog, vergeleken met het oor-10 spronkelijke polypeptide, een betere of toegenomen elektrotrans-porteerbaarheid vertoont, met dien verstande dat het polypeptide-analoog niet de aminozuursequentie heeft die is aangegeven in figuur 1B.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij men een zure rest door een aminozuurrest met een lagere Ρα-waarde vervangt. 15

3· Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij de aminozuurrest met de lagere Ρα-waarde wordt gekozen uit Pro, Gly en Asn.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij men een aminozuurrest door een aminozuurrest met een lagere Ρβ-waarde vervangt.

5· Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij het aminozuurrest met 20 de lagere Ρβ-waarde wordt gekozen uit Pro, Gly en Asp.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5. waarbij het polypeptide-analoog ten minste ongeveer dezelfde biologische activiteit vertoont als het oorspronkelijke polypeptide.

7· Werkwijze volgens een der conclusies 1-6, waarbij het oor-25 spronkelijke polypeptide een parathyroïde-hormoon-molecule (PTH) is, zoals weergegeven in figuur IA.

8. Werkwijze volgens conclusie 7. waarbij het polypeptide-analoog een van de PTH-analogen is die zijn weergegeven in de figuren IB, 1C en 1D. 30

9· Werkwijze volgens een der conclusies 1-6, waarbij het oor spronkelijke polypeptide een hiruloog is, zoals weergegeven in figuur 2A.

10. Werkwijze volgens conclusie 9· waarbij het polypeptide-analoog hiruloog-B2 is, zoals weergegeven in figuur 2C.

11. Werkwijze voor het vervaardigen van een elektrotransport- inrichting voor de afgifte van een polypeptide door een lichaamsoppervlak door middel van elektrotransport, waarbij men een therapeutisch werkzame hoeveelheid van het polypeptide in een donorreservoir van de 1003284 * elektrotransport-inrichting brengt, met het kenmerk, dat men als polypeptide het volgens' de werkwijze van een der conclusies 1-10 verkregen polypeptide-analoog toepast.

12. Analoog van een parathyroïde-hormoon (PTH), dat de aminozuur-5 sequentie omvat die is weergegeven in de figuren 1C of 1D. 1903284