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"Procédé pour augmenter le flux d'électrotransport de polypeptides"
L'invention est relative d'une manière générale à la délivrance de médicament par électrotransport.
Plus particulièrement l'invention est relative à un procédé pour augmenter un flux d'électrotransport d'un polypeptide par réduction du potentiel du polypeptide à former des segments en hélice a ou des segments en feuille ss. L'invention concerne également des molécules qui ont été ainsi modifiées.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIOUE
Une délivrance transdermique (c'est-à-dire à travers la peau) d'agents thérapeutiques offre une technique confortable, appropriée et non invasive à l'administration de médicaments. Le procédé procure plusieurs avantages par rapport aux modes conventionnels de délivrance de médicament. Par exemple des vitesses variables d'absorption et un métabolisme (par exemple hépatique) rencontrés dans le traitement par voie orale sont évités et d'autres inconvénients inhérents, par exemple une irritation gastro-intestinale et analogues, sont éliminés.
La délivrance transdermique permet également un haut degré de contrôle des concentrations sanguines en un médicament particulier et elle est une voie d'administration spécialement attractive pour des médicaments ayant des indices thérapeutiques étroits, de courtes demi-vies et des activités puissantes.
La délivrance transdermique peut être soit passive, soit active. Plusieurs médicaments ne sont pas appropriés pour une délivrance de médicament transdermique passive à cause de leur dimension, de leurs caracté-
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ristiques de charge ionique et leur caractère hydrophobe. Un procédé pour surmonter cette limite consiste à utiliser de faibles niveaux de courant électrique pour transporter activement des médicaments dans le corps à travers une peau intacte.
Cette technique est connue sous le nom de délivrance de médicament par"électro- transport"ou"ionophorèse". La technique procure un procédé plus contrôlable qu'une délivrance de médicament transdermique passive puisque l'amplitude, le réglage dans le temps et la polarité du courant électrique appliqué sont aisément réglés en utilisant des composants électriques standards. Sous ce rapport, le flux de médicament par électrotransport peut être de 50 % à plusieurs ordres de grandeur plus grand qu'un flux transdermique passif du même médicament.
Des dispositifs d'électrotransport emploient d'une manière générale au moins deux électrodes. Ces deux électrodes sont situées en contact électrique intime avec une certaine partie de la peau du corps. Un électrode, appelée l'électrode active ou donneuse, est l'électrode à partir de laquelle l'agent thérapeutique est délivré dans le corps. L'autre électrode, appelée la contre-électrode ou électrode de retour, sert à fermer le circuit électrique à travers le corps. Conjointement à la peau du patient, le circuit est achevé par connexion des électrodes à une source d'énergie électrique, par exemple une batterie, et habituellement à des éléments de circuit capables de commander un passage de courant à travers le dispositif.
En fonction de la charge électrique de l'espèce à délivrer par voie transdermique, soit l'anode soit la cathode peut être l'électrode active ou donneuse. Sous ce rapport, si la substance ionique à amener dans le corps est chargée de manière positive, alors l'électrode positive (l'anode) est l'électrode active et l'électrode négative (la cathode) sert de contre-élec-
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trode, en achevant le circuit. D'autre part, si la substance ionique à délivrer est chargée négativement, l'électrode cathodique est alors l'électrode active et l'électrode anodique sera la contre-électrode. D'une autre manière, à la fois l'anode et la cathode peuvent être utilisées pour délivrer des médicaments de charge appropriée dans le corps. Dans ce cas, les deux électrodes sont considérées comme étant des électrodes actives ou donneuses.
En d'autres mots, l'électrode anodique peut délivrer des agents chargés de manière positive dans le corps tandis que l'électrode cathodique peut délivrer des agents chargés de manière négative dans le corps.
Des dispositifs d'électrotransport existants demandent en supplément un réservoir ou source de l'agent thérapeutique qui est à délivrer dans le corps.
De tels réservoirs à médicament sont connectés à l'anode ou à la cathode du dispositif d'électrotransport pour fournir une source fixe ou renouvelable d'un ou de plusieurs agents ou espèces souhaités. Comme exemples de réservoirs et sources on peut citer une poche, comme décrit dans le US-A-4.250. 878, un corps à base de gel préformé, comme décrit dans le US-A-4.382. 529, et un récipient en verre ou en matière plastique contenant une solution liquide du médicament, comme décrit sur les figures du US-A-4.722. 726.
La délivrance par électrotransport transdermique de peptides, de polypeptides et de protéines est d'un intérêt particulier étant donné les problèmes rencontrés par des voies d'administration de médicament plus communes, comme l'administration par voie orale. Les molécules de polypeptides et de protéines sont hautement susceptibles d'une dégradation par des enzymes protéolytiques dans le tractus gastro-intestinal et elles sont soumises à un métabolisme hépatique accentué lorsqu'elles sont prises oralement. Les polypeptides et
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protéines demandent habituellement une administration parentérale pour obtenir des niveaux thérapeutiques dans le sang du patient. Les techniques d'administration parentérale les plus conventionnelles sont les injections hypodermiques et l'administration par voie intraveineuse.
Cependant, les polypeptides et protéines ont une action courte, de façon inhérente, dans leur activité biologique, ce qui demande de fréquentes injections, souvent plusieurs fois par jour, pour maintenir les niveaux thérapeutiquement efficaces nécessaires.
Les patients trouvent fréquemment ce régime de traitement comme étant incommode et douloureux, avec un risque associé par exemple d'infection.
Beaucoup d'efforts ont été faits pour trouver d'autres voies (autres que des injections parentérales) pour administrer de manière efficace des polypeptides et protéines pharmaceutiques. Les voies d'administration avec moins d'effets secondaires ainsi qu'une meilleure commodité pour le patient ont été d'un intérêt particulier. De telles voies alternatives ont généralement compris une administration orale"protégée"dans laquelle le polypeptide/protéine est libéré d'une capsule ou d'un autre récipient après passage à travers le milieu à faible pH de l'estomac, une délivrance à travers les tissus muqueux, par exemple les tissus muqueux des poumons avec des inhalateurs ou les tissus muqueux nasaux avec des pulvérisateurs nasaux, et des pompes implantables.
Malheureusement actuellement, ces voies alternatives de délivrance de polypeptides/protéines ont rencontré seulement un succès limité.
Une délivrance par électrotransport de polypeptides et de protéines a également rencontré des difficultés techniques. Par exemple, l'eau est le solvant liquide préféré pour former la solution du médicament délivré par électrotransport, à la suite de son excellente biocompatibilité. La peau contient des
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enzymes protéolytiques qui peuvent dégrader le polypeptide/protéine lorsqu'il est délivré par voie transdermique. De plus, certains polypeptides/protéines, en particulier ceux qui ne sont pas naturels à l'animal en traitement, peuvent causer des réactions de la part de la peau, par exemple une sensibilisation ou une irritation.
Un certain nombre de chercheurs ont décrit la délivrance par électrotransport de polypeptides et de protéines. Une étude ancienne de R. Burnette et coll., J. Pharm. Sci., vol. 75 (1986) 738, a développé la perméation à travers la peau in vitro d'une hormone libérant de la thyrotropine, une petite molécule de tripeptide. On a constaté que le flux d'électrotransport était supérieur au flux par diffusion passive.
Chien et coll., J. Pharm. Sci., vol. 78 (1988) 376, ont montré, à la fois dans des études in vitro et in vivo, qu'une délivrance transdermique de vasopressine et d'insuline par électrotransport était possible. Voir aussi Maulding et coll., U. S. Statutory Invention Registration No. H1160, qui décrivent une délivrance par électrotransport de calcitonine dans des cochons nains.
Un certain nombre d'approches (autres que simplement augmenter les niveaux appliqués de courant d'électrotransport) ont été utilisées pour augmenter le flux d'électrotransport transdermique de médicaments à base de polypeptide et de protéine. Une approche développe l'utilisation d'activeurs de flux, comme des agents tensioactifs ioniques. Voir par exemple le US-A- 4.722. 726. Une autre approche utilise des cosolvants autres que justement de l'eau pour activer le flux d'électrotransport. Voir par exemple la EP-A-0 278 473. Une autre approche encore développe une rupture mécanique de la couche externe (c'est-à-dire la couche cornée) de la peau avant la délivrance par électrotransport.
Voir le US-A-5.250. 023.
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D'autres approches pour accroître le flux de médicament par électrotransport transdermique développent la création d'un promédicament ou d'un analogue du médicament intéressant et l'électrotransport du promédicament ou de l'analogue modifié. Par exemple, la WO- 92/12999 décrit une délivrance d'insuline sous la forme d'un analogue d'insuline ayant une tendance réduite à s'auto-associer (les formes apparemment associées d'insuline présentes dans des compositions pharmaceutiques conventionnelles réduisent la délivrance transdermique de l'insuline). Les analogues sont créés par substitution de l'acide aspartique (Asp) ou de " 1'acide glutamique (Glu) à d'autres radicaux d'acide aminé dans des positions sélectionnées le long de la chaîne polypeptidique de l'insuline.
La WO 93/25197 décrit une délivrance de médicaments à la fois peptidiques et non peptidiques, sous la forme de complexes d'agent pharmaceutique-modificateur ou de promédicaments dans lesquels un agent modificateur chimique (par exemple un fragment chargé) est lié de manière covalente à l'agent pharmaceutique parental. La liaison covalente est brisée après que l'agent est délivré dans le corps, en libérant ainsi l'agent parental.
En dépit des approches ci-dessus, certains polypeptides montrent encore un pauvre flux d'électrotransport transdermique. En particulier, le caractère hydrophobe des peptides est connu pour avoir un impact négatif sur le flux d'électrotransport in vitro. Différents paramètres contribuent au caractère hydrophobe, y compris la structure primaire d'une protéine, c'est-à-dire la séquence des acides aminés de la molécule, ainsi que la structure secondaire de la protéine, c'est-à-dire l'agencement récurant, régulier, de la chaîne polypeptidique dans les trois dimensions. Une telle conformation peut prendre la forme de structures hélicoïdales, comme une hélice a, ou une conformation en
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zigzag, plus étendue, connue sous le nom de conformation ss.
L'hélice a présente approximativement 3,6 radicaux par spire de l'hélice. Les groupes R des acides aminés s'étendent vers l'extérieur de l'hélice et des liaisons d'hydrogène intrachaîne sont formées entre l'oxygène des carbonyle du squelette de chaque radical et un atome d'hydrogène de squelette attaché à l'azote électronégatif du quatrième radical le long de la chaîne. L'unité de base de la conformation ss est le brin ss qui existe sous la forme d'une hélice enroulée de manière moins serrée, avec 2,0 radicaux par spire.
La conformation du brin ss est stable uniquement lorsqu'elle est incorporée dans une feuille ss où des liaisons d'hydrogène ayant une géométrie proche de l'optimale sont formées entre les groupes peptidiques de brins ss adjacents ; les moments dipolaires des brins sont également alignés favorablement. Des chaînes latérales provenant de radicaux adjacents du même brin font saillie à partir de côtés opposés de la feuille et ils n'interagissent pas l'un sur l'autre, mais ils ont des interactions importantes avec leur squelette et avec les chaînes latérales de brins voisins. Pour une description générale des hélices a et feuilles ss, voir par exemple T. E. Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993), et A.
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Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 1975).
Les paramètres de Zimm-Bragg, s et a (B. H. Zimm et J. K. Bragg J. Chem. Phys. (1959) 31 : 526-535), et les équations de Lifson-Roig (S. Lifson et A. Roig J.
Chem. Phys. (1961) 34 : 1963-1974) sont habituellement utilisés pour déterminer la stabilité d'un segment hélicoïdal dans un polypeptide donné. S représente la constante de stabilité de l'enroulement d'hélice et a est le facteur de nucléation. Sur base de ces paramètres, la probabilité que certaines régions de molécules
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polypeptidiques forment des hélices a et des feuilles ss peut être prédite en utilisant divers calculs et programmes d'ordinateur. Voir par exemple Finkelstein, A. V. Program"ALB"for protein and polypeptide secondary structure calculation and prédiction (1983). Déposé à la Brookhaven Protein Data Bank, Upton, N. Y. et à l'EMBL, Heidelberg, Allemagne, Finkelstein, A. B. Biopolymers (1977) 16 : 525-529, Finkelstein et coll. Proteins : Structure, Function and Genetics (1991) 10 : 287-299.
De plus, les probabilités de Chou-Fasman (Chou, P. Y. et Fasman, G. D. Ann. Rev. Biochem. (1978) 47 : 251-276) ont été utilisées pour apprécier la propension d'un radical d'acide aminé particulier à favoriser ou défavoriser une formation en hélice a et en feuille ss.
Cependant, ces principes n'ont pas été appliqués précédemment pour altérer les propriétés hydrophobes d'un polypeptide donné, en vue d'augmenter le flux d'électrotransport de celui-ci.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Suivant la présent invention le flux d'électrotransport d'un polypeptide donné est accru par rupture de sa structure secondaire. En particulier, des radicaux d'acides aminés connus pour stabiliser des segments d'hélice a et de feuille ss peuvent être remplacés par des radicaux déstabilisants et des agents de rupture d'hélice connus. De cette manière, le flux du polypeptide à travers une surface de corps (par exemple la peau) peut être augmenté, en permettant une délivrance par électrotransport d'une gamme plus large de médicaments polypeptidiques à des vitesses thérapeutiquement efficaces.
Conformément à cela, suivant une forme de réalisation, l'invention est relative à un procédé de réalisation d'un analogue d'un polypeptide parental présentant un segment d'hélice a et/ou de feuille ss, l'analogue montrant une capacité d'électrotransport
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meilleure/accrue à travers une surface de corps, ce procédé comprenant une substitution d'un ou de plusieurs radicaux d'acides aminés du polypeptide parental dans le polypeptide analogue pour rompre un ou plusieurs segments d'hélice a et/ou de feuille B du polypeptide parental. Le polypeptide analogue offre un électrotransport accru en comparaison du polypeptide parental.
Suivant une forme de réalisation supplémentaire, l'invention concerne un procédé de délivrance d'un agent polypeptidique à travers une surface de corps. Le procédé comprend (a) une formation d'un analogue d'un polypeptide parental, ce polypeptide parental comprenant un segment d'hélice a et/ou de feuille B, le polypeptide analogue présentant un ou plusieurs radicaux d'acides aminés substitués par rapport au polypeptide parental et (b) une délivrance par électrotransport du polypeptide analogue à travers la surface de corps.
Suivant des formes de réalisation particulièrement préférées, la rupture est faite par substitution d'un ou de plusieurs radicaux d'acide aminé du polypeptide parental, un ou plusieurs radicaux d'acide aminé ayant une valeur de Pa ou de PB plus faible que le radical d'acide aminé parental.
Suivant une autre forme de réalisation, l'invention a pour but un analogue d'hormone parathyroïdienne (PTH) comprenant la séquence d'acides aminés illustrée sur la Figure 1 C.
Suivant encore une autre forme de réalisation, l'invention concerne un analogue d'hormone parathyroïdienne (PTH) comprenant la séquence d'acides aminés illustrée sur la Figure 1 D.
La présente invention ne couvre pas l'analogue de PTH dans lequel Met, est subtitué par Leu, Leul5 par Arg, Metl8 par Leu, Glu, par Arg, Glu par Arg, Glu par Lys, Phe34 par Tyr, une lactone d'homosérine étant présente à la terminaison C du peptide (figure 1B).
Ces formes de réalisation de la présente invention ainsi que d'autres apparaîtront aisément à l'homme de métier à la lumière de la description non limitative qui suit.
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La figure 1 représente la séquence d'acides aminés de différentes molécules d'hormone parathyroï- dienne (PTH) utilisées pour illustrer l'invention par des exemples. La figure 1A montre la séquence d'acides aminés du polypeptide PTH parental de type sauvage. La figure 1C montre la séquence d'acides aminés de l'analogue 1C de PTH (1-35). La figure 1D montre la séquence d'acides aminés de l'analogue 1D de PTH (1-35). HSL signifie de l'homosérine/lactone d'homosérine. Les radicaux soulignés sur les figures 1C et 1D indiquent les positions de substitution.
La figure 2 représente les séquences d'acides aminés de différents polypeptides dérivés de l'hirudine et utilisés à titre d'exemples de l'invention. La figure 2A montre la séquence d'acides aminés d'un polypeptide parental hirulog. La figure 2B montre la séquence d'acides aminés de hirulog-1. La figure 2C montre la séquence de hirulog-B2.
La figure 3 est une vue schématique d'un dispositif de délivrance de médicament par électrotransport représentatif, qui peut être utilisé suivant la présente invention.
La figure 4 représente un graphique du caractère elliptique résiduaire moyen de plusieurs analogues d'hormone parathyroïdienne par rapport à une concentration de trifluoroéthanol.
La figure 5 représente un graphique du caractère elliptique résiduaire moyen de deux polypeptides dérivés d'hirudine par rapport à une concentration de trifluoroéthanol.
La pratique de la présente invention emploie, à moins que cela ne soit indiqué autrement, des procédés conventionnels de chimie des protéines, d'électrochimie, de biologie moléculaire et de techniques d'ADN recombinant, connus de l'homme de métier. Ces techniques sont expliquées complètement dans la littérature. Voir par
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exemple T. E. Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993). A. L.
Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 1975), J. S. Newman, Electrochemical Systems (Prentice Hall, 1973), A. J. Bard et L. R. Faulkner, Electrochemical
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Methods, Fundamentals and Applications (John Wiley & Sons, 1980), Sambrook et coll., Molecular Clonincf : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
Il faut noter que, lorsque cela est utilisé dans la description et les revendications annexées, les formes singulières"un","une","le"et"la"comprennent des références plurielles à moins que le contenu ne le dicte clairement d'une autre manière. Donc, par exemple, faire référence à"un polypeptide"comprend un mélange de deux ou de plusieurs polypeptides, etc.
I. DEFINITIONS
Dans la description de la présente invention, les termes suivants sont employés et ils sont destinés pour être définis comme indiqué ci-dessous.
Ici, les termes"électrotransport","ionopho- rèse"et"ionophorétique"sont utilisés pour se référer à la délivrance à travers une surface de corps (par exemple la peau) d'un ou de plusieurs agents polypeptidiques pharmaceutiquement actifs au moyen d'une force électromotrice appliquée à un réservoir contenant l'agent. L'agent peut être délivré par électromigration, électroporation, électro-osmose ou une combinaison quelconque de celles-ci. L'électro-osmose a aussi été désignée par électrohydrocinèse, électroconvection, et osmose électriquement induite.
En général, une électroosmose d'une espèce dans un tissu résulte de la migration d'un solvant dans lequel l'espèce est contenue, à la suite de l'application d'une force électromotrice au réservoir de l'espèce thérapeutique, c'est-à-dire du flux de solvant induit par électromigration d'autres espèces ioniques. Pendant le processus d'électrotrans-
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port, certaines modifications ou altérations de la peau peuvent apparaître, comme la formation de pores existant transitoirement dans la peau, ce que l'on appelle également"une électroporation". N'importe quel transport électriquement assisté d'espèces, qui est accru par des modifications ou altérations à la surface du corps (par exemple formation de pores dans la peau), est également inclus dans le terme de"électrotransport"tel qu'utilisé ici.
Donc, lorsqu'on les utilise ici, les termes"électrotransport","ionophorèse"et"ionophoré- tique"désignent (1) la délivrance d'agents chargés par électromigration, (2) la délivrance d'agents non chargés par le processus d'électro-osmose, (3) la délivrance d'agents chargés ou non chargés par électroporation, (4) la délivrance d'agents chargés par les processus combinés d'électromigration et d'électro-osmose et/ou (5) la délivrance d'un mélange d'agents chargés et non chargés par les processus combinés d'électromigration et d'élec- tro-osmose.
Les termes de"polypeptide","agent polypepti- dique"et"médicament à base de polypeptide"sont utilisés de manière interchangeable ici pour désigner tout polymère bioactif de radicaux d'acide aminé. Les termes comprennent des peptides, des oligopeptides, des dimères, des multimères et des matières analogues. Ces polypeptides peuvent être dérivés de sources naturelles ou ils peuvent être synthétisés ou produits par recombinaison. Les termes comprennent également des modifications post-expression du polypeptide, par exemple une glycosylation, une acétylation, une phosphorylation, etc.
Un médicament ou agent polypeptidique, tel que défini ici, est généralement constitué des 20 acides aminés naturels Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gln (Q), Glu (E), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr
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(T), Trp (W), Tyr (Y) et Val (V) et il peut aussi comprendre un quelconque des nombreux analogues connus d'acides aminés, à la fois ceux apparaissant naturellement et les analogues synthétisés, comme, d'une manière non limitative, de l'homoisoleucine, de l'asaleucine, de la 2- (méthylènecyclopropyl) glycine, de la S-méthylcystéine, de la S- (prop-I-ényl) cystéine, de l'homosérine, de l'ornithine, de la norleucine, de la norvaline, de l'homoarginine, de la 3- (3-carboxyphényl) alanine, de la cyclohexylalanine, de la mimosine, de l'acide pipécolique,
de l'acide 4-méthylglutamique, de la canavanine, de l'acide 2,3-diaminopropionique et des matières analogues. D'autres exemples d'agents polypeptidiques qui trouvent usage dans la présente invention sont donnés dans la suite.
Par polypeptide, agent polypeptidique ou médicament à base de polypeptide"parental", il faut entendre un polypeptide tel que défini ci-dessus qui comprend des segments en hélice a ou en feuille ss qui peuvent être modifiés de telle façon que le flux d'électrotransport du polypeptide soit accru. En particulier, un polypeptide parental comprend d'une manière générale d'environ 10 à environ 50 radicaux d'acides aminés, de préférence d'environ 10 à environ 40 radicaux d'acides aminés. De plus, le polypeptide parental est un qui n'est pas enclin à adopter une structure pliée tertiaire stable en solution, par exemple comme résultat d'une haute concentration de radicaux Cys.
Le polypeptide parental peut être un polypeptide qui apparaît dans la nature ou il peut lui-même avoir des différences structurelles par rapport à un polypeptide apparaissant dans la nature, comme des substitutions, délétions ou additions d'acides aminés ainsi que des modifications posttraductionnelles, comme décrit ci-dessus.
Par"analogue"de polypeptide il faut entendre un polypeptide tel que défini ci-dessus, qui résulte de
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la modification de la structure secondaire du polypeptide parental. Sous ce rapport, l'analogue diffère du parent par voie de substitution d'un ou de plusieurs radicaux d'acide aminé de telle façon qu'un ou plusieurs segments en hélice a et/ou en hélice ss présents dans la molécule parentale soient rompus. Les substitutions appropriées d'acides aminés sont décrites de manière plus complète ci-dessous. L'analogue peut aussi contenir des modifications supplémentaires qui n'affectent pas la structure secondaire, comme des substitutions, délétions ou additions supplémentaires d'acides aminés, ou des modifications post-traductionnelles, comme décrit ci-dessus.
L'analogue peut aussi exister sous des formes neutres ou de sels, par exemple de sels d'addition d'acide (formés avec les groupes amino libres des polypeptides analogues) et ceux qui sont formés avec des acides inorganiques, tels que par exemple des acides chlorhydrique ou phosphorique, ou des acides organiques tels que les acides acétique, succinique, maléique, tartrique, mandélique, et analogues. Des sels formés à partir de groupes carboxyle libres peuvent aussi être dérivés de bases inorganiques, comme par exemple de sodium, de potassium, d'ammonium, de calcium, ou des hydroxydes ferriques, et de bases organiques, telles que de l'isopropylamine, de la triméthylamine, du 2-éthylaminoéthanol, de l'histidine et des matières analogues.
L'analogue de polypeptide a au moins une certaine bioactivité du polypeptide parental, et de préférence il a la même bioactivité ou une bioactivité plus grande que la molécule parentale.
Par" accroissement de l'électrotransport"d'un polypeptide, il faut entendre une augmentation du flux d'électrotransport du polypeptide à travers la surface du corps (par exemple la peau ou une muqueuse), en comparaison du polypeptide parental. Le flux d'électrotransport transdermique peut être déterminé en utilisant
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un certain nombre de méthodes in vivo ou in vitro bien connues dans la technique. Les procédés in vitro comprennent un pinçage d'un morceau de peau d'un animal approprié (par exemple une peau de cadavre humain) entre les compartiments donneur et récepteur d'une cellule à flux d'électrotransport, avec le côté de la couche cornée du morceau de peau en face du compartiment donneur.
Une solution liquide ou un gel contenant le médicament à délivrer est placé en contact avec la couche cornée et un courant électrique est appliqué aux électrodes, une électrode dans chaque compartiment. Le flux transdermique est calculé par échantillonnage de la quantité de médicament dans le compartiment récepteur. Deux modèles satisfaisants, qui sont utilisés pour optimiser une délivrance de médicament par électrotransport transdermique, sont le modèle à patte de peau de cochon isolée de Riviere, M. C. Heit, et coll., J. Pharm. Sci., 82,240-243 (1993), et l'utilisation d'une peau nue isolée de rongeurs ou cochons d'Inde sans poils, par exemple voir B. W. Hadzija et coll., J. Pharm. Pharma- col., 44, 387-390 (1992).
II. MODES DE MISE EN OEUVRE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une substitution par des acides aminés qui rompent des segments en hélice a et en feuille ss d'une molécule de polypeptide pour accroître le flux d'électrotransport de cette molécule, en comparaison du flux du polypeptide parental. Le procédé permet par conséquent un électrotransport d'un grand nombre de substances qui autrement ne seraient pas capables d'une telle délivrance. Sans être lié à une théorie particulière, il apparaît que de tels changements secondaires diminuent la tendance de chaînes latérales hydrophobes de radicaux d'acides aminés, tels que Leu, Phe et Trp, à devenir spatialement agglomérées.
Donc la capacité de la molécule à se fixer à des zones hydrophobes dans la peau pendant l'électrotransport est
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réduite, ce qui facilite le passage du polypeptide à travers la peau.
La présente invention est décrite par l'utilisation, à titre d'exemple, d'une molécule d'hormone parathyroïdienne (PTH) et d'un dérivé d'hirudine comme composés parentaux. La PTH est une hormone peptidique qui règle le contrôle homéostatique du métabolisme du calcium et du phosphate et elle a été utilisée pour traiter l'ostéoporose. Une PTH de type sauvage est représentée sur la figure 1A. La molécule comporte 34 radicaux d'acides aminés et elle présente un poids moléculaire d'environ 4.000 daltons. Comme montré ici, la molécule a une très grande tendance à adopter la formation hélicoïdale a.
Le hirulog est un anticoagulant peptidique synthétique à base d'hirudine qui inhibe de manière efficace à la fois de la thrombine libre et de la thrombine liée à de la fibrine. L'hirulog a été montré comme inhibant une thrombose veineuse post-opératoire chez des patients subissant une intervention chirurgicale orthopédique. La séquence du composé hirulog parental utilisé à titre d'exemple dans la présente invention est représentée sur la figure 2A.
Comme l'utilisation des substances parentales décrites ci-dessus est donnée à titre d'exemple, la présente invention trouve également application avec une large variété d'autres protéines et agents polypeptidiques parentaux, comme d'autres polypeptides dérivés de sources eucaryotes, procaryotes et virales, ainsi que des peptides synthétiques. De tels polypeptides ont d'une manière générale d'environ 10 à environ 50 acides aminés, une structure secondaire qui peut être amenée à une manipulation et qui n'est pas encline à adopter une structure pliée tertiaire stable, par exemple à la suite d'une haute concentration de radicaux Cys.
De tels polypeptides comprennent, sans limitation, des médica-
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ments peptidiques qui sont des antibiotiques et des agents antiviraux, des antinéoplasiques, des immunomodulateurs, des hormones peptidiques comme ACTH, CRF, GHRH, de la cholécystokinine, des dynorphines, des endorphines, de l'endothéline, des fragments de fibronectine, de la galanine, de la gastrine, de l'insulinotropine, du glucagon, des fragments de protéine de fixation de GTP, de la guanyline, les leukokinines, de la magaïnine, des mastoparans, de la dermaseptine, de la systémine, des neuromédines, de la neurotensine, de la pancréastatine, un polypeptide pancréatique, une substance P, de la sécrétine, de la thymosine, et des substances analogues.
La structure secondaire du polypeptide parental est généralement manipulée par remplacement d'un ou de plusieurs radicaux d'acides aminés parentaux sélectionnés par un ou plusieurs radicaux d'acide aminé ayant une moindre tendance à former des conformations d'hélice a et/ou de feuille B. Sous ce rapport, chaque radical d'acide aminé montre des préférences de conformation.
Une mesure de la tendance relative d'un radical particulier à intervenir dans une hélice a ou un brin B a été définie par les paramètres Pa et PB (Chou, P. Y. et Fasman, G. D., Ann. Rev. Biochem. (1978) 47 : 251-276). Une liste mise à jour et révisée des valeurs de Pa et PB est donnée au Tableau 1. Les valeurs Pa dans le Tableau 1, qui sont plus grandes que 1,00, représentent des acides aminés qui favorisent des conformations hélicoïdales a et elles sont définies ici comme étant de"hautes valeurs de Pa". D'une manière semblable, les valeurs de PB dans le Tableau 1, qui sont plus grandes que 1,00, représentent des acides aminés qui favorisent une formation de brin B et elles sont définies ici comme étant de"hautes valeurs de PB".
Les acides aminés ayant des valeurs de Pa et de PB de 1,00 ou moins défavorisent ou rompent les conformations secondaires et
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elles sont définies ici comme étant des"valeurs de Pa faibles"et des"valeurs de PB faibles".
Donc, par exemple, les acides aminés Glu, Ala et Leu ont des valeurs de Pa élevées et ils favorisent une formation d'hélice, tandis que Pro, Gly, Ser, Cys, Tyr et Asn ont des valeurs de Pa faibles et par conséquent défavorisent une formation d'hélice. D'une manière semblable, les radicaux d'acides aminés Val, Ile et Tyr ont des valeurs de PB élevées et favorisent une formation de brin B, tandis que les acides aminés Pro, Asp, Asn, Glu et Gly défavorisent une telle formation. En combinant les valeurs de Pa et de PB, les acides aminés qui montrent la plus faible tendance à former ces types de structures secondaires sont Gly, Asn, Pro et Ser.
TABLEAU 1 *
EMI18.1
<tb>
<tb> Préférences <SEP> de <SEP> conformation <SEP> des <SEP> acides <SEP> aminés
<tb> Radical <SEP> d'acide <SEP> Hélice <SEP> a <SEP> Brin <SEP> ss
<tb> aminé <SEP> (P) <SEP> (PI31
<tb> Glu <SEP> 1,59 <SEP> 0,52
<tb> Ala <SEP> 1,41 <SEP> 0,72
<tb> Leu <SEP> 1,34 <SEP> 1,22
<tb> Met <SEP> 1,30 <SEP> 1,14
<tb> Gln <SEP> 1,27 <SEP> 0,98
<tb> Lys <SEP> 1,23 <SEP> 0,69
<tb> Arg <SEP> 1,21 <SEP> 0,84
<tb> His <SEP> 1,05 <SEP> 0,80
<tb> Val <SEP> 0,90 <SEP> 1,87
<tb> Ile <SEP> 1,09 <SEP> 1,67
<tb> Tyr <SEP> 0,74 <SEP> 1,45
<tb> Cys <SEP> 0,66 <SEP> 1,40
<tb> Trp <SEP> 1,02 <SEP> 1,35
<tb> Phe <SEP> 1,16 <SEP> 1,33
<tb> Thr <SEP> 0,76 <SEP> 1,17
<tb> Gly <SEP> 0,43 <SEP> 0,58
<tb> Asn <SEP> 0,76 <SEP> 0,48
<tb> Pro <SEP> 0,34 <SEP> 0,31
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
EMI19.1
<tb>
<tb> Ser <SEP> 0,57 <SEP> 0,96
<tb> Asp <SEP> 0,99 <SEP> 0,
39
<tb>
* Les données dans le Tableau 1 sont prises de T. E.
Creighton, Proteins : Structures and Molecular Proper- ties (W. H. Freeman and Company, 1993), p. 256.
Un segment d'une structure secondaire particulière est beaucoup plus probable lorsque plusieurs radicaux adjacents préfèrent cette structure. Donc, une hélice a peut être prédite si quatre de six radicaux adjacents sont favorables à une hélice et si la valeur moyenne de Pa est plus grande que 1,05 et plus grande que PB. D'une manière semblable, un brin ss est prédit si trois de cinq radicaux adjacents sont favorables à une feuille et si la valeur moyenne de PB est plus grande que 1,04 et plus grande que Pa. T. E. Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W. H.
Freeman and Company, 1993), pp. 255-257.
Donc, en utilisant ces principes, des radicaux d'acide aminé dans des parties de la molécule, qui sont enclins à une formation d'hélice a et de feuille û, peuvent être remplacés par ces radicaux du Tableau 1 qui défavorisent de telles conformations. De préférence, un radical ayant une valeur élevée de Pa ou de PB est remplacé par un radical ayant une valeur faible de Pa ou respectivement de PB.
D'autres procédés de détermination de la propension d'un polypeptide à former des segments d'hélice a et de feuille ss sont également connus. Par exemple le potentiel d'hélice a d'un polypeptide linéaire peut être estimé par exemple par les équations de Lifson-Roig (S. Lifson et A. Roig, J. Chem. Phys. (1961) 34 : 1963-1974) en utilisant des valeurs pour les paramètres de formation d'hélice résiduaire converties à partir de leurs valeurs de Zimm-Bragg calculées (Zimm, B. H. et Bragg, J. K., J. Chem. Phys. (1959) 11 : 526-535) en employant des équations de conversion de Qian et
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Schellman (Qian, H. et Schellman, J. A., J. Chem. Phys.
(1992) 96 : 3987-3994).
Plus particulièrement, les paramètres de ZimmBragg, s et a, représentent la constante de stabilité d'enroulement d'hélice et respectivement le facteur de nucléation. Un jeu de valeurs s et a de Zimm-Bragg ont été définies pour chaque radical d'acide aminé (voir Tableau 1 de Finkelstein et coll., Proteins : Structure, Function and Genetics, (1991) 10 : 287-299) et la probabilité que la chaîne polypeptidique entière (ou une certaine sous-séquence définie) adopte une hélice a peut être calculée en utilisant les équations rapportées.
Les paramètres d'hélice de Lifson-Roig correspondants, u, v et w, peuvent aussi être utilisés pour réaliser une détermination semblable (Lifton, S. et Roig, A., J. Chem. Phys., (1961) 34 : 1963-1974). Sous ce rapport, w, qui est utilisé pour définir une unité peptidique à l'intérieur d'une séquence ininterrompue d'états hélicoïdaux, peut être calculé à partir de s. v de Lifson-Roig définit une unité peptidique au commencement ou à la fin d'une séquence ininterrompue d'états hélicoïdaux et il peut être calculé à partir du paramètre a-de Zimm-Bragg. Le facteur u définit le poids statistique de la région d'enroulement et il ne correspond pas à une paramètre de Zimm-Bragg.
En utilisant ces paramètres, il y a deux calculs généralement utilisés pour estimer un potentiel d'hélice a. Le premier prend le paramètre d'initiation d'hélice de Lifson-Roig v comme étant une constante de 0,039 (c'est-à-dire que le paramètre ode Zimm-Bragg est de 0,0013 pour tous les radicaux), avec le paramètre w pour chaque acide aminé calculé à partir de la valeur s de Zimm-Bragg trouvée dans le Tableau 1 de Finkelstein et coll., Proteins : Structure, Function and Genetics, (1991) 10 : 287-299. Le deuxième calcul ne suppose pas que tous les radicaux ont la même valeur pour le paramè-
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tre d'initiation d'hélice v (c'est-à-dire que le paramètre a de Zimm-Bragg est unique pour chaque radical d'acide aminé).
En utilisant ce procédé, les valeurs s et a de Zimm-Bragg pour chaque radical peuvent être déterminées à partir du Tableau 1 de Skolnick, J. et Holtzer, A., Macromolecules (1982) 15 : 812-821. Ces procédés sont décrits davantage dans la suite, dans les exemples.
Les analogues de polypeptide suivant la présente invention peuvent être produits suivant un nombre quelconque de manières qui sont bien connues dans la technique. Sous ce rapport, puisque les analogues sont relativement petits, c'est-à-dire jusqu'à environ 50 acides aminés en longueur, ils peuvent être synthétisés de manière appropriée par voie chimique, par n'importe quelle des nombreuses techniques qui sont connues des hommes de métier dans le domaine des peptides. En général, ces procédés emploient l'addition séquentielle d'un ou de plusieurs acides aminés de façon à former une chaîne peptidique croissante. Normalement, soit le groupe amino soit le groupe carboxyle du premier acide aminé est protégé par un groupe de protection approprié.
L'acide aminé protégé ou converti en dérivé peut alors être attaché à un support solide inerte ou utilisé en solution par addition de l'acide aminé suivant dans la séquence ayant le groupe complémentaire (amino ou carboxyle) protégé de manière appropriée, dans des conditions qui permettent la formation d'une liaison amide. Le groupe protecteur est alors éliminé du radical d'acide aminé nouvellement ajouté et l'acide aminé suivant (protégé de manière appropriée) est alors ajouté, et ainsi de suite. Après que les acides aminés souhaités ont été liés dans la séquence appropriée, n'importe quel groupe protecteur restant (et n'importe quel support solide, si des techniques de synthèse en phase solide sont utilisées) est éliminé séquentielle-
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ment ou conjointement pour rendre le polypeptide final.
Par une simple modification de cette procédure générale, il est possible d'ajouter plus d'un acide aminé à la fois à une chaîne croissante, par exemple par couplage (dans des conditions qui ne racémisent pas des centres chiraux) d'un tripeptide protégé à un dipeptide protégé de manière appropriée pour former, après enlèvement de la protection, un pentapeptide. Voir par exemple J. M.
Stewart et J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984) et G. Barany et R. B. Merrifield, The Peptides : Analysis. Synthesis. Biologo, éditeurs E. Gross et J. Meienhofer, Vol. 2, (Academic Press, New York, 1980), p. 3-254, pour des techniques de synthèse de peptides en phase solide, et M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, (SpringerVerlag, Berlin 1984) et E. Gross et J. Meienhofer, Eds., The Peptides : Analysis, Synthesis. Bioloqv, Vol. 1, pour une synthèse en solution classique.
Les groupes protecteurs typiques comprennent du t-butyloxycarbonyle (Boc), du 9-fluorénylméthoxycar- bonyle (Fmoc), du benzyloxycarbonyle (Cbz), du p-toluènesulfonyle (Tx), du 2, 4-dinitrophényle, du benzyle (Bzl), du biphénylisopropyloxycarboxy-carbonyle, du tamyloxycarbonyle, de l'isobornyloxycarbonyle, de l'obromobenzyloxycarbonyle, du cyclohexyle, de l'isopropyle, de l'acétyle, de l'o-nitrophénylsulfonyle et des groupes analogues.
Comme supports solides avantageux, on peut citer des supports polymères réticulés. Ceux-ci peuvent comprendre des polymères de divinylbenzène-styrène réticulé, par exemple des copolymères de divinylbenzènehydroxyméthylstyrène, des copolymères de divinylbenzènechlorométhylstyrène et des copolymères de divinylbenzène-benzhydrylaminopolystyrène.
Les analogues de polypeptide suivant la présente invention peuvent aussi être préparés par voie
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chimique par d'autres procédés, comme par le procédé de synthèse de peptide multiple simultanée. Voir par exemple Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1985) 82 : 5131-5135, US-A-4.631. 211.
En variante, les peptides peuvent être produits par des techniques de recombinaison, par exemple par synthèse d'ADN codant le peptide souhaité, conjointement à un codon d'initiation ATG. La séquence nucléotidique peut être conçue avec les codons appropriés pour la séquence particulière souhaitée d'acides aminés. En général, on choisit des codons préférés pour l'hôte visé dans lequel la séquence est exprimée. La séquence complète est généralement assemblée par superposition d'oligonucléotides préparés par des méthodes standards et assemblés en une séquence codante complète. Voir par exemple Edge Nature (1981) 292 : 756, Nambair et coll., Science (1984) 223 : 1299, Jay et coll., J. Biol. Chem.
(1984), 259 : 6311. Des techniques synthétiques automatisées, telles qu'une synthèse en phase solide à phosphoramide, peuvent être utilisées pour former la séquence nucléotidique. Voir par exemple Beaucage, S. L. et coll., Tet. Lett. (1981) 22 : 1859-1862, Matteucci, M. D. et coll., J. Am. Chem. Soc. (1981) 103 : 3185-3191. Ensuite l'ADN est cloné en un vecteur d'expression approprié, soit procaryote soit eucaryote, en utilisant des procédés conventionnels.
D'une autre manière, des techniques de recombinaison sont aisément utilisées pour cloner le gène de polypeptide parental qui peut alors être soumis à une mutagénèse in vitro par le remplacement de la ou des paires de bases appropriées de façon à obtenir le codon pour l'acide aminé souhaité. Un tel changement peut comprendre aussi peu qu'une paire de bases, en effectuant un changement dans un seul acide aminé, ou il peut englober des changements de plusieurs paires de bases. D'une autre manière, les mutations peuvent être effec-
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tuées en utilisant un amorçeur mal apparié qui s'hybride à la séquence nucléotidique parentale (d'une manière générale de l'ADNc correspondant à la séquence d'ARN), à une température en dessous de la température de fusion du duplex mal apparié.
L'amorceur peut être rendu spécifique en maintenant une longueur d'amorceur et une composition de base à l'intérieur de limites relativement étroites et en maintenant la base mutatrice centralement localisée. Zoller et Smith, Methods Enzymol. (1983) 100 : 468. Une extension d'amorceur est effectuée
EMI24.1
en utilisant de l'ADN polymérase, le produit est cloné et les clones contenant l'ADN muté, dérivés par ségréga- tion du brin étendu d'amorceur, sont sélectionnés. La sélection peut être accomplie en utilisant l'amorçeur de mutant comme sonde d'hybridation. Cette technique est également applicable pour engendrer des mutations en des points multiples. Voir par exemple Dalbie-McFarland et coll., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1982) 79 : 6409.
En utilisant les procédés ci-dessus, un certain nombre d'analogues de polypeptide représentatifs montrant un flux d'électrotransport accru ont été réalisés.
L'analogue de PTH, illustré sur la figure 1C, diffère de la séquence parentale (figure 1A) comme suit :
EMI24.2
Met8 a été substitué par Leu ; Leull a été substitué par Ser ; Leu a été substitué par Arg ; Leuls a été substi
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tué par Ser ; Met, g a été substitué par Ser ; Glug a été substitué par Arg ; Val21 a été substitué par Ser ; Glu22 a été substitué par Arg ; Leu24 a été substitué par Ser ; Leu28 a été substitué par Ser ; Gln, a été substitué par Lys ; Tyr34 a été substitué par Ser ; et une lactone d'homosérine est présente à la terminaison C du peptide.
Prises ensemble, ces substitutions ont pour résultat une structure secondaire diminuée.
Les hirulogs sont une série d'analogues synthétiques d'hirudine, un inhibiteur naturel de la thrombine. Deux de ces analogues sont représentés sur la figure 2. Hirulog-1, représenté sur la figure 2B, est décrit dans Maragnore et coll., Biochem. (1990) 12 : 7095-7101. Hirulog-B2, un peptide de vingt acides aminés ayant un poids moléculaire d'environ 2.186 daltons, a la séquence représentée sur la figure 2C.
Ainsi qu'on peut le voir, l'analogue hirulog-B2 diffère de l'analogue hirulog-1 représenté sur la figure 2C, en ce qu'il comporte de la D-cyclohexylalanine au lieu de D-phénylalanine dans la première position. Hirulog-B2 est décrit dans Witting et coll., Biochem. J. (1992) 287 : 663-664 et la WO 92/13.952.
Une fois que l'analogue de polypeptide souhaité est préparé, il peut être délivré au sujet en utilisant un quelconque des nombreux systèmes de délivrance de médicament par électrotransport et on n'est pas limité à l'utilisation d'un système particulier. Comme exemples de systèmes de délivrance de médicament par électrotransport on peut citer par exemple les US-A- 5.312. 326, US-A-5.080. 646, US-A-5.387. 189 et US-A- 5.169. 383, dont les descriptions sont incorporées ici à titre de référence.
La figure 3 illustre un dispositif de délivrance par électrotransport représentatif qui peut être utilisé conjointement au présent procédé. Le dispositif 10 comprend un corps supérieur 16, une unité de pla-
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quette de circuits 18, un corps inférieur 20, une électrode anodique 22, une électrode cathodique 24, un réservoir d'anode 26, un réservoir de cathode 28 et un adhésif compatible avec la peau 30. Le corps supérieur 16 présente des ailes latérales 15 qui aident au maintien du dispositif 10 sur une peau de patient. Le corps supérieur 16 est de préférence constitué d'un élastomère moulable par injection (par exemple de l'éthylène acétate de vinyle). L'unité de plaquette de circuits imprimés 18 comprend un circuit intégré 19 couplé à des composants électriques discrets 40 et à une batterie 32.
L'unité de plaquette de circuits 18 est attachée au corps 16 par des montants (non représentés sur la figure 1) passant à travers des ouvertures 13a et 13b, les extrémités des montants étant chauffées/fondues en vue de piqueter à chaud l'unité de plaquette de circuits 18 sur le corps 16. Le corps inférieur 20 est attaché au corps supérieur 16 au moyen de l'adhésif 30, la surface supérieure 34 de l'adhésif 30 étant amenée à adhérer à la fois sur le corps inférieur 20 et le corps supérieur 16, y compris les surfaces inférieures des ailes 15.
Sur la face inférieure de l'unité de plaquette de circuits 18 est représentée une pile à bouton 32. D'autres types de batterie peuvent aussi être employés pour alimenter le dispositif 10.
Le dispositif 10 est généralement constitué d'une batterie 32, d'un circuit électronique 19,40, d'électrodes 22,24, et de réservoirs de médicament/produit chimique 26,28, tout cela étant intégré dans une unité autonome. Les sorties (non représentées sur la figure 3) de l'unité de plaquette de circuits 18 permettent un contact électrique avec les électrodes 24 et 22 par des ouvertures 23, 23'dans les évidements 25, 25' formés dans le corps inférieur, au moyen de rubans adhésifs électriquement conducteurs 42, 42'. Les électrodes 22 et 24 sont à leur tour en contact direct
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mécanique et électrique avec les faces supérieures 44', 44 des réservoirs 26 et 28.
Les faces inférieures 46', 46 des réservoirs 26,28 sont en contact avec la peau du patient à travers les ouvertures 29', 29 prévues dans l'adhésif 30.
Le dispositif 10 comporte éventuellement une particularité qui permet au patient de s'auto-administrer une dose de médicament par électrotransport. Après enfoncement du commutateur à bouton poussoir 12, le circuit électronique de l'unité de plaquette de circuits 18 fournit un courant continu prédéterminé aux électrodes/réservoirs 22,26 et 24,28 pendant un intervalle de délivrance de longueur prédéterminée. Le commutateur à bouton poussoir 12 est avantageusement localisé sur la face supérieure du dispositif 10 et il est aisément actionné à travers le vêtement.
Une double pression sur le commutateur à bouton poussoir 12 en l'espace d'une courte période de temps, par exemple de 3 secondes, est de préférence utilisée pour actionner le dispositif de délivrance de médicament, en minimisant ainsi la probabilité d'un actionnement par inadvertance du dispositif 10. De préférence, le dispositif transmet à l'utilisateur une confirmation visuelle et/ou audible du démarrage de l'intervalle de délivrance de médicament au moyen de la DEL 14 devenant allumée et/ou d'un signal sonore audible provenant par exemple d'un émetteur de "bip-bip". Du médicament est délivré à travers la peau du patient par électrotransport, par exemple sur le bras, sur l'intervalle de délivrance prédéterminé.
L'électrode anodique 22 est de préférence constituée d'argent et l'électrode cathodique 24 est de préférence constituée de chlorure d'argent. Les deux réservoirs 26 et 28 sont de préférence constitués de matières à base d'hydrogel polymère. Les électrodes 22, 24 et les réservoirs 26,28 sont retenus à l'intérieur des dépressions 25', 25 dans le corps inférieur 20.
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Le commutateur à bouton poussoir 12, le circuit électronique sur l'unité de plaquette de circuits 18 et la batterie 22 sont"scellés"de manière adhésive entre le corps supérieur 16 et le corps inférieur 20. Le corps supérieur 16 est de préférence constitué d'une matière caoutchouteuse ou d'une autre matière élastomère. Le corps inférieur 20 est de préférence constitué d'une matière en feuille plastique ou élastomère (par exemple du polyéthylène) qui peut être aisément moulée pour former les évidements 25, 25' et les découpes destinées à former des ouvertures 23, 23'. Le dispositif assemblé 10 est de préférence résistant à l'eau (c'est-à-dire résistant aux éclaboussures) et il est très avantageusement étanche à l'eau.
Le système présente un profil bas qui se conforme aisément au corps en permettant une liberté de mouvement au site porteur et autour de celui-ci. Les réservoirs 26 et 28 sont situés sur la face en contact avec la peau du dispositif 10 et ils sont suffisamment séparés pour empêcher un court-circuit accidentel pendant une manipulation et une utilisation normales.
Le dispositif 10 adhère à la surface du corps du patient (par exemple la peau) au moyen d'un adhésif périphérique 30 qui présente une face supérieure 34 et une face en contact avec le corps 36. La face adhésive 36 a des propriétés adhésives qui assurent que le dispositif 10 reste en place sur le corps pendant une activité d'utilisateur normale, et elle permet encore un enlèvement raisonnable après la période de port prédéterminée (par exemple 24 heures). La face adhésive supérieure 34 adhère au corps inférieur 20 et retient le corps inférieur 20 attaché au corps supérieur 16.
Les réservoirs 26 et 28 comprennent d'une manière générale une matrice de gel, avec la solution de médicament uniformément dispersée dans au moins un des réservoirs 26 et 28. Des concentrations de médicament
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de l'ordre d'environ 1 x 10-4M à 1, 0 M ou davantage peuvent être utilisées, les concentrations de médicament dans la partie inférieure de la gamme étant préférées.
Les polymères appropriés pour la matrice de gel peuvent comprendre essentiellement n'importe quelle matière polymère synthétique et/ou apparaissant dans la nature, non ionogène. Une nature polaire est préférée lorsque l'agent actif est polaire et/ou capable d'ionisation, de façon à accroître la solubilité de l'agent. Eventuellement, la matrice de gel est capable de gonfler dans l'eau. Comme exemples de polymères synthétiques appropriés, on peut citer, mais d'une manière non limitative, du poly (acrylamide), du poly (2-hydroxyéthyl-acrylate), du poly (2-hydroxypropyl-acrylate), de la poly (N-vinyl-2pyrrolidone), du poly (n-méthylol-acrylamide), du poly (diacétone-acrylamide), du poly (2-hydroxyléthyl-méthacry- late), du poly (vinyl-alcool) et du poly (allyl-alcool).
Des polymères de condensation hydroxy fonctionnels (c'est-à-dire des polyesters, des polycarbonates, des polyuréthannes) sont également des exemples de polymères synthétiques polaires appropriés. Les polymères polaires apparaissant naturellement (ou leurs dérivés) appropriés pour une utilisation comme matrice de gel sont par exemple des éthers de cellulose, des éthers de méthylcellulose, de la cellulose et de la cellulose hydroxylée, de la méthylcellulose et de la méthylcellulose hydroxyle, des gommes, comme du guar, du locust, du karaya, du xanthane, de la gélatine et leurs dérivés. Des polymères ioniques peuvent aussi être utilisés pour la matrice pourvu que les contre-ions disponibles soient soit des ions de médicament soit d'autres ions qui sont chargés de manière opposée par rapport à l'agent actif.
Donc, les analogues de polypeptide suivant la présente invention sont incorporés dans le réservoir de médicament, par exemple une matrice de gel qui vient juste d'être décrite, et ils sont administrés à un
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patient en utilisant un système de délivrance de médicament par électrotransport, éventuellement tel que celui donné en exemple ci-dessus. Une incorporation de la solution de médicament peut être faite un nombre quelconque de fois, c'est-à-dire par imbibition de la solution dans la matrice de réservoir, par mélange de la solution de médicament avec la matière de matrice avant la formation d'hydrogel, ou d'une manière analogue.
Tandis que l'invention a été décrite conjointement aux formes de réalisation spécifiques préférées de celle-ci, il faut entendre que la description qui précède ainsi que les exemples qui suivent sont destinés à illustrer et non pas à limiter la portée de l'invention. D'autres aspects, avantages et modifications dans le cadre de l'invention apparaîtront à l'homme de métier concerné par l'invention.
III. PARTIE EXPERIMENTALE
D'une manière générale, des techniques standards de technologie d'ADN recombinant sont décrites dans diverses publications, par exemple Sambrook et coll., Molecular Clonie : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), Ausubel et coll., Current Protocols in Molecular Biology, vols. 1 et 2 et suppléments (1987), et Wu et Grossman (éds. ), Methods in Enzymoloqv, Vol. 53 (Recombinant DNA Part D, 1987). Des enzymes de restriction, des milieux de culture de cellules de mammifère, et une lignée cellulaire d'E. coli DH10B (F-mcrA D (mrr-hsdRMS-mcrBC) F80dlacZDM15 DlacX74 deoR recA1 araD139 D (ara, leu) 7697 galU galK IrpsL endA1 nupG) sont vendus par Gibco/BRL (Gaithersburg, MD). De la Taq polymérase est disponible chez Perkin Elmer Cetus (Norwalk, CT).
Une résine de liaison de His est vendue par Novagen (Madison, WI) et est utilisée conformément aux instructions du fabricant. De la DNase et du lysozyme sont vendus par Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). Du bromure de cyanogène
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est vendu par Aldrich (Milwaukee, WI). Des oligonucléotides sont synthétisés sur un synthétiseur d'ADN modèle 394 de Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA), utilisant des produits chimiques ABI. Une hormone parathyroïdienne humaine synthétique et une hormone parathyroïdienne bovine synthétique sont vendues par Bachem (Torrance, CA).
EXEMPLE 1
CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION
POUR LES POLYPEPTIDES PTH
Les vecteurs d'expression de PTH sont construits en plusieurs étapes en utilisant un plasmide pBAD18 (Guzman et coll. 1995), comme plasmide de départ.
Le plasmide pBAD18 contient le promoteur araB suivi par un polylieur et un agent de terminaison sous le contrôle du régulateur positif/négatif araC, également spécifié par le plasmide. Le plasmide pBAD18 contient également une origine de plasmide pBR322 modifié et le gène bla pour permettre une réplication et une sélection dans E. coli, ainsi que la région intragénique de phage M13 pour permettre une sauvetage d'ADN simple brin. Cependant, dans les buts de la présente invention, le vecteur de clonage effectif, utilisé pour construire les vecteurs d'expression de l'invention, n'est pas critique.
Par exemple, un plasmide pMC3 pourrait servir comme vecteur de clonage au lieu du plasmide pBAD18 dans les protocoles ci-dessous. Le plasmide pMC3 est décrit dans le US-A-5.270. 170. Le plasmide pMC3 diffère du plasmide pBAD18 en ce que le plasmide pMC3 code un répresseur lac à queue dynorphine B dans la région correspondant à la région Nhel-Xbal du site de clonage multiple de pBAD18 et code une séquence d'opérateur lac dans la région correspondant au fragment Ndel-Clal du plasmide pBAD18. Comme ce dernier fragment n'est pas essentiel dans les buts de la présente invention, on pourrait construire aisément des vecteurs appropriés
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dans les buts de la présente invention à partir du plasmide pMC3. Le plasmide pMC3 est disponible dans la souche AR1161 de l'American Type Culture Collection sous le numéro de dépôt ATCC 68818.
Les vecteurs de PTH sont alors construits de la manière suivante. La paire suivante d'oligonucléotides partiellement superposés est hybridée et une seconde synthèse de brin est effectuée avec de la Taq polymérase :
EMI32.1
5'-GCT CGG GCT AGC TAA CTA ATG GAG GAT ACA TAA ATG AAA GCT ATC TTC Nhe 1 S & D TrpLe leader GTT CTG AAA GGT TCC CTG GAC CGT GAC CCG GA-3' 3'-AC CTG GCA CTG GGC CTT AAG CAG CTG TAC TAG
Sal I Bel I
EMI32.2
TTG GTC TAG AGG GTG GTG GTG GTA GTG GTA ATT ATT TTC GAA GGC AGG-5 Bgl II His < Hind III Le produit est digéré par Nhel et HinDIII et il est inséré dans les sites correspondants de pBAD18. Le duplex contient le site de fixation de ribosome Shine-Dalgarno (S & D) et le peptide leader (TrpLE).
Cette séquence leader de 17 acides aminés a été précédemment montrée comme accroissant une expression de petites protéines et elle peut promouvoir la séquestration de fusions dans des corps d'inclusion (Derynck et coll., Cell (1984) 38 : 287-297, Miozzari et Yanofsky J., Bacteriol. (1978) 133 : 1457-1466). Le peptide leader TrpLe est séparé de la séquence His6 par un site de clonage multiple. Le site de polyhistidine permet une purification rapide de la molécule d'hormone parathyroïdienne recombinante (RPTH), et d'analogues de RPTH par l'intermédiaire d'une chromatographie par chélation de nickel (voir US-A-4.551. 271). Deux codons d'arrêt (TAATAA) suivent la polyhistidine.
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Un gène RPTH (1-34) avec la séquence suivante est conçu et synthétisé en utilisant des codons de E. coli d'un grand usage : 1234567 8
EMI33.1
Val-Ap-Met-Ile-A3n-Met-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu- 5'-GGC TGG GTC GAC ATG ATC AAC ATG TCC GTT TCC GAA ATC CAG CTG CTG 3'-CCG ACC CAG CTG TAC TAG TTG TAC AGG CAA AGG CTT TAG GTC GAC GAC
Sal I 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 His-Asn-Leu-Gly Lys-His-Leu-Asn-Ser-Leu-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu CAC AAC CTG GGT AAA CAC CTG AAC TCC CTC GAG CGT GTT GAA TGG CTG GTG TTG GAC CCA TTT GTG GAC TTG AGG GAG CTC GCA CAA CTT ACC GAC 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
EMI33.2
AIg-Lys-Lys-Leu-G1n-A3p-Val-His-Asn-Tyr-Met-Gln-Ile-Ser CGT AAA AAA CTG CAG GAC GTC CAC AAC TAC ATG CAG ATC TCC CTC-3' GCA TTT TTT GAC GTC CTG CAG GTG TTG ATG TAC GTC TAG AGG GAG-5' BgIII Ce gène RPTH est digéré par SalI
et BglII et il est inséré dans le vecteur pBAD modifié.
EXEMPLE 2
EXPRESSION ET PURIFICATION DE POLYPEPTIDES PTH
Des E. coli DH10B contenant le plasmide décrit ci-dessus sont mis à croître pendant la nuit dans des milieux LB contenant de l'ampicilline (50 à 100 g/ml).
Dix ml de cette culture sont utilisés pour inoculer une culture de 500 ml de Superbroth (35 g/l de bactotryptone, 20 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCl et NaOH jusqu'à un pH = 7,5) contenant de l'ampicilline. On laisse les cellules croître jusqu'à une DOoo d'environ 0,5 à 1,0 et de la L- (+)-arabinose est ajoutée jusqu'à une concentration finale de 0,2 %. On laisse les cellules croître pendant 3 heures supplémentaires. A la fin de cette période, la DOo est comprise entre 1,5 et 3. Les cellules sont récoltées par centrifugation et lavées successivement avec 250 ml de tampon WTEK (50 mM
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de Tris, pH=7,5, 10 mM d'EDTA, 100 mMde KCl), 250 ml de PBS, et 250 ml de 10 mM de Tris, pH=7,5.
Les cellules sont alors remises en suspension dans 100 ml d'une solution composée de 10 mM de Tris, pH=7,5, de 0,1 mg/ml d'inhibiteur de protéase, la N-tosyl-L-phénylalanine- chlorométhyl-cétone (TPCK), de 0,1 mg/ml d'inhibiteur de protéase, la N-tosyl-L-lysine-chlorométhyl-cétone (TLCK), de 0,1 mg/ml d'inhibiteur de protéase, du fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), et de 0,05 mg/ml de lysozyme. La solution résultante est mise à incuber sur de la glace pendant 1 heure. Les cellules sont alors soumises à un gel-dégel, 1 mg de DNase est ajouté aux cellules gelées-dégelées et le mélange résultant est mis à incuber sur de la glace pendant une heure supplémentaire.
Des corps d'inclusion issus des cellules sont purifiés par centrifugation à 10. 000Xg pendant 15 minutes. Les corps d'inclusion sont solubilisés dans 10 % de SDS, mais dans certains cas, un traitement sonique de l'échantillon est aussi nécessaire pour solubiliser toute la protéine. Un tampon de fixation (5 mM d'imidazole, 500 mM de NaCl et 20 mM de Tris, pH=7,9) est ajouté pour diluer la concentration de SDS à 1 % et l'échantillon est chargé sur une colonne contenant une résine de fixation de His (Novagen). La colonne est alors lavée avec 15 volumes de colonne du tampon de fixation, et la protéine fixée est ensuite éluée avec un volume de colonne de tampon d'élution (500 mM de NaCl, 100 mM d'EDTA et 50 mM de Tris, pH=7,9). Deux volumes d'éthanol absolu sont alors ajoutés pour faire précipiter la protéine.
Le polymère de PTH précipité est ensuite dissous dans 70 % d'acide formique, et un excès molaire de 500 fois (un excès de 100 à 1000 fois peut être utilisé) de CNBr est ajouté. Un espace de temps de clivage (effectué à différentes concentrations de CNBr
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pour déterminer le temps optimal) indique, lorsqu'il est examiné par analyse d'acide aminé, qu'un clivage complet est obtenu en deux heures à la température ambiante.
Après clivage au CNBr, les peptides sont lyophilisés et remis en suspension dans de l'eau distillée. Le peptide est remis en suspension dans un tampon A (0,1 % de TFA) et ensuite il est purifié par HPLC en utilisant une colonne de semi-préparation VYDAC C-18. Approximativement 30 mg du peptide sont injectés sur la colonne. Le peptide est ensuite élué avec un gradient de 20-40 % d'acétonitrile/0, 1 % de TFA pendant 40 minutes. Le pic principal, éluant à approximativement 15 minutes, est recueilli et lyophilisé à sec.
Après isolement de corps d'inclusion et purification comme décrit ci-dessus, le peptide est d'une pureté plus grande que 95 % ainsi qu'il est déterminé par SDS-PAGE. Le peptide est ensuite dessalé et il est partiellement purifié sur une colonne SepPak.
Des pics individuels sont isolés et analysés par une spectrométrie de masse à électropulvérisation pour déterminer la composition. Deux pics mineurs sont présents qui sont le résultat d'un clivage au bromure de cyanogène incomplet et qui représentent le peptide PTHHis6 et le peptide I-N-M-PTH. Le pic principal englobe davantage que 80 % de la protéine totale. Une comparaison entre l'échantillon purifié sur Sep-Pak"brut"et la RPTH purifiée par HPLC ne montre pas une différence significative dans la capacité de stimulation d'adénylate-cyclase.
EXEMPLE 3
PRODUCTION D'ANALOGUES DE PTH
En vue de produire les analogues de PTH de la présente invention, le peptide PTH est substitué avec les acides aminés indiqués sur les figures 1C et 1D. Des analogues de PTH sont produits par recombinaison en étant construits d'une manière semblable à ce qui est
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décrit ci-dessus pour le gène RPTH-A recombinant, par substitution des bases appropriées. Les analogues de PTH sont exprimés et purifiés comme décrit ci-dessus.
EXEMPLE 4
EXAMEN D'ACTIVITE D'ANALOGUE DE PTH
Une PTH synthétique ayant la séquence de type sauvage et les analogues de PTH recombinants (RPTH) sont testés quant à leur capacité de stimuler de l'adénilatecyclase. Les concentrations de PTH sont déterminées par D0280 en utilisant un coefficient d'extinction de 6600 pour le peptide recombinant et de 5500 pour le peptide synthétique. La lignée cellulaire d'ostéosarcome de rat UMR106 (ATCC CRL 1661) est utilisée pour tester in vitro la capacité des peptides à activer le récepteur de PTH.
Une activation du récepteur de PTH conduit à une augmentation intracellulaire de la concentration de cAMP.
Les cellules UMR106 sont ensemencées à environ 2,5 x 105 par puits dans une boîte à 48 puits et on les laisse croître jusqu'à confluence. Les essais sont effectués sur des cellules à 3-5 jours de post-confluence. Les milieux (milieu d'Eagle modifié par Dulbecco, DMEM, avec du sérum de veau foetal) sont éliminés, et 1 ml de milieu frais est appliqué. La PTH (recombinante ou synthétique) à différentes concentrations et de la 3- isobutyl-l-méthylxanthine (IBMX) à une concentration finale de 1 mM sont alors ajoutées à chaque puits de la plaque qui est ensuite mise à incuber pendant 5 minutes à la température ambiante. Le milieu est ensuite éliminé et les cellules sont rapidement lavées avec du PBS refroidi par de la glace. Les cellules sont ensuite extraites à deux reprises avec 1 ml d'éthanol absolu.
Les deux extractions sont combinées et l'éthanol est éliminé par évaporation. Ensuite on redissout l'extrait dans 1 ml de tampon de proximité de scintillation (tampon SPA) (Amersham, Arlington Heights, IL).
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EXEMPLE 5
PREDICATION DES EFFETS DES SUBSTITUTIONS
D'ACIDE AMINE DANS LES ANALOGUES DE PTH SUR
LE POTENTIEL D'HELICE a
Comme expliqué précédemment, le potentiel d'hélice a de polypeptides linéaires peut être estimé en utilisant les équations de Lifson-Roig (Lifson, S. et Roig, A., J. Chem. Phys. (1961) 34 : 1963-1974) et des valeurs pour les paramètres de formation d'hélice résiduaire convertis à partir de leurs valeurs de ZimmBragg (Zimm, B. H. et Bragg, J. K., J. Chem. Phys.
(1959) 31 : 526-535), en employant des équations de conversion de Qian et Schellman (Qian, H. et Schellman, J. A., J. Chem. Phys. (1992) 96 : 3987-3994). Une fois qu'un jeu de valeurs s et a de Zimm-Bragg sont définies pour chaque radical, la probabilité que la chaîne polypeptidique entière (ou une certaine sous-séquence définie) adopte une hélice a peut être calculée en utilisant des équations dans les références ci-dessus.
Les deux calculs généralement utilisés pour estimer un potentiel d'hélice a, décrit ci-dessus, sont appliqués aux deux analogues de PTH engendrés. Le premier calcul prend le paramètre d'initiation d'hélice v de Lifson-Roig comme étant une constante de 0,039 (c'est-à-dire que le paramètre a de Zimm-Bragg est de 0,0013 pour tous les radicaux), avec le paramètre w pour chaque acide aminé calculé à partir de la valeur s de Zimm-Bragg trouvée dans le Tableau 1 de Finkelstein et coll., Proteins : Structure, Function and Genetics (1991) 10 : 287-299.
En appliquant les calculs aux analogues de PTH (figures 1C et 1D), les valeurs s du Tableau 1 de cette référence sont tout d'abord converties de leurs valeurs à 300 K en les valeurs estimées à 273 K en utilisant un changement d'enthalpie supposé de 1 kcal/mole (identique pour tous les radicaux). Pour l'analogue 1C de PTH ce calcul donne une probabilité de 0,18
<Desc/Clms Page number 38>
pour que la séquence entière soit une hélice a. Pour l'analogue 1D de PTH ce calcul donne une probabilité de 0,15 pour que la séquence entière soit une hélice a.
Le deuxième calcul ne suppose pas que tous les radicaux aient la même valeur pour le paramètre d'initiation d'hélice v (c'est-à-dire que le paramètre ce de Zimm-Bragg soit unique pour chaque radical d'acide aminé). Dans ce cas, les valeurs de s et a de Zimm-Bragg pour chaque radical sont prises (excepté pour His, Pro et Trp) du Tableau 1 de Skolnick, J. et Holtzer, A., Macromolecules (1982) 15 : 812-821. Les valeurs de ZimmBragg pour His sont prises de Sueki et coll., Macromolecules (1984) 17 : 148-155. Les valeurs de Zimm-Bragg pour Pro et Trp sont prises de Finkelstein et coll.
Pour ce second calcul alternatif dans chaque cas, la valeur s est calculée à 273 K, et pour les radicaux ayant des chaînes latérales ionisables, la valeur s pour l'état d'ionisation qui prédominerait à un pH de 7 est admise.
Les valeurs s (à 273 K) et les valeurs or obtenues de Sueki et coll. et Skolnick et Holtzer sont converties (Qian et Schellman) à leurs valeurs v et w de LifsonRoig et ensuite utilisées pour calculer la probabilité pour que la chaîne polypeptidique entière (ou une certaine sous-séquence) existe dans l'état hélicoïdal a.
Pour l'analogue 1C de PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,02 pour que la séquence entière soit une hélice a. Pour l'analogue 1D de PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,02 pour que la séquence entière soit une hélice a.
EXEMPLE 6
ESTIMATION DU POTENTIEL D'HELICE a A PARTIR
D'UN DICHROISME CIRCULAIRE EN FAISANT VARIER
DES CONCENTRATIONS DE TRIFLUOROETHANOL
Des examens de dichroïsme circulaire au trifluoroéthanol (TFE) ont été faits en utilisant un spectromètre de dichroïsme circulaire modèle 62DS de
<Desc/Clms Page number 39>
AVIV Associates, Inc. Des concentrations de protéine sont déterminées à partir de lectures d'absorbance en utilisant des coefficients d'extinction calculés pour les analogues dans 10 mM de tampon ionique. Des titrages de TFE sont effectués de 0 à 50 % de TFE, en balayant de 250 à 200 nm à 200C pour chaque échantillon de TFE. 101222 est calculé par : observé à 222* (poids résiduaire moyen)/ (10 (longueur de trajet cellulaire) (concentration de protéine)).
Les données des titrages de TFE à pH 6,5, 10 mM de cacodylate, sont résumées ci-dessous dans le tableau 2 pour les analogues de PTH et elles sont tracées sur la figure 4. La figure 4 montre que, lorsque le cosolvant induisant une hélice a, le trifluoroéthanol, atteint une concentration de 30 % (v/v), sensiblement la quantité maximale d'hélice est formée pour PHT, la quantité moyenne de configuration hélicoïdale étant d'environ 80 %. Le PTH parental, même en l'absence de l'agent inducteur d'hélice, est environ à 20 % a-hélicoïdal.
L'analogue 1C de PTH, en l'absence de TFE inducteur d'hélice, est essentiellement dépourvu d'hélice, et à 30 % de TFE il est au maximum à environ 30 % ahélicoïdal.
L'analogue 1D de PTH, en l'absence de TFE inducteur d'hélice, est essentiellement dépourvu d'hélice, et à 30 % de TFE il est environ 15 % a-hélicoïdal.
Cette réduction de 2 à 3 fois dans la teneur observée en hélice à 30 % de trifluoroéthanol peut être prédite sur base de l'équation de Lifson-Roig et des calculs dérivés de celle-ci, comme indiqué précédemment.
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TABLEAU 2 Données de titrage de TFE
EMI40.1
<tb>
<tb> % <SEP> U <SEP> pour <SEP> ruz22 <SEP> pour <SEP> U <SEP> pour
<tb> TFE <SEP> hPTH <SEP> (I-34) <SEP> analogue <SEP> 1C <SEP> analogue <SEP> 1D
<tb> 0-7793-2750-3867
<tb> 10-15863-4600-6479
<tb> 20-21491-9065-12329
<tb> 30-26288-12081-15161
<tb> 40-27011-14320-15191
<tb> 50 <SEP> -26802 <SEP> -15649 <SEP> -15395
<tb>
EXEMPLE 7
FLUX D'ELECTROTRANSPORT IN VITRO
DES ANALOGUES DE PTH
Des études sur l'électrotransport in vitro sont effectuées dans des cellules à plusieurs compartiments de petit volume, construites sur demande, et utilisant une commande anodique. 1mM de PTH dans 10mM de tampon est placé dans le compartiment donneur et 25mM de récepteur de force ionique finale sont placés dans le compartiment récepteur.
La solution de récepteur pour le PTH naturel et l'analogue 1C est constituée de 15mM de NaCl tamponné à pH 7 avec 10mM d'imidazole, 0,1 % d'albumine de sérum de boeuf (BSA) comme agent bloquant, du détergent Tween 20 et de l'azothydrure de sodium, comme bactéricide. La solution de récepteur pour l'analogue 1D de PTH est constituée de 15mM de NaCl tamponné à un pH de 7 avec 10mM d'imidazole, 0,5 % de bromure de dodécyltriméthyl-ammonium (DTAB, un tensioactif) et 0,3 mg/ml de Trp-Nle-Arg-Phe-amide, un tétrapeptide utilisé comme substrat"alterné"pour des enzymes protéolytiques présentes dans la peau.
<Desc/Clms Page number 41>
La couche cornée d'un cadavre humain, séparée à chaud, est placée entre les compartiments donneur et récepteur, avec le côté épiderme vers le compartiment récepteur. Un courant continu constant de 127 J1. A mA (c'est-à-dire 0,1 mA/cm2) est appliqué. Les cellules sont maintenues à 320C pendant les examens in vitro avec des échantillons de récepteur prélevés toutes les deux heures (volume de récepteur enlevé et remplacé par du récepteur"frais"à chaque échantillonnage). Les échantillons de récepteur sont analysés par HPLC en phase inverse.
Les zones de pic des échantillons de récepteur de PTH sont comparées aux courbes standards du même analogue d'une opération à des concentrations connues en même temps en utilisant une colonne polymère analytique, à un débit de 1,5 ml/minute avec un gradient de 10-50 % de B en dix minutes pour élution. Le tampon A consiste en 0,1 % d'acide trifluoroacétique (TFA), 1 % d'acétonitrile ; le tampon B consiste en 0,1 % de TFA, 98,9 % d'acétonitrile. Des concentrations analogues sont converties en flux de masse et tracées en fonction du temps.
Pour les examens d'électrotransport in vitro, les donneurs décrits contiennent la variante rétroinverse (c'est-à-dire que les radicaux d'acide aminé D sont utilisés et sont assemblés dans l'ordre inverse à l'habituel) de l'analogue 1C de PTH (1mM) dans des solutions aqueuses à un pH de 5,0. Cela est dû au fait que les analogues 1 et 2 de PTH ne sont pas stables lorsqu'ils sont mis à incuber avec une couche cornée séparée, probablement à la suite de la digestion protéolytique par des protéases de la peau. L'analogue 1D de PTH n'est pas une variante rétroinverse, mais au lieu de cela elle a été synthétisée par recombinaison. En vue de protéger l'analogue 1D d'une digestion par une enzyme protéolytique, le tétrapeptide est ajouté à la solution
<Desc/Clms Page number 42>
de récepteur.
Les cellules d'électrotransport totalement assemblées sont mises à incuber à 32 ¯ 0, 5 C. La superficie de contact avec la peau disponible pour le transport est de 1,27 cm2. Le volume de compartiment donneur
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est de 200 pl ; le volume du compartiment récepteur est de 350 pl. La solution de récepteur est séparée de la cathode par une membrane échangeuse d'anions (IonacTM, Eletrosynthesis Co., Lancaster, NY). Chaque cellule est connectée à une source de courant constant, à une
EMI42.2
2 densité de courant standard de 100 MA cm-. La chute de tension à travers chaque cellule est contrôlée à approximativement 2 heures d'intervalle pendant la durée de l'expérience.
Des histogrammes de flux de masse pour chaque point de temps sont tracés. Le flux de masse médian (intervalle de confidence de 95 %) pour l'analogue 1C de PTH est de 3,2 g cm-2h-1 (2,1 à 4,2) et pour l'analogue 1D de PTH il est de 1,1 Mg cm'h'' (0,9-1, 7). Les valeurs de flux de masse moyennes r ds pour ces analogues sont de 4,1 Mg cm-2h-1 ¯ 3,7 et 1,5 g cm-2h-1 ¯ 1, 1 pour les analogues 1C et respectivement 1D.
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EXEMPLE 8
ESTIMATION DU POTENTIEL D'HELICE a A PARTIR DU
DICHROISME CIRCULAIRE EN FAISANT VARIER
DES CONCENTRATIONS DE TRIFLUOROETHANOL
Les examens de dichroïsme circulaire au trifluoroéthanol (TFE) sont effectués en utilisant un spectromètre de dichroïsme circulaire de modèle 62DS de AVIV Associates, Inc. Les concentrations de protéine sont déterminées par des lectures d'absorbance en utilisant des coefficients d'extinction calculés pour les analogues dans 10 mM de tampon ionique. Les titrages de TFE sont effectués à partir de 0 jusqu'à 50 % de TFE, en balayant de 250 à 200 nm à 200C pour chaque échantillon de TFE. 101222 est calculé par : 80bscrvé 222* (poids résiduaire moyen)/ (10 (longueur de trajet cellulaire) (concentration de protéine)).
Les données des titrages de TFE à un pH de 6,5, 10mM de cacodylate, sont résumées ci-dessous dans le tableau 3 pour les analogues d'hirulog et elles sont tracées sur la figure 5. La figure 5 montre que, lorsque le cosolvant inducteur d'hélice a, le trifluoroéthanol, atteint une concentration de 30 % (v/v), sensiblement la quantité maximale d'hélice est formée pour à la fois l'hirulog parental et l'analogue B2, la quantité moyenne de caractère hélicoïdal étant d'environ 10 % pour l'hirulog parental et sensiblement de 0 % pour l'analogue B2. L'hirulog parental et l'analogue B2 ne montrent pas de caractère hélicoïdal a en l'absence de TFE inducteur d'hélice. L'analogue B2 d'hirulog n'a sensiblement pas d'hélice a même à des concentrations de 80 % de TFE.
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TABLEAU 3 Données de titrage de TFE
EMI44.1
<tb>
<tb> %TFE <SEP> U222 <SEP> pour <SEP> U222 <SEP> pour
<tb> l'hirulog <SEP> parental <SEP> l'analogue <SEP> B2
<tb> 0-1120-989
<tb> 10-3679-1313
<tb> 20-5458-1580
<tb> 30-6972-1848
<tb> 40-8365-1896
<tb> 50 <SEP> -8493 <SEP> -1963
<tb>
EXEMPLE 9
FLUX D'ELECTROTRANSPORT IN VITRO D'HIRULOG-B2
L'hirulog-B2 est synthétisé en utilisant des techniques standards. Voir par exemple Maraganore et al.
Thromb. Haemostasis. (1991) 65 : 830 ; Bode et al. EMBO J.
(1989) 8 : 3467-3475 ; et WO 92/13952. Le flux d'électrotransport transdermique d'hirulog-B2 est évalué en utilisant un épiderme humain séparé à chaud. De plus, des formulations d'hydrogel sont aussi investiguées en utilisant de l'épiderme humain en ce qui concerne l'effet de la densité de courant sur le flux transdermique de médicament. Le flux d'hirulog-B2 transdermique est estimé en utilisant des solutions aqueuses préparées avec à la fois du médicament tel que reçu et du médicament dessalé, tamponné par 10mM de tampon d'acétate de force ionique, pH de 5. Les études de flux d'hirulog-B2 sont effectuées à une densité de courant de 0,1 mA/cm2.
En utilisant 15 mM de NaCl tamponnés par de l'acétate à un pH de 5, comme solution de récepteur, des flux d'électrotransport en régime constant d'environ 19 g h-l
<Desc/Clms Page number 45>
cm-2 et 17 gg h''cm' sont obtenus pour la solution de médicament dessalé et la solution de médicament tel que reçu.
La variabilité du flux d'hirulog-B2 pour des échantillons de peau à partir d'un seul donneur ainsi qu'à partir de donneurs multiples apparaît comme étant d'environ 15 à 40 %, ce qui est bien dans les gammes de variabilités observées pour des peptides et des composés protéiques.
Pour les études d'hydrogel, des disques d'hydrogel sont imbibés de médicament et assemblés dans des logements en mousse. Soit des solutions de médicament tel que reçu (11mM d'hirulog-B2 dans 20mM d'acétate) ou des solutions de médicament dessalé (4mM d'hirulog B2 dans 4mM d'acétate) sont imbibées dans les gels.
Un flux d'électrotransport moyen en régime permanent d'environ 27 jig h-'cm-2 est obtenu avec des formulations d'hydrogel contenant du médicament tel que reçu ou du médicament dessalé.
En utilisant des hydrogels imbibés par du médicament tel que reçu, une autre expérience est effectuée pour évaluer l'effet de la densité de courant sur le flux transdermique d'hirulog-B2. Une augmentation de densité de courant a pour effet une augmentation correspondante du flux d'hirulog-B2 sur la gamme de densités de courant examinées. Dans des conditions passives (courant zéro), aucun flux d'hirulog-B2 mesurable n'est observé.
EXEMPLE 10
FLUX D'ELECTROTRANSPORT IN VIVO D'HIRULOG-B2 A. ADMINISTRATION INTRAVEINEUSE D'HIRULOG-B2.
Des cochons utilisés pour des examens intraveineux (IV) pèsent 11 t 1 kg (n=3) et ils sont mis à la diète pendant la nuit avant les injections en bolus. Des injections en bolus IV sont données dans la veine auriculaire ou la veine cave. L'injection IV est admi-
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nistrée pendant environ 30 à 60 secondes et la dose est d'environ 0,3 mg/kg (dans 0,5 ml). Les niveaux d'hirulog-B2 dans le plasma augmentent rapidement chez tous les cochons après l'injection en bolus IV d'hirulog-B2, en atteignant un niveau de pic moyen de 66 f 6 ng/ml au point d'échantillonnage de 15 minutes. Les niveaux d'hirulog-B2 dans le plasma diminuent à moins de 2 ng/ml à 2 heures après l'injection en bolus, et ils restent relativement constants de 2 à 8 heures après l'injection en bolus.
La clairance et la demi-vie d'élimination calculées pour chaque cochon sont indiquées sur le tableau 4. Le volume apparent de distribution et la demi-vie d'élimination moyenne sont calculés, à partir des données de bolus IV, comme étant de 45,4 1 et respectivement de 16 minutes.
<Desc/Clms Page number 47>
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TABLEAU 4 U7UUU. J 1 v Pharmacocinétiques de hirulog-B2 sur des porcs
EMI47.2
<tb>
<tb> Phase <SEP> Cochon <SEP> Cochon <SEP> Cochon
<tb> définitive <SEP> 303 <SEP> 304 <SEP> 305 <SEP> Moyenne <SEP> DS
<tb> IV
<tb> Poids <SEP> de <SEP> corps <SEP> [kg] <SEP> 12 <SEP> H <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 1
<tb> Ke <SEP> [l/h] <SEP> 2,42 <SEP> 2,01 <SEP> 2,5 <SEP> 2, <SEP> 31 <SEP> 0,26
<tb> V <SEP> [1] <SEP> 45,5 <SEP> 49,25 <SEP> 41,55 <SEP> 45, <SEP> 43 <SEP> 3,85
<tb> V <SEP> [I/kg] <SEP> 3,8 <SEP> 4,5 <SEP> 4,2 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 0,35
<tb> CL <SEP> [l/h] <SEP> 110 <SEP> 99 <SEP> 104 <SEP> 104 <SEP> 5,5
<tb> CL <SEP> [l/h/kg] <SEP> 9, <SEP> 2 <SEP> 9,0 <SEP> 10,4 <SEP> 9, <SEP> 5 <SEP> 0,76
<tb> Elimination <SEP> 17,2 <SEP> 20,72 <SEP> 16,6 <SEP> 18, <SEP> 2a <SEP> 2,
23a
<tb> T1/2 <SEP> [min] <SEP> 16
<tb> SC
<tb> Elimination <SEP> -- <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 58h
<tb> T1/2 <SEP> [min]
<tb> 4-ETS
<tb> Elimination---28''
<tb> T1/2 <SEP> [min]
<tb> Accumulation <SEP> -- <SEP> -- <SEP> -- <SEP> 38b
<tb> T,/2 <SEP> [min]
<tb> Phase <SEP> de <SEP> Cochon
<tb> dépistage <SEP> SC-3A
<tb> 3-ETS
<tb> Elimination <SEP> 32
<tb> T,/2 <SEP> [min]
<tb> Accumulation <SEP> 33
<tb> T1/2 <SEP> [min]
<tb>
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a Moyenne calculée à partir de Tu, 2 déterminations individuelles. b Calculé par une régression linéaire de la courbe moyenne de concentration d'hirulog-B2 dans le plasma en fonction du temps.
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B. ADMINISTRATION SOUS-CUTANEE D'HIRULOG-B2.
Des cochons sont mis à la diète pendant la nuit avant les injections sous-cutanées (SC). Environ 0,5 mg/kg (dans 0,5 ml) d'hirulog-B2 est administré SC pendant une minute. Les niveaux d'hirulog-B2 dans le plasma réalisent un pic dans la première heure après l'injection à 57 10 ng/ml et ils déclinent ensuite. La demi-vie d'élimination moyenne qui suit l'injection SC est de 58 minutes (tableau 4). Les niveaux d'hirulog-B2 dans le plasma sont à environ 2 ng/ml à 6 heures après l'injection SC, et ils sont relativement constants de 6 à 8 heures.
C. ELECTROTRANSPORT D'HIRULOG-B2.
Les systèmes d'électrotransport utilisés pour la délivrance d'hirulog-B2 in vivo comprennent une unité contenant du médicament à jeter qui est en contact électrique avec un élément de commande de courant réutilisable. L'unité contenant du médicament à jeter est constituée d'un ruban de mousse adhésive à base de polyéthylène, de qualité médicale, laminé et recevant à la fois la contre-électrode anodique en feuille d'argent et une électrode cathodique en film de polyisobutylène chargé d'AgCl, et les gels respectifs. Le gel d'anode est en contact avec l'anode à base de feuille d'argent. Le gel d'interface cathodique est en contact avec l'électrode cathodique à base d'AgCl. Le gel d'interface est séparé du gel donneur contenant le médicament par une membrane échangeuse de cations.
Le gel donneur est placé dans la cavité cathodique du logement de gel, juste avant l'application du système.
Les gels de médicament sont imbibés le jour avant l'électrotransport par de l'hirulog-B2 dans un tampon d'acétate (10mM, pH 5) pour donner une concentration finale de 5mM de peptide. La superficie de contact
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avec la peau pour chaque gel de médicament est de 6 cama.
La densité de courant appliquée est de 0, 1 mA/cm.
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Les systèmes d'électrotransport sont contrôlés en ce qui concerne le courant et la tension pendant l'électrotransport pour confirmer une continuité électrique du système. Des valeurs de tension sont avantageuses pour ce modèle animal et elles indiquent une diminution initiale suivie par des valeurs presque constantes pendant la durée d'étude. La demi-vie d'élimination moyenne qui suit la fin de l'électrotransport est de 28 minutes (tableau 4). La demi-vie d'accumulation moyenne au début de l'électrotransport est de 38 minutes. Les niveaux d'hirulog-B2 dans le plasma réalisent un pic après 4 heures d'électrotransport continu à 23 6 ng/ml. Les niveaux d'hirulog-B2 dans le plasma restent relativement stables, à 21 7 ng/ml, depuis 2 jusqu'à 6 heures d'électrotransport, et ils diminuent lentement à 8 heures.
La diminution apparente des niveaux d'hirulog-B2 dans le plasma de 6 à 8 heures d'électrotransport peut être due à un épuisement d'hirulog-B2 dans l'hydrogel donneur. Une rapide diminution des niveaux d'hirulog-B2 dans le plasma se produit après la fin de l'électrotransport. A 2 heures après la fin de l'électrotransport, les niveaux d'hirulog-B2 dans le plasma sont de 2 ng/ml ou au voisinage.
L'élimination moyenne à partir de trois systèmes d'électrotransport à la suite de la fin de l'électrotransport est de 32 minutes tandis que la demivie d'accumulation moyenne au début de l'électrotransport est de 33 minutes (tableau 4). Le niveau d'hirulogB2 dans le plasma réalise un pic après 2 heures d'électrotransport à 9 ng/ml après quoi il y a un faible déclin des niveaux d'hirulog-B2 dans le plasma.
Les débits transdermiques, calculés à la fois
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sous la forme d'une vitesse d'entrée (g/h) et d'un flux par unité de surface (g/cmh), sont calculés en utili- sant des analyses à la fois à un compartiment et sans compartiment. L'analyse sans compartiment calcule le
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flux de médicament transdermique à partir de la concentration du médicament dans le sang de l'animal, cette concentration étant mesurée en utilisant des techniques standards, et la vitesse connue à laquelle le médicament particulier est évacué du sang.
L'analyse à un compartiment calcule le flux transdermique de médicament à partir de la concentration (c'est-à-dire celle mesurée) du médicament dans le sang de l'animal et l'hypothèse que l'absorption par l'animal du médicament administré par délivrance IV à une vitesse particulière quelconque est la même que celle atteinte par une administration par électrotransport, en vue d'obtenir une concentration particulière de médicament dans le sang. Les modèles à un compartiment et sans compartiment sont discutés dans Pharmacokinetics, M. Gibaldi, 2ème éd., Marcel Dekker (1982) p. 1-5 et 319-322. Les flux transdermiques d'entrée et par unité de surface utilisant les deux analyses sont indiqués dans le tableau 5.
La vitesse d'entrée moyenne est calculée comme étant de 1873 444 g/h, et le flux est calculé comme étant de 78 18 g h''cm' pour quatre systèmes ETS (hirulog-B2) utilisant le modèle à un compartiment. En utilisant une analyse sans compartiment, la vitesse d'entrée est calculée comme étant de 1900 t 523 g/h, et le flux est calculé comme étant de 79 22 22 h-'cm-2 pour quatre systèmes ETS (hirulog-B2). Un flux moyen de 22 Mg h''cm' est calculé pour l'animal de la phase de dépistage 2 qui reçoit trois systèmes ETS (hirulog-B2).
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TABLEAU 5 Vitesses d'entrée et flux d'électrotransport calculés pour hirulog-B2 chez des porcs
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<tb>
<tb> Phase <SEP> Cochon <SEP> Cochon <SEP> Cochon
<tb> définitive <SEP> 303 <SEP> 304 <SEP> 305 <SEP> Moyenne <SEP> DS
<tb> 4-ETS <SEP> (un <SEP> compartiment)
<tb> Ka <SEP> [l/h] <SEP> 3,64 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 2,94 <SEP> 3,03 <SEP> 0,58
<tb> Vitesse <SEP> [g/h] <SEP> 1361 <SEP> 2096 <SEP> 2161 <SEP> 1873 <SEP> 444
<tb> Flux <SEP> [ g/cm2h] <SEP> 56,7 <SEP> 87,3 <SEP> 90,0 <SEP> 78, <SEP> 0 <SEP> 18,5
<tb> 4-ETS <SEP> (sans
<tb> compartiment)
<tb> Vitesse <SEP> [g/h] <SEP> 1396 <SEP> 1866 <SEP> 2440 <SEP> 1900 <SEP> 523
<tb> Flux <SEP> [ g/cm2h] <SEP> 58,2 <SEP> 77,8 <SEP> 101,7 <SEP> 79, <SEP> 2 <SEP> 21,8
<tb> Phase <SEP> de <SEP> Cochon
<tb> dépistage <SEP> SC-3A
<tb> 3-ETS <SEP> (un
<tb> compartiment)
<tb> Ka <SEP> [l/h] <SEP> 3,
<SEP> 15
<tb> Vitesse <SEP> [g/h] <SEP> 392
<tb> Flux <SEP> [JLg/cm2h] <SEP> 21,8
<tb> 3-ETS <SEP> (sans
<tb> compartiment)
<tb> Vitesse <SEP> [ g/h] <SEP> 412
<tb> Flux <SEP> [ g/cm2h] <SEP> 22,9
<tb>
Donc, des procédés pour accroître le flux par électrotransport d'agents polypeptidiques sont décrits.
Bien que des formes de réalisation préférées de la présente invention aient été décrites dans un certain détail, il est entendu que des variantes évidentes peuvent être réalisées sans sortir de l'esprit et du cadre de l'invention, telle qu'elle est définie par les revendications annexées.