FI75188B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara 9'-tiaergopeptinderivat. - Google Patents

Description

75188

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten 9'-tia-ergopep-tiinijohdannaisten valmistamiseksi

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 822670 5

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten 9'-tia-ergopeptiinijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava (I)

io f1 °H ^ I

C0-NH--4^S^TJ^ (I) jossa R^on metyyli tai isopropyyli ja niiden happoadditio-suolojen valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomais-20 ta, että viljellään kaavan (I) mukaista yhdistettä tuottavaa Claviceps purpurea-kantaa hiili- ja typpilähteen, mineraali-suoja ja hivenaineita sisältävässä viljelyväliaineessa; alkaloidin muodostumisen alussa, 3-6 päivän kuluttua viljelmään lisätään L-tiatsolidiini-4-karboksyylihappoa tai tämän 25 suolaa; viljelyä jatketaan edelleen 6-12 päivän ajan, jonka jälkeen kaavan (I) mukainen yhdiste uutetaan viljelmäliemes-tä, viljelmä suodoksesta tai huovastosta sinänsä tunnetuin menetelmin ja saatu kaavan (I) mukainen yhdiste muutetaan haluttaessa happoadditiosuolakseen.

30 Tämä menetelmä voidaan suorittaa seuraavasti:

Esimerkiksi 91-tia-ergotamiinin ja 9'-tiaergotaminii-nin valmistamiseksi ensisijaisena ergotamiinia/ergotaminii-nia tuottavana kantana käytetään kantaa Claviceps purpurea Mutante NRRL 12043. Tämän viljelmää on tallennettu 20.9.

35 1979 laitokseen United States Department of Agriculture (Northern Regional Research Center), Peoria, 111. USA vil-jelmänumerolla NRRL 12043.

2 75188 9'-tia-ergokristiinin ja 9'-tia-ergokristiniinin valmistamiseen käytetään ensisijaisena ergokristiiniä/ergo-kristiniiniä tuottavana kantana kantaa Claviceps purpurea Mutante NRRL 12044. Tämän viljelmää on tallennettu 20.09.

3 1979 edellä mainittuun talletuspaikkaan viljelmänumerolla NRRL 12044.

Kantojen NRRL 12043 ja 12044 karakteristiikka ja valmistus käyttämällä a) Kannan NRRL 12043 karakteristiikka 10 Lähtösienikantaa eristettiin Bromus-heinästä, paikka kunnalla nimeltä WAllis (Sveitsi), löydetystä rihmastopah-kasta, joka sisälsi ergotamiinia. Useiden mutageenisten käsittelyvaiheiden avulla käyttämällä ultravioletti-sätei-lytystä ja kemikaaleja saatiin keksinnön mukaisesti käytet-15 tävää kantaa NRRL 12043, jota voidaan karakterisoida seuraavasti :

Pieni huovastokappale kantaa NRRL 12043 istutetaan araglevyn keskukseen elatusaineen kanssa, jonka koostumus on seuraava: 20 60 g sakkaroosia, 10 g asparagiinia, 0,5 g Casamino- happoja (Difco) , 0,25 g KH2P04, 0,25 g MgSC>4.7H20, 0,125 g KCl, 16 mg FeSC>4.71^0, 10 mg ZnS04.7H20. 15 g agaria ja tislattua vettä 1 litraksi. pH-arvo säädetään 25%:11a am-moniakkiliuoksella arvoon 6,0. Elatusainetta steriloidaan 25 20 minuuttia 120°C:ssa. Seitsemän päivän kuluttua 24°C:ssa on syntynyt kolonnio, jonka läpimitta on noin 3 cm, 14 päivän kuluttua läpimitta on noin 5 cm ja 20 päivän kuluttua noin 8 cm. Kolonnio on kupera ja lievästi poimuttunut. Reunus on diffuusi. Kolonnin keskus on väriltään beige- 30 violetti ja reunalta beige-harmaa. 20 päivän ikäinen kolon- 2 8 niosisältää cm kohden noin 1x10 kondiota. Nämä ovat soikeita ja niiden mitat ovat 6-12 x 4-7^u.

b) Kannan 12044 karakteristiikka Lähtösienikantaa eristettiin rukiista Pohjois-Ame-35 rikasta löydetystä rihmastopahkasta, joka sisälsi ergokris-tiiniä. Useiden mutageenisten käsittelyvaiheiden avulla käyttämällä ultraviolettisäteilytystä ja kemikaaleja, saatiin keksinnön mukaisesti käytettävää kantaa NRRL 12044, jota voidaan karakterisoida seuraavasti:

II

3 75188

Pieni huovastokappale kantaa NRRL 12044 istutetaan agarlevyn keskukseen elatusaineen kanssa, jonka koostumus on seuraava: 70 g mallasuutetta (Wander), 30 g perunaa (Stocki, 5 Knorr), 15 g agaria ja tislattua vettä 1 litraksi, pH-arvo on 5,3 - 5,7. Elatusainetta steriloidaan 20 minuuttia 120°C:ssa. Seitsemän päivän kuluttua 24°C:ssa on syntynyt kolonnio, jonka läpimitta on noin 2 cm, 14 päivän kuluttua läpimitta on noin 4 cm ja 20 päivän kuluttua noin 5 cm.

10 Huovasto on tasaisen kupera ja valkean, ilmatilaan kohottuvan vanumaisen sienirihmaverkon peittämä. Keskukseen muodostuu kraaterimainen nysty, jonka läpimitta on noin 1 cm. Siitä lähtee säteittäisiä laskoksia. Agarilla oleva huovasto on värjäytynyt violetiksi. Muodostuu samankeskisiä 15 alueita, jotka ovat värittyneet voimakkaammin ja sellaisia alueita, jotka ovat värittyneet heikoimmin. Reunus on dif- 2 fuusi. 20 päivän ikäinen huovasto sisältää cm kohden 1 x g 10 konidiota. Näiden mitat poikkeavat toisistaan melkoisesti (5-12 x 3-7^,u; useimmiten kuitenkin 5-6 x 3^u) . Huovas-20 to ei sisällä mitään alkaloideja.

Lisääntyminen ja ympin valmistus_ a) NRRL 12043

Kannan NRRL 12043 lisääminen ja ympin valmistus voivat tapahtua siten, että konidiot lietetään jostakin 25 edellä selostetuista kolonnioista steriloituun veteen ja tätä istutetaan viistoagarputkiloihin, joissa on agarelatus-ainetta, joka sisältää: 70 g mallasuutetta (Wander), 30 g perunaa (Stocki, Knorr), 15 g agaria ja tislattua vettä 1 litraksi. pH-arvo on 5,3 - 5,7. Elatusainetta steriloidaan 30 20 minuuttia 120°C:ssa. 14 päivän kuluttua sellainen viis- toagarviljelmä (12 ml elatusainetta reagenssilasissa, jonka läpimitta on 18 mm ja pituus 20 cm, muodoltaan kiilamainen) 9 sisältää noin 1x10 konidiota. Sellaisesta viistoagarvil- jelmästä konidiot lietetään steriloituun veteen ja näin vai- 6 7 35 mistetaan konsentraattia, jossa on 10 - 10 itiötä/ml. Sa maa elatusainetta sisältäviin viistoagarputkiloihin istute- 4 75188 taan tasaisesti kuhunkin 0,5 ml tätä suspensiota. Näitä viljelmiä inkuboidaan 24°C:ssa 14 päivän ajan. Tämän jälkeen niitä varastoidaan -40°C:ssa.

b) NRRL 12044 5 Kannan NRRL 12044 lisääminen ja ympin valmis tus voivat tapahtua siten, että konidiot lietetään jostakin edellä selostetuista kolonnioista steriloituun veteen ja tätä istutetaan viistoagarputkiloihin, joissa on edellä selostettua agarelatusainetta. 18 päivän kuluttua sellaisessa 10 viistoagarviljelmässä (12 ml elatusainetta reagenssilasis- sa, jonka läpimitta on 18 mm ja pituus 20 cm, muodoltaan g kiilamainen) on noin 1-2 x 10 konidiota. Konidiot lietetään jostakin sellaisesta viistoagarvil jelmästä steriloituun veteen ja näin valmistetaan konsentraattia, jossa on 10 - 7 15 10 itiötä/ml. Samaa elatusainetta sisältäviin viistoagar putkiloihin istutetaan tasaisesti kuhunkin 0,5 ml tätä suspensiota. Näitä viljelmiä inkuboidaan 24°C:ssa 14 päivää. Tämän jälkeen niitä varastoidaan -40°C:ssa.

Esiviljelmät 20 Keksinnön mukaista menetelmää suoritettaessa on osoit tautunut edulliseksi itiöiden viljeleminen ensin esivaiheessa (esivaiheissa) ennen tuotantoelatusaineeseen istuttamista. Aluksi on valittava elatusaine, jossa itiöiden itäminen tapahtuu hyvin ja huovasto kasvaa nopeasti. Sellaiseen ela-25 tusaineeseen soveltuvat: runsaskonsentraatioinen hiililähde mono- tai disakkaridin muodossa, mahdollisesti yhdistelmänä polyalkoholin kanssa, typpilähde aminohapon tai ammoniumsuo-lan muodossa, edelleen epäorgaaniset suolat, hivenalkuaineet ja kasvien siemenistä saadut lisäainekompleksit. pH :n säätä-30 minen välille 5-7 on edullista. Elatusaineeseen istutetaan ensimmäisessä vaiheessa runsaasti konidioita ja sen jälkeen idätetään ravistuskoneessa tai erikoisissa käymisastioissa 22-26°C:ssa 4-7 päivää. Syntyy kuohkeiden, vanumaisten, 2-3 mm:n mittaisten pigmentittömien huovastotukkojen muodosta-35 ma tiivis viljelmä, jossa on pitkiä, 3-6^u:n läpimittaisia sienirihmoja.

ti 75188 Pääviljelmät

Tuotantoelatusaineeseen, jolla on sellainen edullinen koostumus, että huovaston paino saadaan suureksi lyhyessä ajassa, istutetaan osa yhdestä tai mahdollisesti useammasta 5 esivaiheesta saadusta viljelmästä. Parhaimmaksi ja halvimmaksi hiililähteeksi on osoittautunut sakkaroosi, typpiläh-teeksi ammoniumsuolat, kuten oksalaatti, sitraatti, sukki-naatti ja formiaatti. Elatusaineessa on oltava edelleen mi-neraalisuoloja ja hivenalkuaineina rautaa ja sinkkiä. Vilje-10 lyt suoritetaan joko erlenmeyer-pulloissa tai erikokoisissa käymisastioissa. Hyvä ilmastus on tärkeää. Optimilämpö-tila on 24°C.

Alkaloidin muodostumisen alussa, tavallisesti päävil-jelyn kolmannen ja kuudennen päivän välillä, pääviljelmään 15 lisätään 1-5 g/1 L-tiatsolidiini-4-karboksyylihappoa tai tämän hapon suolaa, kuten esim. kalium-, natrium- tai ammo-niumsuolaa. Tämän jälkeen viljelmiä inkuboidaan edelleen 6-12 päivän ajan. 9-18 päivän aikana syntyy tiivis viljelmä, jonka muodostavat pääasiallisesti 0,5-3 mm:n pituiset ja 20 0,1-1 mm:n paksuiset sylinterimäiset kompaktit huovasto- osaset hienojen hahtuvien ohella. Huovastohiukkaset muistuttavat rakenteeltaan plectenchymaattista kudosta, jossa on pallomaisia tai polyedrin muotoisia - lyhytsylinterisiä, paksuseinäisiä ja voimakkaasti soluttuneita kennoja, mitoil-25 taan 6-12 x 6-14^u, etupäässä 8 x 9^-u, jonka läpi menee jopa 100^u:n pituisia sienirihmoja.

Ne ovat ruskehtaviksi värjäytyneitä. Myös viljelmä-suodos on väriltään ruskehtava.

Huovaston painon lisääntymisen ja alkaloidipitoisuu-30 den vähentyessä, alkaloidit voidaan uuttaa koko viljelmälie-mestä tunnetuin menetelmin orgaanisilla liuottimilla tai huo-vasto erotetaan suodoksesta suodattamalla tai sentrifugoi-malla ja kummatkin osat uutetaan erikseen. Pääosa peptidi-alkaloideista on rikastunut huovastoon.

35 Kaavan (I) mukaisten yhdisteiden eristäminen Nämä rikkipitoiset ergopeptiinit voidaan eristää vil- 6 75188 jelmäliemestä, viljelmäsuodoksesta tai huovastosta tunnetuin uutosmenetelmin. Puhdistus tapahtuu käyttämällä tavanomaisia puhdistusvaiheita, kuten esim. saostamalla aktiivinen osa inaktiivisilla liuottimilla tai muuttamalla vaikealiukoisiksi 5 suoloiksi. Erityisen sopivia ovat tunnetut puhdistusmenetelmät, kuten esim. kromatografointi aluminiumoksideilla, sili-kageeleillä, Sephadex LH-20 -valmisteella jne., kulloinkin sopivilla liuotinseoksilla. Kuten tunnetut ergopeptiinit, myös nämä uudet 91-tia-ergopeptiinit ovat herkkiä päivänvalo lolle. Vapaassa muodossa ja polaarisissa liuottimissa ne iso-meroituvat tiettyyn tasapainotilaan saakka kysymykseen tulevaan toiseen muotoon.

Suolamuodossa, jota voidaan valmistaa esim. metaani-sulfonihapon kanssa, 9'-tia-ergotamiini ja 9'-tia-ergokris-15 tiini säilyttävät stabiilisuutensa pitkähkön ajan.

Keksinnön mukaisia yhdisteitä ei ole toistaiseksi selostettu kirjallisuudessa. Niillä ilmenee eläinkokeessa mielenkiintoisia farmakologisia ominaisuuksia ja sen vuoksi niitä voidaan käyttää lääkeaineina.

20 Näillä yhdisteillä osoittautuu olevan erityisesti do- pamiini-reseptoreita stimuloiva vaikutus. Dopaminergiset ominaisuudet voitiin osoittaa rotilla, joissa 6-hydroksido-pamiiniruiskeella mustatumakkeeseen oli aiheutettu toispuolinen nigro-neosteriatumin dopamiiniradan vaurio, annosten 25 ollessa välillä noin 0,5 - 100 mg/kg /U. Understedt'in mukainen menetelmä, Acta physiol, scand. Suppl. 367 (1971) 69 -93/. Vaikutusaineen annon jälkeen selvä aktivoituminen oli todettavissa siten, että rotat kiersivät sen puolen suuntaan, jonka hermo oli vaurioitumaton.

30 Dopaminergisten ominaisuuksiensa perusteella uusille aineille voi löytyä käyttöä Parkinsonin taudin hoidossa.

Edelleen uusilla yhdisteillä on prolaktiinieritystä ehkäisevä vaikutus. Siten ne ehkäisevät rotalla implantaa-tioita ihonalaisesti annettujen annosten oltua 0,01 - 1 mg/kg 35 ja maidoneritystä annosten oltua 1-10 mg/kg suun kautta annettuna /kirj. viite: Experientia 34 (1978) 1330/.

7 75188

Prolaktiinieritystä ehkäisevien ominaisuuksiensa perusteella uusille aineille voi löytyä käyttöä esim. maidonerityksen ehkäisemiseksi, maidonvuodon estämiseksi, runsas-prolaktiiniverisyyden aiheuttaman sukurauhasten alikehitty-5 neisyyden ja jättikärkisyyden hoitamiseksi tai prolaktino-mian hoitamiseksi.

Edelleen uudet aineet aiheuttavat uni/valvetilakier-rossa kroonisesti implantoituneessa rotassa annoksesta noin 3 mg/kg i.p. tai annoksesta 10 mg/kg p.o. alkaen näennäisen 10 unen keston lyhentymistä ja valvetilan pidentymistä /ks.

J.M. Vigouret ym., Pharmacology 16 (1) (1978) 156-1737. Tä män lisäksi ne aiheuttavat annoksena 0,3 mg/kg i.p. glukoosiaineenvaihdunnan lisääntymistä sensorisen tiedonmuokkauk-sen aivohermotumakkeissa. (Katso L. Solokoff, Journal of 15 Cerebral Blood Flow and Metabolism 1981, 1, 7-36, H.E. Sa-vaki et al., Brain research 1982, 233, 347 ja J. McCulloch et al., Journal of Cerebral Blood Flow and metabolism 1981, 1 , 1 33-136) .

Näiden tulosten perusteella uudet aineet soveltuvat 20 vanhuustylsistymisen hoitoon, erityisesti varhaisvaiheessa ja eloisuuden lisäämiseksi.

Lisäksi keksinnön mukaisilla yhdisteillä on verisuonia supistava vaikutus, mikä voidaan osoittaa in vitro koiran Arteria carotis externa'n kierresuikaleilla /E. Miiller-25 Schweinitzer, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 292 (1976) 113-1187, annoksista 10 nM/1 alkaen.

Verisuonia supistavan vaikutuksensa vuoksi uusia aineita käytetään migreenin hoitoon.

Edelleen ne aiheuttavat rotilla, joiden aivot ja sel-30 käydin ovat vaurioituneet /Brit. J. Pharmac. Chemother. 30 (1 967), 78-87/, annoksen ollessa noin 5 - noin 50^ug/kg i.v., kauan säilyvän painetta kohottavan vaikutuksen, johon liittyy verenpaineen kohoaminen. Mellander-kissalla /Angiologi-ca 3 (1966), 77-997 ne aiheuttavat voimakkaan, annoksesta 35 riippuvan ja kauan säilyvän kapasiteettisuoniston kuroutu-misen annoksien ollessa noin 0,5 - noin 50^ug/kg i.a.

8 75188 Tämän vaikutuksen perusteella aineille voi löytyä käyttöä laskimoa jänteyttävinä aineina.

Lopuksi keksinnön mukaisilla yhdisteillä on uni/val-vetila kierron tulosten perusteella serotonierginen vaiku-5 tus. Tämän vaikutuksen ja Ungerstedt-koemallin antamat tulokset huomioiden niille voi löytyä käyttö masennustiloja lievittävinä aineina ennen kaikkea vanhemman väen osalta.

Seuraavissa esimerkeissä/ jotka selventävät lähemmin keksintöä, kaikki ilmoitetut lämpötilat ovat Celsius-astei-10 ta ja ovat korjaamattomia.

Esimerkki 1 9'-tia-ergotamiini ja 9'-tia-ergotaminiini 1. Kannan NRRL 12043 viljely a) Esiviljelmä 15 Glaviceps purpurea -kannan NRRL 12043 viistoagarvil- 9 jelmän konidioita (noin 10 ) suspendoidaan 10 ml:aan steriloitua vettä. 1 ml tätä konidiosuspensiota istutetaan 200 ml:aan esiviljelmäelatusainetta, jonka koostumus on seuraava: 20 g/litra

Sakkaroosi 100

Proflo 10

Ammoniumoksalaatti 3

Ca(N03) 2*4 H20 1 25 KH2P04 0,25

MgS04-7 H20 0,25 KC1 0,125

FeS04*7 H20 0,0166

ZnS04*7 H20 0,0068 30 tislattu vesi ad 1 litra joka on 500 ml :n Erlenmeyer-pullossa; pH säädetään NH4OH:lla arvoon 6,5. Elatusainetta steriloidaan 20 minuuttia 120°:ssa. Tätä esiviljelmää ravistellaan 24°:ssa pyörittäen viisi päivää (180 kierr./min kehä 5 cm). Kasvun päättyessä viljelmän 35 pH on 5,3 ja huovaston kuivapaino 22 g/1.

Il 9 751 88 b) Pääviljelmä 10 ml esiviljelmää istutetaan 50 ml:aan pääviljelmä-elatusainetta, jonka koostumus on seuraava: g/litra 5 Sakkaroosi 240

Ammoniumoksalaatti 9,6

Ca(N03)2'4 H20 2,5

MgS04-7 H20 0,625 KH2P04 0,625 10 KC1 0,312

FeSC>4 · 7 H2® 0,0252

ZnSO.·7 H„0 0,0102 4 2 tislattu vesi ad 1 litra .joka on 500 ml :n Erlenmeyer-pullossa; pH säädetään 25-%:isel-15 la NH4OH:lla arvoon 6,2. Elatusainetta steriloidaan 20 minuuttia 110°:ssa.

Tätä viljelmää inkuboidaan 24°:ssa pyörötäristysko-neessa (180 kierr./min, kehä 5 cm). Neljän päivän inkuboi-misajan jälkeen viljelmää kohden lisätään 90 mg L-tiatsoli-20 diini-4-karboksyylihappoa. Viljelmiä inkuboidaan pyörötä- ristyskoneessa vielä 10 päivää. Fermentaation päätyttyä viljelmät suodatetaan erilleen. Huovasto kuivataan varoen. Päävil jelmän kuivahuovaston paino on 85 g/1. Alkaloidipitoisuus on 12 mg/g. 9'-tia-ergotamiinin + 9'-tia-ergotaminii-25 nin osuus on 10 % kokonaisalkaloidipitoisuudesta.

2. Otsikon yhdisteiden eristäminen 500 g kuivahuovastoa homogenoidaan kaksi kertaa 1 600 ml:n erien kanssa seosta, jossa on metanolia ja 2 % väkevää ammoniakkia sekä kaksi kertaa 1 200 ml:n erien kans-30 sa metanolia, viisi minuuttia kullakin kerralla, Ultra-Tur-rax-laitteessa ja yhdistetyt suodokset haihdutetaan kuiviin vakuumissa enintään 40°:n haudelämpötilassa (noin 50 g viininpunaista jäännöstä). Tämä jäännös liuotetaan 500 mlraan metanolia ja suodatetaan kromatografiputkessa, jonka läpi-35 mitta on 10 cm 500 g:n aluminiumoksidierän läpi, Aktiivi-tätsstufe II (Woelm), sen jälkeen pestään 2 0CC ml:lla me- __- τ 10 751 88 tanolia ja koko suodos haihdutetaan kuiviin vakuumissa (25 g keltaista vaahtoa). Tämä jäännös erotetaan sitten kromatografisesta 200-kertaisella määrällä tuotetta Kieselgel 60 (Merck) seoksella, jossa on metyleenikloridia + 2 % me-5 tanolia. Fraktiojäännökset tutkitaan ohkokromatografisesti ja fraktiot, jotka sisältävät ainoastaan 9'-tia-ergotamii-nia vastaavia ainetäpliä (vrt. Rf-arvoja taulukossa 1), yhdistetään.

9’-tia-ergotamiini: 10 Fraktiot, jotka ohkokromatografisen analyysin perus teella ja Rf-arvoaan vastaten sisältävät ainoastaan 9'-tia-ergotamiinia, liuotetaan etikkaesteriin, suodatetaan talk-kikerroksen läpi kirkkaaksi ja vakuumissa konsentroinnin jälkeen lisätään vähän heksaania, jolloin alkaloidi kitey-15 tyy erilleen. Kiteyttämällä uudelleen samasta liuottimesta saadaan puhtaita, väriltään valkoisia - kellertäviä kiteitä. Sp. 199°:sta alkaen, hitaasti hajoten; /ie/^0 = -165° (c = 0,5 kloroformissa).

91-tia-ergotamiini-metaanisulfonaatti; 20 180 mg 9'-tia-ergotamiinia liuotetaan pieneen mää rään etanolia ja lisätään alkoholiliuosta, joka sisältää 28 mg metaanisulfonihappoa, jolloin alkaloidi kiteytyy erilleen metaanisulfonaattina. Kiteytettäessä uudelleen metano-lista saadaan puhdasta, valkeaa suolaa. Sp. 211°:sta alka-25 en, hajoten; = +76° (c = 0,51 metanolissa) .

9'-tia-ergotaminiini:

Kromatogrammifraktiot, joilla ohkokromatografisesti saadut täplä ja Rf-arvo ovat yhtenäiset (ks. taulukkoa 1), liuotetaan etikkaesteriin, yhdistetään ja suodatetaan kirk-30 kaaksi talkkikerroksen läpi. Konsentroituun liuokseen lisätään vähän heksaania, jolloin alkaloisi saostuu valkeina kiteinä. Kiteyttämällä uudelleen samasta liuottimesta saadaan puhdasta yhdistettä. Sp. 199°:sta alkaen, hajoten; = +343° (c = 0,55 kloroformissa) .

35 Taulukko 1

Ohkokromatografiset Rf-arvot ergotamiiniin (Et) ja 11 75188 ergotaminiiniin (Et-in) verrattuina

Kerros ja Tia- Et Tia- Et-in liuotin_ Et__Et-in__ 5 Alox ^

Etikkaesteri/sek.butanoli 0,44 0,34 0,68 0,59 9:1

Tolueeni/isopropanoli 0,58 0,50 0,69 0,63 9:1 10 Tolueeni/isopropanoli 0,30 0,24 0,58 0,46 19:1 2)

Silikageeli

Tolueeni/isopropanoli 0,15 0,11 0,43 0,31 85:15 15 CH Cl /metanoli 0,25 0,22 0,65 0,52 93:7 1)

Aluminiumoxid-Fertigplatten Merck F 254 (Typ E) 2)

Kieselgel-Fertigplatten Merck F 254 20 Ohkolevyillä ainetäplät näkyvät UV-valossa kohdalla 254 nm sinivioletteina ja kohdalla 366 nm vaaleansinisinä täplinä. Jodihöyryjä käyttäen ne ovat myöskin tunnistettavissa ruskeina täplinä.

Ergopeptiineille tyypillinen van Urk -reagenssi so-25 veltuu myös erinomaisesti ainetäplien toteamiseen. Suihkut-tamisen jälkeen nämä yhdisteet ilmaantuvat väriltään sinivioletteina, joka väri päivänvalon vaikutuksesta tai ku-ningasvesi-höyryllä höyrystettäessä vahvistuu.

Esimerkki 2 30 9'-tia-ergokristiini ja 91-tia-ergokristiniini 1· Kannan NRRL 12044 viljely

Kantaa NRRL 12044 viljellään esimerkin 1 mukaisesti. Pääviljelmän kuivahuovaston paino on 80 g/1. Alkaloidipitoisuus on 10 mg/kg. Otsikon yhdisteiden osuus on 8 ‘i kokonais-35 alkaloidipitoisuudesta.

2. Otsikon yhdisteiden eristäminen 12 751 88 500 g kuivahuovastoa homogenoidaan kaksi kertaa 1 500 ml:n erien kanssa seosta, jossa on metanolia ja 2 % väkevää ammoniakkia ja kaksi kertaa 1 500 ml:n erillä metanolia, viisi minuuttia kullakin kerralla, Ultra-Turrax-lait-5 teessä. Yhdistetyt suodokset haihdutetaan kuiviin vakuumis-sa enintään 40°reen haudelämpötilassa (190 g viininpunaista jäännöstä). 900 ml:aan metanolia liuottamisen jälkeen suodatetaan 10 cm:n paksuisen kerroksen läpi, jossa on 600 galu-miniumoksidia (emäksistä, aktiivisussaste 2), sen jälkeen 10 pestään 2 000 ml :11a metanolia ja suodos haihdutetaan kuiviin vakuumissa (108 g). Tämä jäännös erotetaan nyt metano-liin 3 000 g:11a tuotetta Sephadex LH-20 ja 200 ml:n fraktioita otetaan talteen ja haihdutetaan kuiviin. Fraktio jäännökset, jotka sisältävät ohkokromatografisesti todettuna 15 uusia tia-ergopeptidejä, yhdistetään (526 mg) ja kromato-grafoidaan vielä kerran 120 g:11a tuotetta Sephadex LH-20 metanolilla, josta saadaan 156 mg puhdasta 9'-tia-ergokris-tiini/-kristiniini-seosta. Näiden molempien yhdisteiden erottaminen tapahtui tunnetuin kromatografisin menetelmin 20 silikageelillä Kieselgel 60 (Merck) eluoimalla seoksella, jossa oli metyleenikloridia ja 2 % metanolia.

91-tia-ergokristiini:

Fraktiojäännökset, jotka ohkokromatografisen analyysin ja vastaavan Rf-arvonsa perusteella (vrt. taulukkoon 2) 25 sisältävät ainoastaan 9'-tia-ergokristiiniä, yhdistetään ja kiteytetään bentseenistä (28 mg). Sp. 146°, sintrautuu hitaasti hajoten; /όί/^0 = -176° (c = 0,5 kloroformissa) .

9 *-tia-ergokristiniini:

Kromatogrammifraktiot, jotka ohkokromatografisesti 30 osoittautuvat yhtenäisiksi ja joilla on vastaavien Rf-arvo-jen mukainen ainetäplä (ks. taulukko 2), yhdistetään ja kiteytetään etanoli-etikkaesteri-seoksesta. Sp. 209-210° hajoten; Z®6/^0 = +344° (c = 0,51 CHCl3:ssa).

Taulukko 2 35 Ohkokromatografiset Rf-arvot verrattuina ergokris- tiiniln (Ec) ja ergokristiniiniin (Ec-in).

13 751 88

Kerros ja Tia- Et Tia- Ec-in liuotin Ec Ec-in

Alox1)

Etikkaesteri/sek.butanoli 0,68 0,63 0,78 0,70 5 9:1

Tolueeni/isopropanoli 0,68 0,62 0,69 0,66 9:1

Tolueeni/isopropanoli 0,50 0,42 0,58 0,47 19:1 2) 10 Silikageeli

Tolueeni/isopropanoli 0,37 0,28 0,56 0,48 85:15 CH2Cl2/metanoli 93:7 0,47 0,41 0,70 0,60 1) 15 Aluminiumoxid-Fertigplatten Merck F 254 (Typ e) 2)

Kieselgel-Fertigplatten Merck F 254

Ainetäplien havainnointi kuten esimerkissä 1.

Claims (1)

1. 751 88 14 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten 9'-tia-ergopeptiinijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava 5 (I) p OH ΓΓΪΓ1 fl 0. ί J CO-NH —4^ A oJ—Ia0 (i> 10 (il Jl N-CH, H CH2~C6H5 3 HN_!1 jossa R^on metyyli tai isopropyyli, ja näiden happoadditio-suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään kaavan (I) mukaista yhdistettä tuottavaa Claviceps purpurea-kantaa hiili- ja typpilähteen, mineraa- 20 lisuoloja ja hivenaineita sisältävässä viljelyväliaineessa; alkaloidin muodostumisen alussa, 3-6 päivän kuluttua viljelmään lisätään L-tiatsolidiini-4-karboksyylihappoa tai tämän suolaa; viljelyä jatketaan edelleen 6-12 päivän ajan, jonka jälkeen kaavan (I) mukainen yhdiste uutetaan viljel-25 maliemesta, viljelmäsuodoksesta tai huovastosta sinänsä tunnetuin menetelmin ja saatu kaavan (I) mukainen yhdiste muutetaan haluttaessa happoadditiosuolakseen. Il