JPH09506973A

JPH09506973A - 粒子の２つの判別可能な型を用いた検定方法

Info

Publication number: JPH09506973A
Application number: JP7517286A
Authority: JP
Inventors: フレンゲン，ヨーマー
Original assignee: シンヴエント・アクシエセルカペト
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-23
Publication date: 1997-07-08
Anticipated expiration: 2018-03-10
Also published as: GB9326379D0; EP0736177A1; WO1995017674A1; US5723346A; CA2179823C; DE69405781T2; EP0736177B1; DE69405781D1; AU1322095A; JP3384805B2; CA2179823A1

Abstract

(57)【要約】分析対象および標識リガンドを、それぞれ分析対象および標識リガンドに対する親和性を有する固体支持結合相手の２つの独立して測定できる形態に反応させ、二重標準検量線を参照することにより、得られる２つの形態から生じたシグナルから分析対象の濃度を測定するような、広い動的範囲と高い精度を与えることのできる二元検定方法。方法で用いるキットも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】粒子の２つの判別可能な型を用いた検定方法本発明は、分析対象を検定する方法およびそのような方法において有用なキットに関する。分析対象の存在、および、望ましくは更にその濃度を、その分析対象に対して特異性を有する結合相手を用いて測定するための検定方法は、例えば生物化学および臨床化学の分野において、頻繁に見ることができる。即ち、例えば広範囲の免疫学的方法および関連方法が、特定の抗原に対する特異的抗体（例えばモノクローナル抗体）のような分析対象に対する適切な結合相手を用いて、血清中の抗原のような物質を測定する目的で提案されている。このような方法の１つは競合的結合検定であり、この方法では、測定すべき分析対象の標識型（例えば放射標識されたもの）の既知量およびそれに対する結合相手の比較的少量の既知量を測定すべき分析対象と共にインキュベートし、これにより、標識物質と天然の分析対象とを結合相手に対して競合させる。その後、結合相手に結合した標識分析対象の量を測定し、その量に対して逆の相関を有する天然の分析対象の濃度を予め作成した標準曲線から求める。もう１つの有用な方法はサンドイッチ検定である。これは過剰量の結合相手を用い、それに結合する分析対象を、やはり分析対象に対する親和性を有する標識リガンドで処理することにより標識する。次に結合し、標識された分析対象の量を測定し、標準検量線を参照することにより分析対象の濃度を求めることができる。このようなサンドイッチ検定における結合相手と標識リガンドは、好ましくは、分析対象上の異なる結合部位（例えばエピトープ）に対して親和性を有する。リガンドを例えば、放射能、吸光度または蛍光に基づいて読み取ることができるように標識してよい。サンドイッチ検定は競合的結合検定よりも感度が高い傾向があるため通常は好ましい。例えば臨床実検室における免疫検定においては、高い感度が必須であり、このような用例においては、例えばナノモル／ｌ〜ピコモル／ｌまたはそれより低い濃度で血清中に存在する抗原を定量することが必要になる場合がある。上記した両方の種類の検定における結合相手は、結合した分析対象および競合する、または、分析対象に結合した標識物質の単離を容易にするために、一般的に固体支持体にカップリングされる。即ち、例えば、結合相手は、反応容器の表面に、例えば適当なプラスチック素材から作成されたマイクロプレートのウエルの表面にカップリングさせることにより、未結合の過剰量の標識リガンドを除去するための洗浄を容易にすることができる。あるいは、結合相手を、例えばポリスチレンまたはポリアクリレートのような適当なプラスチック材料から作成された粒子列の表面にカップリングさせてよい。次に遊離の標識からの結合分析対象／標識の分離を、例えば、濾過により、または、超常磁性体粒子を用いる場合は、磁場を適用することにより行ってよい。結合相手により広い総面積をコーティングするためには、粒子は顕微鏡レベルの大きさであることが好都合である。単一の大きさの粒子の使用は、粒子が標準的結合特性を示すことが確実になるという理由から好ましい。上記した基礎的検定方法の不都合な点は、結合分析対象および標識の分離、および、未結合の標準物質を除去するための関連洗浄段階が、長時間を必要とし、労働集約的であるという固有の問題を有するためである。しかしながら、この問題は、フローサイトメトリーで粒子を分析する際には、粒子系検定の場合には原則的に回避できることが知られている。これには典型的には、連続する個々の粒子が励起光線の照射を受けるように光度系の測定領域に粒子懸濁液を通過させ、粒子の大きさに関連する散乱光のパルス、および別のシグナル、例えば、粒子に結合した標識物質の量および性質に関連する蛍光のパルスの発光を生じさせることが包含される。適当な電子的検出器およびマイクロプロセッサーを用いて結果を分類して保存し、10⁴〜10⁵の個々の粒子の測定結果を、例えば１分のデータ獲得時間のうちに容易に得ることができる。フローサイトメトリー中の試料流の流体力学的集中により測定領域(即ち励起／検出領域内の試料流の体積)を極めて小さく、典型的には(10μｍ)³のオーダーにまですることにより、測定される個々の粒子の周囲の液体中に存在する未結合の標識の量が無視できるものとなる。従って、フローサイトメトリー粒子分析の前に未結合の標識物質を分離する必要が無く、従ってこれは、均質的検定、即ち、無分離検定ということができる。特にフローサイトメトリー方法を用いて実施されるものを含むサンドイッチ検定に関わる一般的な問題点は、その動的範囲が、高い分析対象濃度で生じるフック作用として知られる現象により制限される点である。即ち、結合相手は通常は固定された量で用いられるため、理論的な最大の検出可能な分析対象の濃度は分析対象に対する結合相手の使用可能な総結合容量により決定される。しかしながら、標識リガンドも通常は固定された量で用いられるため、結合分析対象あたりの使用可能な標識の量は、分析対象濃度がこの理論的最大値を超過する場合には、溶液中に残存する過剰量の未結合の分析対象への標識の結合が増大する結果、顕著に減少する。言い換えれば、未結合の過剰量の分析対象は、標識に対して結合分析対象と競合し、これにより、結合分析対象上に固定された標識の量は減少する。その結果、結合相手が飽和する濃度を超えて分析対象濃度が増加するに従って、結合分析対象／標識の観察される濃度は減少する。従って、分析対象濃度に対する結合標識に関わるシグナル強度の検量線は、最大値まで上昇した後は分析対象濃度が更に増加するに従って減少し、その結果、例えば試料の希釈や別の検定を含む更に別の段階を実施しない限り、シグナル強度を単一の濃度値に絶対的に対応させることは不可能である。フック作用の発生は原則的には使用される結合相手の量を増大させることにより遅延されるが、フローサイトメトリーのような測定方法では正確に検出することのできる結果を得るには粒子当たりの結合分析対象／標識の特定の最小値が必要となるため、低い分析対象濃度では感度が低下することは不可避である。米国特許出願4595661号は、免疫検定におけるフック作用は、場合により標識され、そして／または固体担体に結合され、そして、一次結合相手抗体および標識リガンドよりも標的抗原に対して低い親和性を有するようなもう１つの抗体を用いることにより低減されることを示唆している。この低親和性抗体は高い分析対象濃度では分析対象に結合することによりフック作用の発生を遅延させるが、バックグラウンド干渉や非特異的結合が増大する結果、低分析対象濃度での検定の感度がやはり低下するのである。同様の試みが米国特許出願4743542号にも記載されており、この例では、原理はやはり、免疫検定において標識リガンドと競合する未標識の抗体を添加することである。抗原に対する別の試薬として作用することにより、この未標識抗体は抗原濃度を一次結合相手抗体の飽和が起こるまで上昇させ、これによりフック作用の発生を延期させる。全体的な作用は、より広い範囲の抗原濃度を対象にできるが傾きの小さい検量線になってしまうことであり、その結果、何れの測定抗原濃度においても不確実性が大きくなるという不都合な点を有する。 WO-A-8911101号は、フローサイトメトリーで判別可能な種々の単分散粒子にコーティングした高親和性および低親和性の結合相手をそれぞれ用いたより高度な検定方法を記載している。この二元粒子混合物および標識リガンドの所定量を、分析対象と共にインキュベートし、そしてその後得られた二種類の標識リガンド担持粒子を、独立して、ただし同時に、フローサイトメーターにより検出し、このようにして得られた２つの測定値から二重標準検量線を参照しながら分析対象の濃度を求めることができる。この二重アフィニティー検定方法は、標識リガンドが典型的には分析対象の標識型である結合相手に対する親和性を有しなければならないような競合的結合検定、および、標識リガンドが分析対象に対する親和性を有さなければならないサンドイッチ検定の両方に適用してよい。全ての粒子の種類をフローサイトメトリーにより個別に判別できるように、複数の二元粒子混合物を用いて複数の分析対象を同時に検定することが可能である。二重標準検量線を使用することは、１つの試料に対する２つの測定値が一対として二重曲線に適合しなければならないため、検定の精度を高め、異常な、または誤った結果の即時検出を可能にする。２種類の粒子は別々に測定されるため、主に高親和性結合相手の関数である低濃度における感度は、低親和性結合相手の存在により相殺されることなく、これが、高分析対象濃度における高精度測定を可能にし、フック作用より優先させることにより検定の動的範囲を増大させる。これは、標識された別の抗体を用いた場合に２つの結合反応に関与するものの合計のみを測定するため低い抗原濃度では感度が低下する米国特許出願4595661号に記載されている免疫検定とは対象的である。本発明は高い水準の精度を伴った広い動的作業領域が、二元検定系により、即ち、２種類の独立して測定可能である形態の結合相手を用い、２種類の結合相手がそれぞれ分析対象および標識リガンドに対して親和性を有する場合に、二重標準曲線によりこれらの２つの形態に由来する測定値から分析対象の濃度を求めるような系により達成できるという意外な発見に基づいている。即ち、本発明の１つの特徴によれば、分析対象に対する親和性を有する第１の結合相手、分析対象または第１の結合相手に対する親和性を有する標識リガンド、および、標識リガンドに対する親和性を有する第２の結合相手と試料を反応させることを包含し、上記第１および第２の結合相手は独立して測定することのできる固体支持形態にあり、これにより、形成される標識されたリガンドを担持した第１および第２の結合相手に関するシグナルが独立して測定され、これを用いて二重標準検量線を参照しながら分析対象の濃度が求められるような、試料中の分析対象を検定するための方法が提供される。多くの種類の検定系および検出方法を本発明の方法で用いてよい。即ち、例えば、第１および第２の固体支持結合相手は、例えば、大きさに基づいて顕微鏡検査または写真撮影により、または後に詳述するとおり、大きさまたは電気抵抗に基づいてフローサイトメトリーにより、判別可能な２種類の結合相手コーティング単分散粒子を有してよい。あるいは、第１の固体支持結合相手は、例えば適切にコーティングされたディップスティックまたはマイクロプレートのウエルのコーティングされた表面であってよく、第２の結合相手は、適切にコーティングされた微粒子またはビーズであってよく、これらは好ましくは単分散であり、これにより、２種類の固体支持形態を、検定操作終了後、例えば分光分析、放射線測定または写真撮影により適宜、分離して分析してよい。その他の代替系では、第１の結合相手についてはコーティング微粒子、第２の結合相手には適切にコーティングされたフィルターを使用する。操作の第１段階で少なくとも分析対象および標識リガンドをインキュベートすることが一般的に望ましいものの、種々の試薬および分析対象を組み合わせる順序は厳密ではない。即ち、例えば、１セットの時間で分析対象および標識リガンドをまず反応させ、その後、第１および第２の結合相手を同時にまたは何れかの順序で順次添加するのが好都合である。あるいは、まず、例えば第１の結合相手および標識リガンドを試料と組み合わせ、その後、第２の結合相手との反応を行ってもよい。試料と全ての試薬を同時に組み合わせることも可能である。所定のインキュベーション時間を用いた標準的な順序を何れかの所定の検定系で使用することにより、結果の再現性を向上させることが好ましいのは明らかである。更にまた、本発明の範囲内の特定の検定系のための二重標準検量線の全体的形状はサンドイッチ検定系を用いるか、競合的検定系を用いるかにより異なるのは当然である。前者の例では、分析対象の濃度の上昇に従ってより多くの量の標識リガンドが分析対象に結合するため標識リガンド担持第２結合相手のシグナルは減少するのに対し、競合的結合検定では、第２の結合相手と反応することのできる遊離の標識リガンドの量は分析対象の濃度の上昇に従って増大する。本発明を限定する意図の無い添付図面において、図１はサンドイッチ検定系の蛍光強度に対する分析対象濃度の対数プロットによる代表的な二重標準曲線を示しており、この例では、標識リガンドは分析対象に対する親和性を有する蛍光標識を有しており、第１および第２の結合相手は分析対象および標識リガンドに対してそれぞれ親和性を有し、例えば異なる粒径を有することにより判別することのできるような、第１および第２の粒子型ｐ１およびｐ２を有しており、そして、検出はフローサイトメトリーにより行う。図２Ａは、実施例に記載したとおり実験的に得られた二重標準曲線を示すものであり、そして図２Ｂは２つの曲線の二重精度特性を示すものである。図１から明らかなとおり、特定の蛍光強度を単一の分析対象濃度値に明確に対応させることができないように、粒子型ｐ１に対する標準曲線は通常のフック作用を示している。しかしながら、このようなｐ１蛍光強度をｐ２型粒子に対する相当する強度と共に測定した場合、２つの値の組み合わせにより広範囲の作業範囲に亙り、分析対象の濃度を明らかに測定することが可能になる。即ち、米国特許出願4595661号および474 3542号のようにフック作用を延期したり回避したりすることを目的とした従来の方法とは対照的に、本発明の方法はその動的範囲を拡大する作用を現実的に利用している。 WO-A-8911101号の方法を用いた場合のように、二重標準検量線を使用することにより、特定の試料について２つの蛍光強度値を一対として二重曲線に適合させなければならないため、異常な、または不正確な結果を容易に検出できるのである。分析対象濃度Ｘの不偏推定値は、ｒ₁とｒ₂が一対として二重標準曲線に適合しなければならない事を考慮しながら、標準曲線の各々から得た観察可能なｒ₁ およびｒ₂により決定される２つの濃度ｘ₁およびｘ₂の直線的組み合わせとして得てよい。濃度のより進歩した推定は、関係式Ｘ＝ａｘ₁＋(１−ａ)ｘ₂から求めてよく、この式では、値ａは得られるＸの変動が最小になるような統計学的理論を用いて求められる。第１および第２の結合相手に対する投入濃度、およびこれらにより示される親和性の程度のようなパラメーターは、図１に示すとおり、ｐ１曲線が方向を変えるような領域でｐ２曲線が急激な傾きを示すように選択し、これにより、ｐ１曲線が最大の変動を示すような領域でｐ２曲線が精度を有するようにする。本発明の方法における第２の結合相手は１つの意味において、分析対象／第１結合相手／標識リガンド系から生じる定量的に測定できる形体の「洗浄除去」未結合標識リガンドとみなす事ができる。これが好都合である点は、標識リガンドの関与する非特異的結合が減少するか、または、むしろ実質的に完全に排除され、これにより、低分析対象濃度における検定系の感度に関する制約を最小限にしたり、排除できる点である。本発明の方法はまたWO-A-8911101号と比較した場合、同じ特異性を有するが異なる親和性を有するような結合相手の対を用いる必要が無いという点で有利であり、特定の分析対象に対してこのような対を得る事は困難である。第１の結合相手がコーティングされた粒子である場合は、これらは結合相手を比較的大量に有することにより、粒子当たりの結合の量を最大限にし、これにより低分析対象濃度における方法の感度を向上させるのが好都合である。第２の結合相手は、残存未結合標識リガンドの結合を急速に行うためには、好ましくは標識リガンドに対して過剰量で用いる。第２の結合相手を実質的に過剰量で使用することは、この結合が起こる速度を大きくする傾向を有し、従って、より短い全体的検定時間（例えば１〜２）が望まれる場合は特に好ましい。固体支持体系上の第２の結合相手の搭載量は厳密ではなく、特定の検定系に適するように選択する。本発明の方法で用いるインキュベーション時間は、前記したとおり再現性の観点から特定の系に対して標準化することが望ましいものの、厳密ではない。一連の連続反応段階を実施する場合は、例えば段階当たり５分〜２時間の個々のインキュベーション時間を用いてよい。判別可能な粒子の種類を用いる本発明の方法の実施態様は、所望により、その標的分析対象に対する特異的親和性を各々有する標識リガンドＬ、L′、L″、… の適切な量、その標的分析対象に対して特異的な親和性を各々有する第１の結合相手を担持した第１の粒子型ｐ１、ｐ１′ 、ｐ１″…のセット、および、相当する標識リガンドに対して特異的な親和性を各々有する第２の結合相手を担持した第２の粒子型ｐ２、ｐ２′、ｐ２″…のセットを用いた複数の分析対象Ａ、Ａ′、Ａ″、…の同時サンドイッチ検定のために用いてよいが、ただしその際、すべての個々の粒子型ｐ１、ｐ１′、ｐ１″… 、ｐ２、ｐ２′、ｐ２″…は、例えばフローサイトメトリーによりここに個々に判別できるものとする。その後、種々のｐ１／ｐ２、ｐ１′／ｐ２′、ｐ１″／ｐ２″…のような粒子対の組み合わせに対する適切な数の二重標準検量線と照合する。判別可能な粒子型を用いた本発明の方法の実施態様において、第２の結合相手は、所望により２種類の判別可能な型の粒子とカップリングさせてよく、第１の型は好ましくは第２の結合相手を比較的大量に搭載しており、比較的小量で用いることにより、最大の感度を達成し、そして、第２の型をその後過剰量で（例えば１時間後に）添加して平衡の急速な確立を容易にしてよい。次に、ｐ１粒子および２種類のｐ２粒子に関して得られたシグナルを三重標準曲線と対照させることにより、二重標準曲線の場合よりもむしろ高い精度で分析対象の濃度を測定することができる。あるいは、この実施態様においては、２つの型の第２の結合相手は２つの異なる形態の結合相手を有し、１つは分析対象特異的な部位で標識リガンドに結合し、もう１つはこの部位以外で結合することにより、分析対象に対するその結合とは無関係に標識リガンドに結合することになる。フローサイトメトリー検出を用いる本発明の検定においては一般的に、従来のフローサイトメトリーが粒子により散乱した光の量に基づいて粒径を測定できることから、種々の粒子の型が粒径により好都合に判別される。異なる組成、反応性表面基等を有する、広範囲の種類の単一粒径の粒子が、例えばDy no Particles，Lillestrom,Norwayから市販されており、適切なセットのこのような粒子を本発明で用いてよい。このような粒子は高度な単一粒径を有しており、例えば１つの試料集団について散乱光測定において１％以下の相対的標準偏差を示すため、かなりの数のこのような粒子型を混合し、フローサイトメトリー散乱光ヒストグラムで非重複集団として容易に同定してよい。コールター原理を代替として、または付加的に用いることにより、粒径の差から生じる電気抵抗の差により粒子を判別できる。上記したとおり、複数の分析対象を同時に検定する際には、全ての独立した粒子型を例えばフローサイトメトリーにより個別に判別することが必要である。即ち、異なる特異性を有する種々の標識リガンドが全て同じ標識成分を有する場合は、種々の対であるｐ１／ｐ２、ｐ１′／ｐ２′、ｐ１″／ｐ２″…の各々の個々の粒子型が検出可能な粒子特性により他の粒子型から判別されることが必要である。一方、各分析対象に対して特異的な異なる標識を有するリガンドを用いる場合は、標識に由来するシグナル、例えば蛍光シグナルの定性的差の観点から、種々の対の粒子型を他のものと判別することが可能になり、これにより、同じ大きさの粒子を、所望により、全てのｐ１、ｐ１′、ｐ１″…の粒子型に対して用い、異なるセットの同じ大きさの粒子を全てのｐ２、ｐ２′、ｐ２″…の粒子型に対して用いてよい。本発明の方法で用いる好ましい標識物質は、蛍光測定フローサイトメトリーで一般的に用いられているもののような蛍光物質を包含し、例えば、フルオレセインまたはフイコエリスリン、または遅延経時分解蛍光のための蛍光色素を使用してよい。このような標識物質は、所望により、例えばSaunders等がClin．Chem． 31，2020に記載したもののような、0.1ミクロンの直径を有するような、蛍光物質染色微細球の形体であってよい。光学的分析シグナルを得ることのできるその他の標識には、コロイド状金粒子のゾルのような金属系が包含される。例えば金属（例えば金）粒子のような電気抵抗の明らかな差を与えることのできるような標識物質を用いてコールター原理により検出されるシグナルを得てもよく、その後、光散乱のような粒径依存性の特性により、粒子型の差を測定してよい。既に記載したとおり、通常は所定の量で用いられる標識リガンドは、競合的結合検定の場合は結合相手に対して、あるいは、サンドイッチ検定の場合は分析対象に対して、親和性を有さなければならない。後者の操作の場合は、本発明の好ましい特性が示され、標識リガンドおよび結合相手は分析対象上の異なる結合部位（例えばエピトープ）に好ましく結合し、結合相手が特異的である結合部位ａおよび標識リガンドが特異的である結合部位ｂを有するものとして好都合に分析対象を捕らえてよい。本発明の方法によるサンドイッチ検定では第２の結合相手は、標識リガンドに対する必要な親和性を有するという理由から、分析対象の固体支持形態を好都合に有してよい。例えば、所望により、結合を強化するために固定剤またはその他の交叉結合剤を用いながら、第１の結合相手で固体支持体をまずコーティングし、次に、それに分析対象をカップリングさせるのが好都合であり、このような方法においては、分析対象のｂ結合部位は標識リガンドと反応することができるように未使用のままとなる。あるいは、サンドイッチ免疫検定系における第２の結合相手は標識リガンドが親和性を有するような結合部位を模倣した抗イディオタイプ抗体であってよい。標識リガンドが第１の結合相手に対する親和性を有している競合的検定においては、第２の結合相手は、例えば、標識リガンドの標識部分に対する親和性を有する物質の固体支持形態を有してよい。このような物質の一例は、抗FITC抗体である。本発明の方法で用いるための固体支持体系のコーティングは例えば当該分野で知られた方法を用いて行うことができる。即ち、例えば、免疫検定操作における使用のために抗体で単一粒径粒子系をコーティングするための代表的な方法は、 Frengen等のClin．Chem．39，(1993)，pp.2174-2181およびその参考文献、および、Lindmo等のJ．Immunol，Meth．126(1990)，pp.183-189に記載されている。本発明の方法は広範囲の分析対象の検定に用いてよいが、特定の分析対象に対する唯一の限定条件は、適切な固体支持体系の表面にカップリングすることのできる、そのための特異的な結合相手の存在である。分析対象と結合相手の対は、例えば、以下に示す組み合わせの何れかから選択してよく、それらにおいては、対のどちらの片方が分析対象で他方が結合相手になってもよい。（ａ）抗原および特異的抗体；（ｂ）ホルモンおよびホルモン受容体；（ｃ）ハプテンおよび抗ハプテン；（ｄ）ポリヌクレオチドおよび相補ポリヌクレオチド；（ｅ）ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド結合蛋白；（ｆ）ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；（ｇ）酵素および酵素コファクター；（ｈ）レクチンおよび特異的炭水化物。上記した対の１つに所属する構成要員、例えばビオチンまたはハプテンは、所望により何らかの別の分子に連結し、次に得られた「二次的」分析対象を検定することにより間接的に「一次的」分子の濃度を測定してよい。抗原は本発明の方法で用いるための好ましい分析対象の１つのグループであり、それに対する好ましい結合相手はモノクローナル抗体である。本発明の更に別の特徴によれば、下記：（ｉ）分析対象に対する親和性を有する第１の結合相手を担持するかまたは担持するように適合させられた第１の固体支持体系；（ii）分析対象または上記第１の結合相手に対する親和性を有する標識リガンド；および、（iii）上記標識リガンドに対する親和性を有する第２の結合相手を担持するかまたは担持するように適合させられた第２の固体支持体系を含有し、固体支持体系の２種類の形態は検定操作において各形態に結合することになる標識リガンドの量が独立して測定されるようになっている試料中の分析対象の検定に用いるためのキットが提供される。固体支持体系の２つの形態は、好都合には、例えば、フローサイトメトリーのような方法で判別されるような異なる大きさを有する単分散粒子のセットを有する。このような粒子は選択された結合相手でコーティングするか、または、その表面に吸収部位または反応性の基を有することにより、選択された結合相手の吸収またはそれへのカップリングを可能にするのである。本発明のキットは、試料中の分析対象複数の同時検定が行えるように、所望により、固体支持体系の複数の対、好ましくは異なる型の単分散粒子を含んでいてよい。以下に記載する非限定的な実施例は本発明を説明するためのものである。実施例被験分析対象は未損傷のCalbiochem（La Jolla，CA）より入手したヒト絨毛膜ゴナドトロピン(hCG)とした(カタログ番号No.869031)。これより一連の濃度既知の標準溶液を検定緩衝液（後述）で連続希釈することにより調製した。固体支持体結合相手の２種類の形態は、表面エポキシ基を有し、それぞれ直径 6.5および7.5μｍの大孔性アクリレート粒子（SINTEF開発、Trondheim，Norway 、以下それぞれMP6.5およびMP7.5と略記する）とした。MP6.5は、Frengen等（Cl in．Chem．39(1993)，pp.2174-2181）に記載の方法と同様の方法で、Norwegian Radium Hospitalの確立したhCGのα−サブユニットのエピトープに親和性を有するマウスモノクローナル抗体Ｅ26で、150μｇＥ26／mg粒子でコーティングした。MP7.5は同様の方法でCalbiochemから入手した精製hCG β−サブユニット（カタログ番号No.969126）で30μｇ hCG β−サブユニット／mg粒子でコーティングした。標識リガンドはNorwegian Radium Hospitalの確立したhCGのβ−サブユニットのエピトープに対する親和性を有するマウスモノクローナル抗体Ｅ27から調製した。これを、ビオチンの抗体に対するモル比10：１でビオチンと反応させ、得られたビオチニル化Ｅ26（1.9mg／ｌ濃度）をストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（Becton Dickinson）と６：１v/vの比で混合した。操作において用いた検定緩衝液はリットル当たり10ｇウシ血清アルブミン、１ｇナトリウムアジドおよび１mlツイーン20を含有するリン酸塩緩衝食塩水とした。検定試薬試験管のシリーズ各々において、標識抗体20μｌおよび検定緩衝液50 μｌを検定緩衝液中10μｌ hCGと混合した。最低15分間インキュベートした後、粒子MP6.5およびMP7.5の検定緩衝液中の懸濁液20μｌを、共に濃度310mg／ｌで添加した。混合物を１〜1.5時間水平回転振盪器上で室温でインキュベートした後、各試験管の内容物小量を予め洗浄することなくフローサイトメーターで測定した。比較のためにMP7.5粒子を用いずに同様の検定を行った。フローサイトメトリー蛍光および光散乱測定は、75ワットの水銀キセノン灯の装着されたSkatron Argusフローサイトメーターを用いて実施した。使用したフィルターブロックは波長範囲520〜560nmで励起、590〜640nmで蛍光測定を行った。粒子に関わる光散乱および蛍光シグナルは同時に測定し、相関２パラメーターヒストグラムとして登録した。光散乱ヒストグラムの適切なウインドーをゲートとすることにより、種々の対象粒子が生じる蛍光の強度を測定した。対数蛍光ヒストグラムのメジアンチャンネルを粒子関連蛍光の尺度として記録した。 MP6.5およびMP7.5粒子の同時に測定した標準曲線を、それぞれ○および□で添付図面中の図２Ａに記載した。MP6.5粒子のみが存在する場合の検定結果の標準曲線はアスタリスクで示した。結果によれば、２つの実験におけるMP6.5粒子の標準曲線は緊密に重複していたが、ただし、低い分析対象濃度では、MP7.5粒子が含まれる場合に、僅かに低下した非特異的結合により僅かな差異が有った。図２Ｂに示すMP6.5およびMP7.5粒子の精密プロフィールは変動計数(CV)： CV＝σ_Ri ^*〔δ(1nD)／δR_i〕^*100〔％〕〔式中R_iは対数蛍光強度のチャンネル数として現した粒子（ｉ）の測定された応答、σ_Riは本実験では１チャンネルと推定されたR_iにおける相当する標準偏差、そして、Ｄは用量(即ちhCG濃度)〕として現した。 MP6.5およびMP7.5粒子の精密プロフィールは、標準曲線の何れかまたは両方が約20〜３×10⁶ IU／ｌ hCGの濃度範囲全体に亙りCV＜10％であることを示している。同じ応答がhCGの高濃度および低濃度で得られる原因となったMP6.5の標準曲線のあいまいさは、記載したサンドイッチ検定の実施態様において単調に減少する傾きを有する標準曲線が認められるMP7.5粒子から得られる別の情報により排除できる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月８日【補正内容】実施例被験分析対象は未損傷のCalbiochem（La Jolla，CA）より入手したヒト絨毛膜ゴナドトロピン(hCG)とした(カタログ番号No.869031)。これより一連の濃度既知の標準溶液を検定緩衝液（後述）で連続希釈することにより調製した。固体支持体結合相手の２種類の形態は、表面エポキシ基を有し、それぞれ直径 6.5および7.5μｍの大孔性アクリレート粒子（SINTEF開発、Trondheim，Norway 、以下それぞれMP6.5およびMP7.5と略記する）とした。MP6.5は、Frengen等（Cl in．Chem．39(1993)，pp.2174-2181）に記載の方法と同様の方法で、Norwegian Radium Hospitalの確立したhCGのα−サブユニットのエピトープに親和性を有するマウスモノクローナル抗体Ｅ26で、150μｇＥ26／mg粒子でコーティングした。MP7.5は同様の方法でCalbiochemから入手した精製hCG β−サブユニット（カタログ番号No.969126）で30μｇhCG β−サブユニット／mg粒子でコーティングした。標識リガンドはNorwegian Radium Hospitalの確立したhCGのβ−サブユニットのエピトープに対する親和性を有するマウスモノクローナル抗体Ｅ27から調製した。これを、ビオチンの抗体に対するモル比10：１でビオチンと反応させ、得られたビオチニル化Ｅ27（1.9mg／ｌ濃度）をストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（Becton Dickinson）と６：１v/vの比で混合した。操作において用いた検定緩衝液はリットル当たり10ｇウシ血清アルブミン、１ｇナトリウムアジドおよび１mlツイーン20を含有するリン酸塩緩衝食塩水とした。検定試薬試験管のシリーズ各々において、標識抗体20μｌおよび検定緩衝液50μｌを検定緩衝液中10μｌ hCGと混合した。最低15分間インキュベートした後、粒子MP6.5およびMP7.5の検定緩衝液中の懸濁液20μｌを、共に濃度 310mg／ｌで添加した。混合物を１〜1.5時間水平回転振盪器上で室温でインキュベートした後、各試験管の内容物小量を予め洗浄することなくフローサイトメーターで測定した。比較のためにMP7.5粒子を用いずに同様の検定を行った。請求の範囲１．試料を下記： (ｉ) 分析対象に対する親和性を有する第１の結合相手、および、 (ii)(ａ) 分析対象に対する親和性を有する標識リガンド、および、 (iii)(ａ) 標識リガンドに対する親和性を有する第２の結合相手、または、 (ii)(ｂ) 分析対象の標識形態を有するリガンド、および、 (iii)(ｂ) 標識リガンドの標識に対する親和性を有する第２の結合相手のいずれかと反応させることを包含し、上記第１および第２の結合相手は独立して測定できる固体支持形態にあり、これにより、得られる標識リガンド担持第１および第２結合相手に関わるシグナルが独立して測定され、そして、これから分析対象の濃度を二重標準検量線を参照することにより求めるような試料中の分析対象を検定するための方法。２．第１および第２の結合相手のための固体支持体が単一サイズ化粒子の２つの判別可能な型を有する請求項１記載の方法。３．単一サイズ化粒子の２つの型が大きさに基づいて判別できるような請求項２記載の方法。４．単一サイズ化粒子の２つの型がフローサイトメトリーで検出される請求項２または３記載の方法。５．第２の結合相手が標識リガンドに対して過剰量で用いられる前記請求項のいずれかに記載の方法。６．標識リガンドの適切な数および判別可能な粒子型の対のセットを用いて分析対象複数を同時に検定する請求項２〜５のいずれかに記載の方法。７．第２の結合相手のための固体支持体が単一サイズ化粒子の２つの判別可能な型を有し、粒子連結第１結合相手および粒子連結第２結合相手の２つの型に関して測定した結果を三重標準検量線に照合させるような請求項２〜６の何れかに記載の方法。８．標識リガンドの標識成分が蛍光物質である前記請求項の何れかに記載の方法。９．分析対象が抗原であり、結合相手がモノクローナル抗体である前記請求項のいずれかに記載の方法。 10．キットが下記： (ｉ) 分析対象に対する親和性を有する第１の結合相手を担持するかまたは担持するように適合させられた第１の固体支持体系；および、 (ii)(ａ) 分析対象に対する親和性を有する標識リガンド、および、 (iii)(ａ) 上記標識リガンドに対する親和性を有する第２の結合相手を担持するかまたは担持するように適合させられた第２の固体支持体系、または、 (ii)(ｂ) 分析対象の標識形態を有する標識リガンド、および、 (iii)(ｂ) 上記標識リガンドの標識に対する親和性を有する第２の結合相手を担持するかまたは担持するように適合させられた第２の固体支持体系のいずれかを含み、固体支持体系の２種類の形態は検定操作において各形態に結合することになる標識リガンドの量が独立して測定されるようになっている試料中の分析対象の検定に用いるためのキット。 11．固体支持体系の２つの形態が判別可能な単一サイズ化粒子のセットを有する請求項10記載のキット。 12．単一サイズ化粒子のセットが大きさにより判別できる請求項11記載のキット。 13．固体支持体系の対複数を含む請求項10〜12の何れかに記載のキット。 14．第２の固体支持体系が単一サイズ化粒子の２つの判別可能な型を有する請求項10〜13のいずれかに記載のキット。

Claims

【特許請求の範囲】１．分析対象に対する親和性を有する第１の結合相手、分析対象または第１の結合相手に対する親和性を有する標準リガンド、および、標準リガンドに対する親和性を有する第２の結合相手と試料を反応させることを包含し、上記第１および第２の結合相手は独立して測定することのできる固体支持形態にあり、これにより、形成される標識されたリガンドを担持した第１および第２の結合相手に関するシグナルが独立して測定され、これを用いて二重標準検量線を参照しながら分析対象の濃度が求められるような、試料中の分析対象を検定するための方法。２．第１および第２の結合相手のための固体支持体が単分散粒子の２つの判別可能な型を有する請求項１記載の方法。３．単分散粒子の２つの型が大きさに基づいて判別できるような請求項２記載の方法。４．単分散粒子の２つの型がフローサイトメトリーで検出される請求項２または３記載の方法。５．第２の結合相手が標識リガンドに対して過剰量で用いられる前記請求項のいずれかに記載の方法。６．標識リガンドの適切な数および判別可能な粒子型の対のセットを用いて分析対象複数を同時に検定する請求項２〜５のいずれかに記載の方法。７．第２の結合相手のための固体支持体が単分散粒子の２つの判別可能な型を有し、粒子連結第１結合相手および粒子連結第２結合相手の２つの型に関して測定した結果を三重標準検量線に照合させるような請求項２〜６の何れかに記載の方法。８．標識リガンドの標識成分が蛍光物質である前記請求項の何れかに記載の方法。９．分析対象が抗原であり、結合相手がモノクローナル抗体である前記請求項のいずれかに記載の方法。 10．キットが下記：（ｉ）分析対象に対する親和性を有する第１の結合相手を担持するかまたは担持するように適合させられた第１の固体支持体系；（ii）分析対象または上記第１の結合相手に対する親和性を有する標識リガンド；および、（iii）上記標識リガンドに対する親和性を有する第２の結合相手を担持するかまたは担持するように適合させられた第２の固体支持体系を含有し、固体支持体系の２種類の形態は検定操作において各形態に結合することになる標識リガンドの量が独立して測定されるようになっている試料中の分析対象の検定に用いるためのキット。 11．固体支持体系の２つの形態が判別可能な単分散粒子のセットを有する請求項 10記載のキット。 12．単分散粒子のセットが大きさにより判別できる請求項11記載のキット。 13．固体支持体系の対複数を含む請求項10〜12の何れかに記載のキット。 14．第２の固体支持体系が単分散粒子の２つの判別可能な型を有する請求項10〜13のいずれかに記載のキット。