FI89493C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktiva, fosforhaltiga inhibitorer av hmg-coa-reduktas och vid foerfarandet anvaendbar ny mellanprodukt - Google Patents

Description

1 89493

Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten, fosforipitoisten HMG-CoA-reduktaasi-inhibiittoreiden valmistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen uusi välituote 5 Tämä patenttihakemus on osaksi jatkoa US-patentti- hakemukseen 109 680 (jätetty 19.10.1987) ja joka on osaksi jatkoa US-patenttihakemukseen 053 281 (jätetty 22.5.1987).

Tämä keksintö koskee menetelmää uusien fosforia sisältävien yhdisteiden valmistamiseksi, jotka alentavat 3-10 hydroksi-3-metyyliglutaryyli-koentsyymi A -reduktaasin aktiivisuutta ja ovat siten käyttökelpoisia kolesterolin biosynteesin inhiboinnissa, sekä menetelmässä käytettäviä uusia välituotteita.

F. M. Singer et ai., Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 15 102 (1959) 370, ja F. H. Hulcher, Arch. Biochem. Biophys.

146 (1971) 422, ovat esittäneet eräitä mevalonaattijohdannaisia, jotka inhiboivat kolesterolin biosynteesiä.

Endo et ai. ovat esittäneet US-patenttijulkaisuissa 4 049 495, 4 137 322 ja 3 983 140 fermentointituotteen, 20 joka on tehokas kolesterolin biosynteesin inhiboinnissa.

. . Tätä tuotetta nimitetään kompaktiiniksi ja sillä on Brown et ai.'n (J. Chem. Soc. Perkin I, 1976, 1 165) mukaan kompleksinen mevalonolaktonirakenne.

GB-patenttijulkaisussa 1 586 152 on esitetty ryhmä • · 25 synteettisiä yhdisteitä, joilla on kaava

CHTV

; 30 R2 e ;··; *4

2 8949J

jossa E tarkoittaa suoraa sidosta, C^-alkyleenisiltaa tai vinyleenisiltaa ja eri R:t tarkoittavat erilaisia substi-tuentteja. Kyseisessä GB-patenttijulkaisussa ilmoitettu aktiivisuus on alle 1 % kompaktiinin aktiivisuudesta.

5 US-patenttijulkaisussa 4 375 475 (Willard et ai.) on esitetty veren kolesteroli- ja lipidipitoisuutta alentavia yhdisteitä, joilla on rakenne “'to'

E

L

15 Ηιτϋτ r2 4 R3 jossa A on H tai metyyli, E on suora sidos, -CH2-, 20 -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2- tai -CH=CH-, ja Rx, R2 ja R3 ovat kukin H, halogeeni, C1.4-alkyyli, Cx_4-halogeenialkyyli, fe-nyyli, halogeeni-, C1.4-alkoksi-, C2.8-alkanoyylioksi-, Cx_4-alkyyli- tai Cx_4-halogeenialkyylisubstituoitu fenyyli, tai 0R4, jossa R4 on H, C2_8-alkanoyyli, bentsoyyli, fenyyli, 25 halogeeni fenyyli, fenyyli-Cx_3-alkyyli, C1.9-alkyyli, sinna-myyli, Cx_4-halogeenialkyyli, allyyli, sykloalkyyli-C1.3-al-kyyli, adamantyyli-Cx_3-alkyyli tai (substituoitu fenyyli)-Cx_3-alkyyli, jossa kukin substituenteista voi olla halogeeni, Cj.4-alkoksi, Cx.4-alkyyli tai C1.4-halogeenialkyyli; 30 sekä vastaavia dihydroksihappoja, joita syntyy avattaessa laktonirengas hydrolyyttisesti, ja mainittujen happojen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ja Cx_3-al-kyyli-, fenyyli- ja (dimetyyliamino- tai asetyyliaminosub-stituoitu)-Cj.j-alkyyliestereitä; kaikkien mainittujen yh-35 disteiden ollessa enantiomeereja, joilla on edellä esitetyssä kaavassa näkyvässä trans-rasemaatin tetrahydropyraa- I; i 3 89493 niosassa 4R-konfiguraatio.

Patenttihakemuksessa WO 84/02131 (PCT/EP83/00308), joka on jätetty Sandoz AG:n nimissä ja joka perustuu US-patenttihakemukseen 443 668 (jätetty 22.11.1982) ja US-5 patenttihakemukseen 548 850 (jätetty 4.11.1983), on esi tetty mevalonolaktonin kanssa analogisia heterosyklisiä yhdisteitä ja niiden johdannaisia, joilla on kaava

R K

\2 I

10 Vi l ΐΏζν*-* *= ^ 15 // J^--R4 jossa toinen substituenteista R ja R0 on \ R* jossa R4 on vety, C^-alkyyli, Cj^-alkoksi (t-butoksia lukuun 20 ottamatta), trfluorimetyyli, fluori, kloori, fenoksi tai bentsyylioksi, R5 on vety, C1.3-alkoksi, trifluorimetyyli, fluori, kloori, .‘I fenoksi tai bentsyylioksi ja R5a on vety, C^-alkyyli, C1.2-alkoksi, fluori tai kloori, 25 sillä edellytyksellä, että R5 ja R5a ovat molemmat vetyjä R4:n ollessa vety, R5a on vety R5:n ollessa vety, enintään ·.·.' toinen substituenteista R4 ja R5 on trifluorimetyyli, enin tään toinen substituenteista R4 ja R5 on fenoksi ja enintään toinen subsituenteista R4 ja R5 on bentsyylioksi; 30 ja toinen primaarinen tai sekundaarinen C^-alkyyli, C3_6-sykloalkyyli tai fenyyli-(CH2)m-, jossa m on 1, 2 tai 3, R2 on vety, C1.4-alkyyli, C3.6-sykloalkyyli, C1.4-alkyyli (t-butoksia lukuun ottamatta), trifluorimetyyli, fluori, kloori, fenoksi tai bentsyylioksi, ja : 35 R3 on vety, Cj.j-alkyyli, C^-alkoksi, trifluorimetyyli, fluori, kloori, fenoksi tai bentsyylioksi, sillä edelly- 4 89493 tyksellä, että R3 on vety R2:n ollessa vety, enintään toinen substituenteista R2 ja R3 on trifluorimetyyli, enintään toinen substituenteista R2 ja R3 on fenoksi ja enintään toinen substituenteista R2 ja R3 on bentsyylioksi, 5 X on -(CH2 )n-, jossa n on 0, 1, 2 tai 3, tai -CH=CH- ja R6 5 4 3| 2 1

Z on -CH-CH2--C—CH2-C00H

10 OH OH

jossa R6 on vety tai C10-alkyyli; ja jotka ovat vapaan hapon muodossa, sen fysiologisissa olosuhteissa hydrolysoituvan ja fysiologisesti hy-15 väksyttävän esterin tai 6-laktonin muodossa tai suolan muodossa· GB-patenttijulkaisussa 2 162 179A on esitetty meva-lonolaktonin naftyylianalogeja, jotka ovat käyttökelpoisia kolesterolin biosynteesin inhibiittoreina ja joilla on ra-20 kenne 25 2

Ri jossa Rx on C1.3-alkyyli ja Z on ryhmä, joka vastaa kaavaa 30 Z1 tai Z2:

HV

-CHCH- CHCH0 C00R-

4 2i 2 ' .· I I

OH OH 0 35 | <Z1> <Z2» li ! 5 89493 jossa ensin mainitussa kaavassa R7 on vety, hydrolysoituva esteriryhmä tai kationi.

EP-julkaisussa 164 698A on esitetty veren korkeata kolesterolitasoa alentavina aineina käyttökelpoisten lak-5 tönien valmistus käsittelemällä amidi orgaanisella sulfo-nyylihalogenidilla R5S02X ja poistamalla sen jälkeen suo-j aryhmä Pr: R1 R1 10 Pr0^JfR4 Η°Ί^° R2 ! R2 jossa 15 X on halogeeni.

Pr on karbinolin suojaryhmä,

Rl on H tai CH3, R'1 ja R4 ovat kumpikin itsenäisesti H, C, ,-alkyyli tai fe-nyyli-Cj.^-alkyyli, jossa fenyyli on mahdollisesti C^-al-20 kyyli-, C^j-alkoksi- tai halogeenisubstituoitu, R2 on ryhmä, joka vastaa kaavaa A tai B: 0

I J

’ 25 3 R' CH ' J

1 H | ? g ΑιΑ/Π] r8 (A) lg (B)

. · 30 R

jossa Q on R6-C- tai R6-CH- ' : / 0H3 jossa R6 on H tai OH; : 35 R on H tai CH3; b, c ja d ovat mahdollisia kaksoissidoksia; 6 89493 R7 on fenyyli tai bentsyylioksi, renkaan mahdollisesti ollessa kummassakin tapauksessa C^-alkyyli- tai halogeeni-substituoitu, ja R8 ja R9 ovat kumpikin itsenäisesti C^-alkyyli tai halo-5 geeni; ja R5 on C^j-alkyyli, fenyyli tai mono- tai di( C^-alkyyli )fe-nyyli.

DE-hakemusjulkaisussa 3 525 256 (Paul Leroy Anderson) on esitetty mevalonolaktonin naftyylianalogeja, joil-10 la on rakenne

HAr^Y0H

_ 1 «S sz -CHCH-CHCH-CO-R7 '' I

15 r^YVC A 2 A 2 °V

I Π I H OH OH l

Q

Q' joissa kaavoissa R1 on alkyyli, Z on ryhmä, joka vastaa 20 kaavaa Q tai Q1 ja R7 on H tai hydrolysoituva esteriryhmä; ja jotka ovat käyttökelpoisia kolesterolin biosynteesin inhibiittoreina sekä ateroskleroosin hoidossa.

Patenttihakemuksessa W084/02903, joka on jätetty Sandoz AG:n nimissä ja joka perustuu US-patenttihakemuk-25 seen 460 600 (jätetty 24.1.1983), on esitetty mevalonolak tonin kanssa analogisia ja veren kolesterolitasoa alentavina aineina käyttökelpoisia yhdisteitä, joilla on rakenne - :·£·£'· R1 R4 jossa molemmat R0:t muodostavat yhdessä ryhmän, jolla on 35 kaava 7 89493 8 7 6 5" — C = C - C = C— tai - (CH? Κ

ι I J

r3 5 joissa R2 on vety, C^-alkyyli, C1.4-alkoksi (t-butoksia lukuun ottamatta), trifluorimetyyli, fluori, kloori, fenoksi tai bentsyylioksi, ja R3 on vety, C1.3-alkoksi, trif luorimetyyli, fluori, kloori, 10 fenoksi tai bentsyylioksi, sillä edellytyksellä, että enintään toinen substituenteista R2 ja R3 on trifluorime-tyyli, enintään toinen substituenteista R2 ja R3 on fenoksi ja enintään toinen substituenteista R2 ja R3 on bentsyylioksi ; 15 R3 on vety, C^-alkyyli, fluori, kloori tai bentsyylioksi, R4 on vety, Cj.4-alkyyli, C^-alkoksi (t-butoksia lukuun ottamatta), trifluorimetyyli, fluori, kloori, fenoksi tai bentsyylioksi, R5 on vety, C;.3-alkyyli, Cj^-alkoksi, trif luorimetyyli, 20 fluori, kloori, fenoksi tai bentsyylioksi, sillä edellytyksellä, että enintään toinen substituenteista R4 ja R5 on fenoksi ja enintään toinen substituenteista R4 ja Rs on bentsyylioksi, R5a on vety, C^-alkyyli, Cj.j-alkoksi, fluori tai kloori, 25 Ηχ /(CH2)q

X on -(CH2) - tai C=C

/ X (CH2 )q H

joissa 30 n on 0, 1, 2 tai 3 ja molemmat q:t ovat 0 tai toinen on 0 ja toinen 1, ja R6 54 3| 2 1

35 7. on -CH-CH,—C—CH2-COOH

OH OH

8 6 9 4 y 3 jossa R6 on vety tai Cj.j-alkyyli, sillä yleisellä edellytyksellä, että -X-Z ja R4-substituentin sisältävä fenyyli-ryhmä sijaitsevat orto-asemassa toisiinsa nähden; ja jotka ovat vapaan hapon muodossa, sen fysiologi-5 sissa olosuhteissa hydrolysoituvan ja fysiologisesti hyväksyttävän esterin tai δ-laktonin muodossa tai suolan muodossa.

EP-hakemusjulkaisussa 127 848A (Merck & Co., Inc.) on esitetty 3-hydroksi-5-tia- -aryylialkaanihappojen joh-10 dannaisia, joilla on rakennekaava HO 0 I ox 1 C ^S(O) L 5 I n

E

z jossa Z on 20 A < λ /

V

25 R5 joissa R1, R2 ja R3 ovat kukin itsenäisesti esimerkiksi vety, kloori, bromi, fluori, Cj-alkyyli, fenyyli, substituoi-tu fenyyli tai 0R7, jossa R7 on esimerkiksi vety, C2_8-alka-30 noyyli, bentsoyyli, fenyyli, substituoitu fenyyli, C^-al-kyyli, sinnamyyli, C1.4-halogeenialkyyli, allyyli, sykloal-kyyli-C,_3-alkyyli, adamantyyli-C1.3-alkyyli tai fenyyli-Cj.^-alkyyli, ja R4, R5 ja R6 ovat kukin itsenäisesti vety, kloori, bromi, fluori tai C,_,-alkyyli; 35 n on 0, 1 tai 2, i 9 39493 E on -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2- tai -CH2-CH = CH- ja X on esimerkiksi vety, C:_3-alkyyli tai alkalimetallikationi tai ammonium.

5 Kyseisillä yhdisteillä on veren korkeaa kolestero litasoa alentava vaikutus, koska ne kykenevät inhiboimaan 3-hydroksi-3-metyyliglutaryyli-koentsyymi A (HMG-Coa ) -reduktaasia, ja sienten vastainen vaikutus.

FR-patenttihakemuksessa 2 956 393A (Sanofi SA; jä-10 tetty 1.4.1986) on esitetty 3-karboksi-2-hydroksipropaani-fosfonihapon johdannaisia suolat mukaan luettuina, joilla yhdisteillä on kaava R2 0 or3

: ii X

15 R.OOC-CHo-C-CPh-P

I \ OH N OR4 jossa R: ja R2 ovat kumpikin itsenäisesti H, alempi alkyyli tai mahdollisesti substituoitu aryyli tai aralkyyli; 20 ja jotka ovat käyttökelpoisia veren lipiditasoa alentavina aineina.

Näiden yhdisteiden ilmoitetaan alentavan kolesterolin, triglyseridien ja fosfolipidien tasoa enemmän kuin meglutonin.

25 EP-hakemusjulkaisussa 142 146A (Merck & Co., Inc.) on esitetty meviloniinin kaltaisia yhdisteitä, joiden rakennekaava on

«0 O

30 'ΓΎκ1 \^0

E

i

Z

35 jossa 10 89493 R1 on esimerkiksi vety tai C1.4-alkyyli, E on -CH2-CH2-, -CH=CH- tai -(CH2)r-, ja Z on ryhmä 0 5 1) R7-'^^ 10 jossa X on -0- tai -NR9-, jossa R9 on vety tai C1_3-alkyyli, R7 on C2_8-alkyyli ja R8 on vety tai CH3; 15 2) R10__4-R11 ^12 R12 20 jossa R10, R11 ja R12 ovat kukin itsenäisesti esimerkiksi vety, halogeeni tai C^-alkyyli; tai 3) 25 Tämä keksintö koskee menetelmää fosforia sisältä-30 vien yhdisteiden valmistamiseksi, jotka inhiboivat 3-hydr- oksi-3-metyyliglutaryyli-koentsyymi A -reduktaasientsyymiä (HMG-CoA-reduktaasia) ja ovat siten käyttökelpoisia veren kolesterolitasoa alentavina aineina ja jotka sisältävät ryhmän 11 89493 0 il -p-ch2-ch-ch2-co- 1 2 « 2

X OH

(CH2)n

5 Z

jossa X on -0- tai -NH-, n on 1 tai 2 ja Z on jäljempänä annettu "hydrofobinen ankkuri".

Ilmaisulla "hydrofobinen ankkuri" tarkoitetaan täs-10 sa käytettynä lipofiilistä ryhmää, joka ollessaan molekyylin ylempään HMG:n tapaiseen sivuketjuun sopivan yhdistävän ryhmän "X" välityksellä liittynyt sitoutuu entsyymin hydrofobiseen "taskuun", jota ei käytetä hyväksi HMG-CoA-substraatin sitoutumisessa, mistä on tuloksena lisääntynyt 15 teho verrattuna yhdisteisiin, joissa Z on H.

Siten keksintö koskee menetelmää yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava 0 il 20 R-P-CH2-CH-CH2-C02Rx X OH (I ) (CH2)n

Z

jossa 25 R on OH, alempi alkoksi tai alempi alkyyli, X on -O- tai -NH-, n on 1, R1 R2

Z on ryhmä iC3J

30 R2a jossa R1, R2 ja R2a voivat olla samoja tai erilaisia ja ovat kukin itsenäisesti H, halogeeni, alempi alkyyli, ha-logeenialkyyli, fenyyli, substituoitu fenyyli tai 0Ry, jossa Ry on H, alkanoyyli, bentsoyyli, fenyyli, halogeenife-35 nyyli, fenyylisubstituoitu alempi alkyyli, alempi alkyyli, sinnamyyli, halogeenialkyyli, allyyli, sykloalkyylisubsti- 12 89493 tuoitu alempi alkyyli, adamantyylisubstituoitu alempi al-kyyli tai (substituoitu fenyyli)substituoitu alempi alkyyli, ja

Rx on vety tai alempi alkyyli, 5 sekä niiden suolojen valmistamiseksi, jolloin mene telmälle on tunnusomaista, että silyylieetteristä, jolla on kaava 0 9 10 Rc-P-CH2—CH-CH2-C02alkyyli X 0 (VII) (CH2)„ Si-C(CH,)3 Z C6H5 c6h5 15 jossa Rc on alempi alkyyli tai alempi alkoksi, lohkaistaan silyylieetteriryhmä, jolloin muodostuu esteri, jolla on kaava 0

H

20 Rc-P-CH2-CH-CH2-C02Rx X ÖH (VIII) (CH2)n z (Rx on alkyyli) 25 ja esteri muutetaan haluttaessa vastaavaksi suolaksi, jolla on kaava

O

}l 30 R-P-CH2-CH-CH2-C02alkalimetalli

X ÖH

(CH2)n (VIHA) «

Z

35 jossa R on alempi alkyyli tai alempi alkoksi, hapoksi, jolla on kaava 13 89493 0

• I

r-p-ch2-ch-ch2-co2h

X ÖH

(CH2)n (VII IB )

5 Z

vastaavaksi suolaksi, jolla on kaava 0 li 10 alkalimetalli0-P-CH2-CH-CH2-C02alkalimetalli

X ÖH

(CH2 )n (VIIIC) z 15 tai hapoksi, jolla on kaava 0 il ho-p-ch2-ch-ch2-co2h X ÖH (VIIID) 20 (CH2)n

Z

Ilmaisuilla "suola" ja "suolat" tarkoitetaan yhdisteiden epäorgaanisten ja orgaanisten emästen kanssa muo-25 dostamia emäksisiä suoloja. Sellaisia suoloja ovat ammo-niumsuolat, alkalimetallisuolat, kuten litium-, natriumia kaliumsuolat (jotka ovat edullisia), maa-alkalimetalli-suolat, kuten kalsium- ja magnesiumsuolat, suolat orgaanisten emästen kanssa, kuten amiinisuolat, esimerkiksi di-30 sykloheksyyliamiini-, bentsatiini-, N-metyyli-D-glukamii- ni- ja hydrabamiinisuolat, suolat aminohappojen kanssa, kuten arginiini- ja lysiinisuolat, sekä vastaavat. Myrkyttömät, farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ovat edullisia, vaikka muutkin suolat ovat käyttökelpoisia esimerkik-35 si tuotteen eristyksessä tai puhdistuksessa.

14 89493

Kaavan I mukaisiin yhdisteisiin sisältyvät siis yhdisteet

O

il 5 R-P-CH2-CH-CH2-C02Rx (IA)

0 ÖH

(CH2)n

Z

10 ja

O

n R-P-CH2-CH-CH2-C02Rx (IB)

NH ÖH

(CH2)n

15 Z

Ilmaisuilla "alempi alkyyli" ja "alkyyli", joita käytetään tässä joko yksinään tai jonkin toisen ryhmän osana, tarkoitetaan sekä suoraketjuisia että haaroittunei- 20 ta hiilivetyryhmiä, jotka sisältävät normaalissa ketjussa 1-12 hiiliatomia, edullisesti 1-7 hiiliatomia, kuten metyyliä, etyyliä, propyyliä, isopropyyliä, butyyliä, t-butyyliä, isobutyyliä, pentyyliä, heksyyliä, isoheksyy-liä, heptyyliä, 4,4-dimetyylipentyyliä, oktyyliä, 2,2,4-25 trimetyylipentyyliä, nonyyliä, dekyyliä, undekyyliä, dode-kyyliä, niiden erilaisia haaroittuneita isomeerejä sekä vastaavia, samoin kuin ryhmiä, jotka sisältävät halogeeni-substituentin, kuten F-, Br-, Cl-, I- tai CF3-substituen-tin, tai alkoksi-, aryyli-, aryyliaryyli-, halogeeniaryy-30 li-, sykloalkyyli-, hydroksyyli-, alkyyliamino-, alkanoyy- liamino-, aryylikarbonyyliamino-, nitro-, syaani-, tioli-tai alkyylitiosubstituentin.

Ilmaisulla "sykloalkyyli", jota käytetään tässä jonkin toisen ryhmän osana, tarkoitetaan tyydyttyneitä 35 rengasmaisia hiilivetyryhmiä, jotka sisältävät 3-12 hiiliatomia, edullisesti 3-8 hiiliatomia, ja joihin kuulu- I: : 15 89493 vat syklopropyyli, syklobutyyli, syklopentyyli, sykloheks-yyli, sykloheptyyli, syklo-oktyyli, syklodekyyli ja syklo-dodekyyli, joista ryhmistä mikä tahansa voi olla 1 tai 2 halogeenilla, 1 tai 2 alemmalla alkyyliryhmällä, 1 tai 2 5 alemmalla alkoksiryhmällä, 1 tai 2 hydroksyyliryhmällä, 1 tai 2 alkyyliaminoryhmällä, 1 tai 2 alkanoyyliaminoryhmäl-lä, 1 tai 2 aryylikarbonyyliaminoryhmällä, 1 tai 2 amino-ryhmällä, 1 tai 2 nitroryhmällä, 1 tai 2 syaaniryhmällä, 1 tai 2 tioliryhmällä ja/tai 1 tai 2 alkyylitioryhmällä 10 substituoitu.

Ilmaisulla "alempi alkoksi" tarkoitetaan edellä esitetyn kaltaisia alempi alkyyliryhmiä, jotka ovat sitoutuneet happiatomiin.

Ilmaisulla "alkanoyyli", jota käytetään tässä toi-15 sen ryhmän osana, tarkoitetaan alempia alkyyliryhmiä, jot ka ovat sitoutuneet karbonyyliryhmään.

Sanalla "halogeeni" tarkoitetaan tässä käytettynä klooria, bromia, fluoria, jodia ja CF3:a, joista kloori ja fluori ovat edullisia.

20 Edullisia yhdisteitä ovat kaavan I mukaiset yhdis teet, joilla on seuraava rakenne R 0 CH, H CH, v. ·' / 2 \ / \

P C C0,R

i : 25 X OH (II) v CH2 z jossa R on OH tai OLi, Rx on Li tai H, X on -O- tai -NH- ja 30 Ri -^VR2 Z on ryhmä R2a jossa R1 on alkyyli- ja/tai halogeenisubstituentin sisältävä fenyyli, ja 35 R' ja R2 ’ ovat samoja ja ovat halogeenejä tai alempia alkyy-lejä.

16 89493

Keksinnön mukaista menetelmää kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi valaistaan seuraavan reaktio-sarjan ja siihen liittyvän selityksen mukaisesti.

cf»H5 a

OSi-C(CH3»3 R -P(Oalkyyl£)2 O

j £ H m_ y Ra-P-CH2-CH-CH2-C02 alkyyli I-CH2-C-L'H26CD2a!kyy]i Arbuz^ln reaktio Oa I kyy 1 IM1-C (CU 3) (Ra = alempi alkyyli tai ' ' A alempi alkoksyyli ^"6^5

IV

1. (CH ) —SiBr, CH Cl , m

Ra -P-CH -CH-CH--CO.alkyyli IV 2- »2°_ OU ξ>

Fosforiesterin ' Si-C(CIf-) hajotus S \ ^ ^ V'5 C6H5 % I a VA. - Il = alempi alkyyli, jos R oli alempi alkyyli VH. - II3 = Oli, Jos R3 oli alempi alkyyli V3 !<bOH-l)CC · 0 lK ~ °H) (Ub =alempi alkyyli) Rho-f-CH.-CH-CH^CO^lkyyli pyridiini7 OH ^

(esterölnti) I

Si-C(CHj)3 C6H5 C6H5

VI

VI 1) (cocl ) 2; CH2C12 (happokloridln muodostus) O

jfl 2) Z- (CH 2) ^ - XH (kondensaatioreaktio) RC-y-CH^CH-CH 20O2 a Ikyy 1 i VA. ---3> X 5 (C2H5>3N' ™ΛΙ’ Λ,η Si-C (CH3, 1 7\ c6h5 c6H5

VII

(RC alempi alkyyli tai alempi alkoksyyli)

1) (n-C4H9)4NF, CHjCOOH, THF (silyylieetterin O

VII _ hajotus) R-P-CIL-CH-CHj-CO Rx 2) Oli , d (oksaani (hydrolyysl) * = -y 1 öii *7H2>n Z I.

17 89493

Kuten edellä esitetystä reaktyösarjasta ilmenee, kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa jodidin Arbuzov-reaktiolla kuumentamalla jodidia A

5 C6H5 O-Si-C- (CH3 )3 | C6H5 (A ) I -CH2-C-CH2-C02alkyyli t

H

10

ja fosfoniittia/fosfiittia III

Ra-P(Oalkyyli)2 (III)

15 jossa Ra on alempi alkyyli tai alempi alkoksi, tavanomaisissa Arbutsov-reaktion olosuhteissa ja tavanomaisia menettelytapoja käyttäen, jolloin muodostuu fosfinaatti/fos-fonaatti IV

20 O

li

Ra-P-CH2-CH-CH2-C02alkyyli

Oalkyyli^OSi-C( CH3) 3 (IV) C6H5 ^C6H5 25 Fosfinaatti/fosfonaatti IV on uusi yhdiste ja sel laisenaan osa tätä keksintöä.

Sen jälkeen suoritetaan fosforiesterin hajotus käsittelemällä fosfinaatin/fosfonaatin IV liuosta, jossa liuottimena on jonkin inertti orgaaninen liuotin, kuten 30 dikloorimetaani, peräkkäin bis(trimetyylisilyyli)trifluo-riasetamidilla (BSTFA) ja trimetyylisilyylibromidilla inertin kaasukehän, kuten argonin alla, jolloin muodostuu fosfiinihappoa VA, jos Ra yhdisteessä IV on ollut alempi alkyyli, ts. yhdiste 18 89493 0 Ι· alempi alkyyli-P-CH2-CH-CH2-C02alkyyli d)H 6 (VA) i

Si-C( CH, )3 R / \ 3 3 5 c6H5 c6h5 tai fosfiinihappo VB, jos Ra yhdisteessä IV on ollut alempi alkoksi, ts. yhdiste

10 O

n HP-CH2-CH-CH2-C02alkyyli 1 ; OH 0 (VB)

Si-C( CH3 )3 c6h5 c6h5 15

Yhdisteet VA ja VB ovat uusia välituotteita. Saataessa aikaan fosfonihappo VB se esteröidään käsittelemällä sitä kuivassa pyridiinissä alkoholilla VC

20 Rb0H (VC)

jossa Rb on alempi alkyyli, ja disykloheksyylikarbodi-imi-dillä ja sekoittamalla tulokseksi saatavaa reaktioseosta inertin kaasukehän, kuten argonin alla, jolloin muodostuu 25 fosfonihapon monoalkyyliesteri VI

O

Rb0P-CH2-CH-CH2-C02alkyyli OH 0 (VI) i 30 Si-C( CH3 )3 c6h^ c6h5

Esteri VI tai fosfiinihappo VA liuotetaan sitten johonkin inerttiin orgaaniseen liuottimeen, kuten metylee-35 nikloridi in, bentseeniin tai tetrahydrofuraaniin (THF), ja käsitellään triinetyylisilyylidietyyliamiinilla ja seosta I; ; 19 8 9 4 93

sekoitetaan inertin kaasukehän, kuten argonin alla, seos haihdutetaan ja jäännös liuotetaan sen jälkeen metyleeni-kloridiin (tai johonkin muuhun sopivaan inerttiin orgaaniseen liuottimeen). Syntyvä liuos jäähdytetään noin 0-25 5 °C:n lämpötilaan, käsitellään oksalyylikloridilla ja sen jälkeen haihdutetaan, jolloin saadaan fosfonokloridaatti-raakatuote. Fosfonokloridaatti liuotetaan johonkin inerttiin orgaaniseen liuottimeen, kuten metyleenikloridiin, bentseeniin, pyridiiniin tai THFtiin, ja liuos jäähdyte-10 tään noin -20 - 0 °C:seen ja käsitellään yhdisteellä B

Z - (CH2 )n-XH

jota käytetään sellainen määrä, että esterin VI tai hapon 15 VA ja yhdisteen B moolisuhde on noin 0,5:1 - 3:1, edullisesti noin 1:1 - 2:1, ja sen jälkeen trietyyliamiinilla ja katalyyttisellä määrällä 4-dimetyyliaminopyridiiniä (DMAP), jolloin muodostuu additiotuote VII

20 O

II

Rr-P----CH2 -CH-CH2-C02alkyyli X 0 (CH2)n Si-C( CH3 )3 (VII) z c6h5 c6h5 25 jossa Rc on alempi alkyyli tai alempi alkoksi.

Silyylieetteri hajotetaan käsittelemällä yhdiste VII inertissä orgaanisessa liuottimessa, kuten esimerkiksi tetrahydrofuraanissa, jääetikalla ja tetrabutyyliammonium-30 fluoridilla, jolloin muodostuu esteri VIII

0 il

Rc-P-CH2-CH-CH2-C02Rxalkyyli I *

X OH

35 (CH2)n (VIII) Z ( Rx on alkyyli) 20 89493

Esteri VIII voidaan sitten hydrolysoida vastaavaksi alkalimetallisuolaksi tai hapoksi, ts. yhdisteeksi, jossa Rx on alkalimetalli tai H, käsittelemällä se diok-saanissa, tetrahydrofuraanissa tai jossakin muussa iner-5 tissä orgaanisessa liuottimessa, inertin kaasukehän, kuten argonin alla ja 25 °C:n lämpötilassa voimakkaalla emäksellä, kuten esimerkiksi litiumhydroksidilla, jota käytetään sellainen määrä, että emäksen ja esterin VIII moolisuhde on noin 1:1 - 1,1:1, jolloin muodostuu vastaava alkalime-10 tallisuola VIHA

O

M

R-P-CH2-CH-CH2-C02alkalimetalli X OH (VIIIA) 15 I 2 n

Z

jossa R on alempi alkyyli tai alempi alkoksyyli. Yhdiste VIIIA voidaan sitten käsitellä vahvalla hapolla, kuten esimerkiksi HCl:lla, jolloin muodostuu vastaava happo 20

VII IB

O

II

R-P-CH,-CH-CH,-C0oH

12: 22 (VIIIB)

25 X OH

Wn

Z

Esteri VIII, jossa R on alempi alkoksyyli, voidaan 30 muuttaa vastaavaksi di-alkalimetallisuolaksi käsittelemällä se 50-60 °C:n lämpötilassa voimakkaalla emäksellä, jota käytetään sellainen määrä, että emäksen ja esterin

VIII moolisuhde on noin 2:1 - 4:1, jolloin muodostuu suola VIIIC

2i 8 9 493 0 alkalimetallio-P-CH--CH-CH«-CO_alkalimetalli 1 2 z 2 2

X ÖH

l (VIIIC) ( CH- ) 5 I 2 n

Z

Dialkalimetallisuola VIIIC voidaan muuttaa vastaavaksi hapoksi, jossa R on OH, käsittelemällä se vahvalla hapolla, kuten esimerkiksi HClrlla, jolloin muodostuu 10 happo VIIID

O

n

HO-P-CHp-CH-CH^-CO^H

x Sh (viiid) (CH?) 15 « 2 n

Jodilähtöaine A voidaan valmistaa bromidista C OH

BR-CH2-CH-CH2-C02alkyyli (C)

20 /joka valmistetaan käyttäen menettelytapoja, joita kuvataan artikkelissa Tetrahedron Lett. 26 (1985) 295l7, joka liuotetaan imidatsolia ja 4-dimetyyliaminopyridiiniä dime-tyyliformamidissa (DMF) sisältävään liuokseen, ja tulokseksi saatava liuos käsitellään t-butyylidifenyylisilyyliklo-25 ridilla inertin kaasukehän, kuten argonin alla, jolloin muodostuu silyylieetteriä D

Cv6H5 /6H5 \/ (D) 3o 0Si-C(CH3)3

Br-CH2-CH-CH2C02 alkyyli

Inerttiin orgaaniseen liuottimeen, kuten esimerkiksi ... metyylietyyliketoniin tai DMF:iin, liuotettu silyylieette- 35 ri D käsitellään natriumjodidilla inertin kaasukehän, kuten argonin alla, jolloin muodostuu jodidi A.

22 8 9493

Lähtöaineena käytettävä yhdiste B

Z-(CH_) -XH (B) 2 n voidaan valmistaa alla kuvatuin tavoin, jotka määräytyvät 5 Z:n ja X:n merkityksen mukaan.

Yhdisteitä, jotka vastaavat kaavaa B, jossa Z on ryhmä R1

R

ja X on 0, ts. yhdisteistä, joiden rakenne on R1 15 R2a—/q \— (CH2)n-°H (Bl) R2

voidaan valmistaa käsittelemällä aldehydi E

20 R1 R2* (oV- (CH2)n-l"CH0 (E) 25 ^R2 jollakin pelkistimellä, kuten litiumalumiinihydridillä tai natriumboorihydridillä.

Yhdisteitä, jotka vastaavat kaavaa B, jossa Z on 30 ryhmä R1 r2M^oV- 35 ' ' R2 ja X on -NH-, ts. yhdisteitä, joiden rakenne on l· 23 89493 R1 R2a ^q"C—(CH2)n-NH2 (B2) 5 R2

voidaan valmistaa hapettamalla asetoniin liuotettu alde-hydi E esimerkiksi Jones-reagenssilla, jolloin muodostuu happo F

10 R1 R2a—(ÖV<CH2>n-rC00H (F, 15 joka suspendoidaan metyleenikloridiin ja käsitellään oksalyylikloridilla, jolloin muodostuu vastaava happoklo-ridi, joka liuotetaan johonkin inerttiin orgaaniseen liuot-timeen, kuten tetrahydrofuraaniin, ja käsitellään seoksel-2Q la, joka sisältää väkevää ammoniumhydroksidia tetrahydro-furaanissa, jolloin muodostuu amidi, jonka rakenne on R1 25 R2i-^^_(CH2)n.1-C-NH2 (G) R2 ..... 2

Amidi G pelkistetään sitten vastaavaksi amidiksi B käsittelemällä jollakin pelkistimellä, kuten esimerkiksi li-tiumalumiinihydridillä.

24 89493

Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa ra-seemisina seoksina, joiden resoluutio S-isomeerin, joka on edullinen, saamiseksi voidaan toteuttaa myöhemmin. Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan kuitenkin valmistaa suoraan 5 S-isomeerien muodossa tässä ja jäljempänä esitetyissä työskentelyesimerkeissä kuvatulla tavalla.

Keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet ovat 3-hydroksi-3-metyyliglutaryyli-koentsyymi A (HMG-CoA) -reduktaasin inhibiittoreita ja siten käyttökelpoisia ko-10 lesterolin biosynteesin inhiboinnissa, minkä osoittavat seuraavat kokeet.

1) Rotan maksan HMG-CoA -reduktaasi

Rotan maksan HMG-CoA -reduktaasin aktiivisuus mitataan käyttämällä muunnosta menetelmästä, jonka ovat esit-15 täneet Edwards et ai. [P. A. Edwards et ai., J. Lipid Red.

20 (1979) 40]. Ensyymin lähteenä käytetään rotan maksan mikrosomeja ja entsyymiaktiivisuus määritetään mittaamalla 14C-HMG-CoA -substraatin muuttuminen 14C-mevalonihapoksi.

a. Mikrosomien preparointi 20 2-4 Sprague-Dawley -rotalta, joille on syötetty koleryramiinia ja joilta on katkaistu kaula, poistetaan maksa ja maksat homogenoidaan fosfaattipuskuri A:ssa (kaliumfosfaatti, 0,04 M, pH 7,2; KC1, 0,05 M; sakkaroosi, 0,1 M; EDTA, 0,03 M; aprotiniini, 500 KI-yksikköä/ml).

25 Homogenaattia sentrifugoidaan (16 000 x g) 15 minuuttia 4 °C:ssa. Supernatantti poistetaan ja sentrifugoidaan uudelleen samoissa olosuhteissa. Toisen, nopeudella 16 000 x g suoritetun sentrifugoinnin jälkeen erotettua supernatanttia sentrifugoidaan nopeudella 100 000 x g 30 70 minuuttia 4 °C:ssa. Mikrosomipelletit suspendoidaan uu delleen mahdollisimman pieneen määrään fosfaattipuskuri A:ta (3 - 5 ml/maksa) ja homogenoidaan lasi-lasihomogeni-saattorissa. Lisätään ditiotreitolia (10 mM) ja preparaatti jaetaan osiin, pakastetaan nopeasti asetoni-hiilihappo-35 jäähauteessa ja varastoidaan -80 °C:ssa. Ensimmäisen mik- 25 89493 rosomipreparaatin ominaisaktiivisuus oli 0,68 nmol mevalo-nihappoa/mg proteiinia/minuutti. b. Entsyymimääritys

Reduktaasi määritetään 0,25 ml:sta seosta, joka si-5 sältää seuraavia aineosia ilmoitettuina loppupitoisuuksi-na:

Kaliumfosfaatti, pH 7,0 0,04 M

KC1 0,05 M

Sakkaroosi 0,10 M

10 EDTA 0,03 M

Ditiotreitoli 0,01 M

NaCl 3,5 M

Dimetyylisulfoksidi 1 %

Mikrosomiproteiini 50 - 200 pg

15 [14C] (DL-)HMG-CoA

(0,05 pCi, 30 - 60 mCi/mmol) 100 μΜ NADPH (nikotiiniamidiadeniini-

dinukleotidifosfaatti) 2,7 mM

20 Reaktioseosta inkuboidaan 37 °C:ssa. Esitetyissä olosuhteissa entsyymiaktiivisuus lisääntyy lineaarisesti 300 pg:aan mikrosomiproteiinia/reaktioseos saakka ja lineaarinen kasvu kestää 30 minuuttia. Tavanomainen inkuboin-tiaika lääketutkimuksissa on 20 minuuttia, jonka tuloksena 25 HMG-CoA -substraattia käytetään 100 pM:na, joka on kaksinkertainen pitoisuus siihen nähden, mitä entsyymin kyllästäminen esitetyissä olosuhteissa vaatii. NADPH:ta käytetään ylimäärin niin, että sen pitoisuus on 2,7 -kertainen siihen nähden, mitä entsyymireaktion maksiminopeuden saa-30 vuttamiseksi on tarpeen.

Standardisoidut testit inhibiittoreiden arvioimiseksi suoritetaan seuraavaa menettelytapaa noudattaen.

Mikrosomientsyymiä inkuboidaan 15 minuuttia 37 °C:ssa NADHP:n ollessa mukana. Lisätään DMSO-väliainetta 35 testattavan yhdisteen kanssa tai ilman sitä ja seosta in- 26 89493 kuboidaan vielä 15 minuuttia 37 °C:ssa. Entsyymimääritys aloitetaan lisäämällä 14C-HMG-CoA -substraattia. 37 °C:ssa suoritetun 20 minuutin inkuboinnin jälkeen reaktio pysäytetään lisäämällä 25 μΐ 33-%:ista KOH:a. Lisätään 3H-meva-5 lonihappoa (0,05 pCi) ja reaktioseoksen annetaan seistä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Lisätään 50 μΐ 5 N HCl:a mevalonihapon muuttamiseksi laktoniksi. pH-indikaat-toriksi riittävän pH:n alenemisen havaitsemiseksi lisätään bromifenolisinistä. Laktoninmuodostus-reaktion annetaan 10 jatkua 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Reaktioseoksia sentrifugoidaan 15 minuuttia nopeudella 2 800 kierrosta/-minuutti. Supernatantit siirretään lasipylväisiin, joiden sisähalkaisija on 0,7 cm, kaadetun Ag 1-X8 -anioninvaihto-hartsin (Biorad, formiaattimuoto; 2 g) päälle ja eluoidaan 15 2,0 ml:lla vettä. Ensimmäinen 0,5 ml eluaattia heitetään pois ja seuraava 1,5 ml kerätään talteen ja siitä lasketaan sekä tritium että hiili-14 10 ml:ssa Opti-fluor -tui-kenestettä. Tulokset lasketaan 20 minuutin aikana syntyneenä mevalonihappomääränä (nmol) ja korjataan vastaamaan 20 tritiumin 100-%:ista takaisinsaantia. Lääkeaineiden vaikutukset ilmaistaan I50-arvoina (lääkeainepitoisuus, joka saa aikaan entsyymiaktiivisuuden pienenemisen 50 %:lla), jotka saadaan yhdistetyistä annos-vastetiedoista 95 %:n luotettavuus välillä .

25 Laktonimuodossa olevien lääkeaineiden muuntaminen natriumsuoloiksi toteutetaan liuottamalla laktoni DMSOrhon, lisäämällä liuokseen 10-kertainen mooliylimäärä NaOH:a ja antamalla seoksen seistä huoneen lämpötilassa 15 minuuttia. Sen jälkeen seos neutraloidaan osittain (pH-30 arvoon 7,5 - 8,0) 1 N HCl:lla ja laimennetaan sitten ent-syymireaktioseokseksi.

2) Kolesterolin synteesi vastaeristetyissä rotan hepatosyyteissä

Tutkitaan yhdisteiden, joilla on aktiivisuutta 35 HMG-CoA:n inhibiittoreina, kykyä inhiboida 14C-asetaatin li 27 89 493 liitymistä kolesteroliin vastaeristetyistä rotan hepato-syyteistä valmistetuissa suspensioissa käyttäen menetelmiä, jotka alunperin esittivät Capuzzi et ai. [D. M. Ca-puzzi ja S. Margolis, Lipids 6 (1971) 602].

5 A. Rotan hepatosyyttien eristys

Sprague-Dawley -rotat (180 - 220 g) nukutetaan nem-butolilla (50 mg/kg). Vatsa avataan ja porttilaskimon ensimmäinen haara sidotaan kiinni. Suoraan vatsan onttolas-kimon distaaliseen osaan laitetaan yksi sulkuommel ja 10 porttilaskimoon sijoitetaan kanyyli ompeleen ja ensimmäisen haaralaskimon väliin. Maksaa perfusoidaan sen jälkeen kun onttolaskimo on katkaistu, ulosvalumisen mahdollistamiseksi esilämmitetyllä (37 °C) hapetetulla puskuri A:11a (HBSS, joka ei sisällä kalsiumia eikä magnesiumia, mutta 15 sisältää 0,5 pmol EDTA/ml) nopeudella 20 ml/minuutti. Maksaa perfusoidaan lisäksi 200 ml :11a esilämmitettyä puskuri B:tä (HBSS, joka sisältää 0,05 % bakteerikollagenaasia). Puskuri B:llä perfusoinnin jälkeen maksa leikataan irti ja suoritetaan dekapsulaatio 60 mlrssa Waymouthin väliainet-20 ta antaen solujen dispergoitua väliaineeseen. Hepatosyytit eristetään 3 minuutin sentrifugoinnilla, joka suoritetaan pienellä nopeudella (50 x g). Hepatosyyttipelletit pestään kertaalleen Waymouthin väliaineella ja lasketaan ja niiden elinkykyisyys määritetään trypaanisinisellä suoritettaval-25 la ekskluusiolla. Näiden hepatosyyttirikkaiden solususpen-sioiden elinkykyisyys on normaalisti 70 - 90 %.

B. ^ C-asetaatin liittyminen kolesteroliin Hepatosyytit suspendoidaan uudelleen inkubointivä-liaineeseen (IM) (Tris-HCl, 0,02 M, pH 7,4; KC1, 0,1 M; 30 natriumsitraatti, 3,3 mM; nikotiiniamidi, 6,7 mM; NADP, 0,23 mM; glukoosi-6-fosfaatti, 1,7 mM) niin, että solupi-toisuudeksi tulee 5 x 106 solua/2,0 ml).

Testattavat yhdisteet liuotetaan normaalisti DMSO:hon tai DMSO-vesi-seokseen (1:3) ja lisätään IM:ään.

28 89 493 DMSO:n loppupitoisuus IM:ssä on enintään 1,0 %, eikä sillä ole merkittävää vaikutusta kolesterolisynteesiin.

Inkubointi aloitetaan lisäämällä 14C-asetaatti (58 mCi/mmol, 2 pCi/ml) ja sijoittamalla solususpensiot (2,0 5 ml)35 mm:n kudosviljelymaljoihin; inkubointiaika on 2,0' tuntia 37 °C:ssa. Inkuboinnin jälkeen solususpensiot siirretään lasisiin sentrifugointiputkiin ja niitä sentrifu-goidaan nopeudella 50 x g kolme minuuttia huoneen lämpötilassa. Solupelletit suspendoidaan uudelleen 1,0 ml:aan 10 vettä, hajotetaan ja sijoitetaan jäähauteeseen.

Lipidit uutetaan pääpiirteittäin tavalla, jonka ovat esittäneet E. G. Bligh ja W. J. Dyer [Can. J. Bio-chem. and Physiol. 37 (1959) 911]. Alempi orgaaninen faasi erotetaan ja kuivataan typpivirtauksen alla ja jäännös 15 suspendoidaan uudelleen 100 pl:aan kloroformi-metanoli- seosta (2:1). Kokonaisnäytteestä laitetaan täplä ohutker-roslevyille (silikageeli LK6D) ja levyt kehitetään heksaa-ni-etyylieetteri-etikkahapposeoksesta (75:25:1). Levyille tehdään pyyhkäisylaskenta automaattista BioScan -skannaus-20 systeemiä käyttäen. Kolesterolihuipun (Rf 0,28) sisältämä radioaktiivinen merkkiaine määritetään ja tulos ilmoitetaan kokonaistuikemääränä huippua kohden sekä merkkiaineen prosentuaalisena määränä koko lipidiuutteessa. Vertailu-viljelmissä kolesterolihuippujen sisältämä radioaktiivi-25 suus on tavallisesti 800 - 1 000 tuiketta/minuutti ja merkkiaineen määrä koko lipidiuutteessa on 9 - 20 %; tulokset ovat sopusoinnussa Capuzzi et ai.'n ilmoittamien tulosten (9 % uuttunutta merkkiainetta kolesterolissa) kanssa.

30 Lääkeaineiden vaikutukset (kolesterolisynteesin prosentuaalinen inhibitio) määritetään vertaamalla vertai-Luviljelmien ja lääkekäsiteltyjen viljelmien kolesterolin sisältämiä prosentuaalisia merkkiainemääriä. Annos-vaste-käyrät muodostetaan kahden tai useamman tutkimuksen anta- li 29 89 493 mien tietojen perusteella ja tulokset ilmaistaan l50-arvoi-na 95 %:n luotettavuusvälillä.

3) Kolesterolisynteesi ihmisen ihon fibroplasteissa Yhdisteen selektiivisyys, joka johtaa suurempaan 5 inhibitoriseen vaikutukseen maksakudoksessa, olisi koles teroli synteesi n inhibiittorin tunnusmerkki. Siksi sen lisäksi, että kolesterolisynteesin inhibiittoreita tutkitaan hepatosyyteissä, näiden yhdisteiden aktiivisuutta kolesterolisynteesin inhibiittoreina tutkitaan myös viljellyissä 10 fibroplasteissa.

a) Ihmisen ihon fibroplasteista valmistetut viljel-mät

Ihmisen ihon fibroplasteja viljellään Eaglen mini-miravintoalustalla (EM), joka sisältää 10 % sikiökautista 15 naudan seerumia. Kussakin kokeessa varastoviljelmiin lisätään trypsiiniä yksisolukerroksen dispergoimiseksi, suoritetaan laskenta ja solut siirretään kudosviljelymaljoille halkaisijaltaan 35 mm:n syvennyksiin (5 x 10^ solua/2,0 ml). Viljelmiä inkuboidaan 5 % C02:a ja 95 % kosteaa huone-20 ilmaa sisältävässä tilassa 37 °C:ssa 18 tuntia. Kolestero lin biosynteesiin osallistuvat entsyymit aktivoidaan poistamalla seerumia sisältävä ravintoalusta, huuhtomalla yk-sisolukerrokset, lisäämällä 1,0 ml EM:ää, joka sisältää 1,0 % rasvahappovapaata naudan seerumin albumiiinia, ja 25 inkuboimalla viljelmiä vielä 24 tuntia.

b) ^-asetaatin liittäminen kolesteroliin Aktivoidut fibroplastiviljelmät huuhdotaan ENEM100:lla ( Earlen minimiravintoalusta). Testattavat yhdisteet liuotetaan DMSO:hon tai viljelmiin lisätään DMSO-EM-30 seosta (1:3) (DMS0:n loppupitoisuus soluviljelmissä on enintään 1,0 %) ja viljelmiä esi-inkuboidaan 5 % C02:a ja 95 % kosteaa huoneilmaa sisältävässä tilassa 37 °C:ssa 30 minuuttia. Lääkeaineiden kanssa esi-inkuboinnin jälkeen lisätään 1 -c"-n;i t r i umasetaattia (2,0 pCi/ml, 58 mCi/mmol ) 3b ja viljelmiä inkuboidaan uudelleen neljä tuntia. Inkuboin- 30 89493 nin jälkeen elatusalusta poistetaan ja yksisolukerros (200 pg soluproteiinia/viljelmä) raaputetaan 1,0 ml:aan vettä. Hajotetun solususpension sisältämät lipidit uutetaan klo-roformi-metanoliseokseen hepatosyyttien yhteydessä kuva-5 tulla tavalla.

Kolesterolin biosynteesin inhibitio määritetään vertaamalla merkkiaineen prosentuaalista määrää vertailu-viljelmästä ja lääkeainekäsitellystä viljelmästä peräisin olevissa kolesterolihuipuissa. Tulokset ilmaistaan I50-ar-10 voina ja ne saadaan kahden tai useamman kokeen perusteella yhdistetysti muodostetuista annos-vastekäyristä. 95 %:n luotettavuusväli Ib0-arvoille lasketaan myös yhdistetyistä annos-vastekäyristä.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää koos-15 tumuksissa, jotka koostuvat ainakin yhdestä kaavan I mukaisesta yhdisteestä, joka on yhdistetty johonkin farmaseuttiseen väliaineeseen tai laimennusaineeseen. Farmaseuttinen koostumus voidaan formuloida käyttäen sellaisia tavanomaisia kiinteitä tai nestemäisiä väliaineita tai 20 laimennusaineita ja farmaseuttisia lisäaineita, jotka ovat tyypiltään haluttuun antotapaan soveltuvia. Yhdisteet voidaan antaa suun kautta esimerkiksi tablettien, kapselien, rakeiden tai pulvereiden muodossa, tai ne voidaan antaa parenteraalisesti injektoitavissa olevien valmisteiden 25 muodossa, jotka antomuodot sisältävät 1 - 200 mg vaikuttavaa yhdistettä hoidossa käytettävää annosta kohden. Annettava annos riippuu yksikköannoksesta, oireista, sekä potilaan iästä ja ruumiinpainosta.

Yhdisteitä, joilla on kaava I, voidaan antaa samal-30 la tavalla kuin niitä tunnettuja yhdisteitä (kuten lova-statiinia), joita on ehdotettu käytettäviksi kolesterolin biosynteesin inhibiittoreina nisäkkäillä, kuten ihmisillä, koirilla, kissoilla ja vastaavilla. Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan siis antaa noin 4 - 200 mg joko kerta-35 annoksena tai erillisinä annoksina 1-4 kertaa vuorokau- 31 S 9 4 9 3 dessa, edullisesti 4 - 200 mg, osa-annoksina, joiden suuruus on 1 - 100 mg, mielellään 0,5 - 50 mg, 2-4 kertaa vuorokaudessa tai hitaasti vaikuttavaa aineosaa vapauttavassa muodossa.

5 Seuraavat työskentelyesimerkit edustavat edullisia tämän keksinnön mukaisia suoritusmuotoja. Kaikki lämpötilat on ilmoitettu Celsius-asteina, ellei toisin ole mainittu. Flash-kromatografiakäsittelyt toteutettiin joko Merck 60 tai Whatman LPS-1 -silikageelillä. Käänteisfaasi-10 kromatografiakäsittelyt toteutettiin CHP-20 MCI -geeli- hartsilla, jota toimittaa Mitsubishi, Ltd.

E simerkki 1 (S ) - 4-[[[4'-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bifenyl-2-yyli]metoksi]metoksifosfinyyli]-3-hydroksibutaa-15 nihappo, monolitiumsuola A. N-(2,4-dimetyylibentsylideeni)bentseeniamiini [Viite: US-patenttijulkaisu 4 375 475 (Merck), s. 39]

Liuosta, joka sisälsi vastatislattua 2,4-dimetyyli-20 bentsaldehydiä (Aldrich; 6,97 ml, 50 mmol) ja tislattua aniliinia (Aldrich; 4,56 ml, 50 mmol) kuivassa tolueenissa (80,0 ml), refluksoitiin kolme tuntia argonin alla Dean-Starck -vedenerottimella varustetussa pullossa. Seos jäähdytettiin ja haihdutettiin sitten alipaineessa keltaiseksi 25 öljyksi. Epäpuhdas öljy puhdistettiin Kugelrohr-tislauk-sella (0,5 mmHg, 160 - 180 °C), jolloin saatiin 8,172 g (78,1 %) haluttua otsikon mukaista bentseeni-imiiniä vaaleankeltaisena öljynä, joka kiteytyi seistessään matalassa lämpötilassa sulavaksi aineeksi. TLC (heksaani-asetoni, 30 4:1): Rf = 0,67 ja 0,77 (geometrisiä isomeerejä), UV ja I2.

32 8 9493 Γ ^ " “»yCr*— 5 [Oj0iCH3 _ CH3 J 2 [viite: US-patenttijulkaisu 4 375 475 (Merck), s. 3θ]

Seokseen, joka sisälsi osassa A valmistettua bent-seeni-imiiniä (6,0 g, 28,7 mmol) jääetikassa (144 ml), lisättiin palladium (II)asetaattia (6,44 g, 28,7 mmol) ja kirkasta, punaista, homogeenista liuosta refluksoitiin argonin alla 1 tunti. Tulokseksi saatu samea seos suoda-15 tettiin lämpimänä tiiviisti pakkautuneen, J-tuumaisen piimaakerroksen läpi veteen (900 ml) . Saostunut oranssi kiintoaine kerättiin talteen suodattamalla ja sitä kuivattiin alipaineessa 65°C:ssa P20^:lla 16 tuntia, jolloin saatiin 10,627 g (85,5 %) haluttua otsikon mukaista 20 palladiumkompleksia oranssina kiinteänä aineena, jonka sulamispiste oli 194 - 196°C (kirjallisuudessa uudelleen kiteytetylle analyysinäytteelle esitetty sp. 203 - 205°C).

C. 4'-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bifenyyli)-2-karboksaldehydi 25 1) Bromi(4-fluori-3-metyylifenyyli)magnesium {viite: US-patenttijulkaisu 4 375 475 (Merck), s. 37 ja 3¾

Osan C(l) otsikon mukainen Grignard-reagenssi valmistettiin lisäämällä magnesiumlastuihin (1,35 g, 30 55,4 mmol, 8,0 ekv.), joita sekoitettiin kuivassa Et20:ssa (70,0 ml), 5-bromi-2-fluoritolueenia (Fairfield Chemical Co.; 22,5 g, 60,9 mmol) pisaroittain riittävällä nopeudella reaktioseoksen pitämiseksi refluksoituvana. Reaktio käynnistettiin ultraäänilaitteessa. Bromidin lisäyksen 35 päätyttyä seosta sekoitettiin 1 tunti argonin alla huoneen lämpötilassa ja refluksoitiin 15 minuuttia, jonka jälkeen sen annettiin jäähtyä huoneen lämpötilaan.

li 33 89493 2) 4'-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bifenyyli)-2-karboksaldehydi

Toisessa pullossa sekoitettiin seosta, joka sisälsi osassa B valmistettua dipalladiumkompleksia (3,0 g, 5 6,92 mmol) ja trifenyylifosfiinia (14,52 g, 55,4 mmol, 8.0 ekv.) kuivassa bentseenissä (100 ml), huoneen lämpötilassa argonin alla 30 minuuttia. Sen jälkeen tähän liuokseen lisättiin ruiskun avulla yhdessä erässä osan C(l) mukaisesti vastavalmistettu ja suodatettu (lasivilla- 10 täyte) Grignard-reagenssi ja seosta sekoitettiin 1,5 tuntia huoneen lämpötilassa argonin alla. Lisättiin 6.0 N HCl:a (35 ml) ja seosta sekoitettiin vielä tunti huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen se suodatettiin tiiviisti pakkautuneen piimään (i tuuman kerros) läpi. Suo- 15 dos uutettiin Et20:llä (250 ml) ja uuttoliuos pestiin kylläisellä NaCl-liuoksella (2 x 100 ml), kuivattiin vedettömällä MgSO^illa ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 13,35 g viskoosia oranssia öljyä, joka kiteytyi seisoessaan. Epäpuhdas oranssi kiintoaine puhdis-20 tettiin flash-kromatografiakäsittelyllä käyttäen adsorbent-tina silikageeliä (700 g) ja eluenttina heksaania ja sen jälkeen heksaani-Et20-seosta (95:5). Tuotejakeet haihdutettiin, jolloin saatiin 1,507 g (89,9 %) haluttua otsikon mukaista aldehydiä vaaleankeltaisena kiinteänä ai-25 neena, jonka sulamispiste oli 72 - 75°C (kirjallisuudessa ilmoitettu sp. 73 - 74°C). TLC (heksaani-Et20-seos, 95:5): Rf = 0,40, UV ja PMA.

D. 41 fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bifenyyli)-2-metanoli 30 Jäähdytettyyn (0°C, jäähaude), kuivaan Et20:iin (15,0 ml) lisättiin LiAlH^:a (259 mg, 6,82 mmol, 0,55 ekv.) ja syntyneeseen harmaaseen suspensioon li-*-_ sättiin pisaroittain 15 minuutin aikana liuos, joka sisäl si osassa C valmistettua aldehydiä (3,0 g, 12,4 mmol) 35 kuivassa Et20:ssä (15 ml). Seosta sekoitettiin argonin ” alla huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, jonka jälkeen se 34 89493 jäähdytettiin takaisin 0°C:seen ja siihen lisättiin pisaroittaan 260 ^ul vettä, 260 ^.ul 15-%:ista NaOH:a ja 780 ^ul vettä. Suspensio laimennettiin EtOAc:lla ja suodatettiin tiiviisti pakkautuneen piimään (1/4 tuuman 5 kerros), jonka päällä oli vedetöntä Na2SO^:a, läpi ja väritön suodos haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 2,99 g (98,8 %) valkoista kiinteää ainetta. Epäpuhtaan kiintoaineen triturointi kylmän heksaanin kanssa ja kuivaus alipaineessa tuottivat tulokseksi 2,467 g (81,6 %) 10 haluttua otsikon mukaista alkoholia valkoisena kiinteänä aineena, jonka sulamispiste oli 102 - 103°C. TLC (heksaa-ni-EtOAc-seos, 9:1): Rf = 0,24, UV ja PMA.

E. (S)-3-/27l,1-dimetyylietyyli)difenyylisilyl7~ oksi7-4-(hydroksimetoksifosfinyyli)butaanihappo, metyyli-15 esteri 1) (S)-4-bromi-3-hydroksibutaanihappo, metyyliesteri 1 a) /R-(R*,R*)1-2,3,4-trihydroksibutaanihappo, kal-siumsuola, hydraatti [viite: Carbohydate Research 72 (1979) 301 - 304jf 20 Liuokseen, joka sisälsi D-isoaskorbiinihappoa (44,0 g, 250 mmol) vedessä (625 ml), lisättiin kalsiumkar-bonaattia (50 g), suspensio jäähdytettiin 0°C:seen ja siihen lisättiin vähitellen 30-%:ista ^2°2:a (100 ml). Seosta sekoitettiin 30 - 40°C:ssa (öljyhaude) 30 minuuttia.

25 Lisättiin aktiivihiiltä (Darco; 10 g) ja mustaa suspensiota kuumennettiin höyryhauteella, kunnes C^in kehittyminen lakkasi. Suspensio suodatettiin piimään läpi ja haihdutettiin alipaineessa (hauteen lämpötila 40°C). Jäännös liuotettiin veteen (50 ml), liuosta lämmitettiin höy-30 ryhauteella ja siihen lisättiin CH^OHra, kunnes liuos muuttui sameaksi. Saostunut kumimainen aine kerättiin talteen suodattamalla ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin 30,836 g (75,2 %) haluttua kalsiumsuolaa jauhemaisena valkoisena aineena. TLC (iPrOH-NH^OH-I^O-seos, 7:2:1): Rf = 35 0,19, PMA.

I: : 35 89493 1 b) /S-(R*,S*)J-2,4-dibromi-3-hydroksibutaanihappo, metyyliesteri {viite: K. Bock et ai., Acta Scandinavica (B) 37 (1983) 341 - 344] 5 Osassa (l)(a) valmistettu kalsiumsuola (30 g) liuo tettiin 30 - 32-%:iseen HBr:n etikkahappoliuokseen (210 ml) ja liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 24 tuntia. Sen jälkeen ruskeaan liuokseen lisättiin meta-nolia (990 ml) ja seosta sekoitettiin yön yli. Seos haih-10 dutettiin oranssiksi öljyksi, jäännös liuotettiin CH^OHiiin (75 ml), liuosta refluksoitiin 2 tuntia ja se haihdutettiin. Jäännös jaettiin EtOAc:n (100 ml) ja veden kesken ja orgaaninen faasi pestiin vedellä (2 x) ja kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin sitten 15 vedettömällä Na^SO^jUa ja haihdutettiin, jolloin saatiin 22,83 g (90,5 %) puhdistamatonta dibromidia vaaleanorans-sina öljynä. TLC (EtOAc-heksaaniseos, 1:1): Rf = 0,69, UV & PMA.

le) (S)-4-bromi-3-hydroksibutaanihappo, metyyli- 20 esteri JViite: sama kuin yhdisteen (1)(b) valmistuksessa]

Argonilla huuhdottuun liuokseen, joka sisälsi dibromidia (20,80 g, 75,4 mmol) ja vedetöntä NaOAc:a (21,0 g) EtOAc:ssa (370 ml) ja jääetikassa (37 ml), lisättiin 5 % 25 Pd/C-katalysaattoria (1,30 g) ja mustaa suspensiota sekoitettiin H^:n (1 atm) alla tarkkaillen samalla sisäänottoa. 2 tunnin kuluttua n kulutus oli päättynyt, seos suodatettiin piimään läpi, suodos pestiin kylläisellä NaHCO^:lla ja kylläisellä NaCl:lla, kuivattiin 30 sitten vedettömällä magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin, jolloin saatiin epäpuhdasta dibromiesteriä ruskeana öljynä. Puhdistamaton öljy yhdistettiin toiseen valmistus-erään (jossa lähtöaineena käytettiin 36,77 g dibromidia) ja tislattiin alipaineessa, jolloin saatiin 25,77 g 35 (61,3 %) haluttua otsikon mukaista dibromiesteriä kirk kaan Öljynä, jonka kiehumispiste oli 79 - 80°C (1,0 mmHg).

36 89493 TLC (EtOAc-heksaaniseos, 1:1): Rf = 0,44, PMA. Alkuaineanalyysi : laskettu yhdisteelle CgHgC^Br: C, 30,48; H, 4,60; Br, 40,56 todettu: C, 29,76; H, 4,50; Br, 39,86 5 2) (S)-4-bromi-3-//Tl,1-dimetyylietyyli)difenyyli- silyl7oksi7butaanihappo, metyyliesteri

Liuokseen, joka sisälsi osassa E(l) valmistettua bromihydriiniä (4,0 g, 20,4 mmol), imidatsolia (6,94 g, 5.0 ekv.) ja 4-dimetyyliaminopyridiiniä (4-DMAP) (12 mg, 10 0,005 ekv.) kuivassa DMF:ssa (40 ml), lisättiin t-butyyli-difenyylisilyylikloridia (5,84 ml, 1,1 ekv.) ja tulokseksi saatua homogeenista seosta sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa yön yli. Seos jaettiin 5-%isen KHSO^rn ja EtOAc:n kesken ja orgaaninen faasi pestiin vedellä ja kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin vedettömällä MgSO^:lla ja haihdutettiin, jolloin saatiin 9,32 g (100 %) puhdistamatonta silyylieette-riä kirkkaana viskoosina öljynä. TLC (heksaani-EtOAc-seos, 3:1): silyylieetterin Rf = 0,75, UV ja PMA.

20 .

3) (S)-4-jodi-3-//(l,1-dimetyylietyyli)difenyylisi-lyl7oksi7butaanihappo, metyyliesteri

Liuokseen, joka sisälsi puhdistamatonta osassa E(2) valmistettua bromidia (9,32 g, 201 mmol) metyylietyy-25 liketonissa (60 ml, kuivattu 4 A:n molekyyliseuloilla), lisättiin natriumjodidia (15,06 g, 100,5 mmol, 5,0 ekv.) ja tulokseksi saatua keltaista suspensiota refluksoitiin 5.0 tuntia argonin alla. Seos jäähdytettiin, laimennettiin EtOAc:lla ja suodatettiin ja suodos pestiin laimealla 2q NaHSO^Ha (värittömäksi) ja kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin sitten vedettömällä Na„SO.:lla ja haihdutet-tiin alipaineessa, jolloin saatiin 10,17 g keltaista öljyä. Epäpuhdas öljy puhdistettiin flash-kromatografiakä-sittelyllä käyttäen adsorbenttina silikageeliä (600 g) 25 ja eluenttina heksaani-Ci^C^-seosta (3:1). Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 7,691 g 37 89 493 (74,2 %, molempien vaiheiden yhteissaanto) haluttua otsikon mukaista jodidia kirkkaana, värittömänä, viskoosina öljynä. TLC (heksaani-EtOAc-seos, 3:1): Rf = 0,75, UV ja PMA. Huomautus: rinnakkaisia jodidituotetäpliä, joissa 5 mukana bromidilähtöainetta.) 4} (S)-4-(dietoksifosfinyyli)-3-/771/1-dimetyyli-etyyli ) difenyylisilyl/7oksi7butaanihappo, metyyliesteri

Liuosta, joka sisälsi jodidia (7,691 g) trietyyli-fosfiitissa (20 ml), kuumennettiin 155°C:ssa (öljyhaude) 10 3,5 tuntia argonin alla. Seos jäähdytettiin ja fosfiitti- ylimäärä tislattiin pois alipaineessa (0,5 mmHg, 75°C), jolloin jäi jäljelle keltainen öljy (noin 8,0 g). Epäpuhdas öljy puhdistettiin flash-kromatografiakäsittelyllä käyttäen adsorbenttina silikageeliä (400 g) ja eluenttina 15 heksaani-asetoniseosta (4:1). Tuotejakeet haihdutettiin, jolloin saatiin 3,222 g (41,5 %) haluttua otsikon mukaista fosfonaattia kirkaana, värittömänä, viskoosina öljynä. TLC (heksaani-asetoniseos, 1:1): Rf = 0,51 UV ja PMA. Lisäksi saatiin takaisin 2,519 g lähtöaineena käytetystä, 20 osassa (3) valmistetusta jodidista (korjattu saanto 61,1 %).

5) (S)-3-/77l, 1-dimetyylietyyli) difenyylisilyl7-oksi/-4-foSfonobutaanihappo, metyyliesteri

Liuokseen, joka sisälsi osassa (4) valmistettua 25 fosfonaattia (9,85 g, 20,0 mmol) kuivassa CH2Cl2:ssa (60 ml), lisättiin perätysten bistrimetyylisilyylitri-fluoriasetamidia (BSTFA)(5,31 ml, 32,0 mmol, 1,6 ekv.) ja trimetyylisilyylibromidia (TMSBr)(6,60 ml, 50,0 mmol, 2,5 ekv.) ja tulokseksi saatua kirkasta seosta sekoi-. \ tettiin argonin alla huoneen lämpötilassa yön yli. Lisät- tiin 5-%:ista KHSO^:a (80 ml) ja seos uutettiin EtOAc:lla. Vesifaasi kyllästettiin NaCl:lla ja uutettiin : : : uudelleen EtOAc:lla. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pes- -· tiin kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin vedettömällä

Na2SO^:lla ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 38 89493 puhdistamatonta otsikon mukaista fosfonihappoa viskoosina öljynä. TLC (iPrOH-NH4OH-H20-seos, 7:2:1): Rf = 0,30, UV j a PMA.

6) (S)— 3 —/7T1,1-dimetyylietyyli)difenyylisilyl7· 5 oksi7-4-(hydroksimetoksifosfinyyli)butaanihappo, metyyli-esteri

Osassa (5) saatuun puhdistamattomaan fosfonihap-poon (noin 20,0 mmol), joka oli sekoitettu kuivaan pyri-diiniin (25 ml), lisättiin CH20H:a (kuivattu 3 A:n mole-10 kyyliseuloilla; 1,62 ml, 40,0 mmol, 2,0 ekv.) ja disyklo-heksyylikarbodi-imidiä (DCC) (4,54 g, 22,0 mmol, 1,10 ekv.) ja tulokseksi saatua valkoista suspensiota sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa yön yli. Pyridiini poistettiin alipaineessa ja sen jälkeen suori-15 tettiin atseotrooppinen tislaus bentseenin kanssa (2 x 15 ml). Jäljelle jäänyt öljy liuotettiin EtOAc:iin ja liuos suodatettiin, pestiin 1,0 N HCl:lla ja kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin vedettömällä Na2S04:lla ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 8,272 g puh-20 distamatonta otsikon mukaista esteriä öljynä, joka sisälsi pienen määrän saostunutta disykloheksyyliureaa (DCU). TLC (iPr0H-NH40H-H20-seos, 7:2:1): Rf = 0,60, UV ja PMA.

F. (S)-4-^7ffi1-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bife-nyl)-2-yyli7metoksifosfinyyli7-3-(5-butyyli)difenyyli-2 5 silyl7oksi7but.aanihappo, metyyliesteri

Osassa E saatu puhdistamaton fosfonihappomonoes-teri (6,595 g, noin 14,7 mmol) liuotettiin kuivaan CH2Cl2:iin (30 ml), liuokseen lisättiin tislattua trime-tyylisilyylidietyyliamiinia (5,60 ml, 29,4 mmol, 2,0 ekv.) 30 ja seosta sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa 1 tunti. Seos haihdutettiin alipaineessa uudelleen bentseeniä (1 x 30 ml) apuna käyttäen ja kuivattiin alipaineessa. Vaaleankeltainen viskoosi öljy liuotettiin kuivaan CH2Cl2:iin (30 ml) ja DMF:iin (kuivattu 4 A:n 35 molekyyliseuloilla; 2 pisaraa), kirkas liuos jäähdytettiin -10°C:seen (suola-jäähaude) ja siihen lisättiin li s 39 89493 ruiskulla pisaroittain tislattua oksalyylikloridia (1,41 ml, 16,2 mmol, 1,1 ekv.). Ilmeni voimakas kaasun kehittyminen ja liuos muuttui väriltään syvemmän keltaiseksi. Seosta sekoitettiin argonin alla -10°C:ssa 15 mi-3 nuuttia, jonka jälkeen sitä sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1 tunti. Seos haihdutettiin alipaineessa ja uudelleen bentseeniä (1 x 30 ml) apuna käyttäen ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin puhdistamatonta fosfonoklo-ridaattia keltaisena öljynä.

10 Liuokseen, joka sisälsi puhdistamatonta fosfono- kloridaattia (noin 14,7 mmol) kuivassa Cl^C^rssa (10 ml), lisättiin pisaroittain liuos, joka sisälsi osassa D valmistettua bifenyylialkoholia (2,06 g 8,43 mmol) kuivassa pyridiinissä (15 ml) ja tulokseksi saatua seosta sekoili tettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 16 tuntia.

Seos haihdutettiin kuiviin alipaineessa ja jäännös jaettiin 5-%risen KHSO^rn ja EtOAcrn kesken.

Orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaHCO^:lla ja kylläisellä NaClrlla, kuivattiin sitten vedettömällä 20 Na2S0^:lla ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 8,290 g ruskeaa öljyä. Raakatuote puhdistettiin flash-kromatografiakäsittelyllä käyttäen adsorbenttina silika-geeliä (370 g) ja eluenttina heksaani-asetoniseosta (70:30). Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jol-25 loin saatiin 3,681 g (66 %) haluttua otsikon mukaista fosfonaattia vaaleankeltaisena öljynä. TLC (heksaani-asetoniseos, 3:2): Rf = 0,59, UV ja PMA.

G. (S)-4-/7' "f luori“3,3 ' , 5-trimetyyli (1,1 ’ -bifenyl)-2-yyli7metoksifosfinyyli/-3-hydroksibutaanihappo, 30 metyyliesteri

Seokseen, joka sisälsi osassa F valmistettua si-lyylieetteriä (1,103 g, 1,66 mmol) kuivassa THF:ssa (20,0 ml), lisättiin jääetikkaa (380 ^ul, 6,64 mmol, 4,0 ekv.) ja 1,0 M tetrabutyyliammoniumfluoridi-liuosta 35 (4,98 ml, 4,98 mmol, 3,0 ekv.) ja tulokseksi saatua kirkasta keltaista liuosta sekoitettiin huoneen lämpö- 40 89 493 tilassa argonin alla yön yli. Seos jaettiin kylmän veden ja EtOAc:n kesken ja orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaHCO^rlla ja kylläisellä NaCl:lla, kuivattiin vedettömällä Na^O^illa ja haihdutettiin viskoosiksi keltaiseksi öljyksi (1,174 g). Epäpuhdas öljy puhdis-5 tettiin flash-kromatografiakäsittelyllä käyttäen adsorbent-tina silikageeliä (47 g) ja eluenttina CH2Cl2-asetoniseos-ta (85:15). Tuotejakeet haihdutettiin, jolloin saatiin 679 mg (93,1 %) haluttua otsikon mukaista alkoholia kirkkaana viskoosina öljynä. TLC (heksaani-asetoniseos, 1:1): 10 Rf = 0,41, UV ja PMA.

H. (S) -4-,/774 1 - fluori-3,3 1 , 5-tr ime tyyli (1,1' -bife-nyl)-2-yyli7metoksi7metoksifosfinyyli/-3-hydroksibutaani-happo, monolitiumsuola

Liuokseen, joka sisälsi osassa G valmistettua metyy-15 liesteriä (184 mg, 0,420 mmol) dioksaanissa (5,0 ml), lisättiin 1,0 LiOH:a (0,50 ml, 1,2 ekv.) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 3 tuntia. Seos laimennettiin vedellä, suodatettiin 0,4 ^um:n polykarbo-naattikalvon läpi ja haihdutettiin alipaineessa. Jäännös 20 liuotettiin veteen (75 ml), jäädytettiin ja kylmäkuivatuin. Epäpuhdas happo liuotettiin mahdollisimman pieneen määrään vettä ja käsiteltiin kromatografisesti 100 ml:n CHP-20 -hartsikerroksella ja käyttäen eluoinnissa lineaarista H^O-CH^CN-gradienttia. Tuotejakeet haihdutettiin, 25 jäännös liuotettiin veteen (50 ml) ja liuos suodatettiin 0,4 ^um:n polykarbonaattikalvon läpi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 174 mg (89,1 % hydraatin massaan perustuen) haluttua otsikon mukaista monolitiumsuolaa valkoisena kiinteänä aineena. TLC (iPr0H-NH^0H-H20-seos, 7:2:1): 30 Rf = 0,58, UV ja PMA.

Alkuaineanalyysi (C^H^OgPFLi + 1,95 mol H^O; M = 465,46): laskettu: C, 54,19; H, 6,26; F, 4,08; P, 6,65 todettu: C, 54,19; H, 6,21; F, 4,29; P, 6,43 1H-NMR (400 MHz): li i 41 89493 £l,74 - 2,08 ppm (2 H, m, -PO (OCH-,) CH^-) 2,30 (3 H, s, aromaattinen metyyli) 2,32 (3 H, d, Οί-asemassa fluoriin näh den sijaitseva aromaattinen metyy-5 li, JHF = 2,2 Hz) 2,35 - 2,62 (2 H, m, -CH2CQ2Li) 2,46 (3 H, s, aromaattinen metyyli) 3,57 & 3,63 (3 H, 2 duplettia, -OP(OCH3)-, 10 2 diastereomeeria, J„ =10,3 H-p

Hz) 4,28 (1 H, m, -CH^CH(OH)CH^CO^Li)

O

II

4,97 (2 H, m, PhOH2OP(OCH3)R) 15 6,87 - 7,25 (5 H, m, aromaattiset H:t)

Esimerkki 2 (S) - 4-^^4 ' - f luori-3,3 ' , 5-tr ime tyyli (1,1' -bifenyl) -2-yyli7metoksi7hydroksifosfinyyli7-3-hydroksibutaanihappo, dilitiumsuola 20 Liuokseen, joka sisälsi esimerkin 1 mukaista dieste- riä (374 mg, 0,853 mmol) dioksaanissa (8,0 ml), lisättiin 1,0 N LiOH:a (2,6 ml, 3,0 ekv.) ja seosta kuumennettiin 50°C:ssa (öljyhaude) argonin alla 5 tuntia. Muodostui valkoinen sakka. Seos laimennettiin vedellä ja suodatettiin. 25 Vesiliuos uutettiin kertaalleen Et20:lla, suodatettiin 0,4 ^um:n polykarbonaattikalvon läpi ja haihdutettiin alipaineessa. Raakatuote käsiteltiin kromatografisesti CHP-20 -hartsilla (100 ml:n kerros) käyttäen eluoinnissa lineaarista H20-CH3CN-gradienttia. Tuotejakeet haihdutettiin 30 alipaineessa, jäännös liuotettiin veteen (50 ml) ja liuos suodatettiin 0,4 ^um:n polykarbonaattikalvon läpi ja kylmä-kuivattiin, jolloin saatiin 260 mg (67,1 % hydraatin massaan perustuen) haluttua otsikon dilitiumsuolaa valkoisena kiinteänä aineena. TLC (PrOH-NH^OH-H^-seos, 7:2:1): Rf = 0,47, ‘ 35 UV j a PMA.

42 89493

Alkuaineanalyysi (C2()H2206PFLi2 + 1,77 mol H20) : laskettu: C, 52,88; H, 5,67; F, 4,18; P, 6,82 todettu: C, 52,88; H, 5,26; F, 4,24; P, 6,43 1H-NMR (400 MHz, CD3OD):

5 O

c H

O 1,69 ppm (2 H, m, -0PCH2CH(0H)-) 2,26 - 2,42 (2 H, m, CH2C02Li) 2.30 (3 H, s, aromaattinen metyyli) 2.31 (3 H, d, Qd-asemassa F:iin nähden si- 10 jaitseva aromaattinen metyyli, JUT, = rir 1,9 Hz) 2,38 (3 H, s, aromaattinen metyyli) 4,22 (1 H, m, -CH(OH)CH2~)

O

II

15 4,75 (2 H, m, PhCH2OP~) 6,86-7,23 (5 H, M, aromaattiset protonit)

Esimerkki 3 (3 S)-4-//(4’-fluori-3,31-5-trimetyyli(1,1'-bifenyl)-2-yyli/metoksi7metyylifosfinyyli7-3-hydroksibutaanihappo, 20 monolitiumsuola A. (S)-4-/7kloori)metyylifosfinyyli7-3-/77l,1-dime-tyylietyyli)difenyylisilyl7oksi7butaanihappo, metyyliesteri

Otsikon mukainen fosfinokloridaattiyhdiste valmistetaan esimerkin 6 B-osan kolmessa ensimmäisessä kappalees-25 sa kuvatulla tavalla.

B. (3S)~ 4-(7£41-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,11-bife-nyl)-2-yyli7metoksi7metyylifosfinyyli7-3-(t-butyyli)dife-nyylisilyloksibutaanihappo, metyyliesteri Jäähdytettyyn (0°C, jäähaude) liuokseen, joka sisäl-si osan A mukaista fosfinokloridaattia (noin 2,2 mmol) ja esimerkin 1 osassa C(2) valmistettua bifenyylialkoholia (429 mg, 2,2 mmol, 1,0 ekv.) kuivassa CH2Cl2:ssa (10 ml), lisättiin Et^Nra (4,25 ^ul, 3,04 mmol, 1,4 ekv.) ja 4-DMAP:tä (27 mg, 0,22 mmol) ja tulokseksi saatua oranssia 35 liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla yön yli. Seos jaettiin 5-%:isen KHSO^n ja EtOAc:n li i 43 39493 kesken ja orgaaninen kerros pestiin kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin vedettömällä Na^SO^illa ja haihdutettiin, jolloin saatiin 1,1 g oranssia öljyä. Epäpuhdas öljy puhdistettiin flash-kromatografiakäsittelyllä käyttäen 5 adsorbenttina LPS-1 -silikageeliä (44 g) ja eluenttina EtOAc-heksaaniseosta (1:1). Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 298 mg (21 %) haluttua otsikon mukaista kondensaatiotuotetta vaaleankeltaisena öljynä. Saatiin myös takaisin 460 mg lähtöaineena käytettyä, 10 esimerkin 1 osassa C(2) valmistettua bifenyylialkoholia (korjattu saanto 67 %). TLC (EtOAc-heksaaniseos, 1:1): Rf = 0,18, UV ja PMA.

C. (3 S)-4-/7^4'-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bife-nyl)-2-yyli/metoksi/metyylifosfinyyli/-3-hydroksibutaani- 15 happo, metyyliesteri

Liuokseen, joka sisälsi osassa B valmistettua silyy-lieetteriä (298 mg, 0,46 mmol) kuivassa THF:ssa (6,0 ml), lisättiin jääetikkaa (110 ^ul, 1,84 mmol, 4,0 ekv.) ja 1,0 M tetrabutyyliammoniumfluoridin THF-liuosta (1,43 ml, 20 3,1 ekv.) ja tulokseksi saatua liuosta sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa yön yli. Seos jaettiin kylmän veden ja EtOAcrn kesken ja orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaHC03:lla ja kylläisellä NaCl :11a, kuivattiin vedettömällä Na2SC>4:lla ja haihdutet-25 tiin keltaiseksi öljyksi (273 mg). Epäpuhdas öljy puhdistettiin flash-kromatografiakäsittelyllä käyttäen adsorbenttina LPS-1 -silikageeliä (11 g) ja eluenttina heksaani-asetoniseosta (3:2). Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 150 mg (80 %) haluttua otsikon 30 mukaista alkoholia viskoosina öljynä. TLC (heksaani-aseto-niseos, 1:1): Rf = 0,23, UV ja PMA.

D. (33)-4-^,/^41 - fluori-3,3 1 , 5-tr ime tyyli (1,1' -bife-nyl)-2-yyli7metoksi7metyylifosfinyyli7-3-hydroksibutaani- happo, monolitiumsuola 35 Liuokseen, joka sisälsi osassa C valmistettua metyy- liesteriä (150 mg, 0,367 mmol) dioksaanissa (3,0 ml) lisät- 44 89493 tiin 1,0 N LiOH:a (0,44 ml, 1,2 ekv.) ja tulokseksi saatua valkoista suspensiota sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 2 tuntia. Seos laimennettiin vedellä, suodatettiin 4^um:n polykarbonaattikalvon läpi ja haihdutettiin ali-5 paineessa värittömäksi lasimaiseksi aineeksi.

Raakatuote liuotettiin mahdollisimman pieneen määrään vettä ja käsiteltiin kromatografisesti käyttäen ad-sorbenttina HP-20:tä (100 ml:n kerros) ja eluoinnissa lineaarista i^O-CH^CN-gradienttia. Tuotejakeet haihdutettiin, 10 jäännös liuotettiin veteen (50 ml) ja liuos suodatettiin 0,4 ^um:n polykarbonaattikalvon läpi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 130 mg (79 % hydraatin massaan perustuen) haluttua otsikon mukaista litiumsuolaa valkoisena kiinteänä aineena. TLC (CH2Cl2-CH3OH-HOAc-seos, 8:1:1): Rf = 0,52, 15 UV ja PMA.

Alkuaineanalyysi (C2iH25°5FLiP + 1,73 mol H20; M = 445,49): laskettu: C, 56,61; H, 6,44; F, 4,26; P, 6,95 todettu: C, 56,67; H, 6,36; F, 4,31; P, 7,43 XH-NMR (400 MHz):

20 O

C

o 1,49 ppm (3 H, d, -0P(CH3)-, JH_p=14,7 Hz)

O

H

1,83 - 2,0 (2 H, m, P-(CH3)CH2-) 2,27-2,40 (2 H, m, CH2C02Li) 25 2,30 (6 H, s, 2 aromaattista metyyliä) 2,44 (3 H, s, aromaattinen metyyli) 4,26 (1 H, m, -CH2CH(OH)CH2C02Li)

O

I) 4,87 (2 H, m, ArCH2OP(CH3)-) 30 6,90 - 7,20 (5 H, m, aromaattiset H:t)

Esimerkki 4 (S) -4-^T*2,4-dikloori-6-/74-fluorifenyyli)metoksi7-fenyyli7metoksi7metoksifosfinyyli7-3-hydroksibutaanihappo, monolitiumsuola 35 A. 2,4-dikloori-6-/T4-fluorifenyylijmetoksi/bentsal- dehydi [Viite: J. Med. Chem. 29 (1986) 167] l· 45 89493

Liuosta, joka sisälsi 4,6-dikloori-2-hydroksibent-saldehydiä (13,77 g, 72,5 mmol) DMFrssä (100 ml), sekoitettiin ja siihen lisättiin K2CC>3:a (12,02 g, 87 mmol). Tätä seosta kuumennettiin noin 70°C:ssa 60 minuuttia, jonka jäl-5 keen siihen lisättiin 4-fluoribentsyylibromidia (11,7 ml). Tulokseksi saatua liuosta sekoitettiin 70°C:ssa 3,5 tuntia, jonka jälkeen se kaadettiin jääveteen (1,5 1), ja sakka erotettiin suodattamalla, pestiin vedellä ja kiteytettiin uudelleen Et20-petrolieetteriseoksesta. Saatiin 17,88 g 10 (83 %) likaisenvalkoisia kiteitä, sp. 107 - 108°C.

B. 2,4-dikloori-6-/T4-fluori fenyyli)metoksi/bent-seenimetanoli

Kylmään (0°C, jäähaude) kuivaan Etoviin (10,0 ml) lisättiin LiAlH4:ä (158 mg, 4,16 mmol, 0,6 ekv.), ja synty-15 neeseen harmaaseen suspensioon lisättiin pisaroittain liuos, joka sisälsi osassa A valmistettua aldehydiä (2,06 g, 6,93 mmol) kuivassa THF: ssa (10 ml). Seos lämmitettiin huoneen lämpötilaan ja sitä sekoitettiin 1 tunti argonin alla. Seos jäähdytettiin takaisin 0°C:seen (jäähaude) ja 20 siihen lisättiin peräkkäin pisaroittain vettä (160 yul), 15-%:ista NaOH:a (160 yul) ja vettä (475 yul) . Saostuneet suolat poistettiin tiiviisti pakkautuneen piimään (1/4 tuuman kerros), jonka päällä oli vedetöntä Na^SO^ja, läpi suodattamalla. Kirkas suodos haihdutettiin, jolloin saatiin 25 2,052 g (98,9 %) puhdistamatonta alkoholia valkoisina ki teinä. Triturointi kylmän heksaanin kanssa tuotti tulokseksi 1,892 g (91,2 %) puhdasta otsikon mukaista alkoholia valkoisena kiteisenä aineena, jonka sulamispiste oli 72 -73°C. TLC (heksaani-asetoniseos, 4:1): Rf = 0,31, UV ja : - 30 PMA.

Alkuaineanalyysi (C-j^H^C^C^F; M = 301,142): laskettu: C, 55,84; H, 3,68; Cl, 23,55; F, 6,31 todettu: C, 55,97; H, 3,71; Cl, 23,42; F, 6,30 46 89493 C. (S) “4-CCC2· · 4-dikloor 1-6-/74-f luorifenyyli) metok- si? fenyyli7metoksi7metoksifosfinyyli/-3-(t-butyyli)dife-nyylisilyloksibutaanihappo, metyyliesteri

Liuokseen, joka sisälsi esimerkin 1 osassa E(6) val-5 mistettua metyyliesteriä (noin 3,84 mmol) kuivassa CH2Cl2:ssa (10 ml), lisättiin tislattua trimetyylisilyyli-dietyyliamiinia (1,46 ml, 7,68 mmol, 2,0 ekv.) ja tulokseksi saatua liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 1 tunti. Seos haihdutettiin alipaineessa 10 uudelleen bentseeniä (1 x 20 ml) apuna käyttäen ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin puhdistamatonta sily-loitua fosfonihappomonometyyliesteriä värittömänä öljynä.

Liuos, joka sisälsi puhdistamatonta esteriä (noin 3.84 mmol) kuivassa CH2Cl2:ssa (10 ml) ja kuivassa DMFrssa 15 (1 pisara), jäähdytettiin -10°C:seen (suola-jäähaude) ja siihen lisättiin pisaroittain tislattua oksalyylikloridia (368 yUl, 4,22 mmol, 1,1 ekv.). Ilmeni kaasun kehittymistä kirkkaasta keltaisesta liuoksesta. Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 1 tunti ja se haihdu-20 tettiin alipaineessa uudelleen bentseeniä (2 x 20 ml) apuna käyttäen, jolloin saatiin puhdistamatonta fosfonoklo-ridaattia viskoosina keltaisena öljynä.

Puhdistamattomaan fosfonokloridaattiin (noin 3.84 mmol), joka oli liuotettu kuivaan CH2Cl2:iin (10 ml), 25 lisättiin 0°C:ssa (jäähaude) osassa B valmistettua alkoholia (1,15 g, 3,84 mmol, 1,0 ekv.) ja sen jälkeen Et^N:a (805 ^ul, 5,76 mmol, 1,5 ekv.) ja 4-DMAP:a (47 mg, 0,384 mmol, 0,1 ekv.) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla yön yli· Seos jaettiin 30 5-%:isen KHSO^:n ja EtOAcrn kesken, ja orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin vedettömällä Na?SO^:lla ja haihdutettiin, jolloin saatiin 3,197 g tummanruskeaa öljyä. Raakatuote puhdistettiin flash-kroma-tografiakäsittelyllä käyttäen adsorbenttina silikageeliä 35 (160 g) ja eluenttina heksaani-EtOAc-seosta (7:3). Tuote- jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 594 g (21,1 %) haluttua otsikon mukaista fosfonaattia kel- 47 89493 täisenä öljynä. Lisäksi saatiin takaisin 688 mg lähtöaineena käytettyä, osassa B valmistettua alkoholia (korjattu saanto 52,4 %). TLC (heksaani-asetoniseos, 1:1): Rf = 0,29, UV ja PMA.

5 D. (S)4-dikloori-6-/T4-fluorifenyyli)metok- si7 fenyyli7metoksi7metoksifosfinyyli7-3-hydroksibutaani-happo, metyyliesteri

Liuokseen, joka sisälsi osassa C valmistettua silyy-liesteriä (578 mg, 0,788 mmol) kuivassa THF:ssa (8 ml), li-10 sättiin jääetikkaa (180 ^ul, 3,2 mmol, 4,0 ekv.) ja sen jälkeen 1,0 M n-Bu^NF:n THF-liuosta (2,36 ml, 2,36 mmol, 3,0 ekv.) ja tulokseksi saatua vaaleankeltaista liuosta sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa yön yli.

Seos kaadettiin kylmään veteen ja uutettiin EtOAc:lla 15 (2 x). Orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaHCO^:lla ja kylläisellä NaCl:lla, kuivattiin vedettömällä Na2SO^:lla ja haihdutettiin, jolloin saatiin 625 mg keltaista öljyä. Raakatuote puhdistettiin flash-kromatografiakäsittelyllä käyttäen adsorbenttina silikageeliä (31 g) ja eluenttina 20 heksaani-asetoniseosta (7:3). Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 339 mg (86,9 %) haluttua . . otsikon mukaista alkoholia kirkkaana, värittömänä viskoosi na öljynä. TLC (heksaani-asetoniseos, 1:1): Rf = 0,25, UV ja PMA.

25 E. (S) ~4-^jiC2,4-dikloori-6-/74-fluorifenyyli) metok- si7fenyyli7metoksi7metoksifosfinyyli7-3-hydroksibutaani-happo, monolitiumsuola

Liuokseen, joka sisälsi osassa D valmistettua fosfonaattia (132 mg, 0,267 mmol) dioksaanissa (2,5 ml), 30 lisättiin 1,0 N LiOHta (0,32 ml, 1,2 ekv.) ja seosta sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa 4,0 tuntia. Havaittiin muodostuvan valkoinen sakka. Seos laimennettiin vedellä ja suodatettiin ja suodos haihdutettiin kuiviin alipaineessa. Jäännös käsiteltiin kromatografisesti HP-20 :·· 35 -hartsilla (100 ml:n kerros) käyttäen eluoinnissa lineaa rista H^O-CH^CN-gradienttia. Tuotejakeet yhdistettiin ja 48 b 9 493 haihdutettiin, jäännös liuotettiin veteen ja liuos suodatettiin 0,4 ^um:n polykarbonaattikalvon läpi ja kylmä-kuivattiin, jolloin saatiin 108 mg (79 % hydraatin massaan perustuen) haluttua otsikon mukaista litiumsuolaa valkoi-5 sena kiinteänä aineena. TLC (CI^C^-CH^OH-HOAc-seos, 20:1:1): Rf = 0,41, UV ja PMA.

Alkuaineanalyysi (C19H1807Cl2FLi2P + 1,42 mol H20; M = 511,72): laskettu: C, 44,59; H, 4,10; Cl, 13,86; F, 3,71; P, 6,05 10 todettu: C, 44,22; H, 4,09; Cl, 13,91; F, 3,72; P, 6,11 1H-NMR (400 MHz):

O

O 1,98 - 2,11 ppm (2 H, m, OP(OCH3)CH2CH(OH)- 2,26 - 2,45 ppm (2 H, m, -CH(OH)CH2C02Li) 15 3,63 & 3,62 (3 H, 2 duplettia, 2 diastereomeeria,

O

II

OP(OCH3)CH2-, JHp-ll Hz) 4.23 (1 H, m, (-CH2CH(0H)CH2C02Li) 20 5,16 (2 H, s, F-PhCH20) 5.24 (2 H, d, ArCH2OP, JHp=6,2 Hz) 7,13 - 7,53 (6 H, m, aromaattiset H:t)

Esimerkki 5 (3S)- 4 -f(2,4-dikloori-6-/74-fluorifenyyli)metoksi7-25 fenyyli7metoksi7hydroksifosfinyyli7-3-hydroksibutaanihappo, dilitiumsuola

Seokseen, joka sisälsi esimerkin 4 osassa D valmistettua diesteriä (210 mg, 0,424 mmol) dioksaanissa (4,0 ml), lisättiin 1,0 N LiOH:a (1,30 ml, 3,0 ekv.) ja tulokseksi 30 saatua väritöntä liuosta kuumennettiin 50°C:ssa (öljyhau- de) argonin alla 3,5 tuntia. 15 minuutin kuluttua havaittiin valkoinen sakka. Seos laimennettiin vedellä ja suodatettiin ja suodos haihdutettiin alipaineessa. Jäännös liuotettiin mahdollisimman pieneen määrään vettä ja käsi-35 teltiin kromatografisesti HP-20 -hartsilla (100 ml:n kerros) käyttäen eluoinnissa lineaarista H20-CH3CN-gradient- i 49 89493 tia. Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin. Jäännös liuotettiin veteen (50 ml) ja liuos suodatettiin 0,4 ^um:n polykarbonaattikalvon läpi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 175 mg (81 % hydraatin massaan perustuen) 5 haluttua otsikon mukaista dilitiumsuolaa valkoisena kiinteä-nä aineena. TLC (CH2Cl2-CH3OH-HOAc-seos, 8:1:1): Rf = 0,07/ UV ja PMA.

Alkuaineanalyysi (C-^Hj 6C>7Cl2FLi2P + 1,70 mol H20; M = 509,62) : 10 laskettu: C, 42,42; H, 3,84; F, 3,73; Cl, 13,91; P, 6,08 todettu: C, 42,46; H, 3,90; F, 3,93; Cl, 13,42; P, 5,66 1H-NMR (400 MHz):

15 O

II

1,73 - 1,92 ppm (2 H, m, -OP(OLi)-CH2CH(OH)- 2,27 (1 H, dd, -CH(OH)CHoC0~Li, J„ =8,8 Hz) —l nn 2,39 (1 H, dd, -CH(OH)CH2C02Li, JHH=4,4 Hz) 4,26 (1 H, m, CH2CH(OH)CH2C02Li) 20 5,08 (2 H, s, F-Ph-CH2OAr) 7,03 - 7,53 (6 H, m, aromaattiset H:t).

Esimerkki 6 (3S) -4- f CO- r 4-dikloori-6-/T4-f luorifenyyli) metoksi7~ fenyyli7metoksi7metyylifosfinyyli7-3-hydroksibutaanihappo, 25 metyyliesteri A. (3S)-/Y7l,1-dimetyylietyyli)difenyylisilyl7oksi7- 4-(etoksimetyylifosfinyyli)butaanihappo, metyyliesteri

Seosta, joka sisälsi esimerkin 1 osassa E(3) valmistettua jodidia (4,68 g, 9,18 mmol) metyylidietoksifosfii-30 nissa (Strem Chemicals; 5,0 g 36,7 mmol), kuumennettiin 100°C:ssa (öljyhaude) 2,5 tuntia ja sen jälkeen 150°C:ssa 3 tuntia lisää argonin alla. Keltaiseen liuokseen muodostui hitaasti valkoinen sakka. Fosfiiniylimäärä tislattiin pois alipaineessa (0,5 mmHg) ja raakatuote puhdistettiin 35 flash-kromatografiakäsittelyllä käyttäen adsorbenttina silikageeliä ja eluenttina heksaani-asetoniseosta (65:35).

50 ö9493

Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 1,590 g (38 %) haluttua otsikon mukaista fosfiinihap-poesteriä (diastereomeerien seos) kirkkaana viskoosina öljynä. TLC (heksaani-asetoniseos, 3:2): Rf (2 diastereomee-5 ria) = 0,19 ja 0,22 UV ja PMA.

B. (3S) “4-^2£2,4-dikloori-6-/T4-fluorifenyyli)netoksi fenyyli7metoksi7metyylifosfinyyli7-3-(t-butyyli)fenyy-lisilyylibutaanihappo, metyyliesteri

Liuokseen, joka sisälsi osassa A valmistettua fosfii-10 nihappoesteriä (605 mg, 1,3 mmol) kuivassa CH2Cl2:ssa (6,0 ml), lisättiin bis(trimetyylisilyyli)trifluoriaseta-midia (BSTFA) (280 ^ul), 1,05 mmol, 0,8 ekv.) ja trimetyy-lisilyylibromidia (TMSBr) (210 ^,ul, 1,57 mmol, 1,2 ekv.) ja tulokseksi saatua liuosta sekoitettiin huoneen lämpö-15 tilassa argonin alla yön yli. Lisättiin 5-%:ista KHSO^:a (15 ml) ja seos uutettiin EtOAc:lla. Orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin vedettömällä Na2SO^:lla ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin puhdistamatonta fosfiinihappoa värittömänä öljynä.

20 Liuokseen, joka sisälsi puhdistamatonta fosfiini- happoa (noin 1,3 mmol) kuivassa CH2Cl2:ssa (6,0 ml), lisättiin tislattua trimetyylisilyylidietyyliamiinia (270 ^ul, 1,44 mmol, 1,1 ekv.) ja tulokseksi saatua kirkasta seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 1 tunti.

25 Seos haihdutettiin alipaineessa uudelleen bentseenistä.

(1 x 15 ml) apuna käyttäen ja kuivattiin alipaineessa.

Jäähdytettyyn (0°C, jäähaude) liuokseen, joka sisälsi puhdistamatonta silyloitua fosfiinihappoa (noin 1,3 mmol) kuivassa CH2Cl2:ssa (6,0 ml) ja DMF:ssa (1 pisara), lisät-30 tiin ruiskulla pisaroittain tislattua oksalyylikloridia (130 ^ul, 1,44 mmol, 1,1 ekv.). Ilmeni kaasun kehittymistä. Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 1 tunti ja sen jälkeen se haihdutettiin alipainessa uudelleen bentseeniä (2 x 15 ml) apuna käyttäen ja kuivat-35 tiin alipaineessa, jolloin saatiin puhdistamatonta fosfino-kloridaattia keltaisena öljynä.

51 89493 Jäähdytettyyn (0°C, jäähaude) liuokseen, joka sisälsi fosfinokloridaattia (noin 1,3 mmol) ja esimerkin 1 osassa E(6) valmistettua alkoholia (392 mg, 1,3 mmol) kuivassa Cl^C^issa (6,0 ml), lisättiin Et^N:a (275 ^ul, 1,97 mmol, 5 1,5 ekv.) ja 4-DMAP:tä (16 mg, 0,13 mmol, 0,1 ekv.) ja tulokseksi saatua seosta sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa yön yli. Seos jaettiin 5-%:isen KHSO^:n ja EtOAcfn kesken ja orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin vedettömälle lä Na2S0^:lla ja haihdutettiin, jolloin saatiin 908 mg raa-katuotetta tummankeltaisena öljynä. Raakatuote puhdistettiin flash-kromatografiakäsittelyllä käyttäen adsorbentti-na silikageeliä (45 g) ja eluenttina heksaani-EtOAc-seos-ta (3:2). Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jol-15 loin saatiin 266 mg (28,3 %) haluttua otsikon mukaista tuotetta kirkkaana värittömänä öljynä. Saatiin myös takaisin 197 mg lähtöaineena käytettyä alkoholia (korjattu saanto 57 %) .

C. ( 3S) -4-/^2,4-dikloori-6-/T4-f luorif enyyli) metok- 2 0 si7 fenyyli7metoksi7metyylifosfinyyli7-3-hydroksibutaani- happo, metyyliesteri

Liuokseen, joka sisälsi osassa B valmistettua silyy-liesteriä (275 mg, 0,38 mmol) kuivassa THFsssa (6,0 ml), lisättiin jääetikkaa (90 ^ul, 1,53 mmol, 4,0 ekv.) ja 1,0 M 25 tetrabutyyliammoniumfluoridin THF-liuosta (1,2 ml, 3,1 ekv.). Tulokseksi saatua liuosta sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa yön yli. Seos jaettiin kylmän .. . veden ja EtOAcrn kesken ja orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaHCO^lla ja kylläisellä NaClrlla, 30 kuivattiin vedettömällä NaSO^:lla ja haihdutettiin, jolloin saatiin 258 mg keltaista öljyä. Raakatuote puhdistettiin flash-kromatografiakäsittelyllä käyttäen ad-sorbenttina LPS-1 -silikageeliä ja eluenttina heksaani-asetoniseosta (1:1). Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutet-35 tiin, jolloin saatiin 142 mg (77 %) haluttua otsikon mukaista alkoholia kirkkaana värittömänä öljynä. TLC (heksaa-ni-asetoniseos, 1:1): Rf = 0,20, UV ja PMA.

52 89 493 D. (3S) -b-iCCZ, 4-dikloori-6-/T4-fluorifenyyli) -metoks i7 f enyyli7metoksi7metyylifosf inyylj7"3-hydroksibu-taanihappo, monolitiumsuola

Liuokseen, joka sisälsi osassa C valmistettua metyy-5 liesteriä (142 mg, 0,296 mmol) dioksaanissa (3,0 ml), lisättiin 1,0 N LiOH:a (0,36 ml, 1,2 ekv.) ja tulokseksi saatua valkoista suspensiota sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Seos laimennettiin vedellä ja suodatettiin 0,4 ^um:n polykarbonaattikalvon 10 läpi, ja suodos haihdutettiin alipaineessa.

Raakatuote liuotettiin mahdollisimman pieneen määrään vettä ja käsiteltiin kromatografisesti HP-20 -hartsilla (100 ml:n kerros) käyttäen eluoinnissa lineaarista H20-CH3CN-gradienttia. Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdu-15 tettiin. Jäännös liuotettiin veteen ja liuos suodatettiin polykarbonaattikalvon läpi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 93 mg (63 % hydraatin massaan perustuen) haluttua otsikon mukaista litiumsuolaa valkoisena kiinteänä aineena. TLC (CH2C12-CH3OH-HOAc, 8:1:1): Rf = 0,51, UV ja 20 PMA.

Alkuaineanalyysi (C^gH^gC^C^FLiP + 1,38 mol H20; M = 495,94) : laskettu: C, 46,01; H, 4,42; F, 3,83; Cl, 14,30; P, 6,24 25 todettu: C, 46,10; H, 4,49; F, 3,82; Cl, 14,32; P, 6,43 1H-NMR (400 MHz): I: i 53 89493 o

S 1,53 ppm (3 H, d, -OP(CH,)CH_- J

—3 ^ 2 ' JH-P

14,6 Hz)

O

K

1,87 - 2,10 (2 H, m, -OP(OCH^)CH2~) 5 2,27 (1 H, dd, -CH(OH)CH2C02Li, JH-H=8,4 Hz' JH-p=1'1 Hz> 2,38 (1 H, dd, -CH(OH)CH2C02Li, 4,7 Hz, JH_p=l,l Hz) 4,29 (1 H, m, -CH2CH(OH)CH2C02Li) 10 5,16 - 5,18 (4 H, m, ArCH2OP ja F-PhCH2Q)-)

7,11-7,52 (6 H, m, aromaattiset H:tJ

Esimerkki 7 (S)~4 -//7/¾’-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bifenyl)-2-yyli7metyyli/aminojmetoksifosfinyyli?-3-hydroksibutaani-15 happo, monolitiumsuola A. 4-fluori-3,31,5-trimetyyli(1,1'-bifenyyli)-2-karboksyylihappo

Liuokseen, joka sisälsi esimerkin 1 osassa C(2) valmistettua aldehydiä (1,0 g, 4,13 mmol) asetonissa 20 (10,0 ml), lisättiin 0°C:ssa (jäähaude) pisaroittain 8,0 N

Jones-reagenssia (4,1 ml, ylimäärin) ja tulokseksi saatua ruskeanvihreää suspensiota sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa yön yli. Hapetinylimäärä tuhottiin lisäämällä isopropanolia (10,0 ml) ja saostuneet kromisuolat 25 poistettiin suodattamalla seos piimään (1/4 tuuman kerros) läpi. Suodos haihdutettiin, jäännös liuotettiin EtOAc:iin ja liuos pestiin 1,0 N HCl:lla (2 x), kylläisellä NH^Cl:lla (2 x) ja kylläisellä NaCl:lla, kuivattiin sitten vedettömällä Na2SO^:11a ja haihdutettiin, jolloin saatiia 1,011 g 30 vihreää kiinteää ainetta, jonka sulamispiste oli 153 -154°c.

Epäpuhdas happo puhdistettiin valmistamalla siitä disykloheksyyliamiinisuola. Liuokseen, joka sisälsi puh-distamatonta happoa EtOAcrssa (5,0 ml), lisättiin disyk-35 loheksyyliamiinia (DCHA) (823 ^ul, 1,0 ekv.). Liuos laimennettiin heksaanilla ja saostunut kiteinen suola kerättiin 54 89493 talteen, jolloin saatiin 997 g (55 % aldehydistä laskettuna) haluttua tuotetta likaisen valkoisena kiteisenä DCHA-suolana, sp. 181 - 183°C.

DCHA-suola muunnettiin otsikon mukaiseksi 5 vapaaksi hapoksi jakamalla suola 5-%:isen KHSO^:n ja EtOAc:n kesken. Orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin vedettömällä Na2SO^:lla ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 554 mg (52 % aldehydistä laskettuna) haluttua otsikon mukaista happoa.

10 TLC (CH2Cl2-CH3OH-seos, 9:1): Rf = 0,37, UV ja PMA.

B, 41-fluori-3,31,5-trimetyyli(1,1'-bifenyyli)-2-karboksamidi

Suspensioon, joka sisälsi osassa A valmistettua happoa (554 mg, 2,14 mmol) kuivassa CH2Cl2:ssa (6,0 ml) ja 15 kuivassa DMF:ssa (1 pisara), lisättiin ruiskulla pisaroittaan 0°C:ssa (jäähaude) tislattua oksalyylikloridia (205 ^ul, 2,35 mmol, 1,1 ekv.) ja tulokseksi saatua kirkasta keltaista liuosta sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa 1 tunti. Seos haihdutettiin alipaineessa ja 20 uudelleen bentseeniä (2 x) apuna käyttäen ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin puhdistamatonta happokloridia keltaisena öljynä.

Jäähdytettyyn (0°C, jäähaude) THF:n (3,0 ml) ja väkevän NH^OH:n (2,0 ml, ylimäärin) seokseen lisättiin pisa-25 roittain liuos, joka sisälsi puhdistamatonta happokloridia THF:ssa (3,0 ml) ja tulokseksi saatua kirkkaanoranssia liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 1 tunti. Seos jaettiin veden ja EtOAc:n kesken ja orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaHC03:lla, 30 vedellä ja kylläisellä NaCl:lla, kuivattiin sitten vedettömällä Na2S0^:lla ja haihdutettiin, jolloin saatiin 528 mg (96,1 %) puhdistamatonta amidia vaaleanoranssina kiinteänä aineena. Kiteytettäessä se kertaalleen uudelleen EtOAc-heksaaniseoksesta saatiin 435 g (79,1 %) puhdistettua otsi-35 kon mukaista amidia vaaleankeltaisina neulasina, joiden sulamispiste oli 197 - 198°C. TLC (Et20-asetoniseos, 1:1):

Rf = 0,83, UV ja PMA.

55 89493 C. 4'-fluori-3,31,5-trimetyyli(1,11-bifenyyli)-2-metaaniamiini Jäähdytettyyn (0°C, jäähaude) kuivaan THF:iin (5,0 ml) lisättiin kiinteätä LiAlH^:a (125 mg, 3,3 mmol) 5 ja syntyneeseen harmaaseen suspensioon lisättiin pisaroittaan 5 minuutin aikana liuos, joka sisälsi osassa B valmistettua amidia (424 mg, 1,65 mmol) THFissa (5,0 ml). Tulokseksi saatua suspensiota sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 2,5 tuntia ja refluksoitiin sen jälkeen 10 45 minuuttia. Seos jäähdytettiin 0°C:seen (jäähaude) ja siihen lisättiin peräkkäin pisaroittain 125 ^ul vettä, 125 ^ul 15-%:ista NaOH:a ja 275 ^ul vettä. Saostuneet alumiinisuolat poistettiin tiiviisti pakkautuneen piimään, jonka päällä oli vedetöntä Na2S04:a, läpi suodattamalla.

15 Kirkas suodos haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin puhdistamatonta amiinia kirkkaana öljynä. TLC (Et20-aseto-niseos, 7:3): Rf = 0,60, UV ja PMA. Amiini puhdistettiin HCl-suolana.

Liuokseen, joka sisälsi epäpuhdasta amiinia (noin 20 1,65 mmol) absoluuttisessa EtOH:ssa (8,0 ml), lisättiin väkevää HCl:a (152 ^ul, 1,82 mmol) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 15 minuuttia. Seos haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin kiteistä valkoista ainetta. Tätä kiinteää ainetta trituroitiin kylmän Et20:n .·. 25 kanssa ja se kerättiin talteen suodattamalla ja kuivat tiin, jolloin saatiin 426 mg (92,4 %) otsikon mukaisen amiinin hydrokloridia hienoina valkoisina kiteinä.

D. (S)-^~CCCO^ '“flu°ri-3,31,5-trimetyyli(1,1'-bife-nyl)-2-yyli7metyyli7amino7metoksifosfinyyli7-3-(t-butyyli)- 30 difenyylisilyloksibutaanihappo, metyyliesteri

Liuokseen, joka sisälsi esimerkin 1 osassa E(6) valmistettua metyyliesteriä (noin 2,0 mmol) kuivassa CH2Cl2:ssa (5,0 ml), lisättiin tislattua trimetyylisilyylidietyyli-amiinia (758 ^ul, 4,0 mmol, 2,0 ekv.) ja tulokseksi saa-35 tua kirkasta seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla 1 tunti. Seos haihdutettiin alipaineessa uudelleen bentseeniä (1 x 15 ml) apuna käyttäen ja kuivattiin alipaineessa.

56 89 493 Jäähdytettyyn (0°C) liuokseen, joka sisälsi puhdis-tamatonta silyylifosfonaattia kuivassa Cf^C^issa (7,0 ml) ja DMF:ssa (1 pisara), lisättiin pisaroittain tislattua oksalyylikloridia (192 ^ul, 2,2 mmol, 1,1 ekv.). Kirkaasta 5 keltaisesta liuoksesta havaittiin kehittyvän kaasua. Liuosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1 tunti ja se haihdutettiin alipaineessa uudelleen bentseeniä (2 x 15 ml) apuna käyttäen ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin puhdistamatonta fosfonokloridaattia keltaisena viskoosina 10 öljynä.

Jäähdytettyyn (0°C) liuokseen, joka sisälsi fosfono-kloridaattia ja osassa C valmistettua bifenyyliamiini-HCl:a (416 mg, 1,49 mmol) kuivassa Cl^Clissa (10 ml), lisättiin Et3N:a (641 ^ul, 4,6 mmol, 2,3 ekv.) ja 4-DMAP:tä (24 mg, 15 0,2 mmol, 0,1 ekv.) ja tulokseksi saatua kirkasta keltais ta seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa argonin alla yön yli. Seos jaettiin 5-%:isen KHSO^:n ja EtOAc:n kesken ja orgaaninen faasi pestiin kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin vedettömällä Na2S0^:lla ja 20 haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 1,19 g keltaista öljyä. Raakatuote puhdistettiin flash-kromatografiakä-sittelyllä käyttäen adsorbenttina silikageeliä (60 g) ja eluenttina heksaani-asetoniseosta (7:3). Tuotejakeet haihdutettiin, jolloin saatiin 588 mg (59,5 %) haluttua otsikon 25 mukaista fosfonamidia vaaleankeltaisena viskoosina öljynä. TLC (heksaani-asetoniseos, 7:3): Rf = 0,20, UV ja PMA.

E. (S)-4~CCC& 1-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bife- nyl)-2-yyli7metyyli7amino7metoksifosfinyyli7-3-hydroksibu-taanihappo, metyyliesteri 30 Liuokseen, joka sisälsi osassa D valmistettua silyy- lieetteriä (588 mg, 0,888 mmol) kuivassa THF:ssa (10,0 ml), lisättiin jääetikkaa (203 ^ul, 3,55 mmol, 4,0 ekv.) ja 1,0 M tetrabutyyliammoniumfluoridin THF-liuosta (2,66 ml, 2,66 mmol, 3,0 ekv.) ja tulokseksi saatua liuosta sekoi-35 tettiin argonin alla huoneen lämpötilassa yön yli. Seos kaadettiin kylmään veteen ja uutettiin EtOAc:11a. Orgaani- i.

57 89 493 nen faasi pestiin kylläisellä NaHCO^lla ja kylläisellä NaCl:lla, kuivattiin sitten vedettömällä Na^O^lla ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 605 mg oranssia öljyä. Raakatuote puhdistettiin flash-kromatografia-5 käsittelyllä käyttäen adsorbenttina silikageeliä (36 g) ja eluenttina heksaani-asetoniseosta (1:1). Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 196 mg (50,4 %) haluttua otsikon mukaista alkoholia vaaleanorans-sina öljynä. TLC (heksaani-asetoniseos, 1:1): Rf = 0,16 UV 10 ja PMA.

F. (S) -b-CCC& ' - fluori-3,3 ',5-trimetyyli(1,1'-bife-nyl)-2-yyli7metyyli7amino7metoksifosfinyyli7-3-hydroksibu-taanihappo, monolitiumsuola

Liuokseen, joka sisälsi osassa E valmistettua di-15 esteriä (105 mg, 0,240 mmol) dioksaanissa (2,0 ml), lisättiin 1,0 N LiOH:a (288 ^,ul, 1,2 ekv. ) ja tulokseksi saatua valkoista suspensiota sekoitettiin argonin alla huoneen lämpötilassa 4 tuntia. Seos laimennettiin vedellä ja suodatettiin ja suodos haihdutettiin alipaineessa.

20 Jäännös käsiteltiin kromatografisesti HP-20 -hartsilla (100 ml:n kerros) käyttäen eluoinnissa lineaarista vesi-CH^CN-gradienttia. Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin. Jäännös liuotettiin veteen (50 ml) ja liuos suodatettiin 0,4 ^um:n polykarbonaattikalvon läpi ja kylmä-25 kuivattiin, jolloin saatiin 70 mg (62,7 % hydraatin massaan perustuen) haluttua otsikon mukaista litiumsuolaa valkoisena kiinteänä aineena. TLC (CH2Cl2-CH3OH-HOAc-seos, 20:1:1): Rf = 0,19, UV ja PMA.

.. . Alkuaineanalyysi (C2iH26N05PFLi + 2,41 mol H20; M = 30 472,75): ’ laskettu: C, 53,35; H, 6,57; N, 2,96; F, 4,02; ; P, 6,55 todettu: C, 53,35; H, 6,52; N, 2,98; F, 4,05; P, 6,59 35 1H-NMR (400 MHz): 58 89493 o S 1,79 - 1,97 ppm (2 H, m, -P (OCH-^) CH,,-) 2,26 - 2,44 ppm (2 H, m, -C^CC^Li 2,29 (3 H, s, aromaattinen metyyli) 2,31 (3 H, d, Qi-asemassa fluoriin näh- 5 den sijaitseva aromaatti nen metyyli, J„ =1,4 Hz) Γ1Γ 2,47 (3 H, aromaattinen metyyli) 3,46 & 3,50 (3 H, 2 duplettia, 2 diastereomee- 10 ria, JHp=10,5 Hz)

O

3,96 (2 H, m, -PhCH^HP (OCH3) - 4,17 (1 H, m, (-CH2CH(OH)CH2C02Li) 6,84 - 7,21 (5 H, m, aromaattiset protonit)

Esimerkit 8-20 15 . .

Noudattamalla edellä pääpiirteittäin esitettyjä ja aikaisemmissa työskentelyesimerkeissä kuvattuja menettelytapoja voidaan valmistaa seuraavat lisäyhdisteet: 59 89493

Esimerkin

__L_ _2__n__X_ RX

a- 0H <ö) CH2 10 H

cl-<2$- ^H3 9' C2H5° Cli2^py~ 2 NH CH3 10 lo) Γ3 io· c3h? (oy 1 ° li 15 /—Γ cl\2/ C2H5

11 · CH3° ^^-CH2"° 2 NH H

20 :S ©K,

12· 0H fo) 2 0 H

: 30 13· W <0>-ch2-o 1 0 *

(gföX

35 ^^C2H5 60 89493

Esimer kin

nro R _Z_ _n_ _X_ RX

1.4. C5h11 1 NH CH3 5 c»2-f , 0ir 10 =»3

15. OK C.H.-CH 2 0 OK

2 5 I

oo •£0- ch3 20 16· 0[te 2 0 or3

17. CH30 1 »H H

W 2 I I

-C0~·

H

30 I: 61 8S493

Esi merkin nr° ---------- n _ X R*

c2He~c-C-O

18’ CH, 7 \ " 1

OH

10 19· H0 <Ö>- a o Li 15 (δ) 20. CH O /7T\ /C\ 3 \Oy-\Q}— 1 NH h 20 62 89493

Esimerkki 21 (S)-4-(di-isopropyloksifosfinyyli)-3-//T1,1-dimetyy-lietyyli)difenyylisilyl7oksi7butaanihappo, metyyliesteri Esimerkin 1 osassa E(3) valmistettua jodidia 5 (21,70 g, 45,1 mmol) sekoitettiin suuressa alipaineessa 30 minuuttia. Siihen lisättiin yhdessä erässä vastatis-lattua tri-isopropyylifosfiittia (93,92 g, 113, 37 ml, 0,451 mol) ja reaktioseosta sekoitettiin argonin alla ja kuumennettiin 155°C:isessa öljyhauteessa 16,5 tuntia. Sen 10 jälkeen seos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Tri-isopropyylifosf iittiylimäärä ja haihtuvat reaktiotuotteet poistettiin lyhyttietislauksella (10 mmHg), jota seurasi Kugelrohr-tislaus (0,50 mmHg, 100°C, 8 tuntia). Tuote puhdistettiin edelleen flash-kromatografiakäsittelyllä 15 (6 tuuman pylväs, halkaisija 95 mm; Merckin silikageeli; eluenttina heksaani-asetoni-tolueeniseos, 6:3:1; virtausnopeus 2 tuumaa/min, 50 ml:n jakeita), jolloin saatiin 17,68 g (33,96 mmol, saanto 75 %) otsikon mukaista iso-propyylifosfonaattia kirkkaana viskoosina öljynä. TLC 20 (silikageeli; heksaani-asetoni-tolueeniseos, 6:3:1): Rf = 0,32 1HNMR: (270 MH , CDC1,) z 3 7,70 - 7,65 (m, 4H) 7,45 - 7,35 (m, 6H) 25 4,57 - 4,44 (m, 3H) 3,59 (s, 3H) 2,94 ja 2,88 (2 x d, 1H J = 3,7 Hz) 2,65 ja 2,60 (2 x d, 1H J = 7,4 Hz) 2,24 - 1,87 (joukko m:iä, 2H) 30 1,19 ja 1,12 (2 x d, 12H J = 6,3 Hz) 1,01 (s, 9H)

Esimerkki 22 (S)-4-(hydroksimetoksifosfinyyli)— 3 —/7T1,1-dimetyy-lietyyli)difenyylisilyl7oksi7butaanihappo, metyyliesteri, 35 disykloheksyyliamiinisuola (1:1)

Esimerkissä 21 valmistettua isopropyylifosfonaattia (10,66 g, 30,5 mmol) sekoitettiin huoneen lämpötilassa ar- i .

e3 89493 gonin alla kuivassa Cl^C^sssa (80 ml). Tähän liuokseen lisättiin pisaroittain 5 minuutin aikana bistrimetyylisi-lyylitrifluoriasetamidia (BSTFA) (8,44 g, 8,71 ml, 32,8 mmol) ja sen jälkeen pisaroittain 10 minuutin aika 5 trimetyylisilyylibromidia (TMSBr) (7,84 g, 6,75 ml, 51,3 mmol). Sen jälkeen kun reaktioseosta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 20 tuntia, siihen lisättiin 5-%:ista KHSO^rn vesiliuosta (200 ml) ja seosta sekoitettiin voimakkaasti 15 minuuttia. Vesikerros uutettiin kolmesti 10 etyyliasetaatilla. Orgaaniset uuttoliuokset yhdistettiin, pestiin kertaalleen kylläisellä NaCl-liuoksella, kuivattiin Na2S04:lla ja väkevöitiin alipaineessa. Jäännös tislattiin kahdesti atseotrooppisesti tolueenin kanssa (50 ml). Muodostunut sakka suspendoitiin tolueeniin ja 15 suodatettiin. Suodos väkevöitiin ja atseotroppinen tislaus/ suodatus -prosessi toistettiin. Tulokseksi saatu suodos haihdutettiin alipaineessa ja pidettiin sitten pumpulla aikaansaadussa suuressa alipaineessa 5 tuntia. Tulokseksi saatua viskoosia öljyä sekoitettiin argonin alla 20 huoneen lämpötilassa kuivassa pyridiinissä (50 ml). Tähän liuokseen lisättiin yhdessä erässä disykloheksyylikarbo-di-imidi(DCC) (4,65 g, 22,6 mmol), mitä seurasi metanolin (1,31 g, 1,67 ml, 41,0 mmol) lisäys. Sen jälkeen kun reaktioseosta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 20 tuntia, 25 se suodatettiin lasisintteriin muodostetun piimaakerroksen läpi. Piimää pestiin etyyliasetaatilla, ja yhdistetyt suo-: : : dokset haihdutettiin alipaineessa. Jäännös liuotettiin uudelleen etyyliasetaattiin ja pestiin kahdesti 5-%:isella KHSO^rn vesiliuoksella ja kerran kylläisellä NaCl-liuok-30 sella. Orgaaninen uuttoliuos kuivattiin Na2S04:lla ja suodatettiin, suodos väkevöitiin ja tislattiin kahdesti atseotrooppisesti tolueenin kanssa ja jäännös suspendoitiin tolueeniin ja suodatettiin. Tulokseksi saatu suodos väkevöitiin uudelleen, tislattiin atseotrooppisesti ja 35 suodatettiin ja suodos haihdutettiin alipaineessa ja sijoitettiin 6 tunniksi suureen alipaineeseen, jolloin saatiin fosfonaattimonoesteriä kirkkaana viskoosina öljynä 64 89 493 (10,2 g, saanto > 100 %). TLC (silikageeli; nPrOH-NH^OH-H20-seos, 7:2:1): Rf = 0,50. Fosfonaattimonoesteriä (1,21 g) pidettiin pumpulla aikaansaadussa suuressa alipaineessa 4 tuntia, jolloin saatiin 1,16 g (2,57 mmol) 5 esteriä, joka liuotettiin kuivaan etyylieetteriin (10 ml) ja liuokseen lisättiin pisaroittain disykloheksyyliamiinia (0,481 g, 0,528 ml, 2,65 mmol). Tulokseksi saatua homogeenista liuosta seisotettiin huoneen lämpötilassa 7 tuntia, jolloin seurauksena on huomattava kiteiden muodostuminen.

10 Seosta pidettiin -20°C:ssa 16 tuntia, jonka jälkeen se lämmitettiin huoneen lämpötilaan ja suodatettiin. Kiteet pestiin kylmällä kuivalla etyylieetterillä ja sen jälkeen niitä kuivattiin P^^lla suuressa alipaineessa 18 tuntia. Tämän jälkeen kiteitä pidettiin suuressa ali-15 paineessa 45°C:ssa 4 tuntia, jolloin saatiin 1,25 g (1,98 mmol, saanto 77 %) otsikon mukaista disykloheksyyli-amiinisuolaa valkoisena jauhemaisena aineena; sp. 155 -156°C. TLC (silikageeli; MeOH-CH2Cl2-seos, 20:80): Rf = 0,57.

1H-NMR (270 MHz, CDC13): 20 7,71 - 7,65 (m, 4H) 7,40 - 7,32 (m, 6H) 4,02 (m, 1H) 3,52 (s, 3H) 3,28 ja 3,22 (m, 1H) 25 3,11 (d, 3H J = 11 Hz) 2,77 - 2,64 (m, 2H) 2,62 - 2,56 (m, 1H) 1,92 - 1,08 (joukko m:iä, 22H) 1,00 (s, 9H) 30 Massaspektri (FAB): 632 (M + H)+ IR (KBr): 3466 - 3457 (leveä), 3046, 3016, 2997, 2937, 2858, 2836, 2798, 2721, 2704, 2633, 2533, 2447, 1736, 1449, 1435, 1426, 1379, 1243, 1231, 1191, 1107, 1074, 1061, 1051 ja 820 cm ^ 35 Alkuaineanalyysi (c22H3]°6psi-C^H^N) : laskettu: 64,64; H, 8,61? N, 2,22 todettu: C, 64,51; H, 8,49; N, 2,18 I. i

Claims (5)

65 89493

1. Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava 5 0 II r-p-ch,-ch-ch7-co,rx I : X OH (I) (CH2)n

10 Z jossa R on OH, alempi alkoksi tai alempi alkyyli, X on -0- tai -NH-, 15. on 1, R1 R2 Z on ryhmä I j R2a jossa R1, R2 ja R2a voivat olla samoja tai erilaisia ja 20 ovat kukin itsenäisesti H, halogeeni, alempi alkyyli, ha-logeenialkyyli, fenyyli, substituoitu fenyyli tai ORy, jossa Ry on H, alkanoyyli, bentsoyyli, fenyyli, halogeenife-nyyli, fenyylisubstituoitu alempi alkyyli, alempi alkyyli, sinnamyyli, halogeenialkyyli, allyyli, sykloalkyylisubsti-25 tuoitu alempi alkyyli, adamantyylisubstituoitu alempi alkyyli tai (substituoitu fenyyli)substituoitu alempi alkyyli, ja Rx on vety tai alempi alkyyli, sekä niiden suolojen valmistamiseksi, t u n -30 n e t t u siitä, että silyylieetteristä, jolla on kaava

0 II Rc-P-CH2—CH-CH2-C02alkyyli X O (VII) 35 (CH2)n Si-C(CH3)3 1 / \ Z C6H5 C6H5 66 89493 jossa Rc on alempi alkyyli tai alempi alkoksi, lohkaistaan silyylieetteriryhmä, jolloin muodostuu esteri, jolla on kaava 5 0 II Rc-P-CH2-CH-CH2-C02Rx X ÖH (VIII) (CH2)n z 10 (Rx on alkyyli) ja esteri muutetaan haluttaessa vastaavaksi suolaksi, jolla on kaava

15 O tl R-P-CH2-CH-CH2-C02alkalimetalli X OH i (CH2)n (VIHA) Z 20 jossa R on alempi alkyyli tai alempi alkoksi, hapoksi, jolla on kaava

0 II

25 R-P-CH,-CH-CH,-C0,H 1. i X OH ( CH2 )n ( VIIIB) Z 30 vastaavaksi suolaksi, jolla on kaava 0 II alkalimetalli0-P-CH2-CH-CH2-C02alkalimetalli X OH 35 (CH2)n (VIIIC) Z I: ; 67 89493 tai hapoksi, jolla on kaava 0 li ho-p-ch2-ch-ch2-co2h

5. OH (VIIID) (CH2)n Z

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että X on -O- ja R on alkoksi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X on -NH- ja R on alkoksi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistettava yhdiste on

15 S — 4—[[[4'-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bifenyl)-2-yyli]- metoksi]metoksifosfinyyli]-3-hydroksibutaanihappo, metyy-liesteri tai monolitiumsuola, S — 4—[[[4'- fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bifenyl)-2-yyli]-metoksi]hydroksifosfinyyli]-3-hydroksibutaanihappo, dili-20 tiumsuola, (3S )-4-[[[4'-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bifenyl)-2-yy-li]metoksi]metyylifosfinyyli]-3-hydroksibutaanihappo, monolitiumsuola, ( S )-4- [ [ [2,4-dikloori-6- [ ( 4-fluorifenyyli )metoksi] fenyy-25 li]metoksijmetoksifosfinyyli]-3-hydroksibutaanihappo, mo nolitiumsuola, (3S )-4-[[[2,4-dikloori-6-[(4-fluorifenyyli Jmetoksi]fenyy-li]metoksi]hydroksifosfinyyli]-3-hydroksibutaanihappo, dilitiumsuola, 30 (3S )-4-[[[2,4-dikloori-6-[(4-fluorifenyyli)metoksi]fenyy- li]metoksi]metyylifosfinyyli]-3-hydroksibutaanihappo, me-tyyliesteri, tai (S ) -4-[[[[4'-fluori-3,3',5-trimetyyli(1,1'-bifenyl)-2-yy-li]metyyli]amino]metoksifosfinyyli]-3-hydroksibutaanihap-35 po, monolitiumsuola. 68 89493

5. Välituote, tunnettu siitä, että sillä on rakenne 0 tl

5 Ra-P-CH2-CH-CH2-C02alkyyli Oalkyyli OSi-C(CH3)3 (IV) c^h5xc6h5 jossa Ra on alempi alkyyli, alempi alkoksi tai OH, ja 10 joka rakenne sulkee sisäänsä välituotteen kaikki stereo-isomeerit . I, 69 89493