DE19681438B4 - Verwendung von Polypeptidanaloga mit erhöhter Elektrotransportierbarkeit und Parathormon (PTH) - Analog - Google Patents

Verwendung von Polypeptidanaloga mit erhöhter Elektrotransportierbarkeit und Parathormon (PTH) - Analog Download PDF

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Abstract

Verwendung eines Polypeptidanalogs, in welchem ein oder mehrere α-helikale und/oder β-Faltblatt-Abschnitte zerstört sind, zur Herstellung einer Zusammensetzung, die nützlich ist zum Abgeben eines Polypeptidmittels durch eine Körperoberfläche unter Verwendung einer Elektrotransportvorrichtung, wobei das Polypeptidanalog durch ein Verfahren erzeugt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass
ein Ausgangspolypeptid mit einem α-helikalen und/oder β-Faltblatt-Abschnitt bereitgestellt wird,
ein oder mehrere Aminosäurereste des Ausgangspolypeptids durch einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pro, Gly, Asn und Ser, substituiert werden, um einen oder mehrere α-helikale und/oder β-Faltblatt-Abschnitte des Ausgangspolypeptids zu zerstören, um ein Polypeptidanalog zu erzeugen, wobei das Polypeptidanalog eine bessere/verstärkte Elektrotransportierbarkeit im Vergleich zu dem Ausgangspolypeptid aufweist.

Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptidanalogs, in welchem ein oder mehrere α-helikale und/oder β-Faltblatt-Abschnitte zerstört sind, zur Herstellung einer Zusammensetzung, die nützlich ist zum Abgeben eines Polypeptidmittels durch eine Körperoberfläche unter Verwendung einer Elektrotransportvorrichtung.
  • STAND DER TECHNIK
  • Eine transdermale (d. h. durch die Haut erfolgende) Abgabe therapeutischer Mittel bietet eine komfortable, zweckmäßige und nichtinvasive Technik zum Verabreichen von Arzneimitteln. Das Verfahren bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Verfahren einer Arzneimittelabgabe. Beispielsweise werden variable Absorptionsraten und (z. B. hepatischer) Metabolismus, mit denen man bei einer oralen Behandlung konfrontiert wird, vermieden und andere damit verbundene Unannehmlichkeiten – z. B. eine gastrointestinale Irritation und ähnliches – beseitigt. Eine transdermale Abgabe ermöglicht auch ein hohes Ausmaß an Kontrolle über Blutkonzentrationen eines bestimmten Arzneimittels und ist eine besonders attraktive Verabreichungsroute für Arzneimittel mit engen therapeutischen Indizes, kurzen Halbwertszeiten und hohen Aktivitäten.
  • Eine transdermale Abgabe kann entweder passiv oder aktiv erfolgen. Viele Arzneimittel sind für eine passive transdermale Arz neimittelabgabe aufgrund ihrer Größe, ihren ionischen Ladungseigenschaften und ihrer Hydrophobizität nicht geeignet. Ein Verfahren zum Überwinden dieser Einschränkung ist die Verwendung geringer Pegel von elektrischem Strom, um Arzneimittel aktiv in den Körper durch intakte Haut zu transportieren. Diese Technik ist als „Elektrotransport” oder „iontophoretische” Arzneimittelabgabe bekannt. Diese Technik stellt ein besser steuerbares Verfahren als passive transdermale Arzneimittelabgabe bereit, da Amplitude, Zeitverlauf und Polarität des eingesetzten elektrischen Stroms leicht unter Einsatz von elektrischen Standardkomponenten gesteuert wird. Diesbezüglich kann ein Elektrotransport-Arzneimittelfluß 50% bis mehrere Größenordnungen höher als der passive Transdermalfluß desselben Arzneimittels sein.
  • Elektrotransportvorrichtungen setzen im allgemeinen mindestens zwei Elektroden ein. Beide Elektroden sind in engem elektrischem Kontakt mit einem Abschnitt der Haut des Körpers angeordnet. Eine Elektrode, die als aktive oder Donorelektrode bezeichnet wird, ist die Elektrode, von der das therapeutische Mittel in den Körper abgegeben wird. Die andere Elektrode, die als Gegen- oder Rückelektrode bezeichnet wird, dient dazu, den elektrischen Stromkreis durch den Körper zu schließen. In Verbindung mit der Haut des Patienten wird der Stromkreis durch Verbindung der Elektroden mit einer Quelle elektrischer Energie, z. B. einer Batterie, und üblicherweise mit einem Stromkreis, der in der Lage ist, den durch die Vorrichtung fließenden Strom zu steuern, vervollständigt.
  • Abhängig von der elektrischen Ladung der transdermal abzugebenden Molekülspezies kann entweder die Anode oder die Kathode die aktive oder Donorelektrode sein. Wenn diesbezüglich die ionische Substanz, die in den Körper geleitet werden soll, positiv geladen ist, dann ist die positive Elektrode (die Anode) die aktive Elektrode und die negative Elektrode (die Kathode) dient als die Gegenelektrode, die den Stromkreis vervollständigt. Wenn andererseits die abzugebende ionische Substanz negativ geladen ist, dann ist die kathodische Elektrode die aktive Elektrode und die anodische Elektrode ist die Gegenelektrode. Alternativ können sowohl die Anode als auch die Kathode dazu verwendet werden, Arzneimittel geeigneter Ladung in den Körper abzugeben. In diesem Falle werden beide Elektroden als aktive oder Donorelektroden angesehen. In anderen Worten kann die anodische Elektrode positiv geladene Mittel in den Körper abgeben, während die kathodische Elektrode negativ geladene Mittel in den Körper abgeben kann.
  • Bestehende Elektrotransportvorrichtungen erfordern zusätzlich ein Reservoir oder eine Quelle des therapeutischen Mittels, das in den Körper abgegeben werden soll. Derartige Arzneimittelreservoire sind mit der Anode oder der Kathode der Elektrotransportvorrichtung verbunden, um eine fixierte oder erneuerbare Quelle für ein(e) oder mehrere gewünschte Molekülspezies oder Mittel bereitzustellen. Beispiele für Reservoire und Quellen umfassen eine Tasche, wie in dem U.S.-Patent Nr. 4,250,878 von Jacobsen beschrieben, einen vorgeformten Gelkörper, wie in dem U.S.-Patent Nr. 4,382,529 von Webster offenbart, und einen Glas- oder Kunststoffbehälter, der eine flüssige Lösung des Arzneimittels enthält, wie in den Figuren des U.S.-Patents Nr. 4,722,726 von Sanderson et al. offenbart.
  • Von besonderem Interesse ist hier die transdermale Elektrotransportabgabe von Peptiden, Polypeptiden und Proteinen aufgrund der Probleme, denen man bei üblicheren Arzneimittelabgaberouten, wie oraler Abgabe, begegnet. Polypeptid- und Proteinmoleküle sind hochanfällig für einen Abbau durch proteolytische Enzyme in dem Gastrointestinaltrakt und sind einem intensiven hepatischen Metabolismus unterworfen, wenn sie oral eingenommen werden. Polypeptide und Proteine erfordern üblicherweise eine parenterale Verabreichung, um therapeutische Konzentrationen im Blut eines Patienten zu erzielen. Die meisten herkömmlichen parenteralen Verabreichungstechniken sind subkutane Injektionen und eine intravenöse Verabreichung. Polypeptide und Proteine sind jedoch inhärent hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität kurzwirksam, erfordern häufige Injektionen, oftmals mehrmals täglich, um die benötigten therapeutisch wirksamen Konzentrationen aufrechtzuerhalten. Patienten finden dieses Behandlungsschema häufig unbequem, schmerzhaft und mit einem damit verbundenen Risiko von z. B. Infektionen behaftet.
  • Es wurden große Anstrengungen unternommen, andere Routen (als parenterale Injektionen) für eine effektive Verabreichung von pharmazeutischen Polypeptiden und Proteinen zu finden. Verabreichungsrouten mit weniger Nebenwirkungen wie auch besserer Akzeptanz durch die Patienten sind von besonderem Interesse gewesen. Derartige alternative Routen haben allgemein eine ”abgeschirmte” orale Verabreichung, bei der das Polypeptid/Protein aus einer Kapsel oder einem anderen Behälter freigesetzt wird, nachdem diese bzw. dieser die Niedrig-pH-Umgebung des Magens passiert hat, eine Abgabe durch die Schleimhautgewebe, z. B. die Schleimhautgewebe der Lunge mit Inhalationsvorrichtungen oder die Nasenschleimhautgewebe mit Nasensprays, und implantierbare Pumpen umfaßt. Unglücklicherweise sind diese alternativen Routen einer Polypeptid/Proteinabgabe nur begrenzt erfolgreich gewesen.
  • Bei einer transdermalen Elektrotransportabgabe von Polypeptiden und Proteinen sind auch technische Schwierigkeiten aufgetreten. Beispielsweise ist Wasser das bevorzugte flüssige Lösemittel zur Bildung der Lösung des durch Elektrotransport abzugebenden Arzneimittels aufgrund seiner hervorragenden biologischen Verträglichkeit. Die Haut enthält proteolytische Enzyme, die das Polypeptid/Protein abbauen können, wenn es transdermal abgegeben wird. Zusätzlich können bestimmte Polypeptide/Proteine, insbesondere jene, die für das behandelte Tier nicht nativ sind, Hautreaktionen, z. B. eine Sensibilisierung oder Irritation, hervorrufen.
  • Eine Reihe von Forschern hat eine Elektrotransportabgabe von Polypeptiden und Proteinen offenbart. Eine frühe Untersuchung von R. Burnette et al., J. Pharm. Sci. (1986) 75: 738, umfaßte die in vitro-Hautpermeation von Thyreotropin-releasing-Hormon, einem kleinen Tripeptidmolekül. Es wurde festgestellt, daß der Elektrotransportfluß höher als der passive Fluß aufgrund von Diffusion war. Chien et al., J. Pharm. Sci, (1988) 78: 376, zeigten sowohl in in vitro- als auch in vivo-Studien, daß eine transdermale Abgabe von Vasopressin und Insulin über Elektrotransport möglich war. Siehe auch Maulding et al., U. S. Statutory Invention Registration No. H1160, die eine Elektrotransportabgabe von Calcitonin an kleinen Schweinen (Minipigs) offenbart.
  • Mehrere Strategien (andere, als einfach die eingesetzten Pegel von Elektrotransportstrom zu erhöhen) sind eingesetzt worden, um den transdermalen Elektrotransportfluß von Polypeptid- und Proteinarzneimitteln zu verstärken. Eine Strategie umfaßt die Verwendung von Flußverstärkern, wie ionischen grenzflächenaktiven Stoffen. Siehe z. B. Sanderson et al., U.S.-Patent 4,722,726 . Eine andere Strategie verwendet andere Colösemittel als gerade Wasser, um den Elektrotransportfluß zu verbessern. Siehe z. B. Europäische Patentanmeldung 0 278 473 . Noch eine weitere Strategie umfaßt, die äußere Schicht (d. h. das Stratum corneum) der Haut vor der Elektrotransportabgabe durch diese zu zerreißen. Siehe z. B. Lee et al., U.S.-Patent 5,250,023 .
  • Weitere Strategien zur Verstärkung des transdermalen Elektrotransport-Arzneimittelflusses umfassen, ein Prodrug oder ein Analog des Arzneimittels von Interesse zu erzeugen und das Prodrug oder modifizierte Analog durch Elektrotransport zu transportieren. Beispielsweise offenbart WO 92/12999 eine Abgabe von Insulin als Insulinanalog, das eine verringerte Neigung zur Selbstassoziierung aufweist (anscheinend verringern assoziierte Formen von Insulin, die in herkömmlichen pharmazeutischen Zusammensetzungen vorliegen, eine transdermale Abgabe von Insulin). Die Analoga werden hergestellt, indem Asparaginsäure (Asp) oder Glutaminsäure (Glu) gegen andere Aminosäurereste an ausgewählten Positionen entlang der Insulinpolypeptidkette ausgetauscht werden. WO 93/25197 offenbart eine Abgabe von sowohl Peptid- als auch Nicht-Peptid-Arzneimitteln als Komplexe aus pharmazeutischen Mitteln und Modifizierungseinheiten oder Prodrugs, bei denen eine chemische Modifizierungseinheit (z. B. eine geladene Gruppe) kovalent an das pharmazeutische Ausgangsmittel gebunden ist. Die kovalente Bindung wird zerstört, nachdem das Mittel in den Körper abgegeben worden ist, wodurch das Ausgangsmittel freigesetzt wird. Ferner offenbart WO 95/11988 A1 Parathormon (PTH)-Analoga, die durch Austausch von Aminosäureresten an ausgewählten Positionen entlang der PTH-Polypeptidkette hergestellt wurden und eine verbesserte biologische Aktivität und/oder iontophoretische Transportierbarkeit aufweisen sollen.
  • Trotz der vorstehend erwähnten Strategien weisen nach wie vor einige Polypeptide einen schlechten transdermalen Elektrotransportfluß auf. Insbesondere beeinflußt bekanntermaßen die Peptid-Hydrophobizität den Elektrotransportfluß in vitro negativ. Verschiedene Parameter tragen zur Hydrophobizität bei, einschließlich der Primärstruktur eines Proteins, d. h. der Aminosäuresequenz des Moleküls, wie auch die Sekundärstruktur des Proteins, nämlich die reguläre, wiederkehrende, dreidimensionale Anordnung der Polypeptidkette. Eine derartige Konformation kann die Form helikaler Strukturen, wie einer α-Helix, oder einer weiter ausgedehnten Zick-Zack-Konformation, die als β-Konformation bekannt ist, einnehmen.
  • Die α-Helix umfaßt annähernd 3,6 Reste pro Helixwindung. Die R-Gruppen der Aminosäuren erstrecken sich von der Helix nach außen und es werden Wasserstoffbrückenbindungen innerhalb der Kette zwischen dem Sauerstoffatom der Carbonylgruppe des Rückgrats jedes Rests und dem Wasserstoffatom des Rückgrats, das an den elektronegativen Stickstoff des vierten Rests entlang der Kette gebunden ist, gebildet. Die Grundeinheit der β-Konformation ist der β-Strang, der als eine weniger eng verdrehte Helix mit 2,0 Resten pro Windung vorliegt. Die β-Strang-Konformation ist nur stabil, wenn sie in ein β-Faltblatt integriert ist, wo Wasserstoffbrückenbindungen mit annähernd optimaler bis optimaler Geometrie zwischen den Peptidgruppen einander benachbarter β-Stränge gebildet werden; die Dipolmomente der Stränge sind gleichfalls in günstiger Weise ausgerichtet. Seitenketten von benachbarten Resten des gleichen Strangs ragen aus gegenüberliegenden Seiten des Blatts hervor und Wechselwirken nicht miteinander, üben jedoch bedeutende Wechselwirkungen mit deren Rückgrat und mit den Seitenketten benachbarter Stränge aus. Hinsichtlich einer allgemeinen Beschreibung von α-Helices und β-Faltblättern siehe beispielsweise T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993); und A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 1975).
  • Die Zimm-Bragg-Parameter, s und σ (B. H. Zimm und J. K. Bragg, J. Chem. Phys. (1959) 31: 526–535) und Lifson-Roig-Gleichungen (S. Lifson und A. Roig, J. Chem. Phys. (1961) 34: 1963–1974) werden herkömmlicherweise verwendet, um die Stabilität eines helikalen Abschnitts in einem gegebenen Polypeptid zu bestimmen. S steht für die Helix-Knäuel-Stabilitätskonstante („helix-coil stability constant”) und σ ist der Nukleationsfaktor. Beruhend auf diesen Parametern kann die Wahrscheinlichkeit, daß sich an bestimmten Abschnitten von Polypeptidmolekülen α-Helices und β-Faltblätter bilden, vorausgesagt werden, indem verschiedene Berechnungsmethoden und Computerprogramme verwendet werden.
  • Siehe z. B. Finkelstein, A. V., Program „ALB” for Protein and polypeptide secondary structure calculation and prediction (1983); hinterlegt bei der Brookhaven Protein Data Bank, Upton, N. Y., und bei EMBL, Heidelberg, DE; Finkelstein, A. V., Biopolymers (1977) 16: 525–529; Finkelstein et al., Proteins: Structure, Function and Genetics (1991) 10: 287–299. Darüberhinaus sind Chou-Fasman-Wahrscheinlichkeiten (Chou, P. Y., und Fasman, G. D., Ann. Rev. Biochem. (1978) 47: 251–276) verwendet worden, um die Neigung eines bestimmten Aminosäurerestes, die α-Helix- und β-Faltblattbildung zu begünstigen oder ungünstig zu beeinflussen, zu bestimmen.
  • Jedoch sind diese Grundsätze früher nicht angewendet worden, um die hydrophoben Eigenschaften eines gegebenen Polypeptids zu verändern, um den Elektrotransportfluß desselben zu erhöhen.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Wie nachfolgend erläutert, wird der Elektrotransportfluß eines gegebenen Polypeptids verstärkt, indem dessen Sekundärstruktur zerstört wird. Insbesondere können Aminosäurereste, die bekanntermaßen α-helikale und β-Faltblatt-Abschnitte stabilisieren, durch destabilisierende Reste und bekannte Helixbrecher ersetzt werden. Auf diese Weise kann der Fluß des Polypeptids durch eine Körperoberfläche (z. B. die Haut) verstärkt werden, wodurch eine Elektrotransportabgabe einer größeren Reihe von Polypeptidarzneimitteln mit therapeutisch wirksamen Raten ermöglicht wird.
  • Dementsprechend betrifft die Erfindung die Verwendung eines Polypeptidanalogs, in welchem ein oder mehrere α-helikale und/oder β-Faltblatt-Abschnitte zerstört sind, zur Herstellung einer Zusammensetzung, die nützlich ist zum Abgeben eines Polypeptidmittels durch eine Körperoberfläche unter Verwendung einer Elektrotransportvorrichtung, wobei das Polypeptidanalog durch ein Verfahren erzeugt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Ausgangspolypeptid mit einem α-helikalen und/oder β-Faltblatt-Abschnitt bereitgestellt wird, ein oder mehrere Aminosäurereste des Ausgangspolypeptids durch einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pro, Gly, Asn und Ser, substituiert werden, um einen oder mehrere α-helikale und/oder β-Faltblatt-Abschnitte des Ausgangspolypeptids zu zerstören, um ein Polypeptidanalog zu erzeugen, wobei das Polypeptidanalog eine bessere/verstärkte Elektrotransportierbarkeit im Vergleich zu dem Ausgangspolypeptid aufweist. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 6.
  • Die Erfindung betifft auch ein Parathormon (PTH)-Analog, das die in 1D gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt.
  • Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden sich Fachleuten auf diesem Gebiet im Lichte der hier gegebenen Offenbarung leicht erschließen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Aminosäuresequenz verschiedener Parathormon („PTH”)-Moleküle, die verwendet werden, um die Erfindung zu erläutern. 1A zeigt die Aminosäuresequenz des Wildtyp- oder Ausgangs-PTH-Polypeptids. 1B zeigt die Aminosäuresequenz des PTH-Analogs 1 (1-35). 1C zeigt die Aminosäuresequenz des PTH-Analogs 2 (1-35). HSL bezeichnet Homoserin/Homoserin-lacton. Die unterstrichenen Reste in den 1B und 1C zeigen Positionen einer Substitution an.
  • Die 2 zeigt die Aminosäuresequenzen von verschiedenen Hirudinderivat-Polypeptiden, die verwendet werden, um die Erfindung zu erläutern. 2A zeigt die Aminosäuresequenz eines Hirulog-Ausgangspolypeptids. 2B zeigt die Aminosäuresequenz von Hirulog-1. 2C zeigt die Sequenz von Hirulog-B2.
  • 3 ist eine schematische Ansicht einer repräsentativen Elektrotransport-Arzneimittelabgabevorrichtung.
  • 4 ist eine Auftragung der mittleren Rest-Elliptizität von mehreren Parathormon-Analoga gegen die Konzentration von Trifluorethanol.
  • 5 ist eine Auftragung der mittleren Rest-Elliptizität von zwei Hirudinderivat-Polypeptiden gegen die Konzentration von Trifluorethanol.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die praktische Ausführung der Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Verfahren der Proteinchemie, Elektrochemie, Molekularbiologie und von rekombinanten DNA-Techniken, die dem Stand der Technik angehören, einsetzen. Derartige Techniken sind vollständig in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 1975); J. S. Newman, Electrochemical Systems (Prentice Hall, 1973); A. J. Bard und L. R. Faulkner, Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications (John Wiley & Sons, 1980); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
  • Es muß festgehalten werden, daß, wie in diesen Unterlagen und den beigefügten Ansprüchen verwendet, die Singularformen „ein”, „eine” und „der/die/das” pluralische Bezugnahmen mit einbeziehen, sofern der Inhalt nicht eindeutig etwas anderes angibt. Dementsprechend umfaßt beispielsweise die Bezugnahme auf „ein Polypeptid” eine Mischung von zwei oder mehr Polypeptiden u. s. w.
  • I. DEFINITIONEN
  • Bei der Beschreibung der Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet und sollen, wie nachfolgend angegeben, definiert sein.
  • Hier werden die Begriffe „Elektrotransport”, „Iontophorese” und „iontophoretisch” für eine Bezugnahme auf die Abgabe eines oder mehrerer pharmazeutisch aktiver Polypeptidmittel durch eine Körperoberfläche (z. B. Haut) mittels einer an ein das Mittel enthaltendes Reservoir angelegten elektromotorischen Kraft verwendet. Das Mittel kann durch Elektromigration, Elektroporation, Elektroosmose oder eine beliebige Kombination von diesen abgegeben werden. Elektroosmose ist auch als Elektrohydrokinese, Elektrokonvektion und elektrisch induzierte Osmose bezeichnet worden. Im allgemeinen resultiert Elektroosmose einer Spezies in ein Gewebe aus der Wanderung von Lösemittel, in dem die Spezies enthalten ist, als Ergebnis des Anlegens von elektromotorischer Kraft an das Reservoir der therapeutischen Spezies, d. h. aus einem Lösemittelfluß, der durch Elektromigration anderer ionischer Spezies induziert wird. Während des Elektrotransportprozesses können bestimmte Modifizierungen oder Veränderungen der Haut auftreten, wie die Bildung vorübergehend existierender Poren in der Haut, was auch als „Elektroporation” bezeichnet wird. Jeder elektrisch unterstützte Transport von Spezies, der durch Modifizierungen oder Veränderungen der Körperoberfläche (z. B. die Bildung von Poren in der Haut) verstärkt wird, wird gleichfalls von dem Begriff ”Elektrotransport”, wie er hier verwendet wird, umfaßt. Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Elektrotransport”, „Iontophorese” und „iontophoretisch” dementsprechend auf (1) die Abgabe geladener Mittel durch Elektromigration, (2) die Abgabe von ungela denen Mitteln durch das Verfahren der Elektroosmose, (3) die Abgabe von geladenen oder ungeladenen Mitteln durch Elektroporation, (4) die Abgabe von geladenen Mitteln durch die kombinierten Verfahren von Elektromigration und Elektroosmose und/oder (5) die Abgabe einer Mischung geladener und ungeladener Mittel durch die kombinierten Verfahren von Elektromigration und Elektroosmose.
  • Die Begriffe „Polypeptid”, „Polypeptidmittel” und „Polypeptidarzneimittel” werden hier austauschbar verwendet, um jegliches biologisch aktives Polymer aus Aminosäureresten zu bezeichnen. Die Begriffe umfassen Peptide, Oligopeptide, Dimere, Multimere und ähnliches. Derartige Polypeptide können aus natürlichen Quellen abgeleitet sein oder können synthetisiert oder rekombinant erzeugt worden sein. Die Begriffe umfassen auch nach der Expression erfolgende Modifikationen des Polypeptids, z. B. Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, u. s. w.
  • Ein Polypeptidarzneimittel oder -mittel, wie hier definiert, wird im allgemeinen aus den 20 natürlichen Aminosäuren Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gin (Q), Glu (E), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y) und Val (V) gebildet und kann auch jegliche der verschiedenen bekannten Aminosäureanaloga umfassen, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetisierte Analoga, wie, aber nicht darauf beschränkt, Homoisoleucin, Asaleucin, 2-(Methylencyclopropyl)glycin, S-Methyl-cystein, S-(Prop-1-enyl)cystein, Homoserin, Ornithin, Norleucin, Norvalin, Homoarginin, 3-(3-Carboxyphenyl)alanin, Cyclohexylalanin, Mimosin, Pipecolinsäure, 4-Methylglutaminsäure, Canavanin, 2,3-Diaminopropionsäure und ähnliche. Weitere Beispiele von Polypeptidmitteln, die in der Erfindung Verwendung finden, werden nachfolgend aufgeführt.
  • Durch „Ausgangs”polypeptid, -polypeptidmittel oder -polypeptidarzneimittel wird ein Polypeptid, wie vorstehend definiert, bezeichnet, das α-helikale oder β-Faltblatt-Abschnitte umfaßt, die so modifiziert werden können, daß der Elektrotransportfluß des Polypeptids verstärkt wird. Insbesondere wird ein Ausgangspolypeptid im allgemeinen ungefähr 10 bis ungefähr 50 Aminosäurereste, mehr bevorzugt ungefähr 10 bis ungefähr 40 Aminosäurereste umfassen. Darüberhinaus ist das Ausgangspolypeptid eines, das nicht dazu neigt, eine stabile gefaltete Tertiärstruktur in Lösung, z. B. als Ergebnis einer hohen Konzentration von Cys-Resten, anzunehmen. Das Ausgangspolypeptid kann ein natürlich vorkommendes Polypeptid sein oder kann selbst strukturelle Unterschiede gegenüber einem natürlich vorkommenden Polypeptid aufweisen, wie Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -hinzufügungen wie auch posttranslationale Modifikationen, wie sie vorstehend beschrieben wurden.
  • Durch Polypeptid”analog” wird ein Polypeptid, wie vorstehend definiert, bezeichnet, das aus der Modifizierung der Sekundärstruktur das Ausgangspolypeptids resultiert. Diesbezüglich unterscheidet sich das Analog von der Ausgangsverbindung aufgrund der Substitution von einem oder mehreren Aminosäureresten derart, daß ein oder mehrere in dem Ausgangsmolekül vorliegende α-helikale und/oder β-Faltblatt-Abschnitte zerstört sind. Geeignete Aminosäuresubstitutionen werden vollständiger nachfolgend beschrieben. Das Analog kann auch zusätzliche Modifikationen enthalten, die die Sekundärstruktur nicht beeinflussen, wie zusätzliche Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -hinzufügungen, oder posttranslationale Modifikationen, wie vorstehend beschrieben. Das Analog kann auch in neutraler Form oder in Salzform vorliegen, z. B. als Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen der Polypeptidanaloga), die mit anorganischen Säuren, wie beispielsweise Salzsäure oder Phosphorsäure, oder solchen organischen Säuren, wie Essigsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Weinsäure, Mandelsäure und ähnlichen Säuren, gebildet werden. Salze, die von freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen, wie beispielsweise von Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-hydroxiden, und solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin und ähnlichen Verbindungen, abgeleitet sein. Das Polypeptidanalog wird zumindest einen Teil der biologischen Aktivität des Ausgangspolypeptids aufweisen und wird mehr bevorzugt die gleiche oder eine höhere biologische Aktivität als das Ausgangsmolekül aufweisen.
  • Durch „Verstärken des Elektrotransports” eines Polypeptids ist gemeint, den Elektrotransportfluß des Polypeptids durch die Körperoberfläche (z. B. die Haut oder Schleimhaut) im Vergleich zu dem Ausgangspolypeptid zu erhöhen. Der transdermale Elektrotransportfuß kann unter Einsatz mehrerer im Stand der Technik wohlbekannter in vivo- und in vitro-Methoden bestimmt werden. In vitro-Methoden umfassen, ein Stück Haut eines geeigneten Tieres (z. B. Haut von menschlichen Leichen) zwischen die Donor- und Rezeptorkammern einer Elektrotransportflußzelle einzuspannen, wobei die Stratum corneum-Seite des Hautstücks der Donorkammer zugewandt ist. Eine flüssige Lösung oder ein Gel, die bzw. das das abzugebende Arzneimittel enthält, wird in Kontakt mit dem Stratum corneum angeordnet, und die Elektroden werden mit einem elektrischen Strom beaufschlagt, wobei sich eine Elektrode in jeder Kammer befindet. Der transdermale Fluß wird berechnet, indem die Menge an Arzneimittel in der Rezeptorkammer bestimmt wird. Zwei erfolgreiche Modelle, die verwendet werden, um die transdermale Elektrotransport-Arzneimittelabgabe zu optimieren, sind das isolierte Schweinehautlappen-Modell von Riviere, M. C. Heit, et al., J. Pharm. Sci. 82, 240–243 (1993) und die Verwendung isolierter haarloser Haut beispielsweise von haarlosen Nagetieren oder Meerschweinchen. Sie he B. W. Hadzija et al., J. Pharm. Pharmacol. 44, 387–390 (1992).
  • II. WEISEN ZUM AUSFÜHREN DER ERFINDUNG
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine Substitution durch Aminosäuren vorgenommen, die α-helikale und/oder β-Faltblatt-Abschnitte eines Polypeptidmoleküls zerstören, um den Elektrotransportfluß dieses Moleküls im Vergleich zu dem Fluß des Ausgangspolypeptids zu erhöhen. Dies ermöglicht dementsprechend einen Elektrotransport einer großen Anzahl von Substanzen, die ansonsten einer derartigen Abgabe nicht zugänglich wären. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, scheint es, daß derartige Sekundärveränderungen die Neigung hydrophober Seitenketten von Aminosäureresten, wie Leu, Phe und Trp, verringern, sich räumlich in Gruppen zusammenzulagern. Dementsprechend wird die Fähigkeit des Moleküls verringert, sich an hydrophobe Bereiche in der Haut während eines Elektrotransports zu binden, wodurch das Hindurchtreten des Polypeptids durch die Haut erleichtert wird.
  • Die Erfindung wird unter Verwendung eines Parathormon (PTH)-Moleküls und eines Hirudinderivats als Ausgangsverbindungen erläutert. PTH ist ein Peptidhormon, das die homöo-statische Kontrolle des Calcium- und Phosphatmetabolismus steuert, und ist zur Behandlung von Osteoporose eingesetzt worden. Wildtyp-PTH ist in 1A gezeigt. Das Molekül hat 34 Aminosäurereste und ein Molekulargewicht von annähernd 4000 Dalton. Wie hier gezeigt, zeigt das Molekül eine sehr große Neigung, die α-helikale Konformation anzunehmen.
  • Hirulog ist ein auf Hirudin basierendes synthetisches Peptid-Antikoagulans, das wirksam sowohl freies als auch an Fibrin gebundenes Thrombin inhibiert. Es ist gezeigt worden, daß Hirulog postoperative Venenthrombosen bei Patienten, die sich einem orthopädischen chirurgischen Eingriff unterziehen, inhibiert. Die Sequenz der Ausgangs-Hirulogverbindung, die zur Erläuterung der Erfindung verwendet wird, ist in 2A gezeigt.
  • Obwohl die Erfindung unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Ausgangssubstanzen erläutert wird, findet diese gleichfalls Verwendung bei vielen verschiedenen anderen Ausgangsproteinen und -polypeptidmitteln, wie andere von eukaryotischen, prokaryotischen und viralen Quellen abgeleiteten Polypeptiden, wie auch synthetischen Peptiden. Derartige Polypeptide weisen im allgemeinen ungefähr 10 bis ungefähr 50 Aminosäuren und eine einer Manipulation zugängliche Sekundärstruktur auf und neigen nicht dazu, eine stabile gefaltete Tertiärstruktur anzunehmen z. B. als Ergebnis einer hohen Konzentration von Cys-Resten. Derartige Polypeptide umfassen ohne Einschränkung Peptidarzneimittel, die Antibiotika und antivirile Mittel sind, Antineoplastika, Immunmodulatoren, Peptidhormone, wie ACTH, CRF, GHRH, Cholezystokinin, Dynorphine, Endorphine, Endothelin, Fibronectin-Fragmente, Galanin, Gastrin, Insulinotropin, Glucagon, Fragmente von GTP-bindendem Protein, Guanylin, die Leukokinine, Magainin, Mastoparane, Dermaseptin, Systemin, Neuromedine, Neurotensin, Pancreastatin, Pankreas-Polypeptide, Substanz P, Sekretin, Thymosin und ähnliche Verbindungen.
  • Die Sekundärstruktur des Ausgangspolypeptids wird manipuliert, indem ein oder mehrere ausgewählte Aminosäurereste der Ausgangsverbindung durch einen oder mehrere Aminosäurereste, die eine geringere Neigung zeigen, α-helikale und/oder β-Faltblatt-Konformationen zu bilden und aus der Gruppe bestehend aus Pro, Gly, Asn und Ser ausgewählt sind, ausgetauscht werden. Jeder Aminosäurerest zeigt Präferenzen hinsichtlich der Konformation. Ein Maß für die relative Neigung eines bestimmten Rests, an einer α-Helix oder einem β-Strang beteiligt zu sein, ist durch die Parameter Pα und Pβ definiert worden (Chou, P. Y., und Fas man, G. D., Ann. Rev. Biochem. (1978) 47: 251–276). Eine aktualisierte und überarbeitete Liste von Pα- und Pβ-Werten ist in Tabelle 1 aufgeführt. Die Pα-Werte in Tabelle 1, die größer als 1,00 sind, repräsentieren Aminosäuren, die α-helikale Konformationen begünstigen, und werden hier als „hohe Pα-Werte” definiert. In ähnlicher Weise repräsentieren die Pβ-Werte in Tabelle 1, die größer als 1,00 sind, Aminosäuren, die eine β-Strangbildung begünstigen, und werden hier als „hohe Pβ-Werte” definiert. Die Aminosäuren mit Pα- und Pβ-Werten von 1,00 oder weniger wirken sich negativ auf die sekundären Konformationen aus oder zerstören sie und werden hier als „niedrige Pα-Werte” bzw. niedrige Pβ-Werte” definiert.
  • Dementsprechend haben beispielsweise die Aminosäuren Glu, Ala und Leu hohe Pα-Werte und begünstigen eine Helixbildung, während Pro, Gly, Ser, Cys, Tyr und Asn niedrige Pα-Werte aufweisen und sich dementsprechend negativ auf eine Helixbildung auswirken. In ähnlicher Weise haben die Aminosäurereste Val, Ile und Tyr hohe Pβ-Werte und begünstigen eine β-Strangbildung, während die Aminosäuren Pro, Asp, Asn, Glu und Gly sich auf eine derartige Bildung negativ auswirken. Kombiniert man die Pα- und Pβ-Werte, sind die Aminosäuren, die die geringste Neigung zur Bildung dieser Sekundärstrukturtypen zeigen sollten, Gly, Asn, Pro und Ser. TABELLE 1* Konformationspräferenzen der Aminosäuren
    Aminosäurerest α-Helix (Pα) β-Strang (Pβ)
    Glu 1,59 0,52
    Ala 1,41 0,72
    Leu 1,34 1,22
    Met 1,30 1,14
    Gin 1,27 0,98
    Lys 1,23 0,69
    Arg 1,21 0,84
    His 1,05 0,80
    Val 0,90 1,87
    Ile 1,09 1,67
    Tyr 0,74 1,45
    Cys 0,66 1,40
    Trp 1,02 1,35
    Phe 1,16 1,33
    Thr 0,76 1,17
    Gly 0,43 0,58
    Asn 0,76 0,48
    Pro 0,34 0,31
    Ser 0,57 0,96
    Asp 0,99 0,39
    • * Die Daten in Tabelle 1 wurden aus T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993), S. 256 entnommen.
  • Ein Abschnitt mit einer bestimmten Sekundärstruktur ist wesentlich wahrscheinlicher, wenn mehrere einander benachbarte Reste diese Struktur bevorzugen. Dementsprechend kann eine α-Helix vorhergesagt werden, wenn vier von sechs einander benachbarten Resten eine Helix begünstigen und wenn der durchschnittliche Pα-Wert größer als 1,05 und größer als Pβ ist. In ähnlicher Weise wird ein β-Strang vorhergesagt, wenn drei von fünf einander benachbarten Resten ein Faltblatt begünstigen und wenn der durchschnittliche Wert von Pβ größer als 1,04 und größer als Pα ist. T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993), S. 255–257.
  • Dementsprechend werden gemäß vorliegender Erfindung Aminosäurereste in Abschnitten des Moleküls, die zu einer α-Helix- und β-Faltblattbildung neigen, durch einen Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pro, Gly, Asn und Ser ersetzt.
  • Es sind auch andere Verfahren zur Bestimmung der Neigung eines Polypeptids, α-helikale und β-Faltblatt-Abschnitte zu bilden, bekannt. Beispielsweise kann das α-Helix-Potential eines linearen Polypeptids z. B. durch die Lifson-Roig-Gleichungen (S. Lifson und A. Roig, J. Chem. Phys. (1961) 34: 1963–1974) unter Verwendung von Werten für die Rest-Helixbildungsparameter, umgerechnet aus deren berechneten Zimm-Bragg-Werten (Zimm, B. H., und Bragg, J. K., J. Chem. Phys. (1959) 31: 526–535) unter Einsatz der Umrechnungsgleichungen von Qian und Schellman (Qian, H., und Schellman, J. A., J. Chem. Phys. (1992) 96: 3987–3994), abgeschätzt werden.
  • Genauer stehen die Zimm-Bragg-Parameter s und σ für die Helix-Knäuel-Stabilitätskonstante bzw. den Nukleationsfaktor. Für jeden Aminosäurerest ist ein Satz von Zimm-Bragg-s- und -σ-Werten definiert worden (siehe Tabelle 1 von Finkelstein et al., Proteins: Structure, Function and Genetics (1991) 10: 287–299), und die Wahrscheinlichkeit, daß die gesamte Polypeptidkette (oder eine definierte Untersequenz) eine α-Helix einneh men wird, kann unter Verwendung der erläuterten Gleichungen berechnet werden.
  • Die entsprechenden Lifson-Roig-Helixparameter u, v und w können gleichfalls verwendet werden, um eine ähnliche Bestimmung vorzunehmen (Lifson, S., und Roig, A., J. Chem. Phys. (1961) 34: 1963–1974). In dieser Hinsicht kann w, der verwendet wird, um eine Peptideinheit im Inneren einer nicht unterbrochenen Sequenz helikaler Zustände zu definieren, aus s berechnet werden. Der Lifson-Roig-Parameter v definiert eine Peptideinheit am Beginn oder am Ende einer nicht unterbrochenen Sequenz helikaler Zustände und kann aus dem Zimm-Bragg-Parameter σ1/2 berechnet werden. Der Faktor u definiert das statistische Gewicht der Knäuelregion und entspricht keinem Zimm-Bragg-Parameter.
  • Unter Verwendung dieser Parameter werden im allgemeinen zwei Berechnungsmethoden verwendet, um das α-Helixpotential abzuschätzen. Die erste nimmt den Lifson-Roig-Helixinitiationsparameter v als konstanten Wert von 0,039 an (d. h. der Zimm-Bragg-Parameter σ beträgt 0,0013 für alle Reste), wobei der Parameter w für jede Aminosäure aus dem Zimm-Bragg-Wert s, der in Tabelle 1 von Finkelstein et al., Proteins: Structure, Function and Genetics (1991) 10: 287–299, gefunden werden kann, berechnet wird. Das zweite Berechnungsverfahren nimmt nicht an, daß alle Reste den gleichen Wert für den Helixinitiationsparameter v aufweisen (d. h. der Zimm-Bragg-Parameter σ ist für jeden Aminosäurerest einzigartig). Unter Verwendung dieses Verfahrens können die Zimm-Bragg-Werte s und σ für jeden Rest aus Tabelle 1 von Skolnick, J., und Holtzer, A., Macromolecules (1982) 15: 812–821, bestimmt werden. Diese Verfahren werden eingehender nachfolgend in den Beispielen beschrieben.
  • Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptidanaloga können auf eine Vielzahl von Wegen, die als Stand der Technik wohlbekannt sind, hergestellt werden. Da die Analo ga relativ klein sind, d. h. bis zu ungefähr 50 Aminosäuren lang, können sie in dieser Hinsicht zweckmäßigerweise chemisch synthetisiert werden durch jede beliebige von mehreren Techniken, die den Fachleuten auf dem Gebiet der Peptide wohlbekannt sind. Im allgemeinen setzen diese Verfahren die sequenzielle Zugabe einer oder mehrerer Aminosäuren zu einer wachsenden Peptidkette ein. Normalerweise wird entweder die Amino- oder die Carboxylgruppe der ersten Aminosäure durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt. Die geschützte oder derivatisierte Aminosäure kann dann entweder an einen inerten festen Träger angeheftet oder in Lösung verwendet werden, indem die nächste Aminosäure in der Sequenz, bei der die komplementäre Gruppe (Amino- oder Carboxylgruppe) geeignet geschützt ist, unter Bedingungen, die die Bildung einer Amidverknüpfung ermöglichen, zugegeben wird. Die Schutzgruppe wird dann von dem neu zugesetzten Aminosäurerest entfernt und die nächste Aminosäure (in geeigneter Weise geschützt) wird dann zugesetzt, u. s. w. Nachdem die gewünschten Aminosäuren in der korrekten Abfolge verknüpft worden sind, werden jegliche verbleibenden Schutzgruppen (und jeglicher fester Träger, wenn Festphasensynthesetechniken verwendet werden) sequenziell oder gleichzeitig entfernt, um das endgültige Polypeptid zu liefern. Durch einfache Modifizierung dieses allgemeinen Verfahrens ist es möglich, gleichzeitig mehr als eine Aminosäure einer wachsenden Kette hinzuzufügen, beispielsweise indem (unter Bedingungen, die chirale Zentren nicht racemisieren) ein geschütztes Tripeptid mit einem geeignet geschützten Dipeptid unter Bildung eines Pentapeptids, nach Entfernung der Schutzgruppen, gekoppelt wird. Siehe z. B. J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984) und G. Barany und R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Hrsg.: E. Gross und J. Meienhofer, Band 2, (Academic Press, New York, 1980), S. 3–254, für Festphasen-Peptidsynthe-setechniken; und M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, Berlin 1984) und E. Gross und J. Meienhofer, Hrsg., The Pepti des: Analysis, Synthesis, Biology, Band 1 für die klassische Synthese in Lösung.
  • Typische Schutzgruppen umfassen tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), Benzyloxycarbonyl (Cbz), p-Toluolsulfonyl (Tx), 2,4-Dinitrophenyl, Benzyl (Bzl), Biphenylisopropyloxycarboxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, Cyclohexyl, Isopropyl, Acetyl, o-Nitrophenylsulfonyl und ähnliche Gruppen.
  • Typische feste Träger sind vernetzte polymere Träger. Diese können Polymere auf Basis von Divinylbenzol und vernetztem Styrol, beispielsweise Divinylbenzol-Hydroxymethylstyrol-Copolymere, Divinylbenzol-Chlormethylstyrol-Copolymere und Divinylbenzol-Benzhydrylaminopolystyrol-Copolymere umfassen.
  • Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptidanaloga können auch durch andere Verfahren chemisch hergestellt werden, wie durch das Verfahren gleichzeitiger mehrfacher Peptidsynthese („simultaneous multiple peptide synthesis”). Siehe z. B. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1985) 82: 5131–5135; U.S.-Patent Nr. 4,631,211 .
  • Alternativ können die Peptide durch rekombinante Techniken produziert werden, z. B. indem DNA, die das gewünschte Peptid kodiert, zusammen mit einem ATG-Initiationscodon synthetisiert wird. Die Nukleotidsequenz kann mit den geeigneten Codons für die jeweilige gewünschte Aminosäuresequenz gestaltet werden. Im allgemeinen werden bevorzugte Codons für den Wirt, in dem die Sequenz exprimiert werden soll, ausgewählt. Die vollständige Sequenz wird im allgemeinen aus überlappenden Oligonukleotiden, die durch Standardverfahren hergestellt werden, zusammengestellt und zu einer vollständigen kodierenden Sequenz zusammengefügt. Siehe z. B. Edge, Nature (1981) 292: 756; Nambair et al., Science (1984) 223: 1299; Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259: 6311. Automatisierte Synthesetechniken, wie Phosphoramid-Festphasensynthese, können verwendet werden, um die Nukleotidsequenz zu erzeugen. Siehe z. B. Beaucage, S. L., et al., Tet. Lett. (1981) 22: 1859–1862; Matteucci, M. D., et al., J. Am. Chem. Soc. (1981) 103: 3185–3191. Als nächstes wird die DNA in einen geeigneten, entweder prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionsvektor unter Einsatz herkömmlicher Methoden kloniert.
  • Alternativ werden einfach rekombinante Techniken eingesetzt, um das Gen des Ausgangspolypeptids zu klonieren, das dann in vitro durch den Ersatz des geeigneten Basenpaars oder der geeigneten Basenpaare mutiert werden kann, um zu dem Codon für die gewünschte Aminosäure zu gelangen. Eine derartige Änderung kann lediglich ein Basenpaar umfassen, was eine Veränderung in einer einzelnen Aminosäure bewirkt, oder kann mehrere Änderungen von Basenpaaren umfassen. Alternativ können die Mutationen unter Verwendung eines Primers mit Fehlpaarungen bewirkt werden, der mit der Ausgangsnukleotidsequenz (im allgemeinen cDNA entsprechend der RNA-Sequenz) bei einer Temperatur unter der Schmelztemperatur des fehlgepaarten Doppelstrangs hybridisiert. Der Primer kann spezifisch gemacht werden, indem die Länge und die Basenzusammensetzung des Primers innerhalb relativ enger Grenzen gehalten und veranlaßt wird, daß die mutierte Base im Zentrum lokalisiert ist. Zoller und Smith, Methods Enzymol. (1983) 100: 468. Eine Verlängerung des Primers wird unter Verwendung von DNA-Polymerase vorgenommen, das Produkt kloniert und Klone, die die durch Segregation des ausgehend von dem Primer verlängerten Stranges gewonnene mutierte DNA enthalten, selektioniert. Die Selektionierung kann bewerkstelligt werden, indem der mutierte Primer als Hybridisierungssonde verwendet wird. Diese Technik ist auch anwendbar, um mehrere Punktmutationen zu erzeugen. Siehe z. B. Dalbie-McFarland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6409.
  • Unter Verwendung der vorstehend angegebenen Methoden ist eine Anzahl Polypeptidanaloga, die einen erhöhten Elektrotransport-Fluß aufweisen, hergestellt worden. So zeigt 1B die Sequenz des PTH-Analogs 1. Dieses PTH-Analog unterscheidet sich von der Ausgangssequenz (gezeigt in 1A), wie folgt: Met8 wurde durch Leu substituiert; Leu15 wurde durch Arg substituiert; Met18 wurde durch Leu substituiert; Glu19 wurde durch Arg substituiert; Glu22 wurde durch Arg substituiert; Gln29 wurde durch Lys substituiert; Phe34 wurde durch Tyr substituiert; und es liegt am C-Terminus des Peptids ein Homoserinlacton vor.
  • PTH-Analog 2, das in 1C gezeigt ist, unterscheidet sich von der Ausgangssequenz (1A), wie folgt:
    Met8 wurde durch Leu substituiert; Leu11 wurde durch Ser substituiert; Leu15 wurde durch Arg substituiert; Leu18 wurde durch Ser substituiert; Met18 wurde durch Ser substituiert; Glu19 wurde durch Arg substituiert; Val21 wurde durch Ser substituiert; Glu22 wurde durch Arg substituiert; Leu24 wurde durch Ser substituiert; Leu28 wurde durch Ser substituiert; Gln29 wurde durch Lys substituiert; Tyr34 wurde durch Ser substituiert; und es liegt am C-Terminus des Peptids ein Homoserinlacton vor. Zusammengenommen führen diese Substitutionen zu einer verringerten Sekundärstruktur.
  • Die Hirulog-Verbindungen sind eine Reihe synthetischer Analoga von Hirudin, einem natürlichen Thrombininhibitor. Zwei dieser Analoga sind in 2 gezeigt. Hirulog-1, gezeigt in 2B, ist in Maragnore et al., Biochem. (1990) 29: 7095–7101, offenbart. Hirulog-B2, ein 20 Aminosäuren umfassendes Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 2186 Dalton, hat die in 2C gezeigte Sequenz. Wie ersehen werden kann, unterscheidet sich das Analog Hirulog-B2 von dem in 2B gezeigten Analog Hirulog-1, indem in diesem an der ersten Position D-Phenyl-alanin gegen D-Cyclohexylalanin ausgetauscht ist. Hirulog-B2 wird in Witting et al., Biochem. J. (1992) 287: 663–664, und in der Internationalen Veröffentlichung WO 92/13952 beschrieben.
  • Ist das gewünschte Polypeptidanalog einmal hergestellt, kann es an den Patienten unter Verwendung eines beliebigen von mehreren Elektrotransport-Arzneimittelabgabesystemen abgegeben werden und ist nicht auf die Verwendung eines bestimmten Systems beschränkt. Beispiele von Elektrotransport-Arzneimittelabgabesystemen sind z. B. in den U.S.-Patenten Nr. 5,312,326 , Myers et al., 5,080,646 , Theeuwes et al., 5,387,189 , Gyory et al., und 5,169,383 , Gyory et al., deren Offenbarungen in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen werden, beschrieben.
  • 3 veranschaulicht eine repräsentative Elektrotransport-Abgabevorrichtung, die gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden kann. Die Vorrichtung 10 umfaßt ein oberes Gehäuse 16, eine Baugruppe mit einer gedruckten Schaltung 18, ein unteres Gehäuse 20, eine Anodenelektrode 22, eine Kathodenelektrode 24, ein Anodenreservoir 26, ein Kathodenreservoir 28 und einen hautverträglichen Klebstoff 30. Das obere Gehäuse 16 hat seitliche Flügel 15, die dazu beitragen, die Vorrichtung 10 auf der Haut eines Patienten zu halten. Das obere Gehäuse 16 ist vorzugsweise aus einem spritzgießbaren Elastomer (z. B. Ethylenvinylacetat) gebildet. Die Baugruppe mit der gedruckten Schaltung 18 umfaßt einen integrierten Stromkreis 19, der mit diskreten Komponenten 40 und einer Batterie 32 gekoppelt ist. Die Baugruppe mit der gedruckten Schaltung 18 ist an dem Gehäuse 16 durch Zapfen (in 3 nicht gezeigt) befestigt, die durch Öffnungen 13a und 13b hindurchgehen, wobei die Enden der Zapfen erwärmt bzw. geschmolzen werden, um die Baugruppe mit der gedruckten Schaltung 18 mit dem Gehäuse 16 heiß zusammenzufügen. Das untere Gehäuse 20 ist an dem oberen Gehäuse 16 mittels des Klebstoffs 30 angeheftet, wobei die obere Oberfläche 34 des Klebstoffs 30 sowohl an das untere Gehäuse 20 als auch an das obere Gehäuse 16 einschließlich der nach unten weisenden Oberflächen der Flügel 15 anhaftet.
  • Auf der Unterseite der Baugruppe mit der gedruckten Schaltung 18 (teilweise) gezeigt ist eine Knopfzellenbatterie 32. Andere Batterietypen können für die Versorgung der Vorrichtung 10 mit Energie gleichfalls eingesetzt werden.
  • Die Vorrichtung 10 enthält im allgemeinen eine Batterie 32, elektronische Stromkreise 19, 40, Elektroden 22, 24 und Arzneimittel/Chemikalienreservoire 26, 28, die sämtlich in einer unabhängigen Einheit integriert sind. Die Ausgänge (in 3 nicht gezeigt) der Baugruppe mit der gedruckten Schaltung 18 stellen einen elektrischen Kontakt mit den Elektroden 24 und 22 durch Öffnungen 23, 23' in den Vertiefungen 25, 25', die in dem unteren Gehäuse 20 gebildet sind, mittels elektrisch leitender Klebstoffstreifen 42, 42' her. Die Elektroden 22 und 24 ihrerseits stehen in direktem mechanischen und elektrischen Kontakt mit den Oberseiten 44', 44 von Arzneimittelreservoiren 26 und 28. Die Unterseiten 46', 46 der Arzneimittelreservoire 26, 28 berühren die Haut des Patienten durch die Öffnungen 29', 29 im Klebstoff 30.
  • Die Vorrichtung 10 hat wahlweise eine Eigenschaft, die es dem Patienten ermöglicht, sich selbst eine Arzneimitteldosis durch Elektrotransport zu verabreichen. Nach einem Herunterdrücken des Tastschalters 12 liefert der elektronische Stromkreis auf der Baugruppe mit der gedruckten Schaltung 18 einen vorher festgelegten GS- oder DC-Strom zu den Elektroden/Reservoiren 22, 26 und 24, 28 für ein Abgabeintervall von vorher festgelegter Länge. Der Tastschalter 12 befindet sich zweckmäßigerweise auf der Oberseite der Vorrichtung 10 und wird leicht durch Kleidung hindurch betätigt. Ein zweifaches Drücken des Tastschalters 12 innerhalb einer kurze Zeitspanne, z. B. drei Sekunden, wird vorzugsweise verwendet, um die Vorrichtung für die Abgabe von Arzneimittel zu aktivieren, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer unbeabsichtigten Betätigung der Vorrichtung 10 minimiert wird. Vorzugsweise übermittelt die Vorrichtung an den Verwender eine visuelle und/oder akustische Bestätigung des Beginns des Arzneimittelabgabeintervalls mittels der LED 14, die erleuchtet wird, und/oder mittels eines akustischen Tonsignals von z. B. einer Piep- oder Hupvorrichtung („Keeper”). Arzneimittel wird durch die Haut des Patienten durch Elektrotransport, z. B. auf dem Arm, über das vorher festgelegte Abgabeintervall abgegeben.
  • Die anodische Elektrode 22 enthält vorzugsweise Silber und die kathodische Elektrode 24 enthält vorzugsweise Silberchlorid. Beide Reservoire 26 und 28 enthalten vorzugsweise Polymerhydrogelmaterialien. Die Elektroden 22, 24 und Reservoire 26, 28 werden innerhalb der Vertiefungen 25',25 in dem unteren Gehäuse 20 zurückgehalten.
  • Der Tastschalter 12, der elektronische Stromkreis auf der Baugruppe mit der gedruckten Schaltung 18 und die Batterie 32 sind haftend zwischen dem oberen Gehäuse 16 und dem unteren Gehäuse 20 „angesiegelt”. Das obere Gehäuse 16 enthält vorzugsweise ein Gummimaterial oder andersartiges elastomeres Material. Das untere Gehäuse 20 enthält vorzugsweise ein lagenförmiges Kunststoff- oder Elastomermaterial (z. B. Polyethylen), das leicht unter Bildung von Vertiefungen 25, 25' geformt und zur Bildung von Öffnungen 23, 23' geschnitten werden kann. Die zusammengefügte Vorrichtung 10 ist vorzugsweise wasserbeständig (d. h. beständig gegen Spritzer) und am meisten bevorzugt wasserdicht. Das System hat einen geringen Querschnitt, der sich leicht an den Körper anpaßt, wodurch Bewegungsfreiheit bei der Tragestelle und um diese herum ermöglicht wird. Die Reservoire 26 und 28 sind auf der die Haut berührenden Seite der Vorrichtung 10 lokalisiert und sind ausreichend voneinander getrennt, um einen unbeabsichtigten elektrischen Kurzschluß während normaler Handhabung und Verwendung zu verhindern.
  • Die Vorrichtung 10 haftet auf der Körperoberfläche des Patienten (z. B. der Haut) mittels eines umlaufenden Klebstoffs 30, der eine Oberseite 34 und eine den Körper berührende Seite 36 aufweist. Die Klebstoffseite 36 hat Hafteigenschaften, die sicherstellen, daß die Vorrichtung 10 auf dem Körper während normaler Aktivität des Verwenders an Ort und Stelle bleibt, und erlaubt dennoch eine vernünftige Entfernung nach der vorher festgelegten Tragedauer (z. B. 24 h). Die obere Klebstoffseite 34 haftet an dem unteren Gehäuse 20 und hält das untere Gehäuse 20 an dem oberen Gehäuse 16 angeheftet.
  • Die Reservoire 26 und 28 umfassen im allgemeinen eine Gelmatrix, wobei die Arzneimittellösung gleichförmig in mindestens einem der Reservoire 26 und 28 dispergiert ist. Es können Arzneimittelkonzentrationen im Bereich von annähernd 1 × 10–4 M bis 1,0 M oder mehr verwendet werden, wobei Arzneimittelkonzentrationen in dem unteren Abschnitt des Bereichs bevorzugt sind. Geeignete Polymere für die Gelmatrix können im wesentlichen jegliche nichtionischen synthetischen und/oder natürlich vorkommenden polymeren Materialien umfassen. Eine polare Natur ist bevorzugt, wenn das aktive Mittel polar und/oder ionisierbar ist, um die Löslichkeit des Mittels zu erhöhen. Gegebenenfalls ist die Gelmatrix in Wasser quellbar. Beispiele geeigneter synthetischer Polymere umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Poly(acrylamid), Poly(2-hydroxyethylacrylat), Poly(2-hydroxypropylacrylat), Poly(N-vinyl-2-pyrrolidon), Poly(n-methylolacrylamid), Poly(diacetonacrylamid), Poly(2-hydroxy-ethylmethacrylat), Poly(vinylalkohol) und Poly(allylalkohol). Hydroxylfunktionale Kondensationspolymere (d. h. Polyester, Polycarbonate, Polyurethane) sind gleichfalls Beispiele für geeignete polare synthetische Polymere. Polare, natürlich vorkommende Polymere (oder Derivate davon), die für eine Verwendung als Gelmatrix geeignet sind, werden durch Celluloseether, Methylcelluloseether, Cellulose und hydroxylierte Cellulose, Methylcellulose und hydroxylierte Methylcellulose, Pflanzengummis, wie Guaran, Johannisbrotgummi, Karaya-Gummi, Xanthan, Gelatine, und Derivate davon exemplifiziert. Ionische Polymere können auch für die Matrix verwendet werden, vorausgesetzt, daß die verfügbaren Gegenionen entweder Arzneimittelionen oder andere Ionen sind, die bezogen auf das aktive Mittel entgegengesetzt geladen sind.
  • Dementsprechend können die hierin beschriebenen Polypeptidanaloga in das Arzneimittelreservoir, z. B. eine Gelmatrix, wie soeben beschrieben, eingebracht und an einen Patienten unter Verwendung eines Elektrotransport-Arzneimittelabgabesystems, gegebenenfalls wie vorstehend erläutert, verabreicht werden. Das Einbringen der Arzneimittellösung kann auf eine beliebige Vielzahl von Weisen erfolgen, d. h. durch Einsaugen der Lösung in die Reservoirmatrix, durch Mischen der Arzneimittellösung mit dem Matrixmaterial vor der Hydrogelbildung oder ähnliches.
  • Obwohl die Erfindung in Verbindung mit den bevorzugten speziellen Ausführungsformen derselben beschrieben worden ist, versteht es sich, daß die vorangegangene Beschreibung wie auch die folgenden Beispiele die vorliegende Erfindung erläutern und nicht beschränken sollen. Andere Aspekte, Vorteile und Modifizierungen im Rahmen der Erfindung werden für die Fachleute auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht, ersichtlich sein.
  • III. EXPERIMENTELLER TEIL
  • Allgemein werden Standardtechniken rekombinanter DNA-Technologie in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben, z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1 und 2 und Ergänzungen (1987); und Wu und Grossman (Hrsg.), Methods in Enzymology, Band 53 (Recombinant DNA Part D, 1987). Restriktionsenzyme, Säugetier-Zellkulturmedien und die E. coli-Zellinie DH10B (F-mrcA D(mrr-hsdRMS-mcrBC)F80dlacZDM15 DlacX74 deoR recA1 araD139 D(ara, leu) 7697 galU galK I-rpsL endA1 nupG) wurden von Gibco/BRL (Gaithersburg, MD) erworben. Taq-Polymerase stammte von Perkin Elmer Cetus (Norwalk, CT). His-Eindungs-Harz („His-bind resin”) wurde von Novagen (Madison, WI) erworben und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. DNase und Lysozym wurden von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) erworben. Bromcyan wurde von Aldrich (Milwaukee, WI) erworben. Oligonukleotide wurden an einem DNA-Synthesizer, Modell 394 von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) unter Einsatz von ABI-Chemikalien synthetisiert. Synthetisches humanes Parathormon und synthetisches Rinder-Parathormon wurden von Bachem (Torrance, CA) erworben.
  • BEISPIEL 1
  • KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN FÜR DIE PTH-POLYPEPTIDE
  • Die PTH-Expressionsvektoren wurden in mehreren Stufen unter Verwendung des Plasmids pBAD18 (Guzman et al., 1995) als Ausgangsplasmid hergestellt. Das Plasmid pBAD18 enthält den araB-Promotor, gefolgt von einem Polylinker und einem Terminator unter der Kontrolle des positiven/negativen Regulators araC, der gleichfalls durch das Plasmid spezifiziert wird. Das Plasmid pBAD18 enthält auch einen modifizierten Replikationsstartpunkt (Origin) aus dem Plasmid pBR322 und das bla-Gen, um eine Replikation und Selektion in E. coli zu ermöglichen, wie auch die intragenische Region des Phagen M13, um eine Gewinnung einzelsträngiger DNA zu ermöglichen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist jedoch der tatsächlich zur Konstruktion der Expressionsvektoren der Erfindung verwendete Klonierungsvektor nicht kritisch.
  • Beispielsweise könnte das Plasmid pMC3 anstelle des Plasmids pBAD18 in den nachfolgenden Protokollen als Klonierungsvektor dienen. Das Plasmid pMC3 wird in dem U.S.-Patent Nr. 5,270,170 beschrieben. Das Plasmid pMC3 unterscheidet sich von dem Plasmid pBAD18, indem das Plasmid pMC3 einen lac-Repressor mit einem Dynorphin B-Schwanz in dem Bereich, der der NheI-XbaI-Region der multiplen Klonierungsstelle von pBAD18 entspricht, kodiert und eine lac-Operatorsequenz in dem Bereich, der dem NdeI-ClaI-Fragment des Plasmids pBAD18 entspricht, kodiert. Da dieses letztgenannte Fragment für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht essenziell ist, könnten leicht geeignete Vektoren für die Zwecke der Erfindung aus dem Plasmid pMC3 konstruiert werden. Das Plasmid pMC3 ist im Stamm ARI161 von der American Type Culture Collection unter der Aufnahmenummer („Accession Number”) ATCC 68818 erhältlich.
  • Die PTH-Vektoren wurden dann, wie folgt, konstruiert. Das folgende Paar von teilweise überlappenden Oligonukleotiden wurde angelagert und die Synthese des zweiten Strangs mit Taq-Polymerase ausgeführt:
    Figure 00310001
  • Das Produkt wurde durch NheI und HinDIII verdaut und in die entsprechenden Stellen von pBAD18 insertiert. Der Doppelstrang enthält die Shine-Dalgarno-Ribosomenbindungsstelle (S&D) und das TrpLE-Leaderpeptid. Es ist bereits früher gezeigt worden, daß diese 17 Aminosäuren umfassende Leadersequenz die Expression kleiner Proteine verstärkt und die Sequestrierung von Fusi onsprodukten in Einschlußkörper unterstützen kann (Derynck et al., Cell (1984) 38: 287–297; Miozzari und Yanofsky, J. Bacteriol. (1978) 133: 1457–1466). Das TrpLe-Leaderpeptid ist von der His6-Sequenz durch eine multiple Klonierungsstelle getrennt. Die Polyhistidin-Stelle oder -Sequenz ermöglicht eine schnelle Reinigung des rekombinanten Parathormon-Moleküls (RPTH) und von RPTH-Analoga über Nickel-Chelat-Chromatographie (siehe U.S.-Patent Nr. 4,551,271 ). Zwei Stop-Codons (TAATAA) folgen dem Polyhistidin.
  • Ein RPTH(1-34)-Gen mit der folgenden Sequenz wurde entworfen und unter Verwendung von oft verwendeten E. coli-Codons synthetisiert:
    Figure 00320001
    modifizierten pBAD-Vektor insertiert.
  • BEISPIEL 2
  • EXPRESSION UND REINIGUNG VON PTH-POLYPEPTIDEN
  • E. coli DH10B, die das vorstehend beschriebene Plasmid enthalten, wurden über Nacht in LB-Medium, das Ampicillin (50 bis 100 μg/ml) enthielt, gezüchtet. 10 ml dieser Kultur wurden verwendet, um eine 500 ml-Kultur von Superbroth (35 g/l Bactotrypton, 20 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und NaOH bis zu pH 7,5), die Ampicillin enthielt, anzuimpfen. Man ließ die Zellen bis zu einer OD600 von ungefähr 0,5 bis 1,0 wachsen, und es wurde L-(+)-Arabinose bis zu einer Endkonzentration von 0,2% zugesetzt. Man ließ die Zellen weitere drei Stunden wachsen. Nach dieser Zeit lag die OD600 zwischen 1,5 und 3. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und nacheinander mit 250 ml WTEK-Puffer (50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA, 100 mM KCl), 250 ml PBS und 250 ml 10 mM Tris, pH 7,5 gewaschen. Die Zellen wurden dann resuspendiert in 100 ml einer Lösung, zusammengesetzt aus 10 mM Tris, pH 7,5, 0,1 mg/ml Proteaseinhibitor N-Tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (TPCK), 0,1 mg/ml Proteaseinhibitor N-Tosyl-L-lysinchlormethylketon (TLCK), 0,1 mg/ml Proteaseinhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 0,05 mg/ml Lysozym. Die resultierende Lösung wurde auf Eis 1 h inkubiert. Die Zellen wurden dann eingefroren und aufgetaut; 1 mg DNase wurde den eingefrorenen und aufgetauten Zellen zugesetzt und die resultierende Mischung auf Eis eine weitere Stunde inkubiert.
  • Einschlußkörper aus den Zellen wurden durch Zentrifugation bei 10000 × g für 15 min gereinigt. Die Einschlußkörper wurden in 10% SDS solubilisiert, aber in einigen Fällen war auch eine Beschallung der Probe erforderlich, um das gesamte Protein zu solubilisieren. Es wurde Bindungspuffer (5 mM Imidazol, 500 mM NaCl und 20 mM Tris, pH 7,9) zugesetzt, um die SDS-Konzentration auf 1% zu verdünnen, und die Probe wurde auf eine Säule, die His-Bindungsharz (Novagen) enthielt, aufgegeben. Die Säule wurde dann mit 15 Säulenvolumina Bindungspuffer gewaschen und dann gebundenes Protein mit 1 Säulenvolumen Elutionspuffer (500 mM NaCl, 100 mM EDTA und 50 mM Tris, pH 7,9) eluiert. Dann wurden zwei Volumina absoluten Ethanols zugesetzt, um das Protein zu präzipitieren.
  • Das präzipitierte PTH-Polymer wurde dann in 70% Ameisensäure gelöst und BrCN in 500fachem (es kann ein 100- bis 1000facher Überschuß verwendet werden) molaren Überschuß zugesetzt. Ein Zeitverlauf der Spaltung (ausgeführt bei unterschiedlichen BrCN-Konzentrationen, um die optimale Zeitdauer zu bestimmen), wie durch Aminosäureanalyse untersucht, zeigte, daß eine vollständige Spaltung in 2 h bei Raumtemperatur erzielt wurde. Nach der BrCN-Spaltung wurden die Peptide lyophilisiert und in destilliertem Wasser resuspendiert. Das Peptid wurde in Puffer A (0,1% TFA) resuspendiert und weiter durch HPLC unter Verwendung einer semipräparativen VYDAC C-18-Säule gereinigt. Annähernd 30 mg Peptid wurden auf die Säule injiziert. Das Peptid wurde dann mit einem Gradienten von 20–40% Acetonitril/0,1% TFA über 40 min eluiert. Der Hauptpeak, der nach ungefähr 15 min eluiert wurde, wurde gesammelt und bis zur Trockene lyophilisiert.
  • Nach Isolierung von Einschlußkörpern und Reinigung, wie vorstehend beschrieben, war das Peptid zu mehr als 95% rein, wie durch SDS-PAGE bestimmt. Das Peptid wurde dann entsalzt und teilweise auf einer SepPak-Säule gereinigt. Es wurden individuelle Peaks isoliert und durch Elektrospray-Massenspektrometrie analysiert, um die Zusammensetzung zu bestimmen. Es lagen zwei kleinere Peaks vor, die das Ergebnis einer unvollständigen Bromcyanspaltung waren und das PTH-His6-Peptid und das I-N-M-PTH-Peptid darstellten. Der Hauptpeak umfaßte mehr als 80% des gesamten Proteins. Ein Vergleich der „rohen” durch SepPak gereinigten Probe mit einem durch HPLC gereinigten RPTH zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Adenylatcyclasestimulierenden Fähigkeit.
  • BEISPIEL 3
  • ERZEUGUNG VON PTH-ANALOGA
  • Um PTH-Analoga zu erzeugen, wurden an dem PTH-Peptid Substitutionen durch die in den 1B, 1C und 1D angegebenen Aminosäuren vorgenommen. PTH-Analoga wurden rekombinant erzeugt, wobei die Konstruktion auf ähnliche Weise wie vorstehend für das rekombinante RPTH-A-Gen beschrieben durch Substituieren der geeigneten Basen erfolgte. Die PTH-Analoga wurden, wie vorstehend beschrieben, exprimiert und gereinigt.
  • BEISPIEL 4
  • PTH-ANALOG-AKTIVITÄTSASSAY
  • Synthetisches PTH mit der Wildtypsequenz und die rekombinanten PTH (RPTH)-Analoga wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Adenylatcyclase zu stimulieren, untersucht. PTH-Konzentrationen wurden durch OD280 unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 6600 für das rekombinante Peptid und 5500 für das synthetische Peptid bestimmt. Die Ratten-Osteosarcomzellinie UMR106 (ATCC CRL 1661) wurde für eine in vitro-Untersuchung der Fähigkeit des Peptids, den PTH-Rezeptor zu aktivieren, verwendet. Eine Aktivierung des PTH-Rezeptors führt zu einem intrazellulären Anstieg der cAMP-Konzentration.
  • Die UMR106-Zellen wurden zu ungefähr 2,5 × 105 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 48 Vertiefungen ausgesät, und man ließ sie bis zur Konfluenz wachsen. Assays wurden an den Zellen 3–5 Tage nach Konfluenz ausgeführt. Das Medium (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM, mit fötalem Kälberserum) wurde entfernt und 1 ml frisches Medium zugesetzt. Dann wurden PTH (rekombinant oder synthetisch) in verschiedenen Konzentrationen und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) in einer Endkonzentration von 1 mM jeder Vertiefung der Platte zugesetzt, die dann 5 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Das Medium wurde dann entfernt und die Zellen schnell mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann zweimal mit 1 ml absolutem Ethanol extrahiert. Die zwei Extraktionen wurden vereinigt und der Ethanol durch Verdampfung entfernt. Der Extrakt wurde dann erneut in 1 ml „scintillation proximity”-Puffer (SPA-Puffer) (Amersham, Arlington Heights, IL) gelöst. Die cAMP-Konzentration wurde durch einen Assay unter Verwendung eines „scintillation proxi mity”-Assay (SPA)-Kits, erhältlich von Amersham, bestimmt. Das Analog 1 hatte eine Kd (Dissoziationskonstante) von 1,5 nM und eine EC-50 (effektive Konzentration) von 0,9 nM. Wildtyp-PTH hatte eine Kd von 8,5 nM und eine EC-50 von 4,4 nM. Die Analoga 2 und 3 haben keine meßbare Aktivität.
  • BEISPIEL 5
  • VORAUSSAGE DER AUSWIRKUNGEN VON AMINOSÄURESUBSTITUTIONEN IN DEN PTH-ANALOGA AUF DAS α-HELIX-POTENTIAL
  • Wie vorstehend erläutert, kann das α-Helix-Potential von linearen Polypeptiden unter Verwendung der Lifson-Roig-Gleichungen (Lifson, S., und Roig, A., J. Chem. Phys. (1961) 34: 1963–1974) und Werten für die Rest-Helixbildungsparameter, umgerechnet aus deren Zimm-Bragg-Werten (Zimm, B. H., und Bragg, J. K., J. Chem. Phys. (1959) 31: 526–535) unter Einsatz der Umrechnungsgleichungen von Qian und Schellman (Qian, H. und Schellman, J. A., J. Chem. Phys. (1992) 96: 3987–3994), abgeschätzt werden. Ist einmal ein Satz von Zimm-Bragg-Werten s und σ für jeden Rest definiert, dann kann die Wahrscheinlichkeit, daß die gesamte Polypeptidkette (oder eine definierte Untersequenz) eine α-Helix einnimmt, unter Verwendung von Gleichungen in den vorstehend angegebenen Referenzen berechnet werden.
  • Die zwei im allgemeinen zur Bestimmung des α-Helix-Potentials verwendeten Berechnungsmethoden wurden auf die zwei erzeugten PTH-Analoga angewendet. Die erste Berechnungmethode nimmt den Lifson-Roig-Helixinitiationsparameter v als konstanten Wert von 0,039 an (d. h. der Zimm-Bragg-Parameter σ beträgt 0,0013 für alle Reste), wobei der Parameter w für jede Aminosäure aus dem Zimm-Bragg-Wert s, der in Tabelle 1 von Finkelstein et al. (Finkelstein et al., Proteins: Structure, Function and Genetics (1991) 10: 287–299) gefunden werden kann, berechnet wird. Indem die Berechnungsverfahren auf die PTH-Analoga angewendet wurden, wurden zuerst die s-Werte in Tabelle 1 dieser Referenzliteratur aus ihren 300 K-Werten in die geschätzten Werte bei 273 K unter Verwendung einer angenommenen Enthalpieänderung von 1 kcal/mol (identisch für alle Reste) umgerechnet. Für das PTH-Analog 1 ergibt diese Berechnung eine Wahrscheinlichkeit von 0,41, daß die gesamte Sequenz α-helikal ist. Für das PTH-Analog 2 ergibt diese Berechnung eine Wahrscheinlichkeit von 0,18, daß die gesamte Sequenz α-helikal ist. Für das PTH-Analog 3 ergibt diese Berechnung eine Wahrscheinlichkeit von 0,15, daß die gesamte Sequenz α-helikal ist.
  • Die zweite Berechnungsmethode nimmt nicht an, daß alle Reste den gleichen Wert für den Helixinitiationsparameter v aufweisen (d. h. der Zimm-Bragg-Parameter α ist für jeden Aminosäurerest einzigartig). In diesem Falle wurden die Zimm-Bragg-Werte s und σ für jeden Rest (mit Ausnahme von His, Pro und Trp) aus Tabelle 1 von Skolnick, J., und Holtzer, A., Macromolecules (1982) 15: 812–821, entnommen. Die Zimm-Bragg-Werte für His wurden von Sueki et al., Macromolecules (1984) 17: 148–155, genommen. Die Zimm-Bragg-Werte für Pro und Trp wurden von Finkelstein et al. genommen. Für diese zweite alternative Berechnung wurde in jedem Fall der Wert s bei 273 K berechnet, und für die Reste mit ionisierbaren Seitenketten wurde der Wert s für den Ionisierungszustand, der bei pH 7 vorherrschen würde, angenommen. Die von Sueki et al. und Skolnick und Holtzer erhaltenen s-Werte (bei 273 K) und σ-Werte wurden umgerechnet (Qian und Schellman) in ihre Lifson-Roig-Werte v und w und dann verwendet, um die Wahrscheinlichkeit, daß die gesamte Polypeptidkette (oder eine Untersequenz) in dem α-helikalen Zustand existiert, zu berechnen. Für das PTH-Analog 1 ergibt diese Berechnung eine Wahrscheinlichkeit von 0,07, daß die gesamte Sequenz α-helikal ist. Für das PTH-Analog 2 ergibt diese Berechnung eine Wahrscheinlichkeit von 0,02, daß die gesamte Sequenz α-helikal ist. Für das PTH-Analog 3 ergibt diese Berechnung eine Wahrscheinlichkeit von 0,02, daß die gesamte Sequenz α-helikal ist.
  • Zusammengenommen sagen beide Sätze von Annahmen bezüglich der Neigung von Polypeptiden, eine α-helikale Konformation anzunehmen, voraus, daß Analog mit einer zwei- bis dreifach höheren Wahrscheinlichkeit als α-Helix vorliegt als Analog 2.
  • BEISPIEL 6
  • ABSCHÄTZUNG DES α-HELIKALEN POTENTIALS AUFGRUND VON ZIRKULARDICHROISMUS BEI VARIIERENDEN TRIFLUORETHANOLKONZENTRATIONEN
  • Die Trifluorethanol (TFE)-Zirkulardichroismus-Untersuchungen erfolgten unter Einsatz eines Circular Dichroism Spectrometer, Model 62DS, von AVIV Associates, Inc. Proteinkonzentrationen wurden aus Absorptionsablesungen unter Verwendung berechneter Extinktionskoeffizienten für die Analoga in 10 mM ionischem Puffer bestimmt. TFE-Titrationen erfolgten von 0 bis 50% TFE, wobei für jede TFE-Probe ein Scanning von 250 bis 200 nm bei 20°C vorgenommen wurde. [81222 wurde berechnet aus: θbeobachtet bei 222* (mittleres Gewicht des Rests)/(10 (Zellenweglänge)(Proteinkonzentration)).
  • Die Daten aus den TFE-Titrationen bei pH 6,5 und 10 mM Kakodylat sind nachfolgend in Tabelle 2 für die PTH-Analoga zusammengefaßt und in 4 aufgetragen. 4 zeigt, daß, wenn das α-Helix-induzierende Colösemittel, Trifluorethanol, eine Konzentration von 30% (v/v) erreicht, im wesentlichen die maximale Menge an Helix sowohl für PTH als auch Analog 1 gebildet wird, wobei das durchschnittliche Ausmaß an Helizität ungefähr 80% beträgt. Sogar in Abwesenheit des Helix-induzierenden Mittels ist das Ausgangs-PTH zu ungefähr 20% α-helikal.
  • In Abwesenheit des Helix-induzierenden TFE weist das PTH-Analog 2 im wesentlichen keine Helix auf und ist bei 30% TFE höchstens zu ungefähr 30% α-helikal.
  • In Abwesenheit des Helix-induzierenden TFE weist das PTH-Analog 3 im wesentlichen keine Helix auf und ist bei 30% TFE höchstens zu ungefähr 15% α-helikal.
  • Diese zwei- bis dreifache Verringerung des beobachteten Helixgehalts bei 30% Trifluorethanol war auf Grundlage der Lifson-Roig-Gleichung und der, wie vorstehend angesprochen, davon abgeleiteten Berechnungsmethoden vorhersagbar. TABELLE 2 TFE-TITRATIONSDATEN
    % TFE []222 für []222 für []222 für []222 für
    hPTH(1-34) Analog 1 Analog 2 Analog 3
    0 –7793 –4205 –2750 –3867
    10 –15863 –9333 –4600 –6479
    20 –21491 –23098 –9065 –12329
    30 –26288 –26334 –12081 –15161
    40 –27011 –27580 –14320 –15191
    50 –26802 –27705 –15649 –15395
  • BEISPIEL 7
  • IN VITRO-ELEKTROTRANSPORTFLUSS DER PTH-ANALOGA
  • In vitro-Elektrotransportstudien wurden in auf Bestellung angefertigten, kleinvolumigen Mehrkammerzellen unter Verwendung einer anodischen Speisung ausgeführt. 1 mM PTH in 10 mM Puffer wurde in die Donorkammer eingebracht und ein Rezeptor mit 25 mM endgültiger Innenstärke wurde in die Rezeptorkammer eingefüllt.
  • Die Rezeptorlösung für das native PTH und die Analoga 1 und 2 bestand aus 15 mM NaCl, gepuffert auf pH 7 mit 10 mM Imidazol, 0,1% Rinderserumalbumin (RSA) als Blockierungsmittel, Tween 20-Detergens und Natriumazid als Bakterizid. Die Rezeptorlösung für das PTH-Analog 3 bestand aus 15 mM NaCl, gepuffert auf pH 7 mit 10 mM Imidazol, 0,5% Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB, ein grenzflächenaktives Mittel) und 0,3 mg/ml Trp-Nle-Arg-Phe-Amid, ein Tetrapeptid, das als „alternatives” Substrat für proteolytische Enzyme, die in der Haut anwesend sind, verwendet wird.
  • In der Wärme von menschlichen Leichen abgezogenes Stratum corneum wurde zwischen der Donor- und der Rezeptorkammer angeordnet, wobei die Epidermisseite der Rezeptorkammer zugewandt war. Es wurde ein konstanter GS- oder DC-Strom von 127 μA mA (d. h. 0,1 mA/cm2) eingesetzt. Die Zellen wurden während der in vitro-Studien bei 32°C gehalten, wobei Rezeptorproben alle 2 h abgenommen wurden (es wurde ein bestimmtes Volumen von Rezeptor entfernt und durch „frischen” Rezeptor nach jeder Probenentnahme ersetzt). Die Rezeptorproben wurden durch Reverse-Phase-HPLC analysiert.
  • Die Peakflächen von PTH-Rezeptorproben wurden mit Standardkurven des gleichen Analogs in bekannten Konzentrationen, die zu gleicher Zeit unter Verwendung einer analytischen polymeren Säule mit einer Flußrate von 1,5 ml/min mit einem Gradienten von 10–50% B in zehn Minuten Elutionszeit gemessen wurden, verglichen. Puffer A war 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), 1% Acetonitril; Puffer B war 0,1% TFA, 98,9% Acetonitril. Die Analogkonzentrationen wurden in Massenfluss umgerechnet und gegen die Zeit aufgetragen.
  • Für die in vitro-Elektrotransportstudien enthielten beschriebene Donoren die retro-inverso-Versionen (d. h. es wurden D-Aminosäurereste verwendet und in umgekehrter Reihenfolge wie üblich angeordnet) der PTH-Analoga 1 und 2 (1 mM) in wäßrigen Lösungen bei pH 5,0. Dies erfolgte, da die PTH-Analoga 1 und 2 nicht stabil waren, wenn sie mit abgezogenem Stratum corneum inkubiert wurden, wahrscheinlich aufgrund eines proteolytischen Verdaus durch Haut-Proteasen. Das PTH-Analog 3 war keine retro-inverso-Version, sondern wurde stattdessen rekombinant synthetisiert. Um Analog 3 vor einem Verdau durch proteolytische Enzyme zu schützen, wurde das Tetrapeptid der Rezeptorlösung zugesetzt. Die vollständig zusammengebauten Elektrotransportzellen wurden bei 32 ± 0,5°C inkubiert. Die für einen Transport verfügbare Hautkontaktfläche betrug 1,27 cm2. Das Volumen der Donorkammer betrug 200 μl; das Volumen der Rezeptorkammer betrug 350 μl. Die Rezeptorlösung war von der Kathode durch eine Anionenaustauschmembran (IonacTM, Eletrosynthesis Co., Lancaster, NY) getrennt. Jede Zelle war mit einer Quelle konstanten Stroms mit einer Standardstromdichte von 100 μA cm–2 verbunden. Der Spannungsabfall durch jede Zelle wurde in ungefähr 2stündigen Intervallen für die Dauer des Experiments aufgezeichnet.
  • Histogramme des Massenflusses wurden für jeden Zeitpunkt aufgetragen. Der mittlere Beobachtungswert des Massenflusses (95% Konfidenzintervall) für das PTH-Analog 1 betrug 0,3 μg cm–2h–1 (0,1 bis 0,7), für das PTH-Analog 2 3,2 μg cm–2h–1 (2,1 bis 4,2) und für das PTH-Analog 3 1,1 μg cm–2h–1 (0,9 bis 1,7). Die durchschnittlichen Massenflußwerte ± Standardabweichung für diese Analoga waren 1,4 μg cm–2h–1 ± 2,3, 4,1 μg cm–2h–1 ± 3,7 und 1,5 μg cm–2h–1 ± 1,1 für die Analoga 1, 2 bzw. 3.
  • BEISPIEL 8
  • ABSCHÄTZUNG DES α-HELIKALEN POTENTIALS AUFGRUND VON ZIRKULARDICHROISMUS BEI VARIIERENDEN TRIFLUORETHANOLKONZENTRATIONEN
  • Die Trifluorethanol (TFE)-Zirkulardichroismus-Untersuchungen erfolgten unter Einsatz eines Circular Dichroism Spectrometer, Model 62DS, von AVIV Associates, Inc. Proteinkonzentrationen wurden aus Absorptionsablesungen unter Verwendung berechneter Extinktionskoeffizienten für die Analoga in 10 mM ionischem Puffer bestimmt. TFE-Titrationen erfolgten von 0 bis 50% TFE, wobei für jede TFE-Probe ein Scanning von 250 bis 200 nm bei 20°C vorgenommen wurde. [θ]222 wurde berechnet aus: θbeobachtet bei 222* (mittleres Gewicht des Rests)/(10 (Zellenweglänge)(Proteinkonzentration)).
  • Die Daten aus den TFE-Titrationen bei pH 6,5 und 10 mM Kakodylat sind nachfolgend in Tabelle 3 für die Hirulog-Analoga zusammengefaßt und in 5 aufgetragen. 5 zeigt, daß, wenn das α-Helix-induzierende Colösemittel, Trifluorethanol, eine Konzentration von 30% (v/v) erreicht, im wesentlichen die maximale Menge an Helix sowohl für das Ausgangs-Hirulog als auch das Analog B2 gebildet wird, wobei das durchschnittliche Ausmaß an Helizität ungefähr 10% für das Ausgangs-Hirulog und im wesentlichen 0% für das Analog B2 beträgt. In Abwesenheit von Helix-induzie-rendem TFE weisen das Ausgangs-Hirulog und das Analog B2 keine α-Helizität auf. Das Hirulog-B2-Analog hatte sogar bei 80% TFE-Konzentrationen im wesentlichen keine α-Helix. TABELLE 3 TFE-TITRATIONSDATEN
    % TFE []222 für Hirulog-Ausgangsverbindung []222 für Analog B2
    0 –1120 –989
    10 –3679 –1313
    20 –5458 –1580
    30 –6972 –1848
    40 –8365 –1896
    50 –8493 –1963
  • BEISPIEL 9
  • IN VITRO-ELEKTROTRANSPORTFLUSS VON HIRULOG-B2
  • Hirulog-B2 wurde unter Einsatz von Standardtechniken synthetisiert. Siehe z. B. Maraganore et al., Thromb. Haemostasis. (1991) 65: 830; Bode et al., EMBO J. (1989) 8: 3467–3475; und Internationale Veröffentlichung WO 92/13952 . Der transdermale Elektrotransportfluß von Hirulog B-2 wurde unter Verwendung von in der Wärme abgezogener humaner Epidermis ausgewertet. Zusätzlich wurden auch Hydrogelformulierungen unter Verwendung humaner Epidermis hinsichtlich des Einflusses der Stromdichte auf den transdermalen Arzneimittelfluß untersucht. Der transdermale Fluß von Hirulog-B2 wurde untersucht unter Verwendung wäßriger Lösungen, die sowohl mit Arzneimittel, wie es erhalten wurde, als auch mit entsalztem Arzneimittel, gepuffert mit Acetatpuffer von 10 mM Innenstärke, pH 5, hergestellt worden waren. Die Hirulog-B2-Flußstudien wurden bei einer Stromdichte von 0,1 mA/cm2 ausgeführt. Unter Verwendung von Acetat-gepufferter 15 mM NaCl-Lösung, pH 5, als Rezeptorlösung wurde ein Steady-State-Elektrotransportfluß von ungefähr 19 μg h–1 cm–2 und 17 μg h–1 cm–2 für die entsalzte Arzneimittellösung bzw. die Lösung von Arzneimittel, wie es erhalten worden war, erhalten.
  • Die Variabilität des Hirulog-B2-Flusses für Hautproben von einem einzelnen Spender wie auch von mehreren Spendern schien ungefähr 15 bis 40% zu betragen, was gut innerhalb der Variabilitätsbereiche liegt, die für Peptide und Proteinverbindungen beobachtet werden.
  • Für die Hydrogelstudien ließ man Arzneimittel von Hydrogelscheiben aufsaugen und die Hydrogelscheiben wurden in Schaumstoff-Gehäuse eingebaut. Es wurden entweder Lösungen von Arzneimittel, wie es erhalten worden war, (11 mM Hirulog-B2 in 20 mM Acetat) oder von entsalztem Arzneimittel (4 mM Hirulog-B2 in 4 mM Acetat) von den Gelen eingesaugt. Ein durchschnittli cher Steady-State-Elektrotransportfluß von ungefähr 27 μg h–1 cm–2 wurde mit Hydrogelformulierungen erhalten, die entweder Arzneimittel, wie es erhalten worden war, oder entsalztes Arzneimittel enthielten.
  • Unter Verwendung von Hydrogelen, in denen Arzneimittel, wie es erhalten worden war, eingesaugt worden war, wurde ein anderes Experiment vorgenommen, um die Wirkung der Stromdichte auf den transdermalen Fluß von Hirulog-B2 auszuwerten. Eine Erhöhung der Stromdichte führte zu einem entsprechenden Anstieg des Hirulog-B2-Flusses über den Bereich untersuchter Stromdichten. Unter passiven Bedingungen (kein Strom) wurde kein meßbarer Hirulog-B2-Fluß beobachtet.
  • BEISPIEL 10
  • IN VIVO-ELEKTROTRANSPORTFLUSS VON HIRULOG-B2
  • A. INTRAVENÖSE VERABREICHUNG VON HIRULOG-B2
  • Die für intravenöse (IV) Studien eingesetzten Schweine wogen 11 ± 1 kg (n = 3) und man ließ diese vor den Bolusinjektionen über Nacht fasten. IV-Bolusinjektionen wurden in die Aurikelvene oder die Vena cava verabreicht. Die IV-Injektion wurde über ungefähr 30 bis 60 s verabreicht und die Dosis betrug ungefähr 0,3 mg/kg (in 0,5 ml). Die Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen stiegen bei allen Schweinen nach der IV-Bolusinjektion von Hirulog-B2 rasch an, wobei eine durchschnittliche Spitzenkonzentration von 66 ± 6 ng/ml zu dem Probenentnahmezeitpunkt von 15 min erreicht wurde. Die Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen nahmen 2 h nach der Bolusinjektion auf unter 2 ng/ml ab und blieben von Stunde 2 bis Stunde 8 nach der Bolusinjektion relativ konstant. Die für jedes Schwein berechnete Eliminierungshalbwertszeit und Clearance sind in Tabelle 3 gezeigt. Das apparente Verteilungsvolumen und die durchschnittliche Eliminierungshalbwertszeit wurden aus den IV-Bolusdaten zu 45,4 l bzw. 16 min berechnet. TABELLE 4 PHARMAKOKINETIK VON HIRULOG-B2 IN SCHWEINEN
    Definitive Phase Schwein 303 Schwein 304 Schwein 305 Mittelwert Standardabweichung
    IV Körper-gewicht [kg] Ke [l/h] V [l] V [l/kg] CL [l/h] CL [l/h·kg] Eliminierung T1/2 [min] 12 11 10 11 1
    2,42 45,5 3,8 110 9,2 2,01 49,25 4,5 99 9,0 2,5 41,55 4,2 104 10,4 2,31 45,43 4,2 104 9,5 0,26 3,85 0,35 5,5 0,76
    17,2 20,72 16,6 18,2a 16b 2,23a -
    SC Eliminierung T1/2 [min] - 58b -
    4-ETS Eliminierung T1/2 [min] Akkumulation T1/2 [min] - - 28b 38b - -
    Screening-Phase Schwein SC-3A
    3-ETS Eliminierung T1/2 [min] Akkumulation T1/2 [min] 32 33
    • a Mittelwert, berechnet aus individuellen T1/2-Bestimmungen
    • b berechnet aus linearer Regression einer Kurve der mittleren Hirulog-B2-Plasmakonzentration gegen die Zeit
  • B. SUBKUTANE VERABREICHUNG VON HIRULOG-B2
  • Man ließ Schweine vor den subkutanen (SC) Injektionen über Nacht fasten. Es wurden ungefähr 0,5 mg/kg Hirulog-B2 (in 0,5 ml) SC im Verlauf einer Minute verabreicht. Die Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen erreichten innerhalb der ersten Stunde nach der Injektion einen Spitzenwert bei 57 ± 10 ng/ml und nahmen danach ab. Die durchschnittliche Eliminierungshalbwertszeit nach einer SC-Injektion betrug 58 min (Tabelle 4). Die Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen betrugen 6 h nach der SC-Injektion ungefähr 2 ng/ml und waren von Stunde 6 bis Stunde 8 relativ konstant.
  • C. ELEKTROTRANSPORT VON HIRULOG-B2
  • Die für eine Abgabe von Hirulog-B2 in vivo verwendeten Elektrotransportsysteme umfaßten eine Arzneimittel enthaltende Einwegeinheit in elektrischem Kontakt zu einer wiederverwendbaren Strom-Steuereinheit. Die Arzneimittel enthaltende Einwegeinheit bestand aus einem klebenden laminierten Schaumstoffband aus Polyethylen, medizinische Qualität, das sowohl die anodische Silberfoliengegenelektrode als auch eine kathodische, mit AgCl beladene Polyisobutylenfolienelektrode und die jeweiligen Gele aufnahm. Das Anodengel stand in Kontakt mit der Silberfolienanode. Ein kathodisches Grenzflächengel stand in Kontakt mit der kathodischen AgCl-Elektrode. Das Grenzflächengel war von dem Arzneimittel enthaltenden Donorgel durch eine Kationenaustauschmembran getrennt. Das Donorgel wurde in den Kathodenhohlraum des Gelgehäuses unmittelbar vor der Anwendung des Systems eingesetzt.
  • In die Arzneimittelgele ließ man am Tag vor dem Elektrotransport Hirulog-B2 in Acetatpuffer (10 mM, pH 5) einsaugen, um eine Endkonzentration von 5 mM Peptid zu erzielen. Die Hautkon taktfläche für jedes Arzneimittelgel betrug 6 cm2. Die angelegte Stromdichte betrug 0,1 mA/cm2.
  • Die Elektrotransportsysteme wurden hinsichtlich Strom und Spannung während des Elektrotransports überwacht, um die elektrische Kontinuität des Systems zu bestätigen. Die Spannungswerte waren für dieses Tiermodell typisch und zeigten eine anfängliche Abnahme, gefolgt von relativ konstanten Werten über die Dauer der Studie hinweg an. Die durchschnittliche Halbwertszeit der Eliminierung nach Beendigung des Elektrotransports betrug 28 min (Tabelle 5). Die durchschnittliche Halbwertszeit der Akkumulation zu Beginn des Elektrotransports betrug 38 min. Die Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen erreichten nach 4 h kontinuierlichen Elektrotransports einen Spitzenwert von 23 ± 6 ng/ml. Die Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen blieben von Stunde 2 bis Stunde 6 des Elektrotransports relativ stabil bei 21 ± 7 ng/ml und nahmen bei Stunde 8 leicht ab. Die apparente Abnahme der Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen von Stunde 6 bis Stunde 8 des Elektrotransports kann auf die Erschöpfung von Hirulog-B2 in dem Donorhydrogel zurückzuführen sein. Ein rascher Abfall der Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen trat nach Beendigung des Elektrotransports auf. 2 h nach Beendigung des Elektrotransports betrugen die Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen 2 ng/ml oder lagen nahe bei diesem Wert.
  • Die durchschnittliche Eliminierung aus drei Elektrotransportsystemen nach einer Beendigung des Elektrotransports betrug 32 min, während die durchschnittliche Halbwertszeit der Akkumulation zu Beginn des Elektrotransports 33 min betrug (Tabelle 5). Die Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen erreichten nach 2 h Elektrotransport Spitzenwerte von 9 ng/ml, wonach eine langsame Abnahme der Hirulog-B2-Plasmakonzentrationen auftrat.
  • Die transdermalen Flußraten, berechnet sowohl als Einströmrate (μg/h) als auch als Fluß pro Einheitsfläche (μg/cm2 h) wurden unter Verwendung von sowohl Ein-Kompartiments- als auch Nicht-Kompartiments-Analysen berechnet. Die Nicht-Kompartiments-Analyse berechnet den transdermalen Arzneimittelfluß aus der Konzentration von Arzneimittel in dem Blut des Tiers, wobei die Konzentration unter Einsatz von Standardtechniken gemessen wird, und der bekannten Rate, mit der das jeweilige Arzneimittel aus dem Blut entfernt wird. Die Ein-Kompartiments-Analyse berechnet den transdermalen Arzneimittelfluß aus der (d. h. gemessenen) Konzentration von Arzneimittel im Blut des Tiers und der Annahme, daß die Absorption von durch IV-Abgabe verabreichtem Arzneimittel durch das Tier bei jeder jeweiligen Rate die gleiche ist wie jene, die durch eine Elektrotransportverabreichung erzielt wird, um eine bestimmte Konzentration von Arzneimittel im Blut zu erzielen. Die Ein-Kompartiments- und Nicht-Kompartiments-Modelle werden in Pharmacokinetics, M. Gibaldi, 2. Auflage, Marcel Dekker (1982), S. 1–5 und 319–322 diskutiert. Die transdermale Einströmrate und die Flüsse pro Einheitsfläche unter Verwendung beider Analysen sind in Tabelle 4 gezeigt. Die durchschnittliche Einströmrate wurde zu 1873 ± 444 μg/h berechnet und der Fluß wurde zu 78 ± 18 μg h–1 cm–2 für vier ETS (Hirulog-B2)-Systeme unter Verwendung des Ein-Kompartiments-Modells berechnet. Unter Verwendung der Nicht-Kompartiments-Analyse wurde die Einströmrate zu 1900 ± 523 μg/h berechnet und der Fluß wurde zu 79 ± 22 μg h–1 cm–2 für vier ETS (Hirulog-B2)-Systeme berechnet. Ein durchschnittlicher Fluß von 22 μg h–1 cm–2 wurde für das Tier in der Screening-Phase 2 berechnet, das drei ETS (Hirulog-B2)-Systeme erhielt. TABELLE 5 BERECHNETE ELEKTROTRANSPORT-EINSTRÖMRATEN UND -FLUSS FÜR HIRULOG-B2 IN SCHWEINEN
    Definitive Phase Schwein 303 Schwein 304 Schwein 305 Mittelwert Standardabweichung
    4-ETS (Ein-Kompartiment) Ke [l/h] Rate [μg/h] Fluß [μg/cm2 h] 3,64 1361 56,7 2,5 2096 87,3 2,94 2161 90,0 3,03 1873 78,0 0,58 444 18,5
    4-ETS (Nicht-Kompartiment) Rate [μg/h] Fluß [μg/cm2 h] 1396 58,2 1866 77,8 2440 101,7 1900 79,2 523 21,8
    Screening-Phase Schwein SC-3A
    3-ETS (Ein-Kompartiment) Ke [l/h] Rate [μg/h] Fluß [μg/cm2 h] 3,15 392 21,8
    3-ETS (Nicht-Kompartiment) Rate [μg/h] Fluß [μg/cm2 h] 412 22,9
  • Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingehender beschrieben worden sind, versteht es sich, daß naheliegende Abwandlungen vorgenommen werden können, ohne von dem Geist und dem Umfang der Erfindung, wie sie durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, abzuweichen.

Claims (7)

  1. Verwendung eines Polypeptidanalogs, in welchem ein oder mehrere α-helikale und/oder β-Faltblatt-Abschnitte zerstört sind, zur Herstellung einer Zusammensetzung, die nützlich ist zum Abgeben eines Polypeptidmittels durch eine Körperoberfläche unter Verwendung einer Elektrotransportvorrichtung, wobei das Polypeptidanalog durch ein Verfahren erzeugt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Ausgangspolypeptid mit einem α-helikalen und/oder β-Faltblatt-Abschnitt bereitgestellt wird, ein oder mehrere Aminosäurereste des Ausgangspolypeptids durch einen Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pro, Gly, Asn und Ser, substituiert werden, um einen oder mehrere α-helikale und/oder β-Faltblatt-Abschnitte des Ausgangspolypeptids zu zerstören, um ein Polypeptidanalog zu erzeugen, wobei das Polypeptidanalog eine bessere/verstärkte Elektrotransportierbarkeit im Vergleich zu dem Ausgangspolypeptid aufweist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der für die Substitution verwendete Aminosäurerest aus der Gruppe bestehend aus Pro, Asn und Ser ausgewählt ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptidanalog mindestens ungefähr die gleiche biologische Aktivität wie das Ausgangspolypeptid aufweist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Ausgangspolypeptid Hirulog mit der Aminosäuresequenz
    Figure 00510001
    ist, wobei D-Cha D-Cyclohexylalanin bezeichnet.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Polypeptidanalog Hirulog-B2 mit der Aminosäuresequenz
    Figure 00520001
    ist, wobei D-Cha D-Cyclohexylalanin bezeichnet.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Ausgangspolypeptid ein Ausgangs-Parathormon(PTH)-Molekül mit der Aminosäuresequenz
    Figure 00520002
    ist, und wobei das Polypeptidanalog ein PTH-Analog mit der Aminosäuresequenz
    Figure 00520003
    ist.
  7. Parathormon (PTH)-Analog, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:
    Figure 00520004
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