FI72981C

FI72981C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara polypeptider.

Info

Publication number: FI72981C
Application number: FI803634A
Authority: FI
Inventors: Janos Pless; Wilfried Bauer
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1979-11-27
Filing date: 1980-11-21
Publication date: 1987-08-10
Also published as: AU6468880A; CA1182109A; DE3062075D1; ES8301463A1; AU543198B2; CS228140B2; DK150146C; ES8305701A1; JPS6351159B2; JPS5690048A; IL61561A0; IE802452L; LU88344I2; NL930137I2; NL930137I1; ATE2512T1; ES510751A0; FI803634L; HU185920B; HK30686A

Description

1 72981

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten polypeptidien valmistamiseksi

Keksintö koskee uusia polypeptidejä, menetelmiä 5 niiden valmistamiseksi, mainittuja polypeptidejä sisältäviä farmaseuttisia seoksia ja niiden käyttöä farmaseuttisesti vaikuttavia aineina.

Erikoisesti keksinnön kohteena on menetelmä kaavan (I) mukaisen terapeuttisesti käyttökelpoisen polypeptidin 10 ja sen suolojen valmistamiseksi, CH.-S-Y, Y.-S-CH.

I 2 1 2 | 2 A-NH-CH-CO-B-DTrp-Lys-Thr-NH-CH-F (I) 1 2 3 4 5 6 15 jossa A on kaavan RCO- mukainen ryhmä, jossa i) R on C7_^0-fenyylialkyyli, tai ii) RCO- on L- tai D-fenyylialaniinijäännös, joka on mahdollisesti monosubstituoitu renkaassa halogeenilla ja ami- 20 nohappojäännöksen οί-aminoryhmä on mahdollisesti monomety-loitu, B on -Phe-, joka on mahdollisesti monosubstituoitu renkaassa halogeenilla, F on kaavan CONHR^ mukainen ryhmä, jossa R^ on vety tai kaa-25 van -CH(R2>-X mukainen ryhmä, R2 on vety, -(Cl^^-OH tai (CH^^-OH tai edustaa luonnon -aminohapon ot-hiil iatomiin kiinnittyvää substituenttia, ja X on kaavan -CH^OH tai -C0NH2 mukainen ryhmä, jolloin ryhmällä -CH(R2)-X on D-tai L-konfiguraatio, ja Y.^ ja Y2 ovat kukin vetyjä tai yh-30 dessä muodostavat suoran sidoksen, jolloin 1- ja 6-asemassa olevilla jäännöksillä toisistaan riippumatta on L- tai D-konf iguraatio, edellyttäen, että D- ja/tai L-kysteiinijäännökset voivat olla ainoastaan 1- ja 6-asemissa.

35 Tässä patenttiselityksessä ja patenttivaatimuksis sa kauttaaltaan "halogeenilla" tarkoitetaan fluoria, klooria ja bromia.

2 72981

Kaavan I mukaisissa polypeptideissä ensisijaisia ovat seuraavat merkitykset tai yhdistelmät: 1.1. Kun RCO:lla on merkitys ii), aminohappotähteen :Y-aminoryhmä on edullisesti alkyloimaton.

5 1.2. Kun RCOrlla on kohdan ii) mukainen merkitys, tämä on edullisesti D-fenyylialaniini- tai D-(N-metyyli)-fenyylialaniinitähde.

1.3. Ensisijaisimmin RCO:11a on kohdan 1.2. mukainen merkitys.

10 2. B on -Phe-. ^ 3. F on ryhmä, jonka kaava on -CO-Ν'”" x ch(r2)-x jolloin ryhmä -CH(R2)-X omaa edullisesti L-konfiguraation.

3.1. Luonnon aminohapon (s.o. jonka kaava on 15 H2N-CH(R2)-C00H) rt-hiiliatomiin liittyneenä substituent-tina R2 on edullisesti -CH20H, -CH(CH2)-0H, isobutyyli tai bentsyyli, tai R2 on (CH2>2OH tai (CH^^OH. Erityisesti se on -CH20H tai -CH(CH3)0H.

3.2. X on edullisesti ryhmä, jonka kaava on -CH20H.

20 4.1- ja 6-asemissa olevat tähteet omaavat edulli sesti L-konfiguraation.

5. ja Y2 vastaavat yhdessä edullisesti suoraa sidosta.

Keksinnön mukaiset polypeptidit voivat olla suolan 25 muodossa tai komplekseinaan. Happoadditiosuoloja voidaan muodostaa esim. orgaanisten happojen, polymeeri-happojen ja epäorgaanisten happojen kanssa. Sellaisia happoadditio-suolamuotoja ovat esim. hydrokloridit ja asetaatit. Kirjallisuudesta tunnetaan somatostatiinijohdannaisia, jot- 30 ka rakenteeltaan poikkeavat esillä olevan keksinnön mukaisista yhdisteistä. Esim. EP-patenttijulkaisussa 2 262 on kuvattu O-aminohappoja sisältäviä bisyklisiä yhdisteitä ja US-patenttijulkaisussa 4 105 603 on kuvattu somatostatii-neja, jotka sisältävät ainakin 6 aminohappoa Cys-jäännösten 35 välissä.

Keksintö koskee myös menetelmää kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi. Näitä yhdisteitä voidaan 3 72981 valmistaa peptidikemian alalla tunnetuin menetelmin tai kemiallisesti näitä ilmeisesti vastaavin menetelmin, esimerkiksi seuraavilla menetelmillä: a) suojaryhmä tai suojaryhmät poistetaan suojatus-5 ta suoraketjuisesta tai monosyklisestä kaavan (I) mukaisesta polypeptidistä, jossa ainakin yksi funktionaalinen ryhmä on suojattu, b) amidisidoksen avulla liitetään yhteen kaksi pep-tidiyksikköä, joissa kummassakin on ainakin yksi aminohap- 10 po- tai aminoalkoholi-tähde, peptidi-yksiköiden ollessa sellaiset, että muodostuu kaavan (I) mukainen suoraketjui-nen tai monosyklinen polypeptidi, c) suoraketjuinen kaavan (I) mukainen polypeptidi hapetetaan, jolloin saadaan kaavan (I) mukainen monosykli- 15 nen polypeptidi, ja haluttaessa näin saatu polypeptidi muutetaan suolan muotoon .

Edellä esitetty menetelmä voidaan suorittaa esimerkiksi samalla tavalla kuin menetelmät, joita on selostettu 20 seuraavissa esimerkeissä. Mikäli lähtöaineiden valmistusta ei ole selostettu erikseen, yhdisteet ovat tunnettuja tai niitä voidaan valmistaa ja puhdistaa alan tunnetuin menetelmin.

Keksinnön mukaisilla polypeptideillä samoin kuin 25 niiden farmaseuttisesti hyväksyttävillä suoloilla ja komplekseilla on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia kuten eläinkokein on osoitettu. Erityisesti niillä on GH-eritystä ehkäisevä vaikutus, jota osoittaa esim. verihe-ran GH-tason aleneminen rotilla.

30 Tämä koe suoritetaan käyttämällä urosrottia

Nembutal’ilia nukutettuina. Koeainetta annetaan erilaisin logaritmisesti porrastetuin annoksin käyttämällä annosta kohden ainakin 4 rottaa. 15 minuutin kuluttua koeyhdisteen annosta rotilta katkaistaan kaula, veri koo-35 taan talteen ja veriheran GH-taso määritetään radio-im-muuni-määrityksen avulla.

Tämän mukaisesti mainittuja polypeptidejä, niiden suoloja ja komplekseja esitetään käytettäväksi sairauk- ----- 1. ____ " 72981 sien hoitoon, joihin liittyy ylisuuri GH-eritys, esim. hoidettaessa sokeritautia ja verisuonitautia samoin kuin j ättikärkisyyttä.

Mainitut polypeptidit, niiden suolat ja kompleksit 5 ehkäisevät myös mahahapon eritystä ja haiman eritystä kuten on osoitettu standardieläinkokein, esim. menetelmän mukaisesti, jonka ovat kuvanneet Kouturek ym. artikkelissa Scand. J. Gastroent. 6, 423 (1971) haiman erityksen osalta, ja seuraavan menetelmän mukaisesti mahahapon erityksen 10 määrityksen osalta:

Urosrottia (220-280 g) pidetään laboratoriossa erillisissä häkeissä useita päivän (14 tuntia valossa/päivä) paastossa 48 tuntia (veden saannin ollessa rajoittamatonta) välittömästi ennen koetta. Koetta aloitettaessa mahanport-15 ti sidotaan eetteri-nukutuksen alaisena ja mahahapon erityksen stimuloimiseksi injektoidaan ihonalaisesti 100 pg/kg pentagastriinia. Koeyhdisteet injektoidaan samanaikaisesti lääkkeen kanssa. 30 minuutin kuluttua eläimet tapetaan, mitataan mahanesteen tilavuus ja arvioidaan happokonsentraa-20 tio (titraus tymolisinisellä). Lasketaan happotuotto ja arvioidaan prosentuaalinen estyminen suhteessa käsittelemättömiin kontrolleihin.

Mainittuja polypeptidejä ja niiden suoloja esitetään täten edelleen käytettäviksi maha-suoli-seudun sairauksien 25 hoitoon, esimerkiksi hoidettaessa mahahaavaa, maha-suoli-verenvuotoa ja akuuttia haimatulehdusta.

Edellä mainittuihin käyttötarkoituksiin esitettävä päivittäinen annos on noin 0,002, esim. noin 0,07 - noin 20 mg polvpeptidiä, annettuna sopivammin jaettuina annok-30 sinä 2-4 kertaa päivän aikana annosyksikön muodossa tai jatkuvasti vapautuvassa muodossa. Sopivat annosyksikkömuo-dot sisältävät noin 0,0005, esim. noin 0,02 - noin 10 mg keksinnön mukaista polypeptidiä tai ekvivalenttimäärän sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa tai kompleksia, kiin-35 teän tai nestemäisen farmaseuttisen laimentimen tai kantajan yhteydessä.

Seuraavissa esimerkeissä kaikki lämpötilat on il-moitettu Celsius-asteina ja ö*-J-arvot ovat korjaamattomia. Niissä on käytetty seuraavia lyhennyksiä: 5 72981

Ac OH = etikkahappo

Asp-diol = asparagiini-dioli-tähde NH-

HO-CH0-CH~-CH

/2

5 ^CH20H

Boc = tert.-butoksikarbonyyli BTFA = boori-tris-trifluoriasetaatti DCCI = disykloheksyylikarbodi-imidi DMF = N,N-dimetyyliformamidi 10 HOBT = N-hydroksibentsotriatsoli

Hy = -NHNH2

Leu-ol = leusinoli-tähde NH-

CH3-CH(CH3)-CH2-CH

15 CH20H

MBzl = p-metoksibentsyyli

Me = metyyli

MeOH = metanoli

MePhe = -(N-metyyli)-Phe- 20 NE±3 = trietyyliamiini ONP = 4-nitrofenoksi

Phe(pF) = -p-F-Phe-

Phe-ol = fenyylialaninoli-tähde ^ NH- 25 <^CH2-CH/

^CH20H

Ser-ol = serinoli-tähde -NH-CH(CH2OH)2 TFA = trifluorietikkahappo THF = tetrahydrofuraani 30 Thr-ol = treoninoli-tähde ^ NH- CH3-CH(0H)-CH^

V^CH20H

Z = bentsyylioksikarbonyyli 6 72981 I-\

Esimerkki IA: H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-oli 0,70 g Boc-(D)Phe-Cys(MBzl)-Phe-(D)Trp-Lys-(Boc)-Thr-Cys-(MBzD-Thr-olia ja 6,0 ml tioanisolia liuotetaan 0°:ssa 9 ml:aan TFA:a. Liuos jäähdyte-5 tään -10°:seen ja lisätään sekoittaen 12 ml noin 2-mol. BTFA:n TFA-liuosta. Sekoittamista jatketaan 1 1/2 tuntia -5° - -10°:ssa ja lisätään 50 ml kylmää vedetöntä meta-nolia (-70°). Edelleen 5 minuutin kuluttua lisätään sekoittaen 1 litra vedetöntä eetteriä ja 5 ml noin 5-norm.

10 HCl:n eetteriliuosta. Saostunut tuote suodatetaan erilleen, pestään nopeasti eetterillä ja jäännös liuotetaan heti 2,5 litraan dioksaani/H^0-seosta (7:3). pH säädetään arvoon 7-7,5 lisäämällä laimeata ammoniakki-liuosta. Seosta sekoitetaan avoimessa astiassa huoneen 15 lämpötilassa kunnes se todetaan -SH-ryhmien suhteen negatiiviseksi (esim. Ellmann-koe). pH säädetään välille 3-4 lisäämällä HCl:a ja saatu liuos konsentroidaan vakuumissa, ja tuote kylmäkuivataan. Kylmäkuivattu tuote liuotetaan pieneen määrään 10 %:ista etikkahappoa 20 ja puhdistetaan geeli-kromatografiaa (Bio-Rad P4) käyttäen ja käyttämällä 10 %:ista etikkahappoa. Haluttua tuotetta sisältävät fraktiot kootaan yhteen ja kylmä-kuivataan, jolloin saadaan otsikon yhdistettä: - -42° (c = 0,5 95-%:ssa etikkahapossa).

25 Lähtöainetta voidaan saada seuraavasti: a) Z-Lys(Boc)-Thr-OMe 13,5 ml kloorimuurahaishappo-isobutyyli-esteriä lisätään sekoittaen liuokseen, jossa on 56 g disykloheksyyliamiinisuolan muodossa olevaa yhdistettä 30 Z-Lys(Boc)-0H liuotettuna 1200 ml:aan THF:a, joka on esijäähdytetty -20°:seen. Sekoittamista jatketaan edelleen 20 minuuttia -15°C:ssa ja sitten lisätään kylmä liuos (-21°), jossa on 21 g yhdistettä HCl.H-Thr-OMe 600 ml:ssa THF:a. -15°C:ssa lisätään tiputtamalla 17 ml 35 trietyyliamiinia, reaktioseosta sekoitetaan 18 tuntia 0°:ssa ja tuote konsentroidaan väkeväksi seokseksi 72981 vakuumissa. Laimentaminen suoritetaan eetteri/etyyliasetaatti-seoksella (1:1) ja saostunut disykloheksyyli-amiinisuola suodatetaan erilleen. Suodos pestään ^0:11a, 2-norm. sitruunahapolla, 10 %:isella KHCO^illa ja 5 ^O^la. Orgaaninen faasi kuivataan Na2S0^:lla ja haihdutetaan kuiviin, jolloin saadaan otsikon yhdistettä hartsina: - -14° (c=l DMF:ssa).

b) Z-Phe-(D)-Trp-OH

9,0 g yhdistettä Z-Phe-OH jäähdytetään 150 ml:ssa 10 asetonitriiliä -18°:een ja lisätään 3,4 ml N-metyyli- morfoliinia ja sen jälkeen 4,1 ml kloorimuurahaishappo-isobutyyliesteriä. Liuosta sekoitetaan 15 minuuttia -15°:ssa ja lisätään kylmä liuos, jossa on 6,2 g yhdistettä H-(D)Trp-0H 30 ml:ssa 1-norm. Na0K:a ja 100 ml 15 asetonitriiliä, ja sekoittamista jatketaan edelleen 18 tuntia -5° - 0°:ssa. Reaktioseos konsentroidaan vakuumissa, laimennetaan vedellä ja uutetaan 5 kertaa pienellä eetterimäärällä. Vesifaasin pH säädetään noin arvoon 2 lisäämällä 4-norm. HjSO^ia ja sakka uutetaan eetteri/-20 etikkahappo-seoksella. Orgaaninen faasi pestään vedellä ja kuivataan Na2S0^:lla. Vakuumissa suoritetun haihduttamisen jälkeen jäännös kiteytetään eetteri/petroli-eetteri-seoksesta, jolloin saadaan otsikon yhdistettä: sp. 113°, = -5° (c = 0,9 DMF:ssa).

25 c) Z-Phe-(D)Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe

Seosta, jossa on 6,0 g yhdistettä Z-Lys(Boc)-Thr-OMe 150 ml:ssa metanolia, hydrataan Pd/C:n läsnäollessa. Tuote suodatetaan erilleen, pestään metanolilla ja suodos haihdutetaan kuiviin vakuu-30 missä. Jäännös liuotetaan 4,8 gramman kanssa yhdistettä Z-Phe-(D)Trp-0H ja 2,0 g:n kanssa H0BT:tä 50 ml:aan DMF:a. Liuos jäähdytetään -15°:seen ja sekoittaen lisätään liuos, jossa on 2,1 g DCCI:tä 15 ml:ssa DMF:a. Liuosta sekoitetaan edelleen 2 päivää 0°:ssa, haihdute- 8 72981 taan kuiviin vakuumissa, laimennetaan etikkahappo/eetteri-seoksella (1:1) ja saostunut disykloheksyyliurea suodatetaan erilleen. Suodos pestään 2-norm. sitruuna-hapolla, 10 %:sella KHCOg-.lla ja HjO'.lla. Orgaaninen 5 faasi kuivataan Na2S01+:lla ja haihdutetaan kuiviin.

Jäännös kromatografioidaan silikageelillä käyttämällä eluenttina C^C^/metanoli-seosta. Haluttua tuotetta sisältävät fraktiot kootaan yhteen ja haihdutetaan kuiviin vakuumissa, jolloin saadaan otsikon yhdistettä: 10 = -7° (c = 0,9 DMF: ssa) .

d) H-Phe~(D)Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe

Seosta, jossa on 1,2 g yhdistettä Z-Phe-(D)Trp-

Lys(Boc)-Thr-OMe 50 .ulissa metanolia, hydrataan 10 %:sen

Pd/C:n läsnäollessa ja liuos suodatetaan ja haihdute- 15 taan kuiviin vakuumissa, jolloin saadaan otsikon yhdis- 2 0 tettä vaahtomaisena aineena: = "18° (c = 1 me- tanolissa).

e) Boc-(D)Phe-Cys(MBzl)-OH

-20°:seen esijäähdytettyyn seokseen, jossa on 20 16 g yhdistettä Boc-(D)Phe-0H 300 ulissa THF:a, lisä tään 8,4 ml trietyyliamiinia ja sen jälkeen 8,3 ml kloo-rimuurahaishappo-isobutyyliesteriä. Saatua seosta sekoitetaan 10 minuuttia -15°:ssa ja sen jälkeen lisätään tiputtamalla kylmä liuos, jossa on yhdistettä 25 H-Cys-(MBzl)-0H ja 11,5 ml trietyyliamiinia 400 mlissa THF/H20-seosta (5:1). Reaktioseosta sekoitetaan noin 2 päivää 0°:ssa, konsentroidaan vakuumissa, laimennetaan 1,3 litralla H20:ta ja uutetaan eetterillä. Vesi-faasin pH säädetään arvoon 2,0 lisäämällä 4-norm.

30 ^SO^a ja sakka uutetaan etyyliasetaatilla. Etyyliasetaatti-uute pestään vedellä, kuivataan ^280^:11a ja haihdutetaan kuiviin vakuumissa. Jäännös puhdistetaan kromatografioimalla silikageelillä käyttämällä eluenttina seosta eetteri/1 % etikkahappoa. Haluttua 35 tuotetta sisältävät fraktiot yhdistetään ja haihdute- 9 72981 taan kuiviin vakuumissa, jolloin saadaan otsikon yhdistettä: ~ _1^° *-c = 1»1 DMFrssa).

f) Boc-(D)Phe-Cys(MBz1)-Phe-(D)Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe 5 0,30 g DCCIrtä lisätään sekoittaen -20°:seen esijäähdy- tettyyn liuokseen, jossa on 0,67 g yhdistettä Boc-(D)-Phe-Cys(MBzl)-OH, 1,0 g yhdistettä Η-Phe-(D)Trp-Lys-(Boc)-Thr-OMe ja 0,5 g H0BT:tä liuotettuna 30 ml:aan DMF:a. Reaktioseosta sekoitetaan noin 12 tuntia -5° -10 0°:ssa ja noin 4 tuntia huoneen lämpötilassa. Saostunut disykloheksyyliurea suodatetaan erilleen ja suodos pestään 2-norm. sitruunahapolla, 10 %:isella KHCO^illa ja HjOilla. Orgaaninen faasi kuivataan Na2S04:lla, puhdistetaan ja konsentroidaan. Tuote saostetaan lisää-15 mällä eetteriä, suodatetaan ja kuivataan, jolloin saadaan otsikon yhdistettä: sp. 160°, (*yD° - -3o° (c = 1 metanolissa).

g) Boc-(D)Phe-Cys(MBzl)-Phe-(D)Trp-Lys(Boc)-Thr-NHNH2 20 1,5 ml hydratsiinihydraattia lisätään liuokseen, jos sa on 0,9 g yhdistettä Boc-(D)Phe-Cys-(MBzl)-Phe-(D)-Lys(Boc)-Thr-OMe liuotettuna 15 ml:aan DMF:a. Liuoksen annetaan olla paikoillaan 5 tuntia huoneen lämpötilassa ja lisätään vesipitoista metanolia. Sakka suo-25 datetaan erilleen, pestään metanoli/l·^0-seoksella (1:9) ja kuivataan, jolloin saadaan otsikon yhdistettä: sp. 160°, C°<7p0 = -19° (c = 1 DMF: ssa).

h) H-Cys(MBzl)-Thr-oli-trifluoriasetaatti

Liuos, jossa on 7,1 g yhdistettä Boc-Cys(MBzl)- 30 Thr-oli ja 5 ml tioanisolia 25 ml:ssa metyleeniklori- dia, lisätään 50 ml:aan TFA:a ja annetaan olla paikoillaan 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Liuos laimennetaan noin 1,5 litralla eetteriä ja sakka suodatetaan erilleen, pestään eetterillä ja kuivataan, jolloin saa-35 daan otsikon yhdistettä: ~ 8,3° (c = 1,1 95 %:ssa etikkahapossa).

10 72981 i) Boc-Cys(MBzl)-Thr-oli 2,1 ml N-metyylimorfoliinia lisätään sekoittaen seokseen, jossa on -20°:seen esijäähdytettynä 6,3 g yhdistettä Boc-Cys(MBzl)-OH 50 ml:ssa THF:a, minkä jälkeen 5 lisätään tiputtamalla -15°:ssa 2,4 ml kloorimuurahais-happo-isobutyyliesteriä. Kun seosta on sekoitettu 5 minuuttia -15°:ssa, lisätään kylmä liuos (-10°), jossa on 3,3 g yhdistettä H-Thr-oli-hydrokloridi ja 4,1 ml N-me-tyylimorfoliinia 30 ml:ssa DMF:a. Seosta sekoitetaan 2 10 tuntia 0°:ssa ja edelleen 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Lisätään 50 ml 10 %:ista KHCO^a, reaktioseos konsentroidaan vakuumissa, laimennetaan etyyliasetaatilla ja pestään 3 kertaa 2-norm. sitruunahapolla, 3 kertaa 10 %:isella KHCO^illa ja sen jälkeen 30 %:isella NaCl-liuoksella. Or-15 gaaninen faasi kuivataan Na^SO^tlla ja haihdutetaan kuiviin vakuumissa, jolloin saadaan otsikon yhdistettä öljynä: Z/x-7q° = -31° (c = 1,3 DMFrssa).

j) Boc-(D)Phe-Cys(MBzl)-Phe-(D)Trp-Lys(Boc)-Thr-Cys(MBzl)-Thr-oli 20 0,7 ml noin 5-norm. HCl:n eetteriliuosta lisätään sekoittaen -20°:seen esijäähdytettyyn seokseen, jossa on 0,82 g yhdistettä Boc-(’D) Phe-Cys (MBzl)-Phe-(D)-Trp-Lys-(Boc)-Thr-NHNH2 30 mlrssa DMF:a, ja sen jälkeen, kaikkiaan, 0,8 ml 10 %:ista tert.-butyylinitriittiä DMF:ssä.

25 Seosta sekoitetaan 15 minuuttia -20° - -15°:ssa -25°C:ssa lisätään 0,56 ml trietyyliamiinia, ja sen jälkeen -15°:seen esijäähdytetty liuos, jossa on 0,51 g yhdistettä H-Cys-(MBzl)-Thr-oli-hydrokloridi 3 ml:ssa DMF:a, ja koko seosta sekoitetaan 20 tuntia -5° - 0°:ssa ja edelleen 3 tun-30 tia huoneen lämpötilassa. Reaktioseos laimennetaan noin 100 ml :11a metanolia ja tuote saostetaan lisäämällä noin 40 ml H20:ta. Sakka suodatetaan erilleen, pestään vesipitoisella metanolilla ja kuivataan, jolloin saadaan otsikon yhdistettä: hajaantuu 170°: ssa, - -20° 35 (c = 1 DMF:ssa).

11 72981

v—t f—t I—i «—( r—I I—|rH r—( r-f »H

ooooooo ooo L ' j

Λ K

H ' t—( r—4 I—1 T“t r—I r-H r—t ‘ r—i

N N N N N N N N j N

OEC3 CO CO CO CO CO gig

to 2-^0 2- 2 \ 2\ 2\ 2 ^ 2\ S-O

‘jj ο \ Γ 1 Γ & υ υ e α> o o ω cq cd 3 m £ o c m -----------1--------

•π λ υ υ κ E

oh o o

¥ CO CO

CO

•H 0 o O G H-. s- S „ NX9 nno nv| n\ n\

£ >1 ^-:-^- I

>, H K

CO

δ

> K

<3 Q< O

S H

g H________________ (V —

co Q

rn — υ o e f ss $ o § CO X!___-l---------f—-----

‘ä Λ υυυυ ου K

β o o o o o o 2 pa cq o cq co co

—i <—· I A

C NN I—.—.---1

2 CQ ffi CO K

$ 2 0 2 0 •H \ \i o L to _P__P--------——- > ^ >1 cö U „

l_U

£ 4-> 3 % .. +" o S 3 Ά ---— _ h

S 2 S

S & | N to

CO CO

w w________________________ 72981 12 c—t r~{ rH f-H I—l 0 o o o o _ ί " 1 ; i !i j.

r—I I Ί r-l <H

N I N N

ta 1 cq m ii_!x_!x_!\|_n il ί ro

K (N

-:--S3---O----

\ CM

a: d k 2

O S

s s >i

N N O N N K N

_\ r_N ^ Nj X._____ ! 3 4-) ^

d CM

en ° en & ____________________ __ _ E j <—I >—I I—I «—· ^ N N N N p_| a m e α ω m s\ , s\° sx___^__

N KJ tS3 N N E E

13 72981

Seuraavia yhdisteitä voidaan valmistaa edellä selostettujen menetelmien mukaisesti (kaikkia yhdisteitä asetaattina ellei toisin ole mainittu): I-7 5 A-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-F' 1 6

Esim. A F' CoCJ^ 95-%:ssa 10 no"___etikkahapossa 2 H-(D)Phe- -(D)Ser-NH2 -48° (c=l,0) 3 H-(D)Phe- -NH2 -35° (c=l,0) 4 H-(D)Phe- -Phe-oli -41° (c=l,0) 5 H-(D)Phe- -Leu-oli -41° (c=l,0) 15 6 H-(D)Phe- -Asp-dioli -42° (c=l,0) 7 H-(D)MePhe- -Thr-oli -63° (c=l,0) 8 H-(D)Phe- -Ser-oli -43° (c=l,l) 9 /^V(CH2)2-CO- -Thr-oli -25° (c = 0,9) 20 '—' 10 H-(D)Phe(pF)- -Thr-oli -41° (C=0,5) 25 Esimerkki 11: f-1 H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-(D)Cys-(D)Ser-NH2 1 6 30 HC1 suola: CoL-J^ 95-%:ssa etikkahapossa = -85° (c = 0,4).

Esimerkki 12 I-1 H-(D)Phe-(D)Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-(D)Cys-(D)Ser-NH ^ 35 1 6 95-%:sta etikkahapossa = 102° (c = 1,0).

72981

Esimerkki 13:

/ ' I

H-(D)Phe-(D)Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-(D)Ser-NH^ 1 2 5 /7*7 9 5-%: ssa A-OH:ssa = -3 0° (c = 1,0).

Esimerkki 14: r~-—-, 10 H-(D)Phe-Cys-Phe(pF)-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol 1 6 zf°S:7p0 9 5-%: ssa etikkahapossa = -42° (c = 1,0).

15 Esimerkki 15:

Menettelemällä samalla tavalla kuin esimerkeissä 1-14, mutta jättämällä pois viimeinen hapetusvaihe, valmistetaan suoraketjuisia polypeptidejä, jotka vastaavat kutakin mainittua yksityistä monosyklistä polypeptidiä 20 (s.o. joissa 1- ja 6-asemissa olevat -Cys- tähteet eivät ole sitoutuneet). Täten jättämällä pois viimeinen hapetus-vaihe esimerkin IA menetelmässä, valmistetaan suoraket-juista polypeptidiä, jonka kaava on: 25 H-(D)Phe-Cys-Phe(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-oli

Zhydrokloridi7 95-%: ssa et ikkahapossa = -35° (c = 0,5).

Claims

15 72981 Patenttivaatimus Menetelmä kaavan (I) mukaisen terapeuttisesti käyttökelpoisen polypeptidin ja sen suolojen valmistamiseksi, 5 CH0-S-Y Y0-S-CH0 I 2 1 ^ | 2 A-NH-CH-CO-B-DTrp-Lys-Thr-NH-CH-F (I) 1 2 3 4 5 5 10 jossa A on kaavan RCO- mukainen ryhmä, jossa i) R on C7_1Q-fenyylialkyyli, tai ii) RCO- on L- tai D-fenyylialaniinijäännös, joka on mahdollisesti monosubstituoitu renkaassa halogeenilla ja aminohappo jäännöksen o<-aminoryhmä on mahdollisesti monometyloitu, 15. on -Phe-, joka on mahdollisesti monosubstituoitu renkaassa halogeenilla, F on kaavan CONHR-^ mukainen ryhmä, jossa R^ on vety tai kaavan -CH(R2)-X mukainen ryhmä, R2 on vety, -(CH ^-OH tai tai edustaa luonnon X-aminohapon --^-hiiliatomiin 20 kiinnittyvää substituenttia, ja X on kaavan -CH^OH tai -C0NH2 mukainen ryhmä, jolloin ryhmällä -CH(R2)-X on D-tai L-konf iguraatio 5l ja Y^ ja ovat kukin vetyjä tai yhdessä muodostavat suoran sidoksen, jolloin 1- ja 6-asemas-sa olevilla jäännöksillä toisistaan riippumatta on L- tai 25 D-konfiguraatio, edellyttäen, että D- ja/tai L-kysteiinijäännökset voivat olla ainoastaan 1- ja 6-asemissa, tunnettu siitä, että a) suojaryhmä tai suojaryhmät poistetaan suojatus-30 ta suoraketjuisesta tai monosyklisestä kaavan (I) mukaisesta polypeptidistä, jossa ainakin yksi funktionaalinen ryhmä on suojattu, b) amidisidoksen avulla liitetään yhteen kaksi pep-tidiyksikköä, joissa kummassakin on ainakin yksi aminohap- 35 po- tai aminoalkoholi-tähde, peptidi-yksiköiden ollessa sellaiset, että muodostuu kaavan (I) mukainen suoraketjui-nen tai monosyklinen polypeptidi, is 72981 c) suoraketjuinen kaavan (I) mukainen polypeptidi hapetetaan, jolloin saadaan kaavan (I) mukainen monosykli-nen polypeptidi, ja haluttaessa näin saatu polypeptidi muutetaan suolan 5 muotoon. 72981 Förfarande för framställning av en terapeutiskt användbar polypeptid med formeln (I) och salter därav, 5 CH -S-Y Y„-S-CH„ I 2 1 2 | 2 A-NH-CH-CO-B-DTrp-Lys-Thr-NH-CH-F (I) 1 2 3 4 5 6 10 väri A är en grupp med formeln RCO-, där i) R är C7_-Lg-fenylalkyl, eller ii) RCO- är en L- eller D-fenylalaninrest, som eventuellt i ringen är monosubstituerad med halogen och .9<-aminogruppen i aminosyraresten eventuellt är monometylerad,

15 B är -Phe, som eventuellt i ringen är monosubstituerad med halogen, F är en grupp med formeln CONHR^, där är väte eller en grupp med formeln -0Η(Κ^)-Χ, R2 är väte, eller (CH^^-OH eller star för en substituent bindande vid.y-kol-20 atomen i en naturell οί-aminosyra, och X är en grupp med formeln -CH20H eller -C0NH2> varvid gruppen -CH(R2)-X har D- eller L-konfiguration, och Y^ och Y2 vardera är väte eller tillsammans bildar en direkt bindning, varvid res-terna i 1- och 6-ställning oberoende av varandra har L-25 eller D-konfiguration, förutsatt, att D- och/eller L-cysteinresterna kan endast vara i 1- och 5-ställningarna, kännetecknat därav, att man a) avlägsnar skyddsgruppen eller skyddsgrupperna 30 frän en skyddad rakkedjad eller monocyklisk polypeptid med formeln (I), i vilken ätminstone en funktionell grupp är skyddad, b) medelst en amidbindning sammanbinder tvä peptid-enheter, vilka vardera innehäller ätminstone en aminosyra- 35 eller aminoalkoholrest, varvid peptidenheterna är sädana att en rakkedjad eller monocyklisk polypeptid med formeln (I) bildas,