FI81833B - Foerfarande foer framstaellning av nourseotricin, dess salter och adsorbat. - Google Patents

Description

1 81833

Menetelmä nourseotrisiinin, sen suolojen ja adsorbaattien valmistamiseksi Förfarande för framställning av nourseotricin, dess salter och adsorbat

Keksintö kohdistuu nourseotrisiinin uuteen, käymisteitse ta-pahtuvaan valmistusmenetelmään, sekä nourseotrisiinin tuottamiseen suoloinaan ja adsorbaatteinaan. Nourseotrisiini on eräs streptotrisiinien ryhmään kuuluva antibiootti, joka vaikuttaa kiihdyttävästi elomassan lisääntymiseen ja samanaikaisesti rehun kulutuksen vähenemiseen, kun sitä lisätään maataloudellisten hyötyeläinten eläinrehuun ergotrooppisina annoksina. Siitä on siis hyötyä eläinten tuotannossa sekä farmaseuttisessa ja seosrehuteollisuudessa.

Streptomyces noursei'n muunnoksen ATCC 11455 viljelmästä eristetty antibiootti nourseotrisiini vaikuttaa in vitro torjuvasti gram-positiivisiin ja -negatiivisiin bakteereihin, samoin mykobakteereihin (Bradler, G. ja H. Thrum; Nourseotricin A und B, zwei neue antibakterielle Antibiotika einer *’ Streptomyces-noursei-Variante. Zschr. Allgem. Mikrobiol. 3^ 105...112 (1963)). Nourseotrisiini on veteen ja alempiin alko-holeihin liukoinen emäs. Käyttökelpoisia muotoja ovat sen suolat. Nourseotrisiinin molekyyli on rakentunut gulosamiini-: : aminosokerista ja streptolidiini- sekä β-lysiini-aminohapois- ta. Peptidin kaltaisesti toisiinsa liittyneiden β -lysiini-jäännösten lukumäärä molekyylissä erottaa nourseotrisiinin yksittäiset komponentit toisistaan. Nourseotrisiini-kompleksi koostuu noin 90 % risesti pääkomponenttien F ja D lähes yhtä suurista osuuksista, sekä noin 10 % risesti molemmista sivukom-.. ponenteista C ja D (Gräfe, U.; Bocker, H.; Reinhardt, G. ja H.

Thrum: Regulative Beeinflussung der Nourseothricinbiosynthese : durch o-Aminobenzoesäure in Kulturen des Streptomyces noursei JA 3890b. Zschr. Allgem. Mikrobiol. JL_4, 659...673 ( 1974)).

Antibioottia nourseotrisiini muodostava Streptomyceten-kanta 2 81833 on tallennettu DDR:n keskuslaitoksen kantakokoelmaan der Stammsammlung des Zentralinstituts fiir Mikrobiologie und expe-rimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR nimikkeellä Streptomyces noursei ZIMET JA 3890b ja sen nimike on nyt Streptomyces noursei ZIMET 43176.

Kirjallisuudesta tunnettujen menetelmien mukaan (Bocker, H. ja H. Thrun: Stimulation of nourseothricin production by amino- benzoic acids. Julkaisussa: Herold, M. ja Z. Gabriel: Antibiotics - Advances in research, production and clinical use. London 1966; sivut 585...587) viljely suoritetaan aerobeissa oloissa. Tällöin tämän Streptomyces-kannan mullassa lyofili-soitua itiömateriaalia siirretään sopivalle agarravintoalus-talle. 28...30 °C lämpötilassa tapahtuneen, 6...10 päivää kestäneen inkuboinnin jälkeen siirrostetaan näin kasvanutta itiöistä myseelirihmastoa nestemäiseen, steriiliin ravinto-alustaan. Siirrostus voidaan suorittaa myös suoraan nourseo-trisiinia tuottavan Streptomyceten-kannan säilytetyllä, gelatiiniin lyofilisoidulla submerssimyseelillä. Siirrosmateriaa-lin submerssikasvatusten nestemäiset ravintoalustat sisältävät ; substraatteina hiilen ja typen lähteet sekä epäorgaanisia, suoloja. Hiililähteenä käytetään glukoosia ja/tai glyseriiniä. Typpilähteinä kysymykseen tulevat erityisesti soijajauho, erilaiset aminohapot ja/tai ammoniumsuolat. Edullisin happa-muus siirrosmateriaalin kasvatuksessa viljelyn alussa on pH-alueella 6,0...6,7.

Inkubointi suoritetaan 28...30 °C lämpötilassa 24...48 tunnin ajan. Näin kasvatetulla siirrosmateriaalilla siirrostetaan varsinaisen kasvatuksen steriili, nestemäinen ravintoalusta. Nämä ravintoalustat koostuvat hiili- ja typpilähteistä sekä epäorgaanisista suoloista. Hiililähteenä käytetään maissitärk-kelystä ja/tai glukoosia. Typpilähteinä kysymykseen tulevat erityisesti soijajauho, erilaiset aminohapot ja/tai ammoniumsuolat. Antibiootin tuotolle edullisin happamuus käymisen alussa on pH-alueella 6,0...7,5.

Viljely tapahtuu 26...32 °C lämpötilassa, etupäässä lämpöti- 3 81833 lassa 28...30 °C ja kestää jopa 150 tuntia.

Tunnetusti Streptomyces noursei'n ZIMET JA 3890b submerssivil-jely tapahtuu ravistelukasvatuksena tai sekoitetuissa ja ilmastetuissa fermentoreissa ilman substraatin lisäystä tai pH-säätöä.

Tunnettua on (Bradler, G. ja H. Thrum: Nourseothricin A und B, Zwei neue antibakterielle Antibiotika einer Streptomyces-nour-sei-Variante. Zschr. Allgem. Mikrobiol. _3, 105...1 12 ( 1963 )), että suhteellisen vähäistä nourseotrisiinin muodostumista alkuperäisessä käymisliuoksessa voidaan lisätä tunnetuissa teknisissä oloissa 5. . . 10-kertaiseksi lisäämällä varsinaisen kasvatuksen alussa aminoaralkarboksyylihappoja, erityisesti 5...10 mM o-aminobentsoehappoa (Bocker, H ja H. Thrum: Stimulation of nourseothricin production by aminobenzoic acids. In: Herold, M. und. Z. Gabriel: Antibiotics - Advances in rese arch, production and clinical use, London 1966, s. 584...587).

Tutkimusten (yhteenvedonomaisesti kirjoitettu: Gräfe, U. ; ; Staudel, A; Bocker, H. ja H. Thrum: Regulative influence of o-aminobenzoic acids (OABA) on the biosynthesis of nourseo-" thricin in cultures of Streptomyces noursei JA 3890b. V. Eff ect of OABA on cytochrom levels and amino acid transport, Zschr. Allgem. Mikrobiol. ^0, 185...194 (1980)) perusteella on tunnettua, että o-aminobentsoehappo ja/tai muut aminoaryyli-karboksyylihapot ehkäisevät spesifisesti a-tyypin sytokromin (sytokromi-oksidaasi) muodostumista ja täten estävät epäsuorasti sekä aminohappojen kulkeutumisen ravintoliuoksesta my-seeliin että aminohappojen oksidatiivisen deaminoitumisen nourseotrisiinin tuottajien soluissa. Täten toisaalta solunsi-. . säinen typpikataboliittien ylitarjonta estää sekundääriaineen- : : vaihdunnan estymisen. Toisaalta tällä tavoin estyy se, että : kasvuvaiheensa aikana antibiootin tuottajat pääpiirteissään käyttäisivät alustan nourseotrisiinin prekursoreina toimivat aminohapot.

Nämä aminohapot ovat siten nourseotrisiinin muodostumisen 4 81833 aikana paremmin sekundääriaineenvaihdunnan käytettävissä, sillä biomassan tuotantoon käytetään etupäässä epäorgaanisia typpilähteitä (ammoniumtyppeä).

Nourseotrisiinin fermentatiivisessa tuotannossa käyttämällä aminoaryylikarboksyylihappoja, joilla tosin tunnetusti saavutetaan käymistapahtuman saannon oleellinen lisääntyminen, on kuitenkin haittapuolia, erityisesti mitä tulee kustannuksiin, sterilisointiin ja jätevesiongelmaan, jotka vaikeuttavat teollista soveltamista.

Lisäksi on tunnettua, että ylimääräinen fosfaatti vaikuttaa haitallisesti useimpien sekundäärimetaboliittien biosyntee-seihin (esitetty yhteenvedonomaisesti: Martin, J.F. ja A.L. Demain: Control of antibiotic biosynthesis, Microbiol. Rev.

44, 230...251 (1980)). Sen vuoksi teknis-mikrobiologiset fer-mentoinnit sekundäärimetaboliittien, kuten antibioottien, tuottamiseksi suoritetaan sellaisissa fosfaattipitoisuuksissa, jotka ovat alle optimin tuottajan kasvulle. Tavallisesti käytetään monimutkaisia, kasvi- ja eläinkunnasta peräisin olevia ravintoalustan komponentteja, kuten tärkkelystä, soijajauhoa, maissin liotusvettä, melassia, lihauutetta mm., kun sekundää-rimetaboliitteja tuotetaan käymistietä teknisessä mitassa. Riippuen siitä, mistä sellaiset monimutkaiset ravintoalustan komponentit on saatu ja miten ne on esikäsitelty, ovat niiden kokonaisfosfaattipitoisuudet erilaiset ja eroavat fosfaatin biologiselta käyttöarvolta. Osa käytettävissä olevasta fosfaatista on käymisalustassa liukoisena fosfaattina. Tämä seikka vaikeuttaa perinpohjin ravintoalustojen standardisoimista.

Liukoisen tai käytettävissä olevan fosfaatin alkupitoisuudella on ratkaiseva vaikutus siihen, millainen haluttujen sekundäärimetaboliittien saanto käymisteitse on, koska toisaalta tuottavien mikro-organismien kasvuun vaaditaan tiettyä fosfaatti-määrää, ja toisaalta liian korkea fosfaatin alkupitoisuus inhiboi sekundäärimetaboliittien muodostumisen.

DD-patentti 155239 vaatii kasvatusalustassa olevien fosfaat- 5 81833 ti-ionien pitoisuuden käyttämisen kasvatusprosessin stabili-soinnin säätösuureena. Menetelmä kohdistuu kuitenkin vain biomassan tuottoon käymisteitse, jolloin pitoisuuden asetus-arvo tulee asettaa alueelle 20...60 mg/1 fosforia. Tämän menetelmän käyttö sekundäärimetaboliittien biosynteesin säätelyyn mikro-organismien panoskasvatuksessa ei ole tunnettu.

Kun mikro-organismien avulla tapahtuvaa sekundäärimetaboliittien tuottamisen valmistusmenetelmää parannetaan, sovitetaan ravintoalusta ja tuottava mikro-organismi vuorovaikutteisella muuntelulla toisiinsa niin, että fosfaatin molempien, vastakkaisiin suuntiin toimivien vaikutusten välille saadaan kompromissi aikaan. Tämä asteittainen suorituskyvyn nostamistie on kuitenkin aikaa vievä ja vaatii paljon kustannuksia.

Edelleen on tunnettua, että ravintoliuoksen koostumuksen aikaansaaman säätelevän vaikutuksen lisäksi saavutetaan käymis-saannon paraneminen käymisprosessin ohjaamisella, mieluiten reaaliaikaohjaamisella. (Sukatsch, D.A. ja G. Nesemann: Automates che Parametererfassung bei industriellen Fermentationen, Chemie-Technik 6, 261.. (1977)).

Kun tehokkaan käymisprosessin läpiviemisen vaatimaa reaaliai-kaohjausta käytetään, on olemassa vaara, että käymistekniik-kaan vakiintuneista, jatkuvasti mitattavista yleisistä pro-sessiparametreistä, kuten pH-arvo, p02~arvo, annosteluerä, poistokaasujen koostumus, lämmön muodostuminen, on luovuttava ensisijaisina säätelevinä prosessiparametreinä vasta jälkeenpäin usein aikaavievän kemiallisen analytiikan avulla määritettävän substraattipitoisuuden asemesta.

Mitä nourseotrisiinin eristämiseen tulee, on lopuksi tunnettua, että myseelistä vapautetusta kasvatusliuoksen suodoksesta saatu vaikuttava aine adsorboituu sopiviin kationinvaihtajiin, jonka jälkeen se eluoidaan laimeilla hapoilla ja saadaan puh-.. taana aineena neutraloinnin, eluaatin konsentroinnin, raaka- tuotteen uudelleen saostamisen metanoli/asetoni-järjestelmällä ja kuivaamisen jälkeen. (Bradler, G. ja H. Thrum: nourseothri- cin A und B, zwei neue antibakterielle Antibiotika einer

Streptomyces noursei-Variants. Zchr. Allgem. Mikrobiol. 3_, 105. . .115 (1963) ) .

6 81833

Keksinnön tavoitteena on esittää vaikuttava aine nourseotri-siini korkeina tila-aika-saantoina. Keksintö perustuu tehtävään esittää teknisesti edullinen menetelmä, joka tekee nour-seotrisiinin teollisen valmistamisen suoloina ja adsorbaattei-na mahdolliseksi ja joka välttää jo tunnettujen ratkaisujen haitat. Keksinnön tarkemmat tunnusmerkit ilmenevät oheisista patenttivaatimuksista.

Havaittiin, että hengitysketjun estoaineiden, kuten esim. natriumatsidin tai muiden alkaliatsidien, edullisesti 0,05... 0,25 millimolaarisena liuoksena, brentskateiinin sekä amytalin (etyyli-isoamyylibarbituurihappo), lisääminen ja/tai varsinaiseen kasvatukseen siirrostushetkellä elävän solun aminohappo-kuljetuksen estoaineiden, esimerkiksi (b -alaniinin, edullisesti 0,2...1,75 millimolaarisena liuoksena, tai vesiliukoisen sinkkisuolan, edullisesti 0,25...1,75 millimolaarisena liuoksena, lisääminen vaikuttaa nourseotrisiinin biosynteesiä edistävästi vaikuttamatta muuttavasti käymisprosessin kemiallisiin tai biologisiin ominaisuuksiin.

Hengitysketjun ja/tai aminohappokuljetuksen inhibiittoreiden lisääminen voi jäädä pois, kun käytetään kantoja, joiden amy-lolyyttinen aktiivisuus on korkea ja polymeerisiä hiilen lähteitä, kuten maissitärkkelystä.

Yllättäen todettiin, että nourseotrisiinia muodostavien viljelmien metabolian aktiviteetin (hengitys, happamoitumisnope-us, glukoosin ja ammoniumin kuluminen, antibiootin muodostuminen mm.) määrää ensisijassa käymisen etenemisen aikana saatavilla oleva fosfaatti, eikä ainoastaan hiilen ja typen lähteiden saatavuus. Erityisen merkittävää tässä on, että sterilisoidussa ravintoaineliuoksessa liukoisen ja myös biologisesti käyttökelpoisen fosfaatin alkukonsentraatio alenee, kun lämpö-sterilointi suoritetaan 115...125 °C:ssa, johtuen eräästä 7 81833 sterilisointitapahtuman aktiivisesta tekijästä, nimittäin sulfaatti-ionien 0,05...0,2 molaarisesta pitoisuudesta ja epäorgaanisten suolojen tai metalli-ionien pitoisuudesta, jolloin fosfaatti-tai sulfaatti-ionien kanssa muodostuu vaikealiukoisia sakkoja. Tässä yhteydessä on osoittautunut, että näiden alku-pitoisuuksien alenemisen aiheuttaa, mikäli saatavilla on tarpeellinen sulfaatti-ionien määrä, heikosti happaman ravinto-alustan happamuuden siirtyminen alkaalisiin pH-arvoihin steriloinnin aikana, koska kalsiumsulfaattia saostuu ja siihen liittyen ravintoliuoksesta poistuu happamia sulfaatti-ioneja.

Tämän mukaan liukoisen tai biologisesti käyttökelpoisen fosfaatin alkukonsentraatio alenee myös, vaikka ennen sterilointia pH-arvo on asetettu alkaaliseksi. pH-arvon kohottaminen saa sen aikaan, että edellytykset fosfaatin, tiettyjen ravintoliuoksessa olevien metalli-ionien kanssa tapahtuvaan saostumiseen vaikealiukoisiksi sakoiksi ovat olemassa.

Fosfaattipitoisten sakkojen saostamista edistetään sellaisten metalli-ionien, kuten esimerkiksi sinkki(III) ja/tai rauta- (III), alumiini (III), magnesium(II), kalsium(II), mangaani(II) mm. tarkoituksellisella lisäämisellä, edullisesti 0,1...1,75 millimolaarisena konsentraationa. Erityisen edullista fosfaat-tisaostukselle on ueeimmissa teknisissä käymisissä käytetty sterilointimenetelmä, jossa käytetään suoraan vaikuttavaa tulistettua höyryä, sekä kalsiumkarbonaatin läsnäolo, jota käytetään käymistapahtumassa pH-puskurointiin.

Ravintoalustan fosfaattipitoisuutta voidaan myös yleensä alentaa vähentämällä fosfaattipitoisten, monimutkaisten tarveaineiden osuutta. Täten menetelmästä tulee edullisempi.

Kuvatuilla edellytyksillä liukoisen tai biologisesti käyttökelpoisen fosfaatin alkupitoisuutta alennetaan niin, että joka tapauksessa nourseotrisiinia tuottaville mikro-organismeille • · ominaiset fosfaatin ylemmät sietoarvot alitetaan. Nämä vähäiset fosfaattipitoisuudet tekevät nyt mahdolliseksi saada fosfaatin suhteen lähes standardisoitu alusta, kun steriloinnin jälkeen 8 81833 fosfaattia lisätään määrätyllä tavalla. Sen lisäksi fosfaatin lisäystavalla voidaan mikro-organismien fosfaattiaineenvaihdun-taa ohjata niin, että saadaan hyvä tuotteen saanto. Fosfaatin lisääminen voidaan suorittaa liuoksen, kiinteän aineen tai suspension muodossa. Fosfaatti voi esiintyä joko vapaina fosfaatti-ioneina tai kemiallisesti tai fysikaalisesti sitoutuneena fosfaattina. Aina steriloinnista riippuen suoritetaan fosfaatin tai fosfaattipitoisten aineiden lisääminen steriloinnin jälkeen tai käymisen aikana joko yhdellä kertaa ja/tai useammalla lisäyksellä ja/tai jatkuvasti, edullisesti kaliumdi-vetyfosfaatin vesiliuoksena. Jatkuva lisääminen käymisen aikana voidaan suorittaa erilaisin nopeuksin.

Nämä lisäykset ovat lisänä sille vapautuvalle fosfaatille, jota kasvatusliuosten monimutkaisten fosfaattilähteiden, esim. soijajauhon, maapähkinäjauhon, perunatärkkelyksen mm., hydrolyyt-tinen tai entsymaattinen hajoaminen tuottaa tai jota vapautuu reversiibelisti epäorgaanisista sakoista. Sterilointi edistää edellä mainittujen orgaanisten substraattien hydrolyyttistä hajoamista alkaalisella reaktiolla. Kun käymisen aikana vety-ionien pitoisuus kohotetaan fysiologiselle alueelle, saadaan aineenvaihdunnallista aktiivisuutta stimuloitua, koska epäorgaanisista sakoista vapautuu paremmin fosfaattia.

Reunaedellytyksenä on taattava, ettei tuotteen muodostumiselle epäedullista substraattien rajoittumista synny ja että ympäristöolosuhteet eivät aiheuta vaikeuksia fosfaatin lisäyksen yhteydessä ja fosfaatin lisäyksen aiheuttamassa kasvussa tai kohonneessa aineenvaihdunnan aktiivisuudessa.

pH-arvojen alueella 7,4...7,8 suoritetun alkaalisen steriloinnin ja steriloinnin lopettamisen, sekä pH-arvojen alueen 7,2 ...8,8 saavuttamisen jälkeen todettiin lisäksi, että kun käy-misprosessia ohjataan glukoosin ja epäorgaanisen typen suhteen ! asettamisella ja suhteen ylläpitämisellä, niin tämä vaikuttaa . . pitkähkön aikaa edullisesti nourseotrisiinin muodostumisen tuottavuuteen. Tämä glukoosin ja ammoniumsuolojen tai ammonium-hydroksidin annostuksella saatu glukoosin ja epäorgaanisen 9 81833 typen suhde on 5...15: 0,015...0,2 (g/1 glukoosia:g/1 epäorgaanista typpeä). Annostus suoritetaan pH-alueella 5,0...6,5, jolloin hapen osapaine (pC>2) on 30...80 %, mieluimmin 40...60 %. Yllättävästi todettiin, että sopivien asetusarvojen valinta kasvatusliuoksen fysiologiselta säätelyltään tehokkaiden pH-arvojen alueella tapahtuvaan pH-arvojen säätöön, joka suoritetaan lisäämällä sopivan pitoista ammoniumhydroksidiliuosta alemman pH-rajan takaamiseksi, vaikuttaa, että ammoniumhydrok-sidin annostelunopeuden ajallinen kulku kuvaa fysiologisesti vaikuttavan fosfaatin kulumisnopeuden ajallista kulkua. Kuvauksen vastaavuus riippuu pH-arvon alemman säätörajan asettamisesta. Ensimmäisten käymistuntien aikana tapahtuva pH: n muuttuminen, ja sen perusteella ammoniumhydroksidin annostelunopeuden asettuminen, riippuu alun ravintoalustan puskuroinnista.

Näin suoran ja/tai epäsuoran fosfaatin annostuksen, ja samalla käymisviljelmän aineenvaihdunnan aktiivisuuden ohjaamiseen on käytettävissä hyvin herkkä, jatkuva signaali.

Mitä tulee suoraan fosfaatin annostukseen fosfaattipitoisten aineiden ulkoisesta säiliöstä tapahtuvan lisäyksen muodossa, sekä epäsuoraan fosfaatin annostukseen monimutkaisten substraattien entsymaattisen tai hydrolyyttisen hajoamisen takaamalla fosfaattiyhdisteiden olemassaololla havaittiin, että ammoniumhydroksidin annostelunopeuden suuruus osoittaa suoran ja epäsuoran fosfaattiannostuksen välistä ylimenoa nousemalla tai laskemalla merkittävästi.

Sen lisäksi havaittiin, että ajankohtaista ammoniumhydroksidin annostelunopeutta voidaan käyttää hiililähteen ja muiden typ-pilähteiden sekä vaikuttavien aineiden annostuksen ohjaussuu-reena; ja ottamalla huomioon kyseisen fermentorin hapen yli-menonopeus voidaan suoraa fosfaatin annostusta muuttaa niin, että käymisen edetessä tuotteen muodostumisnopeus on edullinen. Tällä tavoin reaktoriteknisesti määräytyneissä hapen siirtymis-olosuhteissa, kun ilman lisäys on määrätty, onnistuu tuotteen korkean loppuarvon toteuttaminen, substraatin tehokas hyväksikäyttö tavoiteltuna käymisaikana sekä biomassan pitoisuuden 10 81 833 käsittelyteknisesti mielekkääseen määrään rajoittaminen.

Edelleen todettiin, että reaktiolämpö ja/tai reaktionopeus kuvaavat aineenvaihdunnan aktiivisuuden ajallista kulkua. Tästä syystä ajankohtaiset reaktiolämmöt ja hengitys ovat myös fosfaatin tai muiden aineiden annostuksen ohjaussuureita.

Valmistusmenetelmään soveltuvat Streptomyces-lajin, erityisesti suvun Streptomyces noursei, nourseotrisiinia tuottavat Strepto-myces-kannat, joille seuraavat kriteerit ovat tunnusmerkillisiä: nourseotrisiinin muodostumisen herkkyys varsinaisen kasvatuksen ravintoalustan liukoisen fosfaatin korkeille pitoisuuksille kyky hajoittaa monimutkaisia fosfaattipitoisia hiili- ja typpilähteitä amylolyyttinen aktiivisuus polymeerien hiililähteiden hajottamiseksi .

Kuvatun menetelmän konkreettinen läpivienti riippuu siitä, miten kulloinkin käytetty Streptomyceten-kanta toteuttaa kolme edellä mainittua kriteeriä.

Runsas nourseotrisiinin muodostuminen kuvatuissa menetelmän puitteissa rajatapauksessa, kun tuottajan fosfaattiherkkyys on suuri, on vain silloin mahdollista, kun varsinaisen kasvatuksen ravintoliuoksen liukoisen fosfaatin alkupitoisuus on alennettu alueelle 0,1...10 mg/1 fosfaattifosforia aiemmin edellä kuvatuilla toimenpiteillä, kuten alkaalisella alueella tapahtuvalla kuumasteriloinnilla ja/tai fosfaattia seostavien aineiden lisäyksellä .

Kun käytetään sellaisia nourseotrisiinia muodostavia Strepto-myceten-kantoja, joiden kyky hajottaa monimutkaisia fosfaattipitoisia substraatteja, joita ravintoliuoksessa edellytetään olevan riittävästi saatavilla, on hyvä, voidaan käymisen aikana fosfaatin annostusta vähentää jopa arvoon 0.

Kun käytetään sellaisia nourseotrisiinia muodostavia Strepto- 11 81833 myceten-kantoja, joilla on korkea fosfaattiresistenssi, voidaan fosfaattia saostavien aineiden lisääminen ravintoliuokseen pudottaa aina arvoon 0 saakka. Havaittiin, että samalla sellaisten Streptomyces noursei-suvun Streptomyceten-kantojen amylolyyttinen aktiivisuus on korkea.

Nämä esitykset osoittavat, että valmistusmenetelmässä käytetään fysiologisesti erilaisia Streptomyceten-kantoja. Siten keksinnön tunnusmerkillinen ominaisuus ei ole mikään tietty Strepto-myceten-kanta.

Mitä vaikuttavan aineen erottamiseen kasvatusliuoksesta tulee, todettiin yllättävästi, että nourseotrisiini voidaan eristää myseelipitoisen adsorbaatin muodossa. Tällöin käymisen keskeyttämisen jälkeen kasvatusliuoksen pH asetetaan heikosti happamaksi, erityisesti alueelle pH 6,0...6,2, lisäämällä laimeaa rikkihappoa. Tämän jälkeen happamaksi tehtyyn kasvatusliuokseen sekoitetaan huolella heikosti hapan, fysiologisesti hyväksyttävän adsorbenssin, kuten natrium-muotoisen bentoniitin, vesisuspensio. Tällöin huomiota on kiinnitettävä siihen, että reaktio-liuoksen happamuus pysyy pH-alueella 5,5...6,5 fermentaation 110.. .145 tuntia pitkän keston aikana. Fermentaatiolämpötila on 26.. .32 °C, edullisesti 28...30 °C ja hapen osapaine on 30...80 %, edullisesti 40...60 %. Erottuva, nourseotrisiinipitoinen kiintoaines erotetaan suodattamalla tai sentrifugoimalla sekä kuivataan lämpimässä ilmavirrassa, jonka lämpötila on korkeintaan 70 °C. Näin valmistettu myseelipitoinen adsorbaatti sisältää 1...10 %, pääasiassa 4...7 % vaikuttavaa ainetta, nourseo-trisiiniemäkseksi laskettuna.

Lisäksi yllättävästi todettiin, että tietyt nourseotrisiini-suolat ovat vaikealiukoisia metanolin 90...95 % vesiliuokseen, ja ne voidaan eristää sekä puhdistaa jäljempänä esitetyn menetelmän oloissa. Tällöin nourseotrisiinin adsorbaatteja yhdistettynä heikosti happameen kationinvaihtajaan eluoidaan sellaisilla laimeilla, useampiemäksisillä hapoilla, jotka muodostavat nourseotrisiiniemäksen kanssa metanoliin liukenemattomia suoloja. Tämän jälkeen eluaateissa ylimääräisinä aineina ole- i2 81 833 vat, useampiarvoiset epäorgaaniset kationit seostetaan veteen vaikealiukoisina suoloina. Tämän jälkeen yksiarvoiset epäorgaaniset kationit poistetaan käsittelemällä eluaatti paljon ristisidoksia sisältävällä, vetymuodossa olevalla sulfonihap-potyyppisellä kationinvaihtajalla ja vapautuneet hapot neutraloidaan OH-muodossa olevalla anioninvaihtajalla.

Kun eluaatti on konsentroitu vakuumissa ja epäpuhtaudet on poistettu aktiivihiileen adsorboimalla, seuraa lopulta puhtaan nourseotrisiinin suolan erottaminen metanolisaostuksella tai hellävaraisella kuivauksella. Nourseotrisiinisulfaatti on amorfista, valkoista, veteen helppoliukoista, metanoliin ja useimpiin orgaanisiin liuottimiin vaikealiukoista jauhetta.

Alkuainekoostumus (C=32,46, 32,31; H=6,65, 6,22; N=15,73, 16,00; S=7,74, 7,60) vastaa melko tarkoin streptotrisiini-D:n = (C31H5QN12°lo · 2m5H2S04.H2O) ja streptotrisiinin F-sulfaa- tin (Ci9H34N8O8.1,5H2SO4.H2O) l:l-seoksen kemiallista koostumusta .

Nourseotrisiini-oksalaatti on amorfista, valkoista, veteen helppoliukoista, alkoholeihin ja muihin orgaanisiin liuotinaineisiin vaikealiukoista jauhetta. Alkuainekoostumus (C 40.31, 40.44; H 6.42, 6.21; N 16.21, 16.49) sekä oksaalihappopitoi- .'Ί suus (20.12, 20.28) vastaavat suurinpiirtein streptotrisiinin D-(c31H58N12°10 2,5C2H204 . 1-3 H2O) ja streptotrisiinin F-oksalaatin (C19H34N8O8 . 1,5 C2H2O4 . 1-3 H2O) l:l-seoksen . koostumusta.

Nourseotrisiinifosfaatti on amorfista, valkoista, veteen helppoliukoista, alkoholeihin ja muihin orgaanisiin liuotinaineisiin vaikealiukoista ainetta. Alkuainekoostumus (C 31.59, ; 31.85; H 6.25, 6.63; N 14.95, 15.18; P 10.08, 10.36) vastaa seuraavaa streptotrisiinin D-(C3ιΗ58Νχ2°10 · 4 H3PO4 . O-l H2O) ja streptotrisiinin F-fosfaatin (C19H34N8O8 - 2 H3PO4 .

0-1 H2O) l:l-seoksen koostumusta.

Näin saatujen suolojen suhteellinen antimikrobinen aktiivisuus voidaan mikrobiologisesti selvittää reikälevy-diffuusiokokeen avulla käyttämällä testiorganismina Bacillus subtilista ATCC

i3 81 833 6633. Standardina käytetään puhdistettua nourseotrisiinisul-faattia, joka koostumukseltaan vastaa streptotrisiinin D-(^31^58^12^10 · 2,5 H2SO4 . H2O) ja streptotrisiinin F-sulfaa-tin (C19H34N8O8 . 1,5 H2O) l:l-seosta, ja joka sisältää 705 yg emästä/mg. Mikrobiologisen arvon määrityksen olosuhteet on valittava niin, että 0,05 ml sellaista koeliuosta, joka sisältää 10 yg nourseotrisiiniemästä/ml, antaa halkaisijaltaan 19_+1 mm estovyöhykkeen, kun reikä on halkaisijaltaan 9 mm.

Suoritus es imerkkej ä

Esimerkki 1

Kannan Streptomyces noursei ZIMET 43716 multaan kuivattu itiö-lyofilisaatti levitetään sopivalle agaralustalle, esim. n. k. Emerson-agarilla. 30 °C lämpötilassa noin 7 vuorokautta kestäneen inkuboinnin jälkeen erotetaan leikkaamalla noin 2 cm2 suuruisia myseelirihmaston kappaleita, ja niitä käytetään kulloinkin yhden 1. esikasvatuksen kasvatusalustan siirrostuk-seen.

Tämän esikasvatusalustan koostumus litraa kohden on seuraava: 40,0 g glukoosia; 15,0 g soijauuterouhetta; 0,3 g KH2PO4; 5,0 g NaCl; 3,0 g CaCC>3; täytetään litraksi johtovedellä; pH 6,5 ...6,9 (ennen sterilointia).

Tätä alustaa on laitettu kulloinkin 50 ml: n määrä 500 ml: n vanutulpin suljettuihin vinopintapulloihin. Sterilointi suoritetaan autoklaavissa 35 minuuttia kestävällä kuumennuksella 121 °C lämpötilaan.

Siirrostettuja panoksia inkuboidaan ravistelukasvatuksina 48 tuntia 29 °C lämpötilassa. Varsinaisen kasvatuksen viljelypa-.·. nokset siirrostetaan kulloinkin 3 ml:11a näin saadusta esikas- vatuksesta.

Seuraavia perusaineita käytetään varsinaiseen kasvatukseen litraa johtovettä kohti: 14 81 833

Alusta Bo-30 29,0 g glukoosia; 13,0 g soijauuterouhetta; 5,0 g NaCl; 3,0 g CaCC>3; täytetään litraksi johtove-dellä; pH 6,5 (ennen sterilointia).

Alusta Bo-31 30,0 g maissitärkkelystä; 3,0 g glukoosia; 7,0 g soijauuterouhetta; 5,0 g NH4NO3; 2,0 g MgS04; 5,0 g NaCl; 3,0 g CaCC>3; täytetään litraksi johtovedellä; pH 6,0 (ennen sterilointia).

Varsinaisen kasvatuksen ravintoalustaa laitetaan kulloinkin 80 ml 500 ml suuruisiin, vanutulpin suljettuihin vinopintapulloi-hin, ja ne steriloidaan autoklaavissa 30 minuuttia 121 °C lämpötilassa.

Koesuunnitelman mukaisesti siirrostushetkellä varsinaisen kasvatuksen näin käsiteltyjä panoksia käytetään kyseeseen tulevien, taulukoissa 1 ja 2 esitettyjen aineiden steriilisuo-datettujen, neutraaleiden vesiliuosten kanssa (lisäys korkeintaan 3,0 ml/80 ml alustaa). 72...120 tuntia kestävän, 26 °C lämpötilassa ravistelupöydällä (180 kierrosta/min.) tapahtuvan, varsinaisen kasvatuksen inkuboinnin aikana saadut suurimmat nourseotrisiinipitoisuudet on lueteltu taulukoissa 1 ja 2. Pitoisuudet on saatu reikälevydiffuusiokokeen avulla käyttämällä koemikrobina Bacillus subtilista ATCC 6633. Muu työskentely tapahtuu esimerkkien 8...13 mukaisesti.

Esimerkki 2

Nourseotrisiinia muodostavan kannan ZIMET 43716 selektantin NG

13-14 multaan kuivattu itiölyofilisaatti levitetään sopivalle agaralustalle, kuten esim. n.k. Emerson-agarille. 30 °C lämpötilassa tapahtuvan, noin seitsemän vuorokautta kestävän inkuboinnin jälkeen erotetaan leikkaamalla noin 2 cm^ myseeli-; rihmaston kappaleita, ja ne siirrostetaan kulloinkin yhteen esikasvatuksen viljelypanokseen. Esikasvatuksen alusta sisäl-tää seuraavat aineet yhtä johtovesilitraa kohden: 40,0 g glu koosia; 15 g soijauuterouhetta; 0,3 g KH2PO4; 5 g NaCl ja 3 g CaCC>3. Ennen sterilointia happamuus asetetaan arvoon pH 6,5. Tätä ravintoalustaa laitetaan kulloinkin 50 ml 500 ml suurui-

II

« 81833 siin, vanutulpin suljettuihin vinopintapulloihin. Sterilointi suoritetaan autoklaavissa 35 minuutin kuumennuksella 121 °C lämpötilassa.

Siirrostettuja esikasvatuspanoksia inkuboidaan ravistelukasva-tuksina 48 tuntia 29 °C lämpötilassa. Varsinaisen kasvatuksen laboratoriofermentorissa oleva, 2500 ml suuruinen viljelypanos siirrostetaan 150 ml:lla näin saatua esiviljelmää.

Varsinaiseen kasvatukseen käytetään alustaa Bo-34, joka sisältää seuraavat aineet yhtä johtovesilitraa kohden: 32 g perunatärkkelystä; 29 g glukoosia; 11 g soijauuterouhet-ta; 11 g (NH4)2S04; 2 g MgS04 . 7H20; 1 g NaCl; 6 g CaC03 ja 0,5 g ZnS04 . 7H20.

Yksi millilitra ANTAPHROlJ©-vaahdonestoainetta, joka on siliko-nipohjainen, lisätään 2500 ml:aan ravintoalustaa. Ennen sterilointia happamuuden arvo on pH 6,0. Kun 2500 ml :11a täytetty fermentori-viljelyastia on steriloitu autoklaavissa 121 °C lämpötilassa ja kun se on jälleen jäähdytetty 30 °C lämpötilaan, asetetaan aloitushappamuus arvoon pH 6,8 lisäämällä • aseptisesti 10 % steriiliä rikkihappoa. Siirrostettuja fermen- toripanoksia inkuboidaan 160 tuntia 30 °C lämpötilassa, jol-loin ilmastusnopeus on 2500 ml ilmaa/minuutti ja sekoitusnope-Y us 800 kierrosta/minuutti (kierrosta/min). Kun varsinaisen ·:* kasvatuksen siirrostuksesta on kulunut 1,5 tuntia, aloitetaan Y: peristalttisen pumpun avulla suoritettava, 4 g KH2P04 litrassa tislattua vettä sisältävän liuoksen jatkuva lisääminen, joka kestää 5 tuntia ja lisäysnopeus on 1,8 ml/tunti; sen jälkeen suoritetaan tämä lisääminen 21 tunnin ajan annostelunopeudella 3,5 ml/tunti. Käymisen aikana otetaan kasvatus liuoksesta sään-*; nöllisin väliajoin aseptisesti näytteitä, joiden nourseotri- ’ ] siiniemäksen pitoisuus määritetään reikälevydiffuusiokokeen : : avulla käyttämällä Bacillus subtilista ATCC 6633 koemikrobina.

Samoin määritetään glukoosi-, ammoniumtyppi- sekä kiintoaine-pitoisuus. Poistoilman parametrejä p02, pH ja C02-pitoisuus seurataan prosessin kulun aikana rekisteröivillä mittauksilla.

16 81 833

Kasvatusliuoksen happamuuden aleneminen alle pH-arvon 5,8 estetään steriilin, 5 % natriumlipeän lisäyksellä.

Kun glukoosin pitoisuus laskee alle 5 g/1 tai ammoniumtypen pitoisuus laskee alle 0,5 g/1, mikä havaitaan pH-arvon kohoamisena ja p02~arvon sekä poistoilman CC>2-pitoisuuden alenemisena, lisätään epäjatkuvasta 25 g glukoosia, vastaavasti 10 g (NH4)2SO4:a, vahvoina steriileinä liuoksina.

Toinen käyminen suoritetaan ilman KH2PC>4:n, glukoosin ja (NH4)2804: n lisäyksiä, mutta olosuhteet ovat muuten samat. Kun käyminen keskeytetään, löytyy viljelyliuoksesta vielä selvästi mitattavia vapaan glukoosin ja vapaan ammoniumin määriä.

Molempien erilaisten käymisten viljelysuodoksesta määritetyt nourseotrisiiniemäksen pitoisuudet on esitetty taulukossa 3.

Esimerkki 3

Esimerkissä 2 mainitun, nourseotrisiinia muodostavan Strepto-myces-kannan glukoosigelatiiniin lyofilisoitua myseelisäily-kettä (säilykkeen sisällön bruttopaino noin 300 mg) sekoitetaan 3 ml:aan 0,9 % NaCl-liuosta. Tästä suspensiosta käytetään 0,5 ml ensimmäisen vaiheen 400 ml esikasvatuksen ymppinä.

Esikasvatuksen alustan koostumus ja happamuus ovat samat, ·. mitkä esimerkissä 2 on annettu. Tätä alustaa kaadetaan kul loinkin 400 ml 2500 ml:n suuruisiin, vanutulpalla suljettuihin vinopintapulloihin. Sterilisointi suoritetaan autoklaavissa 35 minuuttia kestävällä kuumennuksella 121 °C lämpötilassa.

Panokset, jotka on jäähdytetty takaisin huoneenlämpötilaan ja jotka on siirrostettu, inkuboidaan 48 tuntia ravistelukasva-tuksina (180 kierrosta/min.) 29 °C lämpötilassa. 1200 ml:11a ensimmäisestä esikasvatuksesta näin saatua kasvatusliuosta siirrostetaan esikasvatuksen toinen vaihe, joka suoritetaan jaloteräsfermentorissa (bruttotilavuus 250 litraa), jossa on i7 81 833 150 litraa kuumasteriloitua (60 minuuttia, 121 °C) kasvatus-liuosta, jonka koostumus on sama kuin ensimmäisessä esikasva-tuksessa. Fermentori on varustettu steriilin ilmastuksen ja sekoituksen vaatimin laittein. Viljely suoritetaan 27...29 °C lämpötilassa, sekoittimen nopeus on 240 kierrosta minuutissa ja ilmastusnopeus on litra ilmaa/minuutti jokaista kasvatus-liuoslitraa kohden.

Varsinaisessa kasvatuksessa käytetään jaloteräsfermentoria (bruttotilavuus 710 litraa), joka on varustettu steriilin ilmastuksen ja keskiosassa tapahtuvan sekoituksen vaatimin laittein. Fermentoriin laitetaan kulloinkin 500 litraa Bo-34-ravintoalustaa (ohje esimerkissä 2). Vaahdonestoaineena käytetään 0,5 g/1 ANTAPHROliS-vaahdonestoainetta. Ennen sterilointia happamuus asetetaan alueelle pH 6,7...7,0. Ravintoalustan sterilointi (ilman glukoosin osuutta) tapahtuu in situ nostamalla vaippahöyryllä esilämmityksen aikana lämpötila noin 70 °C:een, jonka jälkeen suoralla höyryllä lämpötila nostetaan 121 °C:een 15 minuutin ajaksi.

Kun ravintoalusta on jäähtynyt noin 30 °C:een, lisätään glukoosi aseptisesti 50 % vesiliuoksen muodossa, joka on steri-loitu erikseen kuumentamalla sitä 30 minuuttia 121 °C lämpöti-: lassa. Ennen siirrostusta asetetaan aloitushappamuus pH 6,9:n -;· ja pH 7, 1: n väliseen arvoon steriilillä 10 % rikkihapolla.

Varsinaisen kasvatuksen fermentoripanoksia, jotka kulloinkin on siirrostettu toisesta esikasvatusvaiheesta saadulla 5 % siirrosteella, kasvatetaan 120 tuntia 28...30 °C lämpötilassa. Ilmastuksen nopeus on 500 litraa ilmaa/minuutti (paine 0,14 ;; ...0,16 MPa), ja sekoitusnopeus on 320 kierrosta minuutissa.

Kun siirrostuksesta on kulunut tunti, aloitetaan vesiliuoksena olevan 87 g KH2PC>4:n lisääminen molempiin fermentoripanoksiin tasaisella nopeudella peristalttisen pumpun avulla. Kun happamuus laskee alle pH 6,3:n, palautetaan pH-arvo tästä arvosta ylöspäin steriilillä ammoniumhydroksidin 25 %:isella vesiliuoksella .

i8 81 833 Käymisen aikana kasvatusliuoksesta otetaan säännöllisin väliajoin aseptisesti näytteitä, ja niiden nourseotrisiiniemäksen pitoisuus määritetään reikälevydiffuusiokokeen avulla käyttäen Bacillus subtilista ATCC 6633 koemikrobina. Myös näytteiden glukoosi-, ammoniumtyppi- ja kiintoainepitoisuudet määritetään. Prosessin kulun aikana poistuvan ilman parametrejä pH ja CO2-pitoisuus seurataan rekisteröityvin mittauksin.

Kun glukoosipitoisuus alenee arvon 5 g/1 alapuolelle, tai ammoniumtyppi arvon 0,5 g/1 alapuolelle, mikä havaitaan mitatun pH-arvon kohoamisena ja poistuvan ilman C02~pitoisuuden alenemisena, lisätään epäjatkuvasti 5000 g glukoosia tai vastaavasti 1800 g ammoniumsulfaattia väkevinä, steriileinä vesi-liuoksina .

Toiseen fermentoripanokseen ei lisätä fosfaattia, glukoosia tai ammoniumsulfaattia. pH:ta ei säädetä; jatkuvasti mitatut happamuuden arvot liikkuvat alueella pH 6,4...7,2. Kun käyminen keskeytetään, sisältää kasvatusliuos vielä yli 5 g/1 glukoosia ja 0,5 g/1 ammoniumtyppeä.

Taulukossa 4 esitetään ne nourseotrisiiniemäkset, jotka on . · määritetty molempien erilaisten käymisten kasvatusalustan _ t suodoksesta.

Esimerkki 4

Streptomyces noursein ZIMET 43710 tuottoisan kannan lyofili-soitua myseelisäilykettä, joka on suspendoitu fysiologiseen keittosuolaliuokseen, käytetään ensimmäisen submerssivaiheen siirrostukseen. Kasvatusalusta sisältää litrassa vesijohto-'* ‘ vettä: 15 g glukoosia; 15 g soijauuterouhetta; 0,3 g KH2PO4; 5,0 g NaCl; 1,0 g CaC03; pH 6,5...6,9 (laitetaan kulloinkin 50 ml 500 ml:n ravistelukolveihin).

i9 81 833

Alusta steriloidaan 120 °C lämpötilassa 35 minuuttia. Kun kasvatuksia on pyörittävässä ravistelulaitteessa 28 °C lämpötilassa inkuboitu 48 tuntia, kasvatetaan toinen submerssivaihe (laitetaan 250 ml 2000 ml: n ravistelukolveihin) pyörittävässä ravistelulaitteessa 24 tunnin ajan. Tällöin käytetään suhdetta 1 osa ymppiä ja 25 osaa ravintoalustaa.

600 ml:aa toisesta submerssivaiheesta saatua liuosta käytetään ymppikäymisen ravintoalustan, jota on 800 1, siirrostukseen. Ravintoalusta sisältää litraa kohden: 15 g glukoosia; 15 g soi jauuterouhetta; 0,3 g KH2PO4; 5,0 g NaCl; 1,0 g CaCC>3; 5 g ANTAPHROl·^-vaahdonestoainetta; 3 7,5 g auringonkukkaöljyä.

Ennen sterilointia pH-arvo asetetaan 7,2...7,4:ään, steriloinnin jälkeen pH: n arvo on 6,8...7,0. Sterilointi suoritetaan 120 °C lämpötilassa 60 minuutin ajan. Kun kasvatus on kestänyt noin 30 tuntia lämpötilan ollessa 28 °C, on fosfaattia käytetty noin 60 mg/1 ja samalla biomassaa on muodostunut 15 g/1. 800 litran siirrostemäärä riittää 18 m3:lie varsinaisen kasva- ·.·. tuksen tuotteenmuodostusalustaa.

!*'. Tuotantofermentorin ravintoalusta sisältää litraa kohden: 32,0 g perunatärkkelystä; 15,0 g soijauuterouhetta; 1,0 g NaCl; 6,0 g CaCC>3; 0,5 g ZnSC>4 . 7H2O; 2,0 g MgSC>4 . 7H2O; 3,0 g aurin-gonkukkaöl jyä; 0,3 g ANTAPHROl^®- vaahdonestoainetta; 29,0 g *.* glukoosia; 6,0 g (NH4 )2004.

Komponentit glukoosi ja ammoniumsulfaatti lisätään ravinto-alustaan erillisen steriloinnin (120 °C, 30 minuuttia) jäl keen.

- · Ravintoalusta steriloidaan 115 °C lämpötilassa 60 minuutin ajan, ennen steriloinnin aloittamista pH-arvo on asetettu 7,5 . . . 7,8 : aan, ja kun sterilointi on päättynyt, on pH saavut-tanut arvon väliltä 7,2...8,2.

20 81 833

Valmiiksi tehdyn alustan pH-arvo on välillä 7,0...7,4. Käyminen tapahtuu 28 °C lämpötilassa, ja ilmastus on tällöin 0,3 VVM (volyymia ilmaa/volyymia kasvatusliuosta minuutissa), paine 0,02 MPa ja hapen osapaine 60 %.

Kun glukoosin raja-arvo 15 g/1 tai ammoniumtyoen raja-arvo 0,2 g/1 alittuu, lisätään näitä komponentteja 50 %:na steriileinä liuoksina, kunnes kasvatusliuoksen pH saavuttaa arvon 5,2 ammoniumtyppiarvon ollessa yli 300 mg/1.

Ammoniumtypen muu lisääminen tapahtuu ammoniakkiveden annosta-misella pH:n ollessa arvoltaan vakio 5,5. Kun käymisaikaa on kulunut 130 tuntia, on biologinen aktiivisuus kohonnut arvoon 8000...11000 yg nourseotrisiinia/ml kasvatusliuosta.

Esimerkki 5

Siirrosmateriaalin kasvatukseen käytetään 2,5 1 vinopintapul-loja, joihin kulloinkin on annosteltu 400 ml steriloitua ravintoalustaa, joka litraa kohden sisältää: 40 g glukoosia? 15 g soijauuterouhetta? 0,3 g KH2PO4; 5 g NaCl; 3 g CaC03? täytetään litraksi johtovedellä. Näiden pullojen siirrostukseen käytetään 0,5 ml Streptomyces noursein ZIMET 43716 selektantin myseelisäilykkeestä valmistettua lietettä. Kasvatus tapahtuu 29 °C lämpötilassa 48 tunnin ajan pyörittävällä ravistelupöy-dällä.

Toisessa esikasvatuksen vaiheessa käytetään jaloteräsferment <-ria (bruttotilavuus 240 1), johon on laitettu 180 1 höyryste-riloitua ravintoalustaa (45 minuuttia 120 °C lämpötilassa), jonka koostumus on sama kuin ensimmäisessä esikasvatuksen vaiheessa. Fermenf >rin siirrostukseen käytetään 800 ml ensimmäisestä esikasvatusvaiheesta näin saatua kasvatusliuosta. Kasvatus kestää 40 tuntia lämpötilan ollessa 28...29 °C, sekoittajan pyörimisnopeuden ollessa 240 k ier rosta/min. ja i3 -mastusnopeuden ollessa 1,0 WM.

2i 81833

Varsinaiseen kasvatukseen käytetään jaloteräsfermer': 'reita (bruttotilavuus 4200 1) , joihin on laitettu 2500 1 ravinto-liuosta, jonka peruskoostumus on seuraava: 62,5 g maissitärk-kelystä, 2,5 g glukoosia; 16 g soijauuterouhetta; 11 g NH4SO4; 2 g MgSC>4 . 7H2O; 1 g NaCl; 6 g CaC03; 0,5 g polypropyleeni-glykolia; täytetään johtovedellä litraksi. Näihin perusaineisiin lisätään yhdessä tapauksessa 0,5 g ZnSC>4/litra vettä, ja toisessa tapauksesa 0,1 g Fe2(804)3 . 7H2O. Ennen sterilointia ravintoliuoksen happamuus asetetaan arvoon dH 6,2. Sterilointi (ilman glukoosin osuutta) suoritetaan suoralla höyrykuumennuksella 120 °C:ssa 15 minuutin ajan. Kun ravintoliuos on jäähtynyt 29 °C lämpötilaan lisätään glukoosi aseptisesti 50 % vesiliuoksena, joka on steriloitu erikseen.

Ennen siirrostusta suoritetaan ravintoliuoksen aloitushappa-muuden asettaminen pH-arvoon 6,8+0,1 rikkihapolla.

Fermentointipanokset siirrostetaan 4 % siirrosteella, joka saadaan toisesta esikasvatusvaiheesta. Kasvatus kestää 140 tuntia 29 °C lämpötilassa, ilmastusnopeuden ollessa 0,5 VVM (0. ...20. tunti) vastaavasti 1,0 VVM (20. ...140. tunti), paineen ollessa 0,03 MPa alipainetta ja sekoitusnopeuden ollessa 180 kierrosta/min. Kun kasvatusliuoksen happamuus on laskenut pH-arvoon 6,0 + 0,1, säädetään happamuutta jatkuvasti 25 %:lla ammoniumhydroksidiliuoksella.

Kasvatusliuoksesta määritetään biologisella kokeella seuraavat nourseotrisiinin pitoisuudet.

Käymis- Nourseotrisiinin pitoisuudet (mg/ml) tunti (h) ZnS04 . 7 H2O Fe2(S04)3 —- ___ __ 116. 7,1 6,8 140. 8,3 8,0 22 81833

Esimerkki 6

Siirrostemateriaalin kasvatuksessa käytetään ensimmäisessä vaiheessa 2,5 1 vinopintapulloja, joihin on kulloinkin lai tettu 400 ml steriloitua ravintoliuosta (15 g maapähkinän uuttorouhetta; 10 g maissin liotusvettä (100 % kuiva-ainetta); 40 g maltoosia; 5 g (NH4)2S04; 6 g CaCC>3; täytetään litraksi johdovedellä), ja jotka siirrostetaan Streptomyces noursein ZXMET 43716 selektantin myseelisäilykkeestä valmistetulla lietteellä. Kasvatus tapahtuu 29 °C lämpötilassa 48 tunnin ajan pyörittävällä ravistelupöydällä. Toisessa esikasvatus-vaiheessa käytetään jaloteräsfermentoria (bruttotilavuus 240 1), johon on laitettu 150 1 höyrysteriloitua ravintoalustaa (30 min, 120 °C), jonka koostumus on sama kuin ensimmäisessä esikasvatusvaiheessa. Fermentori siirrostetaan 800 ml: 11a ensimmäisestä esikasvatusvaiheesta näin saatua liuosta. Kasvatus tapahtuu 28...29 °C lämpötilassa 40 tunnin ajan, sekoitti-men pyörimisnopeus on 240 kierrosta/min. ja ilmastusnopeus 1,0 WM 0,003 MPa:n ylipaineessa.

- Varsinaiseen kasvatukseen käytetään jaloteräsfermentoria (bruttotilavuus 720 1), johon on laitettu 500 1 ravintoliuos-ta, jonka koostumus on seuraava (litraa kohden): 60 g maissi- '··' tärkkelystä; 25 g maapähkinän uuterouhetta; 10 g maissin liotusvettä (110 %:sesti kuiva-ainetta); 10 g (^4)2004; 5 g kalsiumkarbonaattia, 3 g auringonkukkaöljyä; täytetään litraksi johtovedellä. Ravintoliuoksen pH säädetään ennen sterilointia arvoon 6,8...7,0. Sterilointi suoritetaan 120 °C 30 minuutin ajan.

Fermentointipanos siirrostetaan 5 %:n siirrosteella, joka - saadaan toisesta esikasvatusvaiheesta.

Lisäksi käymisen aikana lisätään alustan litraa kohden kaksi kertaa 30 g maissitärkkelystä 30 %:na suspensiona. (Vedessä turvonnut tärkkelys nesteytetään tunnetulla tavalla käsittelemällä sitä entsyymivalmistein, joilla on amylolyyttistä aktii 23 81 833 visuutta, esim. panimoentsyymeillä. Liuos steriloidaan tämän jälkeen.) Kasvatusliuoksen happamuus pidetään vakiona pH-ar-vossa 6,2 + 0,1 25 %:lla ammoniumhydroksidiliuoksella.

Kun 144 tunnin käyminen on ohi, lämpötila oli 29 °C, sekoitti-men nopeus 320 kierrosta/min. ja ilmastusnopeus 0,75 WM 0,03 MPa-.n ylipaineessa, on saatu 580 1 kasvatusliuosta, jossa tuotteen pitoisuudeksi määritettiin 6,85 mg nourseotrisiinia/ ml.

Esimerkki 7

Varsinaiseen kasvatukseen käytetään jaloteräsfermentoria (4200 l:n bruttotilavuus), joka on varustettu steriilin ilmastuksen sekä keskeltä tapahtuvan sekoituksen vaatimin laittein. Fer-mentoriin oli laitettu 2500 litraa ravintoalustaa, jonka koostumus yhtä johtovesilitraa kohden oli 32 g perunatärkkelystä; 60 g glukoosia; 11 g soijauuterouhetta; 11 g (NH4)2S04; 2 g

MgS04 . 7H20; 1 g NaCl; 6 g CaCO3 ja 0,5 g ZnSC>4. Vaahdonesto-aineena käytetään 0,5 g ANTAPHROl^-vaahdonestoainetta NM 40 litraa ravintoliuosta kohden. Ennen sterilointia happamuus ; säädetään arvoon 6,2. Ravintoliuoksen in situ lämpösterilointi (ilman glukoosin osuutta) suoralla höyryllä suorittaminen ” perustuu siihen, että säätösuureena käytetään steriloinnin funktionaalista arvoa. Tämän säädön asetusarvo on St=35 (kon-taminoitumisvaara 10-3, solutiheys 5-106 solua/ml ravinto-liuosta ennen sterilointia) ja se säilytetään säätämällä sisäänviedyn suoran höyryn määrää, kun tasolämpötila on noin 120 °C. Steriloinnin funktionaalin St todellinen arvo on tässä saatu kaavasta

st =J (X) ] dLZ

missä f/ - / on Arrhenius-funktio sterilointilämpötilan T (t) todellisesta kulusta.

Kuvissa 1 ja 2 näkyy happoliukoisen fosfaatin pitoisuuden riippuvuus jäähdytetyssä, steriloidussa ravintoliuoksessa sekä ravintoliuoksen happamuuden riippuvuus steriloinnin funktio- 24 8 1 8 3 3 naalin ase tusarvosta; St = 35 vastaa käytettävissä olevan fosfaatin alkupitoisuuden asettamista arvoon 5 mg/1, kun pH on 8,0. pH:n alentaminen käymisen alussa fysiologisesti vaadittuun arvoon 7,4 suoritetaan rikkihappoa lisäämällä sen jälkeen, kun 50 %:isen vesiliuoksen muodossa oleva glukoosin osuus, joka on erikseen steriloitu (30 minuuttia, 120 °C) on lisätty aseptisesti.

Varsinaisen kasvatuksen käymispanosta, joka on siirrostettu toisesta esikasvatusvaiheesta saadulla 4 %:n si irrosteella, kasvatetaan 120 tuntia 29 °C lämpötilassa, jolloin ilmastusno-peus on 1250 litraa minuutissa (0. ... 12. tunti), vastaavasti 2500 litraa minuutissa (12. ... 120. tunti) 0,03 MPa:n ylipaineessa ja jolloin sekoitusnopeus on 180 kierrosta/minuutti.

Seuraavista kuvista näkyy käymisen kulku:

Kuva 3 Tuotetun nourseotrisiiniantibiootin ja biomassan kuivapainon ajallinen kehittyminen

Kuva 4 pH-arvon, glukoosi- ja ammoniumtyppipitoisuuksien ajallinen kehittyminen

Kuva 5 Ammoniumhydroksidin annostelunopeuden, fosfaattipitoi-suuden ja liuenneen hapen pitoisuuden ajallinen käyttäytyminen

Kuva 6 Hapen ja hiilidioksidin avulla saatu poistuvan kaasun ··; koostumuksen ja reaktiolämmön ajallinen kehittyminen

Kuva 7 Spesifisen tuotteen muodostumisnopeuden ja spesifisen kasvunopeuden ajallinen kehittyminen.

Mitä säätötoimenpiteisiin tulee, fermentointi suoritetaan käsikäy ttöisesti ja epä jatkuvasti suoralla fosfaatin ja glukoosin annostuksella ammoniumhydroksidin annostelunopeuden käyttäytymisen mukaan. pH:n asetusarvon vaihteluväliksi on määrätty 6,2+ 0,05 ja alaraja 6,15 saavutetaan 38 tunnin käy-misajan kuluttua.

25 81833

Suoraan fosfaatin annostukseen käytetään KH2PC>4:n steriloitua vesiliuosta. 32 ensimmäisen käymistunnin aikana tätä liuosta annostellaan siten, että yhteensä 42 mg fosforia fosfaattina lisätään kasvatusalustan litraa kohden aineenvaihdunnan aktiivisuuden kiihdyttämiseksi.

Ammon iumhydrok s id ia annostellaan 38. tunnista lähtien, minkä määrää valittu pH:n asetusarvon vaihteluväli, ravintoliuoksen puskurointitila ja emäksen pitoisuus.

Ammoniumhydroksidin annostelunopeuden kohoamisen havaittu heikkeneminen laukaisee suorat fosfaattiannostukset, kulloinkin 8,5 mg fosfaattifosforia kasvatusliuoksen litraa kohden, 47. ja 48. vastaavasti 53. ja 54. tunnin välissä.

Täten annostelunopeus saavuttaa suurimman arvonsa 62. tuntiin mennessä ja sitten lakkaa, mikä vastaa ylimenoa suorasta fosfaatt iannostuksesta epäsuoraan fosfaattiannostukseen substraateista vapautumalla. Tällä tavoin käyminen tapahtuu noin 20 tuntia optimaalisen spesifisen annostelunopeuden paikkeilla ja tämä nopeus on 230 ml 25 %:ista ammoniumhydroksidiliuosta yhtä kuutiometriä kasvatusliuosta ja tuntia kohden. Lisätty ammo-niumhydroksidiliuos riittää pitämään typpipitoisuuden fysiologisesti edullisella alueella. Siitä syystä muita typpilähteitä ei lisätä. Mitä hiilen lähteeseen tulee, antaa toisen fosfaat-tiannostuksen jälkeinen ammoniumhydroksidin annostelunopeuden kohoamisen voimistunut heikkeneminen syyn lisätä 48 q glukoosia kasvatusliuoksen litraa kohden 56. tunnin kohdalla.

Ilmoitusta 95. tunnin vaiheilla tapahtuvasta epäsuoraan fosfaattiannostukseen siirtymisestä käytetään toisen glukoosian-nostuksen laukaisuun. Toisessa glukoosiannostuksessa 18 q . . glukoosia lisätään kasvatusliuoksen litraa kohden.

Mitä liuenneen hapen pitoisuuteen tulee, suorassa fosfaattian-nostuksessa ei ole rajoituksia. Reaktiolämpö ja poistuvan - ilman koostumus osoittavat käymisvaiheiden tilan, ja niitä voidaan käyttää substraattien saatavuuden rajoittumisen vält- 26 81 833 tämiseen. Nourseotrisiinin loppuarvo 10,5 mg/ml kasvatusliuos-ta saavutetaan, mikäli tehollinen, spesifinen tuotteen muodos-tumisnopeus 45 tunnin ajan on arvojen 8 -0_2/tunti ja 9 10-3/tunti välissä. Lisäksi käytetty glukoosi kuluu täysin ja työskentelyteknisesti asetettua biomassan raja-arvoa ei ylitetä .

Esimerkki 8

Kun antibioottia eristetään, 750 litraan sellaista käymisliu-osta, jonka nourseotrisiiniemäksen pitoisuus on 2900 y/ml, lisätään 7,6 kg:sta valmistetun oksaalihapon kylläistä vesi-liuosta. Kun pH on ammoniakilla säädetty arvoon 4,2, lämmitetään liuosta lyhyen aikaa 70 °C lämpötilassa, kiintoaineosuus erotetaan separoimalla, kasvatusliuoksen suodos neutraloidaan ammoniakilla ja se separoidaan uudelleen samentavien aineiden poistamiseksi ja liuos ajetaan kahden peräkkäin kytketyn pylvään, kussakin 5 1 WOFATI1® CP-joninvaihtohartsia (Na-muotoi-nen) , läpi alhaalta ylöspäin nopeudella 25 1/tunti tuotteen adsorboimiseksi. Molempien pylväiden adsorbaatit pestään perä-. . tysten kulloinkin 30 litralla vettä, 20 litralla 0,1 N etikka- ; happoa ja 15 litralla vettä. Tämän jälkeen antibiootti eluoi- daan kulloinkin 20 litralla 0,5 N rikkihappoa ja sen jälkeen . *: 10 litralla vettä.

Eluaatit, joiden pH-arvo on alle 3,0, neutraloidaan WOFATI1® : ; AD 41-joninvaihtohartsia (CH-muotoinen).

Pylvään I eluaattiin (32,8 1) lisätään koko ajan sekoittaen niin kauan diammoniumvetyfosfaattia ja ammoniakkia, kunnes ... sakkaa ei enää muodostu pH-arvon ollessa 7,5...7,7. Kun saos tunut epäorgaaninen fosfaatti on erotettu suodattamalla, suo-·. . datetaan kirkas suodos 10 litralla WOFAT ΙΊ® KP 16-joninvaihto-

: : hartsia (H-muotoinen) ja sen jälkeen 10 litralla WOFATIT® AD

41-joninvaihtohartsia (OH-muotoinen) nopeudella 20 1/tunti suolan poistamiseksi. Kun vaihtajahartsi on pesty 20 litralla vettä, yhdistetään eluaatti ja pesuvesi (noin 55 1), konsentroidaan vakuumissa 30...40 °C lämpötilasa 6,5 litraksi ja 27 81 833 käsitellään 100 g:11a aktiivihiiltä. Suodoksen pH säädetään rikkihapolla arvoon 4,0...4,5, jonka jälkeen siihen lisätään tipoittain koko ajan sekoittaen 75 1 metanolia, jolloin amorfinen nourseotrisiinisulfaatti saostuu. Sakka erotetaan suodattamalla, pestään metanolilla ja kuivataan vakuumissa 40 °C lämpötilassa.

Pylvään II eluaatti käsitellään samalla tavalla.

Saanto:

Pylväs I: 745 g nourseotrisiinisulfaattia

/0(/25 _ -27,5° (o=l;vesi); sulfaattituhkaa D

2,2 % mikrobiologinen vaikutus: 687 yg/mg Pylväs II: 579 g nourseotrisiinisulfaattia; sulfaattituhkaa: 2,0 % mikrobiologinen vaikutus: 470 yg/mg.

Esimerkki 9 9,6 1 esimerkin 8 mukaan saatua eluaattifraktiota, josta suolat on poistettu, haihdutetaan vakuumissa 30...40 °C lämpötilassa 440 ml: n tilavuuteen, eluaattikonsentraatti käsitellään ; 12 grammalla aktiivihiiltä ja sen pH asetetaan rikkihapolla arvoon 6,0 suodatuksen jälkeen.

Sumutuskuivaus: 220 ml eluaattikonsentraattia, josta väri on poistettu, (kiin-toainepitoisuus 33 %) sumutuskuivataan laboratoriosumutuskui-vaimella Mini Spray Dryer Buchi 190. Ilman sisäänmenolämpötila on 165...175 °C ja ulostulolämpötila 85...90 °C.

Saanto: 58,4 g nourseotrisiinisulfaattia :·. Mikrobiologinen vaikutus 980 yg/mg • · /a/25 = -32,8° (c=l;vesi); sulfaattituhkaa 0,4 %

D

vesipitoisuus: 6,0 % C36,87, 37,01, H 6,48, 6,66; N 16,99, 16,95; S 5,64, 5,71; 28 81 833

Pakastekuivaus : 220 ml eluaattikonsentraattia, josta väri on poistettu, kuivataan pakastekuivauslaitteella TG 5 (valmistaja: VEB Hochvakuum Dresden). Tuotteen ulostulolämpötila on tällöin -20 °C ja loppupaine 0,03 Torr.

Saanto: 71,5 g nourseotrisiinisulfaattia

Mikrobiologinen vaikutus: 994 yg/mg /Ot/25 --34^20 ( c= 1,28 ; vesi ) . Vesipitoisuus: 3,0 %;

D

C 36,85, 36,98; H 6,32, 6,32; N 16,89, 17,16; S 5,87, 5,85;

Alkuaineanalyysi vastaa lähes seuraavaa, Streptotrisiini D:n ja Streptotrisiini F-sulfaatin 2:1 seoksen koostumusta: (2 C3iH58Ni2°10 · 2H2SO4 . 2H2O + C19H34N8O8 . H2SO4 . 2H2O).

Esimerkki 10 75 1 esimerkin 8 mukaisesti saatua kasvatusliuosta, jonka nourseotrisiiniemäksen pitoisuus on 4846 yg/mg, ajetaan WOFATI1© CP-joninvaihtohartsilla (Na-muotoinen), 2 1, täytetyn pylvään läpi alhaalta ylöspäin nopeudella 4 1/tunti antibiootin adsorboitumiseksi. Tämän jälkeen hartsi pestään seuraa-villa aineilla esitetyssä järjestyksessä: 15 1 tislattua ·. ; vettä, 9 1 0,1 N etikkahappoa ja 10 1 tislattua vettä, jonka jälkeen antibiootti eluoidaan 0,5 N fosforihapolla. Eluaatti " (pH 3...4) neutraloidaan sekoittamalla se 2 litraan WOFATIT® AD 41-joninvaihtohartsia (OH-muotoinen). Saostunut kalsium-fosfaatti suodatetaan yhdessä ioninvaihtajän kanssa ja suodok-sen pH asetetaan arvoon 7,7, jolloin ammoniummagnesiumfosfaat-ti saostuu ja se erotetaan suodattamalla. Tämän jälkeen yksiarvoiset kationit poistetaan nourseotrisiinifosfaattiliuokses-ta sekoittamalla siihen 1 1 WOFATIT^KP 16-joninvaihtohartsia (H-muotoinen) . Tämän jälkeen liuos (17 1) haihdutetaan vakuu-missa 40 °C lämpötilassa 1,5 litraksi, tehdään fosforihapolla happamaksi pH-arvoon 4,5 ja käsitellään 7,5 g:11a aktiivi- hiiltä. Kirkas suodos lisätään tipoittain 20 litraan meta-nolia. Nourseotrisiinifosfaatti muodostaa kolloidisen liuoksen, joten liuokseen lisätään 25 %:ista dimetyyliamiiniliuos- ta, jolloin nourseotrisiinisulfaatti saostuu ja muuttuu hyvin suodatettavaan muotoon. Sakka erotetaan suodattamalla, pestään metanolilla ja kuivataan vakuumissa kalsiumkloridin kanssa.

29 81 833

Saanto: 169,5 g nourseotrisiinifosfaattia /ol/25 = -29,9° (c=l;vesi); sulfaattituhkaa 1,06 %

D

Mikrobiologinen vaikutus: 818 yg/mg Esimerkki 11 75 1 esimerkin 8 mukaan saatua kasvatusliuosta, jonka nourseo-trisiiniemäksen pitoisuus on 3000 yg/mg, ajetaan 2 litralla WOFATIT® CP-joninvaihtohartsia (Na-muotoinen) täytetyn pylvään läpi alhaalta ylöspäin nopeudella 4 1/tunti. Kun hartsi on pesty 15 litralla tislattua vettä, 10 litralla 0,1 N etikka-happoa ja vielä kerran 10 litralla tislattua vettä, eluoidaan antibiootti 10 litralla 0,5 N oksaalihappoa. Eluaatti (11 1) neutraloidaan sekoittamalla se 2 litraan WOFATI AD 41-jonin-vaihtohartsia (OH-muotoinen) , saostuneet suolat ja ioninvaih-taja suodatetaan yhdessä, ja kirkas suodos sekoitetaan 2 litraan WOFATI1© KP 16-joninvaihtohartsia (H-muodossa) yksiarvoisten kationien poistamiseksi. Tämän jälkeen liuos neutra-·.: loidaan 0,5 litralla WOFATIT® AD 41-joninvaihtohartsia (OH- muotoinen) ja haihdutetaan vakuumissa 40 °C lämpötilassa 800 ml:ksi. Konsentraatti käsitellään 7 grammalla aktiivihiiltä ja suodattamisen jälkeen se lisätään tipoittain 12 litraan meta-nolia. Nourseotrisiinioksalaatti jää kolloidisena liuokseen ja se saostetaan lisäämällä 25 %:ista dimetyyliamiinia, jolloin se muuttuu hyvin suodatettavaan muotoon. Suodattamalla erotettu sakka pestään metanolilla ja kuivataan vakuumissa kalsiumkloridin kanssa.

Saanto: 162 g nourseotrisiinioksalaattia /«, /25 = -41,8° (c=l;vesi); sulfaattituhkaa: 0,9 %

D

Mikrobiologinen vaikutus: 809 yg/mg.

30 81 833

Esimerkit 12 ja 13

Kun sikojen syöttökokeissa käytettiin sellaista esisekoitettua rehua, jota oli täydennetty nourseotrisiinihydrokloridilla 40 mg/kg kuivapainoa (KP), voitiin 70 koepäivän aikana todeta noin 6 % parempi keskimääräinen elomassan kehittyminen. Kun rehuannoksen kanssa käytettiin 21 mg/kg KP nourseotrisiinia myseeliadsorbaatin muodossa, voitiin 70-päiväisen ruokintako-keen aikana keskimääräinen päivittäinen elomassan lisääntyminen kohottaa noin 23 %, ja tällöin rehun kulutus oli jopa 7 % vähäisempi kuin vertailuryhmän eläimillä.

Nourseotrisiinin antamisella vasikoille myseeliadsorbaatin muodossa porrastettuina annostuksina arvoihin 52,5 mg vaikuttavaa ainetta/eläin/päivä asti oli erittäin edullinen vaikutus eläinten terveyteen, mikä voitiin todeta kuolintapausten selvänä taantumisena sekä ripulipäivien huomattavana vähenemisenä. Edullisimmat vaikutukset vasikoiden elomassan lisääntymiseen voitiin todeta erityisesti ensimmäisen neljän elinviikon aikana. Kun päivittäinen nourseotrisiiniannostus rehussa oli 35 mg/eläin, voitiin neljä viikkoa kestäneen ruokinnan aikana todeta elomassan kehityksen parantuneen noin 25 %; 10-viikkoi-sen ruokintakokeen päätyttyä oli tämä arvo korkeimmillaan 13 / ; %.

Nourseotrisiinimyseelin sieto ei osoittautunut eläinkokeissa toksiseksi. Aina 5000 mg/kg ruumiin painoa (RP) annokset eivät vaikuttaneet koe-eläinten ruumiinpainon kehittymiseen, eikä aineen aiheuttamaa kuolleisuutta todettu. Tämä annos annettiin yhdellä kertaa koiras- ja naaras-Wistar-rotille (ruumiinpaino noin 200 g) nielusondin avulla.

' Esimerkki 12

Kun valmistetaan myseelipitoisen adsorbaatin muodossa olevaa, nourseotrisiinipitoista esisekoitetta, lisätään välittömästi käymisen lopettamisen jälkeen 0,1 litraa formaliiniliuosta 100 kasvatusalustan litraa kohden ja sekoitetaan 15...30 minuut tia. Sen jälkeen lisätään 25 %:ista rikkihappoa, kunnes happa muus on saavuttanut arvon pH 6,0.

3i 31833

Vastaavana ajankohtana valmistetaan bentoniittisuspensio, haponkestävästä materiaalista tehdyssä sekoitusastiassa siten, että 2 kg natrifioitua bentoniittia laitetaan 15 litraan vettä ja lisätään 0,2 litraa 25 %:ista rikkihappoa. Tämän suspension turpoamisajän on oltava vähintään 12 tuntia.

Kun näin valmistettu bentoniittisuspensio on sekoitettu 100 litraan kasvatusliuosta (vaikuttavan aineen pitoisuus: 5000 mg nourseotrisiinia litrassa), asettuu tavallisesti pH-arvojen 6,0 ja 6,5 väliin; tarvittaessa pH asetetaan tälle alueelle lisäämällä 25 %:ista rikkihappoa tai 30 %:ista natriumlipeää. Adsorptioprosessin aikana reaktioliuosta on koko ajan sekoitettava. Kun reaktioaika on ollut vähintään 60 minuuttia, voidaan kiintoaineen erottaminen aloittaa, ja se tapahtuu suodattamalla tai separoimalla.

Vakuumi-kääntösuodatin soveltuu erityisen hyvin tämänkaltaiseen erotustyöhön; suodatin on vastaavana ajankohtana saatettava käyttövalmiiksi siten, että sen päälle vedetään suodatuksen apuainekerros, joka on erityisesti valmistetusta kalsium-sulfaatista. 7· 10^ Pa:n alipaineella voidaan saavuttaa 250 ;:· 1/m2 h suodatustehokkuus. 100 litrasta kasvatusliuosta (noin 115 1 bentoniitti-kasvatusliuos-suspensiota) suodatetaan pois noin 93...98 litraa suodosta, jonka vaikuttavan aineen jään-nösaktiivisuus vastaa noin 5...10 % alkuaktiivisuudesta.

Välituotteena suodatettu kiintoaines painaa 12...14 kg ja sen ;; jäännöskosteus on 58...65 %. Suodatettaessa 110...115 litraa suspensiota tarvitaan 2,0...2,5 kg suodatuksen apuainetta.

: : Erotettu, kostea kiintoaines on välittömästi saatettava kuiva ukseen. Lämpimässä ilmavirrassa tapahtuvan kuivausprosessin aikana ei tuotteen lämpötila saa kohota yli 70 °C. 12...14 kg:sta kosteata kiintoainesta saadaan 4,5...5,0 kg kuivaa tuotetta, jonka nourseotrisiinipitoisuus on 75...85 kg kuivaa 32 81 833 tuotekiloa kohden. Vaikuttavan aineen pitoisuus määritettiin agarlevyn diffuusiokokeella käyttäen koemikrobina Bacillus subtilista ATCC 6633.

Kun käytetään rengasvirtakuivuria, tulee kuivasta tuotteesta niin hienorakeista, että sitä voidaan välittömästi käyttää premiksinä seosrehuun sekoittamiseen. Tuote, joka on saatu ristikko-, nauha- tai pyörrekerroskuivurista on jauhettava ennen standardisointia tai rehuun sekoitusta.

Seosrehuun sekoittaminen mitataan niin, että nourseotrisiinin pitoisuus on 5...100 mg seosrehun kuiva-ainekiloa kohden.

Yksittäisille maataloudellisille hyötyeläinlajeille ja ruokin-tajaksoihin määrättyjen seosrehuaineiden koostumus säädetään sitovasti "Eläintuotannossa käytettävän seosrehun laatuvaatimuksilla" .

Esimerkki 13

Myseelipitoisen, kuivan tuotteen muodossa olevan, nourseotri-siinipitoisen premiksin valmistamiseksi lisätään kasvatusliu-okseen välittömästi käymisen päättymisen jälkeen formaliinia, .'·· kuten esimerkissä 12 on esitetty, ja kasvatusliuoksen happa- : muus asetetaan arvoon pH 6,0 25 %:isella rikkihapolla.

Seuraavaksi näin esikäsitelty kasvatusliuos haihdutetaan varovaisesti tarkoitukseen soveltuvassa haihduttajassa (vakuumi-haihdutin, alipaine 4·104...6·104 Pa, lämpötila 70 °C), jonka jälkeen konsentraatti kuivataan vakuumivalssikuivurilla hieno-partikkeliseksi, kiinteäksi tuotteeksi. Alipaineessa 4·104...- 6-104 suoritettavan kuivausprosessin aikana ei kuivattavaa materiaalia saa kuumentaa yli 70 °C:een. Kuivatun lopputuot-teen jäännöskosteuden on oltava 3 % alhaisempi. 100 litrasta kasvatusliuosta, jonka vaikuttavan aineen alkuperäinen pitoisuus oli 5000 mg nourseotrisiini/1, saadaan 3750 g myseelipi-toista kuivaa tuotetta, jonka vaikuttavan aineen pitoisuus on 113 mg nourseotrisiinia kuiva-ainegrammaa kohti.

33 81 833 Näin saatava, myseelipitoinen kuiva tuote on jauhettava ennen standardisointia tai rehuun sekoittamista.

Vaikuttavan aineen pitoisuuden mikrobiologinen määritysmenetelmä ja seosrehun arvon määritys ovat esimerkissä 12 esitettyjen menetelmien mukaiset.

Mitä sovellutuksiin tulee, esitetään keksinnön edut jäljempänä. Siipikarjan kasvatuksessa suoritetun ruokintakokeen yhteydessä jaettiin 400 lajittelematonta Breiler-kananpoikasta (Tetra B) 8 eläintä käsittäviin alaryhmiin. Jokaista käsittelyä seurasi 10 toistokoetta. Kananpoikasten keskimääräinen massa oli kokeen alussa 38 g/eläin. Eläimille annettiin valtiollista laatuvaatimusta 1980/81 vastaavaa broilereiden syöttöön käytettävää rehua, jonka koostumus oli: 64.5 % maissirouhetta 21,0 % soijauuterouhetta 6.0 % kalajauhoa 2.0 % rehuhiivaa 3.0 % rapsia 2,5 % siipikarjalle tarkoitettua mineraaliaineseosta, jossa oli 54 g P/kg 1.0 % vaikuttavan aineen esisekoitetta broilereiden syöttöön käytettävälle rehulle (ei sisällä antibioottia).

Koervhmän rehuannoksia täydennettiin puhtaalla nourseotrisiini hydr ok lor idillä.

Porrastettujen nourseotrisiinilisäysten vaikutus elomassan kehittymiseen, rehun syöntiin ja rehun kulutukseen esitetään taulukoissa 5, 6 ja 7. Kanalassa suoritettua ruokintakoetta varten jaettiin 3000 lajittelematonta broileri-kananpoikaa (Tetra B) 100 eläimen alaryhmiin. Jokaista käsittelyä seurasi 6 uusintaa. Kokeen alussa keskimääräinen kananpojan massa oli 37.5 g. Eläimille syötetyn rehun koostumus oli, kuten edellä kuvataan. Koeryhmän rehuannokset täydennettiin puhtaalla nourseotr is iin ihydrok lor idillä.

34 81 833

Porrastettujen nourseotrisiinilisäysten vaikutukset elomassan kehittymiseen, rehun syöntiin ja rehun kulutukseen on esitetty taulukoissa 8, 9 ja 10.

Maasikalassa suoritettua ruokintakoetta varten 55 sikaa nykyään sikatuotannossa käytetyistä risteytyseläimistä jaettiin kulloinkin 11 eläintä käsittäviin alaryhmiin. Kokeen alussa keskimääräinen elomassa oli 10,5 kg/eläin.

Käytetyn seosrehun koostumus oli seuraava: 40 elomassakiloon saakka: 45.0 % vehnää 33.0 % ohraa 5.0 % kalajauhoa 5.0 % rasvatonta maitojauhetta 10.0 % soijauuterouhetta 1.0 % mineraaliaineiden seosta, jossa oli 50 g P/kg

1.0 % vaikuttavan aineen seosta sikojen kasvatusrehuun I

(ei sisältänyt antibioottia).

40 elomassakilosta lähtien: 40.0 % vehnää ;'· 48,0 % ohraa 7.0 % soijauuterouhetta 3.0 % kalajauhoa 1.0 % mineraaliaineseosta, jossa oli 35 g P/kg

1.0 % vaikuttavan aineen seosta sikojen ruokintarehuun II

(antibiootitonta) \ Koeryhmän rehuannokset täydennettiin puhtaalla nourseotrisii- : : nihydrokloridilla, vaihtoehtoisesti kormorgrisiinillä tai sinkkibasitrisiinillä.

'* Porrastettujen ergotrooppilisäysten vaikutukset elomassan kehittymiseen, rehun syöntiin ja rehun kulutukseen on esitetty taulukoissa 11, 12 ja 13.

35 81 833

Kahta maasikalassa suoritettua ruokintakoetta (kokeet A ja B) varten jaettiin kulloinkin 48 porsasta nykyään sikatuotannossa käytetyistä risteytyseläimistä kulloinkin 12 eläimen alaryhmään. Kokeen alussa keskimääräinen elopaino oli 10,7 kg (koe A), vastaavasti 12,6 kg (koe B).

Koeryhmän rehuannokset täydennettiin nourseotrisiinipremiksil-lä, joka oli myseelipitoisen adsorbaatin muodossa.

Kulloinkin 70-päiväisen kokeen aikana havaitut vaikutukset keskimääräisen elopainon kehittymiseen, rehun syömiseen ja rehun kulutukseen on esitetty taulukoissa 14, 15 ja 16.

10-päiväistä ruokintakoetta varten jaettiin 36 vasikkaa (mustankirjava mainonauta) kulloinkin 9 eläimen alaryhmiin. Kokeen alussa keskimääräinen elopaino oli 54 kg/eläin.

Maidonkorvikejuoma sisälsi litraa kohden 100 g vasikoille tarkoitettua, veteen liuotettua maidon korviketta. Tämä juoma täydennettiin myseelipitoisella nourseotrisiini-bentoniitti-; adsorbaatilla välittömästi ennen tarjoamista.

" Eläimet saivat tämän lisäksi vapaasti konsentraattia, jonka koostumus oli seuraava: :*· 30,0 % vehnärouhetta 38,0 % ohrarouhetta 20,5 % soijauuterouhetta 4.0 % sokeriruo'on kappaleita, kuivattuja 3.0 % rehuhiivaa, kuivattua " 1,5 % MILSIPAi^ (vitamiinitiiviste) sekä päivittäin heinää 0,5 kiloon asti eläintä kohden ikää :· vastaten.

Porrastettujen nourseotrisiinilisäysten vaikutus eläinten terveyteen ja vasikoiden elopainon kehittymiseen esitetään taulukossa 17.

36 81 833

•P

c C o O' —» oo lo cm ip

OI I I I I I I I —l CM p Ό LO —.LO

-P CM CO «Ό CM CM CM —1 fΉ - p

O P

C -H O

o c o (Λ —i cp

•P Ή —I

E 3d O 3 3 O ro LO OOO'OO'OCMCMO'I'^p-

4J *1 I ·—i OO O' p" Ό Ό O LO ro ro CM

(fl O O _2tf t l l l l roro-iTjiONirrfTti O 3d Ö 3d

Ό (fl C

O P O —i 3 C C (f) E O o

P P

c xi (c -I

•H 3 O LO—IOO—I—lO-^-LO

C -—I —il i i i i i i i oo cm cm O' O O r-- O' -»OO >1 —· CM CM CM ro CM —» •O ”P £ li Xi - <

—I ·- C

P ιβ · — -PO·—»

O O -P -H

O E -P C

(C 3 :« p ·Ρ Ιβ · — 3 P -h 3d O -P —ρ o

. . CO -P

. . CO o

C -H 3d (O N ·4 O CM CM O

occ o ιβ ι i i i i i i lor^-O'O'—»oolo

-•I C3·-» ·-» P CMCMCMro-^a-rocM

C 3d -H CC

O C -»O

3d - O — P

• - - I O —I U? CQ

* Ό 1/3 O ·«

—i (Λ I P

t" o «A -P

ro (fl ‘ O

^ 3d O —i 3 - X Ό — H P O P ·γ- 3 ω o ·ρ 3 <fl —»

E > p OP

M <β P C O O

CM O O £roo — O OO p CM O p- P

3d O —»3oocoO'roLO'3-r^rocMi ι ι ι ι i p ι 3 <p E-p—1 (Ncmcop-lococMcm 0) ·— —P 1—I P > 0 0 3 MP w ιβ P (fl 3 0 i. li - \Z :θ ... * 3 -p 3d p .. O > 3d (/3 . . C O C · ^3 .· · P -p S :0 • * (β (β E ιβ O C -— -n . : p o o -» p >> c o C IÄ -OE-P-P 03LOOLOOLOOLOOOOO c 3d oE-p ιβ 3cMLor--ocMLor^oLooLooLooLo o

. 3d P >3 O 3d (AOOOppp —iCMCMLOt'^OCMLOt'- E

3 CL P O ίο·—» — *— *— — — ®— — — — — —

’ - Ρ οιβρ .-O OOOOOOOOOOOOppp — M

3 P -p >3 ιβ ρ o p ~a e —; H </3 0 0 P oj 37 81 833 c 0) —-

c CC O

•rt -rt SI

e -- x >>

-3 CC

0 CO •'O' —I q_, o T3 f-( 01

0) 3 C

0 SI

C --( --- 3 3d ai λ ·η •H C .3 ε ·-> -3

3 0 cC

-3 cC

0 ·3 C-i

0 n —I s-H^ooiortooH

TJ -3 3 iiiiiioo—«mLooooooo

O 0 oorsO-LOOHN

3 CO -rt H H N N N N

E ·- 3d C 3d

C -H C

•H ·Η ·ι-4 C 3d 0 —t 0) •rH —> 0 3 •H 3d S3 0 .3 -3

O C -H

Φ i) c 0 3 — 3 .O -3 3 3d : : o - oi C cc -3

• -rt CC — — -=1- Ό O OO ro O

f CO 3d IltllTtOOOvOOOO—I SI

HJ * cO0 (3--=1-(3--( CS^ OO r— I l Ό . ; C 0 ·ι-ί -»-> —< — -h

C -3 CC

^ cC * ^ 3 3d E —( c

3 0 X

. Ό Ή -H S- i- -u 4_>

co ci O -H

C 0) Ό tö -H ^ H C 3 0 3 ω 3 3 -3 —· S 3d -H o CC ·-

M <O c E CO

N - I 3 —I LO vO —i m -3 COO f—(•HvOCDCSO'QOlO 3

1 0 CQ E 3 <3- —( -Ί OO O -O I I I I I I I I O

•rt 0 -43 —( rt —-4 —H ^ .. 3 3 cC W) cc —-

0 0 C 3 Z

3 3d CC \ ctC

3 3 3 -3 : : 03 0 0 C cc 3 — >.

• · > -t s :cc 0 0 CC £ 0 . · 3 CC -_- -rt

‘'." CSI 3 3d · - -H

Π C C (Λ

• .- O S—i-c-1 33 OO'^iO'JCOOOOO C

* - 3d O 3 -rt 0 3 Ό O SI ·ΟΓ^Ο O O O c^ O Ό O O CO

J! 3 3 3 3d 0 O —I—I—I—(SirOrttLOt— 0CM<-00 E

*-3Q-0-*J -rt - — 'N*'*'*' — =- =· =- —4

·· H J)-rt :tc ccoo OOOOOOOOOO-c-c-rtCM M

... : 3 3 > 0 0 -3 (¾ +J Ci ·γΗ ·Η ·ι-4 HI/) i-H U α 38 81 833

Taulukko 3

Kannalla Streptomyces noursei ZIMET 43716/NG 13-14 suoritettujen 1aboratoriokäymiskasvatusten nourseo-trisiinipitoisuudet käymisajan funktiona, kun KH^PO^iää, glukoosia ja ( ) 2SO4 : ää oli annostelut ja ei oltu annosteltu Käymisaika Annostus Ilman annostusta h_/iig/ml %_(vertailu) /Ug/ml % 24 1035 249 415 100 48 2980 165 1805 100 72 5412 294 1840 100 96 8311 213 3905 100 120 8800 195 4520 100 144 9230 213 4005 100

Taulukko 4

Kannalla Streptomyces noursei ZIMET 43716/NG 13-14 suoritettujen 500 1:n käymiskasvatusten nourseotrisiini-pitoisuudet käymisajan funktiona, kun Kt^PO^rää, glukoosia ja (NH^^SO^iää oli annosteltu ja ei oltu annosteltu Käymisaika Annostus Ilman annostusta (vertailu) ; V; h_/ug/ml_%_/ug/ml_%_ 20 225 216 104 100 44 1600 228 702 100 68 4858 299 1627 100 ·;' 92 4903 208 2362 100 ·;·; 1 16 6862 191 3585 100 144 7781 200 3885 100 39 81 833

Taulukko 5

Porrastettujon nourseotrisiinien lisäysten vaikutus elopainon kehittymiseen maakanalan broilerikananpojilla

Nourseotrisiini- Eläimen elopaino täydennys 14· pv:nä 28. pv:nä 52 pv:nä (mg/kg)_g_%_g_% g_%_ o 200 loo 525 100 1463 100 5.0 190 95 532 101 1469 100 10.0 208 104 548 104 1478 101 30.0 210 105 593 113 1548 106 50.0 214 107 588 112 1543 106 τ0,05 14 51 77

Taulukko 6

Porrastettujen nourseotrisiinien lisäysten vaikutus maa-kanalan broilerikananpoikien rehun syöntiin

Nourseotrisiini- Rehun syönti/eläin täydennys 28. pv 52. pv (mg/kg)_g %_g_% o 1105 100 3560 100 5.0 1087 98 3430 96 : 10,0 1183 107 3505 99 30.0 1146 104 3522 99 50.0 noo 100 3476 98

Taulukko 7

Porrastettujen nourseotrisiinien lisäysten vaikutus maa-kanalan broilerikanapoikien rehun kulutukseen (1.-52. ruokintapäivä)

Nourseotrisi ini-: hydrokloridi- 1 täydennys (mg/kg) 0 5,0 10,0 30,0 50,0

Rehun kulutus (kg/kg lisäys)_2,5 2,4_2_j_4_2_l3_2,3 T0,05 0,2 40 81 833

Taulukko 8

Porrastettujen nourseotrisiinien lisäysten vaikutus sisä-kanalan broilerikananpoikien elopainon kehittymiseen

Nourseotrisiini- Eläimen elopaino hydrokloridi- 14· pv 28. pv 52. pv täydennys (mg/kg) g_%_g_%_g_%_ 0 203 100 575 100 1477 100 20 196 97 594 103 1489 101 30 215 106 603 105 1567 106 40 219 108 614 108 1612 109 50 208 103 547 95 1544 105 T0,05 25 114

Taulukko 9

Porrastettujen nourseotrisiinilisäysten vaikutus sisäkanaian broilerikananpoikien rehun syöntiin

Nourseotrisiini- Rehun syönti hydrokloridi- 28. päivä 52. päivä täydennys (mg/kg)_g _%_g_%_ 0 1131 100 3562 100 20 1186 105 3605 102 ' ; 30 1 1 57 102 3641 102 40 1048 93 3530 99 ; 50 1061 94 3400 96 • · Taulukko 10

Porrastettujen nourseotrisiinilisäysten vaikutus sisäkanaian kanapoikien rehun kulutukseen (1.-52. ruokintapäivä)

Nourseotrisiini-hydrokloridi- 1 täydennys (mg/kg) 0 20 30 40 50 :: Rehun kulutus (kg/kg lisäys) 2,5 2,5 2,4 2,2 2,3 % 100 100 96 88 92 41 81833

Taulukko 11

Erilaisten ergotrooppisten aineiden vaikutus maasikalan porsaiden päivittäiseen elopainon kehittymiseen

Elopainoryhmä 3··-45 kg 45·..120 kg 8...120 kg ( ergotrooppi )_g_%_g_%_g_%_

Sinkkibasitrasiini 510 105 ./.

120 mg/kg (82,8)

Sinkkibasitrasiini ./. 621 101 58l 101 40 mg/kg_(86,0)_(70,7)_

Kormogrisiini 559 115 578 94 574 101 40 mg/kg_(61,3)_(74,4)_(49,8)_

Nurseotrisiini- hydrokloridi 503 104 602 98 567 100 10mg/kg (57,8) (55,0) (40,2)

Nurseotrisiini- hydrokloridi 587 121 617 101 602 106 40 mg/kg_(36,6)_(63,7)_(47,7)_

Vertailu_484 100_613 100_568_100 (Suluissa olevat arvot = Mitattujen arvojen hajontaa)

Taulukko 12

Erilaisten ergotrooppien vaikutus maasikalan sikojen päivittäiseen rehunkulutukseen

Elopainoryhmä 8...45 kg 45··.120 kg 8...120 kg (ergotrooppi)_g_%_g_%_g_%

Sinkkibasitrasiini 1,33 95 ·/· -·· 120 mg/kg 2,12 95 : Sinkkibasitrasiini ./. 2,59 97 ” 40 mg/kg_

Kormogrisiini 40 mg/kg_1,37 98_2,49 93_2,10 94

Nourseotrisi ini 10 mg/kg 1,34 95 2,58 96 2,11 95

Nourseotrisiini 40 mg/kg_1,74 124_2,65 99_2,31 104

Vertailu_1,40 100_2,67 100_2,94 100 42 81 833

Taulukko 13

Erilaisten ergotrooppien vaikutus maasikalan sikojen rehunkulutukseen (kg/kg lisäys)

Elopainoryhmä 8...45 kg 45··«120 kg 8...120 kg (Ergotrooppi)_g_|_g_%_g_%

Sinkkibasitrasiini 2.61 90 ./.

150 mg/kg 3,58 91

Sinkkibasitr asiini__4 ? 18 95_

Kormogr isiini 40 mg/kg_2,45 85 4,38 99_3,63 93

Nourseotrisi ini-hydrokloridi 10 mg/kg 2,66 92 4,28 97 3,74 95

Nourseotrisiini-hydrokloridi 40 mg/kg_2,96 102 4,26 96_3,34_98_

Vertailu 2,89 100 4,42 100 3,92 100

Taulukko 14

Porrastettujen nourseotri siinilisäysten (myseeliadsorbaattina) vaikutus maasikalan sikojen keskimääräiseen päivittäiseen elo-painon kehittymiseen (g/eläin); kokeen kesto 70 vuorokautta

Koe Vertailu Vaikuttava aine nourseotr i si i ni mg/rehukilo 7 14 21 _g_% g_%_g_%_g_% A 479 100 496 104 548 1 14 580 123 (104) (HO) (41) (118) B 584 100 564 97 594 102 6l6 106 : ; (85) (92) ( 118) (507) (Lukuarvot suluissa = mitattujen arvojen hajonta) 43 81 833

Taulukko 15

Porrastettujen nourseotrisiinilisäysten (rayseeliadsorbaattina) vaikutus maasikalan sikojen keskimääräiseen päivittäiseen rehun syöntiin (kg/rehua/eläin). Kokeen kesto 70 vuorokautta.

Koe Vertailu Vaikuttava aine nourseotrisiini (mg/rehukilo) 7 14 21 g%g %g % g % A 1,33 100 1,38 104 1,56 117 1,55 117 B 1,72 100 1,66 97 1,62 94 1,68 98

Taulukko 16

Porrastettujen nourseotrisiinilisäysten vaikutus (myseeliadsor-baattina) maasikalan sikojen keskimääräiseen rehun kulutukseen (kg/kg lisäystä). Kokeen kesto 70 vuorokautta.

Koe Vertailu Vaikuttava aine nourseotrisiini (mg/rehukilo) 7 14 21 _2_I_2_%_2_%_2_% A 2,78 100 2,78 100 2,85 102 2,63 95 B 2,94 100 2,94 100 2,73 93 2,73 93

Taulukko 17

Porrastettujen nourseotrisiinilisäysten vaikutus (myseeliadsorbaat-tina) vasikoiden terveyteen ja elopainon kehittymiseen (9 eläintä/ ryhmä)

Vaikuttava aine nourseotrisiini (mg/eläin/päivä)_0/)_17,5_35,0_52,5_

Alkupaino, ka 55 53 53 35 • : Ripulipäiviä 58 17 11 9

Kuolintapauksia 1 000

Elopainon kehittyminen (g/eläip/päivä) 1.. .4 elinviikko 488 (100%) 552 (113%) 611 (125%) 587 (120%) 1.. .10 elinviikko 663 (100%) 708 (107%) 742 (113%) 729 (110%)

Claims (6)

44 81 833

1. Menetelmä nourseotrisiinin, sen suolojen ja adsorbaattien valmistamiseksi kasvattamalla nourseotrisiinia muodostavaa Streptomyceten-kantaa Streptomyces noursei ZIMET 43716 aerobisissa olosuhteissa submerssikasvatuksena sellaisella ravinto-alustalla, joka sisältää soveltuvat hiilen ja typen lähteet sekä mineraalisuolat, ja eristämällä vaikuttava aine, tunnettu siitä, että varsinaisen kasvatuksen ravintoliuokseen lisätään vesiliukoisia sinkkisuoloja, edullisesti 0,2...1,75 millimolaarisena konsentraationa, ja/tai β -alaniinia, edullisesti 0,25...1,75 millimolaarisena konsentraationa, ja/tai alkalimetalliatsidia, edullisesti 0,05...0,25 millimolaarisena konsentraationa, ja/tai brentskatekiinia, edullisesti 0,20... 1.75 millimolaarisena konsentraationa, ja/tai etyyli-iso-amyylibarbituurihappoa (amytaalia), edullisesti 0,25...1,75 millimolaarisena konsentraationa, että varsinaisen kasvatuksen ravintoliuoksen kuumasterilointi suoritetaan edullisesti 115.. .125 °C:ssa sinkin (II), raudan (III), alumiinin (III) tai mangaanin (II) suolojen läsnäollessa, edullisesti 0,10... 1.75 millimolaarisena konsentraationa, jolloin liuokseen tarvittaessa ennen sterilointia on lisätty alkalilipeää siten, että steriloinnin loputtua saavutetaan pH-arvo alueelta 7,2 ’ : ...8,8, että käymisen aikana taataan fosfaatin syöttö alueelta 0,1...10 mg fosfaattifosforia liuoksen litraa kohti tunnissa, säilytetään pH-arvo alueella pH 5,0...6,5 110...145 tunnin, edullisesti 120...130 tunnin kestävän fermentoinnin aikana, sekä ylläpidetään fermentointilämpötila alueella 26...32 °C, edullisesti 28...30 °C, ja asetetaan hapen osapaine alueelle 30.. .80 %, edullisesti 40...60 % sekä, että muut substraatti-rajoitukset estetään ylläpitämällä hiili-typpi-pitoisuus-suhdetta 5...10 g glukoosiyksikköä 0,015...0,2 g:aan ammonium-typpeä liuoksen litraa kohti, ja että antibiootti eristetään ·*·. adsorptiolla, eluoidaan, konsentroidaan ja puhdistetaan.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att det vid värmesteriliseringen av huvudkulturens när-medium finns närvarande förutom kalciumkarbonat även sulfat-joner i en 0,05...0,20 molar koncentration.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että varsinaisen kasvatuksen ravintoliuoksen kuuma-steriloinnissa läsnä on paitsi kalsiumkarbonaattia myös sul- 45 81 833 faatti-ioneja 0,05...0,20 molaarisena konsentraationa.

3. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat '"· av att man efter ympningen av fermentationen tillsätter fos- .:. fathaltiga ämnen, fördelaktigt en vattenlösning av kalium- • · divätefos fat, kontinuerligt eller i intervaller i förhällande tili fermantationen.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentaation siirrostamisen jälkeen lisätään fosfaattipitoisia aineita, edullisesti kaliumdivetyfosfaatin vesiliuosta, jatkuvasti tai jaksottaisesti fermentaation suhteen.

4. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att det verksamma ämnet uppstär som sait av nourseotricin, ...· fördelaktigt flerbasiska salter.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaikuttava aine esiintyy nourseotrisiinisuolana, edullisesti moniemäksisten happojen suolana.

5. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att adsorptionen av det verksamma ämnet utförs med svagt sura katjonbytare.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaikuttavan aineen adsorptio suoritetaan heikosti happamilla kationinvaihtajilla.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaikuttava aine adsorboidaan bentoniitille. ·.· 1. Förfarande för framställning av nourseotricin, dess salter och adsorbat genom att odla den nourseotricinbildande Strepto-myceten-stammen Streptomyces noursei ZIMET 43715 under sub-mersa aeroba kulturbetingelser pä ett närmedium som innehäller lämpliga koi- och kvävekällor och mineralsalt, och genom att isolera de verksamma ämnena, kännetecknat av att man till huvudkulturens närmedium tillsätter vattenlösliga zinksalter fördelaktigt i en 0,2...1,75 millimolar koncentra-tion, och/eller β-alanin, fördelaktigt i en 0,25...1,75 milli-; : molar koncentration, och/eller alkalimetalliazid, fördelaktigt i en 0,05...0,25 millimolar koncentration, och/eller brenz-katekin, fördelaktigt i en 0,20...1,75 millimolar koncentration, och/eller etyl-isoamylbarbitursyra (amytal), fördelaktigt i en 0,25...1,75 millimolar koncentration, att en värmesterilisation av huvudkulturens närmedium genomförs fördelaktigt vid 115...125 °C i närvaro av salter av zink (II), 46 81 833 järn (III), aluminium (III) eller mangan (II) fördelaktigt i en 0,10...1,75 millimolar koncentration, varvid man vid behov tillsatt aikaillut före steriliseringen sä, att man vid slut-förandet av steriliseringen erhäller ett pH-värde inom omradet 7,2...8,8, att man under fermentationen garanterar en fosfat-tillgang inom omradet 0,1...10 mg fosfatfosfor per liter medium i timmen, bibehäller pH-värdet inom omradet 5,0...6,5 under den 110...145, fördelaktigt 120...130 timmar langa fer-menteringen, samt upprätthäller en fermentationstemperatur imnom omradet 26...32 °C, fördelaktigt 28...30 °C, och in-ställer syrets partialtryck till omradet 30...80 %, fördelaktigt 40...60 % samt att man förhindrar ytterligare substrat-begränsningar under bibehallandet av ett kol-kväveförhällande om 5...10 g glukosenheter till 0,015...0,2 g ammoniumkväve per liter medium och att antibiotikan isoleras genom adsorption, elueras, koncentreras och renas.

6. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att det verksamma ämnet adsorberas pä bentonit.