CS228140B2

CS228140B2 - Production of straight or monocyclic polypeptides

Info

Publication number: CS228140B2
Application number: CS808184A
Authority: CS
Inventors: Wilfried Bauer; Janos Dr Pless
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1979-11-27
Filing date: 1980-11-26
Publication date: 1984-05-14
Also published as: ES8305701A1; ES497113A0; PT72103B; GR71636B; JPS5690048A; IL61561A0; CA1182109A; FI72981B; EP0029579A1; DE19375086I2; PH22841A; EP0029579B1; ES8301463A1; ES510751A0; FI72981C; IE50571B1; HU185920B; DK501980A; NZ195640A; ATE2512T1

Description

Vynález popisuje nové polypeptidy, způsob jejich výroby, farmaceutické prostředky obsahující tyto polypeptidy a jejich použití jako farmaceuticky účinných látek.

Vynález zejména popisuje přímé nebo monocyklické polypeptidy obsahující hexapeptidový zbytek, který v poloze 1 (N-terminální poloha) obsahuje cysteinový zbytek, v poloze 2, popřípadě na kruhu substituovaný fenylalaninový zbytek, v poloze 3, popřípadě na benzenovém kruhu substituovaný tryptofanový zbytek, v poloze 4, popřípadě ε-Ν-alkylovaný lysinový zbytek, v poloze 5 zbytek aminokyseliny a v poloze 6 (C-terminální poloha) cysteinový nebo cysteinolový zbytek, přičemž v případě monocyklického polypeptidu jsou atomy síry v cysteinovém zbytku v poloze 1 a cysteinovém nebo cysteinolovém zbytku v poloze 6 spojeny za vzniku disulfidického můstku —S—S—, a kde zbytky v polohách 1, 3, 5 a 6 mají nezávisle na sobě D- nebo L-konfiguraci a zbytky v polohách 3, 4 a 5 jsou nezávisle na sobě, popřípadě «Ν-alkylovány, jakož i jejich soli a komplexy.

V souhlase s vynálezem jsou výhodnými sloučeninami polypeptidy obecného vzorce I

А CH2—S—Yi Y2—S—CH2 \ I I

N—CH—СО—В—C—D—E—NH—CH—F / 1 2 3 4 5 6

A‘ (1) ve kterém

A znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku, fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, skupinu vzorce

RCO— kde

R představuje atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 11 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, nebo skupina vzorce RCO— představuje

a) zbytek L- nebo D-fenylalaninu, který je popřípadě substituován v kruhu halogenem, nitroskupinou, aminoskupinou, hydroxylovou skupinou, alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku a/nebo alkoxyskupinou s 1 až 3 atomy uhlíku, bj zbytek přírodní «-aminokyseliny odliš né od α-aminokyseliny definované výše v odstavci a], nebo odpovídající D-aminokyseliny, nebo

c] dipeptidlcký zbytek, v němž zbytky jednotlivých aminokyselin jsou stejné nebo rozdílné a jsou vybrány ze zbytků uvedených výše v odstavcích a) a/nebo b), přičemž α-aminoskupina zbytků aminokyselin podle odstavců a) a b), a N-terminální aminoskupina dipeptidického zbytku podle odstavce c) je popřípadě mono- nebo dialkylována alkylovou skupinou s 1 až 12 atomy uhlíku,

A* znamená atom vodíku nebo v případě, že A představuje alkylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, znamená rovněž alkylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku,

В představuje zbytek -Phe-, popřípadě substituovaný v kruhu halogenem, nitroskupinou, aminoskupinou, hydroxyskupinou, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku a/nebo alkoxyskupinou s 1 až 3 atomy uhlíku,

C znamená zbytek -(LJ- nebo -(D)-Trp-, popřípadě α-N-methylovaný a popřípadě substituovaný na benzenovém kruhu halogenem, nitroskupinou, aminoskupinou, hydroxylovou skupinou, alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku a/nebo alkoxyskupinou s 1 až 3 atomy uhlíku,

D představu zbytek -Lys-, popřípadě α-N-methylovaný a popřípadě ε-N-alkylovaný alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku,

E znamená zbytek přírodní α'-aminokyseliny nebo odpovídající D-aminokyseliny, kterýžto zbytek je popřípadě a-N-methylovaný,

F představuje zbytek —COORi, —CH2OR2,

R3 / —CO—N \ Rá nebo

Ri znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku,

Rz znamená atom vodíku nebo zbytek fyziologicky přijatelného, fyziologicky hydrolyzovatelného esteru,

R3 znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku,

Rí znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku nebo v případě, že R3 představuje atom vodíku nebo methylovou skupinu, představuje R4 rovněž skupinu vzorce —CH(K5)—X,

Rs znamená atom vodíku, skupinu — (СНг)2—OH, skupinu — (СН2)з—OH nebo substituent odpovídající zbytku navázanému na α-uhlík přírodní a-aminokyseliny a

X znamená zbytek vzorce —COORi, —CH2OR2 nebo

Re Z —CO—N \ R7 kde

Ri a Ra mají shora uvedený význam,

Re představuje atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku a

R7 představuje atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, přičemž seskupení — CHfRs)— X má D- nebo L-konfiguraci, a

Yi a Y2 nezávisle na sobě představují vždy atom vodíku nebo oba tyto symboly společně tvoří přímou vazbu, přičemž zbytky v poloze 1 a 6 nezávisle na sobě mají L- nebo D-konfiguraci, s tím, že zbytky D- a/nebo L-cysteinu jsou přítomny pouze v polohách 1 a 6, jakož i jejich soli a komplexy.

V popisné části i v definici předmětu vynálezu se výrazem „halogen“ míní fluor, chlor a brom.

V polypeptidech obecného vzorce I jsou výhodné následující významy jednotlivých obecných symbolů nebo jejich kombinace:

1. A znamená fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, zejména fenethylovou skupinu, nebo skupinu RCO—, s výhodou představuje A skupinu RCO.

1.1. R znamená s výhodou alkylovou skupinu s 1 až 11 atomy uhlíku nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, zejména fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku a zvláště pak fenethylovou skupinu, nebo

RCO má význam uvedený výše v odstavci a), b) nebo c).

1.2. Pokud RCO má význam uvedený výše v odstavci a), b) nebo c), pak a-aminoskupina zbytku aminokyseliny podle odstavce a) a b), a N-terminální aminoskupina dipeptidického zbytku podle odstavce c) s výhodou není alkylovaná nebo je monoalkylovaná alkylovou skupinou s 1 až 12 atomy uhlíku, zejména s 1 až 8 atomy uhlíku, a zvláště pak monomethylovaná. Nej výhodnější je případ, kdy N-terminální skupina není alkylovaná.

1.3. Pokud RCO má význam podle odstavce a], je tímto zbytkem s výhodou a‘) zbytek L- nebo D-fenylalaninu nebo

-tyrosinu, popřípadě· mono-N-alkylovaný alkylovou skupinou s 1 až 12 atomy uhlíku.

Výhodnějším zbytkem podle odstavce a‘) je· zbytek L- nebo D-fenylalaninu nebo Lnebo D-N-alkylfenylalaninu, kde alkyl obsahuje 1 až 8 atomů uhlíku. Nejvýhodnějším zbytkem podle odstavce a‘) je pak zbytek D-fenylalaninu nebo D^^-í^Híylfenylalani^r^u, kde alkyl obsahuje 1 až 8 atomů uhlíku, zejména pak zbytek D-fenylalaninu nebo D(N-meth yl) f enylalaninu.

1.4. Pokud RCO má význam podle shora uvedeného odstavce b) nebo c), je příslušným zbytkem s výhodou zbytek lipofilní. Výhodnými zbytky podle odstavce b) jsou tedy b‘) zbytky «-aminokyselin s postranním uhlovodíkovým řetězcem, například zbytek leucinu nebo norleucinu, přičemž tyto zbytky mají L- nebo D-konflguraci, a výhodnými zbytky podle odstavce c) jsou dipeptidické zbytky, v nichž zbytky jednotlivých aminokyselin jsou stejné nebo rozdílné a jsou vybrány ze zbytků uvedených výše v odstavcích a‘) a b‘).

1.5. Nejvýhodněji představuje zbytek RCO některou ze skupin uvedených výše v odstavci a), zejména pak v odstavci a‘).

2. B představuje zbytek—Phe—.

3. C představuje zbytek — (D)Trp—.

4. D představuje zbytek —Lys—, —MeLys— nebo —LysU—Mee—, zejména —Lys—.

5. E představuje zbytek přírodní «-aminokyseliny, zejména zbytek —Thr—.

6. F představuje skupinu vzorce

R3 Z —CO—N \ '

R4 zejména skupinu vzorce

Rs Z CO—N \

CH-(Rs)— X (v kterémžto případě R3 znamená vodík nebo methylovou skupinu). V posledně zmíněném případě má seskupení — CH(Rs)—X s výhodou L-konfiguraci.

6.1. R3 představuje s výhodou atom vodíku.

6.2. (ako substituent navázaný na «-uhlík přírodní aminokysetlny [tj. kyseliny vzorce HžN—CHJRsJ—COOH] představuje R5 s výhodou skupinu —CH2OH, -CH(CH3)-OH, isobutylovou skupinu nebo benzylovou · skupinu, nebo Rs znamená skupinu (CH2)2OH nebo (CH2)3OH. S výhodou představuje Rs skupinu —CH2OH nebo —CH(CH3)OH.

6.3. X představuje s výhodou skupinu vzorce .

Rs

Z —CO-N \ ·

R7 nebo —CH2—OR2, zejména skupinu vzorce —CH2—OR2 a R2 znamená s výhodou atom vodíku nebo má význam uvedený níže v odstavci 7. Nejvýhodněji znamená R2· atom vodíku.

7. (ako· zbytek fyziologicky přijatelného, fyziologicky hydrolyzovatelného esteru představuje Ra s výhodou skupinu HCO, alkylkarbonylovou skupinu se 2 až 12 atomy uhlíku, fenylkarbonylovou skupinu s 8 až 12 atomy uhlíku nebo benzoylovou skupinu.

8. Zbytky v polohách 2 a 7 mají s výhodou L-konfigurac-i.

9. Yi a Ya s výhodou představují společně přímou vazbu.

Určitou skupinu sloučenin podle vynálezu tvoří polypeptidy shora uvedeného obecného vzorce I, ve kterém

A znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku nebo· zbytek vzorce RCO—,

A‘ představuje atom vodíku,

R znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, nebo

RCO představuje

a) zbytek L- nebo D-fenylalaninu, popřípadě monosubstituovaného na kruhu halogenem, nitroskupinou, aminoskupinou, hydroxylovou skupinou, alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku nebo alkoxyskupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, nebo

b) zbytek přírodní α-aminokyseliny odlišné od «-aminokysehny definované výše v odstavci a), nebo odpovídající D-aminokyseliny, přičemž aminoskupina zbytků aminokyselin podle odstavců a) a b) je popřípadě monoalkylovaná alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku,

F představuje skupinu vzorce —COORi, —CH2OR2 nebo

Rs

Z —CO—N \ ^:

R4

Rž znamená atom vodíku,

R3 představuje atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku,

R7 znamená atom vodíku nebo' alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku a

Yi a Y2 společně tvoří přímou vazbu, a jejich adiční soli s kyselinami a komplexy.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být ve formě solí nebo komplexů. Zmíněné slouče niny mohou tvořit adiční soli například s organickými kyselinami, polymerními kyselinami a anorganickými kyselinami. Mezi tyto adiční soli s kyselinami náležejí například hydrochloridy a acetáty. Výše zmíněnými komplexy se míní sloučeniny známého typu, vznikající ze sloučenin obecného vzorce I adicí anorganických látek, například anorganických solí nebo hydroxidů, jako solí vápníku a zinku, a/nebo adicí polymerních organických látek.

Předmětem vynálezu je způsob výroby shora uvedených sloučenin, který se provádí tak, že se odštěpí alespoň jedna chránící skupina z chráněného přímého nebo monocyklického polypeptidu se sekvencí odpovídající obecnému vzorci I, vzniklý přímý polypeptid obecného vzorce . I, v němž Yi a Y2 znamenají atomy vodíku, se popřípadě oxiduje na odpovídající monocyklický polypeptid obecného vzorce I, v němž Yi a Y2 společně tvoří přímou vazbu, a takto získaný polypeptid se popřípadě převede na sůl nebo komplex.

Shora uvedený způsob je možno provádět o sobě známým způsobem, například podle postupů popsaných níže v příkladech · provedení. Pokud není konkrétně ' popsána výroba výchozích látek, jsou tyto látky buď známé, · nebo je lze připravit a vyčistit podle metod známých v daném oboru.

Polypeptidy podle vynálezu, ·jakož i jejich farmaceuticky upotřebitelné soli a komplexy vykazují cenné farmakologické vlastnosti, · jak · vyplývá · z · pokusů na . zvířatech. Popisované sloučeniny zejména inhibují sekreci růstového hormonu, o čemž svědčí například jejich · účinek na snížení hladiny růstového hormonu v séru krysy.

Tento test se provádí za použití krysích samců narkotízov.-ných Nembutalem. Testovaná sloučenina se podává . v různých, logaritmicky odstupňovaných dávkách, přičemž každá dávka se zkouší nejméně na 4 krysách. Po aplikaci se krysy za 15 minut dekapitují, · jejich krev se · shromáždí a radioimunologickou zkouškou se zjistí hladina růstového hormonu v séru.

Shora · uvedené polypeptidy, jejich soli a komplexy jsou v souhlase s tím vhodné pro použití k léčbě poruch, jejichž původ je zapříčiněn nebo souvisí s nadměrnou sekrecí růstového hormonu, například k léčbě diabetes mellitus a angiopathie, jakož i akromegalie.

Polypeptidy podle vynálezu, j’ej’ich soli a komplexy rovněž inhibují žaludeční a pankreatickou sekreci, o čemž svědčí standardní testy na zvířatech. Pankreatická sekrece se zjišťuje například podle metody, kterou popsali Kouturek a spol. [Scand. J. Gastroent. 6, 423 (19^:L)], žaludeční sekrece pak následujícím způsobem:

Samci krys o hmotnosti 220 až 280 g se v laboratoři uchovávají několik dnů v individuálních · klecích (14 hodin světla denně.), přičemž 48 hodin před zahájením testu se nechají hladovět (příjem vody není . omezen). Na počátku pokusu se vrátník zvířete pod etherovou narkózou podváže a k stimulaci žaludeční sekrece se subkutánní injekcí podá 100 jxg/kg pentagastrlnu. Současně se intramuskulární injekcí podá testovací sloučenina. Po 30 minutách se zvířata usmrtí, změří se objem žaludečních šťáv a titrací za použití thymolové modři jako indikátoru se zjistí koncentrace kyseliny. Vypočte se produkce kyseliny a v porovnání s neošetřenými kontrolními zvířaty se zjistí inhibice v procentech.

Shora uvedené polypeptidy, jejich soli a komplexy lze tedy dále používat k léčbě ga^t^^ointes^inálních poruch, například k léčbě žaludečních vředů, ga^l^trointestinálního krvácení a akutní pankreatitidy.

Pro shora uvedená použití se indikovaná denní dávka pohybuje zhruba od 0,002, napříkladklad zhruba od 0,07, do cca 20 mg příslušného polypeptidu, kterážto dávka se účelně podává v dílčích dávkách dvakrát až čtyřikrát denně v jednotkové dávkovači formě nebo v protrahované formě. Vhodné jednotkové dávkovači formy obsahují zhruba od 0,0005, například zhruba od 0,02 do cca 10 mg polypeptidu podle vynálezu, nebo ekvivalentní množství jeho farmaceuticky upotřebitelné solí nebo komplexu, spolu s pevným nebo kapalným farmaceutickým ředidlem nebo nosičem.

Vynález ilustrují následující příklady provedení, jimiž se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje. . V těchto příkladech hodnoty · [a]_D ²⁰ nejsou korigovány. Používané zkratky mají následující významy:

Asp-díol = zbytek asparagin-diolu, odpovídající vzorci

NH— /

HO—CH2—CH2—CH \

CH2OH

Boc = terc.butoxykarbonyl

Hy = —NHNH2 Leu-ol = leucinolový zbytek odpovídající vzorci

NH— /

CH3—CH (CH )3—CH2—CH \

CH2OH

MBzl = p-methoxybenzyl

Me = methyl

MePhe = — (N-methyl)-PheONP = 4-nitrofenoxyskupma Plhe(pF) = p-F-PhePhe-ol = fenylalaninolový zbytek odpovídající vzorci

' .......' ' 8	10
	Thr-ol -= threoninolový - zbytek odpovídající
^í χ ch₁oh	. - vzorci NH— / CIh—CHjOH j—CH \ CHzOH
Ser-ol = serinolový zbytek odpovídající vzorci —NH—CH(CH2OH)2	Z - = -benzyloxykarbonyl.

Přík 1 ad 1A . _?

V 9 ml trifluoroctové kyseliny, se. při ..teplotě 0°C rozpustí 0,70 g Boc—('D)Phe—C.ys-(МБгЦ—Phe—(D)Trp—Lys(Bocj—Thr—Cys(MBzl)-Thr-ol.u ' -a 6,0 ml thioanisolu. roztok se ochladí na —10 ·°ϋ a za míchání - se . k němu přidá 12 ml cca 2 M trifluoroctanu boritého v trinuoroctové kyselině. V ' míchání při teplotě —5 až —10 °C se pokračuje ještě 1½ hodiny, pak se přidá 50 ml absolutního methanolu ochlazeného na — 70 °C a po dalších 5 minutách se za míchání přidá 1 litr absolutního etheru a 5 ml cca 5 Ν etherického chlorovodíku. Vysrážený produkt se odfiltruje, krátce se promyje etherem - a zbytek na filtru se ihned rozpustí -. ve 2,5 litru směsi dioxanu a vody (7 : 3). - Přidáním zředěného roztoku amoniaku se hodnota pH upraví na 7 až 7,5 a směs se v . Otevřené reakční nádobě míchá při teplotě místnosti až do negativní reakce ' na skupiny —SH ' (například Ellmannův test]. Přídavkem kyseliny chlorovodíkové še - pH upraví na hodnotu 3 - až 4, výsledný - roztok se - zahustí ve vakuu a odparek se lyofilizuje. -Lyo- filizát se rozpustí v malém množství -10%.. kyseliny octové a vyčistí se chromatografií na gelu (Bio-Rad P4] za - použití. 10% kysell· ny octové jako elučního činidla. . Frakce obsahující žádaný. produkt se spojí a lyofilizují, čímž se .získá sloučenina uvedená - - v názvu, o optické rotaci [ajD²⁰ = —42° (c - = 0,5 v 95 % kyselině octové). ^;

Výchozí materiál je možno - získat tímto způsobem:

a) Z—Lys(Bocj—Thr—OMe

K roztoku 56 g Z—Lys(Boc)—OH ve formě dicyklohexylamonlové soli v 1200 ml tetrahydrofuranu ochlazenému -na —20 ° seza míchání přidá 13,5 ml isobutylesteru kyseliny chlormravenčí. V míchání při teplotě —15 °C se pokračuje ještě 20 minut, načež se přidá roztok 21 g hydrochloridu H— Thr—OMe v 600 ml tetrahydrofuranu, ochlazený na —21 °C. Při teplotě —15 °C se přikape 17 ml triethylaminu, - reakční směs se 18 hodin míchá při teplotě 0 °C, načež se silně - - zahustí ve vakuu. Zbytek se zředí směsí stejných dílů etheru a ethylacetátu a vysrážená dicyklohexylamoniová ' sůl se- . odfiltruje, - Filtrát - se promyje vodou, 2 N kyselinou citrónovou, - 10% roztokem hydrogenuhličitanu draselného a znovu vodou, - organická fáze se vysuší síranem sodným a -odpaří se k suchu. Získá se sloučenina uvedená v názvu, ve formě pryskyřičnatého materiálu o optické rotaci [a](²0 = —14° (c = 1 v dimethylformamidu).

b) Z—Phe— (D)Trp—OH .·' 9,0 - -g Z—Phe—OH ve 150 - ml . acetonitrilu se - ochladí na —18- °C a - přidá - se - nejprve

3,4 ml - N-methylmorfoИnu - a. pak 4,1 ml isobutylesteru - kyseliny chlormravenčí. Výsledný/roztok - se- 15 minut - míchá . - při -teplotě ' —15 °C, přidá - se . k němu studený - roztok . 6,2' gramu H—(D)Trp—OH -ve- 30 ' - ml - 1 'N louhu sodného a 100 ml acetonttrilu, a v míchání při teplotě - —5 až - 0 °C - se pokračuje ještě 18 hodin. - - Reakční směs ' se . zahustí ve- vakuu, odparek - - sé .' zředí vodou a extrahuje - - se . třikrát vždy malým . množstvím - etheru. . Přidáním· 4 N kyseliny sírové se hodnota pH vodné fáze upraví na cca 2 a - vyloučená sraženina- se extrahuje směsí - etheru ' a kyseliny octové. Organická -fáze se- .promyje vodou a vysuší se síranem sodným, - načež še odpaří ve vakuu. Zbytek poskytne po .. krystalizací ze směsi . . etheru ' a petroletheru - -sloučeninu uvedenou v . názvu, o teplotě tání 113 °C a optické rotaci . [ah²⁰ = . —5° (c - = 0,9 v dimethylformamidu ).

c) Z—Phe— (D )Trp—Lys(Boc) —Thr—OMe

6,0 g - Z—tys(Boc)—Thr—OME - ve 150 . ml methanolu se hydrogenuje v přítomnosti paládia na uhlí. Reakční směs se zfiltruje, zbytek na filtru se promyje methanolem a filtrát se odpaří ve - vakuu. Zbytek se spolu s 4,8 g Z—Phe—(D)Trp—OH a 2,0 g N-hydroxybenzotriazolu rozpustí v 50 ml dimethylformamidu, roztok se ochladí na —15 °C a

2 81'40 za míchání se k němu přidá 2,1 g dicyklohexylkarbodiimidu v 15 ml dimethylforamidu. Výsledný roztok se ještě další 2 dny míchá při teplotě 0 °C, pak se odpaří ve vakuu, odparek se zředí směsí stejných dílů kyseliny octové a etheru a vysrážená dicyklohexylmočovina se odfiltruje. Filtrát se promyje 2 N kyselinou citrónovou, 10% roztokem hydrogenuhličitanu draselného a vodou, organická fáze se vysuší síranem sodným a odpaří se. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití směsi dichlormethanu a methanolu jako elučního činidla. Frakce obsahující žádaný produkt se spojí a odpaří se ve vakuu, čímž se získá sloučenina uvedená v názvu, o optické rotaci [_a]_D-20 = _7° (c = 0,9 v dimethylformamidu).

d ). H—Phe— (D )Trp—Lys (Boc) — Thr—OMe

1,2 . g Z—Phe-(D)Trp—Lys(Boc)—Thr— OMe . v . 50 ml methanolu se hydrogenuje v přítomnosti 10% paládia na uhlí. Reakční směs se zfiltruje . a odpaří se ve vakuu, čímž se získá . sloučenina . uvedená v názvu. Produkt rezultuje ve . formě pěny o optické rotaci [«]d20 - —18° (c = lv methanolu).

e) Boc—(D)Phe—C.ys(MBzl)—OH

K roztoku 16 g Boc(D)Phe—OH ve 300 ml . tetrahydrofuranu, ochlazenému na — 20 °C, se přidá nejprve 8,4 ml triethylaminu a pak

8,3 . ml isobutylesteru kyseliny chlormravenčí, . směs se 10 minut míchá při teplotě —15° Celsia, načež se .k ní přikape studený roztok H—Cys—(.MBžl)—OH a 11,5 ml triethylaminu ve 400 . ml směsi tetrahydrofuranu a vody (5' .:1). Reakční směs se cca 2 'dny míchá při teplotě 0 °C, ' pak ' se zahustí ve vakuu, odparek se zředí 1,3 litru vody a extrahuje se etherem. Vodná fáze se přídavkem' 4 N kyseliny sírové okyselí na pH 2,0 a vyloučená . sraženina se extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátový extrakt ' se promyje vodou, vysuší se ' síranem ' sodným a odpaří se ve vakuu. Zbytek se ' vyčistí chromatografií na silikagelu za použití etheru s 1 % kyseliny octové jako elučního činidla. Frakce obsahující žádaný produkt se spojí a odpaří se ve vakuu, čímž se získá sloučenina uvedená ' v názvu, o optické rotaci [л^0 = —18° (c = 1,1 v dimethylformamidu).

f) Boc-^Phe—Cys^Bzz) —Phe- (D)Trp—Lys( Bocj-Thr-OMe

K roztoku 0,67 g Boc-(D)Phe—Cys(MBzzj-OH, 1,0 g H-Phe—(D)Trp—Lys( Bocj-Thr-OMe a 0,5 g N-hydroxybenzotriazolu ve 30 ml dimethylformamidu ochlazenému na - 20 °C se za míchání přidá 0,30 gramu dicyklohexylkarbodiimidu. Reakční směs se cca 12 hodin míchá při teplotě od —5 do 0 cc a ' pak ' cca 4 hodiny při teplotě místnosti, vysrážená dicyklohexylmočovina se odfiltruje a filtrát se promyje 2 N kyselinou citrónovou, 10% roztokem hydrogenuhličitanu draselného a vodou. Organická fáze se vysuší síranem sodným a po vyčištění se zahustí. Produkt se vysráží přidáním etheru a po odfiltrování se vysuší. Získá se sloučenina uvedená v názvu, o teplotě tání 160°C a optické rotaci [a]D²0 = -30° (c = = 1 v methanolu).

g) Boc-(D)Phe—Cys(MBzl)—Phe—(D)Trp—Lys (Boc) —Thr—NHNHz

K roztoku 0,9 g Boc-(D)Phe—Cys(MBzz)—Phe— (D )Trp—Lys (Boc) —Thr— OMe v 15 ml dimethylformamidu se přidá

1,5 ml hydrazinhydrátu, výsledný roztok se nechá 5 hodin stát při teplotě místnosti, načež se k němu přidá vodný methanol. Vyloučená sraženina se odfiltruje a po promytí směsí methanolu a vody (1:9) se vysuší. Získá se sloučenina uvedená v názvu, o teplotě tání ' 160 °C a optické rotaci [a]D²⁰ = = —19° (c = 1 v dimethylformamidu).

h) H—Cys (MBz!) -Thr-ol-trifluoracetát

Roztok 7,1 g Boc—Cys(MBzl)—Thr-olu a a 5 ml thioanisolu ve 25 ml methylenchloridu se vnese do 50 ml trifluoroctové kyseliny, výsledný roztok se ' nechá 20 minut stát při teplotě místnosti, pak se zředí cca 1,5 litru etheru a vyloučená sraženina se odfiltruje. . ' Po promytí etherem a vysušení se získá sloučenina uvedená v názvu, o optické .rotáci [a]_D ⁱ²⁰ = 8,3° (c = 1,1 v 95% kyselině octové).

i) Boc—Cys^Bzzj—Thr-ol

K ' roztoku 6,3 ' g Boc—Cys^Bz^—OH v 50 ml tetrahydrofuranu ' ochlazenému na —20 °C se zá míchání přidá 2,1 ml N-methylmorfo- linu a pak ' se při teplotě —15 °C přidá 2,4 ml isobutylesteru kyseliny chlormravenčí. Po pětiminutovém míchání při teplotě —15 ^CC se ' přidá na —10 °C ochlazený roztok 3,3 g H-Thr-ol-hydrochloridu a 4,1 ml N-methylmorfolinu ve 30 ml dimethylformamidu, směs se míchá 2 hodiny při teplotě 0 °C a pak ještě další 2 hodiny při teplotě místnosti. Po přidání 50 ml 10% roztoku hydrogenuhličitanu draselného se reakční směs zahustí ve vakuu, odparek se zředí ethylacetátem a promyje se třikrát 2 N kyselinou citrónovou, třikrát 10% roztokem hydrogenuhličitanu draselného a nakonec 30% roztokem chloridu . sodného. Organická fáze se vysuší síranem sodným a odpaří se ve vakuu, čímž se ' získá sloučenina uvedená v názvu, ve formě oleje o optické rotaci [a]D²⁰ = —31° (c = 1,3 v dimethylformamidu).

j) Boc—(D)Phe—Cys(MBzl)—Phe—(D)Trp—Lys ' (Boc) —Thr—Cys (MBzl) -Thr-ol

14

К roztoku 0,82 g Вос—(D)Phe—Cys(MBzl)—Phe- (D) Trp—Lys (Boc) —Thr— NH—NHž ve 30 ml dimethylformamidu ochlazenému na — 20 °C se za míchání přidá 0,7 ml cca 5 N chlorovodíku v etheru a pak 0,8 ml 10% terc.butylnitrltu v dimethylformamidu. Směs se 15 minut míchá při teplotě —20 až —15 °C, pak se к ní při teplotě —25 °C přidá 0,56 ml triethylaminu, načež se přidá roztok 0,51 g H—Cys(MBzí)—Thr-ol-hydrochloridu ve 3 ml dimethylformamidu ochlazený na —15 °C a výsledná směs se míchá nejprve 20 hodin při teplotě —5 až 0^cC a potom ještě další 3 hodiny při teplo tě místnosti. Reakční směs se zředí cca 100 ml methanolu a produkt se vysráží přidáním cca 40 ml vody. Sraženina se odfiltruje, promyje se vodným methanolem a vysuší se. Získá se titulní sloučenina rozkládající se při teplotě 170 °C o optické rotaci [«Jd²⁰ = — 20° (с = 1 v dimethylformamídu).

Příklad IB

Produkt uvedený v příkladu 1A lze rovněž připravit podle tohoto syntetického postupu:

(D)Phe -----Cys ------ Phe ---- (D/Trp --- Lys ----- Thr ------ Cys---- Thr-Ό1

-------------------------1--------------------------------------- Г—\| r4 N N	r—1 N CQ	MBzl /	r—! N 0)	MBzl /	1—1 03	------------------------------------------------------------------------------------------------------1 r-4 N ω	i------------------------------------------------------------------------------------------------------- H N 0)
O (. o c m 0	) 0 ) 3 0 c	4 4 > I
φ φ	c < 0	1 ) C ) c 3 0 1) (1	) 0 ) ) w К 0 >	4 5 _N	NJ ^03	CO \
и 04 O
υ c 0 c w π	) 0 ) 3 0 c	4 Э i
		1

rH . г-н <Н г-н <4

О о о О о

	'					3
1—i N m £	.			гЧ N « £	4—ί N	л ti •н Я О ° / ^к\
						Ή о W о ф , - С! ......
tO		CL к- IX С L X	* с ) Ν)		L*	>Ф 0! •н гЧ Ф ω S	. £ м ^rd о >
						XI) . .... . > 0 •Р о о м о Р .гЧ	Ъо peroxid
						«н •н ч -Р > ‘ >> •Р *н	ф ¹ Г-1 Л4 м Г-Н ω £
«—i N		гЧ N (£1 Ц Sx С - \	н Г-Н N ч 05		г—1 N X	ч‘ о гО 3 d •Р о о и й \	о •н м w Ср IQ О . а
						и Р . г-1 *н •н	-р d
			.

to to Ю to to И ЙЗ

Podle shora popsaných postupů je možno vyrobit tyto sloučeniny (pokud není uvedeno jinak, jsou všechny produkty ve formě acetátů):

A~Cys-Ph<z,-(D) Trp - Lys -E- Cys-F

6

Příklad	A	E	F‘	[a]_D ²⁰ v 95% kyselině
číslo				octové

2	H	—Thr—	—NH2	+ 33° (c = 1,1)
3	H— (D)Phe—	—Thr—	— (D)Ser—NH2	—48° (c = 1,0)
4	H— (D)Phe—	—Thr—	—NH2	—35° (c = 1,0)
5	H— (D)Phe—	—Thr—	—Phe-ol	—41° (c =1,0)
6	H— (D)Phe—	—Thr—	—Leu-ol	—41° (c =1,0)
7	H— (D)Phe—	—Thr—	—Asp-diol	—42° (c = 1,0)
8	H—Nle—	—Thr—	— (D)Ser—NH2	—42° (c = 1,0)
9	H	—Thr—	— (D)Ser—NH2	+ 26^e (c = 0,5)
10	H— (D)Phe—	— (D)Ala-	— (D)Ser—NH2	—23° (c = 0,9)
11	H—Asn—	—Thr—	— (D)Ser—NH2	—28° (c = 0,5)
12	H— (D)MePhe—	—Thr—	—Thr-ol	—63° (c = 1,0)
13	H—Nle—Asn—	—Thr—	—Thr-ol	—40° (c = 1,0)
14	H— (D)Phe—	— (D)Ala—	—Thr-ol	—9° (c = 1,0)
15	H— (D)Phe—	—Thr—	—Ser-ol	-43° (c = 1,1)
16	H— (D)Phe—	— (D)Thr—	-Thr-ol	—73° (c = 1,0)
17	O^ícH^^c°-	—Thr-	—Thr-ol	-25° (c = 0,9)
18	H—(D)Phe(pFJ—	—Thr—	—Thr-ol	—41° (c = 0,5)

Příklad 19

H- (D) Ph<b- Cys-Pha-JD) Trp -Lys-Thr-(D)Cys-(D)Sa.r-N H, b ^k

Hydrochlorid tohoto produktu má optickou rotaci [a]_D ²⁰ = —85° (c = 0,4 v 95% kyselině octové).

Příklad 20

H~(O)Phtz,~(D) CYS~Ph&-(D) Trp-Ly$ - Thr~(D) Cys-(D)Sa.r- N H, 1 6 •[plo⁸⁰ = —102° (c = 1,0 v 95% kyselině octově).

P ř í к 1 a d 21

H~(D)Ph&-(D) Cys-Pha.-(D)Trp-L.y‘>-Thr-Cy5~(D)Sa,r~N . 6 fajn²⁰ = —30° (c = 1,0 v 95% kyselině octové).

Příklad 22

H~(D)Ph<í-Cy&-Pha-(pF) — ((D^p-Lys- Thr-Cys-Thir-ol &

[«]d²0 = —42° (c = 1,0 v 95% kyselině octové).

Příklad 23

Analogickým způsobem jako v příkladech 1 až 22, ale s vyloučením finálního oxidačního stupně, se připraví polypeptidy s přímým řetězcem odpovídající jednotlivým monocyklickým polypeptidům uvedeným v těchto příkladech, tzn. polypeptidy, v nichž zbyt ky —Cys— v polohách 1 a 6 nejsou spolu spojeny.

Tak při vypuštění finálního oxidačního stupně z postupu popsaného v příkladu IA se získá přímý polypeptid vzorce

H— (D )Phe—Cys—Phe— (D( Trp—Lys—Thr —Cys—Thr-ol [hydrochlorid] o optické rotaci [a]^ = —35° [c = 0,5 v 95% kyselině octové).

Claims

PREDMET VYNALEZU

1. Způsob výroby přímých nebo monocyklických polypeptidů obecného vzorce I

A CH2—S—Y1 Y2—S—CH2 \ II

N—CH—-CO—B—C—D—E—NH—CH—F / 1 2 3 4 56

A‘(I) ve kterém

A znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku, fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, skupinu vzorce

RCO kde

R představuje atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 11 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylovou skupinu se 7 · až 10 atomy uhlíku, nebo skupina vzorce RCO— představuje

a) zbytek L- nebo D-fenylalaninu, který je popřípadě substituován v kruhu halogenem, nitroskupinou, aminoskupinou, hydroxylovou skupinou, alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku a/nebo alkoxyskupinou s 1 až 3 atomy uhlíku,

b) zbytek přírodní «-aminokyseliny odlišné od «-αminokysetiny definované výše v odstavci a), nebo odpovídající D-aminokyseliny, nebo'

c) dipeptidický zbytek, v němž zbytky jednotlivých aminokyselin jsou stejné nebo rozdílné a jsou vybrány ze zbytků uvedených výše v odstavcích a) a/nebo b), přičemž a-aminoskupina zbytků aminokyselin podle odstavců a) a b), a N-terminální aminoskupina dipeptidického zbytku podle odstavce

c) ee popřípadě mono- nebo dialkylována alkylovou skupinou s 1 až 12 atomy uhlíku,

A‘ znamená atom vodíku nebo v případě, že A představuje alkylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, znamená rovněž alkylovou skupinu s 1 až 12 atomy uhlíku nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku,

B představuje zbytek —Phe—, popřípadě substituovaný v kruhu halogenem, nitroskupinou, aminoskupinou, hydroxyskupinou, alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku a/ /nebo alkoxyskupinou s 1 až 3 atomy uhlíku,

C znamená zbytek —(L)— nebo —(D) — . Trp—, popřípadě «-N-methylovaný a popřípadě substituovaný na benzenovém kruhu halogenem, nitroskupinou, aminoskupinou, hydroxylovou skupinou, alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku a/nebo alkoxyskupinou s 1 až 3 atomy uhlíku,

D představuje zbytek —Lys—, popřípadě α-N-methylovaný a popřípadě ε-N-alkylovaný alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku,

E znamená zbytek přírodní «-aminokyseliny nebo odpovídající D-aminokyseliny, kterýžto zbytek je popřípadě a-]^-^-^(^^]^ylovaný,

F představuje zbytek —COORi, —CH2OR2,

Rs

Z —CO—N \

R4 nebo

-СО-w—X

Ri znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku,

Ra znamená atom vodíku nebo zbytek fyziologicky přijatelného, fyziologicky hydrolyzovatelného esteru,

R3 znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku,

Rí znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku nebo v případě, že R3 představuje atom vodíku nebo methylovou skupinu, představuje R4 rovněž skupinu vzorce —CH(R5j—X,

Rs znamená atom vodíku, skupinu -(CHaja-OH, skupinu — (СНг)з—OH nebo substituent odpovídající zbytku navázanému na a-uhlík přírodní «-aminokyseliny a

X znamená zbytek vzorce —COORj —CH2OR2 nebo

Re Z —CO-N \

R7 kde

Ri a R2 mají shora uvedený význam,

Re představuje atom vodíku nebo alkylovou skupinu s až 3 atomy uhlíku a

R7 představuje atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, přičemž seskupení —CH(R5j—X má D- nebo· L-konflguraci, a

Yi a Y2 nezávisle na sobě představují vždy atom vodíku nebo oba tyto symboly společně tvoří přímou vazbu, přičemž zbytky v poloze 1 a 6 nezávisle na sobě mají L- nebo D-konflguraci s tím, že zbytky D- a/nebo L-cysteinu jsou přítomny pouze v polohách 1 a 6, jejich solí a komplexů, vyznačující se tím, že se odštěpí alespoň jedna chránící skupina z chráněného přímého nebo monocyklického polypeptidu se sekvencí odpovídající obecnému vzorci I, vzniklý přímý polypeptid obecného vzorce I, v němž Yi a Y₂znamenají atomy vodíku a zbývající obecné symboly mají shora uvedený význam, se popřípadě oxiduje na odpovídající monocyklický polypeptid obecného vzorce I, v němž Yi a Y2 společně tvoří přímou vazbu, a tak to získaný polypeptid se popřípadě převede na svoji sůl nebo komplex.
2. Způsob podle bodu 1 к výrobě polypeptidů výše uvedeného obecného vzorce I, ve kterém

A znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku nebo skupinu vzorce —RCO— kde

R představuje atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, fenylovou skupinu nebo fenylalkylovou skupinu se 7 až 10 atomy uhlíku, nebo skupina vzorce RCO— představuje

a) zbytek L- nebo D-fenylalaninu, který je popřípadě monosubstituován v kruhu halogenem, nitroskupinou, aminoskupinou, hydroxylovou skupinou, alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku nebo alkoxyskuplnou s 1 až 3 atomy uhlíku, nebo

b) zbytek přírodní «-aminokyseliny odlišné od «-aminokyseliny definované výše v odstavci a), nebo odpovídající D-aminokysellny, přičemž aminoskupina zbytků aminokyselin podle odstavců a) a b) je popřípadě monoalkylována alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku,

A‘ znamená atom vodíku,

F představuje zbytek —COORi, —CH2OR2 nebo

R3 Z —CO—N \

R4

Ri, Ri, Rs, R6 а X mají význam jako v bodu 1,

R2 znamená atom vodíku,

R3 znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku a

R7 znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku,

Yi a Y2 společně tvoří vazbu a

B, C, D a E mají význam jako v bodu 1, a jejich adičních solí s kyselinami a komplexů, vyznačující se tím, že se odštěpí alespoň jedna chránící skupina z chráněného polypeptidu se sekvencí odpovídající obecnému vzorci I, v němž Yi a Y2 mají význam jako v bodu 1 a zbývající obecné symboly mají v tomto bodu uvedený význam, popřípadě vzniklý přímý polypeptid obecného vzorce I, v němž Yi a Ya znamenají atomy vodíku a zbývající obecné symboly mají v tomto bodu uvedený význam, se oxiduje na odpovídající monocyklický polypeptid obecného vzorce I, v němž Yi a Y2 společně tvoří přímou vazbu, a takto získaný polypeptid se popřípadě převede na svoji sůl nebo komplex.

21 22
3. Způsob podle bodu 1 к výrobě- polypeptidů obecného vzorce!

H-(D)Ph4,-Cye₎-Ph&-(D)Tr^,p-Ly&-Thr-Cys~F ky nejsou popřípadě spojeny, popřípadě vzniklý přímý polypeptid se oxiduje na odpovídající monocyklický polypeptid shora uvedeného vzorce a takto získaný polypeptid se popřípadě převede na svoji sůl nebo komplex.

ve kterém

F‘ znamená zbytek Leu-ol nebo Thr-ol, a jejich adičních solí s kyselinami a komplexů, vyznačující se tím, že se odštěpí alespoň jedna chránící skupina z chráněného polypeptidů se sekvencí odpovídající shora uvedenému vzorci, v němž cysteinové zbyt-