FI74820C - Anvaendning av vatten-dispergerbara hydrofoba faergaemnen eller pigment som maerkaemnen i immunoanalyser. - Google Patents

Anvaendning av vatten-dispergerbara hydrofoba faergaemnen eller pigment som maerkaemnen i immunoanalyser. Download PDF

Info

Publication number
FI74820C
FI74820C FI810054A FI810054A FI74820C FI 74820 C FI74820 C FI 74820C FI 810054 A FI810054 A FI 810054A FI 810054 A FI810054 A FI 810054A FI 74820 C FI74820 C FI 74820C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
dye
hcg
sol
conjugate
solution
Prior art date
Application number
FI810054A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI74820B (fi
FI810054L (fi
Inventor
Johannes Hendrikus W Leuvering
Thomas Cornelis Joseph Gribnau
Frits Roeles
Original Assignee
Akzo Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nv filed Critical Akzo Nv
Publication of FI810054L publication Critical patent/FI810054L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI74820B publication Critical patent/FI74820B/fi
Publication of FI74820C publication Critical patent/FI74820C/fi

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805Optical property

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Devices For Use In Laboratory Experiments (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

1 74820
Veteen dispergoituvien hydrofobisten väriaineiden tai pigmenttien käyttö merkkiaineina immunoanalyyseissä
Keksinnön kohteena on menetelmä immunokemiallisesti 5 reaktiokykyisen komponentin, kuten hapteenin, antigeenin tai vasta-aineen määrittämiseksi kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti vesipitoisessa testiväliaineessa, samalla käyttäen hyväksi tällaisten komponenttien immunokemiallis-ta reaktiivisuutta toistensa suhteen.
10 Tunnetaan suuri joukko menetelmiä, joilla aineita voidaan määrittää kvalitatiivisella ja/tai kvantitatiivisella tavalla ja jotka perustuvat spesifisten immuunikom-pleksien muodostumiseen. Valikoima analyyttisiä menetelmiä on käytettävissä lopuksi muodostuneiden immuunikompleksien 15 suoraa tai epäsuoraa havaitsemista varten. Paitsi osoittamista paljaalla silmällä, käytetään usein lajaalti fysikaalisia menetelmiä, kuten spektrofotometriaa, fluoromet-riaa, nefelometriaa ja elektorni-/tummatausta-mikroskopiaa. Nämä menetelmät voidaan yhdistää merkki- tai jälkiaineen 20 käyttöön. Varsinaisen immuunikompleksin asemesta havaitaan merkkiaine, joka on liittynyt kompleksin johonkin komponenttiin, niin että saavutetaan huomattavasti alempi havaitsemista ja.
Esimerkkeinä kvalitatiivisista immunokemiallisistä 25 menetelmistä voidaan mainita klassinen presipitiinireaktio (Heidelberger ja Kendall, 1930) ja immunodiffuusio - joka samalla tavalla perustuu immunosaostumiseen - (Ouchterlony, 1948), mitä 1953 seurasi Grabar'in kehittämä immunoelektro-foreesi. Kahdessa viimeksi mainitussa menetelmässä anti-30 geeni ja vasta-aine saatetaan kosketukseen diffuusion kautta agarhyytelössä. Syntynyt saostumisviiva voidaan, joko edeltävän värjäämisen jälkeen tai ilman sitä, havaita paljaalla silmällä. Eräs näiden yksinkertaisten menetelmien haitta on, että diffuusio kestää melko pitkän ajan ja että 35 havaitsemisraja on suhteellisen korkealla.
2 74820
Kvantitatiivisia määritysmenetelmiä, jotka perustuvat immunosaostumisen periaatteeseen, kehitti Mancini (1965; säteittäinen immunodiffuusio) sekä Laurell (1966; raketti-elektroforeesi). Näiden menetelmien haittoja ovat 5 samoin melko pitkä määritysaika ja/tai suhteellisen korkea havaitsemisraja.
Paitsi näitä ei-merkittyjä immunokemiallisia menetelmiä, on vuosien kuluessa kehitetty joukko merkitsemismene-telmiä, joista voidaan mainita agglutinaatio-testi, jossa 10 yksi komponenteista kiinnitetään erytrosyyttien pinnalle; immunofluoresenssi-menetelmä, jossa yksi komponenteista merkitään fluoresoivalla yhdisteellä (fluoroforilla), ra-dio-immunoanalyysi, jonka ovat kehittäneet Yalow ja Berson n. 1959 ja jossa fluoroforin asemesta jälkiaineena käyte-15 tään radioaktiivista atomia tai radioaktiivista ryhmää; sekä viimeisin entsyymi-immunoanalyysi -menetelmä, josta ensimmäiset julkaisut ilmestyivät 1971 kahden toisistaan riippumattomasti työskentelevän ryhmän toimesta, joista toisen muodostivat ruotsalaiset tutkijat Engvall ja Perlmann 20 ja toisen hollantilaiset Schuurs ja van Weemen. Periaatteessa jälkimmäinen analyysi on analoginen tunnettujen radio-immunoanalyysien kanssa sillä erolla, että radioaktiivisen merkitsemisen asemesta käytetään merkkiaineen entsyymiä.
Radioimmunoanalyyseillä, joita käytetään laajalti, 25 on epäilemättä suuri arvo, mutta niitä rasittaa joukko merkittäviä puutteita, kuten vaaratekijä, joka aiheutuu työskentelystä radioaktiivisten aineiden kanssa, reagoivien aineiden ja laitteiston kalleus, radioaktiivisesti merkittyjen reagenssien lyhytaikaisesta pysyvyys ja vaatimus, että 30 ainoastaan koulutettu henkilökunta saa tehdä tällaisia analyysejä.
Entsyymi-immunoanalyysillä ei ole näitä haittoja, mutta siitä huolimatta on toivottavaa, että kehitetään uusia analyysimenetelmiä, jotka ovat yhä herkempiä, voidaan 35 helpommin automatisoida ja/tai tekevät mahdolliseksi useiden immunokomponenttien samanaikaisen määrittämisen.
3 74820
Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään ainakin yhtä merkittyä immunokemiallisesti reaktiivista komponenttia ja jolloin tietyn reaktioajan aikana immunokemiallista reaktiota varten tai sen jälkeen, valinnaisesti vapaan ja 5 sidotun merkityn komponentin (komponenttien) erottamisen jälkeen, testiväliaineessa tai jossakin erotuksen jälkeen saadussa jakeessa määritetään merkkiaineen luonne ja/tai määrä, jolloin tämä määritys antaa kvalitatiivisen ja/tai kvantitatiivisen osoituksen määritettävästä immunokemial-10 lisesti reaktiivisesta komponentista (komponenteista). Menetelmälle on erikoisesti tunnusomaista, että mainittu merkitty komponentti (komponentit) on saatu liittämällä tällainen komponentti tai tällaisia komponentteja suoraan tai epäsuorasti hydrofobisen väriaineen tai pigmentin tai täl-15 laisella väriaineella tai pigmentillä päällystettyjen poly-meeriytimien vesipitoisen dispersion osasiin.
Tämän keksinnön mukaisesti kehitetty "immunoanalyysi dispergoidulla väriaineella" (DIA) on huomattavasti yksinkertaisempi kuin "radioimmunoanalyysi" (RIA), koska lopul-20 lisen havaitsemisen aikana voidaan käyttää yksinkertaista tuloksen lukemista paljaalla silmällä ja/tai yksinkertaisella kolorimetrillä. Verrattuna "entsyymi-immunoanalyysiin" p p (EIA, ELISA , EMIT^) määritys on yksinkertaisempi ja nopeampi, koska entsyymi/substraatti-inkubointi voidaan jättää 25 pois. Lisäksi on mahdollista määrittää kaksi tai useampia komponentteja samanaikaisesti käyttämällä merkkiaineina sellaisia kromoforoja, jotka ovat selvästi spektrofotomet-risesti erottuvia. Lopuksi väriaineen etu merkkiaineena, jota voidaan syntetisoida toistettavasti, joka voidaan luon-30 nehtia tarkasti analyyttisin/-kemallisin menetelmin ja joka on pysyvä (kolloidisten osasten muodossa), on ilmeinen verrattuna radioaktiivisiin ja entsyymi-merkkiaineisiin, joilla on rajoitettu pysyvyys ja/tai muuttuva laatu panoksittain; kun taas havaitsemisrajät ovat ainakin samanarvoiset. Dis-35 pergoitujen väriaineiden sooleilla on etuja verrattuna metalli (esim. kulta)-sooleihin kolorimetrisissä analyyseissä, 74820 4 mikä johtuu väriaine-soolien huomattavasti suuremmista mo-laarisista absorbtiokyvyistä verrattuna metallisooleihin; esimerkiksi: kulta-soli (osaskoko 50 nm) : 3 300 1.mooli-1.cm-1 5 dispersio-väriaineet 5 000 - 80 000 1.mooli-1.cm-1 vrt. K. Venhataraman: "The Analytical Chemistry of Synthetic
Dyes", Wiley & Sons, 1977).
Lisäksi väriä voidaan vahvistaa (lisäys absorptio- kykyyn) väri-merkkiaineen lopullisen määrityksen aikana 10 liuottamalla väriaine-sooliosaset orgaaniseen liuottimeen (esim. etanoliin, metanoliin, isopropanoliin). Esimerkiksi:
Merkkiaine ^max(sooli) * lEt0H> a! cmx fxx (nm) maxmax ^max e
PalanilR
Luminous Yellow G 496 70,77 28 300
Luminous Yellow G 464 110,36 44 100
PalanilR
Luminous Red G 520 48,33 19 300
Luminous Red G 544 88,27 35 300 20 v _ i _ i xl.f 1. cm 1 XX1.mooli-1. cm-1 Värillisten orgaanisten yhdisteiden, jotka ovat käyttökelpoisia hydrofobisen soolin muodossa tässä kuvatussa 25 keksinnössä, ryhmään kuuluvat kaikki hydrofobiset orgaaniset väriaineet ja pigmentit, jotka ovat veteen liukenemattomia tai liukoisia ainoastaan hyvin rajoitetusti.
Näihin tulisi sisällyttää myös vesiliukoiset orgaaniset väriaineet, sikäli kun nämä sopivissa väkevyyksissä muo-30 dostavat yhdistettyjä kolloideja, jotka, edeltävän silloit-tamisen jälkeen tai ilman sitä, voidaan stabiloida. Lisäksi on myös mahdollista käyttää leuko-kyyppivärejä, jotka ovat liukoisia emäksiseen vesipitoiseen väliaineeseen ja jotka voidaan hapettamalla muuttaa alkuperäisväriseensä ja veteen 35 liukenemattomaan muotoon; näihin kuuluvat myös leukokyyppi-värit, jotka ovat vesiliukoisia ja stabiloituja sulfaatti-puoliesterin muodossa. Toisen käyttökelpoisen ryhmän muodos- . 74820 tavat väriainekomponentit, jotka, sellaisenaan liukoisina veteen ja jotka värillisinä tai värittöminä, toisiinsa liittämisen jälkeen in situ, esimerkiksi hapettamalla tai diatsokytkennällä, voidaan muuttaa veteen liukenemattomik-5 si väriaineiksi. Edellä mainituista väriaineista voidaan esimerkkeinä mainita seuraavat ryhmät käyttäen tähän tarkoitukseen virallista "Colour Index"-nimistöä: "dispersio-värit, liuotinvärit, pigmentit, kyyppivärit, rikkivärit, peittavärit, liuennetut (leuko) kyyppivärit, liuennetut 10 (leuko) rikkivärit, naftolivärit, hapetusemäkset, kuituvä-rit" sekä "siirtovärit", joita ei vielä ole virallisesti nimetty.
Merkkiaineina käytettäviä kolloidisia väriainehiuk-kasia voidaan valmistaa lukuisilla eri menetelmillä, jotka 15 ovat ennestään tunnettuja; ks. esimerkiksi: Kruyt (toim.) (1952) "Colloid Science”, nide I, Elsevier, Amsterdam; Benkataraman (toim.): "The Chemistry of Synthetic Dyes", Academic Press, New York, Nide I (1952), II (1952), III (1970), IV (1971), V (1971); VI (1972), VII (1974), VIII 20 (1978); Dollmetsch (1976): "Untersuchungen uber die
Ursachen der Agglomeration von Dispersionsfarbstoffen durch Farbstoffhilfsmittel beim Färben", Forschungsbericht Neue Serie No. 2, Institut för Chemiefasern der Institute fur Textil- und Faserforschung Stuttgart; Leube (1978) Textil 25 Praxis International, vihko 6, 733-737; vihko 7, 823-831.
Tämän keksinnön mukainen menetelmä on erityisen sopiva jonkin immunokemiallisesti reaktiokykyisen komponentin, kuten hapteenin, antigeenin tai vasta-aineen, jotka ovat läsnä testiväliaineessa, kvalitatiivista ja/tai kvan-30 titatiivista määritystä varten, mutta sitä voidaan käyttää myös tällaisten komponenttien histologisiin tai sytologisiin määrityksiin.
Keksintö koskee myös uusia immunokemiallisia reagens-seja, jotka käsittävät hydrofobisen väriaineen tai pigmen-35 tin, joka on normaalisti luonteeltaan orgaaninen, tai tällaisella väriaineella tai pigmentillä päällystettyjen poly-meeri-ytimien osasten, joihin joko suoraan tai epäsuorasti 6 74820 on liitetty iiranunokemiallisesti reaktiokykyinen komponentti, vesipitoisen dispersion.
Samoin keksintö koskee uusia testisarjoja, jotka sisältävät tällaisen immunokemiallisen reagenssin.
5 Immunokemiallisesti reaktiokykyisen komponentin liittämisellä osaseen, suoraan tai epäsuorasti, tarkoitetaan mitä tahansa kemiallista, fysikaalista tai fysikaalis-kemiallista sidosta, kuten kemiallista kovalenttista sidosta, vetysiltoja, polaarista attraktiota tai adsorptiota, myös 10 bio-spesifinen adsorptio mukaan lukien.
Hydrofobisen väriaineen tai pigmentin tai tällaisella väriaineella tai pigmentillä päällystettyjen polymeeri-ytimien vesipitoisen dispersion osasten osaskoko on vähintäin 5 nm ja edullisesti 10-500 nm. Nämä dispersiot ovat 15 normaalisti sooleja, mutta myös muuntyyppisiä dispersioita voi esiintyä.
Väriainesoolin osasilla on varaus, joka antaa stabiloivan vaikutuksen keskinäisen hylkimisen vaikutuksesta. Lisäämällä pääasiallisesti vahvoja elektrolyyttejä, varaus-20 malli muuttuu niin, että tapahtuu kasautumista ja flokkuloi-tumista . Tämä voidaan estää päällystämällä osaset makromolekyyleillä, joissa on polaarisia ryhmiä, kuten proteiineilla, polysakkarideilla, polyetyleeniglykoleilla, poly-vinyylialkoholeilla jne.
25 Suojäävinä proteiineina on mahdollista käyttää an tigeenejä, vasta-aineita tai niiden polypeptidi-osasia, jotka vielä ovat immunokemiallisesti aktiivisia. Lisäksi on mahdollista todeta hapteeneja, jotka ovat liittyneet makromolekyyleihin (esim. proteiineihin, polysakkarideihin), 30 jotka eivät sopivan immunoanalyysin aikana saa aikaan mitään häiritsevää reaktiota muiden komponenttien kanssa. Tämän aikana saadaan samanaikaisesti väriaineen soolilla merkitty, immunokemiallisesti aktiivinen komponentti.
Saattaa tapahtua, että väriainesoolin stabiloimi-35 seksi tarvitaan esimerkiksi vasta-aineen niin suuri pitoisuus kolloidisten osasten pinnalla, että vaikutetaan tämän liikkumattomaksi tehdyn proteiinin tehokkaaseen immuno- 7 74820 kemialliseen aktiivisuuteen, esimerkiksi steerisesti estämällä. Tällaisessa tapauksessa päällystäminen voidaan suorittaa kahdessa vaiheessa: 1) päällystetään optimimäärällä (joka on määritettä-5 vä) esimerkiksi vasta-ainetta, minkä jälkeen 2) päällystetään makromolekyyliyhdisteellä (esim. proteiinilla, polysakkaridilla, polyetyleeniglykolilla, po-lyvinyylialkoholilla), joka sopivan immunoanalyysin aikana ei saa aikaan häiritsevää reaktiota muiden komponenttien 10 kanssa. Tämän "myöhemmän päällystämisen", esim. naudan see-rumialbumiinilla, tehtävänä voi samanaikaisesti olla alentaa mahdollisia ei-spesifisiä adsorptiovaikutuksia.
Toinen suojaproteiinimahdollisuus on proteiini A tai lektiinien (esim. Con A) ryhmä. Sooli-osasten alkupäällys-15 tyksen jälkeen näillä proteiinilla on mahdollisuusta, mikä johtuu näiden proteiinien spesifisestä affiniteetista, levittää selektiivisesti adsorptiolla toinen kerros immuno-globuliineja (Fc-osan kautta) ja glykoproteiineja (myös immunoglobuliinit mukaan luettuina) läsnäolevan sokerijään-20 nöksen (jäännösten) kautta.
Eräs mahdollisuus on, että väriaine-sooliosaset ensin päällystetään polymeerillä tai seakpolymeerillä, joka on inertti lopullisessa immunoanalyysissä, mink jälkeen adsorptiolla ja/tai kovalenttisella sidoksella voidaan myö-25 hemmin liittää immunokemiallisesti aktiivinen komponentti päällystysainekerrokseen. Sooli-osasten päällystämisen aikana inertillä polymeerillä tai sekapolymeerillä jokainen osanen voidaan päällystää erikseen, mutta on myös mahdollista, että useita kolloidi-osasia sisällytetään yhden ja 30 saman polymeerikerroksen sisään.
Väriaine-sooliosasten päällystäminen inertillä polymeerillä voi tapahtua kahdella tavalla: saattamalla väri-aine-sooli kosketukseen polymeerin kanssa, mitä seuraa adsorptio ja/tai kovalenttinen sitominen sooli-osasiin tai 35 saattamalla sooli monomeeri- tai erilaisten monomeerien ympäristöön ja polymeroimalla tai sekapolymeroimalla jälkimmäiset in situ. Polymerointuminen voidaan saattaa tapah- 8 74820 tumaan esimerkiksi säteilyttämällä tai lisäämällä sopiva initiaattori, kuten esimerkiksi jotakin persulfaattia. Vä-riaine-sooliosasen päällystäminen polymeroimalla in situ monomeeriliuos, jossa osanen sijaitsee, epäorgaanisen ini-5 tiaattorin, kuten persulfaatin, vaikutuksen alaisena, aiheuttaa käytännön vaikeuksia, koska sooli - kun tällainen initiaattori lisätään - flokkuloituu. Todettiin kuitenkin, että tällainen päällystäminen on kaikesta huolimatta mahdollinen suojaamalla sooli-osaset ensin ja panemalla suoja-10 tut osaset sitten monomeeriliuokseen, ja käynnistämällä polymerointi vasta sen jälkeen. Edellä mainittuja yhdisteitä voidaan käyttää suoja-aineina tätä tarkoitusta varten .
Kolloidisten väriaineosasten päällystäminen, kun 15 tavoitteena (tavoitteina) on: soolin stabilointi, immuno-kemiallisesti reaktiokykyisen komponentin levittäminen, ei-spesifisten adsorptio-vaikutusten poistaminen ja/tai vastaavasti polymeeri- tai sekapolymeeri-välittäjäkerroksen levittäminen, voidaan suorittaa suoralla/epäsuoralla ad-20 sorptiolla kolloidisilla väriaineosasilla, mutta myös ko-valenttisesti kemiallisesti sitomalla. Jälkimmäistä ohjaa sopivien funktionaalisten ryhmien läsnäolo päällystysainek-sessa ja väriaineessa. Voidaan esimerkiksi suorittaa aromaattisten aminoryhmien diatsotointi, mitä seuraa diatso-25 kytkentä aktivoituun aromaattiseen rengassysteemiin; karb-oksyyliryhmät voidaan aktivoida karbodi-imidillä ja sitten, mahdollisesti aktiivisen esterin kautta, liittää primääriseen aminokomponenttiin. Alifaattisia primäärisiä aminoryh-miä ja hydroksyyliryhmiä voidaan aktivoida esimerkiksi 30 syaanibromidilla tai halogeeni-substituoiduilla di- tai tri-atsiineilla, minkä jälkeen voi tapahtua liittäminen primääriseen aminokomponenttiin tai esimerkiksi komponenttiin, joka sisältää -SH-, -OH- tai imidiatsolyyli-ryhmän. Voidaan käyttää myös bifunktionaalisia reaktiokykyisiä yh-35 disteitä. Esimerkiksi glutaarialdehydiä voidaan käyttää primääristen aminokomponenttien keskinäistä liittämistä varten, kun taas esimerkiksi heterobifunktionaalista 9 74820 reagenssia, kuten N-sukkiini-imidyyli-3-(2-pyridyyliditio)-propionaattia voidaan käyttää primäärisen aminokomponentin liittämiseen tioliryhmän sisältävään komponenttiin.
Tässä yhteydessä voidaan myös mainita veteen liuke-5 mattomat reaktiokykyiset dispersio- ja muut reaktiokykyi-set väriaineet, joissa väriaine käsittää kromoforin, joka on kovalenttisesti sidottu ryhmään, joka jo on reaktiivinen, kuten esimerkiksi halogeeni-substituoituihin di- ja triat-siineihin, epoksiryhmiin, vinyyli-sulfoniryhmiin ja diha-10 lokinoksaliineihin /ks. Siegel, (1972): Venkataraman (toim.): "The Chemistry of Synthetic Dyes", Academic Press, New York, nide VI; Harms, 1979: Banks (toim.): "Organofluori-ne Chemicals and their Industrial Applications", Ellis Horwood Ltd., Chichester; sivut 188-2047.
15 Tavallisesti kolloidisilla väriaineosasilla merkit tyjä immunokemiallisesti reaktiokykyisiä komponentteja käytetään reagenssina yhdessä muiden reagenssien kanssa esimerkiksi hapteenien, antigeenien ja vasta-aineiden havaitsemista ja/tai kvantitatiivista määritystä varten, 20 joille immunokomponenteille voidaan ajatella kaikentyyppisiä immunokemiailisiä menetelmiä, kuten RIA:a ja EIA:a varten käytettyjä.
Siten keksinnön kohteena on myös "testisarjoja" käytettäviksi tällaisissa immunokemiallisissa menetelmissä, 25 jotka sarjat tärkeimpänä komponenttinaan sisältävät immunokemiallisesti reaktiokykyisen komponentin, joka on merkitty väriaine-soolilla, joka käsittää väriaine-soolin, jonka osaset on päällystetty suoraan tai epäsuorasti, ad-sorptiivisesti ja/tai kovalenttisesti immunokemiallisesti 30 reaktiokykyisellä komponentilla.
Eräs tavanomaisista immunokemiallisista menetelmistä on kilpaileva immunoanalyysi, jota voidaan käyttää minkä tahansa immunokemiallisesti reaktiokykyisen komponentin osoittamiseen ja/tai määrittämiseen. Esimerkiksi jonkin 35 tietyn antigeenin osoittamiseksi tämä menetelmä käsittää testinäytteen, joka sisältää tuntemattoman määrän antigeeniä, saattamisen kosketukseen joko tietyn määrän kanssa 10 74820 vastaavaa antigeenä, joka on merkitty väriaine-soolilla, ja vasta-ainetta, joka on liitetty liukenemattomaan kantajaan ja joka kohdistuu tätä antigeeniä vastaan, tai tietyn määrän kanssa antigeeniä liitettynä liukenemattomaan kan-5 timeen ja vasta-ainetta, joka on merkitty väriaine-soolilla ja joka kohdistuu tätä antigeeniä vastaan.
Sen jälkeen, kun reaktio on loppunut, väriaineen luonne ja/tai määrä määritetään sidotussa ja/tai vapaassa jakeessa, mikä antaa kvalitatiivisen ja/tai kvantitatiivisen 10 osoituksen määritettävästä antigeenistä. Tarvittaessa modifioituna analoginen menetelmä soveltuu muiden immunoke-miallisesti reaktiokykyisten komponenttien määritykseen.
Laajalti käytetään myös "sandwich"-menetelmää, joka on myös sopiva käytettäväksi immunokemiallisesti reaktio-15 kykyisten komponenttien kanssa, jotka on merkitty kolloidisilla väriaineosasilla. Tätä menetelmää käytettäessä tällainen komponentti, esimerkiksi vasta-aine, tapauksissa, joissa on määritettävä antigeeni, tehdään liikkumattomaksi liukenemattomalle kantajalle. Tämä kantaja voi olla esimer-20 kiksi reaktioastian, jossa immunokemiallinen reaktio saatetaan tapahtumaan, sisäpinta; on myös mahdollista käyttää kantajia pallosten tai pienten sauvojen muodossa. Alkuinku-boinnin jälkeen näytteen kanssa, joka sisältää antigeenin, mahdollisesti pesuvaiheen jälkeen, suoritetaan toinen inku-25 bointi vasta-aineen kanssa, joka on merkitty väriaine-soolilla, minkä jälkeen väriaine määritetään sidotussa ja/tai vapaassa faasissa.
Paitsi näitä mainittuja menetelmiä, on olemassa myös lukemattomia muita immunokemiallisiä menetelmiä, joissa vä-30 riaine-soolilla merkittyä immunokemiallisesti reaktioky-kyistä komponenttia voidaan käyttää reagenssina. Tämä koskee erityisesti erästä immunokemiallista testiä, joka perustuu agglutinointi-periaatteelle. Tässä esimerkiksi väriaine-soolilla merkitty vasta-aine lisätään nestenäytteeseen, 35 joka sisältää määritettävän antigeenin. Merkittyjen komponenttien sidottujen ja vapaiden jakeiden erottamisesta voidaan tässä luopua, koska havaitseminen perustuu väriaine- n 74820 soolin visuaaliseen arviointiin tai spektrofotometriseen/ kolorimetriseen määritykseen.
Tämä keksintö tekee myös mahdolliseksi todeta jostakin testinäytteestä erilaisia immunokemiallisesti reaktio-5 kykyisiä komponentteja, kuten esimerkiksi hapteeneja, antigeenejä ja vasta-aineita tai niiden yhdistelmiä käyttämällä samanaikaisesti kullekin osoitettavalle komponentille vastaavaa immunokemiallisesti reaktiokykyistä komponenttia, joka on merkitty kolloidisella väriaineosasella, joka on 10 tunnusomainen tälle komponentille.
Väriaineen luonteen ja/tai pitoisuuden määrittäminen testin lopussa voidaan suorittaa käyttäen erilaisia tunnettuja menetelmiä. Esimerkkeinä näistä voidaan mainita visuaalinen arviointi, joka on erikoisen sopiva kvalitatii-15 vista määritystä varten väriaineita käytettäessä; kvantitatiivista määritystä varten voidaan käyttää esimerkiksi kolorimetriaa/spektrofotometriaa. Mainitut menetelmät ovat myös sopivia lopullista havaitsemista varten agglutinaatio-testissä, jossa väriaineen pitoisuudella ei ole niinkään 20 paljon merkitystä, vaan sen sijaan väriaine-soolin ulkonäöllä (enemmän tai vähemmän kasautumista, mahdollista flokkuloitumista, tästä aiheutuvia kirjomuutoksia). Lisäksi voidaan väriaineen (tai väriaineiden samanaikaisen määrityksen aikana) kvantitatiivista määritystä varten ajatella 25 fluorometriaa ja -metallikompleksi-väriaineiden ja/tai pigmenttien ollessa kysymyksessä, "normaalia" ja/tai liekitöntä atomiadsorptio-spektrofotometriaa. Keksintöä kuvataan nyt yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien avulla.
Esimerkki 1 30 Ihmisen sikiön suonikalvo-gonadotropiinin (HCG) ko- lorometrinen ja/tai visuaalinen määritys DIA-periaatteen mukaisesti ("sandwich-testi").
1.1 Väriaine-soolin valmistus
PalanilR red BF (BASF, 7 g) dispergoitiin tislattuun 35 veteen (140 ml). Dispersiota sekoitettiin 45 minuuttia huoneen lämpötilassa ja lingottiin sitten (30 min., 125 g = 1 225 N/kg). Sakan päällä oleva neste siirrettiin toisiin 12 7482 0 sentrifugiputkiin ja lingottiin (30 min., 7 500 g = 73 500 N/kg). Sakan päällä oleva neste poistettiin ja pelletti pestiin kolmasti tislatulla vedellä (3 x 140 ml, linkoaminen: 30 min., 7 500 g = 73 500 N/kg). Pelletti sus-5 pendoitiin uudelleen tislattuun veteen (70 ml) ja sen jälkeen lisättiin niin monta lasihelmeä (läpimitta 3 mm ja läpimitta 4 mm, seos 1/2), että nestetaso oli sama kuin la-sihelmien taso. Sitten ravisteltiin viisi päivää huoneen lämpötilassa ravistustelineessä. Neste dekantoitiin ja 10 lingottiin (30 min., 300 g = 2 940 N/kg). Sakan päällä oleva neste siirrettiin sitten toisiin sentrifugi-putkiin ja lingottiin uudelleen (30 min., 1 000 g = 9 800 N/kg). Tästä jälkimmäisestä sakan päällä olevasta nesteestä imettiin varovasti 3/4-osaa (52,5 ml) ja tätä väkevöityä väriaine-15 soolia varastoitiin huoneen lämpötilassa. Tämän soolin 20-kertaisesti laimennetun näytteen ekstinktio 533 (=X ) J max nm:ssä oli 1,57.
1.2. Kaniini-anti-HCG-immunoglobuliini/väriainesooli-konjugaatin valmistus 20 Edellä kohdassa 1.1. kuvatun väriaine-soolin näyte (0,8 ml) laimennettiin tislatulla vedellä (4,2 ml) ja pH säädettiin 7,0:aan käyttäen 0,1 mol/1 NaOH tai HC1. Tämän soolin ekstinktio on 5,0 533 nmrssä (= \a> £) . Sen jälkeen lisättiin kaniini-anti-HCG-immunoglobuliini-liuosta (0,1 ml); 25 reaktioseosta ravisteltiin 15 minuutin välein yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin naudan seerumialbumiini (BSA)-liuosta (1 ml; 307,2 g BSA + 0,1 g natriummertiolaattia + 5 mmol NaCl/1, pH 7,0). Dispersiota ravisteltiin 15 minuutin välein yhden tunnin ajan huoneen 30 lämpötilassa ja lingottiin sitten (30 min., 4 000 g = 39 200 N/kg). Sakan päällä oleva neste poistettiin ja pelletti suspendoitiin uudelleen 15 ml:n tilavuuteen asti liuosta, jolla oli seuraava koostumus: 51,2 g BSA + 0,1 g natriummertiolaattia + 5 mmoolia NaCl/1 (pH asetettu 7,0:aan 35 o,l mol/1 NaOH:11a).
Kaniini-anti-HCG-immunoglobuliini-liuos valmistettiin seuraavasti: kaniini-anti-HCG-seerumin immunoglobulii- 13 74820 ni-jae eristettiin tunnetulla Na2SO^-saostusmenetelmällä. Sakka liuotettiin ja dialysoitiin vesipitoista liuosta vastaan, jossa oli 5 mmoolia/1 NaCl ja jonka pH oli säädetty 7,Oraan kiinteällä Na^O^illa. Dialysoitu liuos lai-5 mennettiin lopuksi proteiini-pitoisuuteen 1 mg/ml (Warburg-Kalckar -kaavan mukaisesti: proteiinipitoisuus (mg/ml) = 1,45 x A»-0,75 x , tai 0,65 mg/ml (sen mukaan,
η Zov i o zbU
että A = 14,5 IgGslle).
ä oU
1.3. Microelisa -levyjen ''päällystäminen" kaniini-10 anti-HCG-immunoglobuliinilla
Fosfaattipuskuri (FFB): 0,04 mol/1 Na^PO^ ja 0,04 mol/1 NaH2P0^ sekoitettiin antamaan liuos, jonka pH oli 7,4; sitten lisättiin NaClra 0,15 mol/1 väkevyyteen asti.
15 Liuos A
Kaniini-anti-HCG-immunoglobuliinia (ks. 1.2.) liuotettuna FFB:aan 30 mg/1 pitoisuuteen asti.
Liuos B
20 g BSA + 0,1 g natriummertiolaattia/1 FFB.
20 Liuosta A (0,11 ml) pipetoitiin Microelisa -levy jen syvennyksiin, minkä jälkeen levyjä inkuboitiin 16 tuntia 0-4°C:ssa. Imemisen jälkeen lisättiin liuosta B (0,11 ml) jokaiseen syvennykseen, minkä jälkeen levyjä inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lopuksi syven-25 nykset imettiin ja pestiin kolmasti tislatulla vedellä, minkä jälkeen levyt kuivattiin (16 tuntia huoneen lämpötilassa esikuivatulla piihappogeelillä), pakattiin alumiini-laminaatti-pusseihin (pienen piihappogeelipussin kanssa) ja varastoitiin 4°C:ssa.
30 1.4. Standardi-käyrän määrittäminen HCGrlle fosfaat tipuskurissa ja puhtaassa virtsassa
Fosfaattipuskuri (FFB)
Kuten kohdassa 1.3. selostettiin, mutta käyttäen 1 g BSA/1 ja 1 g natriummertiolaattia/1.
35 Pesupuskuri I
Fosfaattipuskuri.
14 74820
Pesupuskuri II
0,1 mol TRIS /(HOCH2) .^ΟΝΗ^/ + 0,1 mol NaCl + 0,5 g TweenR-20 + 0,1 g natriummertiolaattia/1, pH säädetty 7,4:ään 4 mol/1 HClslla.
5 Etanoli
Keskimäärin 96-%:inen (tilav./tilav.).
HCG
Ihmisen sikiön suonikalvo-gonadotropiinin liuos, joka sisältää 1 000 IU (immunoanalyysi)/ml FFB.
10 Puhdas virtsa
Naisten, jotka eivät ole raskaana, virtsa, suoda-R
tettu Hyflo :11a ja jäädytetty sen jälkeen; suodatettu ennen käyttöä taitetun suodattimen läpi.
Konjugaatti 15 Väriaine-sooli/anti-HCG-konjugaattia, joka oli val mistettu, kuten kohdassa 1.2. selostettiin, (9 ml) sekoitettiin väkevöidyn fosfaattipuskurin (1 ml: 10-kertaisesti väkevöity FFB) kanssa.
Menettelytapa: 20 1. Tehtiin HCG-liuoksen seuraava laimennussarja FFBseen ja vastaavasti virtsaan: 4 000, 1 000, 250, 62,5, 15,6, 3,9 ra IU (immunoanalyysi)/ml.
2. 0,1 ml näitä liuoksia ja puhdasta FFB ja virtsaa
D
pipetoitiin Microelisa -levyn, joka oli sitä ennen "pääl- 25 lystetty", kuten kohdassa 1.3. selostettiin, kaniini-anti-HCG-immunoglobuliinilla (ks. 1.3.), syvennyksiin. Kaikki tämä tehdään kaksinkertaisesti.
3. Levy suljetaan sopivalla kannella ja inkuboi-tiin 3,5 tuntia 37°C:ssa vesihöyryllä kyllästetyssä atmos- 30 fäärissä.
4. Syvennykset imetään, pipetoidaan pesupuskuria I (0,3 ml) jokaiseen syvennykseen ja imetään jälleen.
5. Jokaiseen syvennykseen pipetoidaan konjugaattia (0,1 ml).
35 6. Inkuboidaan, kuten kohdassa 3 selostettiin, mut ta nyt 18 tuntia.
is 74820 7. Syvennykset imetään, väri arvioidaan silmämääräisesti syvennyksissä ja/tai pipetoidaan pesupuskuria II (0,3 ml) syvennyksiin. Imetään ja toistetaan tämä työvaihe vielä kahdesti.
5 8. Lisätään etanolia (0,12 ml) kaikkiin kuiviin sy vennyksiin, ravistellaan lievästi ja arvioidaan väri silmämääräisesti ja/tai mitataan ekstinktio 516 nmrssä (=λ ).
Jos, käyttäen kuvattua menettelytapaa, mukaan otetaan näytteitä, joilla on tuntematon HCG-pitoisuus, voi-10 daan HCG-pitoisuus helposti arvioida silmämääräisesti; tarkempi määritys voidaan tarvittaessa suorittaa ekstinktio-mittauksella ja vertaamalla standardikäyrään. Tällä tavalla määritettyjä standardi-käyriä HCG:lle virtsassa ja FFBtssa on esitetty kuviossa 1.
15 Havaitsemisraja, joka on määritelty (puhdas + 2 x standardipoikkeama) on FFBrlle 3,9 m IU (immunoanalyysi)/ml ja virtsalle 15,6 IU (immunoanalyysi)/ml.
1.5. HCG:n määritys naisten virtsassa raskauden havaitsemiseksi 20 Reagenssit
Ks. kohta 1.4.
Menettelytapa
Kuten kohdassa 1.4. selostettiin, mutta nyt sisällyttäen vastaavat virtsanäytteet, jotka voivat olla laimen-25 nettuja tai laimentamattomia. Tulokset on esitetty seuraa-vassa taulukossa: Näyte Laimennus Pregnos- Visuaa- A-.,. HCG väk.
ticonR lisesti "All-in" 30 1374 laimentamaton + + 0,588 4 000
1374 1:10 + + 0,595 40 000X
1130 laimentamaton + + 0,659 4 000 305 laimentamaton + + 0,707 4 000 726 laimentamaton - - 0,057 80 35 546 laimentamaton - - 0,043 65 1123 laimentamaton - - 0,047 65 laimentamattomassa näytteessä is 74820
Johtopäätös siitä, onko kysymyksessä raskaus vai ei, p vastaa tuloksia Pregnosticon "All-in"-raskaustestistä. Tässä jälkimmäisessä testissä "+" = >1 000 IU/ml ja = <500 IU/1.
5 Esimerkki 2
Kuten esimerkki 1, mutta valmistettiin dispersiovä- p ri/anti-HCG-konjugaatteja käyttäen Resolin Brilliant Blue p RRL ja fluoroivia dispersioväiriaineita Samaron Brilliant p p
Red H6GF, Samaron Brilliant Yellow H10GF, Palanil Luminous p 10 Red G ja Palanil Luminous Yellow G kolloidisina merkkiaineina (vastaavia A^nax~arvoja varten ks. esimerkki 9).
HCG:n laimennussarjoja tehtiin puskuriin. Tutkittiin inkubointiaikojen lyhentämistä verrattuna standardimenette-lytapaan: HCG-inkubointi 2,5 tuntia ja konjugaatti-inkuboin-15 ti 2,5 tuntia vastaavasti 6,5 ja 18 tunnin asemesta. Havait-semisrajaksi saatiin 0,02 - 0,25 mIU HCG/ml. Tämä on varsin hyvin verrattavissa muihin testisysteemeihin: - RIA: 2 mIU HCG/ml /DL.HCG-pitoisuus (90 %:n sitominen + 2 x SD):11a/ 20 - EIA: 20 mIU HCG/ml (DL: kuten RIA:11a) - SPIA: 0,25 - 1. mIU/ml (DL: puhdas + 2 x SD) (kolorimetrinen havaitseminen) - rev-HAI: 10-20 mIU HCG-ml (DL: HCG-pitoisuus, joka antaa merkittävän muutoksen malliin).
25 Lisäksi kokonaistestausaikaa lyhennettiin 24,5 tun nista viiteen tuntiin, millä oli ainoastaan rajoitettu vaikutus havaitsemisrajaan (Samaron Brilliant Red H7GF:n tapauksessa) .
Fluoresoivia dispersiovärejä tutkittiin havaitsemis- 30 rajan parantamiseksi mittaamalla fluoresenssi absorbans-
R
sin asemesta. Merkitsevä parannus saatiin Samaron Brilliant p
Yellow H10GF:n ja Palanil Luminous Yellow G:n kohdalla, p kun taas mitään vaikutusta ei havaittu Samaron Brilliant p
Red H6GF:n ja Palanil Luminous Red G:n ollessa kysymykses-35 sä.
17 74 8 2 0
Esimerkki 3 DIA Hepatitis B-pinta-antigeenille (HBsAg); sandwich-järjestelmä.
3.1. Väriaine-soolin valmistus p 5 Ks. osa 1.1.; dispersiovärejä Palanil Red BF ja £
Samaron Brilliant Red H6GF käytettiin kolloidisina merkkiaineina. (Vastaavia A -arvoja varten ks. esimerkki 9.) max 3.2. Lammas-(anti-HBsAg) IgG/väriaine-konjugaatin valmistus 10 Ks. osa 1.2.; mutta käyttäen lammas-(anti-HBsAg) immunoglobuliinia kaniini-anti-HCG IgG:n asemesta.
3.3. Microelisa -levyjen päällystäminen lammas-(anti-HBsAg) IqGilla
Ks. osa 1.3.; käyttäen lammas-immunoglobuliinia ka-15 niini-immunoglobuliinin asemesta.
3.4. Standardikäyrien määrittäminen HBsAg:lie (alatyypit ad ja ay)
Valmistettiin HBsAg:n (ad ja ay) laimennussarja käyttäen ihmisen negatiivista vertailuseerumia laimennus-20 aineena, alueella 4-1 000 ng/ml. Näiden laimennusten näytteitä (0,1 ml) ja negatiivisen vertailuseerumin näytteitä analysoitiin osassa 1.4. kuvatun menetelmän mukaisesti (vaiheet 3-8); A (etanoli) varten ks. esimerkki 9.
ITlaX
Havaitsemisrajat 16-23 ng/ml (ad) ja 24-38 ng/ml 25 (ay) saatiin Samaron -väri/konjugaatilla. Vertailun vuoksi: p EIA (Hepanostika ): 3 ng/ml EIA (Hepanostika-T ): 0,7 ng/ml (DL: keskimääräinen negatiivinen arvo + 5 x SD) SPIA: 20-40 ng/ml (DL: puhdas + 2 x SD) (kolorimet-30 rinen havaitseminen).
DIA/sandwich-järjestelmää käytettiin myös monokloo-nisten vasta-aineiden useiden näytteiden vertaamiseen heterogeenisen lammas-anti-HBsAg IgG:n standardivalmisteeseen. Kolme näytettä antoivat annos/vastekäyriä, jotka olivat sa-35 manlaisia kuin standardi, kun taas muut valmisteet olivat selvästi huonompilaatuisia.
Esimerkki 4 ie 7482 0 DIA ihmisen istukka-laktogeenille (HPL); sandwich-järjestelmä.
4.1. Väriaine-soolin valmistus .
5 Ks. osa 1.1.; Dispersiovärejä Palanil Red BF ja p
Palanil Yellow 3G käytettiin kolloidisina merkkiaineina (vastaavia *max -arvoja varten ks. esimerkki 9).
4.2. Kaniini-(anti-HPL) IgG/väri-konjugaatin valmistus Ks. osa 1.2.; mutta käyttäen anti-HPL anti-HCG:n ase- 10 mesta.
£ 4.3. Microelisa -levyjen päällystäminen kaniini-anti-HPL IgG:lla.
Ks. osa 1.3.; mutta käyttäen anti-HPL anti-HCG:n asemesta.
15 4.4. Standardikäyrien määrittäminen HPL:lie
Valmistettiin HLP:n laimennussarja FFB:hen (ks. osa 1.4.) alueella 0,4 - 100 ng/ml. Näiden laimennosten näytteitä (0,1 ml) ja FFB:n näytteitä analysoitiin osassa 1.4.
(vaiheet 3-8) kuvatun menetelmän mukaisesti; χ (etanoli) max 20 varten ks. esimerkki 9.
Saatiin havaitsemisraja 1,2 - 1,7 ng HPL/ml. Vertailun vuoksi: RIA: 0,03 - 0,14 ng/ml EIA: 2 ng/ml 25 SPIA: 0,12 ng/ml (kolorimetria)
Esimerkki 5 DIA anti-Rubella:lle; sandwich-järjestelmä.
5.1. Väriaine-soolin valmistus
Ks. osa 1.1.; dispersiovärejä Palanil Red BF ja p 30 Resolin Brilliant Blue RRL käytettiin kolloidisina merkkiaineina (vastaavia -arvoja varten ks. esimerkki 9).
5.2. Lammas-anti-(ihmis-IqG) IgG/väri-konjugaatin valmistus
Ks. osa 1.2.; mutta käyttäen lammas-immunoglobulii-35 nia kaniiniaineksen asemesta.
19 74820 p 5.3. Microelisa -levyjen päällystäminen inaktivoi- dulla Rubella-virusantigeenilla (saatu kudosviljelmäs-tä)
Ks. osa 1.3.; mutta käyttäen Rubella-antigeenia im-5 munoglobuliinin asemesta.
5.4. Standardikäyrien määrittäminen ihmisen anti-Rubella1 lie
Valmistettiin ihmisen anti-Rubella-laimennussarja käyttäen laimennusaineena lampaan negatiivista vertailu-10 seerumia, alueella 0,4 - 320 IU/ml. Näiden laimennosten ja negatiivisen vertailuseerumin näytteitä (0,1 ml) analysoitiin osassa 1.4. (vaiheet 3-8) kuvatun menetelmän mukaisesti; λ (etanoli) varten ks. esimerkki 9.
Havaitsemisraja, määriteltynä (BL + 2 x SD):na, oli 15 2,5 IU/ml, joka on edullisesti verrattavissa Rubenostikan havaitsemisrajän arvioon n. 10 IU/ml.
Esimerkki 6 DIA ihmisen prolaktiinille (PRL); sandwich-järjestelmä .
20 6.1. Väriaine-soolin valmistus
Ks. osa 1.1.; Dispersio-värejä Palanil Luminous Red £ G ja Palanil Luminous Yellow G käytettiin kolloidisina merkkiaineina (vastaavia Xmax-arvoja varten ks. esimerkki 9) .
25 6.2. Monokloonisen (anti-PRL) IgG/väri-konjugaatin valmistus
Ks. osa 1.2.; mutta käyttäen monokloonista IgG:tä kaniiniaineksen asemesta.
6.3. Microelisa -levyjen/nauhojen päällystäminen 30 monokloonisella (anti-PRL) IgG:lla.
Ks. osa 1.3.; mutta käyttäen monokloonista IgG:tä kaniiniaineksen asemesta.
Huom.: Immunoglobuliineja eri klooneista käytettiin konjugaatin (6.2.) valmistukseen ja levyjen/nauhojen pääl-35 lystämiseen.
20 7 4 8 2 0 6.4. Standardikäyrien määrittäminen PRL:lle PRL:n laimennussarja tehtiin FFBrhen (ks. osa 1.4.) alueella 0,4 - 100 ng/ml. Näiden laimennosten ja FFB:n näytteitä (0,2 ml) analysoitiin osassa 1.4. (vaiheet 3-8) 5 kuvatun menetelmän mukaisesti seuraavin muutoksin: - antigeenin (PRL) inkubointi: 20 tuntia, huoneen lämpötila - konjugaatin inkubointi: 20 tuntia, huoneen lämpötila .
10 (etanoli) varten ks. esimerkki 9.
'max
Saatiin havaitsemisraja 1-4 ng/ml.
Vertailun vuoksi: EIA 1-3 ng/ml SPIA 6-10 ng/ml.
Esimerkki 7 HCG:n ja HPL:n samanaikainen määrittäminen DlA-pe-riaatteen mukaisesti; sandwich-järjestelmä.
7.1. Väriaine-soolien valmistus
Ks. osa 1.1.; dispersiovärejä Resolin Brilliant p
Blue RRL ja Palanil Yellow 3G käytettiin kolloidisina 20 merkkiaineina (vastaavia λ. -arvoja varten ks. esimerkki 9).
max J
7.2. Kaniini-(anti-HCG) IgG/- ja kaniini-(anti-HPL) IgG/väri-konjugaattien valmistus
Ks. osa 1.2.; valmistetaan seuraavat yhdistelmät:
- ResolinR Brilliant Blue RRL/anti-HCG
25 - PalanilR Yellow 3G/anti-GPL.
Yhdistetty konjugaatti valmistetaan sekoittamalla yhtä suuret tilavuusmäärät näitä kahta konjugaattia, jolloin lopullisesti absorbanssiksi saadaan 5 (amax:ssa) kullekin väriaine-konjukaatille.
p 30 7.3. Päällystetään Microelisa -levyjä kaniini-anti- HCG:lla, kaniini-anti-HPL:11a ja näiden kummankin seoksella. Ks. osa 1.3.; levyjä samanaikaista analyysiä varten valmistettiin käyttäen seuraavaa päällystysseosta: kaniini-anti-HCG 15 ng/1 35 kaniini-anti-HPL 15 ng/1.
2i 74 820 7.4. HCG:n ja HPL:n samanaikainen määrittäminen
Yleensä käytettiin osassa 1.4. kuvattua analyysi-menettelyä (Amax~arvoja varten etanolissa, ks. esimerkki 9): a) Yksinkertaiset ja yhdistetyt konjugaatit testat-5 tiin mikrotiitterilevyillä, jotka olivat päällystettyjä ainoastaan kaniini-anti-HCG:11a tai anti-HPL:11a. Yhdistetty konjugaatti ja anti-HCG-konjugaatti antoivat samat vasteet HCG:n laimennussarjassa FFB:ssa (ks. osa 1.4.), kun taas anti-HPL-konjugaatti ei reagoinut.
10 Anti-HPL-konjugaatti antoi suuremman vasteen kuin yhdistetty konjugaatti HPL:n laimennussarjassa FFBrssa, kun taas anti-HCG-konjugaatti ei reagoinut.
b) Lopuksi HCG:n, HPL:n ja (HCG + HPL):n näytteitä FFBsssa inkuboitiin mikrotiitterilevyn, joka oli päällys- 15 tetty kaniini-anti-HCG:11a ja anti-HPL:11a samanaikaisesti, syvennyksissä. Toinen inkubointi suoritettiin yhdistetyllä konjugaatilla. Tulokset on esitetty kuviossa 2, mikä osoittaa samanaikaisen DIA/kerrostuksen mahdollisuuden.
Esimerkki 8 20 DIA testosteronille.
8.1. Menetelmä 1 Tämä menetelmä perustuu vapaan anti-testosteronin havaitsemiseen kiinteällä faasilla inkuboinnin jälkeen testosteronia sisältävän näytteen kanssa.
25 8.1.1. Väriaine-soolin valmistus
Ks. osa 1.1.
8.1.2. Testosteroni-110(-hemlsukkinyyli-BSA/värisoo-li-konjugaatin valmistus
Testosteroni-lloc-hemisukkinaattia liuotetaan 2 ml:aan 50 dimetyyliformamidia (DMF) ja liuos jäähdytetään sitten -15°C:seen.
Naudan seerumialbumiinia (BSA, 140 mg) liuotetaan tislattuun veteen (3 ml), minkä jälkeen lisätään 40 ^ul 4 mol/1 NaOH ja 2 ml DMF. Liuos jäähdytetään sitten 35 -15°C:seen.
Sitten lisätään 12,5 ^ul N-metyylimorfoliinia ja 12,5 ^,ul isobutyyliklooriformiaattia testosteroni-johdan- 22 74 82 0 naisen liuokseen. Kolmen minuutin kuluttua tämä reaktioseos lisätään BSA-liuokseen. Reaktioseosta pidetään samalla sekoittaen yksi tunti -15°C:ssa ja sitten kolme tuntia 0°C:ssa. Sen jälkeen reaktioseosta dialysoidaan tislattua vettä vas-5 taan 16 tuntia 4°C:ssa, jolloin tislattu vesi säännöllisesti uudistetaan. Dialysoitu liuos lingotaan sitten ja sakan päällä oleva kirkas neste pakastekuivataan.
Testosteroni-ll<*-hemisukkinyyli-BSA/värisooli-konju-gaatti valmistetaan nyt käyttäen menetelmää, joka kuvattiin 10 tehtäessä kaniini-anti-HCG-immunoglobuliini liikkumatto-maksi Palanil Red BF-soolille, käyttäen samaa pitoisuutta testosteroni-BSA-johdannaiselle kuin kaniini-anti-HCG-im-munoglobuliinille.
8.1.3. Microelisa -levyjen "päällystäminen" kaniini-15 anti-testosteroni-immunoglobuliineilla Päällystäminen suoritettiin, kuten osassa 1.3. kuvattiin käyttäen immunoglobuliini-jaetta, joka oli eristetty kaniini-antiseerumista, joka oli saatu immunoimalla tes-tosteroni-110C-hemisukkinyyli-BSA: 11a.
20 8.1.4. Testosteronin määrittäminen Käyttäen HCG:lle osassa 1.4. kuvattuja reagensseja ja testi-menetelmää, määritettiin testosteronille standardi-käyrä, jonka avulla sen jälkeen laskettiin tuntemattomien näytteiden testosteroni-pitoisuus näytteiden, jotka oli 25 saatu tämän testimenetelmän mukaisesti, Ä5^g;n kautta. Tämän määrityksen havaitsemisraja on 1 ng/ml.
On helppoa arvioida testosteroni-pitoisuudet lukemalla paljaalla silmällä (standardi- ja tuntemattoman näytteen värin voimakkuuden vertailu reaktion pysäyttämisen 30 jälkeen).
8.2. Menetelmä 2 Tämä menetelmä perustuu testosteroni (T):n ja 3 11 T -BSA:n kilpailevaan sitoutumiseen anti-(T -BSA):han, joka on tehty liikkumattomaksi kiinteälle faasille (esim.
35 polystyreeniputkelle tai mikrotiitterilevylle). Havaitse- nen tapahtui toisella inkuboinnilla anti-(T^-BSA)/väri- konjugaatin kanssa.
3 23 7 4 8 2 0
Huoiu. ; T -BSA: testosteroni-3-0-karboksimetyyli-ok-siimi, joka on kovalenttisesti sidottu BSA:n Nl^-ryhmään (amidisidos), T^-BSA: testosteroni-ll-hemisukkinaatti, joka 5 on kovalenttisesti sidottu BSA:n N^-ryhmään (amidisidos).
8.2.1. Väriaine-soolin valmistus
Ks. osa 1.1.; dispersiovärejä Samaron Brilliant Red H6GF ja SamaronR Brilliant Yellow H10GF käytettiin kolloidisina merkkiaineina (vastaavia *>max~arvoja varten, ks.
10 esimerkki 9).
8.2.2. Kaniini-(anti-T^-BSA) IgG/väri-konjugaatin valmistus
Ks. osa 1.2.; mutta käyttäen kaniini-anti-T^-BSA anti-HCG:n asemesta.
15 8.2.3. Microelisa -levyjen ja polystyreeniputkien päällystäminen kaniini- (anti-T^-BSA) IgGilla
Ks. osa 1.3.; mutta käyttäen kaniini-(anti-T^-BSA) anti-HCG:n asemesta.
Huom.: 1 ml liuoksia A ja B käytetään, kun on kysy-20 myksessä putkien päällystäminen.
8.2.4. Standardikäyrien määrittäminen testostero- nille 3 a) Kilpailevassa analyysissä käytettävän T -BSA:n 3 pitoisuus tutkittiin inkuboimalla ainoastaan T -BSA:n lai- 25 mennussarjaa, mitä seurasi konjugaatti; 1 ml:n tilavuus- määrät putkea kohti tai 0,1 ml:n tilavuusmäärät mikrotiit- terilevyn syvennystä kohti. Menettelytapa, kuten osassa 1.4. (vaiheet 3-8) kuvattiin: > (etanoli) varten ks. esi- max merkki 9. Kilpailevaa kokonaisanalyysiä varten valittiin
O
30 T -BSA:lie pitoisuudet, jotka vastasivat 12 ja 16 pmoolia T/ml:n kokonaistestitilavuutta.
3 b) Kilpaileva analyysi suoritettiin käyttäen T -BSA:n muuttumattomia pitoisuuksia, jotka vastaavat 2 ja 16 pmoolin T/ml kokonaistestitilavuutta sekä laimennussarjaa 05 0-64 pmoolia T/ml näytettä; putkille: 0,9 ml testosteronia 3 sisältävä näyte ja 0,1 ml T -BSA-liuosta (mikä vastaa 20 ja vastaavasti 160 pmoolia T/ml); mikrotiitteri-levylle 24 74 820 vastaavat tilavuudet muutetaan 0,09 ja 0,1 ml:ksi. Jatko- menettely, kuten osassa 1.4. (vaiheet 3-8) on kuvattu; > (etanoli) varten ks. esimerkki 9. max
Havaitsemisraja, määriteltynä (BL - 2 x SD):nä,
O
5 oli 0,2 - 0,4 pmol T/ml näytettä, käyttäen T -BSA-väkevyyt-tä, joka vastaa 2 pmoolia T/ml kokonaistestitilavuutta. Ko-konaishavaitsemisalue oli n. 0-8 pmoolia T/ml näytettä. RIArssa ja EIArssa 50-%:inen sitominen saavutetaan vastaavasti 1 pmoolia T/ml:11a ja 0,7 pmoolia T/ml:11a.
10 Esimerkki 9
Vaihtoehtoisia menetelmiä väriaine-soolien valmistamiseksi 9.1. Dispersioväriaineet
Osassa 1.1. mainitun Palanil Red BF (BASF) asemes-15 ta on väriaine-soolien valmistukseen käytetty myös muita dispersiovärejä, kuten: 74820 25 W™» Vitattu(nm)C) vesia^ etanoli*5^ etanoli
PalanilR Violet 6R BASF 623 571 " Yellow 3G " 415 443 443 ^ " Luminous .>
Yellow Gd' " 496 464 443 " Luminous
Red Gd' " 520 544 540 p
Terasil Brilliant
Flavin 8GFFa' Ciba-Geigy 488 461 443
10 R
Terasil Brilliant
Pink 4BN Ciba-Geigy 571 571 540
CibacetR
Violet 2R Ciba-Geigy 538 592 549
O
Foron Brilliant
Flavin S8GFd^ Sandoz 433 427 15 r
Resolin Brilliant
Blue RRL Bayer 670 578 600
Prociny1R Blue Re) ICI 672
R
Samaron Brilliant
Red H6GFd^ Hoechst 512 510 510 20 Samaron Brilliant
Yellow H10GFd> Hoechst 451 458 443
Samaron Brilliant
Orange HFRd' Hoechst 508 499 492
Samaron Violet HFRL Hoechst 566 543 540 25 a) kolloidisena liuoksena b) molekyyliliuoksena c) näitä arvoja käytettiin johtuen käytettävissä olevista suotimista 30 d) dispersioväriaineiden edustajia, jotka voidaan havaita myös fluorometrialla e) "reaktiivisten" dispersioväriaineiden edustaja. Sooleja valmistettiin kaupallisista väriaineista lähtien väriaineen 5-%:isesta (paino/tilav.) dispersiosta 35 tislatussa vedessä, kuivien, jauhemaisten tuotteiden ollessa kysymyksessä; nestemäisten valmisteiden tapauksessa kokeet suoritettiin lähtien 5-%:isesta (tilavuus/tilavuus) dispersiosta tislatussa vedessä.
26 7 4 8 2 0 Väriainedispersion fraktioiminen veteen suoritettiin linkoamalla, kuten l.l.:ssä on kuvattu. Fraktioiminen osas-kokoon on myös suoritettu suodattimien avulla, joilla on määrätty huokoskoko. Tällä tavalla saadaan käyttökelpoisia 5 sooleja, mutta väriaineen saanto oli huomattavasti pienempi kuin lingottaessa, minkä lisäksi menetelmä on äärimmäisen aikaavievä.
Hydrodynaaminen kromatografia ja gradienttien käyttö linkoamisen aikana muodostavat käyttökelpoisen täydennyksen 10 edellä mainittuihin menetelmiin.
9.2. Siirtovärit
Siirtovärit ovat väriaineita, joita käytetään siir-topainossa, jolloin värillinen malli siirretään toiselta pinnalta toiselle, yleensä paperilta kankaalle. "Subli-15 staattisessa, sublimointi-, kuivakuuma- tai lämpöpainomene-telmässä" käytetään sublimoituvia orgaanisia väriaineita, jotka ovat yleensä liukenemattomia veteen ja liukoisia orgaanisissa ympäristöissä. Tämäntyyppisten väriaineiden soo-lit on myös valmistettu vedessä "kondensaatiomenetelmässä" 20 (ks. J.Th.G. Overbeek: H.R. Kruyt (toim.) "Colloid Science", nide I, sivut 59-60; 1952, Elsevier, Amsterdam).
9.2.1. LurafixR Blue FFR (BASF)
Lurafix Blue FFR:n asetoniliuoksia (1 ml), joilla oli seuraavat pitoisuudet: 2, 1,5, 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 ja 25 0,2 g/1, lisättiin voimakkaasti sekoittaen aina 49 ml:aan tislattua vettä. Saatuja suspensioita lingotaan (30 minuuttia, 1 000 g = 9 800 N/kg) ja pelletit pestään tislatulla vedellä (50 ml) ja lingotaan uudelleen edellä mainituissa olosuhteissa. Sitten pelletit suspendoidaan sellaiseen ti-30 lavuusmäärään tislattua vettä, että loppupitoisuus on 0,1 mg/ml. Lopulliset väriaine-soolit saatiin saattamalla eri suspensiot ultraäänikäsittelyyn (Branson Sonifier B-12, 2 minuuttia, 70 wattia). Näiden väriaine-soolien absorptio-kirjo merkittiin muistiin alueella 750-360 nm. λ :n arvo 35 putosi 716:sta 617 nm:ään lähtien soolista, joka vastasi alkuperäistä väriaine/asetoni-pitoisuutta 2 g/1 alaspäin 0,2 g/1:aan. Nämä kirjomuutokset osoittavat pienentyvää 27 7 4 8 2 0 osaskokoa (ks. H.R. Kruyt: "Colloids"; s. 132; 1930, Wiley, New York; G.H. Jonker: H.R. Kruyt (toim.): "Colloid Science", nide I, s. 102, Elsevier, Amsterdam; F.B.
Gribnau, Dissertation, Utrecht (1935).
5 9.2.2. LurafixR Red BF (BASF)
R
a. Lurafix Red BF:n liuos asetonissa (1 ml, 0,5 g/1) lisätään voimakkaasti sekoittaen tislattuun veteen (24 ml). Sitten asetoni haihdutetaan varovasti tyhjössä ja huoneen lämpötilassa. Aluksi pysyvän soolin kautta saadaan lopuksi 10 sakka. Suspensiota lingotaan (30 minuuttia, 1 000 g = 9 800 N/kg)ja pelletti suspendoidaan uudelleen tislattuun veteen (25 ml), mitä seuraa ultraäänikäsittely (Branson Sonifier B-12, 2 minuuttia, 70 wattia).
b. Lurafix Red BF:n liuos asetonissa (1 ml, 5 g/1) 15 lisätään voimakkaasti sekoittaen tislattuun veteen (249 ml, 50°C). Yhden minuutin jälkeen 50°C:ssa seos jäähdytetään huoneen lämpötilaan. Yhden päivän seisomisen jälkeen huoneen lämpötilassa aluksi pysyvä sooli alkaa osittain flok-kuloitua.
20 Kummastakin vastavalmistetusta soolista otettiin va lokuvat pyyhkäisyelektronimikroskoopin avulla, ks. valokuvat 1 ja 2.
9.3. Rasvaväriaineet (liuotinvärit)
Ryhmä hydrofobisia orgaanisia väriaineita, jotka 25 ovat liukenemattomia veteen, mutta liukoisia orgaanisiin liuottimiin tai niiden seoksiin. Käyttäen 9.2.:ssa kuvattuja kondensaatiomenetelmiä, voidaan näistä väriaineista valmistaa sooleja vesipitoisessa väliaineessa.
9.4. Kyyppivärit 30 Nämä veteen liukenemattomat antrakinoidi- tai indi- goidi-väriaineet voidaan muuttaa pelkistämällä alkalisessa väliaineessa vastaaviksi, vesiliukoisiksi leukoyhdisteiksi. Näistä on sitten mahdollista valmistaa väriaine-sooleja säädetyllä hapetuksella. Leuko-yhdisteitä (liuennettuja kyyp-35 pivärejä), jotka on stabiloitu sulfaattiesteriksi, voidaan myös käyttää tähän tarkoitukseen.
28 74820 9.5. Orgaaniset pigmentit Nämä yhdisteet, jotka määritelmän mukaan ovat liukenemattomia veteen ja orgaanisiin väliaineisiin, voidaan muuttaa dispersiomenetelmällä (ks. P. Nylen ja E. Sunderland: 5 "Modern Surface Coatings", Interscience Publishers, Lontoo 1965) kolloidisiksi "liuoksiksi".
Esimerkki 10
Esimerkissä 1 (1.2.) kuvattujen väriaine-sooli/im-munoglobuliini-konjugaattien valmistuksen muunnoksia.
10 10.1. Immunoglobuliinin tekeminen liikkumattomaksi kolloidisille väriaineosasille 10.1.1. LurafixR Blue FFR (BASF) p
Lurafix Blue FFR:n liuos asetonissa (5 ml, 1 g/1) lisätään voimakkaasti sekoittaen tislattuun veteen (245 ml). 15 Linkoamisen jälkeen (30 minuuttia, 1 000 g = 9 800 N/kg) sakan päällä oleva neste poistetaan ja pelletti pestään tislatulla vedellä (50 ml). Pelletti suspendoidaan uudelleen tislattuun veteen (50 ml:aan asti) ja suspensiota käsitellään ultraäänellä (Branson Sonifier B-12, 2 minuuttia, 1 cni 20 70 wattia). Saatu sooli laimennetaan antamaan Ag17 1,0.
Kaniini-anti-HCG-immunoglobuliini-liuos (0,2 ml, 1 mg/ml liuoksessa, jossa on 5 mmol NaCl/1, pH 7,0) lisätään 10 ml:aan tätä soolia ja seosta varastoidaan 16 tun-tia huoneen lämpötilassa. Sitten lisätään Carbowax -20M:n 25 (0,2 ml, 10 g/1, liuoksessa, jossa on 5 mmol NaCl/1,
pH 7,0) liuos ja sen jälkeen, kun on pidetty tätä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, sooli lingotaan (30 minuuttia, 4 000 g = 39 200 N/kg). Pelletti pestään kahdesti R
Carbowax -20M-liuoksella (0,2 g/1 liuoksessa, jossa on 30 5 mmol NaCl/1, pH 7,0) ja suspendoidaan siihen sen jälkeen uudelleen antamaan 5 ml:n lopputilavuus.
Edellä esitetty menettely toistetaan, mutta käyttäen nyt normaalia kaniini-immunoglobuliinia. Konjugaattien im-munoaktiivisuus todetaan seuraavalla tavalla: 35 Jokaisen konjugaatin näytteitä (2 ml) laimennetaan käyttäen viimeksi mainittua Carbowax -20M-liuosta. Tähän lisätään 0,1 ml HCG:n, joka on merkitty piparjuuri-perok- 29 74820 sidaasilla HRP, liuosta ja reaktioseosta inkuboidaan kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Sitten tätä lingotaan (30 minuuttia, 4 000 g = 39 200 N/kg), pelletit pestään kahdesti viimeksi mainitulla Carbowax -20M-liuoksella ja suspendoi-5 daan uudelleen kromogeeni/substraatin (o-fenyyli-di-amiini/ ureaperoksidi)-liuokseen. Yhden tunnin jälkeen huoneen lämpötilassa entsyymireaktio pysäytetään 4 mol/1 rikkihapolla ja sakan päällä olevien nesteiden mitataan linkoamisen jälkeen (30 minuuttia, 4 000 g = 39 200 N/kg).
10 Väriaine/anti-HCG Ig-konjugaatti: A4g2 = 0/556 väriaine/normaali Ig-konjugaatti: A4g2 = 0,275.
10.1.2. PalanilR Red BF (BASF)
Esimerkiksi proteiinien immobilisointi kiinteille kantaja-aineille voidaan aikaansaada adsorptiolla ja suoralla 15 tai epäsuoralla kovalenttisella sidoksella. Viimeksi mainittu riippuu sopivien funktionaalisten ryhmien läsnäolosta väriaineen kemiallisessa rakenteessa. On esimerkiksi mahdollista käyttää aromaattisia aminoryhmiä diatsokytkennässä, kun taas karboksyyliryhmiä voidaan aktivoida karbodi-imidil-20 lä. Alifaattisia primäärejä aminoryhmiä ja hydroksyyliryh-miä voidaan aktivoida syaanibromidilla. Voidaan käyttää myös bifunktionaalisia yhdisteitä; siten on mahdollista käyttää glutaarialdehydiä aminokomponenttien liittämiseen.
Tässä yhteydessä on myös mahdollista käyttää reaktio-25 kykyisiä dispersiovärejä, jolloin nämä ovat väriaineita, joissa kromofori on liittynyt ryhmään, joka jo on reaktiivinen sellaisenaan, esim. halogeenitriatsiinit ja halogee-nipyrimidiinit.
Seuraavat esimerkit on toteutettu dispersiovärillä 30 PalanilR Red BF (BASF) käyttäen jaetta, joka on eristetty seuraavalla tavalla: Tämän väriaineen dispersiota vedessä (62,5 g/1) lingotaan (30 minuuttia, 750 g = 7 350 N/kg). Pelletti pestään viisi kertaa tislatulla vedellä ja kahdesti polyvinyy- 30 7 4 8 2 0 lialkoholin (PVA) liuoksella vedessä (1 g PVA/1; PVA:
Mowiol 28-99, Hoechst). Lopuksi pelletti suspendoidaan uudelleen 2 l:n lopputilavuuteen PVA-liuokseen (0,1 g PVA/1 liuoksessa, jossa on 5 mmol NaCl/1, pH 7,0). Tämän väriaine-5 soolin näytteitä (25 ml), valinnaisesti seuraavassa yksityiskohtaisemmin kuvatun käsittelyn jälkeen, sekoitettiin lammas-anti-HCG-immunoglobuliinin liuokseen (0,65 ml, 40 mg/ml liuoksessa, jossa oli 5 mmol NaCl/1, pH 7,0).
Tämän proteiinin adsorptio ja/tai liittäminen kol-10 loidisiin väriaineosasiin suoritettiin 16 tunnin aikana eritellyissä olosuhteissa: 10.1.2.1. Adsorptio a. Adsorptio pH 4,0:ssa ja 0 moolia NaCl/1 b. Acsorptio pH 4,0:ssa ja 0,1 moolia NaCl/1 15 c. Adsorptio pH 7,0:ssa ja 0 moolia NaCl/1 d. Adsorptio pH 7,0:ssa ja 0,1 moolia NaCl/1 e. Adsorptio pH 6,0:ssa ja 0 moolia NaCl/1 (sooli ja proteiini sekoitettiin pH 4,0:ssa) f. Adsorptio pH 6,0:ssa ja 0,1 moolia NaCl/1 20 (sooli ja proteiini sekoitettiin pH 4,0:ssa).
10.1.2.2. Diatsokytkentä Väriaine diatsotoitiin 4°C:ssa käyttäen NaNC^/HCl ja sen jälkeen reaktioseoksen pH säädettiin 8,6:een käyttäen kiinteää Na2CO^. Lopuksi lisättiin proteiini; kytkentä 25 suoritettiin 4°C:ssa.
a. NaNC>2: 0,1 mol/1 HC1: 0,1 mol/1 b. NaN02: 0,05 mol/1 HC1: 0,05 mol/1 c. NaNC^r 0,01 mol/1 HC1: 0,01 mol/1 10.1.2.3. Silloittaminen glutaarialdehydin avulla 30 Väriaine-soolin glutaarialdehydipitoisuus säädettiin 1 ja 10 mmooli/1:ksi vastaavasti, minkä jälkeen pH säädettiin 7,4:ään ja vastaavasti 10,Oraan. Yhden tunnin jälkeen huoneen lämpötilassa pH 10 laskettiin 9,Oraan. Lopuksi lisättiin proteiini. Reaktio saatettiin tapahtumaan huoneen 35 lämpötilassa.
a. Glutaarialdehydir 1 mmol/1 pH 7,4 b. Glutaarialdehydi: 10 mmol/1 pH 7,4 3i 74820 c. Glutaarialdehydi: 1 mmol/1 pH 10,0 10.1.2.4. CNBr-aktivointi Väriaine-sooli lingottiin ja pelletti pestiin liuoksella, jossa oli 5 mmol NaCl/1, pH 7,0. Tätä seurasi uudel-5 leensuspendoiminen samaan liuokseen tai liuokseen, jossa oli PVA (10 g/1 liuoksessa, jossa oli 5 mmol NaCl/1, pH 7,0). Eri soolien CNBr-pitoisuus säädettiin 0,045:een ja vastaavasti 0,005:een mol/1, minkä jälkeen pH säädettiin ll,0:aan käyttäen 4 mol/1 NaOH. 12,5 minuutin jälkeen huoneen lämpö-10 tilassa reaktioseokset lingottiin ja pelletit pestiin kahdesti 0,1 mol/1 NaHC03, pH 8,5 (4°C). Tätä seurasi uudelleen suspendoiminen alkuperäiseen tilavuuteen 0,025 mol/1 NaHCO^rssa, pH 8,5. Proteiinin liittäminen suoritettiin 4°C:ssa.
15 a. PVA-pitoisuus: 0 g/1 CNBr-pitoisuus: 0,045 mol/1 b. PVA-pitoisuus: 10 g/1 CNBr-pitoisuus: 0,045 mol/1 c. PVA-pitoisuus: 10 g/1 CNBr-pitoisuus: 0,005 mol/1.
16 tunnin kuluttua eri reaktioseokset lingottiin (30 minuuttia, 1 000 g = 9 800 N/g). Sakan päällä olevat 20 nesteet poistettiin ja pelletit pestiin kahdesti liuoksella, jossa oli 5 mmoolia NaCl/1, pH 7,0 ja suspendoitiin uudelleen lopulliseen 20 ml:n tilavuuteen samaan liuokseen.
Eri konjugaattien immunoaktiivisuus määritettiin in-kuboimalla 5 ml kutakin konjugaattia (16 tuntia, 4°C, pi-25 meässä) HCG:n kanssa, joka oli merkitty piparjuuri-perok-sidaasilla (HRP). Sitten reaktioseoksia lingotaan (1 000 g, 9 800 N/kg 30 min). Pelletit pestään kahdesti 3 ml :11a liuosta, jossa on 5 mmoolia NaCl/1, pH 7,0 ja suspendoi-daan sen jälkeen uudelleen kromogeeni/substraatin (o-feny-30 leeni-diamiini/ureaperoksidi) liuokseen. Yhden tunnin reaktion jälkeen huoneen lämpötilassa (pimeässä) entsyymireak-tio pysäytetään 4 moolia/1 rikkihapolla ja linkoamisen (30 min, 1 000 g = 9 800 N/kg) jälkeen sakan päällä olevien nesteiden A^^ mitataan.
35 Edellä mainittu menettely suoritettiin myös käyt täen pelkästään HRP, spesifisyyden tarkistamiseksi.
32 74820
Konjugaatti A^2 A4g2 (HCG-HRP)X (HRP)X) (HCG-HRP)X' 10.1.2.1- a. 0,195 0,094 b. 0,420 0,098 0,750 5 c. 1,738 0,109 1,970 d. 0,942 0,109 1,280 e. 0,230 0,109 f. 1,129 0,103 1,496 10.1.2.2- a. 0,738 0,120 1,260 10 b. 0,568 0,113 1,316 c. 0,777 0,086 1,505 10.1.2.3- a. 1,097 0,062 1,920 b. 0,489 0,073 c. 0,443 0,065 15 d. 0,436 0,118 10.1.2.4- a. 1,900 0,088 2,153 b. 1,300 0,137 2,020 c. 1,022 0,118 1,671 X)
Konjugaatit testattiin kolmena eri päivänä: 20 1. päivä: 10.1.2.1-a/f 2. päivä: 10.1.2.2-a/c ja 10.1.2.3-a/c 3. päivä: 10.1.2.4-a/c XX) Nämä konjugaatit testattiin samana päivänä.
10.2. Väriaine-sooli/immunoglobuliini-konjugaattien 25 "myöhemmän päällystämisen" vaikutus immunoaktiivisuuteen Kokeet suoritettiin käyttäen esimerkkinä Palanil Red BF (BASF) ja käyttäen soolityyppiä, joka jo on valmistettu edellä l.l.:ssa kuvatun.menetelmän mukaisesti. Tämän soolin pH säädettiin 7,0:aan käyttäen 0,1 moolia/1 NaOH 30 tai HC1 ja ekstinktio (533 nm:ssä) asetettiin 5,0:aan.
Tämän soolin näytteitä (37 ml) sekoitettiin kaniini-anti-HCG-immunoglobuliiniliuoksen kanssa (0,74 ml, 1 g/1 liuoksessa, jossa on 5 mmol NaCl/1, pH 7,0). Ig-väkevyys reaktioseoksessa on silloin 20 mg/1. Yhden tunnin inkuboin-35 nin jälkeen huoneen lämpötilassa sooleihin lisättiin seu-raavat: a. ei mitään 33 74820
R
b. Carbowax -20M 0,2 g/l:n väkevyyteen asti c. BSA 0,2 g/l:n väkevyyteen asti.
Vielä yhden tunnin inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa soolit lingotaan (30 min, 4 000 g = 39 200 N/kg).
5 Pelletit suspendoidaan uudelleen 37 ml:n lopputilavuuteen liuokseen, jossa on 5 mmoolia NaCl/1 joko ilman ylimääräis-
O
tä lisäainetta, 0,2 g:n kanssa Carbowax -20M/1 tai 0,2 g:n kanssa BSA/1.
Eri konjugaatit ja pelkkä väriaine-sooli testattiin 10 DIA:ssa ("sandwich-testi") käyttäen osassa 1.4. kuvattua menettelyä. HSG:lle käytetty laimennussarja oli 0, 250, 1 000 ja 4 000 IU (immunoanalyysi)/1 fosfaattipuskuria. Konjugaatti A516 HCG (IU/1) 0 250 1 000 4 000 15 10.2-a 0,579 0,773 0,722 0,480 b 0,165 0,178 0,165 0,166 c 0,621 0,967 1,300 1,591
Pelkkä väriaine- sooli 0,056 - 20 10.3. Puhdistusmenetelmiä konjugaatin eristämistä varten valmistuksen jälkeen
Esimerkiksi seuraavia menetelmiä voidaan käyttää menettelytapoina puhdistamista varten: - linkoaminen 25 - geelikromatografia - affiniteettikromatografia - membraanisuodatus - osittainen saostaminen (flokkulointi, mitä seuraa pesu ja soolin uudelleenmuodostaminen).
50 Linkoamista ja geelikromatografiaa tutkittiin yksi tyiskohtaisesti ja tuloksia verrattiin tuloksiin konjugaa-tille, jota ei ollut puhdistettu, mutta muutoin valmistettu samalla tavalla. Tätä tarkoitusta varten käytettiin puh-distamatonta konjugaattia 10.2-c.
35 10.3-a Geelikromatografia
4 ml konjugaattia = 5,0) viedään SepharoseR
CL 28 -kolonnin läpi (Pharmacia K 16/20, tilavuus 35 ml; 34 74 8 2 0 tasapainotettu liuoksella, jossa on 5 mmoolia NaCl + 0,2 g BSA + 1,0 g NaN^/1, pH 7,0). Kolonni eluoidaan ta-sapainotuspuskurilla (huoneen lämpötila, 30 ml/h); eluaat-ti tutkittiin mittaamalla A2gQ* Kootaan 1,3 ml:n jakei-5 ta; pääjakeet väriaineen huipulta sekoitetaan.
10.3- b Linkoaminen 4 ml konjugaattia (^533 = 5,0) lingotaan (30 min, 4 000 g = 39 200 N/kg) ja suspendoidaan uudelleen 4 ml:n lop-putilavuuteen käyttäen liuosta, jossa on 5 mmoolia NaCl + 10 0,2 g BSA + 1,0 g NaN3/l, pH 7,0.
10.3- c Ei puhdistusta Tähän tarkoitukseen käytetään puhdistamatonta konjugaattia 10.2-c.
Nämä kolme konjugaattia testataan DIA:ssa (sandwich-15 testi) käyttäen osassa 1.4. kuvattua menettelyä. Käytettiin HCG-laimennussarjaa osasta 10.2.
Konjugaatti A516 HCG (IU/1) 0 250 1 000 4 000 Saalis (%) 10.3-a 0,228 0,551 0,713 0,505 4,3 20 b 0,218 0,339 0,456 0,557 93,6 c 0,234 0,418 0,583 0,700 100,0 10.4. Konjugaatin valmistuksen aikana käytetyn immu-noglobuliinipitoisuuden vaikutus lopulliseen immunoaktiivisuuteen 25 Väriaine-soolin, joka on valmistettu PalanilR Red BF:stä (BASF) osassa 1.1. selostetun menetelmän mukaisesti, näytteitä (5 ml) sekoitetaan 0,1 ml:n kanssa kaniini-anti-HCG-immunoglobuliini-liuosta (5 mmol NaCl/1, pH 7,0), jolloin saadaan loppupitoisuudet: 30 io.4-a 10 mg/1 b 20 mg/1 c 40 mg/1 d 80 mg/1
Yhden tunnin inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilas-35 sa, lisätään 0,1 moolia BSA-liuosta (5 mmol NaCl + 20 g BSA/l, pH 7,0), jolloin saadaan loppupitoisuus 0,4 g BSA/1. Yhden tunnin inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa soolit 35 7 4 8 2 0 lingotaan (30 min, 4 000 g = 39 200 N/kg), sakan päällä olevat nesteet poistetaan ja pelletit suspendoidaan uudelleen 5 ml:n lopputilavuuteen asti käyttäen liuosta, jossa on 5 mmoolia NaCl +0,4 g BSA + 0,1 g natriummertiolaattia/1, 5 pH 7,0.
Konjugaattien iimnunoaktiivisuus todetaan DIA: 11a (sandwich-testi) osassa 1.4. kuvatun menettelyn mukaisesti; käytettiin HCG-laimennussarjaa osasta 10.2.
Konjugaatti A516 10 HCG (IU/1) 0 250 1 000 4 000 10.4-a 0,268 0,499 0,761 1,000 b 0,362 0,658 0,902 1,141 c 0,511 0,741 0,913 1,107 d 0,507 0,681 0,847 0,955 15 10.5. Anti-HCG-immunoglobuliinin tyypin vaikutus konjugaatin immunoaktiivisuuteen; lammas- ja kaniini-anti-HCG-seerumista ja monokloonisesta hiiri-anti-HCG-immunoglo-buliinista eristetyn anti-HCG-immunoglobuliinin käyttö
Anti-HCG-immunoglobuliini/väriaine-sooli-konjugaatit rs 20 valmistettiin päällystämällä Palanil Red BF-soolin, joka oli valmistettu osassa 1.1. kuvatun menetelmän mukaisesti, 1 citi näytteitä (5 ml, AjT^g = 5,0) seuraavalla tavalla: 10.5- a Lammas-anti-HCG-immunoglobuliini
Proteiiniliuos (0,1 ml, 1 g/1 liuoksessa, jossa on 25 5 mmol NaCl/1, pH 7,0) lisätään sooliin ja reaktioseosta inkuboidaan yksi tunti huoneen lämpötilassa. Sitten lisätään BSA-liuos (0,1 ml, 20 g/1 liuoksessa, jossa oli 5 mmol NaCl/1, pH 7,0) ja yhden tunnin inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa sooli lingotaan (30 min, 4 000 g = 39 200 N/kg).
30 Sakan päällä oleva neste poistetaan ja pelletti suspendoidaan uudelleen 5 ml:n lopputilavuuteen liuokseen, jossa on 5 mmol NaCl + 0,4 g BSA + 0,1 g natriummertiolaattia/1, pH 7,0.
10.5- b Kaniini-anti-HCG-immunoglobuliini 35 Sama kuin 10.5-a, mutta nyt kaniini-immunoglobulii- nilla.
36 7 4 8 2 0 10.5- c Monoklooninen hiiri-anti-HCG-immunoglobuliini Kuten 10.5-a, mutta nyt hiiri-immunoglobuliinilla ja käyttäen seuraavia määriä: 10.5- c-l: 0,1 ml immunoglobuliiniliuosta (1 g/1, 5 5 mmol NaCl/1, pH 7,0) 10.5- C-2: 0,1 ml immunoglobuliiniliuosta (0,25 g/1, 5 mmol NaCl/1, pH 7,0).
Konjugaattien immunoaktiivisuus todettiin käyttäen DIA:ta (sandwich-testi) osassa 1.4. selostetun menetelmän 10 mukaisesti. Käytettiin seuraavaa HCG-laimennussarjaa: 0, 15,6, 62,5, 250, 1 000 ja 4 000 IU (immunoanalyysi)/1. Konjugaatti A
b Ib HCG (IU/1) 0 15,6 62,5 250 1 000 4 000 10.5-a 0,483 0,509 0,552 0,618 0,789 1,032 15 b 0,556 0,608 0,649 0,710 0,877 1,114 c 0,406 0,432 0,450 0,503 0,536 0,586 d 0,437 0,495 0,497 0,528 0,559 0,653 10.6. "Myöhemmän päällystämisen1* aikana annetun BSA-pitoisuuden vaikutus konjuqaatin immunoaktiivisuuteen 20 Dispersiovärin PalanilR Red BF (BASF) konjugaatteja valmistettiin osissa 1.1. ja 1.2. kuvatun menetelmän mukaisesti, kuitenkin seuraavin muunnoksin BSA-pitoisuuksissa: BSA-pitoisuus lisätyssä BSA-pitoisuus reaktio-liuoksessa (g/1) seoksessa (g/1 25 10.6-a 9,6 1,6 b 19,2 3,2 c 38,4 6,4 d 76,8 12,8 e 153,6 25,6 30 f 307,2 51,2
Konjugaatit eristettiin, kuten osassa 1.2. selostettiin ja suspendoitiin lopuksi uudelleen liuokseen, jolla on seuraava koostumus: 5 mmoolia NaCl + 0,1 g natriummer-tiolaattia + x g BSA/1 (pH säädetty 7,0:aan 0,1 mol/1 35 NaOH:lla); BSA-pitoisuus on aina sama kuin sen pitoisuus "myöhemmin päällystämisen" aikana ja on siten vastaavasti: x = 1,6, 3,2, ... 51,2 g/1 (ks. taulukko).
37 7 4 8 2 0
Konjugaattien immunoaktiivisuus todettiin DIA:11a ("sandwich-testi") osassa 1.4. kuvatun menetelmän mukaisesti. Tämän aikana käytettiin seuraavaa HCG-laimennussarjaa: 0, 3,9, 15,6, 62,5, 62,5, 250, 1 000, 4 000 ja 16 000 IU 5 (immunoanalyysi)/1.
Konjugaatti A516 HCG (IU/1) 0 3,9 15,6 62,5 250 1 000 4 000 16000 10.6-a 0,322 0,397 0,378 0,436 0,565 0,773 0,954 1,043 b 0,254 0,282 0,286 0,344 0,489 0,707 0,892 0,960 10 c 0,137 0,154 0,175 0,235 0,397 0,661 0,812 0,906 d 0,062 0,078 0,095 0,147 0,297 0,594 0,778 0,852 e 0,039 0,040 0,054 0,110 0,283 0,572 0,759 0,843 f 0,021 0,029 0,044 0,111 0,310 0,629 0,803 0,882
Esimerkki 11 15 Ihmisen sikiön suonikalvon gonadotropiinin (HCG) kolorimetrinen ja/tai silmämääräinen määrittäminen DIA-pe-riaatteen mukaisesti (agglutinaatiotesti; menetelmä 1).
11.1. Väriaine-soolin valmistus Ks. 1.1.
20 11.2. Kaniini-anti-HCG-immunoglobuliini/väriaine- sooli-konjugaatin valmistus
Ks. 1.2.; tässä tapauksessa BSA-liuos sisältää kuitenkin 24 g/1, koska pelletti suspendoidaan uudelleen liuokseen, jolla on kuvattu koostumus, mutta jossa on 0,4 g 1 cm 25 BSA/1. Konjugaatti laimennetaan lopuksi A^^ :n arvoon 2,2.
11.3. HCG:n määrittäminen fosfaattipuskurissa tai virtsassa TRIS-puskuri 1 moolia TRIS + 1 moolia NaCl + 10 g BSA/1, pH sää-30 detty 7,4:ään 4 mol/1 HCl:lla.
HCG
Ks. 1.4.
Virtsa Ks. 1.4.
35 Fosfaattipuskuri (FFB)
Ks. 1.4.
38 74820
Konjugaatti Ks. 11.2.
Menettelytapa 1. Valmistetaan HCG-liuokset 5 000 ja 1 000 IU (im-5 munoanalyysi)/1 laimentamalla standardi HCG-liuos FFB:11a tai virtsalla.
2. Kennoon (1 cm:n valorata) pipetoidaan: konjugaat-tia (1 ml), TRIS-puskuria (0,1 ml) ja HCG-liuosta (0,11 ml). Sekoitetaan hyvin ja mitataan välittömästi absorptiokirjo 10 alueella 750-360 nm FFB:11a ja virtsalla vastaavasti vertailua varten.
3. Annetaan kennojen seistä huoneen lämpötilassa 20 tuntia. Sitten sisällöt arvioidaan silmämääräisesti ja kennoja ravistellaan ja mitataan sitten uudelleen absorptio- 15 kirjo alueella 750-360 nm.
Edustavia kirjoja on annettu kuviossa 3 samalla, kun numeroarvot on annettu seuraavassa taulukossa: HCG-väk. Visuaali- (A -^) -(A,-.,.,) xx) (A,„) n- (Ας7Ε-)__ (IU/1) nenx) 533 0 533 x 575 0 575 x 20 o 0 0 1 000 + 0,15 0,14 5 000 ++ 0,40 0,21 X) ei agglutinaatiota/kasautumista. Väriaine-sooli pysyvä.
25 alkavaa agglutinaatiota/kasautumista. Sakan päällä oleva neste väriltään vaaleampi kuin vastaavalla sokealla kokeella (0 IU HCG/1), mikä johtuu sedimentoitumisesta .
”++": täydellinen agglutinaatio/kasautuminen. Väriaine-30 sooli on flokkuloitunut täydellisesti ja väriaine on saostunut. xx) 0: 0 IU HCG/1 x: 1 ja 5 vastaavasti, IU HCG/1.
35 39 7 4 8 2 0
Esimerkki 12
Ihmisen sikiön suonikalvon godanotropiinin (HCG) ko-lorimetrinen määritys DIA-periaatteen mukaisesti (aggluti-naatiotesti; menetelmä 2): 5 12.1. Väriaine-soolin valmistus
Ks. osa 1.1.
12.2. Yleinen testimenettely DIA/agglutinaatiota varten Väriaine-immunoglobuliini-konjugaattia (2 ml) pipe-10 toitiin lasi- tai polystyreeni-kyvettiin ja sekoitettiin 0,2 ml:n kanssa antigeeninäytettä, joka oli liuotettu FFB:hen (ks. osa 1.4.) tai pelkästään 0,2 ml:n FFB ja 0,2 ml:n kanssa tislattua vettä tai MgSO^-liuoksen kanssa tislatussa vedessä. Ryvettejä pidettiin huoneen lämpötilas-15 sa (sekoittamista) ja absorbanssit määritettiin (ilman edeltävää sekoittamista) säännöllisin väliajoin. Antigeeni saa aikaan väriainesooli-osasten agglutinaation, mistä seuraa absorbanssin alentuminen, mikä johtuu lisääntyneestä tehokkaasta osaskoosta sinänsä ja kasautumien samanaikai-20 sesta laskeutumisesta.
Kaikki seuraavat kokeet koskevat HCG:n määritystä.
12.3. Kaniini-(anti HCG) IgG/väriaine-konjugaatin valmistus
Standardimenetelmä: ks. osa 11.2.
25 Optimointi suoritettiin tutkimalla seuraavat para metrit : 12.3.1. Konjugaattien toistopäällystäminen BSA:lla
Konjugaatit DIA/kerrosta varten toistopäällystetään BSA:lla ei-spesifisten vaikutusten vähentämiseksi; tämä 30 konjugaatin ylimääräinen päällystäminen parantaa varmasti myös sen pysyvyyttä ja on siten epäedullinen konjugaateil-le, joita käytetään DIA/agglutinaatiossa. Konjugaatteja, jotka oli päällystetty vaihtelevilla määrillä BSA ja myös ilman BSA, vertailtiin agglutinaatio-analyysissä. Konju-35 gaatti ilman BSA antoi suurimman herkkyyden ja alhaisimman havaitsemisrajan lyhyimmässä testiajassa ja oli vielä riittävän pysyvä antamaan muuttumattoman sokean kokeen.
40 7 4 8 2 0 12.3.2. Optimi IgG-pitoisuus konjugaatln valmistuksen aikana p
Valmistettiin Palanil Red BF/anti-HCG-konjugaatteja käyttäen eri IgG-pitoisuuksia päällystämisen aikana, ja nii-5 tä seulottiin agglutinaatio-analyysissä käyttäen muuttumatonta HCG-pitoisuutta 5 IU/ml näytettä (tai: 0,42 IU/ml kokonaistestitilavuutta). Optimi IgG-pitoisuus konjugaatin valmistuksen aikana näytti olevan 0,033 mg/ml reaktioseosta soolipitoisuudessa, joka vastasi = 5.
10 12.3.3. IgGtn inkuboinnin vaikutus pH 2,0:ssa ennen konjugaatin valmistusta
Kaniini-anti-HCG IgG:n liuoksen pH (4-5 mg/ml 5 mmol NaCl/l:ssa pH 7,0) säädettiin 2,0:aan ja inkuboitiin yksi tunti 4°C:ssa; pH säädettiin uudelleen 7,4:ään ja IgG-15 liuosta käytettiin konjugaatin valmistukseen. "pH 2-kä-sitellyn IgG":n pitoisuutta konjugaatti-synteesin aikana vaihdeltiin ja eri konjugaatit seulottiin, kuten 12.3.2:ssa kuvattiin.
Pitoisuus 0,033 mg "Ph 2-käsiteltyä IgG"/ml reaktio- l· cm 20 seosta soolipitoisuudessa, joka vastasi A^q = 5, näytti olevan optimiarvo.
Konjugaattien, jotka pohjautuivat luonnon IgGrhen ja "pH 2-käsiteltyyn IgG":hen, vertailu osoitti selvästi jälkimmäisen edun reaktiivisuuden suhteen agglutinaatio-25 testissä:
IgG konjugaatissa (HCG) Alentuma A^^Sssa (%) (IU/ml) 4 h:n kuluttua 18 h:n kuluttua luonnon IgG 2,5 6 21 5 13 63 30 pH-2-käsitelty IgG 2,5 14 74 5 28 100 12.3.4. Lisäaineiden vaikutus konjugaattien reaktio- kYkYZ-n
Destabiloimisaineen (esim. MgSO^) lisääminen konju-35 gaattiin ennen näytteen lisäämistä lyhentää reaktioaikaa ja/tai alentaa agglutinaatio-analyysin havaitsemisrajaa, erityisesti, kun kysymyksessä ovat konjugaatit, jotka si- 41 74820 p nänsä ovat erittäin pysyviä. Anti-HCG/Palanil Red BF-kon-jugaatteja, jotka perustuivat väriainepanoksiin 5228513 (jauhe) ja 4742893 (märkädispersio), inkuboitiin MgSO^-laimennussarjän kanssa antamaan loppupitoisuusalue 0-20 5 itunoolia MgS04/l kokonaistestiseosta ja A^q määritettiin säännöllisin väliajoin. Väkevyyksien 1,2 ja 9,5 mmoolia MgSO^/l kokonaistestiseosta, vastaavasti, havaittiin olevan yhteensopivia konjugaattien vielä sopivan pysyvyyden X cm kanssa (A^q :n alenema pienempi kuin 0,1 - 0,2 kahden 10 tunnin kuluttua).
HCG:n laimennussarjaa FFB:ssa (ks. osa 1.4.; 0-5
O
IU/ml näytettä) inkuboitiin anti-HCG/Palanil Red BF (4742893)-konjugaatin kanssa yhdessä 1,5 mmoolin kanssa
MgSO./l kokonaistestiseosta tai ilman sitä. Konjugaatti ** 2 cm 15 ilman MgSO^ antoi ainoastaan pienen aleneman A^q :ssa verrattuna sokeaan kokeeseen, kun taas MgSO^in läsnäollessa havaittiin absorbanssin alentuminen, joka merkitsevästi poikkesi sokeasta kokeesta: /fagSC>47 (HCG) Alenema AL^m:ssa (%) 20 (yumol/ml kokonaistes- (IU/ml) (2,5 h:n tiseosta jälkeen) 0 2,5 3 9,5 2,5 13 0 5,0 4 25 9,5 5,0 21 Ό 12.3.5. Anti-HCG/Palanil Red BF-konjugaatin, joka perustuu "pH 2-käsiteltyyn" IgGihen ja MgSO^rn läsnäollessa, reaktiivisuus
Yhdistetyt vaikutukset, jotka on kuvattu 12.3.3./ 30 12.3.4:ssä tutkittiin PalanilR Red BF-konjugaateilla (jot ka perustuivat kaupalliseen märkä- ja kuivavalmistukseen), ja HCG-laimennussarjalla FFB:ssa (0-4 IU/ml näytettä). Saadut havaitsemisrajat /määriteltyinä HCG:n pitoisuutena, joka antaa vasteen, joka on (BL - 2 x SD),/, on esitetty 35 seuraavassa: - PalanilR Red BF 120 IU/1 (20 h) 5228513 (jauhe) 400 IU/1 (4 h) „ 74820 42 - PalanilR Red BF 280 IU/1 (20 h) 4742893 (dispersio) 1 300 IU/1 (4 h) SPIA/agglutinaation havaitsemisraja on 100 IU/1 (kolorimetrinen havaitseminen kahden tunnin kuluttua).
5 12.3.6. Osaskoon vaikutus konjugaatin reaktiokykyyn Tähän asti kaikki kokeet suoritettiin kokonaiväri-aine-dispersion ainoastaan yhdellä jakeella, nimittäin aineella, joka jäi sakan päällä olevaan nesteeseen 1 000 - 1 100 g:ssa (9 800 - 10 800 N/kg), mikä vastaa karkeasti 10 osaskokoa, jossa läpimitta on 0,2 6^um. Osaskoon vaikutusta tutkittiin edelleen valmistamalla anti-HCG-konjugaatte- p ja Palanil Red BF:n eri "g-jakeista" ja testaamalla ne HCG-agglutinaatio-analyysillä. Havaittiin merkittäviä vaikutuksia (vrt. kuvio 4), jolloin optimitulokset saatiin 15 väriainejakeelle, joka oli eristetty välillä 1 500 - 2 500 g.
Esimerkki 13
Dispersioväri/immunoglobuliini-konjugaattien lyofi-lointi; pysyvyys.
p 20 Palanil Red BF/kaniini-anti-HCG-konjugaatti lyofi- 1 crn loitiin vesipitoisesta dispersiosta AjT^g n. 5), joka sisältä seuraavat aineosat:
5 mmol NaCl 5 g BSA
25 1 g natriummertiolaattia/litra; pH 7,0 2,5 g dekstraania (mp. 40 000 Daltonia) 5,0 g laktoosia
Uudelleenmuodostetulla kuivalla konjugaatilla ei havaittu reaktiivisuuden häviötä verrattuna alkuperäiseen 30 märkävalmistukseen. Konjugaatti säilyttää immunoreaktiivi-suutensa ainakin 2,5 kuukautta -20°C:ssa, 4°C:ssa ja huoneen lämpötilassa. Jonkin verran aktiivisuuden häviötä havaittiin 2,5 kuukauden kuluttua 37°C:ssa, huomattava häviö havaittiin 2,5 kuukauden kuluttua 45°C:ssa.

Claims (5)

43 74820
1. Menetelmä immunokemiallisesti reaktiivisen komponentin, kuten hapteenin, antigeenin tai vasta-aineen mää- 5 rittämiseksi kvalitatiivisesti ja/tai kvantitatiivisesti vesipitoisessa testiväliaineessa käyttäen tällaisten komponenttien immunokemiallista reaktiivisuutta toistensa suhteen, jolloin käytetään ainakin yhtä merkittyä immunokemiallisesti reaktiivista komponenttia ja jolloin tietyn 10 reaktioajan aikana immunokemiallista reaktiota tai sen jälkeen, valinnaisesti vapaan ja sidotun merkityn komponentin (komponenttien) erottamisen jälkeen, testiväliaineessa tai jossakin erotuksen jälkeen saadussa jakeessa määritetään merkkiaineen luonne ja/tai määrä, jolloin tämä määritys 15 antaa kvalitatiivisen ja/tai kvantitatiivisen osoituksen määritettävästä immunokemiallisesti reaktiivisesta komponentista (komponenteista), tunnettu siitä, että mainittu merkitty komponentti (komponentit) on saatu liittämällä tällainen komponentti tai tällaisia komponentteja 20 suoraan tai epäsuorasti hydrofobisen väriaineen tai pigmentin tai tällaisella väriaineella tai pigmentillä päällystettyjen polymeeriytimien vesipitoisen dispersion osasiin.
2. Testisarja käytettäväksi yhden tai useampien immunokemiallisesti reaktiivisten komponenttien määrittämi- 25 seksi vesipitoisessa väliaineessa, tunnettu siitä, että se sisältää: a) yhden tai useampia merkittyjä immunokemiallisesti reaktiivista komponentteja, jotka on saatu liittämällä tällainen komponentti tai tällaisia komponentteja suoraan tai 30 epäsuorasti hydrofobisen väriaineen tai pigmentin tai tällaisella väriaineella tai pigmentillä päällystettyjen polymeeriytimien vesipitoisen dispersion osasiin, b) muita reagensseja.
3. Menetelmä uuden immunokemiallisen reagenssin val-35 mistamiseksi, jota voidaan käyttää patenttivaatimuksen 1 mukaisessa määritysmenetelmässä, tunnettu siitä, 44 7 4 8 2 0 etä suoraan tai epäsuorasti liitetään immunokemiallisesti reaktiivinen komponentti hydrofobisen väriaineen tai pigmentin tai tällaisella väriaineella tai pigmentillä päällystettyjen polymeeriytimien vesipitoisen dispersion osa-5 siin.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukaisesti valmistettu uusi immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää hydrofobisen väriaineen tai pigmentin tai tällaisella väriaineella tai pigmentillä päällystettyjen poly- 10 meeriytimien osasten vesipitoisen dispersion, joihin osasiin on suoraan tai epäsuorasti liitetty immunokemiallises-ti reaktiivinen komponentti.
5. Pakastekuivattu tai suihkukuivattu reagenssi, jota voidaan käyttää patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän 15 yhteydessä, tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useampia merkittyjä immunokemiallisesti reaktiivisia komponentteja, jotka on saatu liittämällä suoraan tai epäsuorasti tällainen komponentti tai tällaisia komponentteja hydrofobisen väriaineen tai pigmentin tai tällaisella väri- 20 aineella tai pigmentillä päällystettyjen polymeeriytimien vesipitoisen dispersion osasiin. 74820
FI810054A 1980-01-11 1981-01-09 Anvaendning av vatten-dispergerbara hydrofoba faergaemnen eller pigment som maerkaemnen i immunoanalyser. FI74820C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8000173 1980-01-11
NL8000173A NL8000173A (nl) 1980-01-11 1980-01-11 Toepassing van in water dispergeerbare, hydrofobe kleurstoffen als label in immunochemische testen.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI810054L FI810054L (fi) 1981-07-12
FI74820B FI74820B (fi) 1987-11-30
FI74820C true FI74820C (fi) 1988-03-10

Family

ID=19834655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI810054A FI74820C (fi) 1980-01-11 1981-01-09 Anvaendning av vatten-dispergerbara hydrofoba faergaemnen eller pigment som maerkaemnen i immunoanalyser.

Country Status (18)

Country Link
US (1) US4373932A (fi)
EP (1) EP0032270B1 (fi)
JP (1) JPS56160655A (fi)
AT (1) ATE13098T1 (fi)
AU (1) AU534775B2 (fi)
CA (1) CA1143654A (fi)
DE (1) DE3070604D1 (fi)
DK (1) DK155968C (fi)
ES (1) ES8204175A1 (fi)
FI (1) FI74820C (fi)
GR (1) GR73163B (fi)
HU (1) HU183283B (fi)
IE (1) IE50655B1 (fi)
IL (1) IL61864A (fi)
MX (1) MX161039A (fi)
NL (1) NL8000173A (fi)
PT (1) PT72329B (fi)
ZA (1) ZA8174B (fi)

Families Citing this family (154)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5622871A (en) * 1987-04-27 1997-04-22 Unilever Patent Holdings B.V. Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents
DE2915309A1 (de) * 1979-04-14 1980-10-30 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung von anti-hyaluronidase und hierfuer verwendbares mittel
DK256581A (da) * 1980-06-13 1981-12-14 Nat Res Dev Bindingsanalyse
US4419453A (en) * 1981-09-28 1983-12-06 The Dow Chemical Company Immunological agglutination assays with dyed or colored latex and kits
USRE32011E (en) * 1981-12-14 1985-10-22 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
US4687732A (en) * 1983-06-10 1987-08-18 Yale University Visualization polymers and their application to diagnostic medicine
DE3485918T2 (de) * 1983-06-10 1993-04-15 Univ Yale Mit einem nachweisagens versehenes polymer, das aus mehreren visualisierungsmonomeren besteht.
US4500788A (en) * 1983-08-19 1985-02-19 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Device for providing antibacterial radiation
US4703017C1 (en) * 1984-02-14 2001-12-04 Becton Dickinson Co Solid phase assay with visual readout
JPH0634014B2 (ja) * 1984-05-17 1994-05-02 日本合成ゴム株式会社 免疫診断用着色粒子
GB8415998D0 (en) * 1984-06-22 1984-07-25 Janssen Pharmaceutica Nv Staining method
US4745075A (en) * 1984-09-06 1988-05-17 Burroughs Wellcome Co. Diagnostic test methods
US4735907A (en) * 1985-03-18 1988-04-05 Eastman Kodak Company Stabilized fluorescent rare earth labels and labeled physiologically reactive species
JPS61292556A (ja) * 1985-06-20 1986-12-23 Green Cross Corp:The 酵素免疫測定方法およびキツト
US5501949A (en) * 1985-12-10 1996-03-26 Murex Diagnostics Corporation Particle bound binding component immunoassay
DE3545252A1 (de) * 1985-12-20 1987-08-06 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und reagenz zur bestimmung von testosteron sowie hierzu geeignete monoklonale antikoerper
CA1291031C (en) * 1985-12-23 1991-10-22 Nikolaas C.J. De Jaeger Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances
FR2592717B1 (fr) * 1986-01-07 1989-06-02 Robert Raymond Reactif et procede nouveau pour la detection d'un element contenu dans un milieu biologique mettant en jeu la production d'un complexe agglutinable, tel qu'un complexe antigene-anticorps
US4780421A (en) * 1986-04-03 1988-10-25 Sclavo Inc. Cleavable labels for use in binding assays
JPH0611870B2 (ja) 1986-06-27 1994-02-16 徳山曹達株式会社 無機化合物/染料複合体粒子
US4786589A (en) * 1986-08-18 1988-11-22 Huntington Medical Research Institute Immunoassay utilizing formazan-prelabeled reactants
US4891324A (en) * 1987-01-07 1990-01-02 Syntex (U.S.A.) Inc. Particle with luminescer for assays
USRE38430E1 (en) 1987-03-27 2004-02-17 Becton, Dickinson And Company Solid phase chromatographic immunoassay
EP0560411B1 (en) 1987-04-27 2000-07-26 Unilever N.V. Specific binding assays
US4962023A (en) * 1987-06-22 1990-10-09 Louisiana State University, Agricultural And Mechanical College Single incubation immuno sorbent assay method using particle labels to detect test antigen specific antibodies in presence of other antibodies
US4954452A (en) * 1987-07-09 1990-09-04 Abbott Laboratories Non-metal colloidal particle immunoassay
US5120643A (en) * 1987-07-13 1992-06-09 Abbott Laboratories Process for immunochromatography with colloidal particles
US4853335A (en) * 1987-09-28 1989-08-01 Olsen Duane A Colloidal gold particle concentration immunoassay
US4978625A (en) * 1987-10-19 1990-12-18 Becton, Dickinson And Company Fluorescence immunoassay using water insoluble dyes
NL8702769A (nl) * 1987-11-19 1989-06-16 Holland Biotechnology Werkwijze voor het bepalen in een testmonster van componenten van de reactie tussen een specifiek bindend eiwit en de bijbehorende bindbare stof onder toepassing van ten minste een gemerkte component, werkwijze voor het bereiden van de gemerkte component, en testkit voor de bepaling van immunocomponenten.
US5620845A (en) * 1988-06-06 1997-04-15 Ampcor, Inc. Immunoassay diagnostic kit
AU2684488A (en) 1988-06-27 1990-01-04 Carter-Wallace, Inc. Test device and method for colored particle immunoassay
US4963478A (en) * 1988-07-05 1990-10-16 Immucor, Inc. Article for preforming immunological assays utilizing organic dyes and method for producing and utilizing same
US5252459A (en) * 1988-09-23 1993-10-12 Abbott Laboratories Indicator reagents, diagnostic assays and test kits employing organic polymer latex particles
IE71197B1 (en) * 1988-11-14 1997-02-12 Akzo Nv Aqueous suspension for diagnostic tests
US6352862B1 (en) * 1989-02-17 2002-03-05 Unilever Patent Holdings B.V. Analytical test device for imuno assays and methods of using same
US5075078A (en) * 1989-10-05 1991-12-24 Abbott Laboratories Self-performing immunochromatographic device
US5252496A (en) * 1989-12-18 1993-10-12 Princeton Biomeditech Corporation Carbon black immunochemical label
KR910014706A (ko) * 1990-01-10 1991-08-31 원본미기재 세척이 필요없는 개량된 이뮤노어세이(immunoassay)장치
US5141850A (en) * 1990-02-07 1992-08-25 Hygeia Sciences, Inc. Porous strip form assay device method
US5096837A (en) * 1990-02-08 1992-03-17 Pacific Biotech, Inc. Immunochromatographic assay and method of using same
US5223220A (en) * 1990-03-27 1993-06-29 Pacific Biotech, Inc. Solid phase immunoassay device and method of making same
US5998220A (en) 1991-05-29 1999-12-07 Beckman Coulter, Inc. Opposable-element assay devices, kits, and methods employing them
US5877028A (en) 1991-05-29 1999-03-02 Smithkline Diagnostics, Inc. Immunochromatographic assay device
US6168956B1 (en) 1991-05-29 2001-01-02 Beckman Coulter, Inc. Multiple component chromatographic assay device
DE69229960T2 (de) * 1991-12-13 2000-01-05 Bion Diagnostic Sciences, Inc. Agglutierungsassays und kolloide farbstoffe verwendende testsätze
US5518887A (en) * 1992-03-30 1996-05-21 Abbott Laboratories Immunoassays empolying generic anti-hapten antibodies and materials for use therein
US5395754A (en) * 1992-07-31 1995-03-07 Hybritech Incorporated Membrane-based immunoassay method
US5354692A (en) * 1992-09-08 1994-10-11 Pacific Biotech, Inc. Analyte detection device including a hydrophobic barrier for improved fluid flow
JPH06227955A (ja) * 1992-12-08 1994-08-16 Kanebo Ltd 染毛剤又は化粧料及び前処理剤並びに染毛方法
FI92882C (fi) * 1992-12-29 1995-01-10 Medix Biochemica Ab Oy Kertakäyttöinen testiliuska ja menetelmä sen valmistamiseksi
US5424193A (en) * 1993-02-25 1995-06-13 Quidel Corporation Assays employing dyed microorganism labels
US5837546A (en) 1993-08-24 1998-11-17 Metrika, Inc. Electronic assay device and method
US5547833A (en) * 1994-01-04 1996-08-20 Intracel Corporation Radial flow assay, delivering member, test kit, and methods
US5561045A (en) * 1994-01-04 1996-10-01 Intracel Corporation Detection reagent, article, and immunoassay method
EP0724909A1 (en) 1994-11-28 1996-08-07 Akzo Nobel N.V. Sample collection device
US5712172A (en) 1995-05-18 1998-01-27 Wyntek Diagnostics, Inc. One step immunochromatographic device and method of use
US20010051350A1 (en) 1995-05-02 2001-12-13 Albert Nazareth Diagnostic detection device and method
US7635597B2 (en) 1995-08-09 2009-12-22 Bayer Healthcare Llc Dry reagent particle assay and device having multiple test zones and method therefor
US5968839A (en) * 1996-05-13 1999-10-19 Metrika, Inc. Method and device producing a predetermined distribution of detectable change in assays
US5945345A (en) * 1996-08-27 1999-08-31 Metrika, Inc. Device for preventing assay interference using silver or lead to remove the interferant
US6001658A (en) * 1996-09-13 1999-12-14 Diagnostic Chemicals Limited Test strip apparatus and method for determining presence of analyte in a fluid sample
US6979576B1 (en) * 1997-07-25 2005-12-27 Shu-Ching Cheng Methods of use of one step immunochromatographic device for Streptococcus A antigen
US6194221B1 (en) * 1996-11-19 2001-02-27 Wyntek Diagnostics, Inc. Hybrid one-step immunochromatographic device and method of use
US20050101032A1 (en) * 1997-02-10 2005-05-12 Metrika, Inc. Assay device, composition, and method of optimizing assay sensitivity
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
US6103536A (en) * 1997-05-02 2000-08-15 Silver Lake Research Corporation Internally referenced competitive assays
CN1271417A (zh) * 1997-08-29 2000-10-25 丰富音质股份有限公司 对生物样品中的分析物进行快速分析的方法和设备
US6267722B1 (en) 1998-02-03 2001-07-31 Adeza Biomedical Corporation Point of care diagnostic systems
US6394952B1 (en) 1998-02-03 2002-05-28 Adeza Biomedical Corporation Point of care diagnostic systems
EP1062508A1 (en) * 1998-03-20 2000-12-27 The Rockefeller University Assays for screening compounds which interact with cation channel proteins, mutant prokaryotic cation channel proteins, and uses thereof
US20060019404A1 (en) * 1998-05-06 2006-01-26 Blatt Joel M Quantitative assay with extended dynamic range
US20080096236A1 (en) * 1998-08-25 2008-04-24 Binax, Inc. Method for Detecting the Presence of Target Bacteria or a Target Component Carbohydrate Antigen Thereof
US6824997B1 (en) * 1998-09-18 2004-11-30 Binax, Inc. Process and materials for the rapid detection of streptococcus pneumoniae employing purified antigen-specific antibodies
US9134303B1 (en) 1998-08-25 2015-09-15 Alere Scarborough, Inc. ICT immunoassay for Legionella pneumophila serogroup 1 antigen employing affinity purified antibodies thereto
US6699722B2 (en) 2000-04-14 2004-03-02 A-Fem Medical Corporation Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes
US20040043510A1 (en) * 2000-07-14 2004-03-04 Nobuyuki Shigetoh Particle-labeled protein and immuno-chromatograph using the same
US8586349B2 (en) * 2000-08-10 2013-11-19 Biomerieux B.V. Moving droplet diagnostic assay
US6777198B2 (en) 2000-10-11 2004-08-17 Pharmacia Diagnostics Ab Assay method and kit therefor
JP4291572B2 (ja) * 2001-02-01 2009-07-08 シグマ−アルドリッチ・カンパニー 分子プルダウンおよび免疫沈降用途のための視感度を強化した改善親和性マトリックス
US7291477B2 (en) 2001-07-03 2007-11-06 Xenotope Diagnostics, Inc. Method and device for trichomonas detection
US20030211040A1 (en) 2001-08-31 2003-11-13 Paul Greengard Phosphodiesterase activity and regulation of phosphodiesterase 1B-mediated signaling in brain
US6855561B2 (en) * 2001-09-10 2005-02-15 Quidel Corporation Method for adding an apparent non-signal line to a lateral flow assay
US6867005B2 (en) 2001-10-24 2005-03-15 Beckman Coulter, Inc. Method and apparatus for increasing the dynamic range and accuracy of binding assays
US7910586B2 (en) 2002-01-04 2011-03-22 The Rockefeller University Compositions and methods for prevention and treatment of amyloid-β peptide-related disorders
JP2004069677A (ja) * 2002-06-13 2004-03-04 Canon Inc 免疫学的測定方法、免疫学的測定用試薬及びその製造方法
SI1535068T1 (sl) 2002-08-13 2010-07-30 N Dia Inc Naprave in postopki za odkrivanje amnijske tekočine v vaginalnih izločkih
WO2004033101A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-22 Zbx Corporation Diagnostic devices
US6900058B2 (en) * 2003-03-11 2005-05-31 Bionostics, Inc. Control solution for photometric analysis
JP4933258B2 (ja) 2003-09-22 2012-05-16 クイデル コーポレーション 試料中の複数分析物の検出装置
US20050148005A1 (en) * 2003-12-12 2005-07-07 Pasha Emadi-Konjin Dye solubilization binding assay
US7150995B2 (en) * 2004-01-16 2006-12-19 Metrika, Inc. Methods and systems for point of care bodily fluid analysis
WO2005078442A1 (en) * 2004-02-10 2005-08-25 Dantini Daniel C Comprehensive food allergy test
US20050227370A1 (en) * 2004-03-08 2005-10-13 Ramel Urs A Body fluid analyte meter & cartridge system for performing combined general chemical and specific binding assays
EP1733232A1 (en) * 2004-03-23 2006-12-20 Quidel Corporation Hybrid phase lateral flow assay
FR2870139B1 (fr) * 2004-05-14 2006-07-07 Luc Doublet Moyens pour la coloration de supports
US20060040258A1 (en) * 2004-08-23 2006-02-23 Huiyan Guo Water-soluble conjugates and methods of preparation
CA2579676A1 (en) 2004-09-08 2007-02-15 Hana Golding Compositions and methods for the detection of hiv-1/hiv-2 infection
US7709208B2 (en) * 2004-11-08 2010-05-04 New York University Methods for diagnosis of major depressive disorder
JP5139811B2 (ja) 2004-12-08 2013-02-06 アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド ドセタキセル耐性または感受性の測定方法
US7387890B2 (en) * 2004-12-16 2008-06-17 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Immunoassay devices and use thereof
WO2006098804A2 (en) 2005-03-11 2006-09-21 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Dual path immunoassay device
US7189522B2 (en) * 2005-03-11 2007-03-13 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Dual path immunoassay device
US20060205090A1 (en) * 2005-03-14 2006-09-14 Newton Michael W Water-soluble conjugates for electrochemical detection
BRPI0618713B8 (pt) 2005-11-18 2021-07-27 The Government Of The United State Of America Representado Por The Secretary Of The Dept Of Health A cardiolipina modificada e seus usos
US7763453B2 (en) 2005-11-30 2010-07-27 Micronics, Inc. Microfluidic mixing and analytic apparatus
WO2008002462A2 (en) * 2006-06-23 2008-01-03 Micronics, Inc. Methods and devices for microfluidic point-of-care immunoassays
US9056291B2 (en) 2005-11-30 2015-06-16 Micronics, Inc. Microfluidic reactor system
US20090053694A1 (en) * 2005-12-26 2009-02-26 Kriksunov Leo B Photochemically Amplified Bioassay
US7794656B2 (en) * 2006-01-23 2010-09-14 Quidel Corporation Device for handling and analysis of a biological sample
US7871568B2 (en) * 2006-01-23 2011-01-18 Quidel Corporation Rapid test apparatus
US7569396B1 (en) 2006-09-08 2009-08-04 Purplecow Llc Caffeine detection using internally referenced competitive assays
US7919331B2 (en) * 2006-12-21 2011-04-05 Silver Lake Research Corporation Chromatographic test strips for one or more analytes
EP2716656B1 (en) 2007-06-15 2016-10-12 Xiamen University Monoclonal antibodies binding to avian influenza virus subtype H5 haemagglutinin and uses thereof
US20090196852A1 (en) * 2008-02-04 2009-08-06 Watkinson D Tobin Compositions and methods for diagnosing and treating immune disorders
DE102009010563A1 (de) 2009-02-16 2010-08-26 Matthias W. Engel Vorrichtung zum Nachweis von Analyten in Körperflüssigkeiten
AU2010241706B2 (en) 2009-04-29 2015-07-09 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. ERG monoclonal antibodies
US8168396B2 (en) 2009-05-11 2012-05-01 Diabetomics, Llc Methods for detecting pre-diabetes and diabetes using differential protein glycosylation
EP2433132B1 (en) 2009-05-21 2018-02-21 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Compositions and methods for the detection of hiv-1/hiv-2 infection
US20120225496A1 (en) * 2009-11-17 2012-09-06 Satoru Yoshida Organic colored microparticles, diagnostic reagent kit containing the same, and in vitro diagnosis method
CN102740976B (zh) 2010-01-29 2016-04-20 精密公司 取样-应答微流体盒
WO2012012499A1 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Nurx Pharmaceuticals, Inc. Optical reader system
WO2012012500A1 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Nurx Pharmaceuticals, Inc. Optical reader systems and lateral flow assays
US8956859B1 (en) 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines
US8486717B2 (en) 2011-01-18 2013-07-16 Symbolics, Llc Lateral flow assays using two dimensional features
US8703439B1 (en) 2011-01-31 2014-04-22 Linda Lester Point of care iodine sensor
US8603835B2 (en) 2011-02-10 2013-12-10 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Reduced step dual path immunoassay device and method
EP2492279A1 (en) 2011-02-25 2012-08-29 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Rapid immunogen selection method using lentiviral display
EP2606897A1 (en) 2011-12-22 2013-06-26 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Methods and compositions for the treatment of diseases caused by enveloped viruses
KR102090934B1 (ko) 2012-01-09 2020-03-19 퍼킨엘머 헬스 사이언시즈, 아이엔씨. 마이크로유체 반응기 시스템
WO2013119763A1 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Intuitive Biosciences, Inc. Mycobacterium tuberculosis specific peptides for detection of infection or immunization in non-human primates
US9874556B2 (en) 2012-07-18 2018-01-23 Symbolics, Llc Lateral flow assays using two dimensional features
EP2698377A1 (en) 2012-08-17 2014-02-19 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants
KR20150097764A (ko) 2012-12-21 2015-08-26 마이크로닉스 인코포레이티드. 휴대형 형광 검출 시스템 및 미량분석 카트리지
KR102102123B1 (ko) 2012-12-21 2020-04-20 퍼킨엘머 헬스 사이언시즈, 아이엔씨. 유체 공학 회로 및 관련 제조 방법
JP6935167B2 (ja) 2012-12-21 2021-09-15 ペルキネルマー ヘルス サイエンシーズ, インコーポレイテッド マイクロ流体使用のための低弾性フィルム
ES2761575T3 (es) 2013-01-02 2020-05-20 Qiagen Sciences Llc Métodos para predecir el tiempo hasta el parto en una mujer embarazada
US10160797B2 (en) 2013-03-15 2018-12-25 Sanofi Pasteur Biologics, Llc Antibodies against Clostridium difficile toxins and methods of using the same
JP6484222B2 (ja) 2013-05-07 2019-03-13 マイクロニクス, インコーポレイテッド 核酸の調製および分析のためのデバイス
US10386377B2 (en) 2013-05-07 2019-08-20 Micronics, Inc. Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching
CA2911303C (en) 2013-05-07 2021-02-16 Micronics, Inc. Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions
CN108051590B (zh) 2013-09-13 2020-12-11 Symbolics有限责任公司 运用二维试验和对照信号读出模式的侧向层析检测
MX2016012881A (es) 2014-04-02 2017-05-10 Chembio Diagnostic Systems Inc Inmunoensayo que utiliza un conjugado de captura.
US10534004B2 (en) 2014-05-02 2020-01-14 Uab Research Foundation Methods and compositions for diagnosis and treatment of meningitis
US20160116466A1 (en) 2014-10-27 2016-04-28 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Rapid Screening Assay for Qualitative Detection of Multiple Febrile Illnesses
WO2016123165A2 (en) 2015-01-29 2016-08-04 Neogen Corporation Methods for immuno chromatographic assay desensitization
CA2994209A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Lia Diagnostics, Inc. Water dispersible assays
US10935555B2 (en) 2016-12-22 2021-03-02 Qiagen Sciences, Llc Determining candidate for induction of labor
US10656164B2 (en) 2016-12-22 2020-05-19 Qiagen Sciences, Llc Screening asymptomatic pregnant woman for preterm birth
WO2018154401A1 (en) 2017-02-21 2018-08-30 Medicortex Finland Oy Non-invasive brain injury diagnostic device
US20240011984A1 (en) 2020-10-27 2024-01-11 Merck Patent Gmbh Proteins for the detection of schistosoma infection
DE102020007953A1 (de) 2020-12-29 2022-06-30 Wasiliki Tsalastra-Greul Verfahren zur Bestimmung des Kunststoffpartikelgehalts mit hydrophobem Farbstoff
WO2023242155A1 (en) 2022-06-14 2023-12-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Compositions and methods for the diagnosis of hiv infection
NL2032668B1 (en) 2022-08-02 2024-02-07 Academisch Ziekenhuis Leiden Means for detecting schistosoma infection

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3449488A (en) * 1965-10-22 1969-06-10 Bionetics Research Lab Inc Immunology
US3720760A (en) * 1968-09-06 1973-03-13 Pharmacia Ab Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples
US3641235A (en) * 1968-11-01 1972-02-08 Miles Lab Immunological reagent and process for making same
US4097586A (en) * 1970-06-11 1978-06-27 Biological Developments, Inc. Immunochemical assay method
US3789116A (en) * 1970-12-09 1974-01-29 Abbott Lab Fluorescent labeled antibody reagent
SE374686B (fi) * 1971-01-26 1975-03-17 B O Heger
US3773625A (en) * 1971-04-08 1973-11-20 Us Army Soluble antigen-antibody complexes
US3900558A (en) * 1971-06-23 1975-08-19 Richardson Merrell Inc Method of measuring histamine release from mast cells
US3853987A (en) * 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3996344A (en) * 1972-05-15 1976-12-07 Biological Developments, Inc. Phenethylamine antigenic conjugates, their preparation, antibodies and use
US4211766A (en) * 1972-07-10 1980-07-08 Ab Bonnierforetagen Cancer associated polypeptide antigen compositions
US3941876A (en) * 1973-04-25 1976-03-02 Gte New Ventures Corporation In vitro method for determining allergic hypersensitivity
US4160019A (en) * 1973-06-25 1979-07-03 Bjorklund Knut B Detection of cancer associated polypeptide antigen and preparation of antibodies thereto
US4166105A (en) * 1973-07-30 1979-08-28 Block Engineering, Inc. Dye tagged reagent
US4161515A (en) * 1973-10-02 1979-07-17 Syva Company Double receptor fluorescent immunoassay
US3998943A (en) * 1973-10-02 1976-12-21 Syva Company Double receptor fluorescent immunoassay
US3997657A (en) * 1973-10-15 1976-12-14 American Cyanamid Company Dry slide reagent employed in immunofluorescent test for detection of human antinuclear factor
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
GB1451669A (en) * 1974-01-02 1976-10-06 Radiochemical Centre Ltd Protein staining
US4011308A (en) * 1974-01-04 1977-03-08 General Electric Company Method for surface immunological detection of biological particles by the use of tagged antibodies
US4108972A (en) * 1974-03-15 1978-08-22 Dreyer William J Immunological reagent employing radioactive and other tracers
US4016250A (en) * 1974-03-22 1977-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Method for testing for pregnancy
US3939350A (en) * 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
SE387746B (sv) * 1974-05-29 1976-09-13 Pharmacia Diagnostics Ab Forfarande for visuellt pavisande av antikroppar i ett vattenhaltigt prov
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4006360A (en) * 1974-08-21 1977-02-01 Block Engineering, Inc. Method of discriminating between dyed particles and background fluorescence of the dye
US3992516A (en) * 1974-10-30 1976-11-16 Sook Kyung Lim Direct fluorescent antibody composition and method for P. Pneumocystis carinii
US3951748A (en) * 1974-11-11 1976-04-20 Medical Products, Inc. Sensitized matrix for detection of disease
US4169137A (en) * 1974-12-20 1979-09-25 Block Engineering, Inc. Antigen detecting reagents
GB1533410A (en) 1974-12-20 1978-11-22 Block Engineering Antigen detecting reagents
SE388694B (sv) * 1975-01-27 1976-10-11 Kabi Ab Sett att pavisa ett antigen exv i prov av kroppvetskor, med utnyttjande av till porost berarmaterial bundna eller adsorberande antikroppar
US3992631A (en) * 1975-02-27 1976-11-16 International Diagnostic Technology, Inc. Fluorometric system, method and test article
US4056724A (en) * 1975-02-27 1977-11-01 International Diagnostic Technology Fluorometric system, method and test article
US4011219A (en) * 1975-03-28 1977-03-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Phthalazine derivatives and salts thereof
US4187075A (en) * 1975-05-26 1980-02-05 Noller Hans G Method of analyzing biological, liquid specimens for antigens or antibodies
US4018884A (en) * 1975-06-26 1977-04-19 Hoffmann-La Roche Inc. Fluorogenic materials and labeling techniques
US4174384A (en) * 1975-06-30 1979-11-13 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4058732A (en) * 1975-06-30 1977-11-15 Analytical Radiation Corporation Method and apparatus for improved analytical fluorescent spectroscopy
US4181650A (en) * 1975-08-25 1980-01-01 Maier Charles L Jr Procedure for the assay of pharmacologically immunologically and biochemically active compounds in biological fluids
US4201763A (en) * 1975-10-09 1980-05-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Solid phase immunofluorescent assay method
US4036946A (en) * 1975-10-20 1977-07-19 Marcos Kleinerman Immunofluorometric method for measuring minute quantities of antigens, antibodies and other substances
US3999948A (en) * 1975-11-03 1976-12-28 International Diagnostic Technology Diagnostic reagent holder and method
CA1083508A (fr) * 1975-11-13 1980-08-12 Jacques Grange Supports porteurs de chaines laterales, procedes d'obtention de ces supports, procedes de fixation de composes organiques comportant un residu glucidique sur lesdits supports, produits et reactifs resultant de ladite fixation chimique
US4020151A (en) * 1976-02-17 1977-04-26 International Diagnostic Technology, Inc. Method for quantitation of antigens or antibodies on a solid surface
AR215459A1 (es) * 1976-04-02 1979-10-15 Brewer J Metodo para producir un agente terapeutico capaz de proporcionar una marca en un animal no humano para indicar la administracion del agente al animal y para proporcionar tambien un repositorio del agente a ser libeberado durante un espacio de tiempo
US4160818A (en) * 1976-04-15 1979-07-10 Technicon Instruments Corporation Fluorimetric immunoassay for diphenylhydantoin
US4067959A (en) * 1976-05-10 1978-01-10 International Diagnostic Technology, Inc. Indirect solid surface test for antigens or antibodies
US4025310A (en) * 1976-05-28 1977-05-24 International Diagnostic Technology, Inc. Method for reading a wet fluorescent surface
US4069352A (en) * 1976-07-02 1978-01-17 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Immunoadsorbent polymeric material and method of making same
GB1582956A (en) * 1976-07-30 1981-01-21 Ici Ltd Composite magnetic particles
GB1583869A (en) * 1977-08-19 1981-02-04 Technicon Instr Competitive binding analysis by fluorescence
JPS5344622A (en) * 1976-09-30 1978-04-21 Mochida Pharm Co Ltd Immunologically measuring method
GB1572220A (en) * 1976-10-07 1980-07-30 Mochida Pharm Co Ltd Immunochemical process of measuring physiologically active substances
US4098876A (en) * 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4203716A (en) * 1976-11-24 1980-05-20 Eastman Kodak Company Photographic elements having hydrophilic colloid layers containing hydrophobic addenda uniformly loaded in latex polymer particles
GB1566423A (en) 1976-11-29 1980-04-30 Block Engineering Photometric system
US4130462A (en) * 1976-12-16 1978-12-19 Syva Company Receptor steric hindrance immunoassay for receptor determination
IL51668A (en) * 1977-03-16 1981-12-31 Israel State Analytical method for the quantitative determination of immunogens and antibodies and a kit therefor
US4202815A (en) * 1977-03-21 1980-05-13 Rohner Ag Pratteln Concentrated powder or granular formulations dispersable in aqueous media
IT1079045B (it) * 1977-05-16 1985-05-08 Syva Co Analisi imuunologica fluorescente a doppio ricettore
US4115535A (en) * 1977-06-22 1978-09-19 General Electric Company Diagnostic method employing a mixture of normally separable protein-coated particles
DE2728922C3 (de) * 1977-06-27 1982-02-25 Dragoco Gerberding & Co Gmbh, 3450 Holzminden Glycerintri-3,5,5-trimethylhexanoat
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
US4152411A (en) * 1977-07-27 1979-05-01 Akzona Incorporated High specific activity labeled substances
US4197361A (en) * 1977-08-23 1980-04-08 Warner-Lambert Fluorescent immunoassay sandwich technique for HBs Ag
US4223002A (en) * 1978-08-28 1980-09-16 Hoffmann-La Roche Inc. Isolation of alpha1 -fetoprotein
US4294817A (en) * 1977-11-25 1981-10-13 International Diagnostic Technology, Inc. Method of fluoro immunoassay
US4194877A (en) * 1977-11-28 1980-03-25 United States Of America Dye-containing polymer composition
US4258130A (en) * 1977-12-12 1981-03-24 Hunt-Wesson Foods, Inc. Method for detection of antigens
US4231750A (en) * 1977-12-13 1980-11-04 Diagnostic Reagents, Inc. Methods for performing chemical assays using fluorescence and photon counting
US4283382A (en) * 1977-12-28 1981-08-11 Eastman Kodak Company Fluorescent labels comprising rare earth chelates
US4163779A (en) * 1978-01-09 1979-08-07 International Diagnostic Technology, Inc. Test for quantitation of immunoglobulin and identification of abnormal immunoglobulin
US4215102A (en) * 1979-01-05 1980-07-29 Lee Sin H Cytochemical agents and methods for the detection of steroid hormone receptors in human tissues
US4279992A (en) * 1978-03-13 1981-07-21 Miles Laboratories, Inc. Specific binding assay employing an enzyme-cleavable substrate as label
DE2812307A1 (de) * 1978-03-21 1979-10-04 Basf Ag Zubereitungen von dispersionsfarbstoffen
US4277437A (en) * 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4220450A (en) * 1978-04-05 1980-09-02 Syva Company Chemically induced fluorescence immunoassay
US4235869A (en) * 1978-05-16 1980-11-25 Syva Company Assay employing a labeled Fab-fragment ligand complex
US4193983A (en) * 1978-05-16 1980-03-18 Syva Company Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith
US4234563A (en) * 1978-06-02 1980-11-18 American Hospital Supply Corporation Insolubilized deoxyribonucleic acid (DNA)
NL7807532A (nl) * 1978-07-13 1980-01-15 Akzo Nv Metaal-immunotest.
US4222743A (en) * 1978-07-20 1980-09-16 Wang Wei Kung Method and apparatus for detecting biological particles by fluorescent stain
US4225485A (en) * 1978-07-24 1980-09-30 Miles Laboratories, Inc. Chemiluminescent naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazide-labeled polypeptides and proteins
US4297273A (en) * 1978-07-24 1981-10-27 Miles Laboratories, Inc. Chemiluminescent phthalhydrazide-labeled protein and polypeptide conjugates
US4238395A (en) * 1978-07-24 1980-12-09 Miles Laboratories, Inc. Dimethyl 7-[ω-N-(phthalimido)alkyl]aminonaphthalene-1,2-dicarboxylates
US4225783A (en) * 1978-07-24 1980-09-30 Abbott Laboratories Determination of microbial cells in aqueous samples
US4207075A (en) * 1978-08-08 1980-06-10 Liburdy Robert P Rabbit immunoglobulin-N-(3-pyrene)-maleimide conjugate for fluorescent immunoassay
US4302536A (en) * 1978-08-15 1981-11-24 Longenecker Robert W Colorimetric immunoassay process
DE2836362A1 (de) * 1978-08-19 1980-03-06 Behringwerke Ag Diagnostisches mittel
US4222744A (en) * 1978-09-27 1980-09-16 Becton Dickinson & Company Assay for ligands
US4259313A (en) * 1978-10-18 1981-03-31 Eastman Kodak Company Fluorescent labels
FR2440555A1 (fr) * 1978-10-31 1980-05-30 Maes Roland Perfectionnements aux procedes de determination de substances montrant entre elles des affinites de liaison specifiques, par des tests faisant intervenir une phase solide
US4318707A (en) * 1978-11-24 1982-03-09 Syva Company Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays
US4238195A (en) * 1979-01-18 1980-12-09 Miles Laboratories, Inc. Fluorescer-labeled specific binding assays
US4278653A (en) * 1979-02-01 1981-07-14 New England Nuclear Corporation Methods and kits for double antibody immunoassay providing a colored pellet for easy visualization
JPS55116258A (en) * 1979-03-01 1980-09-06 Fuji Photo Film Co Ltd Microimmunoassay method
JPS55116259A (en) * 1979-03-01 1980-09-06 Fuji Photo Film Co Ltd Microimmunoassay method
US4256834A (en) * 1979-04-09 1981-03-17 Syva Company Fluorescent scavenger particle immunoassay
US4261968A (en) * 1979-05-10 1981-04-14 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4252783A (en) * 1979-06-18 1981-02-24 Syva Company Reducing fluorescent background in fluorescent immunoassays
US4284412A (en) * 1979-07-13 1981-08-18 Ortho Diagnostics, Inc. Method and apparatus for automated identification and enumeration of specified blood cell subclasses
US4248854A (en) * 1979-08-27 1981-02-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Production of antibody toward asbestos and immunoassay therewith
US4272506A (en) * 1979-08-31 1981-06-09 Syva Company Purification of reagents by disulfide immobilization
US4318846A (en) * 1979-09-07 1982-03-09 Syva Company Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers
US4254219A (en) * 1979-09-21 1981-03-03 Merck & Co., Inc. Process for recording data in the leucocyte migration inhibition assay
US4254096A (en) * 1979-10-04 1981-03-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Reagent combination for solid phase immunofluorescent assay
US4254097A (en) * 1979-11-05 1981-03-03 American Hospital Supply Corporation Method of detecting antibodies to human thyroglobulin
US4251514A (en) * 1979-11-05 1981-02-17 American Hospital Supply Corporation Insolubilized deoxyribonucleic acid (DNA)
US4314026A (en) * 1980-03-31 1982-02-02 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Process for determining the complement-dependent cytotoxicity mediated by anti-HLA antibodies by means of ATP determination and device for ATP determination
US4323647A (en) * 1980-10-15 1982-04-06 University Of Miami Steric hindrance enzyme immunoassay

Also Published As

Publication number Publication date
AU534775B2 (en) 1984-02-16
ATE13098T1 (de) 1985-05-15
IL61864A (en) 1984-09-30
EP0032270B1 (en) 1985-05-02
FI74820B (fi) 1987-11-30
JPS56160655A (en) 1981-12-10
PT72329A (en) 1981-02-01
ES498430A0 (es) 1982-04-16
JPH0322586B2 (fi) 1991-03-27
DE3070604D1 (en) 1985-06-05
NL8000173A (nl) 1981-08-03
FI810054L (fi) 1981-07-12
ZA8174B (en) 1982-01-27
DK155968C (da) 1989-10-16
IL61864A0 (en) 1981-02-27
GR73163B (fi) 1984-02-14
AU6611181A (en) 1981-07-16
IE810002L (en) 1981-07-11
ES8204175A1 (es) 1982-04-16
CA1143654A (en) 1983-03-29
MX161039A (es) 1990-07-13
DK155968B (da) 1989-06-05
IE50655B1 (en) 1986-06-11
US4373932A (en) 1983-02-15
PT72329B (en) 1981-12-18
DK4681A (da) 1981-07-12
HU183283B (en) 1984-04-28
EP0032270A1 (en) 1981-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI74820C (fi) Anvaendning av vatten-dispergerbara hydrofoba faergaemnen eller pigment som maerkaemnen i immunoanalyser.
US4313734A (en) Metal sol particle immunoassay
US5395754A (en) Membrane-based immunoassay method
US5518887A (en) Immunoassays empolying generic anti-hapten antibodies and materials for use therein
FI92883C (fi) Testimenetelmä ja reagenssikitti sitä varten
US4169138A (en) Method for the detection of antibodies
US4786589A (en) Immunoassay utilizing formazan-prelabeled reactants
US4960692A (en) Assay employing binding pair members on particles and on a filter or membrane
US5270166A (en) Immunoassays employing generic anti-hapten antibodies and materials for use therein
Gribnau et al. Particle-labelled immunoassays: a review
MXPA05005950A (es) Dispositivos de ensayo de flujo directo autocalibrados.
US4865997A (en) Assay for ligands by separating bound and free tracer from sample
EP0564494A1 (en) TEST PROCEDURE AND REAGENT SET THEREFOR.
US7851209B2 (en) Reduction of the hook effect in assay devices
EP0593956B1 (en) Agglutination assays using multivalent ligands
US5468618A (en) Article for performing immunological assays utilizing organic dyes to immobilize immunologically reactive components to a solid phase support and methods for producing and utilizing same
JP2001033454A (ja) 多孔質固相リガンド測定試験片上における被検物質の定量法および装置
JPH0792460B2 (ja) 抽出組成物として界面活性剤混合物を使用する歯周病に随伴する微生物検出用キットおよびその検出方法
CA2008100A1 (en) Method for the determination of immunologically detectable substance
JP2833624B2 (ja) 診断試薬用ラテックス
CN108072756A (zh) 一种同时检测邻苯二甲酸二甲酯和双酚a的量子点荧光淬灭层析试纸条
Lubavina et al. A noninstrumental immunoassay based on colloidal dyes

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired

Owner name: AKZO N.V.