FI90800B

FI90800B - Biospesifinen määritysmenetelmä sekä tuote määritystä varten

Info

Publication number: FI90800B
Application number: FI911246A
Authority: FI
Inventors: Veikko Naentoe
Original assignee: Veikko Naentoe
Priority date: 1991-03-13
Filing date: 1991-03-13
Publication date: 1993-12-15
Also published as: DE4208156C2; FR2674026A1; FI911246A; DE4208156A1; FI90800C; FI911246A0; FR2674026B1

Description

90800

BIOSPESIFINEN MÄÄRITYSMENETELMÄ SEKÄ TUOTE MÄÄRITYSTÄ VARTEN

Keksintö koskee biospesifisiä määritysmenetelmiä, joissa käytetään spesifisiä reagenssimateriaaleja biospesifisessä reaktiossa kiinteässä faasissa olevan komponentin kanssa, jolloin määritys suoritetaan lisäämällä näyte tai standardi 5 reaktiokaivoon, joka sisältää sekä käyttövalmiin kiinteä faasi -komponentin että muut biospesifisen reaktion määrityskoh-taiset komponentit käyttövalmiissa muodossa, jolloin muut määrityskohtaiset komponentit on kuivattu käyttövalmiiseen muotoon.

10 Keksintö koskee myös biospesifisiä määrityksiä varten tarkoitettua tuotetta, joka käsittää biospesifisen reaktion kiinteä faasi-komponentin ja muut määrityskohtaiset komponentit käyttövalmiissa muodossa sisältävän reaktiokaivon reagens-sien lisäämiseksi tuotteeseen määrityksen suorittamiseksi, 15 jolloin biospesifisen reaktion muut määrityskohtaiset komponentit ovat reaktiokaivossa kuivattuina käyttövalmiiseen muotoon.

KEKSINNÖN TAUSTA

Erityisesti helppokäyttöisistä, nopeista immunokemiallista 20 määrityksistä on ollut pitkään tarvetta markkinoilla.

Perinteiset radioimmunomääritykset tehtiin alussa liuoksessa käyttäen koeputkia ja monimutkaisia erotusmenetelmiä. Kiinteän faasin teknologioiden tultua markkinoille erilaiset merkkiaineet ovat korvanneet radioisotooppeja ja erityisesti mono-25 klonaalisia vasta-aineita on sovellettu lisääntyvässä määrin.

Nämä parannukset ovat erilaistaneet perinteisiä immunomää-rityksiä (esim. Alternative Immunoassays, Ed. W.P. Collins, Wiley, Chichester 1985). Kiinteän faasin määrityksistä on tullut rutiinimenetelmiä sekä kompetitiivisten että ei-30 kompetitiivisten määritysten alueella ja perinteinen koeputki on usein korvattu vaihtoehtoisilla kiinteillä faaseilla.

2

Rutiini- hormonimäärityksessä esiteltiin mikrotiitterilevy kiinteänä faasina vuonna 1984 Wallac Oy:n (Turku, Finland) tuodessa DELFIAR-teknologian markkinoille. Muut kaupalliset yritykset (esim. Amerlite, Amersham International U.K.) ovat 5 myöhemmin ottaneet käyttöön samanlaisia kiinteitä faaseja vastaavissa rutiinikokeissa, vaikka ne ovat perustuneet muihin leimateknologioihin. Tähän saakka kaikki mikrotiitterilevyjen käyttöön perustuvat immunomääritykset käyttävät levyä joko ainoastaan astiana tai sitten kiinteänä faasina immobile) lisoidulle määrityskomponentille. Kaikki muut määrityskom-ponentit täytyy lisätä erikseen levyn yksittäisiin mikrotiit-terikaivoihin. Tämä johtaa siihen, että mikrotiitterilevymuo-toon perustuvien kaupallisten tuotteiden (kittien), täytyy sisältää joukko erillisiä astioita (pulloja) , jotka sisältävät 15 määrityksen vaatimia komponentteja. Komponenttien määrä vaihtelee tietenkin määrityksen ja sen periaatteen mukaan. Tästä on seurauksena, että tällaisen tuotteen käyttäjän pitää tehdä suuri määrä toimenpiteitä ja pipetointivaiheita suorittaakseen määrityksen.

20 Nämä tekijät yksin tekevät mikrotiitterilevypohjaiset immunomääritykset hankaliksi käyttää ja vaikeiksi automatisoida.

US-patentissa 4 017 597 on esitetty tuote, jossa ensimmäinen komponentti on kiinteässä kantajassa ja toinen komponentti on 25 kiinteän kantajan päällä, mutta se on saatettu reagoimattomaan muotoon tätä komkponenttia sisältävän liuoksen nopealla kylmäkuivauksella.

US-patentissa 4 162 003 on esitetty tuote, jossa on käytetty kylmäkuivausta tai jäädytystä komponenttien saamiseksi 30 reagoimattomaan muotoon eri kohtiin.

Suomalaisessa kuulutusjulkaisussa 84301 on erillinen irrallinen, toisen komponentin sisältävä kappale, joka on kiinteässä faasissa olevan ensimmäisen komponentin päällä. Kuitenkin myös tässä tapauksessa on kysymys kylmäkuivatusta komponentista,

II

3 90800 joka on saatu aikaan antamalla toista komponenttia sisältävän liuoksen tai suspension pudota vapaasti kylmän, veteen sekoittumattoman ja tiheydeltään vettä pienemmän nesteen läpi, minkä jälkeen näin saadut jäätyneet napit voidaan kylmäkuiva-5 ta.

Kylmäkuivauksen haittana on se, että se vaatii erityislaitteet valmistettaessa biospesifisiin määrityksiin tarkoitettua tuotetta.

KEKSINTÖ LYHYESTI

10 Kyseinen keksintö poistaa monet heikkoudet ja epätäydellisyydet verrattuna mikrotiitterilevyyn perustuviin immuno-määrityksiin, jotka käyttävät reaktion ulkopuolisia rea-gensseja, immobilisoitua komponenttia lukuunottamatta, ja verratuna edellä mainittuihin tunnettuihin ratkaisuihin, 15 joissa komponentit ovat käyttövalmiissa muodossa.

Keksinnön menetelmän mukaisesti määritys suoritetaan lisäämällä näyte tai standardi reaktiokaivoon, jossa biospesifisen reaktion muut määrityskohtaiset komponentit ovat käyttövalmiiseen muotoon kuivattuina kiinteästä faasista erillisellä reak-20 tiokaivoon sijoitetulla alustalla, kuten muovia, nitrosellu-loosaa, selluloosaa tai lasikuitua olevalla alustalla.

Käyttövalmiiden spesifisten reagenssien käyttö on helppoa keksinnön mukaisessa mikrotiitterilevymuodossa. Ainoat määrityksen suorittamiseen vaadittavat lisäkomponentit 25 käyttövalmiissa muodossa ovat näyte tai standardi ja näyte-puskuri, johon sisältyy myös pesuliuos.

Keksinnön mukaiselle tuotteelle on ominaista se, että reaktiokaivossa biospesif isen reaktion muut määrityskohtaiset komponentit ovat käyttövalmiiseen muotoon kuivattuina 30 kiinteästä faasista erillisellä reaktiokaivoon sijoitetulla alustalla, kuten muovia, nitroselluloosaa, selluloosaa tai lasikuitua olevalla alustalla.

4

Erään suoritusmuodon mukaan levymuotoinen tuote voi olla immunomääritystuote (kitti) sisältäen mikrotiitterilevyn (8x12 tai 12x8 kaivoa), jossa jokainen kaivorivi on pinnoitettu immobilisoidulla kiinteä faasi -komponentilla (reaktiokaivori-5 vi) . Vastaavasti jokainen mikrotiitterilevy sisältää 8 x 12 tai 12 x 8 reaktiokaivoriviä. Näin ollen immunomääritystuote sisältää 96 yksittäistä määritystä sisältävän käyttövalmiin mikrotiitterilevyn.

Edellä mainittuun tuotteeseen voidaan soveltaa myös muita 10 reaktiokaivorivimääriä. Immunomääritystuote voi sisältää muita levytörmäätteja sisältäen vaihtelevan määrän reaktiokaivori-vejä. Lisäksi immunomääritystuote voi sisältää useita spesifisiä määrityksiä. Standardit toimitetaan erikseen, mikäli tarpeen, ja määrityspuskuri pesuliuos mukaanluettuna 15 toimitetaan suurissa erissä.

Keksintö täyttää seuraavat vaatimukset: 1. Kaikki määrityskohtaiset reagenssit sisältyvät tuotteen (kitin) käyttövalmiiseen muotoon = mikrotiitterilevyyn 2. Määrityskohtaisia reagenssiastioita ei sisälly tuotteeseen 20 3. Valmistaja voi suorittaa analyyttikohtaisen standar disoinnin 4. Analyyttikohtaiset määritykset tuotteelle (kitille) = mikrotiitterilevymääritys, voidaan suorittaa joko manuaalisesti tai täysin automatisoituna 25 5. Sekä kompetitiivisiä että ei-kompetitiivisiä immunomää- rityksiä kuten myös takaisintitrausta vaativia määritysmenetelmiä voidaan käyttää 6. Tuotetta voidaan soveltaa myös nukleiinihappo-hybri-disaat io-määr ityksi in

II

5 90800 7. Tuotetta voidaan käyttää myös reseptorimäärityksiin 8. Tuote (kitti) = mikrotiitterilevy on sopiva erityisesti joko manuaalisiin tai täysin automatisoituihin erätyyp-pisiin määrityksiin

5 KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

Keksinnön menetelmää voidaan soveltaa sekä kilpaileviin että ei-kilpaileviin spesifisiin immunomäärityksiin sisältäen myös esim. virus-vasta-ainemääritykset ja serologiset määritykset, tai myös nukleiinihappohybridisaatiomäärityksiin tai resepto-10 rimäärityksiin.

Kaikki immunomääritykset suoritetaan käyttövalmiilla mikro-tiitterilevyllä, tällöin minimoidaan käsittelyaika ja optimoidaan erätyyppinen määritys, automaatio, toistettavuus ja standardisointi.

15 Keksintöä kuvataan seuraavasti:

Kuva 1. esittää käyttövalmista mikrotiitterilevyä, jossa rivit A, B, C, D, E, F, G ja H ovat reaktiokaivo-rivejä,

Kuva 2. esittää käyttövalmista mikrotiitterilevyä, jossa 20 rivit 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ja 12 ovat r eakt ioka i vor i ve j ä,

Kuva 3. esittää keksinnön mukaisesti suoritetun hTSH-mää-rityksen standardikuvaajän ja toistettavuuskäyrän, ja 25 Kuva 4. esittää keksinnön mukaisesti suoritetun hCG-määrityk-sen standardikuvaajän ja toistettavuuskäyrän.

Määritysspesif inen mikrotiitterilevy sisältää reaktiokaivori-vejä, kuten esitetty kuvissa 1. ja 2. Niin kauan kuin 6 reaktiokaivorivi pystyy säilyttämään immobilisoidun komponentin sekä tarvittaessa määrityskohtaiset lisäkomponentit ei mikrotiitterilevyn muoto tai materiaali sellaisenaan rajoita keksinnön suorituskykyä. 96 kaivoa sisältävä mikrotiitterilevy 5 voidaan joko valaa yhdestä kappaleesta tai se voidaan koota 1-12:sta mikrotiitteri-osasta, jolloin yksi osa sisältää joko 8 tai 12 kaivoa. Vaihtoehtoisesti se voidaan tehdä yksittäisistä valetuista kaivoista, jotka on asennettu sopivaan mikrotiitterilevymuotoiseen kehykseen.

10 Käyttövalmis määrityskohtainen mikrotiitterilevy on työstetty pinnoittamalla reaktiokaivorivin mikrotiitterikaivot vaaditulla, biospesifisen reaktion sopivalla kiinteä faasi -komponentilla. Menetelmä ja valittavat komponentit ovat riippuvaisia spesifisestä määrityksestä ja sen periaatteesta, jotka ovat 15 ovat tunnettuja menetelmän tuntevalle alan ammattimiehelle.

Reaktiokaivorivin mikrotiitterikaivot sisältävät myös muut määritysspesifiset biospesifisen reaktion lisäkomponentit. Käyttövalmiiden lisäkomponenttien, kuten leimattujen komponenttien, lisäys on tapahduttava tuotantovaiheessa niin että 20 tuote on käyttövalmis, kun siihen lisätään näyte tai standardi ja näytepuskuri, johon sisältyy myös pesuliuos.

Ei-kilpailevassa (non-kompetitiivinen) määrityksessä on leimatun immunokomponentin (vasta-aineen) lisäys pinnoitetun reaktiokaivorivin mikrotiitterikaivoihin tapahduttava niin 25 että leimattu komponentti ei pääse epäspesifisestä sitoutumaan pinnoitettuun mikrotiitterikaivoon. Tällöin leimattu komponentti kuivataan kvantitatiivisesti suodatinpaperille, josta leikataan tietyn leimakomponenttimäärän sisältävä kiekko kuhunkin pinnoitetun reaktiokaivorivin mikrotiitterikaivoon. 30 Suodatinpaperikiekko voi olla esim. muovia, lasikuitua, nitroselluloosaa tai selluloosaa. Määrityksessä näytepuskuri liuottaa nopeasti paperille kuivatun leimakomponentin ja paperikiekko sellaisenaan poistetaan reaktiokaivorivin mikrotiitterikaivosta ensimmäisen pesuvaiheen yhteydessä. 35 Täten voidaan yksivaiheinen ei-kilpaileva immunomääritys tehdä li 7 90800 reaktiokaivorivin mikrotiitterikaivoissa, jotka valmiiksi sisältävät kaikki määritysspesifiset komponentit.

Käyttövalmiit määrityskohtaiset mikrotiitterilevyt voidaan standardisoida jo valmistus- tai tuotantovaiheessa niin, että 5 vain kontrollit ja näytteet analysoidaan, kun tuotetta (kittiä) käytetään.

Sovellettava merkkiaine käyttövalmiissa mikrotiitterilevy-pohjäisessä tuotteessa pitää lukea suoraan reaktiokaivosta. Keksintö on tarkoitettu erityisesti aikaerotteiseen fluoro-10 metriaan ja lantanidikelaattien käyttämiseen merkkiaineena, jolloin saadaan joko kvalitatiivinen tai kvantitatiivinen lukema immunomäärityksen tapahduttua.

Keksintö ei sellaisenaan sulje pois muiden merkkiaineiden käyttöä, kuten radioisotooppien, entsyymien, perinteisten 15 fluoroforien ja kemiluminesenssin, jos ne sopivat käyttövalmiiseen reaktiokaivo-mikrotiitterilevykonseptiin, joka on kuvattu aiemmin. Tästä seuraa, että mittaaminen suoritetaan joko beta- tai gammalaskimella, fotometrillä, fluorometrillä tai luminometrillä.

20 Käyttövalmista määrityskohtaista mikrotiitterilevyä voidaan soveltaa erätyyppisiin määrityksiin joko manuaalisesti tai täysin automatisoidussa määrityksessä.

Manuaaliseen menetelmään liittyen esim. seuraavaa määritys-periaatetta voidaan soveltaa: 25 Ei-kilpaileva yhden inkubaation määritys (tuote sisältää reaktiokaivorivejä, joissa on mikrotiitterikaivokohtainen suodatinpaperikiekko)

Vaiheet: 1. Näytteen ja puskurin pipetointi reaktiokaivoriviin 30 2. Inkubaatio, ravistelu, huoneenlämmössä (tai 35°C:ssa) 8 3. Reaktiokaivorivin pesu (immunomääritys viety loppuun) 4. Reaktiokaivorivin mittaaminen

Seuraavat ei-rajoittavat sovellutusesimerkit kuvaavat keksinnön toimintaa: 5 Esimerkki 1:

Ei-kilpaileva yhden inkubaation aikaerotteinen hTSH:n fluoroimmunomääritys, joka tehdään käyttövalmiilla mikro-tiitterilevymenetelmällä käyttäen reaktiokaivoja, jotka sisältävät leimatun vasta-aineen suodatinpaperikiekolla.

10 Mikrotiitterilevyn reaktiokaivorivin kaivot sisältävät anti-hTSH monoklonaalisen vasta-aineen immobilisoituna ja kuivana kaivojen seinällä. Lisäksi kaivot sisältävät suodatinpaperi-kiekon, jossa on kuivattuna toinen anti-hTSH monoklonaalinen vasta-aine, joka on leimattu fluoresoivalla europiumkelaatil-15 la.

hTSH-määritys käyttäen käyttövalmista mikrotiitterilevyä (tuote) sisältää seuraavat vaiheet: 1. 50 μΐ suurissa erissä toimitettavaa määrityspuskuria + 50 μΐ näytettä pipetoidaan jokaiseen reaktiokaivorivin 20 kaivoon.

2. Mikrotiitterilevy inkuboidaan 60 min. jatkuvasti ravistellen huoneenlämmössä.

3. Reaktiokaivorivin kaivot pestään (immunomääritys on viety loppuun).

25 4. 200 μΐ liuosta lisätään, joka irroittaa fluoresoivan europiumkelaatin kaivojen pinnasta.

n 9 90800 5. Europiumfluoresenssi mitataan jokaisesta reaktiokaivorivin kaivosta käyttäen aikaerotteista fluorometriaa.

Tulokset:

Kuva 3. hTSH-määrityksen standardikäyrä ja toistettavuuskäyrä 5 suoritettuna keksinnön mukaisesti.

Esimerkki 2:

Ei-kilpaileva yhden inkubaation aikaerotteinen hCG:n fluoroim-munomääritys, joka tehdään käyttövalmiissa reaktiokaivoissa, jotka sisältävät leimatun vasta-aineen muovikiekolla.

10 Anti-hCG monoklonaalinen vasta-aine, joka oli leimattu fluoresoivalla europiumkelaatilla laimennettiin kuivausliuok-seen ja liuos levitettiin muovipinnalle syöttämällä vakiovir-taus ruostumatonta terästä olevan kapillaariputken kautta. Kapillaariputki oli kosketuksissa muovikalvon pinnan kanssa 15 levityksen aikana aiheuttaen täten leimaliuoksen jatkuvan viivan, jossa oli pituussuunnassa vakio leimakonsentraatio. Syötetty liuos kuivattiin kalvon pintaan voimakkaalla ilmavirtauksella. Kuivauksen jälkeen kalvosta stanssattiin pyöreitä kiekkoja, jotka oli keskitetty leiman muodostaman 20 viivan suhteen. Muovikiekon halkaisija oli 3 mm ja kuivatun liuoksen määrä kiekolla oli 0,2 μΐ. Kiekot siirrettiin liuskan kaivoihin, jotka oli aikaisemmin päällystetty anti-hCG monoklonaalisella vasta-aineella ja kuivattu.

25 μΐ hCG-standardeja pipetoitiin liuskan kaivoihin. Kuhunkin 25 kaivoon lisättiin 100 μΐ määrityspuskuria. Liuskoja inkuboi-tiin huoneenlämpötilassa yhden tunnin ajan ravistellen hitaasti. Inkubaatio-vaiheen jälkeen kiekot poistettiin reaktiokaivoista alipaineeseen yhdistetyllä imusuuttimella. Kukin liuska aspiroitiin ja pestiin kuusi kertaa. 200 μΐ 30 mittausliuosta lisättiin, ja liuskoja ravisteltiin hitaasti kolmen minuutin ajan fluoresoivan Eu-kelaatin irrottamiseksi n

Claims

90800

1. Biospesifinen määritysmenetelmä, kuten spesifinen im-munomääritys, nukleiinihappohybridisaatiomääritys tai reseptorimääritys, jossa käytetään spesifisiä reagenssimateri- 5 aaleja biospesifisessä reaktiossa kiinteässä faasissa olevan komponentin kanssa, jolloin määritys suoritetaan lisäämällä näyte tai standardi reaktiokaivoon, joka sisältää sekä käyttövalmiin kiinteä faasi -komponentin että muut biospesifisen reaktion määrityskohtaiset komponentit käyttövalmiissa muodos-10 sa, jolloin muut määrityskohtaiset komponentit on kuivattu käyttövalmiiseen muotoon, tunnettu siitä, että näyte tai standardi lisätään reaktiokaivoon, jossa biospesifisen reaktion muut määrityskohtaiset komponentit ovat käyttövalmiiseen muotoon kuivattuina kiinteästä faasista erillisellä reak-15 tiokaivoon sijoitetulla alustalla, kuten muovia, nitrosellu-loosaa, selluloosaa tai lasikuitua olevalla alustalla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiokaivoja on useampia yhdessä tai useammassa reaktiokaivorivissä (A-H; 1-12).

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tulos mitataan reaktiorivikaivosta fluorometriällä, kuten aikaerotteisella fluorometria11a, fotometrialla, luminometrialla tai gamma- tai betalaskimella.

4. Biospesifisiin määrityksiin, kuten spesifiseen im-25 munomääritykseen, nukleiinihappohybridisaatiomääritykseen tai reseptorimääritykseen tarkoitettu tuote, joka käsittää biospesifisen reaktion kiinteä faasi -komponentin ja muut määrityskohtaiset komponentit käyttövalmiissa muodossa sisältävän reaktiokaivon reagenssien lisäämiseksi tuotteeseen 30 määrityksen suorittamiseksi, jolloin biospesifisen reaktion muut määrityskohtaiset komponentit ovat reaktiokaivossa kuivattuina käyttövalmiiseen muotoon, tunnettu siitä, että reaktiokaivossa biospesif isen reaktion muut määrityskohtaiset komponentit ovat käyttövalmiiseen muotoon kuivattuina kiinteästä faasista erillisellä reaktiokaivoon sijoitetulla alustalla, kuten muovia, nitroselluloosaa, selluloosaa tai lasikuitua olevalla alustalla.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen tuote, tunnettu siitä, 5 että reaktiokaivo muodostaa toisten samanlaisten kaivojen kanssa ainakin yhden reaktiokaivorivin (A-H; 1-12).

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen tuote, tunnettu siitä, että tuote on mikrotiitterilevymuodossa ja koostuu yhdestä kappaleesta tai useammista yhteenliitetyistä kappaleista, 10 jolloin levy muodostuu esimerkiksi 12 kaivon 8 rivistä tai 8 kaivon 12 rivistä, kun se käännetään 90 astetta alkuperäisestä asennosta.

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen tuote, tunnettu siitä, että se on tarkoitettu spesifiseen immunomääritykseen, 15 joka on kilpaileva määritys, ei-kilpaileva määritys, virus-vasta-ainemääritys tai serologinen määritys. n 90800