DK155968B - Fremgangsmaade til kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse af en immunokemisk reaktiv komponent i et vandigt proevemedium - Google Patents
Fremgangsmaade til kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse af en immunokemisk reaktiv komponent i et vandigt proevemedium Download PDFInfo
- Publication number
- DK155968B DK155968B DK004681AA DK4681A DK155968B DK 155968 B DK155968 B DK 155968B DK 004681A A DK004681A A DK 004681AA DK 4681 A DK4681 A DK 4681A DK 155968 B DK155968 B DK 155968B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- dye
- sol
- component
- hcg
- labeled
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Devices For Use In Laboratory Experiments (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
i
DK 155968 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af en immunokemisk reaktiv komponent, såsom et hapten, antigen eller antistof, i et vandigt prøvemedium, idet man anvender den specifikke vek-5 selvirknings princip mellem sådanne immunokemisk reaktive komponenter.
Der kendes et stort antal metoder, hvorved stoffer kan bestemmes på kvalitativ og/eller kvantitativ måde, på basis af dannelsen af specifikke immunokomplekser. En række for-10 skellige analytiske metoder står til rådighed for direkte eller indirekte detektering af de til slut dannede immunokomplekser. Ud over aflæsning med det ubevæbnede øje benyttes ofte fysiske metoder, såsom spektrofotometri, fluorime= tri, nephelometri og elektron-/mørkefeltmikroskopi. Disse 15 metoder kan kombineres med anvendelsen af et mærke eller sporstof. I stedet for det aktuelle immunokompleks bliver mærket koblet til én af kompleksets komponenter og derefter detekteret, så at en betydelig lavere detekteringsgrænse kan opnås.
20 Som eksempler på kvalitative immunokemiske metoder kan nævnes den klassiske præcipitinreaktion (Heidelberger og Kendall, 1930) og immunodiffusion - på lignende måde baseret på immu= noprecipitation - (Ouchterlony, 1948), efterfulgt i 1953 af immunoelektroforese udviklet af Grabar. Ved de to sidstnævnte 25 metoder møder antigen og antistof hinanden via diffusion i en agargel. Den resulterende precipitationslinie kan, uanset, om det sker efter forudgående farvning eller ikke, opfattes med det ubevæbnede øje. En ulempe ved disse i og for sig simple metoder er, at diffusion tager temmelig lang tid, og at 30 detekteringsgrænsen er relativ høj.
Kvantitative bestemmelsesmetoder på basis af immuno-præcipi= tationsprincippet blev udviklet af Mancini (1965j radial immunodiffusion) og Laurell (1966; raket-elektroforese).
2
DK 155968 B
lang bestemmelsestid og/eller en relativ høj detekteringsgrænse .
Ud over disse immunokemiske metoder uden mærkning er der i 5 årenes løb blevet udviklet et antal mærkningsmetoder, blandt hvilke man kan nævne hæmagglutineringsprøven, hvor én af komponenterne knyttes til overfladen af erythrocyter, immunofluo-rescensmetoden, hvor én af komponenterne mærkes med en fluorescerende forbindelse (fluorophor), radio-immunoprøven udvik-10 let af Yalow og Berson omkring 1959, hvor man i stedet for en fluorophor benytter et radioaktivt atom eller en radioaktiv gruppe som sporstoffet, og den allerseneste enzymimmunoprøv-ningsteknik, om hvilken de første publikationer fremkom i 1971 fra to uafhængigt af hinanden arbejdende grupper, som omfatter 15 de svenske forskere Engvall og Perlmann og hollænderne Schuurs og van Weemen. I princippet er den sidstnævnte prøve analog med de kendte radio-immunoprøver med den forskel, at man i stedet for anvendelse af radioaktive sporstoffer benytter et enzym som mærke.
20 I US patentskrift nr. 4.108.972 er der beskrevet et mærke, som består af en partikel med en størrelse på 100-200 mesh, hvori der er indlejret en ringe mængde af en påviselig forbindelse, såsom en radioaktiv markør eller en fluorescerende forbindel-25 se. Disse mærker er ikke egnede til anvendelse i en prøve af sandwichtype. I en prøve af agglutinationstype sedimenterer partiklerne endog uden aggregation. De er derfor kun anvendelige til agglutinationsforsøg, hvori aggregation af partiklerne påvises ved mikroskopisk undersøgelse eller ved tælling af 30 partiklerne - hvilke metoder begge er uegnede til rutinemæssig anvendelse i kliniske laboratorier. Endvidere er mængden af den påviselige forbindelse i partiklerne for lav til at muliggøre udførelse af følsom prøve eller analyse med dette mærke.
35 Radio-immunoprøver, der anvendes i vid udstrækning, har u-tvivlsomt vist sig at være af stor værdi, men de er behæftet med et antal væsentlige ulemper, såsom risikofaktoren forårsaget af arbejdet med radioaktive materialer, de store udgifter 3
DK 155968 B
til reagenser og udstyr, den kortvarige stabilitet af de radioaktivt mærkede reagenser samt kravet om, at kun kvalificeret personale må foretage sådanne prøver.
5 Enzym-immunoprøven er ikke behæftet med disse ulemper, men uanset dette er det ønskeligt, at nye prøvemetoder udvikles, som er endnu mere følsomme, kan foretages hurtigere, lettere kan automatiseres og/eller muliggør samtidig bestemmelse af flere immunokomponenter.
10 *'
Den foreliggende opfindelse angår en immunoprøve, sommer ejendommelig ved, at den eller de mærkede immunokemisk reaktive komponenter er blevet opnået ved hjælp af direkte eller indirekte kobling af en sådan komponent eller sådanne komponenter 15 til partikler i en vandig sol af et hydrofobt organisk farvestof eller pigment.
Den "dispergeret farvestof-immunoprøve" (DIA), som er udviklet ifølge den foreliggende opfindelse, er betydelig enklere end 20 "radio-immunoprøven" (RIA), fordi man under den endelige detektering kan benytte sig af en simpel aflæsning med øjnene og/eller kan benytte sig af et simpelt kolorimeter. I sammenligning med "enzym-immunoprøven" (EIA, ELISA®, EMIT®) er bestemmelsen enklere og hurtigere, fordi enzym/substratinkuba-25 tionen kan udelades. Endvidere er det muligt at bestemme to eller flere komponenter samtidigt ved anvendelse af sådanne chromophorer som mærker, der er tydeligt skelnelige spektrofo-tometrisk. Endelig er fordelen ved et farvestof som mærke, som kan syntetiseres reproducerbart, som kan karakteriseres nøjag-30 tigt ved hjælp af analytiske/kemiske metoder, og som er sta-bilt (i form af en kolloidal partikel) evident sammenlignet med radioaktive mærker og enzymmærker med begrænset stabilitet og/eller varierbar batch-kvalitet, medens detekteringsgrænser i det mindste er ækvivalente. Sole af dispergerede farvestof-35 fer har fordele frem for metalsole (f.eks. guld) ved kolori- metriske prøver som følge af den betydelig højere molære ab-sorbans af farvestofsol ene sammenlignet med metalsolene; f . eks.: 4
DK 155968 B
Guldsol (partikelstørrelse 50 nm): 3300 1 mol'1 cm'1 disperse farvestoffer (5.000-80.000 1 mol”1 cm'1; jf. K Venha-taraman: "The Analytical Chemistry of Synthetic Dyes", Wiley & Sons, 1977).
5
Farven kan endvidere intensiveres (forøgel se af absorbans) under den endelige bestemmelse af farvestofmærket ved opløsning af farvestofsol part i kierne i et organisk opløsningsmiddel (f.eks. ethanol, methanol, isopropanol). F.eks.: 10 Mærke xmaks.{®°^ xmaks.|Et°H* aJc®* e** (nm) (nm) XfflakS. e 15 Palani1®
Lysende gult G 496 70,77 28300 " " 464 110,36 44100
Palani1®
Lysende rødt G 520 48,33 19300 " " " 544 88,27 35300 20 * 1 g'1 cm'1 ** 1 mol'1 cm'1.
Til gruppen af farvede organiske forbindelser, der kan anvendes i form af en hydrofob sol ved den her beskrevne 25 fremgangsmåde, hører alle de hydrofobe organiske farvestoffer og pigmenter, som er uopløselige i vand eller kun er opløselige i et meget begrænset omfang.
Til disse skal også medregnes de vandopløselige organiske far-30 vestoffer, for så vidt disse i passende koncentrationer danner associationskolloider, der kan stabiliseres, eventuelt efter forudgående tværbinding. Endvidere er det også muligt at anvende leuco-kypefarvestoffer, som er opløselige i alkalisk vandigt medium, og som ved hjælp af oxidation kan omdannes til 35 deres oprindelige farvede og vanduopløselige form. Disse indbefatter også leuco-kypefarvestofferne, som er vandopløselige og stabiliserede i form af sulfat-halvestere. En anden anvendelig gruppe er gruppen af farvestofkomponenter, der som s
DK 155968 B
delig gruppe er gruppen af farvestofkomponenter, der som sådanne er opløselige i vand og uanset om de er farvede eller ej, efter kobling til hinanden in situ, f.eks. via oxidation eller diazokobling, kan omdannes til vanduopløselige farve-5 stoffer. De følgende grupper kan nævnes som eksempler på ovennævnte farvestoffer, idet der til dette formål benyttes den officielle farveindeksnomenklatur: "Dispersionsfarvestoffer, opløsningsfarvestoffer, pigmenter, kypefarvestoffer, svovl farvestof fer, bejdsefarvestoffer, sol ubi 1 i serede (leuco) 10 kypefarvestoffer, sol ubi 1 i serede (leuco) svovl farvestoffer, azofarvestoffer, oxidationsbaser, gennemfarvningsfarvestoffer" samt "tranferfarvestoffer", der endnu ikke er blevet officielt navngivet.
15 De til anvendelse som mærker bestemte kolloidale farvestofpartikler kan fremstilles ved hjælp af et stort antal metoder, der allerede kendes, se f.eks. Kruyt (Ed.) (1952) "Colloid Science", bind 1, Elsevier, Amsterdam; Venkataraman (Ed.).* "The Chemistry of Synthetic Dyes", Academic Press, New York,
20 bind I (1952), II (1952), III (1970), IV (1971), V (1971), VI
(1972), VII (1974), VIII (1978), Dollmetsch (1976): "Unter- suchungen Liber die Ursachen der Agglomeration von Dispersions-farbstoffen durch Farbstoffhi 1fsmittel beim Fårben", For-schungsbericht Neue Serie No. 2, Institut flir Chemiefasern der 25 Institute fUr Textil- und Faserforschung Stuttgart, Leube (1978) Textil Praxis International, hæfte 6, 733-737, hæfte 7, 823-831.
Proceduren ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særlig 30 egnet til den kvalitative og/eller kvantitative bestemmelse af en immunokemisk reaktiv komponent, såsom hapten, antigen eller antistof, der er til stede i et vandigt prøvemedium, men den kan også anvendes til histologiske eller cytologiske bestemmelser af sådanne komponenter.
Af denne grund angår opfindelsen på tilsvarende måde et hidtil ukendt immunokemisk reagens, der er opnået ved den direkte eller indirekte kobling af en immunokemisk reaktiv komponent til 35
DK 155968 B
e partikler i en vandig sol af et hydrofobt organiske farvestof eller pigment.
Dette immunokemiske reagens kan fordelagtigt være frysetørret 5 eller sprøjtetørret til opnåelse af bedre stabilitet ved lagring. Opfindelsen angår derfor tilsvarende et sådant frysetørret eller sprøjtetørret immunokemisk reagens.
Opfindelsen angår på tilsvarende måde hidtil ukendte prøvesst 10 indeholdende et sådant Immunokemisk reagens.
Med kobling af den immunokemisk reaktive komponent til partiklen, direkte eller indirekte, menes enhver kemisk, fysisk eller fysisk-kemisk binding, såsom en kovalent kemisk binding, 15 via hydrogenbroer, polær tiltrækning eller adsorption, indbefattet også bio-specifik adsorption.
Partiklerne i den vandige sol af et hydrofobt farvestof eller pigment har en partikelstørrelse på mindst 5 nm, fortrinsvis 20 fra 10 til 500 nm.
Farvestofsol-partiklerne kan bære en ladning, der frembringer en stabiliserende effekt på grund af indbyrdes frastødning.
Ved tilsætning af hovedsagelig stærke elektrolytter modifice-25 res ladningsmønsteret, så at aggregation og flokkulering kan finde sted. Dette kan forhindres ved overtrækning af partiklerne med makromolekyler, der har polære grupper, såsom proteiner, polysaccharider, polyethylenglycoler, polyvinylalko-holer, etc.
30
Som beskyttende proteiner er det muligt at anvende antigener, antistoffer eller polypeptidfragmenter deraf, som stadig er immunokemisk aktive. Endvidere er det muligt at tage haptener i betragtning, som er knyttet til makromolekyler (f.eks. pro-35 teiner, polysaccharider), og som under den pågældende immuno-prøve ikke giver anledning til nogen generende reaktion med de andre komponenter. Herved opnås den farvestofso 1-mærkede immunokemisk aktive komponent.
DK 155968 B
7
Det kan forekomme, at der med henblik på stabilisering af farvestofsolen kræves en sådan høj koncentration af f.eks.
5 antistof på overfladen af de kolloidale partikler, at den effektive immunokemiske aktivitet af dette iimnobiliserede protein påvirkes, f.eks. af sterisk hindring. I et sådant tilfælde kan overtrækningen foretages i to trin: 1) Overtrækning med en optimal mængde, som skal bestemmes, 10 af f.eks. et antistof, efterfulgt af 2) overtrækning ræd en makromolekylær forbindelse (f.eks. et protein, et polysaccharid, en polyéthylenglycol eller en polyvinylakohol), som under den pågældende immunoprøve ikke giver anledning til en generende reaktion med andre kompo- 15 nenter. Denne "efterfølgende overtrækning", f.eks. med kvæg-serumalbumin, kan samtidig tjene til at formindske eventuelle uspecifikke adsorptionseffekter.
En anden mulighed med hensyn til et beskyttende protein kan være protein A eller gruppen af lectiner (f.eks. Con A) .
20 Efter en indledningsvis overtrækning af solpartiklerne med disse proteiner, er det som følge af proteinernes specifikke affinitet muligt at påføre et andet lag selektivt ved hjælp af adsorption af immunoglobuliner (via Fc-delen) samt glyco= proteiner (også indbefattende immunoglobuliner) via den el-25 ler de tilstedeværende sukkerrester.
En anden mulighed består i, at farvestofsolpartiklerne først overtrækkes med en polymer eller copolymer, der er indifferent ved den endelige immunoprøve, hvorpå en immunokemisk aktiv komponent derefter ved hjælp af adsorption og/eller 30 kovalent tilknytning kan knyttes til laget af overtræksmateriale. Under overtrækningen af solpartiklerne med den indifferente oolvmer eller copolymer kan hver partikel omslut- 8
DK 155968 B
.*·*· ~·.'Γ ** tes separat, men det er også muligt for flere kolloide partikler at blive inkorporeret inden i ét og samme polymerlag.
Overtrækningen af farvestofsolpartiklerne med den indifferente polymer kan foregå på to måder, enten ved at bringe farve-5 stofsolen i kontakt med polymeren efterfulgt af adsorption og/eller kovalent kobling til solpartiklerne, eller ved at bringe solen ind i en monomers omgivelser eller ind i forskellige monomerers omgivelser og polymerisere eller copolymerisere sidstnævnte in situ. Polymerisation kan 10 foretages f.eks. ved hjælp af stråling eller ved tilsætning af en passende initiator, såsom eksempelvis et persulfat. Omslutningen af en farvestofsolpartikel ved hjælp af in situ - polymerisation af den monomere opløsning, hvori partiklen is.·».· ?befinder sig, under indflydelse af en uorganisk initiator, 15 såsom et persulfat, involverer praktiske vanskeligheder, fordi solen - når en sådan initiator tilsættes, flokkulerer ud.
Det har imidlertid vist sig, at en sådan overtrækning ikke desto mindre er mulig, når man først af alt beskytter solpartiklerne og derefter placerer de beskyttede partikler i 20 den monomere opløsning, idet polymerisation først derefter initieres. De ovenfor nævnte forbindelser kan benyttes som - beskyttelsesmidler til dette formål.
*
Ovértrækning af de kolloidale farvestofpartikler med det eller de følgende formål: Stabilisering af solen, påføring 25 af en immunokemisk reaktiv komponent, eliminering af uspecifikke adsorptionseffekter og/eller påføring af et inter-mediært polymer- eller copolymerlag, kan foretages via direkte /indirekte adsorption af de kolloidale farvestofpartikler, men også ved hjælp af kovalent kemisk tilknytning.
30 Det sidstnævnte styres ved hjælp af tilstedeværelsen af • passende funktionelle grupper i overtræksmaterialet og i farvestoffet. I betragtning kan f.eks. komme diazotering af ^aromatiske grupper efterfulgt af diazo-tilknytning til et aktiveret aromatisk ringsystem; carboxylgrupper kan aktive-35 res ved hjælp af et carbodiimid og derefter, eventuelt via 9
DK 155968 B
en aktiv ester, knyttes til en primær aminokomponent. Alifatiske primære aminogrupper og hydroxylgrupper kan eksempelvis aktiveres ved hjælp af cyanogenbromid eller 'halogen= substituerede di- eller triaziner, hvorefter tilknytning 5 kan finde sted med en primær aminokomponent eller med f.eks.
en komponent indeholdende en -SH, -OH eller imidazolylgruppe. Der kan også gøres brug af bifunktionelle reaktive forbindelser. F.eks. kan glutaraldehyd anvendes til den indbyrdes kobling af primære aminokomponenter, medens f.eks. et hetero-bifunktionelt reagens, såsom N-succinimidyl-3-(2-pyridyldi= 10 thio)propionat, kan benyttes til kobling af en primær amino= komponent til en komponent indeholdende en thiolgruppe.
I denne forbindelse kan også nævnes de reaktive disperger-bare farvestoffer og andre reaktive farvestoffer, der ikke er uopløselige i vand, hvor farvestoffet består af en chromo= 15 phor, der er kovalent koblet med en gruppe, der som så dan allerede er reaktiv, såsom eksempelvis halogensubstituerede di- og triaziner, epoxygrupper, vinyl-sulfongrupper og dihaloquinoxaliner (se Siegel, (1972) i: Venkataraman (Ed.): "The Chemistry of Synthetic Dyes", Academic Press, New York, 20 bind VI; Harms, 1979 i: Banks (Ed.): "Organofluorine Chemicals and their Industrial Applications", Ellis Horwood Ltd., Chichester;* side 188-204) .
De immunokemisk reaktive komponenter, som er mærket med kol-loidale farvestofpartikler, benyttes sædvanligvis som reagens 25 i kombination med andre reagenser til detektering og/eller kvantitativ bestemmelse af f.eks. haptener, antigener og antistoffer, hvortil alle typer immunokemisk teknik kan overvejes, såsom de til RIA og EIA benyttede.
Opfindelsen angår således også "prøvesæt" til anvendelse ved 30 sådanne immunokemiske metoder, hvilke prøvesæt som deres vigtigste komponent indeholder en immunokemisk reaktiv komponent, der er mærket med en farvestof sol, idet den Ια μ. m Jb 5a am «Α JT b. <* £2 BA UIABM M i· Mb MB *1 1a BAA Μ· M *a AM Jb ·! 1· 1 MB AM Λ AM A¥fAA>i· AM« b1* Ib A iIb b3 A _ 10
DK 155968 B
rekte eller Indirekte, adsorptivt og/eller kovalent med den immunokemisk reaktive komponent.
En af de konventionelle immunokemiske metoder er konkurrerende immunoprøve, der kan anvendes til demonstration og/eller 5 bestemmelse af enhver immunokemisk reaktiv komponent. Til demonstration af f.eks. et bestemt antigen, består denne metode i at bringe en forsøgsprøve indeholdende en ukendt mængde antigen i kontakt med enten en bestemt mængde af det tilsvarende antigen, som er mærket med en farvestofsol, og et 10 antistof, der er knyttet til en uopløselig bærer, hvilket antistof er rettet mod dette antigen, eller med en bestemt mængde antigen, som er knyttet til en uopløselig bærer, og et med en farvestofsol mærket antistof, der er rettet mod dette antigen.
15 Efter at reaktionen er afsluttet, bestemmes naturen og/eller mængden af farvestoffet i den bundne og/eller den frie fraktion, hvilket tilvejebringer en kvalitativ og/eller kvantitativ angivelse af det antigen, som skal bestemmes. Alt andet lige benyttes en analog procedure til bestemmelse af andre 20 immunokemisk reaktive komponenter.
Der gøres også omfattende brug af "sandwich-metoden”, der også er velegnet til anvendelse sammen med immunokemisk reaktive komponenter, som er mærket med kolloidale farvestofpartikler. Ved anvendelse af denne teknik bliver en sådan 25 komponent, f.eks. et antistof i tilfælde, hvor et antigen skal bestemmes, immobiliseret på et uopløselige bæremateriale. Dette bæremateriale kan f.eks. være den indre overflade af reaktionsbeholderen, hvori den immunokemiske reaktion foretages. Det er også muligt at anvende bærematerialer i form 30 af perler eller små stænger. Efter indledningsvis inkubation sammen med prøvemængden indeholdende antigenet, eventuelt efterfulgt af et vasketrin, foregår en anden inkubation sammen med et antistof mærket med en farvestofsol, hvorefter farvestoffet bestemmes i den bundne og/eller frie fase.
DK 155968 B
11
Ud over de til dette formål nævnte metoder findes der også utallige andre immunokemiske metoder, ved hvilke den immuno-kemisk reaktive komponent, som er mærket med farvestofsolen, kan benyttes som reagens. Der tænkes her specielt på en im-5 munokemisk prøve, som er baseret på agglutinationsprincippet. Eksempelvis et antistof, der er mærket med en farvestofsol, sættes her til en prøvemængde af en væske indeholdende det antigen, der skal bestemmes. Separationen af de mærkede komponenters bundne og frie fraktioner kan der ses bort fra, 10 fordi detekteringen er baseret på en visuel vurdering af farvestofsolen eller på en spektrofotometrisk/kolorimetrisk bestemmelse.
Den foreliggende opfindelse gør det også muligt samtidigt at påvise tilstedeværelsen i en prøvemængde af forskellige im-15 munokemisk reaktive komponenter, såsom eksempelvis haptener, antigener og antistoffer eller kombinationer deraf, ved at man for hver af komponenterne, som skal påvises, anvender en tilsvarende immunokemisk reaktiv komponent, der er blevet mærket med en kolloidal farvestofpartikel, der er karakteri-20 stisk for denne komponent.
Bestemmelsen af naturen og/eller koncentrationen af farvestoffet ved prøvens afslutning kan foretages ved anvendelse af forskellige kendte metoder. Som eksempler på disse kan nævnes visuel bestemmelse, der er overordentlig egnet til 25 en kvalitativ bestemmelse, specielt ved anvendelse af farvestoffer. Til kvantitativ bestemmelse kan der eksempelvis gøres brug af kolorimetri/spektrofotometri. De nævnte metoder er også egnede til den endelige detektering ved agglutina-tionsprøven, hvor vigtigheden ikke knytter sig så meget til 30 koncentrationen af farvestoffet, men i stedet til det ydre udseende af farvestofsolen (en større eller mindre aggregationsgrad, eventuel flokkulation, spektrale ændringer forårsaget deraf).
Τ7λ Λ Λ a V« 1»»* ^ vs J· 4 J· ·—* -1— 4 τ*Λ Λ Λ Λ 1 Α Λ ^ ·Ρ "Ρ ^ A J· A 4* ·Ρ A Ja ( Α 11α *ΙΑ
DK 155968B
12 farvestofferne under samtidig bestemmelse), kan der endvidere tyes til fluorimetri, og - i tilfælde af metalkompleks-farvestoffer og/eller pigmenter, kan der anvendes "normal" og/ eller flammeløs atomabsorptionsspektrofotometri. Opfindelsen 5 forklares nærmere nedenfor ved hjælp af de efterfølgende eksempler.
Eksempel 1.
Kolorimetrisk og/eller visuel bestemmelse af humant chorionisk gonadotropin (HCG) ifølge det beskrevne DIA-princip ("sand-10 wich-prøve").
1.1. Fremstilling af farvestofsolen.
"Palanil’’ ® rødt BF (BASF, 7 g) blev dispergeret i destilleret vand (140 ml). Dispersionen blev omrørt i 45 minutter ved stuetemperatur og derefter centrifugeret (30 minutter, 15 125 g = 1.225 N/kg). Supernatanten blev over ført til andre centrifugerør og centrifugeret (30 min., 7.500 g = 73.500 N/kg). Den oven på svømmende væske blev fjernet, og de sammenpressede småkugler blev vasket tre gange med destilleret vand (3 x 140 ml, centrifuge: 30 min., 20 7.500 g = 73.500 N/kg). De sammenpressede småkugler blev gen suspenderet i destilleret vand (70 ml), og derefter tilsattes så mange glasperler (diameter = 3 mm og diameter = 4 mm, blanding 1:2) , at væskeniveauet var det samme som glasperleniveauet. Tromlebehandling blev udført i 5 dage ved stue-25 temperatur på en tromlebænk. Væsken blev dekanteret fra og centrifugeret (30 min., 300 g = 2.940 N/kg). Supernatanten blev derefter overført til andre centrifuge rør og atter centrifugeret (30 min., 1.000 g = 9.800 N/kg).
Fra denne sidste supernatant blev 3/4 (52,5 ml) 30 omhyggeligt opsuget, og denne koncentrerede farvestofsol blev opbevaret ved stuetemperatur. Ekstinktionen ved 533 (= ^maks.) nra af en 20 x fortyndet prøve af denne sol var 1,57.
DK 155968 B
13 1.2. Fremstilling af kanin anti-HCG-immunoglobulin/farve-stofsol-konjugatet.
En prøve (0,8 ml) af den under 1.1. beskrevne farvestofsol blev fortyndet med destilleret vand (4,2 ml), og pH-værdien 5 blev indstillet til 7,0 ved anvendelse af 0,1 mol/1 NaOH
eller HC1. Denne sols ekstinktion er 5,0 ved 533 nm (= \naks.).
X)
Derefter blev kanin anti-HCG-immunoglobulinopløsning (0,1 ml) tilsat. Reaktionsblandingen blev rystet hvert femtende minut i løbet af 1 time ved stuetemperatur, hvorefter en opløsning 10 af kvægserumalbumin (BSA) blev tilsat (1 ml; 307,2 g BSA + 0,1 g natriummerthiolat + 5 mmol NaCl/1, pH 7,0). Dispersionen blev rystet hvert femtende minut i løbet af 1 time ved stuetemperatur og blev derefter centrifugeret (30 minutter, 4.000 g = 39.200 N/kg). Supernatanten 15 blev fjernet, og de sammenpressede småkugler blev resuspen-deret indtil et volumen på 5 ml i en opløsning med følgende sammensætning: 51,2 g BSA + 0,1 g natriummerthiolat + 5 mmol NaCl/1 (pH indstillet til 7,0 med 0,1 mol NaOH/1).
x)
Opløsningen af kanin anti-HCG immunoglobulin blev frem-20 stillet som følger: Immunoglobulinfraktionen af kanin anti-HCG serum blev isoleret ved hjælp af den kendte Na2S04-udfældningsmetode. Præcipitatet blev opløst i og dialyseret mod en vandig opløsning af 5 mmol NaCl/1, hvis pH-værdi var blevet indstillet til 7,0 med fast ^200^. Den dialyserede 25 opløsning blev til slut fortyndet til en proteinkoncentration på 1 mg/ml (ifølge Warburg-Kalckar-formlen: Proteinkoncentration (mg/ml) = 1,45 x A^ - 0,75 x A^-?1*1) eller 280 1 cm 1* 260 0,65 mg/ml (i overensstemmelse med A2gQ ' ° = 14,5 for IgG).
1.3. "Overtrækning" af "Microelisa" ^ -plader med kanin 30 anti-HCG immunoglobulin.
Phosphatpuffer (FFB): 0,04 mol Na2HPO^/l og 0,04 mol Na^PO^/l blev blandet til
DK 155968 B
14 sattes NaCl indtil en koncentration på 0,15 mol/1.
Opløsning A.
Kanin anti-HCG immunoglobulin (se 1.2.) opløst i FFB indtil en koncentration på 30 mg/1.
5 ' Opløsning B.
20 g BSA + 0,1 g natriummerthiolat/1 FFB.
Opløsning A (0,11 ml) blev pipetteret i "Microelisa" ® -pladers fordybninger, hvorefter pladerne blev inkuberet i 16 timer ved 0-4°C. Efter bortsugning blev opløsning B 10 (0,11 ml) sat til alle fordybningerne, hvorefter pladerne .blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Til slut blev fordybningerne tømt ved opsugning og vasket tre gange med destilleret vand, hvorefter pladerne blev tørret (16 timer ved stuetemperatur over fortørret silicagel), em-15 balleret i poser af aluminiumlaminat (med silicagelpose) og opbevaret ved 4°C.
1.4. Bestemmelse af en standardkurve for HCG i phosphatpuf-fer og i ren urin.
Phosphatpuffer (FFB).
20 Som beskrevet i 1.3, men med 1 g BSA/1 og 1 g natriummer= thiolat/1.
Vaskepuffer I. Phosphatpuffer.
Vaskepuffer II.
0,1 mol TRIS ( (HOCH2)3CNH2) +0,1 mol NaCl + 0,5 g "Tween 25 20+0,1 g natriummerthiolat/1, indstillet til pH 7,4 med 4 mol HCl/1.
15
DK 15S968B
Ethanol.
P.A., 96% (v/v).
HCG.
En opløsning af humant chorionisk gonadotropin med et 5 indhold på 1.000 IU FFB (immunoprøve)/ml.
Ren urin.
Urin fra en ikke-gravid kvinde, filtreret over "Hyflo"® og derefter frosset. Før anvendelse filtreret gennem foldefilter.
10 Konjugat.
Farvestofsol/anti-HCG konjugatet, fremstillet som beskrevet i 1.2 (9 ml), blev blandet med koncentreret phosphatpuffer (1 ml; 10 x koncentreret FFB).
Procedure: 15 1. Den følgende fortyndingsrække af HCG-opløsningen blev foretaget i henholdsvis FFB og urin: 4.000, 1.000, 250, 62,5, 15,6, 3,9 m IU (immunoprøve)/ml.
2. 0,1 ml af disse opløsninger og af ren FFB og urin blev pipetteret i fordybningerne i en "Microelisa" ®-plade, der 20 forinden var blevet "overtrukket", som beskrevet i 1.3, med kanin anti-HCG immunoglobulin (se 1.3). Alt dette foretages dobbelt.
3. Pladen lukkes med et passende låg og inkuberes i 3 1/2 time ved 37°C i en atmosfære, der er mættet med vanddamp.
25 4. Fnrrh/hn -i ποαπίρ Ί-Μτητηι»« hnrf.snrmi na . hvpr fnrdvhni ner • i i DK 155968 B j 16 pipetteringsvaskes med puffer I (0,3 ml), og der bortsuges atter.
5. Konjugatet (0,1 ml) pipetteres i hver fordybning.
6. Inkubering foretages som beskrevet under punkt 3, men 5 nu i 18 timer.
7. Fordybningerne tømmes ved bortsugning, farven i fordybningerne bedømmes visuelt og/eller der pipetteringsvaskes med puffer II (0,3 ml) i fordybningerne. Der bortsuges, og proceduren gentages yderligere to gange.
10 8. Ethanol (0,12 ml) sættes-t.il alle de tørre fordybninger, der rystes forsigtigt, og farven bestemmes visuelt og/eller ekstinktionen måles ved 516 nm (= \taks.).
Hvis der ved anvendelse af den beskrevne procedure også medtages prøver med et ukendt HCG-indhold, kan HCG-koncen-15 trationen let bestemmes visuelt. En mere nøjagtig bestemmelse kan om ønsket foretages ved hjælp af ekstinktionsmåling og sammenligning med standardkurven. Standardkurver for HCG i urin og for FFB,. der. er bestemt på denne måde, er vist i fig. 1.
20 Detekteringsgrænsen, defineret som (blindprøve + 2 x stand ardafvigelse) , er for FFB 3,9 m IU (immunoprøve)/ml, og for urin er den 15,6 IU (immunoprøve)/ml.
1.5. Bestemmelse af HCG i urin fra kvinder med henblik på detektering af graviditet.
25 Reagenser: Se afsnit 1.4.
Procedure:
Som beskrevet i 1.4., men nu under medtagelse af de tilsvarende urinprøver, som eventuelt kan fortyndes. Resulta-
DK 155968 B
17 terne er vist i den efterfølgende tabel: "Pregnos=
Prøve Fortynding ticon" ® Visuelt A,-ls HCG kone.
"All-in" b±b 5 1374 ufortyndet + + 0,588 4.000 1374 1:10 + + 0,595 40.000* 1130 ufortyndet + + 0,659 4.000 305 ufortyndet + + 0,707 4.000 726 ufortyndet - - 0,057 80 10 546 ufortyndet - - 0,043 65 1123 ufortyndet - - 0,047 65 x i den ufortyndede prøve.
Konklusionen om, hvorvidt graviditet foreligger, svarer til (r) resultaterne af graviditetsprøven "Pregnosticon"^ "All-in".
15 Ved denne sidstnævnte prøve betyder "+" = > 1000 IU/ml, og "-" = 500 IU/1.
Eksempel 2.
Som i eksempel 1, men dispergeret, blev farvestof/anti^HCG konjugater fremstillet under anvendelse af "Resorlin"^ 20 brilliantblåt RRL og de fluorescerende dispergerede farve stoffer "Samaron" ®brilliantrødt H6GF, "Samaron" ®brilli-antgult H10GF, "Palanil"®luminescensrødt G og "Palanil" ® luminescensgult G som kolloidale mærker. (Med hensyn til tilsvarende ^maks.-værdier, se eksempel 9).
25 Fortyndingsrækker af HCG blev fremstillet i puffer. Reduktion af inkubationstiderne sammenlignet med standardproceduren blev undersøgt: HCG inkubation var 2,5 h og konjugat-inkubation 2,5 h i stedet for henholdsvis 6,5 h og 18 h.
Der opnåedes en detekteringsgrænse på 0,02-0,25 mlU HCG/ml.
Tf) Dette svarer udmærket til de andre Droivesvsterner:
DK 155968 B
18 - RIA: 2 mlU HCG/ml (DL:HCG-koncentration ved (90% binding +2 x SD)) - EIA: 20 mlU HCG/ml (DL: som for RIA) - SPIA: 0,25-1 mIU/ml (DL: blindprøve +2 x SD) 5 (kolorimetrisk detektering) - rev-HAI: 10-20 mlU HCG/ml (DL: HCG-koncentration, der frembringer en signifikant ændring i mønsteret).
Endvidere blev den samlede forsøgstid nedsat fra 24,5 h til 5 h, hvilket kun havde en begrænset virkning på detekterings-10 grænsen (i tilfælde af "Samaron" ©brilliantrødt H6GF).
De fluorescerende dispergerede farvestoffer blev undersøgt med henblik på forbedring af detekteringsgrænsen ved måling af fluorescens i stedet for ekstinktion. En betydelig forbedring opnåedes i tilfælde af "Samaron"© brilliantgult 15 H10GF og "Palanil"^luminescensgult G, medens ingen virkning opnåedes itilfælde af "Samaron"^ brilliantrødt H6GF og (r) "Palanil"^ luminescensrødt G.
Eksempel 3.
DIA for hepatitis B overfladeantigen (HBsAg); sandwichsystem.
20 3.1. Fremstilling af farvestofsol _ £r^ se afsnit 1.1. j de dispergerede farvestoffer "Palanil*·-' rødt BF og "Samaron"® brilliantrødt H6GF blev benyttet som kolloidale mærker. (Med hensyn til tilsvarende ^maks.-værdier, se eksempel 9).
25 3.2. Fremstilling af fåre-(anti-HBsAg) IgG/farvestofkonjugat.
Se afsnit 1.2. j men benyt fåre-(anti-HBsAg) immunoglo= bulin i stedet for kanin anti-HCG IgG.
3.3. Overtrækning af "Microelisa"^ -plader med fåre-(anti-HBsAg) IgG.
30 Se afsnit 1.3.j anvend fåre-immunoglobulin i stedet for
Van *t i Tnrmiia/vrl λΚπ 1 *ϊ r>
DK 155968 B
19 3.4. Bestemmelse af standardkurver for HBsAg (subtype ad og ay).
Fortyndingsrækker af HBsAg (ad og ay) blev fremstillet under anvendelse af humant negativt kontrolserum 5 som fortyndingsmiddel i intervallet 4-1000 ng/ml.
Prøver (0,1 ml) af disse fortyndinger og af det negative kontrolserum blev bedømt i overensstemmelse med proceduren, beskrevet i afsnit 1.4. (trin 3-8). Vedrørende \naks. (ethanol), se eksempel 9.
10 Detekteringsgrænser på 16-23 ng/ml (ad) og 24-38 ng/ml (ay) (r) blev opnået med "Samaron" ^ farvestof/konjugat. Til sammenligning: - ΞΙΑ ("Hepanostika"®): 3 ng/ml - EIA ("Hepanostika"-T^): 0,7 ng/ml (DL: middelnegativ 15 værdi + 5 x SD) - SPIA: 20-40 ng/ml (DL: blindprøve + 2 x SD) (kolorimetrisk detektering).
DIA/sandwichsystemet blev også benyttet til sammenligning af flere prøver af monoklonale antistoffer med et standard-20 præparat af heterogent fåre-anti-HBsAg IgG. Tre prøver resulterede i dosis-svarkurver svarende til standarden, medens de andre præparater var af en tydeligt ringere kvalitet.
Eksempel 4.
DIA til humant placentalt lactogen (HPL); sandwichsystem.
25 4.1. Fremstilling af farvestofsol.
Ir)
Se afsnit 1.1.j de dispergerede farvestoffer "Palanil"^ rødt BF og "Palanil"^-gult 3G blev benyttet som kol-loidale mærker (vedrørende tilsvarende \naks.-værdier, se eksempel 9).
5 η Δ O ffroraaf i 1 1 inrr a-F Van-in fan-t-ϊ— ΙϊΡΤΛ T / Famroej-f-nFVnn "i nrra —
DK 155968 B
20 tet. ,! j
Se afsnit 1.2.; men brug anti-HPL i stedet for anti-HCG.
4.3. Overtrækning af "Microelisa"® -plader med kanin-anti- 5 HPL IgG.
Se afsnit 1.3.; men benyt anti-HPL i stedet for anti-HCG.
4.4. Bestemmelse af standardkurver for HPL.
Fortyndingsrækker af HPL blev fremstillet i FFB (se 10 afsnit 1.4) i intervallet 0,4-100 ng/ml. Prøver (0,1 ml) af disse fortyndinger og af FFB blev bedømt i overensstemmelse med proceduren beskrevet i afsnit 1.4.
(Trin 3-8). Vedrørende \naks. (ethanol), se eksempel 9.
En detekteringsgrænse på 1,2-1,7 ng HPL/ml blev opnået. Til 15 sammenligning: -RIA: 0,03-0,14 ng/ml -EIA: 2 ng/ml -SPIA: 0,12 ng/ml (kolorimetri).
Eksempel 5.
20 DIA til anti-rubella; sandwichsystem.
5.1. Fremstilling af farvestofsol.
Se af£snit 1.1.; de dispergerede farvestoffer "Palanil'^4· rødt BF og "Resolin"® -brilliantblåt RRL blev benyttet som kolloidale mærker (vedrørende tilsvarende \aaks.-25 værdier, se eksempel 9).
5.2. Fremstilling af fåre-anti-(humant IgG) IgG/farvestof-konjugat.
Se afsnit 1.2.; men benyt fåre-immunoglobulin i stedet kanin-materialet.
(S' 30 5.3. Overtrækning af "Microelisa" ^ -plader med inaktiveret rubella viralt antigen (opnået fra vævskultur).
DK 155968 B
21
Se afsnit 1.3.; men benyt Rubella antigen i stedet for immunoglobulinet.
5.4. Bestemmelse af standardkurver for humant anti-Rubella. Fortyndingsrækker af humant anti-Rubella blev frem-5 stillet under anvendelse af fåre-negativt kontrolserum som fortyndingsmiddel i intervallet 0/4-320 IU/ml. Prøver (0/1 ml) af disse fortyndinger og af det negative kontrolserum/ blev bedømt i overensstemmelse med proceduren beskrevet i afsnit 1.4. (Trin 3-8). Vedrørende 10 \naks. (ethanol), se eksempel 9.
Detekteringsgrænsen, defineret som (BL + 2 x SD), var 2,5 IU/ml, hvilket svarer udmærket til en skønnet detekteringsgrænse for "Rubenostika" på ^10 IU/ml.
Eksempel 6.
15 DIA til humant Prolactin (PRL); sandwichsystem.
6.1. Fremstilling af farvestofsol.
Se afsnit 1.1., de dispergerede farvestoffer "Palanil" (§) luminescensrødt G og "Palanil"^ -luminescensgult G blev benyttet som kolloidale mærker (vedrørende til-20 svarende \naks.-værdier, se eksempel 9).
6.2. Fremstilling af det monoklonale (anti-PRL) IgG/farve-stofkonjugat.
Se afsnit 1.2.; men benyt det monoklonaleIgG i stedet for kaninmaterialet.
25 6.3. Overtrækning af "Microelisa" ^-plader/strimler med monoklonalt (anti-PRL) IgG.
Se afsnit 1.3.; men benyt det monoklonaleIgG i stedet for kaninmaterialet.
Bemærkning: Immunoglobuliner fra forskellige kloner 30 blev benyttet til fremstilling af konju- — ~ j_ / r n t__j_ * i _i_ ^ M ^ \
DK 155968 B
22 6.4. Bestemmelse af standardkurver for PRL.
Fortyndingsrækker af PRL blev fremstillet i FFB (se afsnit 1.4.) i intervallet 0,4-100 ng/ml.
Prøver (0,2 ml) af disse fortyndinger og af FFB blev 5 bedømt i overensstemmelse med proceduren beskrevet i afsnit 1.4. (trin 3-8) med følgende ændringer: - inkubering af antigen (PRL): 20 h, stuetemperatur, - inkubering af konjugat: 20 h, stuetemperatur, vedrørende \naks. (ethanol) se eksempel 9.
10 En detekteringsgrænse på 1-4 ng/ml blev opnået.
Til sammenligning: EIA 1-4 ng/ml SPIA 6-10 ng/ml.
Eksempel 7.
Samtidig bestemmelse af HCG og HPL i overensstemmelse med 15 DIA-princippet; sandwichsystem.
7.1. Fremstilling af farvestofsolene.
Se afsnit 1.1.; de dispergerede farvestoffer "Resolin" brilliantblåt RRL og "Palanil"® -gult 3G blev benyttet som kolloidale mærker (vedrørende tilsvarende ^maks.-20 værdier, se eksempel 9).
7.2. Fremstilling af kanin (anti-HCG) IgG/- og kanin (anti-HPL) IgG/farvestofkonjugaterne.
Se afsnit 1.2.; fremstil følgende kombinationer:
- "Resolin" ® -brilliantblåt RRL/anti-HCG
25 - "Palanil” ® -gult 3G/anti-HPL.
Det kombinerede konjugat fremstilles ved blanding af lige volumener af de to konjugater, hvilket resulterer i en slutekstinktion på 5 (ved maks.) for hvert farve-stofkonjugat.
30 7.3. Overtrækninu af "Microelisa" ^-olader med kanin anti-
DK 155968 B
23 HCG, kanin anti-HPL og med en blanding af begge dele.
Se afsnit 1.3.j plader til den samtidige bedømmelse blev fremstillet ved anvendelse af følgende overtræksblanding: 5 Kanin anti-HCG 15 ng/1 kanin anti-HPL 15 ng/1.
7.4. Samtidig bestemmelse af HCG og HPL.
Generelt blev den i afsnit 1.4. beskrevne bedømmelsesprocedure benyttet (vedrørende ^maks.-værdier i etha= 10 nol, se eksempel 9): a) De enkelte og kombinerede konjugater blev afprøvet i mikrotitreplader, der kun var overtrukket med kanin anti-HCG eller kanin anti-HPL. Det kombinerede konjugat og anti-HCG-konjugatet resulterede i en jævnbyrdig reak-15 tion i en fortyndingsrække af HCG i FFB (se afsnit 1.4.), medens anti-HPL-konjugatet ikke reagerede.
Anti-HPL-konjugatet resulterede i en kraftigere reaktion end det kombinerede konjugat i en fortyndingsrække af HPL i FFB, medens anti-HCG-konjugatet ikke reagerede.
20 b) Endelig blev prøver af HCG, HPL og (HCG + HPL) i FFB
inkuberet i fordybningerne i en mikrotitreplade, der var overtrukket med kanin anti-HCG og med kanin anti-HPL samtidigt. Den anden inkubering blev foretaget med det kombinerede konjugat. Resultaterne er vist i fig. 2, 25 som viser muligheden af en samtidig DIA/sandwich.
Eksempel 8.
DIA til testosteron.
8.1. Metode 1.
Denne metode er baseret på detekteringen af frit anti-30 testosteron på den faste fase, efter inkubering med den testosteronholdige prøve.
DK 155968B
24
Se afsnit 1.1.
8.1.2. Fremstilling af testosteron-lla-hemisuccinyl-BSA/ farvestofsolkonjugat.
Testosteron-lla-hemisuccinat opløses i 2 ml dimethyl= 5 formamid (DMF), og opløsningen køles derefter til -15°C.
Kvægserumalbumin (BSA, 140 mg) opløses i destilleret vand (3 ml), hvorefter 40 μΐ 4 mol/1 NaOH og 2 ml DMF tilsættes. Opløsningen køles derefter til -15°C.
10 Derefter sættes 12,5 μΐ N-methylmorpholin og 12,5 μΐ iso= butylchlorformiat til testosteronderivatopløsningen. Efter 3 minutter sættes denne reaktionsblanding til BSA-opløsningen. Reaktionsblandingen holdes under omrøring ved 1 time ved -15°C og derefter i 3 timer ved 0°C. Derefter dialyseres 15 reaktionsblandingen mod destilleret vand i 16 timer ved 4°C, idet det destillerede vand regelmæssigt fornyes. Den dialyserede opløsning bliver derefter centrifugeret, og den klare supernatant frysetørres.
Testosteron-lla-hemisuccinyl-BSA/farvestofsolkonjugatet 20 fremstilles derefter under anvendelse af metoden, der er beskrevet til immobilisering af kanin anti-HCG immunoglo= bulin på en "Palanil"^ -rødt BF-sol, idet man anvender den samme koncentration til testosteron-BSA-derivatet som til kanin anti-HCG immunoglobulinet.
25 8.1.3. 11 Over trækning11' af "Microelisa"® -plader med kanin anti-testosteron immunoglobuliner.
Overtrækningen blev udført som beskrevet i afsnit 1.3. under anvendelse af immunoglobulinfraktionen, der var isoleret fra et kanin antiserum, opnået ved 30 immunisering med testosteron-lla-hemisuccinyl-BSA.
O I A Ο'λ ·>"· 4- 1 A « 4· Λ Λ Λ *· <1* Α ίΛΛ Μ
DK 155968 B
25
Ved anvendelse af reagenserne og forsøgsproceduren som beskrevet for-HCG i afsnit 1.4., bestemtes en standardkurve for testosteron, ved hjælp af hvilken testosteronkoncentrationen af ukendte prøver der-5 efter blev beregnet via prøvernes Aglg, som opnået i i overensstemmelse med nævnte forsøgsprocedure. Detekteringsgrænsen for denne bestemmelse er 1 ng/ml.
Det er let at beregne testosteronindholdene ved aflæsning med det ubevæbnede øje (sammenligning af 10 farveintensiteten af standardprøver og ukendte prøver efter standsning af reaktionen.
8.2. Metode 2.
Denne metode er baseret på en konkurrerende binding af o 11 testosteron (T) og T -BSA til anti-(T -BSA), som var 15 immobiliseret på den faste fase (f.eks. polystyrenrør eller mikrotitreplade).
Detektering efterfulgt af en anden inkubering med et anti-(T^-BSAj/farvestofkonjugat.
3
Bemærkning: .T -BSA: Testosteron-3-0-carboxymethyl= 20 oxim, kovalent koblet til en Nl^-gruppe i BSA (amidbinding) . T^-BSA: Tes tos teron-ll-hemisuccinat, ko valent koblet til en Nl^-gruppe i BSA (amidbinding).
25 8.2.1. Fremstilling af farvestofsol.
Se afsnit 1.1; de dispergerede farvestoffer "Samaron"®brilliantrødt H6GF og "Saraaron"^-bril-liantgult H10GF blev benyttet som kolloidale mærker (vedrørende tilsvarende ^maks.-værdier, se eksempel 9).
30 8.2.2. Fremstilling af kanin (anti-T^-BSA) IgG/farvestof kon jugatet.
Se afsnit 1.2.; men anvend kanin anti-T^-BSA i ste-
DK 155968 B
26 8.2.3. Overtrækning af "Microelisa"®-plader og polysty= renrør med kanin (anti-T^-BSA) igG.
Se afsnit 1.3. j men anvend kanin (anti-T^-BSA) i stedet for kanin anti-HCG.
5 Bemærkning; 1 ml af opløsningerne A og B anvendes i tilfælde af overtrækning af rørene.
8.2.4. Bestemmelse af standardkurver for testosteron.
3
Der fremstilledes opløsninger af T og T -BSA i FFB (se afsnit 1.4.).
3 10 a) Koncentrationen af T -BSA til anvendelse ved den konkurrerende prøve blev undersøgt ved inkubering af en fortyndingsrække af T^-BSA alene, efterfulgt af konjugatetj 1 ml volumener pr. rør, eller 0,1 ml volumener pr. mikrotitreplade-fordybning. Proceduren er 15 som beskrevet i afsnit 1.4. (trin 3—8)5 vedrørende ^maks. (ethanol), se eksempel 9. Til den samlede konkurrerende bedømmelse valgtes koncentrationer af 3 T -BSA svarende til 2 og 16 pmol T/ml samlet prøvevolumen.
20 b) Den konkurrerende prøve blev foretaget under an- 3 vendelse af konstante koncentrationer af T -BSA svarende til 2 og 16 pmol T/ml samlet prøvevolumen og en fortyndingsrække på 0-64 pmol T/ml prøve. Til rørene benyttedes 0,9 ml testosteronholdig prøve og 3 25 0,1 ml af en T -BSA-opløsning (svarende til henholds vis 20 og 160 pmol T/ml). Til mikrotitrepladen ændres de respektive volumener til 0,09 og 0,01 ml. Den yderligere procedure er som beskrevet i afsnit 1.4.
(trin 3-8). Vedrørende ^maks. (ethanol), se eksempel 9.
30 Detekteringsgrænsen, defineret som (BL - 2 x SD), var 0,2 - 3 0,4 pmol T/ml prøve, ved anvendelse af en T -BSA-koncentration svarende til 2 pmol T/ml samlet prøvevolumen. Det totale detekteringsinterval var ca. 0-8 pmol T/ml prøve. Ved RIA og EIA opnås 50% binding ved henholdsvis 1 pmol T/ml og Λ C Λ *7 ΓΠ /rnl
DK 155968 B
27
Eksempel 9.·
Alternative metoder til fremstilling af farvestofsole.
9.1. Dispergerede farvestoffer.
I stedet for "Palanil" ® -rødt BF (BASF), som nævnt 5 i afsnit 1.1./ har også andre dispergerede farvestof fer været benyttet til fremstilling af farvestofsole, hvilke farvestoffer indbefatter: i ;Amaks.-(nm) "lAmåling(nm)~ :_ _ivanda^ ethanol^ ethanol_ 10 "Palanil"®-violet 6R BASF 623 571 " -gult 3G " 415 443 443 " -luminescens gult G d) " 496 464 443 " luminescens 15 rødt G d) " 520 544 540 "Terasil" ^ -brilliant-
Flavin 8GFFd) Ciba- 488 461 443
Geigy Æn ........
"Terasil" ^-brilliantly serødt 4BN " 571 571 540 20 "Cibacet" ^-violet 2R " 538 592 549 "Foron" ®-brilliant-
Flavin S8GFd> Sandoz 433 427 "Resolin" ®-brilliant- blåt RRL Bayer 670 578 600 25 "Procinyl"®-blåt Re) ICI 672 "Samaron" ® -brilliant- rødt H6GFd) Hoechst 512 510 510 "Samaron" ®-brilliant- gult Hl0GFd' " 451 458 443 (S) 30 "Samaron" y -brilliant- orange HFRd' " 508 499 492 /S\ "Samaron" ^-violet HFRL " 566 543 540 a) som kolloidal opløsning 35 M som molekvlær ODlOsnina 23
DK 155968 B
til rådighed stående filtre.
d) eksempler på dispergerede farvestoffer, som også kan detekteres ved hjælp af fluorometri.
e) et eksempel på "reaktive" dispergerede farvestoffer.
5 Sole blev fremstillet ud fra i handelen gående farvestoffer, gående ud fra en 5% (vægt/volumen) dispersion af farvestoffet i destilleret vand, i tilfælde af tørre, pulveriserede produkter. I tilfælde af flydende præparater blev forsøg påbegyndt med en 5% (vægt/vægt) dispersion i destilleret vand.
10 Fraktionering af farvestofdispersionen i vand blev foretaget ved hjælp af centrifugering som beskrevet i afsnit 1.1.. Fraktionering til partikelstørrelse har også være udført ved hjælp af filtre med en bestemt porestørrelse. På denne måde opnås anvendelige sole, men farvestofudbyttet var betydeligt 15 mindre end i tilfælde af centrifugering, og yderligere er denne metode ekstremt tidsforbrugende.
Hydrodynamisk kromatografi og anvendelsen af gradienter under centrifugering udgør et nyttigt supplement til de ovenfor nævnte metoder.
20 9.2. Transferfarvestoffer.
Transferfarvestoffer er farvestoffer, som benyttes ved transfertrykning, hvorved et farvet mønster overføres fra én overflade til en anden, generelt fra papir til tekstil. "Sublistatisk-, sublimations-, tør varme- eller 25 termotrykkeprocessen" benytter sublimerbare organiske farvestoffer, der generelt er uopløselige i vand og opløselige i organiske medier. Sole af denne farvestoftype er også blevet fremstillet i vand via "kondensationsmetoden" (sé J.Th.G. Overbeek i: H.R. Kruyt (Ed.) 30 "Colloid Science", bind I, side 59-60, 1952, Elsevier,
Amsterdam).
DK 155968 B
29
ÆV
9.2.1. "Lurafix" ^ -blåt PFR (BASF). - Æ)
Opløsninger (1 ml) af "Lurafix" ^ -blåt FFR i acetone med følgende koncentrationer: 2, 1,5, 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 og 0,2 g/1 blev under intensiv omrøring tilsat, 5 hver gang til 49 ml destilleret vand. De opnåede sus pensioner centrifugeres (30 minutter, 1000 g = 9.800 N/kg), og småkuglerne vaskes med destilleret vand (50 ml) og centrifugeres atter under de ovennævnte betingelser. Derefter suspenderes småkuglerne i et 10 sådant volumen destilleret vand, at slutkoncentration en bliver 0,1 mg/ml. De til slut opnåede farvestofsole blev opnået ved at underkaste de forskellige suspensioner en ultrasonisk behandling (Branson Sonifier B-12, 2 minutter, 70 Watt). Disse farvestof-15 soles absorptionsspektrum blev registreret i området 750-360 nm. ^maks.-værdien faldt fra 716 til 617 nm, idet man gik ud fra solen svarende til en oprindelig farvestof/acetonekoncentration fra 2 g/1 ned til 0,2 g/1. Disse spektrale ændringer angiver en faldende 20 partikelstørrelse (se H.R. Kruyt: "Colloids”, side 132, 1930, Wiley, New York} G.H. Jonker i H.R. Kruyt (Ed.): "Colloid Science", bind I, side 102, 1952, Elsevier, Amsterdam} og F.B. Gribnau, Dissertation, Utrecht 1935).
9.2.2. "Lurafix"· ® -rødt BF (BASF).
25 a. En opløsning af "Lurafix" ® -rødt BF i acetone (1 ml, 0,5 g/1) sættes under kraftig omrøring til destilleret vand (24 ml). Derefter afdampes acetonen jævnt under vakuum og ved stuetemperatur. Via en indledningsvis stabil sol opnås til sidst et præcipitat. Suspen-30 sionen centrifugeres (30 minutter, 1000 g = 9.800 N/kg), og småkuglerne resuspenderes i destilleret vand (25 ml) efterfulgt af en ultrasonisk behandling (Branson Sonifier B-12, 2 minutter, 70 Watt).
(R) b. En opløsning af "Lurafix" rødt BF i acetone (1 ml, "3 ζ ζ <τ/1 \ caa-h-hoe l in ri ον Vraffi rr rrairrtn'nrt +- i 1 flocf i 1 1 orp +
DK 155968 B
30 vand (249 ml/ 50°C). Efter 1 minut ved 50°C køles blandingen ned til stuetemperatur. Efter henstand i en dag ved stuetemperatur begynder den indledningsvis stabile sol delvis at flokkulere.
5 Fotografier blev taget af de to netop fremstillede sole ved hjælp af et scanning elektronmikroskop, se fotografierne 1 og 2.
9.3. Fedt-farvestoffer (opløsningsmiddel-farvestoffer).
En gruppe hydrofobe organiske farvestoffer, som er 10 uopløselige i vand, men opløselige i organiske opløs ningsmidler eller blandinger deraf. Ved anvendelse af kondensationsmetoder, som beskrevet i afsnit 9.2., kan sole fremstilles ud fra disse farvestoffer i vandige medier.
15 9.4. Kype farves toffer.
Disse vand-uopløslige anthraquinoide eller indigoide farvestoffer kan ved hjælp af reduktion i alkalisk medium omdannes til de tilsvarende, vandopløselige leuco-forbindelser. Ud fra disse er det derefter muligt at 20 fremstille farvestofsole ved hjælp af styret oxidation.
Leucoforbindelserne (solubiliserede kypefarvestoffer), der er stabiliseret som sulfatester, kan også anvendes til dette formål.
9.5. Organiske pigmenter.
25 Disse forbindelser, som definitionsmæssigt er uopløse lige i vand og organiske medier, kan via en dispersionsmetode omdannes til kolloidale "opløsninger" (se P.
Nylen og E. Sunderland: "Modern Surface Coatings", Interscience Publishers, London 1965).
30 Eksempel 10.
Varianter af fremstillingen af farvestofsole/immunoglobulin-
DK 155968 B
31 konjugater, således som de er beskrevet i eksempel 1 (1.2.).
10.1. Immobilisering af immunoglobulin på kolloidale farvestofpartikler.
10.1.1. "Lurafix" ® -blåt FFR (BASF) --;-/ør 5 En opløsning af "Lurafix" ^ -blåt FFR i acetone (5 ml, 1 g/1) sættes under kraftig omrøring til destilleret vand (245 ml). Efter centrifugering (30 minutter, 1000 g = 9800 N/kg) fjernes den oven på svømmende væske, og småkuglerne vaskes med de- 10 stilleret vand (50 ml). Småkuglerne resuspenderes destilleret., vand (indtil 50 ml) , og suspensionen behandles ultrasonisk (Branson Sonifier B-12, 2 minutter, 70 watt). Den opnåede sol fortyndes til 1 citi opnåelse af en -værdi på 1,0.
15 Kanin anti-HCG immunoglobulinopløsning (0,2 ml, 1 mg/ml i en opløsning af 5 mmol NaCl/1, pH 7,0) sættes til 10 ml af denne sol, og blandingen opbevares i 16 timer ved stuetemperatur. Derefter tilsættes en opløsning af "Carbowax" ®-20M (0,2 ml, 10 g/1 i en opløsning af 5 mmol NaCl/1, pH 7,0), 20 og efter opbevaring i 30 minutter ved stuetemperatur centrifugeres solen (30 minutter, 4000 g= 39.200 N/kg). Småkuglerne vaskes to gange med "Carbowax" S -2OM opløsning (0,2 g/1 i en opløsning af 5 mmol NaCl/1, pH 7,0) og resuspenderes derefter deri til opnåelse af et slutvolumen på 5 ml.
25 Den ovenfor beskrevne procedure gentages, men nu ved anvendelse af normalt kaninimmunoglobulin. Immunoaktiviteten af konjugaterne fastslås på følgende måde:
Prøver (2 ml) af hvert konjugat fortyndes ved anvendelse af den sidstnævnte "Carbowax" ® -20M-opløsning. Hertil sættes 30 0,1 ml af en opløsning af HCG, der er mærket med peberrod- peroxidase HRP, og reaktionsblandingen inkuberes i 2 timer ved stnefAmnAratair. norpftpr nentrifuaerer man (3Ω minutter.
DK 155968 B
32 4000 g = 39.200 N/kg), småkuglerne vaskes to gange med sidst-
(S
navnte "Carbowax" ^-20M-opløsning, og de resuspenderes i en opløsning af chronægen/substrat (o-phenylendiamin/urinstof= peroxid). Efter en time ved stuetemperatur standses enzym= 5 reaktionen med 4 mol/1 svovlsyre, og supernatan- ternes måles efter centrifugering (30 minutter, 4000 g = 39.200 N/kg).
Farvestof/anti-HCG Ig konjugat: = 0/556 farvestof/normalt Ig konjugat: A.492 = 0,275.
10 10.1.2. "Palanil" ® -rødt BF (BASF)
Immobilisering af f.eks. proteiner på faste bærermaterialer kan opnås via adsorption og via direkte eller indirekte kovalent kobling. Det sidstnævnte afhænger af tilstedeværelsen af passende funktionelle 15 grupper i farvestoffets kemiske formel. F.eks. er det muligt at anvende aromatiske aminogrupper ved en diazokobling, medens carboxylgrupper kan aktiveres ved hjælp af et carbodiimid. Alifatiske primære aminogrupper og hydroxylgrupper kan aktiveres ved 20 hjælp af cyanogenbromid. Der kan også gøres brug af bifunktionelle forbindelser. Det er således muligt at anvende glutaraldehyd til kobling af aminokompo-nenter.
Det er i denne forbindelse også muligt at anvende reaktive 25 dispersionsfarvestoffer, idet disse er farvestoffer, hvori chromophoren er knyttet til en gruppe, som allerede som sådan er reaktiv, f.eks. halogentriaziner og halogenpyrimidi= ner.
De følgende eksempler er blevet gennemført med dispersions te) 30 farvestoffet "Palanil" -rødt BF (BASF) under anvendelse % af en fraktion, som blev isoleret på følgende måde:
DK 155968 B
33
En dispersion af dette farvestof i vand (62/5 g/1) centrifugeres (30 minutter, 750 g = 7.350 N/kg). Småkuglerne vaskes fem gange med destilleret vand og to gange med en opløsning af poly (vinylalkohol) (PVA) i vand (1 g PVA/lf PVA: 5 "Mowiol” ® 28-99, Hoechst). Til slut resuspenderes småkugler ne til et slutvolumen på 2 liter i en PVA-opløsning (0,1 g PVA/1 i en opløsning af 5 mmol NaCl/1, pH 7,0). Prøver (25 ml) af denne farvestofsol, om ønsket efter behandling, som beskrevet mere detaljeret i det foregående, blev blandet 10 med en opløsning af fåre anti-HCG immunoglobulin (0,65 ml, 40 mg/ml i en opløsning af 5 mmol NaCl/1, pH 7,0).
Adsorption og/eller tilknytning af dette protein til de kolloidale farvestofpartikler blev udført i 16 timer under de nedenfor anførte betingelser: 15 10.1.2.1. Adsorption.
a. Adsorption ved pH 4,0 og 0 mol NaCl/1 b. Adsorption ved pH 4,0 og 0,1 mol NaCl/1 c. Adsorption ved pH 7,0 og 0 mol NaCl/1 d. Adsorption ved pH 7,0 og 0,1 mol NaCl/1 20 e. Adsorption ved pH 6,0 og 0 mol NaCl/1 (sol og protein blev blandet ved pH 4,0) f. Adsorption ved pH 6,0 og 0,1 mol NaCl/1 (sol og protein blev blandet ved pH 4,0).
10.1.2.2. Diazokobling 25 Farvestoffet blev diazoteret ved 4°C under an vendelse af NaNC^/HCl, og derefter blev reaktionsblandingens pH-værdi indstillet til 8,6 ved anvendelse af fast Na2CC>2. Til slut tilsattes proteinet, og koblingen blev foretaget ved 4°C.
30 a. NaN02: 0,1 mol/1, HC1: 0,1 mol/1 b. NaN02: 0,05 mol/1, HC1: 0,05 mol/1 c. NaN02: 0,01 mol/1, HC1: 0,01 mol/1.
DK 155968 B
34 10.1.2.3. Tværbinding ved hjælp af glutaraldehyd. Glutaraldehydkoncentrationen i farvestofsolen blev indstillet til henholdsvis 1 og 10 mmol/1, hvorefter pH-værdien blev indstillet til henholdsvis 5 7,4 og 10,0. Efter 1 time ved stuetemperatur blev pH-værdien på 10,0 reduceret til 9,0. Til slut tilsattes protein. Reaktionen blev foretaget ved stuetemperatur .
a. Glutaraldehyd: 1 mmol/1, pH 7,4 10 b. " : 10 mmol/1, pH 7,4 c. " : 1 mmol/1, pH 10,0.
10.1.2.4. CNBr-aktivering
Farvestofsolen blev centrifugeret, og småkuglerne blev vasket med en opløsning af 5 mmol NaCl/1, 15 pH 7,0. Dette blev efterfulgt af resuspendering i den samme opløsning eller i en opløsning af PVA (10 g/1 i en opløsning af 5 mmol NaCl/1, pH 7,0). CNBr-koncentrationen i de forskellige sole blev indstillet til henholdsvis 0,045 og 0,005 20 mol/1, hvorefter pH-værdien blev indstillet til 11,0 ved anvendelse af 4 mol NaOH/1. Efter 12,5 minutter ved stuetemperatur blev reaktionsblandingerne centrifugeret, og småkuglerne blev vasket to gange med 0,1 mol/1 NaHCC>3, pH 8,5 (4°C) .
25 Dette blev efterfulgt af resuspendering til be gyndelsesvolumenet i 0,025 mol/1 NaHC03, pH 8,5. Proteinkoblingen blev udført ved 4°C.
a. PVA-koneentration: 0 g/1, CNBr-konc.: 0,045 mol/1 b. " : 10 g/1, " " : 0,045 mol/1 30 c. : 10 g/1, * " : 0,005 mol/1.
Efter 16 timer blev de forskellige reaktionsblandinger centrifugeret (30 minutter, 1000 g = 9.800 N/kg). De oven på svømmende væsker blev fjernet, og småkuglerne blev vasket to gange med en opløsning af 5 mmol NaCl/1, pH 7,0, og re-35 suspenderet til et slutvolumen på 20 ml i den samme opløs-
DK 155968 B
35 ning.
Immunoaktiviteten af de forskellige konjugater blev bestemt ved inkubering af 5 ml af hvert konjugat (16 timer, 4°C, i mørket) med HCG, der var mærket med peberrod-peroxidase 5 (HRP). Derefter centrifugeres reaktionsblandingerne (1000 g = 9.800 N/kg, 30 minutter). Småkuglerne vaskes to gange med 3 ml af en opløsning af 5 mmol NaCl/1, pH 7,0, og derefter resuspenderes de i en opløsning af chromogen/substrat (o-phenylendiamin/urinstofperoxid). Efter en times reaktions-10 tid ved stuetemperatur (i mørket) standses enzymreaktionen med 4 mol/1 svovlsyre, og efter centrifugering (30 minuttter, 1000 g = 9.800 N/kg), måles supernatenternes A492“værdi*
Den ovennævnte procedure blev også foretaget under anvendel-15 se af HRP alene med henblik på specificitetskontrol.
Konjugat A492 A492 A492 _· ' (HCG-HRP) XJ · (HRP) ’ ': (HCG-HRP) ’__j 10.1.2.1- a. 0,195 0,094 b. 0,420 0,098 0,750 20 c. 1,738 0,109 1,970 d. 0,942 0,109 1,280 e. 0,230 0,109 f. 1,129 0,103 1,496 10.1.2.2- a. 0,738 0,120 1,260 25 b. 0,568 0,113 1,316 c. 0,777 0,086 1,505 10.1.2.3- a. 1,097 0,062 1,920 b. 0,489 0,073 c. 0,443 0,065 30 d. 0,436 0,118 10.1.2.4- a. 1,900 0,088 2,153 b. 1,300 0,137 2.020 c. 1,022 0,118 1,671
DK 155968 B
36 s) Konjugaterne blev afprøvet på tre forskellige dage:
Dag 1: 10.1.2.1-a/f
Dag 2: 10.1.2.2-a/c og 10.1.2.3-a/c
Dag 3: 10.1.2.4-a/c.
5 xx) Disse konjugater blev afprøvet den samme dag.
10.2. Virkningen af "ef terføi'gende overtrækning11 af farvestof-sol/immunoglobulinkonjugater på immunoaktivitet.
iS)
Forsøgene blev foretaget under anvendelse af "Palanil"'-' rødt BF (BASF) som eksempel/ idet der benyttedes den 10 type sol, som allerede er fremstillet i overensstem melse med den i afsnit 1.1. ovenfor beskrevne metode. Denne sol blev indstillet til pH 7,0 ved anvendelse af 0,1 mol/1 NaOH eller HC1, og ekstinktionen(ved 533 nm) blev indstillet til 5,0.
15 Prøver (37 ml) af denne sol blandes med en opløsning af kanin anti-HCG immunoglobulin (0,74 ml, 1 g/1 i en opløsning af 5 mmol NaCl/1, pH 7,0). Ig-koncentrationen i reaktionsblandingen er derefter 20 mg/1. Efter 1 times inkubation ved stuetemperatur sættes følgende til solene: 20 a. Ingenting n b. "Carbowax" -20M indtil en koncentration på 0,2 g/1 c. BSA indtil en koncentration på 0,2 g/1.
Efter yderligere 1 times inkubation ved stuetemperatur centrifugeres solene (30 min., 4000 g = 39.200 N/kg). Småkug-25 lerne resuspenderes til et slutvolumen på 37 ml i en opløsning af 5 mmol NaCl/1 med enten intet yderligere additiv, 0,2 g "Carbowax"® -20M/1 eller 0,2 g BSA/1.
De forskellige konjugater og den rene farvestofsol blev afprøvet ved en DIA ("Sandwich-prøve") under anvendelse af 30 den i afsnit 1.4. beskrevne procedure. Den til HCG benyttede
DK 155968 B
37 fortyndingsrække var 0/ 250, 1000 og 4000 IU (immunoprøve) liter phosphatpuffer.
. . Kon.j ugat. . ..... .........Α5Γ6....... i - · . . ... .G.C.G. .(ih/ι.).·'. . ", : o.... ·;. : .2.5.0:..." .1000 . 4.000 5 10.2-a '0,579 0,773 0,722 0,480 b 0,165 0,178 0,165 0,166 c........0,62.1. ..0.,.967... .1,300 1,591
Ren .f.ar.ve stofs.o.1. . . .0.,.056. . . -......- 10.3. Rensningsmetoder til isolation af konjugatet efter 10 fremstilling.
Blandt andet kan følgende metoder betragtes som rensningsmetoder: - centrifugering - gelkromatografi 15 - affinitetskromatografi - membranfiltrering - delvis udfældning (flokkulation, efterfulgt af vask-ning og genfortynding af solen).
Centrifugering og gelkromatografi blev undersøgt i detaljer, 20 og resultaterne blev sammenlignet med resultaterne opnået med et konjugat, der ikke var blevet renset, men iøvrigt var fremstillet på identisk måde. Med henblik herpå benyttedes urenset konjugat 10.2-c.
10.3-a gelkromatografi 25 4 ml konjugat = fØres gennem en "Sepharose"^ CL 2B-søjle (Pharmacia K 16/20, lagvolumen 35 ml, ækvi-libreret med en opløsning af 5 mmol NaCl + 0,2 g BSA + 1,0 g NaN^/l, pH 7,0). Søjlen elueres med ækvilibrerings-puffer (stuetemperatur, 30 ml/time). Detektering af _ — x « x a · .
DK 155968 B
38 på 1,3 ml opsamles, og hovedfraktionerne fra farvestoftoppen blandes.
10.3- b Centrifugering.
1 cm 4 ml konjugat (A^33 = 5,01 centrifugeres (30 min., 5 4000 g = 39.200 N/kg) og resuspenderes til opnåelse af et slutvolumen på 4 ml ved anvendelse af en opløsning af 5 mmol NaCl + 0,2 g BSA +1,0 g NaN3/l, pH 7,0.
10.3- c Ingen rensning
Det urensede konjugat 10.2-c benyttes til dette formål.
10 De tre konjugater afprøves ved en DIA {sandwichprøve) under anvendelse af den i afsnit 1.4. beskrevne procedure. HCG-fortyndingsrækken i afsnit 10.2. blev benyttet.
. Konjugat. .... A51g.......
HCG (IU/1) 0 250 1000 . . .4.000. Udbytte (%) 15 10.3-a 0,228 0,551 0,713 0,505 4,3 b 0,218 0,339 0,456 0,557 93,6 c 0,234 0,418 0,583 0,700 100,0 10.4. Virkning af den under fremstillingen af konjugatet benyttede' 'immunoglobulinkoncentration på den endelige 20 ' immunoaktivitet.
Prøver (5 ml) af en farvestofsol fremstillet ud fra "Palanil” ® -rødt BF (BASF) i overensstemmelse med metoden beskrevet i afsnit 1.1. blandes med 0,1 ml af en kanin anti-HCG immunoglobulinopløsning (5 mmol NaCl/1, 25 pH 7,0) , hvilket resulterer i slutkoncentrationer på: 10.4-a 10 mg/1 b 20 mg/1 c 40 mg/1 d 80 mg/1.
DK 155968 B
39
Efter inkubering i 1 time ved stuetemperatur tilsættes 0,1 mol af en BSA-opløsning (5 mmol NaCl + 20 g BSA/1, pH 7,0)', hvilket resulterer i en slutkoncentration på 0,4 g BSA/1.
Efter inkubering i 1 time ved stuetemperatur centrifugeres 5 solene (30 min., 4000 g = 39.200 N/kg), supernatan- terne fjernes, og småkuglerne resuspenderes indtil et slut-volumen på 5 ml ved anvendelse af en opløsning af 5 mmol NaCl + 0,4 g BSA + '0,1 g natriummerthiolat/1, pH 7,0.
Immunoaktiviteten af konjugaterne fastslås ved hjælp af en 10 DIA (sandwichprøve1 i overensstemmelse med den i afsnit 1.4. beskrevne procedure. HCG-fortyndings rækken fra afsnit 10.2,, blev benyttet. .....
' Kon. j.ugat.................A516..... j HCG. /(1.0/1} 0 250 1000 j 4000 j 15 10.4-a 0,268 0,499 0,761 1,000 b 0,362 0,658 0,902 1,141 c 0,511 0,741 0,913 1,107 . . d...... 0.,50.7.. 0,.681 0,847 . 0,955 10.5. Virkning af typen af anti-HCG immunoglobulin på immuno-20 ' aktiviteten' af konjugatet; anvendelsen af anti-HCG im= munoglobulin, der er isoleret fra får samt kanin anti-HCG-serum samt monoklonalt muse-anti-HCG immunoglobulin.
Anti-HCG immunoglobulin/farvestofsol-konjugaterne blev X cn fremstillet ved overtrækning af prøver (5 ml, A^^ ‘ -25 5,0) af en "Palanil"®-rødt BF-sol, der er fremstillet i overensstemmelse med den i afsnit 1.1. beskrevne metode, på følgende måde: 10.5-a Fåre anti-HCG immunoglobulin.
Proteinopløsningen (0,1 ml, 1 g/1 i en opløsning af 30 5 mmol NaCl/1, pH 7,0) sættes til solen, og reak-
DK 155968 B
40 tur. Derefter tilsættes en BSA-opløsning (0,1 ml, 20 g/1 i en opløsning af 5 mmol NaCl/1, pH 7,0) , og efter inkubering i 1 time ved stuetemperatur centrifugeres solen (30 min., 4000 g = 39.200 N/kg). .
5 Supernatanten fjernes, og småkuglerne re- suspenderes indtil et slutvolumen på 5 ml i en opløsning af 5 mmol NaCl + 0,4 g BSA + 0,1 g natriummer= thiolat/1, pH 7,0.
10.5- b Kanin anti-HCG immunoglobulin.
10 Det samme som 10.5-a, men nu med kanin immunoglobulin.
10.5- c Monoklont muse anti-HCG immunoglobulin
Som 10.5-a, men nu med muse-immunoglobulinet og under anvendelse af følgende mængder: 10.5- c-l: 0,1 ml immunoglobulinopløsning (1 g/1, 15 5 mmol NaCl/1, pH 7,0) 10.5- C-2: 0,1 ml immunoglobulinopløsning (0,25 g/1, 5 mmol NaCl/1, pH 7,0).
Immunoaktiviteten af konjugaterne blev fastslået ved anvendelse af en DIA (sandwichprøve) i overensstemmelse med 20 den i afsnit 1.4. beskrevne procedure. Følgende HCG fortyndingsrække blev benyttet. 0, 15,6, 62,5, 250, 1000 og 4000 IU (immunoprøve)/1.
Konjugat . Å516 ' ' HCG : (IIT/1) O' ' 15-, 6 1 62,5 250 1 1000 I 4000 25 10.5-a 0,483 0,509 0,552 0,618 0,789 1,032 b 0,556 0,608 0,649 0,710 0,877 1,114 c-1 0,406 0,432 0,450 0,503 0,536 0,586 c-2 0,437 0,495 0,497 0,528 0,559 0,653 ..... . . . j. ..... .... I. ..... -
DK 155968 B
41 * 10.6. Virkning af BSA-koncentrationen' opnået under "efterfølgende overtrækning på immunoaktiviteten af' kon j uga tet. ·
Konjugater af dispersionen af farvestoffet "Palanil" 5 rødt BF (BASF) blev fremstillet i overensstemmelse med den i afsnittene 1.1. og 1.2. beskrevne procedurer, men med følgende variationer i BSA-koncentrationerne: BSA-koncentration i den · BSA-koncentration i reak-. . .tilsatte opløsning, .(.g/l). . .ti.on.sblandingen (g/l) 10 10.6-a 9,6 1,6' b 19,2 3,2 c 38,4 6,4 d 76,8 12,8 e 153,6 25,6 15 . .f. . .3.07,2....... .51,2____
Konjugaterne blev isoleret som beskrevet i afsnit 1.2. og til slut resuspenderet i en opløsning med følgende sammensætning: 5 iranol NaCl + 0,1 g natriummerthiolat + x g BSA/1 (pH indstillet til 7,0 med 0,1 mol NaOH/1). BSA-koncentra-20 tionen er altid lig med koncentrationen under den "efterfølgende overtrækning", og den er således henholdsvis x = 1.6, 3,2, ...... 51,2 g/1 (se tabel).
Immunoaktiviteten af konjugaterne blev fastslået ved hjælp af en DIA ("Sandwichprøve") i overensstemmelse med den i 25 afsnit 1,4. beskrevne procedure. Under denne blev følgende HCG-fortyndingsrække benyttet: 0, 3,9, 15,6, 62,5, 250, 1000, 4000, 16000 IU (immunoprøve)/1.
DK 155968 B j 42
Konjugaf......... .... : . . . . A516...... ......
HCG ίΧϋ/l) O . 3/9 . . 15,6 62,5 | 250 1 1000 4000 ) 16000 10.6-a 0/322 0,397 0,378 0,436 0,565 0,773 0,954 1,034 b 0,254 0,282 0,286 0,344 0,489 0,707 0,892 0,960 5 c 0,137 0,154 0,175 0,235 0,397 0,661 0,812 0,906 d 0,062 0,078 0,095 0,147 0,297 0,594 0,778 0,852 e 0,039 0,040 0,054 0,110 0,283 0,572 0,759 0,843 f . . 0,021 .0,029 .0,0.44 .0,111. .0,310 0,629 0,803 .0,882 ! 1 -- - - — 1 ----
Eksempel 11.
10 Kolorimetrisk og/eller visuel bestemmelse af humant chorionisk gonodotropin (HCG) i overensstemmelse med DIA-princippet (al-lutinationsprøve; metode 1).
11.1. Fremstilling af farvestofsolen.
Se 1.1.
15 11.2. Fremstilling af kanin an'ti-HCG immunoglobulin/ farvestofsol-konjugatet.
Se 1.2.} i dette tilfælde indeholder BSA-opløsningen imidlertid 2,4 g/1, fordi småkuglerne er resuspende-ret i en opløsning med den beskrevne sammensætning, 20 men indeholdende 0,4 g BSA/1. Konjugatet bliver til slut yderligere fortyndet indtil en A^.^111 “vær<^ = 2,2.
11.3. Bestemmelse af HCG i phosphatpuffer eller urin TRIS-guffer 25 1 mol TRIS + 1 mol NaCl + 10 g BSA/1, indstillet til pH 7,4 med 4 mol/1 HCl.
HCG Se 1.4.
DK 155968B
43
Urin
Se 1.4. se 1.4.
5 Konjugat.
Se 11.2.
Procedure
1. HCG-opløsnirig åf 5.000 og 1.000 IU (immunoprøve)/1 fremstilles ved fortynding af standard HCG-opløsningen med FFB
10 eller urin.
2. I en celle (1 cm lysbane) pipetteres: Konjugat (1 ml}, TRIS-puffer (0,1 ml) samt HCG-opløsning (0,11 ml). Der blandes godt, og absorptionsspektret skanderes øjeblikkeligt i området 750-360 nm med henholdsvis FFB og urin som reference.
15 3. Man lader cellerne henstå ved stuetemperatur i 20 timer.
Derefter vurderes indholdene visuelt, cellerne rystes, og man fastslår endnu en gang et absorptionsspektrum i området 750-360 nm.
Repræsentative spektre er vist i fig. 3, medens numeriske 20 data er anført i den følgende tabel: HCG-koncen- > . " UU/l)11· ' VisUelt (A533)0_(A533^x ^.575^ O-(A575} x 0 - 0 0 1000 + 0,15 0,14 5000 ++ 0,40 0,21 •_ 25 x) : Ingen agglutination/aggregation. Stabil farvestofsol„. "+": Begyndende agglutination/aggregation. Den oven på svømmende væske har lysere farve end den tilsvarende blindprøvevæske (0 IU HCG/1) som følge af sedimentation.
^++1^ Fil Ids tænd i rr acralnfinsfirin /airrcroasfirtn . PaMmafnianl
DK 155968 B
44 er fuldstændig flokkuleret, og farvestoffet er udfældet.
xx) 0: 0 IU HCG/1 x: henholdsvis 1 og 5, IU HCG/1.
Eksempel 12.
5 Kolorimetrisk bestemmelse af humant chorionisk gonadotropin (HCG) i overensstemmelse med DIA-princippet (agglutinations- prøvej metode 2).
12.1. Fremstilling af farvestofsol.
Se afsnit 1.1.
10 12.2. Generel prøveprocedure for DIA/agglutination
Farvestof-immunoglobulinkonjugatet (2 ml) blev pipetteret i en glas- eller polystyrenkuvette og blandet med 0,2 ml af antigenprøven, som var opløst i FFB (se afsnit 1.4.), eller med 0,2 ml FFB alene, samt 0,2 ml 15 destilleret vand eller 0,2 ml af en opløsning af MgSO^ i destilleret vand. Kuvetterne blev opbevaret ved stuetemperatur (uden omrøring), og ekstinktionerne blev bestemt (uden forudgående omrøring) efter regelmæssige tidsrum. Antigenet forårsager agglutination af farve- 20 solpartiklerne, hvilket bevirker et fald i ekstink tionen som følge af den forøgede effektive partikelstørrelse per se og som følge af den ledsagende sedimentation af aggregaterne.
Alle yderligere forsøg vedrører bestemmelsen af HCG.
25 12.3. Fremstilling af kanin (anti HCG) IgG/farvestofkonjugatet.
Standardprocedure: Se afsnit 11.2.
Optimalisering blev foretaget ved undersøgelse af følgende parametre:
DK 155968 B
45 12.3.1. Sekundær_overtræknin2_af^kon2ugater_med_BSA.
Konjugater til DIA/sandwich overtrækkes sekundært · med BSA med henblik på formindskelse af uspecifikke virkninger. Denne ekstra overtrækning af konju-5 gatet vil med sikkerhed også forbedre dets stabili tet og vil derfor være ufordelagtig for konjugater, som skal anvendes ved DIA/agglutination. Konjugater, som er overtrukket med varierende mængder BSA, og også uden BSA, blev sammenlignet ved agglutinations-10 prøven. Konjugatet uden BSA resulterede i den højeste sensitivitet og den laveste detekteringsgrænse i løbet af den korteste forsøgstid, og det var stadig tilstrækkelig’stabilt'til at kunne give en konstant blindprøveværdi.
12.3.2. 0gtimal_<l2G-koncentration_under_konjugatfremstilling.
15 "Palanil" ® -rødt BF/anti-HCG-konjugater blev frem stillet under anvendelse af forskellige IgG-koncen-trationer under overtrækningen, og de blev sorteret ved agglutinationsprøven under anvendelse af en konstant HCG-koncentration på 5 IU/ml prøve (eller: 0,42 20 IU/ml samlet forsøgsvolumen). Den optimale IgG-kon- centration under konjugatfremstillingen viste sig at være 0,033 mg/ml reaktionsblanding ved en solkoncentration svarende til en Α^™111 = 5.
DjU
9 12.3.3. Virkning_af_inkubation_af_IgG_ved-gH-2i0_før_konjugat-
En opløsning af kanin anti-HCG IgG (4-5 mg/ml i 5 mmol NaCl/l,pH 7,0). blev indstillet til pH 2,0 og inkuberet i 1 time ved 4°C. pH-værdien blev genindstillet til 7,4, og IgG-opløsningen blev benyttet til 30 konjugatfremstilling. Koncentrationen af "pH 2-behand- let IgG" under konjugatsyntesen blev forandret, og de forskellige konjugater blev sorteret som beskrevet -i Τ') o
DK 155968 B
46
En koncentration på 0,033 mg "pH 2-behandlet IgG"/ ml reaktionsblanding, ved en solkoncentration sva-1 cm rende til =5, viste sig at være den optimale værdi.
5 Sammenligning mellem konjugater på basis af naturligt
IgG og "pH 2-behandlet" IgG viste tydeligt fordelen ved sidstnævnte med hensyn til reaktivitet ved agglu= tinationsforsøget: (HCG) Formindskelse i aL«111 (%)
IgG i konjugat (IQ/ml) Bfter 4 h efter 18 h 10 Naturligt IgG 2,5' 6 21 5 13 · 63 pH-2-behandlet 2,5 14 i 74
IgG 5 28 I 100 ! · ~___> 12.3.4. Yi^kninc^af_additiver_gå_kon2u^aters_reaktiyitet.
15 Tilsætning af et destabiliserende middel (f.eks.
MgSO^) til konjugatet forud for tilsætning af prøven kan resultere i en formindskelse af reaktionstiden og/eller af detekteringsgrænsen ved agglutinations-prøven, især i tilfælde af konjugater, der er meget 20 stabile per se. Anti-HCG/"Palanil" ® -rødt BF-kon- jugater, baseret på farvestofbatcherne 5228513 (pulver) og 4742893 (våd dispersion), blev inkuberet med en fortyndingsrække af MgSO^, hvilket resulterede i et slutkoncentrationsinterval på 0-20 mmol MgSO./l 25 samlet forsøgsblanding, og A^q blev bestemt med regelmæssige tidsintervaller. Koncentrationer på henholdsvis 1,2 og 9,5 mmol MgSO^/1 samlet forsøgsblanding viste sig at være foreneligt med en stadigvæk passende stabilitet hos konjugaterne (formindskelse 30 af Aj^^ på mindre end 0,1-0,2 efter 2 timer).
DK 155968 B
47
En fortyndingsrække af HCG i FFB (se afsnit 1.4.j 0-5 IU/ml prøve) blev inkuberet med anti-HCG/ "Palanil" ® -rødt BF (4742893) konjugat med og uden 9,5 mmol MgS04/l samlet forsøgsblanding. Konjugatet 5 uden MgSO. resulterede kun i en ringe formindskelse af -værdien sammenlignet med blindprøven, hvor imod der ved tilstedeværelse af MgSO^ iagttoges en formindskelse af ekstinktionen,, som signifikant afveg fra blindprøven: [MgSO^) (HCG) formindskelse af A^q151 (%) 10 (ymol/ml samlet (IU/ml) (efter 2,5 h) forsøgsblanding) ..........' 0 2,5 3 9.5 2,5 13 0 5,0 4 9.5 5,0 21 15 12.3.5. Reaktivitet af anti-HCG/"Palanil" ®_rgØdt_BF-konlu- gatf baseret på "pH 2-behandlet"_IgGf og ved til-stedeværelse af MgSO^.
De kombinerede virkninger, som er beskrevet i 12.3.3./ 12.3.4., blev undersøgt med "Palanil" ® -rødt BF-20 konjugater (baseret på det våde og det tørre i hande len gående præparat), og en HCG-fortyndingsrække i FFB (0-4 IU/ml prøve). De opnåede detekteringsgrænser (defineret som koncentrationen af HCG, der resulterer i en reaktion lig med (BL - 2 x SD)) er sammenfattet 25 nedenfor: - "Palanil" ® -rødt BF 120 IU/1 (20 h) 5228513 (pulver) 400 IU/1 ( 4 h) - "Palanil" ® -rødt BF 280 IU/1 (20 h) 4742893 (dispersion) 1300 IU/1 ( 4 h).
30 Detekteringsgrænsen for SPIA/agglutination er 100 IU/ 1 (kolorimetrisk detektering efter 2 h).
DK 155968 B
48 12.3.6. Virkning af partikelstørreIse på konjugatreaktivitet.
Alle forsøg indtil nu blev udført med kun en fraktion af den samlede farvestofdispersion, nemlig materialet, som bliver tilbage i den oven på svømmende 5 væske ved 1000 - 1100 g (9800 - 10.800 N/kg), hvil ket groft svarer til en partikelstørrelse ^ 0,2 ym diameter. Virkningen af partikelstørrelse blev yderligere undersøgt ved fremstilling af anti-HCG konju-gater af forskellige "g-fraktioner" af "Palanil" R -10 rødt BF og afprøvning af disse ved en HCG agglutina- tionsprøve. Signifikante virkninger iagttoges (se fig. 4) og resulterede i optimale resultater for den farvestoffraktion, som blev isoleret mellem 1500 og 2500 g.
15 Eksempel 13.
Lyofilisering af dispergerede farvestof-immunoglobulin-konju-gater; stabilitet.
Et "Palanil" ® -rødt BF/kanin anti-HCG-konjugat blev lyofili-
X CIR
seret fra en vandig dispersion (A^q 5) indeholdende 20 følgende bestanddele: 5 mmol NaCl
5 g BSA
1 g natriummerthiolat pr. liter; 2,5 g dextran (molekylvægt 40.000,Dalton) pH 7,0 25 5,0 g lactose
Det genfortyndede tørre konjugat viste intet reaktivitetstab sammenlignet med det oprindelige våde præparat. Konju-gatet bevarer sin immunoreaktivitet i mindst- 2 1/2 måned ved -20°C, 4°C og stuetemperatur. Et vist aktivitetstab 30 viste sig efter 2 1/2 måned/37°C, og et betydeligt tab viste sig efter 2 1/2 måned/45°C.
Claims (10)
1. Fremgangsmåde til kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse af en immunokemisk reaktiv komponent, såsom et hapten, antigen eller antistof, i et vandigt prøvemedium under anvendelse af sådanne komponenters immunokemiske reaktivitet i forhold til hinanden, hvorved en eller flere mærkede immunokemisk reaktive komponenter anvendes, og hvorved naturen og/eller mængden af mærket bestemmes under anvendelse metoder, der kendes til dette formål, under eller efter fen vis reaktionstid for den immunokemiske reaktion, eventuelt^ efter fraskillelse af den eller de frie og den eller de bundn^ mærkede komponen- - x ter, i prøvemediet eller i en af de efter fraskillelse opnåede fraktioner, kendetegnet ved, at den mærkede immu-nokemisk reaktive komponent eller hver maerket immunokemisk reaktive komponent er opnået ved direkte eller indirekte kob- Vi Ting af en sådan komponent eller sådanne komponenter til par- M tikler i en vandig sol af et hydrofobt organisk farvestof eller pigment. t|
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at detekteringen finder sted ved konstatering af farvestofsolens fysisk-kemiske ændringer, enten visuelt eller ved hjælp af måling.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og/eller 2, kendetegnet ved, at to eller flere immunokemisk reaktive komponenter samtidigt bestemmes ved, at der for hver komponent, som skal angives eller bestemmes, anvendes en tilsvarende immunokemisk reaktiv komponent, som er mærket med en organisk farve-stofsolpartikel, der er karakteristisk for komponenten, ved anvendelse af chromophorer, som tydeligt kan skelnes fra hinanden spektralt og/eller visuelt.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den mærkede komponent eller hver mærket komponent er opnået ved til solen af det organiske farvestof eller pigment at sæt so DK 155968 B te et eller flere makromolekyler, der er immunokemisk indifferente ved den tilsvarende bestemmelse, og som overtrækker sol-partiklerne, hvorefter den immunokemisk reaktive komponent knyttes til overtræksmaterialet ved hjælp af adsorption, eventuelt bio-specifikt, eller via kovalent kobling.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den mærkede komponent eller hver mærket komponent er opnået ved anbringelse af den organiske farvestofsol og/eller den organiske pigmentsol i en opløsning af monomerer, hvorefter monomererne polymeriseres eller copolymeriseres til opnåelse af omsTutning af solpartiklerne, og den immunokemisk reaktive komponent derefter adsorberes eller kovalent kobles til polymermaterialet.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den mærkede komponent eller hver mærket komponent er opnået ved kovalent kobling af den immunokemisk reaktive komponent til kolloidale organiske farvestofpartikler, enten ved forudgående kemisk aktivering af egnede funktionelle grupper i farvestoffet og/eller i den immunokemisk reaktive komponent, eller ved anvendelse af konjugater af organiske hydrofobe chro-moforer og reaktive grupper, der kendes som reaktive (dispersions) farvestoffer.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den organiske farvestofsol s og/eller den organiske pigmentsols partikler først beskyttes ved hjælp af et hydrofilt ma-kromolekyle, hvorefter (co)-polymerisation finder sted under indvirkning af en uorganisk initiator.
9. Immunokemisk reagens til anvendelse til bestemmelse af en eller flere immunokemisk reaktive komponenter i et vandigt medium, kendetegnet ved, at det omfatter en mærket immunokemisk reaktiv komponent, der er opnået ved direkte eller indirekte tilknytning af en sådan komponent til partikler i en vandig sol af et hydrofobt organisk farvestof eller pigment. DK 155968 B
10. Frysetørret eller sprøjtetørret immunokemisk reagens, kendetegnet ved, at 'det er opnået ved frysetørring eller sprøjtetørring af det immunokemiske reagens ifølge krav 9.
11. Prøvesæt til anvendelse ved kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse af en eller flere immunokemisk reaktive komponenter i et vandigt prøvemedium, kendetegnet ved, at det foruden andre reagenser indeholder et eller flere immu-nokemiske reagenser ifølge krav 9 eller 10.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL8000173A NL8000173A (nl) | 1980-01-11 | 1980-01-11 | Toepassing van in water dispergeerbare, hydrofobe kleurstoffen als label in immunochemische testen. |
NL8000173 | 1980-01-11 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK4681A DK4681A (da) | 1981-07-12 |
DK155968B true DK155968B (da) | 1989-06-05 |
DK155968C DK155968C (da) | 1989-10-16 |
Family
ID=19834655
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK004681A DK155968C (da) | 1980-01-11 | 1981-01-07 | Fremgangsmaade til kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse af en immunokemisk reaktiv komponent i et vandigt proevemedium |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4373932A (da) |
EP (1) | EP0032270B1 (da) |
JP (1) | JPS56160655A (da) |
AT (1) | ATE13098T1 (da) |
AU (1) | AU534775B2 (da) |
CA (1) | CA1143654A (da) |
DE (1) | DE3070604D1 (da) |
DK (1) | DK155968C (da) |
ES (1) | ES498430A0 (da) |
FI (1) | FI74820C (da) |
GR (1) | GR73163B (da) |
HU (1) | HU183283B (da) |
IE (1) | IE50655B1 (da) |
IL (1) | IL61864A (da) |
MX (1) | MX161039A (da) |
NL (1) | NL8000173A (da) |
PT (1) | PT72329B (da) |
ZA (1) | ZA8174B (da) |
Families Citing this family (154)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5622871A (en) * | 1987-04-27 | 1997-04-22 | Unilever Patent Holdings B.V. | Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents |
DE2915309A1 (de) * | 1979-04-14 | 1980-10-30 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von anti-hyaluronidase und hierfuer verwendbares mittel |
DK256581A (da) * | 1980-06-13 | 1981-12-14 | Nat Res Dev | Bindingsanalyse |
US4419453A (en) * | 1981-09-28 | 1983-12-06 | The Dow Chemical Company | Immunological agglutination assays with dyed or colored latex and kits |
USRE32011E (en) * | 1981-12-14 | 1985-10-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
US4687732A (en) * | 1983-06-10 | 1987-08-18 | Yale University | Visualization polymers and their application to diagnostic medicine |
AU580263B2 (en) * | 1983-06-10 | 1989-01-12 | Yale University | Novel visualization polymers and their application to diagnostic medicine |
US4500788A (en) * | 1983-08-19 | 1985-02-19 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Device for providing antibacterial radiation |
US4703017C1 (en) * | 1984-02-14 | 2001-12-04 | Becton Dickinson Co | Solid phase assay with visual readout |
JPH0634014B2 (ja) * | 1984-05-17 | 1994-05-02 | 日本合成ゴム株式会社 | 免疫診断用着色粒子 |
GB8415998D0 (en) * | 1984-06-22 | 1984-07-25 | Janssen Pharmaceutica Nv | Staining method |
US4745075A (en) * | 1984-09-06 | 1988-05-17 | Burroughs Wellcome Co. | Diagnostic test methods |
US4735907A (en) * | 1985-03-18 | 1988-04-05 | Eastman Kodak Company | Stabilized fluorescent rare earth labels and labeled physiologically reactive species |
JPS61292556A (ja) * | 1985-06-20 | 1986-12-23 | Green Cross Corp:The | 酵素免疫測定方法およびキツト |
US5501949A (en) * | 1985-12-10 | 1996-03-26 | Murex Diagnostics Corporation | Particle bound binding component immunoassay |
DE3545252A1 (de) * | 1985-12-20 | 1987-08-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung von testosteron sowie hierzu geeignete monoklonale antikoerper |
CA1291031C (en) * | 1985-12-23 | 1991-10-22 | Nikolaas C.J. De Jaeger | Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances |
FR2592717B1 (fr) * | 1986-01-07 | 1989-06-02 | Robert Raymond | Reactif et procede nouveau pour la detection d'un element contenu dans un milieu biologique mettant en jeu la production d'un complexe agglutinable, tel qu'un complexe antigene-anticorps |
US4780421A (en) * | 1986-04-03 | 1988-10-25 | Sclavo Inc. | Cleavable labels for use in binding assays |
JPH0611870B2 (ja) | 1986-06-27 | 1994-02-16 | 徳山曹達株式会社 | 無機化合物/染料複合体粒子 |
US4786589A (en) * | 1986-08-18 | 1988-11-22 | Huntington Medical Research Institute | Immunoassay utilizing formazan-prelabeled reactants |
US4891324A (en) * | 1987-01-07 | 1990-01-02 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Particle with luminescer for assays |
USRE38430E1 (en) | 1987-03-27 | 2004-02-17 | Becton, Dickinson And Company | Solid phase chromatographic immunoassay |
JPH0746107B2 (ja) | 1987-04-27 | 1995-05-17 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | 検定法 |
US4962023A (en) * | 1987-06-22 | 1990-10-09 | Louisiana State University, Agricultural And Mechanical College | Single incubation immuno sorbent assay method using particle labels to detect test antigen specific antibodies in presence of other antibodies |
US4954452A (en) * | 1987-07-09 | 1990-09-04 | Abbott Laboratories | Non-metal colloidal particle immunoassay |
US5120643A (en) * | 1987-07-13 | 1992-06-09 | Abbott Laboratories | Process for immunochromatography with colloidal particles |
US4853335A (en) * | 1987-09-28 | 1989-08-01 | Olsen Duane A | Colloidal gold particle concentration immunoassay |
US4978625A (en) * | 1987-10-19 | 1990-12-18 | Becton, Dickinson And Company | Fluorescence immunoassay using water insoluble dyes |
NL8702769A (nl) * | 1987-11-19 | 1989-06-16 | Holland Biotechnology | Werkwijze voor het bepalen in een testmonster van componenten van de reactie tussen een specifiek bindend eiwit en de bijbehorende bindbare stof onder toepassing van ten minste een gemerkte component, werkwijze voor het bereiden van de gemerkte component, en testkit voor de bepaling van immunocomponenten. |
US5620845A (en) * | 1988-06-06 | 1997-04-15 | Ampcor, Inc. | Immunoassay diagnostic kit |
AU2684488A (en) | 1988-06-27 | 1990-01-04 | Carter-Wallace, Inc. | Test device and method for colored particle immunoassay |
US4963478A (en) * | 1988-07-05 | 1990-10-16 | Immucor, Inc. | Article for preforming immunological assays utilizing organic dyes and method for producing and utilizing same |
US5252459A (en) * | 1988-09-23 | 1993-10-12 | Abbott Laboratories | Indicator reagents, diagnostic assays and test kits employing organic polymer latex particles |
ATE129075T1 (de) * | 1988-11-14 | 1995-10-15 | Akzo Nobel Nv | Wässerige suspension für diagnostischen test. |
US6352862B1 (en) | 1989-02-17 | 2002-03-05 | Unilever Patent Holdings B.V. | Analytical test device for imuno assays and methods of using same |
US5075078A (en) * | 1989-10-05 | 1991-12-24 | Abbott Laboratories | Self-performing immunochromatographic device |
US5252496A (en) * | 1989-12-18 | 1993-10-12 | Princeton Biomeditech Corporation | Carbon black immunochemical label |
KR910014706A (ko) * | 1990-01-10 | 1991-08-31 | 원본미기재 | 세척이 필요없는 개량된 이뮤노어세이(immunoassay)장치 |
US5141850A (en) * | 1990-02-07 | 1992-08-25 | Hygeia Sciences, Inc. | Porous strip form assay device method |
US5096837A (en) * | 1990-02-08 | 1992-03-17 | Pacific Biotech, Inc. | Immunochromatographic assay and method of using same |
US5223220A (en) * | 1990-03-27 | 1993-06-29 | Pacific Biotech, Inc. | Solid phase immunoassay device and method of making same |
US5998220A (en) | 1991-05-29 | 1999-12-07 | Beckman Coulter, Inc. | Opposable-element assay devices, kits, and methods employing them |
US5877028A (en) | 1991-05-29 | 1999-03-02 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Immunochromatographic assay device |
US6168956B1 (en) | 1991-05-29 | 2001-01-02 | Beckman Coulter, Inc. | Multiple component chromatographic assay device |
DE69229960T2 (de) * | 1991-12-13 | 2000-01-05 | Bion Diagnostic Sciences Inc | Agglutierungsassays und kolloide farbstoffe verwendende testsätze |
US5518887A (en) * | 1992-03-30 | 1996-05-21 | Abbott Laboratories | Immunoassays empolying generic anti-hapten antibodies and materials for use therein |
US5395754A (en) * | 1992-07-31 | 1995-03-07 | Hybritech Incorporated | Membrane-based immunoassay method |
US5354692A (en) * | 1992-09-08 | 1994-10-11 | Pacific Biotech, Inc. | Analyte detection device including a hydrophobic barrier for improved fluid flow |
JPH06227955A (ja) * | 1992-12-08 | 1994-08-16 | Kanebo Ltd | 染毛剤又は化粧料及び前処理剤並びに染毛方法 |
FI92882C (fi) * | 1992-12-29 | 1995-01-10 | Medix Biochemica Ab Oy | Kertakäyttöinen testiliuska ja menetelmä sen valmistamiseksi |
US5424193A (en) * | 1993-02-25 | 1995-06-13 | Quidel Corporation | Assays employing dyed microorganism labels |
US5837546A (en) | 1993-08-24 | 1998-11-17 | Metrika, Inc. | Electronic assay device and method |
US5561045A (en) * | 1994-01-04 | 1996-10-01 | Intracel Corporation | Detection reagent, article, and immunoassay method |
US5547833A (en) * | 1994-01-04 | 1996-08-20 | Intracel Corporation | Radial flow assay, delivering member, test kit, and methods |
EP0724909A1 (en) | 1994-11-28 | 1996-08-07 | Akzo Nobel N.V. | Sample collection device |
US5712172A (en) | 1995-05-18 | 1998-01-27 | Wyntek Diagnostics, Inc. | One step immunochromatographic device and method of use |
US6319676B1 (en) | 1995-05-02 | 2001-11-20 | Carter Wallace, Inc. | Diagnostic detection device and method |
US7635597B2 (en) | 1995-08-09 | 2009-12-22 | Bayer Healthcare Llc | Dry reagent particle assay and device having multiple test zones and method therefor |
US5968839A (en) * | 1996-05-13 | 1999-10-19 | Metrika, Inc. | Method and device producing a predetermined distribution of detectable change in assays |
US5945345A (en) * | 1996-08-27 | 1999-08-31 | Metrika, Inc. | Device for preventing assay interference using silver or lead to remove the interferant |
US6001658A (en) * | 1996-09-13 | 1999-12-14 | Diagnostic Chemicals Limited | Test strip apparatus and method for determining presence of analyte in a fluid sample |
US6979576B1 (en) * | 1997-07-25 | 2005-12-27 | Shu-Ching Cheng | Methods of use of one step immunochromatographic device for Streptococcus A antigen |
US6194221B1 (en) * | 1996-11-19 | 2001-02-27 | Wyntek Diagnostics, Inc. | Hybrid one-step immunochromatographic device and method of use |
US20050101032A1 (en) * | 1997-02-10 | 2005-05-12 | Metrika, Inc. | Assay device, composition, and method of optimizing assay sensitivity |
US5969102A (en) | 1997-03-03 | 1999-10-19 | St. Jude Children's Research Hospital | Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof |
US6103536A (en) * | 1997-05-02 | 2000-08-15 | Silver Lake Research Corporation | Internally referenced competitive assays |
EP1019723A4 (en) * | 1997-08-29 | 2003-01-29 | Fertility Acoustics Inc | METHOD AND DEVICE FOR RAPIDLY ANALYZING SUBSTANCES TO BE ANALYZED IN BIOLOGICAL SPECIMENS |
US6267722B1 (en) | 1998-02-03 | 2001-07-31 | Adeza Biomedical Corporation | Point of care diagnostic systems |
US6394952B1 (en) | 1998-02-03 | 2002-05-28 | Adeza Biomedical Corporation | Point of care diagnostic systems |
WO1999047923A2 (en) | 1998-03-20 | 1999-09-23 | The Rockefeller University | Assays for screening compounds which interact with cation channel proteins, mutant prokaryotic cation channel proteins, and uses thereof |
US20060019404A1 (en) * | 1998-05-06 | 2006-01-26 | Blatt Joel M | Quantitative assay with extended dynamic range |
US9134303B1 (en) | 1998-08-25 | 2015-09-15 | Alere Scarborough, Inc. | ICT immunoassay for Legionella pneumophila serogroup 1 antigen employing affinity purified antibodies thereto |
US6824997B1 (en) * | 1998-09-18 | 2004-11-30 | Binax, Inc. | Process and materials for the rapid detection of streptococcus pneumoniae employing purified antigen-specific antibodies |
US20080096236A1 (en) * | 1998-08-25 | 2008-04-24 | Binax, Inc. | Method for Detecting the Presence of Target Bacteria or a Target Component Carbohydrate Antigen Thereof |
US6699722B2 (en) | 2000-04-14 | 2004-03-02 | A-Fem Medical Corporation | Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes |
WO2002006837A1 (fr) * | 2000-07-14 | 2002-01-24 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Proteine a marquage de particules et immuno-chromatographe utilisant ce dernier |
WO2002012895A1 (en) * | 2000-08-10 | 2002-02-14 | Biomerieux B.V. | Moving droplet diagnostic assay |
US6777198B2 (en) | 2000-10-11 | 2004-08-17 | Pharmacia Diagnostics Ab | Assay method and kit therefor |
ES2545526T3 (es) * | 2001-02-01 | 2015-09-11 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Matrices de afinidad mejorada con visibilidad mejorada para aplicaciones de arrastre molecular e inmunoprecipitación |
US7291477B2 (en) | 2001-07-03 | 2007-11-06 | Xenotope Diagnostics, Inc. | Method and device for trichomonas detection |
AU2002324846B2 (en) | 2001-08-31 | 2007-05-10 | Childrens Hospital Medical Center | Phosphodiesterase activity and regulation of phosphodiesterase 1-B-mediated signaling in brain |
US6855561B2 (en) * | 2001-09-10 | 2005-02-15 | Quidel Corporation | Method for adding an apparent non-signal line to a lateral flow assay |
US6867005B2 (en) | 2001-10-24 | 2005-03-15 | Beckman Coulter, Inc. | Method and apparatus for increasing the dynamic range and accuracy of binding assays |
AU2003206397B2 (en) | 2002-01-04 | 2008-07-17 | The Rockefeller University | Compositions and methods for prevention and treatment of amyloid-beta peptide-related disorders |
JP2004069677A (ja) * | 2002-06-13 | 2004-03-04 | Canon Inc | 免疫学的測定方法、免疫学的測定用試薬及びその製造方法 |
SI1535068T1 (sl) | 2002-08-13 | 2010-07-30 | N Dia Inc | Naprave in postopki za odkrivanje amnijske tekočine v vaginalnih izločkih |
ES2525318T3 (es) * | 2002-10-11 | 2014-12-22 | Zbx Corporation | Dispositivos de diagnóstico |
US6900058B2 (en) * | 2003-03-11 | 2005-05-31 | Bionostics, Inc. | Control solution for photometric analysis |
EP1664781B1 (en) | 2003-09-22 | 2013-05-08 | Quidel Corporation | Devices for the detection of multiple analytes in a sample |
US20050148005A1 (en) * | 2003-12-12 | 2005-07-07 | Pasha Emadi-Konjin | Dye solubilization binding assay |
US7150995B2 (en) * | 2004-01-16 | 2006-12-19 | Metrika, Inc. | Methods and systems for point of care bodily fluid analysis |
US20050255533A1 (en) * | 2004-02-10 | 2005-11-17 | Brendan Bioscience, Llc | Comprehensive food allergy test |
US20050227370A1 (en) * | 2004-03-08 | 2005-10-13 | Ramel Urs A | Body fluid analyte meter & cartridge system for performing combined general chemical and specific binding assays |
WO2005095967A1 (en) * | 2004-03-23 | 2005-10-13 | Quidel Corporation | Hybrid phase lateral flow assay |
FR2870139B1 (fr) * | 2004-05-14 | 2006-07-07 | Luc Doublet | Moyens pour la coloration de supports |
US20060040258A1 (en) * | 2004-08-23 | 2006-02-23 | Huiyan Guo | Water-soluble conjugates and methods of preparation |
EP2309269B1 (en) | 2004-09-08 | 2016-10-26 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Compositions and methods for the detection of HIV-1/HIV-2 infection. |
US7709208B2 (en) * | 2004-11-08 | 2010-05-04 | New York University | Methods for diagnosis of major depressive disorder |
CN102605067A (zh) | 2004-12-08 | 2012-07-25 | 安万特药物公司 | 测量对多西他赛抗药性或敏感性的方法 |
US7387890B2 (en) * | 2004-12-16 | 2008-06-17 | Chembio Diagnostic Systems, Inc. | Immunoassay devices and use thereof |
US7189522B2 (en) | 2005-03-11 | 2007-03-13 | Chembio Diagnostic Systems, Inc. | Dual path immunoassay device |
WO2006098804A2 (en) | 2005-03-11 | 2006-09-21 | Chembio Diagnostic Systems, Inc. | Dual path immunoassay device |
US20060205090A1 (en) * | 2005-03-14 | 2006-09-14 | Newton Michael W | Water-soluble conjugates for electrochemical detection |
BRPI0618713B8 (pt) | 2005-11-18 | 2021-07-27 | The Government Of The United State Of America Representado Por The Secretary Of The Dept Of Health A | cardiolipina modificada e seus usos |
US7763453B2 (en) | 2005-11-30 | 2010-07-27 | Micronics, Inc. | Microfluidic mixing and analytic apparatus |
US9056291B2 (en) | 2005-11-30 | 2015-06-16 | Micronics, Inc. | Microfluidic reactor system |
US20090053694A1 (en) * | 2005-12-26 | 2009-02-26 | Kriksunov Leo B | Photochemically Amplified Bioassay |
US7794656B2 (en) * | 2006-01-23 | 2010-09-14 | Quidel Corporation | Device for handling and analysis of a biological sample |
US7871568B2 (en) * | 2006-01-23 | 2011-01-18 | Quidel Corporation | Rapid test apparatus |
AU2007265628B2 (en) * | 2006-06-23 | 2012-12-06 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Methods and devices for microfluidic point-of-care immunoassays |
US7569396B1 (en) | 2006-09-08 | 2009-08-04 | Purplecow Llc | Caffeine detection using internally referenced competitive assays |
US7919331B2 (en) * | 2006-12-21 | 2011-04-05 | Silver Lake Research Corporation | Chromatographic test strips for one or more analytes |
EP2716656B1 (en) | 2007-06-15 | 2016-10-12 | Xiamen University | Monoclonal antibodies binding to avian influenza virus subtype H5 haemagglutinin and uses thereof |
US20090196852A1 (en) * | 2008-02-04 | 2009-08-06 | Watkinson D Tobin | Compositions and methods for diagnosing and treating immune disorders |
DE102009010563A1 (de) | 2009-02-16 | 2010-08-26 | Matthias W. Engel | Vorrichtung zum Nachweis von Analyten in Körperflüssigkeiten |
ES2495367T3 (es) | 2009-04-29 | 2014-09-17 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Anticuerpos monoclonales de ERG |
WO2010132447A2 (en) | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Diabetomics, Llc | Methods for detecting pre-diabetes and diabetes using differential protein glycosylation |
US8980546B2 (en) | 2009-05-21 | 2015-03-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Method for the detection of HIV-1-specific antibodies utilizing a Vpu polypeptide |
KR101464418B1 (ko) * | 2009-11-17 | 2014-11-21 | 아사히 가세이 셍이 가부시키가이샤 | 유기 착색 미립자, 이것을 포함하는 진단약 키트 및 인비트로 진단 방법 |
US9132423B2 (en) | 2010-01-29 | 2015-09-15 | Micronics, Inc. | Sample-to-answer microfluidic cartridge |
WO2012012499A1 (en) | 2010-07-20 | 2012-01-26 | Nurx Pharmaceuticals, Inc. | Optical reader system |
WO2012012500A1 (en) | 2010-07-20 | 2012-01-26 | Nurx Pharmaceuticals, Inc. | Optical reader systems and lateral flow assays |
US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
US8486717B2 (en) | 2011-01-18 | 2013-07-16 | Symbolics, Llc | Lateral flow assays using two dimensional features |
US8703439B1 (en) | 2011-01-31 | 2014-04-22 | Linda Lester | Point of care iodine sensor |
US8603835B2 (en) | 2011-02-10 | 2013-12-10 | Chembio Diagnostic Systems, Inc. | Reduced step dual path immunoassay device and method |
EP2492279A1 (en) | 2011-02-25 | 2012-08-29 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Rapid immunogen selection method using lentiviral display |
EP2606897A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-26 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Methods and compositions for the treatment of diseases caused by enveloped viruses |
JP6190822B2 (ja) | 2012-01-09 | 2017-08-30 | マイクロニクス, インコーポレイテッド | マイクロ流体リアクタシステム |
EP3415919B1 (en) | 2012-02-07 | 2020-07-29 | Intuitive Biosciences Inc. | Mycobacterium tuberculosis specific peptides for detection of infection or immunization in non-human primates |
US9874556B2 (en) | 2012-07-18 | 2018-01-23 | Symbolics, Llc | Lateral flow assays using two dimensional features |
EP2698377A1 (en) | 2012-08-17 | 2014-02-19 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Enhanced rapid immunogen selection method for HIV gp120 variants |
WO2014100732A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Micronics, Inc. | Fluidic circuits and related manufacturing methods |
EP2935559B1 (en) | 2012-12-21 | 2020-09-16 | PerkinElmer Health Sciences, Inc. | Fluorescence detection system |
US10518262B2 (en) | 2012-12-21 | 2019-12-31 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Low elasticity films for microfluidic use |
US20140234987A1 (en) | 2013-01-02 | 2014-08-21 | N-Dia, Inc. | Methods for predicting time-to-delivery in pregnant women |
WO2014144292A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sanofi Pasteur Biologics , Llc | Antibodies against clostridium difficile toxins and methods of using the same |
US10087440B2 (en) | 2013-05-07 | 2018-10-02 | Micronics, Inc. | Device for preparation and analysis of nucleic acids |
JP6472788B2 (ja) | 2013-05-07 | 2019-02-20 | マイクロニクス, インコーポレイテッド | 粘土鉱物およびアルカリ性溶液を使用して核酸含有試料を調製するための方法 |
US10386377B2 (en) | 2013-05-07 | 2019-08-20 | Micronics, Inc. | Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching |
CN108051590B (zh) | 2013-09-13 | 2020-12-11 | Symbolics有限责任公司 | 运用二维试验和对照信号读出模式的侧向层析检测 |
CN106574223B (zh) | 2014-04-02 | 2019-11-01 | 生化诊断系统公司 | 利用俘获缀合物的免疫测定 |
WO2015168615A2 (en) | 2014-05-02 | 2015-11-05 | Uab Research Foundation | Methods and compositions for diagnosis and treatment of meningitis |
US20160116466A1 (en) | 2014-10-27 | 2016-04-28 | Chembio Diagnostic Systems, Inc. | Rapid Screening Assay for Qualitative Detection of Multiple Febrile Illnesses |
US20180011088A1 (en) | 2015-01-29 | 2018-01-11 | Neogen Corporation | Methods for Immuno Chromatographic Assay Desensitization |
EP3785799B1 (en) | 2015-08-06 | 2023-01-18 | Lia Diagnostics, Inc. | Manufacturing methods for water dispersible assays |
US10935555B2 (en) | 2016-12-22 | 2021-03-02 | Qiagen Sciences, Llc | Determining candidate for induction of labor |
US10656164B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-05-19 | Qiagen Sciences, Llc | Screening asymptomatic pregnant woman for preterm birth |
CA3050363A1 (en) | 2017-02-21 | 2018-08-30 | Medicortex Finland Oy | Non-invasive brain injury diagnostic device |
US20240011984A1 (en) | 2020-10-27 | 2024-01-11 | Merck Patent Gmbh | Proteins for the detection of schistosoma infection |
DE102020007953A1 (de) | 2020-12-29 | 2022-06-30 | Wasiliki Tsalastra-Greul | Verfahren zur Bestimmung des Kunststoffpartikelgehalts mit hydrophobem Farbstoff |
WO2023242155A1 (en) | 2022-06-14 | 2023-12-21 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Compositions and methods for the diagnosis of hiv infection |
NL2032668B1 (en) | 2022-08-02 | 2024-02-07 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means for detecting schistosoma infection |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3853987A (en) * | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
US4108972A (en) * | 1974-03-15 | 1978-08-22 | Dreyer William J | Immunological reagent employing radioactive and other tracers |
EP0007654A1 (en) * | 1978-07-13 | 1980-02-06 | Akzo N.V. | Process for the detection and/or determination of components of the reaction between a specific binding protein and the corresponding bindable substance in an aqueous test sample; freeze-dried reagent and test kit to be used in the process |
Family Cites Families (107)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3449488A (en) * | 1965-10-22 | 1969-06-10 | Bionetics Research Lab Inc | Immunology |
US3720760A (en) * | 1968-09-06 | 1973-03-13 | Pharmacia Ab | Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples |
US3641235A (en) * | 1968-11-01 | 1972-02-08 | Miles Lab | Immunological reagent and process for making same |
US4097586A (en) * | 1970-06-11 | 1978-06-27 | Biological Developments, Inc. | Immunochemical assay method |
US3789116A (en) * | 1970-12-09 | 1974-01-29 | Abbott Lab | Fluorescent labeled antibody reagent |
SE374686B (da) * | 1971-01-26 | 1975-03-17 | B O Heger | |
US3773625A (en) * | 1971-04-08 | 1973-11-20 | Us Army | Soluble antigen-antibody complexes |
US3900558A (en) * | 1971-06-23 | 1975-08-19 | Richardson Merrell Inc | Method of measuring histamine release from mast cells |
US3996344A (en) * | 1972-05-15 | 1976-12-07 | Biological Developments, Inc. | Phenethylamine antigenic conjugates, their preparation, antibodies and use |
US4211766A (en) * | 1972-07-10 | 1980-07-08 | Ab Bonnierforetagen | Cancer associated polypeptide antigen compositions |
US3941876A (en) * | 1973-04-25 | 1976-03-02 | Gte New Ventures Corporation | In vitro method for determining allergic hypersensitivity |
US4160019A (en) * | 1973-06-25 | 1979-07-03 | Bjorklund Knut B | Detection of cancer associated polypeptide antigen and preparation of antibodies thereto |
US4166105A (en) * | 1973-07-30 | 1979-08-28 | Block Engineering, Inc. | Dye tagged reagent |
US4161515A (en) * | 1973-10-02 | 1979-07-17 | Syva Company | Double receptor fluorescent immunoassay |
US3998943A (en) * | 1973-10-02 | 1976-12-21 | Syva Company | Double receptor fluorescent immunoassay |
US3997657A (en) * | 1973-10-15 | 1976-12-14 | American Cyanamid Company | Dry slide reagent employed in immunofluorescent test for detection of human antinuclear factor |
US3935074A (en) * | 1973-12-17 | 1976-01-27 | Syva Company | Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies |
GB1451669A (en) * | 1974-01-02 | 1976-10-06 | Radiochemical Centre Ltd | Protein staining |
US4011308A (en) * | 1974-01-04 | 1977-03-08 | General Electric Company | Method for surface immunological detection of biological particles by the use of tagged antibodies |
US4016250A (en) * | 1974-03-22 | 1977-04-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for testing for pregnancy |
US3939350A (en) * | 1974-04-29 | 1976-02-17 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation |
SE387746B (sv) * | 1974-05-29 | 1976-09-13 | Pharmacia Diagnostics Ab | Forfarande for visuellt pavisande av antikroppar i ett vattenhaltigt prov |
US3996345A (en) * | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4006360A (en) * | 1974-08-21 | 1977-02-01 | Block Engineering, Inc. | Method of discriminating between dyed particles and background fluorescence of the dye |
US3992516A (en) * | 1974-10-30 | 1976-11-16 | Sook Kyung Lim | Direct fluorescent antibody composition and method for P. Pneumocystis carinii |
US3951748A (en) * | 1974-11-11 | 1976-04-20 | Medical Products, Inc. | Sensitized matrix for detection of disease |
GB1533410A (en) | 1974-12-20 | 1978-11-22 | Block Engineering | Antigen detecting reagents |
US4169137A (en) * | 1974-12-20 | 1979-09-25 | Block Engineering, Inc. | Antigen detecting reagents |
SE388694B (sv) * | 1975-01-27 | 1976-10-11 | Kabi Ab | Sett att pavisa ett antigen exv i prov av kroppvetskor, med utnyttjande av till porost berarmaterial bundna eller adsorberande antikroppar |
US3992631A (en) * | 1975-02-27 | 1976-11-16 | International Diagnostic Technology, Inc. | Fluorometric system, method and test article |
US4056724A (en) * | 1975-02-27 | 1977-11-01 | International Diagnostic Technology | Fluorometric system, method and test article |
US4011219A (en) * | 1975-03-28 | 1977-03-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Phthalazine derivatives and salts thereof |
US4187075A (en) * | 1975-05-26 | 1980-02-05 | Noller Hans G | Method of analyzing biological, liquid specimens for antigens or antibodies |
US4018884A (en) * | 1975-06-26 | 1977-04-19 | Hoffmann-La Roche Inc. | Fluorogenic materials and labeling techniques |
US4058732A (en) * | 1975-06-30 | 1977-11-15 | Analytical Radiation Corporation | Method and apparatus for improved analytical fluorescent spectroscopy |
US4174384A (en) * | 1975-06-30 | 1979-11-13 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4181650A (en) * | 1975-08-25 | 1980-01-01 | Maier Charles L Jr | Procedure for the assay of pharmacologically immunologically and biochemically active compounds in biological fluids |
US4201763A (en) * | 1975-10-09 | 1980-05-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Solid phase immunofluorescent assay method |
US4036946A (en) * | 1975-10-20 | 1977-07-19 | Marcos Kleinerman | Immunofluorometric method for measuring minute quantities of antigens, antibodies and other substances |
US3999948A (en) * | 1975-11-03 | 1976-12-28 | International Diagnostic Technology | Diagnostic reagent holder and method |
CA1083508A (fr) * | 1975-11-13 | 1980-08-12 | Jacques Grange | Supports porteurs de chaines laterales, procedes d'obtention de ces supports, procedes de fixation de composes organiques comportant un residu glucidique sur lesdits supports, produits et reactifs resultant de ladite fixation chimique |
US4020151A (en) * | 1976-02-17 | 1977-04-26 | International Diagnostic Technology, Inc. | Method for quantitation of antigens or antibodies on a solid surface |
AR215459A1 (es) * | 1976-04-02 | 1979-10-15 | Brewer J | Metodo para producir un agente terapeutico capaz de proporcionar una marca en un animal no humano para indicar la administracion del agente al animal y para proporcionar tambien un repositorio del agente a ser libeberado durante un espacio de tiempo |
US4160818A (en) * | 1976-04-15 | 1979-07-10 | Technicon Instruments Corporation | Fluorimetric immunoassay for diphenylhydantoin |
US4067959A (en) * | 1976-05-10 | 1978-01-10 | International Diagnostic Technology, Inc. | Indirect solid surface test for antigens or antibodies |
US4025310A (en) * | 1976-05-28 | 1977-05-24 | International Diagnostic Technology, Inc. | Method for reading a wet fluorescent surface |
US4069352A (en) * | 1976-07-02 | 1978-01-17 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Immunoadsorbent polymeric material and method of making same |
GB1582956A (en) * | 1976-07-30 | 1981-01-21 | Ici Ltd | Composite magnetic particles |
GB1583869A (en) * | 1977-08-19 | 1981-02-04 | Technicon Instr | Competitive binding analysis by fluorescence |
JPS5344622A (en) * | 1976-09-30 | 1978-04-21 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
GB1572220A (en) * | 1976-10-07 | 1980-07-30 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunochemical process of measuring physiologically active substances |
US4098876A (en) * | 1976-10-26 | 1978-07-04 | Corning Glass Works | Reverse sandwich immunoassay |
US4203716A (en) * | 1976-11-24 | 1980-05-20 | Eastman Kodak Company | Photographic elements having hydrophilic colloid layers containing hydrophobic addenda uniformly loaded in latex polymer particles |
GB1566423A (en) | 1976-11-29 | 1980-04-30 | Block Engineering | Photometric system |
US4130462A (en) * | 1976-12-16 | 1978-12-19 | Syva Company | Receptor steric hindrance immunoassay for receptor determination |
IL51668A (en) * | 1977-03-16 | 1981-12-31 | Israel State | Analytical method for the quantitative determination of immunogens and antibodies and a kit therefor |
US4202815A (en) * | 1977-03-21 | 1980-05-13 | Rohner Ag Pratteln | Concentrated powder or granular formulations dispersable in aqueous media |
IT1079045B (it) * | 1977-05-16 | 1985-05-08 | Syva Co | Analisi imuunologica fluorescente a doppio ricettore |
US4115535A (en) * | 1977-06-22 | 1978-09-19 | General Electric Company | Diagnostic method employing a mixture of normally separable protein-coated particles |
DE2728922C3 (de) * | 1977-06-27 | 1982-02-25 | Dragoco Gerberding & Co Gmbh, 3450 Holzminden | Glycerintri-3,5,5-trimethylhexanoat |
US4208479A (en) * | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
US4152411A (en) * | 1977-07-27 | 1979-05-01 | Akzona Incorporated | High specific activity labeled substances |
US4197361A (en) * | 1977-08-23 | 1980-04-08 | Warner-Lambert | Fluorescent immunoassay sandwich technique for HBs Ag |
US4223002A (en) * | 1978-08-28 | 1980-09-16 | Hoffmann-La Roche Inc. | Isolation of alpha1 -fetoprotein |
US4294817A (en) * | 1977-11-25 | 1981-10-13 | International Diagnostic Technology, Inc. | Method of fluoro immunoassay |
US4194877A (en) * | 1977-11-28 | 1980-03-25 | United States Of America | Dye-containing polymer composition |
US4258130A (en) * | 1977-12-12 | 1981-03-24 | Hunt-Wesson Foods, Inc. | Method for detection of antigens |
US4231750A (en) * | 1977-12-13 | 1980-11-04 | Diagnostic Reagents, Inc. | Methods for performing chemical assays using fluorescence and photon counting |
US4283382A (en) * | 1977-12-28 | 1981-08-11 | Eastman Kodak Company | Fluorescent labels comprising rare earth chelates |
US4163779A (en) * | 1978-01-09 | 1979-08-07 | International Diagnostic Technology, Inc. | Test for quantitation of immunoglobulin and identification of abnormal immunoglobulin |
US4215102A (en) * | 1979-01-05 | 1980-07-29 | Lee Sin H | Cytochemical agents and methods for the detection of steroid hormone receptors in human tissues |
US4279992A (en) * | 1978-03-13 | 1981-07-21 | Miles Laboratories, Inc. | Specific binding assay employing an enzyme-cleavable substrate as label |
DE2812307A1 (de) * | 1978-03-21 | 1979-10-04 | Basf Ag | Zubereitungen von dispersionsfarbstoffen |
US4277437A (en) * | 1978-04-05 | 1981-07-07 | Syva Company | Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay |
US4220450A (en) * | 1978-04-05 | 1980-09-02 | Syva Company | Chemically induced fluorescence immunoassay |
US4193983A (en) * | 1978-05-16 | 1980-03-18 | Syva Company | Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith |
US4235869A (en) * | 1978-05-16 | 1980-11-25 | Syva Company | Assay employing a labeled Fab-fragment ligand complex |
US4234563A (en) * | 1978-06-02 | 1980-11-18 | American Hospital Supply Corporation | Insolubilized deoxyribonucleic acid (DNA) |
US4222743A (en) * | 1978-07-20 | 1980-09-16 | Wang Wei Kung | Method and apparatus for detecting biological particles by fluorescent stain |
US4297273A (en) * | 1978-07-24 | 1981-10-27 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent phthalhydrazide-labeled protein and polypeptide conjugates |
US4225783A (en) * | 1978-07-24 | 1980-09-30 | Abbott Laboratories | Determination of microbial cells in aqueous samples |
US4225485A (en) * | 1978-07-24 | 1980-09-30 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazide-labeled polypeptides and proteins |
US4238395A (en) * | 1978-07-24 | 1980-12-09 | Miles Laboratories, Inc. | Dimethyl 7-[ω-N-(phthalimido)alkyl]aminonaphthalene-1,2-dicarboxylates |
US4207075A (en) * | 1978-08-08 | 1980-06-10 | Liburdy Robert P | Rabbit immunoglobulin-N-(3-pyrene)-maleimide conjugate for fluorescent immunoassay |
US4302536A (en) * | 1978-08-15 | 1981-11-24 | Longenecker Robert W | Colorimetric immunoassay process |
DE2836362A1 (de) * | 1978-08-19 | 1980-03-06 | Behringwerke Ag | Diagnostisches mittel |
US4222744A (en) * | 1978-09-27 | 1980-09-16 | Becton Dickinson & Company | Assay for ligands |
US4259313A (en) * | 1978-10-18 | 1981-03-31 | Eastman Kodak Company | Fluorescent labels |
FR2440555A1 (fr) * | 1978-10-31 | 1980-05-30 | Maes Roland | Perfectionnements aux procedes de determination de substances montrant entre elles des affinites de liaison specifiques, par des tests faisant intervenir une phase solide |
US4318707A (en) * | 1978-11-24 | 1982-03-09 | Syva Company | Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays |
US4238195A (en) * | 1979-01-18 | 1980-12-09 | Miles Laboratories, Inc. | Fluorescer-labeled specific binding assays |
US4278653A (en) * | 1979-02-01 | 1981-07-14 | New England Nuclear Corporation | Methods and kits for double antibody immunoassay providing a colored pellet for easy visualization |
JPS55116259A (en) * | 1979-03-01 | 1980-09-06 | Fuji Photo Film Co Ltd | Microimmunoassay method |
JPS55116258A (en) * | 1979-03-01 | 1980-09-06 | Fuji Photo Film Co Ltd | Microimmunoassay method |
US4256834A (en) * | 1979-04-09 | 1981-03-17 | Syva Company | Fluorescent scavenger particle immunoassay |
US4261968A (en) * | 1979-05-10 | 1981-04-14 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4252783A (en) * | 1979-06-18 | 1981-02-24 | Syva Company | Reducing fluorescent background in fluorescent immunoassays |
US4284412A (en) * | 1979-07-13 | 1981-08-18 | Ortho Diagnostics, Inc. | Method and apparatus for automated identification and enumeration of specified blood cell subclasses |
US4248854A (en) * | 1979-08-27 | 1981-02-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Production of antibody toward asbestos and immunoassay therewith |
US4272506A (en) * | 1979-08-31 | 1981-06-09 | Syva Company | Purification of reagents by disulfide immobilization |
US4318846A (en) * | 1979-09-07 | 1982-03-09 | Syva Company | Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers |
US4254219A (en) * | 1979-09-21 | 1981-03-03 | Merck & Co., Inc. | Process for recording data in the leucocyte migration inhibition assay |
US4254096A (en) * | 1979-10-04 | 1981-03-03 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Reagent combination for solid phase immunofluorescent assay |
US4251514A (en) * | 1979-11-05 | 1981-02-17 | American Hospital Supply Corporation | Insolubilized deoxyribonucleic acid (DNA) |
US4254097A (en) * | 1979-11-05 | 1981-03-03 | American Hospital Supply Corporation | Method of detecting antibodies to human thyroglobulin |
US4314026A (en) * | 1980-03-31 | 1982-02-02 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Process for determining the complement-dependent cytotoxicity mediated by anti-HLA antibodies by means of ATP determination and device for ATP determination |
US4323647A (en) * | 1980-10-15 | 1982-04-06 | University Of Miami | Steric hindrance enzyme immunoassay |
-
1980
- 1980-01-11 NL NL8000173A patent/NL8000173A/nl not_active Application Discontinuation
- 1980-12-29 AT AT80201241T patent/ATE13098T1/de active
- 1980-12-29 DE DE8080201241T patent/DE3070604D1/de not_active Expired
- 1980-12-29 EP EP80201241A patent/EP0032270B1/en not_active Expired
-
1981
- 1981-01-02 IE IE2/81A patent/IE50655B1/en not_active IP Right Cessation
- 1981-01-02 US US06/222,263 patent/US4373932A/en not_active Expired - Lifetime
- 1981-01-06 IL IL61864A patent/IL61864A/xx unknown
- 1981-01-06 ZA ZA00810074A patent/ZA8174B/xx unknown
- 1981-01-07 DK DK004681A patent/DK155968C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-01-08 JP JP160781A patent/JPS56160655A/ja active Granted
- 1981-01-08 PT PT72329A patent/PT72329B/pt unknown
- 1981-01-09 MX MX185494A patent/MX161039A/es unknown
- 1981-01-09 GR GR63833A patent/GR73163B/el unknown
- 1981-01-09 AU AU66111/81A patent/AU534775B2/en not_active Expired
- 1981-01-09 FI FI810054A patent/FI74820C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-01-09 ES ES498430A patent/ES498430A0/es active Granted
- 1981-01-09 HU HU8154A patent/HU183283B/hu unknown
- 1981-01-12 CA CA000368406A patent/CA1143654A/en not_active Expired
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3853987A (en) * | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
US4108972A (en) * | 1974-03-15 | 1978-08-22 | Dreyer William J | Immunological reagent employing radioactive and other tracers |
EP0007654A1 (en) * | 1978-07-13 | 1980-02-06 | Akzo N.V. | Process for the detection and/or determination of components of the reaction between a specific binding protein and the corresponding bindable substance in an aqueous test sample; freeze-dried reagent and test kit to be used in the process |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL61864A0 (en) | 1981-02-27 |
EP0032270B1 (en) | 1985-05-02 |
IE50655B1 (en) | 1986-06-11 |
JPH0322586B2 (da) | 1991-03-27 |
HU183283B (en) | 1984-04-28 |
ATE13098T1 (de) | 1985-05-15 |
IL61864A (en) | 1984-09-30 |
US4373932A (en) | 1983-02-15 |
MX161039A (es) | 1990-07-13 |
NL8000173A (nl) | 1981-08-03 |
ES8204175A1 (es) | 1982-04-16 |
FI810054L (fi) | 1981-07-12 |
PT72329B (en) | 1981-12-18 |
PT72329A (en) | 1981-02-01 |
DE3070604D1 (en) | 1985-06-05 |
DK4681A (da) | 1981-07-12 |
FI74820B (fi) | 1987-11-30 |
DK155968C (da) | 1989-10-16 |
ES498430A0 (es) | 1982-04-16 |
AU534775B2 (en) | 1984-02-16 |
EP0032270A1 (en) | 1981-07-22 |
FI74820C (fi) | 1988-03-10 |
ZA8174B (en) | 1982-01-27 |
JPS56160655A (en) | 1981-12-10 |
IE810002L (en) | 1981-07-11 |
AU6611181A (en) | 1981-07-16 |
CA1143654A (en) | 1983-03-29 |
GR73163B (da) | 1984-02-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK155968B (da) | Fremgangsmaade til kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse af en immunokemisk reaktiv komponent i et vandigt proevemedium | |
US4313734A (en) | Metal sol particle immunoassay | |
EP0106685B1 (en) | Fluorescence screening for blood typing | |
AU768736B2 (en) | Methods for simultaneously detecting both members of a binding pair | |
Gribnau et al. | Particle-labelled immunoassays: a review | |
EP0724156A1 (en) | Kit for immunologically assaying biological substance and assay process | |
US4320194A (en) | Process for the production of carrier particles from yeast cells and for producing diagnostic agents therefrom and test kits containing such agents | |
EP0516529A2 (en) | Assay of specific antibody | |
CN114778819A (zh) | 一种多模式聚集诱导荧光免疫层析试纸及其制备方法 | |
JPH05223820A (ja) | 抽出組成物として界面活性剤混合物を使用する歯周病に随伴する微生物検出用キットおよびその検出方法 | |
JP2833624B2 (ja) | 診断試薬用ラテックス | |
JPH08262024A (ja) | 生体内物質の免疫測定用キットおよび免疫測定方法 | |
CN113125715B (zh) | 一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒及其应用 | |
CN113125711B (zh) | 一种受体试剂及其应用 | |
CN112114131A (zh) | 一种均相化学发光检测方法及其应用 | |
CN112114130A (zh) | 一种用于均相化学发光检测的受体试剂及其应用 | |
CN113125703B (zh) | 一种肌红蛋白的均相检测试剂盒及其应用 | |
CN113125714A (zh) | 一种人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒及其应用 | |
CN113504365A (zh) | 一种彩色乳胶颗粒、复合物、免疫层析试纸及其制备方法 | |
CN116859057A (zh) | 一种肌红蛋白的均相检测试剂盒及其应用 | |
JPH01152366A (ja) | 免疫学的診断用試薬 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |