FI119912B - Kaasumaisen typpioksidin käyttö lääkkeen valmistamiseksi verisuonen uudelleen ahtautumisen hoitamiseksi - Google Patents

Description

Kaasumaisen typpioksidin käyttö lääkkeen valmistamiseksi verisuonen uudelleen ahtautumisen hoitamiseksi

Lausunto liittovaltion tukemasta tutkimuksesta 5 Tähän keksintöön liittyvä tutkimus oli osittain tuettu Yhdysvaltain hallitukselta saadulla rahoituksella (USFHS-apurahat HL42397 ja HL45895). Täten hallituksella on tiettyjä oikeuksia tähän keksintöön.

Keksinnön tausta 10 Tämä keksintö koskee kaasumaisen typpioksidin (NO) käyttöä lääkkeen valmistamiseksi valtimon sellaisen uudelleen ahtautumisen hoitamiseksi, inhiboimiseksi tai estämiseksi, joka johtuu liiallisesta intiman liikakasvusta.

TromboQsi, eli verihyytymän muodostuminen tai läs-15 näolo verisuonen sisällä, voi johtua valtimon seinämän fyysisestä vaurioitumisesta, jonka syynä on verisuoneen kohdistuva intervenfciomenetelmä kuten perkutaaninen trans-luminaalinen sepelvaltimon angioplastia ("PTCA", eräs pallolla tehtävän angioplastian tyyppi) tai sepelvaltimon 20 ohitusleikkaus. Tromboosi voi myös johtua luonnollisen taudin, kuten ateroskleroosin, etenemisestä. Monia eri agensseja, mukaan lukien aspiriini, prostaglandiini El, selektiiviset tromboksaani A->:n inhibiittorit, selektiiviset trombiinin inhibiittorit, verihiutalereseptori GPIIb/ 25 IIIa:n estäjät, plasminogeenin kudosaktivaattori, strepto-kinaasi, hepariini ja kistriini, on käytetty trom-boosilääkkeinä. Katso esim. Yasuda ym, (Circulation 83:1038 (1991)); ja Gold ym. (Circulation (Supplement IV) 83:IV26 (1991)). Tällä hetkellä saatavilla oleviin veri- 30 hiutaleita estäviin aineisiin kuuluvat aspiriini, tiklopi-diini, monoklonaaliset vasta-aineet, nitroglyseriini ja natriumnitroprussidi.

Toinen epäsuotava tulos, joka johtuu siitä että valtimo vaurioituu verisuoneen kohdistuvien interventiome-35 netelroien johdosta, on valtimon uudelleen ahtautuminen.

2

Esimerkiksi PTCA:tä on käytetty laajasti tukkeutuneiden valtimoiden avaamiseen sekä sepelvaltimossa että ääreisverenkierrossa. Vaikka se on alun perin menestyksekäs yli 95 %:ssa tapauksista, asteittainen uudelleen kapeneminen 5 tai uudelleen tukkeutuminen, joka tapahtumasarja tunnetaan nimellä uudelleen ahtautuminen ("restenosis"), tapahtuu kuuden kuukauden sisällä 30 - 50 %:ssa potilaista.

Verisuoneen kohdistuvilla interventiomenetelmillä on taipumus vahingoittaa verisuonen seinämää. Sellainen 10 vaurio laukaisee verisuonen sileiden lihassolujen lisääntymisen, mikä johtaa intiman liikakasvuun. Tämä lisääntyminen voi johtua osittain verihiutaleiden vapauttamien ve-rihiutaleperäisten kasvutekijöiden vaikutuksesta, jotka tarttuvat valtimon vaurlokohtaan, Ylenmääräinen intiman 15 liikakasvu johtaa uudelleen ahtautumiseen, eli valtimon lumenin kapenemiseen uudestaan. Niinpä valtimon uudelleen ahtautuminen voi rajoittaa vakavasti 'verisuoneen kohdistuvien intervehtiomenetelmien pitkän aikavälin tehokkuutta. Keksinnön yhteenveto 20 On havaittu, että sisään hengitetty typpioksidi (NO) -kaasu lisää verisuonen avoimuutta tukoksen liuottamisen jälkeen kriittisen ahtautumisen kohdassa saamatta aikaan mitään systeemisiä hemodynaamisiä vaikutuksia. Si-säänhengitetyn NO:n antitromboottiset vaikutukset kestävät 25 NO:n sisäänhengityksen lakattuakin. On myös havaittu, että sisään hengitetty NO inhiboi liiallisesta intiman liikakasvusta johtuvaa valtimon uudelleen ahtautumista.

Piirteenä keksinnössä on kaasumaisen typpioksidin käyttö lääkkeen valmistamiseksi, jolla voidaan hoitaa, in-30 hifooida tai estää valtimon uudelleen ahtautumista nisäkkäässä, siten että nisäkäs saadaan hengittämään sisään terapeuttisesti tehokas määrä kaasumaista NO:ta. Valtimon uudelleen ahtautuminen voi liittyä tautiin tai vaurioon.

Toinen, yhdiste, joka voimistaa sisäänhengitetyn 35 NO:n edullisia vaikutuksia, voidaan antaa nisäkkäälle yh dessä NO: n sisäänhengityksen kanssa. Yksi keino, jolla 3 toinen yhdiste voisi voimistaa NO: n sisä änheng i t ylt s en edullisia vaikutuksia, on pitkittää s i s äänhengitetyn NO:n vaikutusta kohdekudoksiin tai soluihin, jotka ovat vuorovaikutuksessa kohdekudosten kanssa, ilman että saadaan ai-5 kaan epäsuotavaa systeemistä verisuonten laajenemista ja tästä johtuvaa systeemistä verenpaineen laskua. Erityisemmin, sisäänhengitetyn NO:n intiman liikakasvua inhiboivan vaikutuksen pitkittäminen voidaan saada aikaan antamalla fosfodiesteraasia inhiboiva agenssi yhdessä NO:n sisään-10 hengityksen kanssa (se on: sitä ennen, sen aikana tai heti sen jälkeen). Edullisia fosfodiesteraasin inhibii11oreita ovat ne, jotka inhiboivat selektiivisesti cGMP-spesifisiä fosfodiesteraaseja, samalla kun ne vaikuttavat minimaalisen vähän muiden fosfodiesteraasien aikaansaamaan syklisen 15 adenosiini-3',5'-monofosfaatin (cAMP) hajoamiseen. Edullinen fosfodiesteraasin inhibiittori, jolla ilmenee edellä mainittu spesifisyys, on Zaprinast™ (M&B 22948; 2-o- pr opoks ifenyyl i - 8 - a tsapur i ini - 6 ·· oni, Rhone- Poulenc Rorer,

Dagenham Essex, UK). Muita cGMP-spesifisiä fosfodiesterää-20 sin inhibiittoreita tiedetään ja nämä voivat korvata Zap- rinastinuM.

Toinen keino, millä toinen yhdiste voisi voimistaa NO:n s isäänhengi tyks en edullisia vaikutuksia, on NO:n puoliintumisajan pidentäminen in vivo. Tämä voidaan saada ai-25 kaan esimerkiksi antamalla superoksidi-dismutaasia. Super-oksidi-dismutaasi poistaa superoksidiradikaalit, jotka reagoivat NO:n kanssa.

Toinen antitromboottinen aine, joka voimistaa sisäänhengitetyn NO:n edullisia antitromboottisia vaikutuk-30 siä, voidaan antaa nisäkkäälle yhdessä sisäänhengitetyn NO:n kaiassa. Esimerkkeihin kuuluvat aspiriini, tiklopidii-ni, monoklonaaliset vasta-aineet, nitroglyseriini ja nat-r i uitin i t r oprus s i d i:.

Tässä käytettynä "akuutti iskeeminen sepelvaltimo-35 oireyhtymä" tarkoittaa sepelvaltimon akuuttia tukkeutumista, esimerkiksi akuuttia sydänlihaksen infarktia/ epästa- I

Δ hiiliä angina pectorista, crescendo-tyyppistä antina pec-torista, angina pectorista, välimuotoista sepelvaltimo-oireyhtymää, trombolyysin jälkeistä angina pectoris -tilaa ja PTCÄ:n jälkeistä angina pectoris -tilaa.

5 Tässä käytettynä "antitrombOottinen aine" tarkoit taa ainetta, joka inhiboi trombin muodostumista, stimuloi trombolyysiä, eli tukoksen liukenemista, tai molempia.

Tässä käytettynä "intiman (tai neointiman) liikakasvu" tarkoittaa valtimon sileiden lihassolujen lisäänty-10 mistä intimassa valtimon endoteelin kulumisen tuloksena.

Tässä käytettynä "verenkierron palauttaminen" tarkoittaa veren kuljetuksen alkamista uudelleen osaan nisäkkään ruumista.

Tässä käytettynä "kohdesolut" tarkoittaa ei-15 keuhkosoluja, jotka ovat suorassa vuorovaikutuksessa NO:n kanssa NO:n sisäänhengityksen jälkeen, niin että ne välittävät edullisen vaikutuksen tromboosin tai valtimon uudelleen ahtautumisen inhiboitumisen, estymisen tai hoidon muodossa.

20 Tässä käytettynä "terapeuttisesti tehokas kaasu maisen NO:n pitoisuus" on pitoisuus, joka saa aikaan tietyssä potilaassa yhden tai useamman, seuraavista: rintakivun helpottumisen, hengenahdistuksen helpottumisen, iskee-misten EkG-muutosten häviämisen ja sepelvaltimon verivir-25 tauksen parantumisen (joka voidaan osoittaa angiografiällä) .

Tässä käytettynä "terapeuttisesti tehokas" määrä fosfodiesteraasin inhibiittoria on se määrä, joka lisää kaasumaisen NO:n terapeuttisen vaikutuksen kestoaikaa (eli 3 0 puoliintumisaikaä): tai suuruusluokkaa.

Tässä käytettynä ''tromboosi" tarkoittaa verihyyty-män muodostumista tai läsnäoloa verisuonessa, joka hyytymä voi saada aikaan verisuonen ruokkimissa kudoksissa infarktin tai iskemian.

5 Tässä käytettynä "valtimon uudelleen ahtautuminen" tarkoittaa valtimon lumenin epänormaalia kapenemista liiallisen (neo)intiman liikakasvun tuloksena.

Tässä käytettynä "verisuoneen kohdistuva interven-5 tiomene telinä" tarkoittaa mitä tahansa kirurgista menetel mää, johon kuulua se että verisuonta riko taan anatomisesti: tai sitä häiritään mekaanisesti· Ei-kattavaan luetteloon verisuoneen kohdistuvista interventiomenetelmistä kuuluu pallolla tehtävä angioplastia, laserilla tehtävä, anglo-10 plastia, sepelvaltimokirurgia, aterektomia ja sepelvaltimon stentit.

Tässä esitetyt menetelmät ovat hyödyllisiä hoidettaessa, inhiboitaessa tai estettäessä tromboosia, kuten sellaista joka voi olla tuloksena luonnössa ilmenevästä 15 taudista, esimerkiksi ateroskleroosista, tai verisuoneen kohdistuvasta interventiomenetelmästä, esim. angioplasties ta tai sepelvaitimokirurgiasta. Tässä esitetyt menetelmät ovat myös hyödyllisiä hoidettaessa.'.*· inhiboitaessa tai estettäessä sellaista valtimon uudelleen ahtautumista.» jo-20 ka on tuloksena intiman liiallisesta liikakasvusta. Sellainen valtimon uudelleen ahtautuminen on yleinen komplikaatio, joka liittyy verisuoneen kohdistuviin interventio-menetelmiin, kuten PTCA tai sepelvaltimon ohitusleikkaus.

Tämän keksinnön mukaisesti NO-kaasua voidaan antaa; 25 a) jatkuvasti tai ajoittain, b) tupakansavun poissa ollessa, c) pitoisuutena 0,1 - 3 00 miljöonasoSaä (ppm) , edullisesti 1,0 - 200 miljoonasosaa, ja edullisimmin 20 -100 miljoonasosaa, 30 d): seoksena joka käsittää NO:n, hapen {Oy.) ja ty pen (Ny) tai muita inerttejä kaasuja.:, edullisesti niin että siinä on FiOy (eli Oy:n osuus tilavuudesta) 0,20 -0,99, kun Oy:n osuus ilmassa on 0,21, ja missä NO-kaasu sekoitetaan Oy:ta sisältävään kaasuun hieman ennen sisään-35 hengitystä (esim. alle 5 minuuttia ennen sisäänhengitystä 6 ja edullisemmin alle yksi minuutti ennen sisäänhengitystä) ja e) sellaisella tavalla, että NOsih pitoisuutta, tarkkaillaan ja se pidetään turvallisissa rajoissa (esi-5 merkiksi alle 1 miljoonasosaa), Tämän keksinnön tärkeä etu on se, että sisään hengitetty NQ ei indusoi systeemistä verisuonien laajenemista ja tästä seuraavaa akuuttia systeemistä verenpaineen laskua. Systeeminen verenpaineen lasku on epäsuotava, mahdol~ 10 lisesti vaarallinen sivuvaikutus, joka liittyy pitkittyneeseen, systeemiseen NO:n vapautumiseen sellaisista suun kautta tai laskimonsisäisesti annetuista NÖ-donoriyhdis-teistä, joita on käytetty inhiboimaan, troinboosia tai liiallista intiman liikakasvua.

15 Muut keksinnön piirteet ja edut ovat ilmeisiä seu- raavasta edullisten suoritusmuotojen kuvauksesta ja patenttivaatimuksista .

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio IA on kuvaaja, jossa verrataan aikaa, jonka 20 valtimo on avoinna (prosenttiosuutena koko ajasta) kontrolliryhmän tapauksessa, NO: n sisään hengitystä (nolla miljoonasosaa) ennen, sen aikana ja sen jälkeen, koiraa käyttävässä sepelvaltimon tromboosin mallissa.

Kuvio IB on kuvaaja, jossa verrataan aikaa, jonka 25 valtimo on avoinna (prosenttiosuutena koko ajasta) sellaisen ryhmän tapauksessa, joka hengitti sisään NO;ta (20 miljoonasosaa), NO:n sisäänhengitystä ennen, sen aikana ja sen jälkeen, koiraa käyttävässä sepelvaltimon tromboosin mallissa. Asteriski osoittaa arvoa, joka eroaa merkitse-30 västi perusviivasta (p < 0,05).

Kuvio 1C on kuvaaja, jossa verrataan aikaa jonka valtimo on avoinna {prosenttiosuutena koko ajasta) sellaisen ryhmän tapauksessa, joka hengitti sisään NO:ta (80 miljoonasosaa):, NO:n sisäänhengitystä ennen, sen aikana ja 35 sen jälkeen, koiraa käyttävässä sepelvaltimon tromboosin 7 mallissa. Asteriski osoittaa arvoa> joka eroaa merkitsevästi perusviivasta (p < 0,05)....

Kuvio ID on kuvaaja, jossa verrataan aikaa jonka valtimo on avoinna (prosenttiosuutena koko ajasta) sellai-5 sen i~yhmän tapauksessa, joka hengitti sisään NO: ta (200 miljoonasosaa), NO:n sisäänhengitystä ennen, sen aikana ja sen jälkeen, koiraa käyttävässä sepelvaltimon tromboosin mallissa.

Kuvio 2 on kuvaaja, jossa verrataan käyriä, jotka 10 kuvaavat miten ADP indusoi koirassa verihiutaleiden aggre-goitumista, silmälläpitäen näytteitä jotka on altistettu 0 miljoonasosaa NO:lie tai 400 miljoonasosaa NO:lie.

Kuvio 3 on kuvaaja, jossa verrataan annosvastetuloksi a koskien sisäänhengitetyn NO:n vaikutusta koiran ve-15 rihiutaleiöen aggr ego i tiimi seen.

Kuvio 4 on kuvaaja, jossa verrataan intiman ja keskikalvon suhdetta kontrollirotissa; rotissa:, jotka on altistettu kahden viikon ajan NO:lie (20 miljoonasosaa); rotissa, jotka on altistettu kahden viikon ajan NO*lie (80 20 miljoonasosaa); ja rotissa, jotka on altistettu yhden viikon ajan NO:lie (80 miljoonasosaa), mitä seuraa ilman hengitys yhden viikon ajan- Asteriski osoittaa arvoa, joka eroaa merkitsevästi perusviivasta (p < 0,05).

Yksityiskohtainen kuvaus 25 Valtimon uudelleen ahtautuminen

Keksintö tarjoaa yksinkertaisen, nopean, selektiivisen ja tehokkaan menetelmän sellaisen valtimon uudelleen ahtautumisen hoitamiseen, inhiboimiseen tai estämiseen, joka johtuu intiman liiallisesta liikakasvusta. Liiallinen 30 intiman liikakasvu ja valtimon uudelleen ahtautuminen tapahtuvat usein verisuoneen kohdistuvien interventiomene-teImien jälkeen, kuten mikä tahansa verisuonen angioplas-tia (esim, kaulan, reiden, koronaarisen jne.}; tai mikä tahansa koronaarisen verenkierron palauttamismenetelinä, 35 mukaan lukien pallolla tehtävä angioplastia, laserilla 8 tehtävä angiopias tia, sepelvaltimon phitussiirrännäisen käyttö, a terokt eromi a tai sepelvaltimon stentit.

Sisään hengitettyä NO:ta voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti sellaisen nisäkkään hoitamiseen, jol-5 la on tunnistettu olemassa oleva valtimon uudelleen ahtautuminen. Nisäkkäiden tiedetään ilmentävän monia erilaisia merkkejä ja oireita jotka liittyvät valtimon uudelleen ahtautumisen olemassaoloon, ja nämä voidaan täten tunnistaa.

Sellaisten merkkien ja oireiden tunnistus kuuluu lääkärien 10 taitoihin. Valtimon uudelleen ahtautumisen merkkeihin ja oireisiin nisäkkäässä kuuluvat, näihin rajoittumatta, seuraajat: rintakipu, hengenahdistus, EKG-muutokset ja ko~ ronaariset angiografiset löydökset. Hoidettaessa olemassaolevaa valtimon uudelleen ahtautumista sisään hengitetyllä 15 NO;11a tavoitteena on vähentää uudelleen ahtautuneen valtimon intIraan paksuutta, ja täten lisätä valtimon lumenin halkaisijaa, eli vähentää patologista rakennetta.

Sisään hengitettyä, NO;ta voidaan vaihtoehtoisesti käyttää tämän keksinnön mukaisesti valtimon uudelleen ah-20 tautumisen inhiboimiseksi tai estämiseksi sellaisessa nisäkkäässä (esim,, ihmisessä) , jolla ei ole ennestään valtimon uudelleen ahtautumista, mutta jolla on tunnistettu olevan riski kehittää valtimon uudelleen ahtautuminen.

Tietyt verisuoneen kohdistuvat interventiomenetelmät 25 esim. PTCA ja sepelvaltimon ohitusleikkaus, voivat saada aikaan valtimon vaurioitumisen. Valtimon vaurion tiedetään johtavan liialliseen intiman liikakasvuun ja valtimon uudelleen ahtautumiseen. Niinpä nämä menetelmät tuovat potilaalle valtimon uudelleen ahtautumisen kehittymisen ris-30 kin. Niinpä yksilöitä, jotka ovat käyneet läpi yhden tai ; useamman verisuoneen kohdistuvan interventiomenetelmän, ja yksilöitä joihin kohdistuu yksi tai useampi verisuoneen kohdistuva interventiomenetelmä välittömässä tulevaisuudessa, voidaan vastaavasti edullisesti hoitaa tämän kek-35 sinnon mukaisesti.

9

Sisään hengitetty NO annetaan esimerkiksi sellaiselle ihmispotilaalle, jonka on tarkoitus käydä läpi verisuoneen kohdistuva interventiomenetelmä. Sisään hengitetty NO voidaan antaa ennen verisuoneen kohdistuvaa in-5 terventiomenetelmää, sellaisen intiman paksuuntumisen minimoimiseksi joka tapahtuu valtimon sellaisen vaurion jälkeen, joka liittyy normaalisti verisuoneen kohdistuviin interventiomenetelmiin. Potilaalla, joka saa Sisään hengitettyä NO:ta estävänä toimenpiteenä ennen verisuoneen koh-10 distuvaa interventyömenetelmää, voi olla tai olla olematta olemassa oleva valtimon uudelleen ahtautuminen. Sisään hengitetty NO voidaan vaihtoehtoisesti antaa potilaalle, joka on jo käynyt läpi verisuoneen kohdistuvan interven-tiomene te Intän. Tässä tilanteessa sisäänhengitetyn NO: n an-15 taminen alkaa edullisesti joidenkin tuntien sisällä verisuoneen kohdistuvasta interventiomenetelmästä. Ammattimies ymmärtää tietenkin, että Sisään hengitetty NO voidaan antaa ennen verisuoneen kohdistuvaa interventiomenetelmää, sen aikana tai sen jälkeen. Riippumatta siitä annetaanko 20 Sisään hengitetty NO ennen menetelmää, sen aikana tai sen jälkeen, tai kaikki kolme, Sisään hengitettyä NO:ta voidaan antaa jatkuvasti tai ajoittain.

Sisäänhengitetyn NO:n antaminen

Sisään hengitetty NO annetaan edullisesti varas-2:5.· toidun, kompressoidun NO-kaasun lähteestä. Kompressoitua NQ-kaasua voidaan saada kaupallisesta lähteestä kuten Air-co (Murray Hill, NJ) , tyypillisesti seoksena jossa on 200 - 800 miljoonasosaa NO:ta puhtaassa ^-kaasussa. NO:n lähde voi olla 100 % NO, tai laimennettu N?.: 11a täi millä 30 tahansa muulla inertillä kaasulla (esim, heliumilla). On elintärkeää, että NO hankitaan ja varastoidaan seoksena, joka on vapaa mistä tahansa määrästä fcöntaminoivaa O?:ta tai typen korkeampia oksideja:, koska sellaiset typen korkeammat oksidit (jotka voivat muodostua 02:n reagoidessa 35 NO:n kanssa) ovat mahdollisesti haitallisia keuhkokudoksille, Haluttaessa NO:n puhtaus voidaan osoittaa kemilumi- | 10 nesenssianalyysillä, tunnetuilla menetelmillä ennen potilaalle antamista. NO-Nox-kemiluminesenssianalysaattorit ovat kaupallisesti saatavilla {esim. Model 14A, Thermo Environmental Instruments, Franklin, mä). No-Na-seös voidaan 5 sekoittaa ilman tai 02:11 kanssa esimerkiksi sellaisten kalibroitujen rotametrien läpi, jotka on validoitu aikaisemmin spirometrilla. NO:n lopullinen pitoisuus hengitettävässä seoksessa voidaan varmistaa ammattimiesten hyvin tuntemilla kemiallisella tai kerniluminesenssitekniikalla 10 (esim. Fontijin ym . , Anal. Ghem. 42:575 (1970). NO- ja :Np2-pitDisuuksia voidaan vaihtoehtoisesti monitoroida sähkökemiallisella analysaattorilla. Mitkä tahansa epäpuhtaudet, kuten NO®, voidaan pestä pois altistamalla NaOI-I-liuoksilie, kalsium- ja bariumhydroksidin seokselle tai 15 natronkalkille. Lisäkontrollina voidaan myös: arvioida lopullisen kaasuseoksen FiOa. Haluttaessa ventilaattorissa voi olla kaasunsieppauslaite uloshengitysputkeen kiinnitettynä sen varmistamiseksi, että merkittäviä, määriä NO: ta ei pakene lähiympäristöön.

20 Sairaalassa tai hätätilanteessa kentällä NO-kaasun antaminen voitaisiin saada aikaan esimerkiksi kiinnittämällä tankki kompressoitua NO-kaasua Kb:ssa ja töinen tankki, jossa on happea tai happi/N2-seosta, kaasunaamariin, joka on suunniteltu niin että se sekoittaa kaasua 25 kahdesta lähteestä; säätämällä kaasun virtausta, kummastakin lähteestä, potilaan sisään hengittämän NO:n pitoisuus voidaan pitää optimaalisella tasolla. NO-kaasu voidaan sekoittaa myös huoneilmaan käyttämällä standardinornaista "low-flow"-sekoitinta {esim. Bird Blender, Palm Springs, 30 CA) . NO voidaan tuottaa Naista ja O2:sta (eli ilmasta) käyttämällä sähkökäyttöistä NG-generaattoria, Sellainen generaattori kuvataan Zapolin US-patenttihakemuksessa 07/850 383 ("notice of allowance issued"} joka liitetään täten tähän viitteenä. Lisäksi NO:ta voidaan välittää 35 ajoittain kaasunaamarista. Kaasunaamarin käyttö voi olla 11 erityisen edullista jos NO: n yhteydessä annetaan suun kautta tai inhalaationa fosfodiesterassin inhibiittoria, NO voidaan antaa sellaiselle nisäkkäälle, jolla on tunnistettu olevan valtimon uudelleen ahtautuminen, tai 5 nisäkkäälle, jolla on tunnistettu olevan riski kehittää valtimon uudelleen ahtautuminen, pitoisuutena 0,1 - 3 00 miljoonasosaa ilmassa, puhtaassa hapessa tai toisessa soveliaassa kaasussa: tai kaasuseoksessa, niin kauan kuin tarvitaan. Pitoisuus on edullisesti välillä 1,0 - 200 mil-10 joonasosaa; ja edullisimmin välillä 20 - 100 miljoonasosaa (esim. 30 miljoonasosaa, 40 miljoonasosaa, 50 miljoonasosaa, 60 miljoonasosaa, tai 80 miljoonasosaa). Pitoisuutta voidaan lisätä tilapäisesti lyhyinä ajanjaksoina: esim. 5 min 300 miljoonasosaa NO, kun halutaan välitön, diamaattl-15 nen vaikutus. Jäljempänä selitetyistä syistä samanaikainen hoito fosfodiesteraasin inhibiittorilla voi vähentää tarvittavaa NO:n kokonaisannosta (tai mahdollistaa ajoittaisen annostuksen) jotta saadaan aikaan tyydyttävä uudelleen ahtautumista estävä vaikutus.

20 Valtimon uudelleen ahtautumisen hoitoa, inhibitio- ta tai estämistä varten voi olla välttämätöntä antaa sisään hengitetty NO nenäputkilla, kaasunaamarilla, teltalla, henkitorven sisäisellä katetrilla tai intubaätloput-keila pitkiä aikoja, esim. päiviä tai viikkoja. Antaminen 25 voi olla jatkuvaa pitkän ajanjakson ajan. Antaminen voisi vaihtoehtoisesti olla ajoittaista pitkän ajanjakson kuluessa. Kaasumaisen NO:n antaminen voi tapahtua spontaanilla tai mekaanisella ventilaatiolla.

Sisäänhengitetyn NO:n vaikutuksien arviointi 30 Kun sisään hengitetty NO annetaan valtimon uudel leen ahtautumisen hoitamiseksi, inhiboimiseksi tai estämiseksi, on suotavaa monitoroida NO:n sisäänhengityksen vaikutuksia. Sellaista monitorointia voidaan käyttää tietyssä yksilössä suotavien vaikutusten todentamiseksi ja mahdol-35 listen epäsuotavien sivuvaikutusten tunnistamiseksi, Sellainen monitorointi on myös hyödyllistä säädettäessä tie- 12 tyssä potilaassa sis äänhengi te tyn NO:n annos taso, kesto ja annostiheys.

S i s äänhengi t e tyn NO:ri vaikutukset potilaaseen arvioitaisiin edullisesti yhdellä tai useammalla seuraavis-5 ta: kliiniset oireet kuten rintakipu; elektrokardiografia; verisuonen avoimuuden sarja-analyysi ultraäänellä, sepel-valtimon angiografiällä tai muilla keinoilla; ja cGMP-tasojen lisääntymiset plasmassa tai verihiutaleissa.

Fo s f odi esteraasin iixhibii11orit 10 NO hajoaa nopeasti reagoimalla molekylaarisen ha pen kanssa, jolloin syntyy nitriittiä ja nitraattia. Lisäksi vereen tuleva NO inaktivoituu nopeasti tiukan hemoglobiiniin sitoutumisen vuoksi. Näistä syistä NO:11a on vain lyhyt puoliintumisaika valtimoveressä. Tämä tarkoit-15 taa, että sisään hengitetty NO edullisesti välttää systeemisen verisuonten 1aaj enemis en, epäsuotavan, mahdollisesti vaarallisen sivuvaikutuksen, joka liittyy pitkittyneeseen systeemiseen NO:n vapautumiseen NO-donoriyhdisteistä.

Voi olla suotavaa pitkittää sisään hengitetyn NO:n 20 edullisia vaikutuksia köhäesolujen sisällä tai niiden solujen sisällä, jotka ovat vuorovaikutuksessa kohdesolujen kanssa keuhkossa. Tromboosln inhibition, estämisen ja hoitamisen yhteydessä verenkierron verihiutaleet ovat koh-desoluja. Valtimon uudelleen ahtautumisen inhibition, es-25 tämisen ja hoitamisen yhteydessä verenkierron verihiutaleet (ja mahdollisesti valkosolut) ovat niitä soluja, jotka ovat vuorovaikutuksessa kohdesolujen kanssa verisuonistossa .

Kun analysoidaan keinoja pitkittää sisään hengite-30 tyn NO:n edullisia vaikutuksia, on hyödyllistä ajatella että yksi NO: n vaikutuksista in vivo on liukoisen guany-laattisyklaasin aktivaatio, joka stimuloi syklisen guano-siini-3',5'-monofosfaatin (cGMP) tuotantoa. Ainakin jotkin NO:n edulliset vaikutukset vaikuttavat olevan tulosta sii~ 35 tä että NO stimuloi cGMP:n biosynteesiä. Vastaavasti keksinnön edullisessa suoritusmuodossa fosfodiesteraasin in- 13 hibiittori annetaan yhdessä NO: n sisäänhengityksen kanssa jotta saataisiin inhihitoitua endögeeniste11 fosfödleste-raas.ien aikaansaama cGMP:n hajoaminen.

Fosfodiesteraasin inhibiittori voidaan tuoda ni-5 säkkäälle millä tahansa soveliaalla menetelmällä, mukaan lukien suun kautta, limakalvon läpi, laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihon läpi tai vatsaontelon sisäisesti. Inhibiittori voi vaihtoehtoisesti olla nisäkkään sisään hengittämä. Sisään hengitystä varten fosfodiesteraasin in-10 hibiittori formuloidaan edullisesti kuivajauheena tai aerosolin muotoon saatettuna liuoksena, jolla on partikkelin tai pisaran koko alle 10 um optimaalista alveoleihin antamista varten, ja se voidaan mahdollisesti hengittää sisään kaasussa joka sisältää NO:ta.

15 Edullinen fosfodiesteraasin inhibiittori on Zap- rinasttvi (M&B 22 948; 2-o-propoksifenyyli-8-atsäpuriini- 6-oni; Rhone-Poulenc Rorer, Dagenham Essex, UK). Zap-rinast™ inhiboi selektiivisesti cGMP:n hydrolyysiä samalla kun sillä on minimaalisia vaikutuksia cAMP-:.n hajoami-20 seen verisuonen sileissä lihassoluissa (Trapani ym., J.

Pharmacol. Exp. Ther. 2258:269 {1991); Harris ym. , J.

Pharmago1. Exp. Ther. 249:394 (1989); Lugnier ym., Bio- chem, Pharmacol. 35:1743 (1986); Souness ym., Br. J. Pharmacol. 98:725 (1989)). Kun käytetään keksinnön mukaista 25 Zaprinastia™, edullinen antoreitti on laskimonsisäinen tai suun kautta. Ammattimies voi määrittää soveliaan an-nosälueen. Zaprinastin™ kantaliuos voidaan valmistaa 0,05 N NaÖH:hon. Kantaliuos voidaan sitten liuottaa Ringe-rin laktaattiliuokseen haluttuun lopulliseen Zaprinast™-30 pitoisuuteen juuri ennen käyttöä.

Tätä keksintöä voidaan käyttää muiden fosfodiesteraasin inhibiittoreiden kanssa. Alalla tunnetaan monia erilaisia fosfodiesteraasin inhibiittoreita, mukaan lukien dipyridamDli ja teofyliini. Kuten Zaprinastin™ tapaukses-35 sakin, ammattimies voi määrittää antoreitin ja soveliaan annosalueen.

t 14

Muita autitromboottisia aineita yhdessä sisääiihen-gitetyn NO:n kanssa

Tromboosia voidaan hoitaa aineilla, jotka estävät tukoksen muodostumista, aineilla, jotka stimuloivat trom-5 bolyysiä, eli tukoksen liukenemista, tai molemmilla. Esimerkkejä antitromboottisista aiheista ovat aspiriini, streptokinaasi, urokinaasi, pläsminogeenin kudosaktivaat-tori ("t-PA"), met-t-PÄ (eli t-PA jossa on N-terminaalinen metioniinitähde) , FElX (t-PA-analogi). * hepariini, hirudii-10 ni ja HirulogTM {hirudiinianalogi), Muitakin antitromboot-fcisia aineita voitaisiin käyttää tätä keksintöä käytettäessä, Yksi tai useampi sellainen antitromboo11inen aine voidaan antaa nisäkkäälle ennen sisäänhengitetyllä l\(0:11a Suoritettua hoitoa, sen aikana tai sen jälkeen, niin että 15 niiden erillistä antitromboottista aktiivisuutta käytetään edullisesti sisäänhengitetyn NQ:n antitromboottis{t)en vaikutuksen/·vaikutus ten voimistamiseksi.

Esimerkiksi sovelias t-PA.-annos annetaan ennen NO.;n sisäärihengitystä, sen aikana tai heti sen jälkeen, 20 tromboosin hoitamiseksi. Samalla kun sisään hengitetty Nö .inhiboi tai estää uusien tukosten muodostumista, t-PA stimuloi seuräavien liukenemista: 1) tukosten, jotka ovat jp: läsnä sinä aikana kun sisään hengitetty NO annettiin, tai 2) tukosten, jotka muodostuvat (vaikkakin vähentyneellä 25 nopeudella) NO: n sisäänhengityksen aikana tai heti sen jälkeen. Sellaisten soveliäiden antitromboottisten aineiden valinta, jotka on määrä antaa yhdessä sisäänhengitetyn NO:n kanssa, ja näiden anfcitromboottisten aineiden soveliaan annoksen ja antoreitin valinta voidaan tehdä sinänsä j 30 tunnetulla tavalla.

Edullisesti aspiriini annetaan ennen NO:ή sisään-hengitystä, sen aikana tai heti sen jälkeen, tromboosin hoitamiseksi. Edullinen aspiriinin annosalue on 81 - 325 mg (Suun kautta) per päivä.

15

On ymmärrettävä että yksilöllä voi jo olla, tai Hänellä voi olla riski kehittää, sekä troiaboosi että valtimon uudelleen ahtautuminen.

Kokeellinen informaatio 5 Tromboosikokeet NO m vaikutuksia verihiutaleita vastaan on arvioitu tunnetussa koiraa käyttävässä mallissa, jossa tehdään akuutti sepelvaltimon trombolyysi tukoksen muodostumisen jälkeen. Käytetty koiramalli oli oleellisesti samanlainen 10 kuin on kuvattu artikkeleissa Yasuda ym. (J. Am. Doll.

Cardiol. 13:1409 (1989)) ja Gold ym. (Circulation {suppl.

XV) 83:IV26 (1991)).

25 aikuista sekarotuista koiraa (20 - 25 kg) , jotka edustivat kumpaakin sukupuolta, nukutettiin pentobarbi-15 taalilla (30 mg/painokilo).. Tarvittaessa annettiin lisää pentobarbitaalia yleisen nukutus tilan ylläpitämiseksi. Koirien henkitorvi intuboitiin ja niiden keuhkoja venti-loitiin mekaanisesti 15 hengitysliikettä/min ja 10 - 15 ml/painokilo hengityskoneella, FiCh 21 - 35 % (Hudson Ven-20 tronics, Tenecula, CA) ja säädettiin valtimoveren Ög :.n pitämiseksi 80 - 100 torrissa. Happisaturaatiota monitoroitiin jatkuvasti kokeen aikana käyttämällä pulssioksimetria (Helleor, Inc ., Haywood, CA).

Reisivaltimo ja laskimo kanyloitiin polyvinyyli-25 klpridikatetrilla jatkuvaa valtimopainetta, verinäytteiden ottoa ja infuusiota varten. Lidokaiinia, 0,1 mg/kg/min i.v., annettiin rytmihäiriöiden sattuessa. Rintaontelon avaus suoritettiin vasemmalta viidennen kylkiluun välisestä tilasta. Sydänpussi avattiin ja sydän ripustettiin sy-30 dänpussin varaan. Vasemmanpuoleinen etumainen laskeva valtimo dissektoitiin irralleen ja 2,5 cm segmentti eristettiin distaalisesti ensimmäisestä diagonaalisesta haarasta. Yksi millilitra verta otettiin erilleen tukoksen muodostumista silmälläpitäen. 0,7 mm i.d. katetri sijoitettiin 35 eristetyn vasemmanpuoleinen etumaisen laskevan sepelvalti- mosegmentin sivuhaaraan ja ultraäänianturi (T101 Transonic 16

System, Inc. , Ithaca, NY) sijoitettiin valtimon proksimaa-liseen osaan veren virtauksen jatkuvaa monitorointia varten. 2 mm leveä muovilanka (Mass Gas and Electric Supply, Watertown, MA) kiristettiin asteittain vasemman etumaisen: 5 laskevan valtimon ympärille, aivan distaalisesti ehdotetun tukoksen mmodostumiskohdan suhteen, verivirtauksen rajoittamiseksi 50 ± 10 %;iin perustasosta. Aikaisempi angiogra-finen tutkimus on osoittanut tämän vähentävän lumenin halkaisijaa yli 90 %.

10 Eristetty vasemmanpuoleinen etumainen laskeva se pelvaltimo vaurioitettiin: neljällä peräkkäisellä ulkoisella puristuksella tylpillä pinseteillä 3 - 5 sekunnin ajan endoteelin vahingoittamiseksi ja tukoksen kiinnittymisen edistämiseksi. Tukoksia tehtiin silmukalla distaalisesti 15 anturin ja proksimaalisesti kuristuskohdan suhteen. Trombiini (0,1 ml, 100 U/ml; Thrombinar, Armour Pharmaceutical, Kankakee, IL) sekoitettuna 0,3 ml:aan verta injektoitiin sivuhaarakatetrin kautta tyhjennettyyn sepelvalti-moseginenttiin tukoksen, muodostumisen aikaansaamiseksi. 10 20 minuutin jälkeen oroksimaalinen silmukka irrotettiin. Kaksi minuuttia myöhemmin distaalinen silmukka irrotettiin. Kymmenen minuutin kuluttua tukoksen muodostumisesta annettiin kerta-annoksena hepariini-injektiö (75 UI/kg) laskimonsisäisesti ja sitä seurasi jatkuva hepariinin infuusio 25 (50 UI/kg/h). 30 minuuttia kestäneen stabiilin tukkeutuman ajan jälkeen, rekombinanttisia t-Pa-kerta-annosinjektioita (0,45 mg/kg; Activase, Genentech Inc., South San Francisco, CA) annettiin 15 minuutin väliajoin, kunnes tukkeutuneen sepelvaltimon uudelleen avautuminen saatiin aikaan 30 tai maks imi s saan neljä kerta-annosinjaktiota oli annettu.

Tämä menetelmä sai aikaan vaihtelevia jaksoja uudelleen avautumisia ja uudelleen tukkeutumisia (määritetty alle 25 %:ksi ahtautumisen jälkeisestä virtauksesta) sen jälkeen kun vasemmanpuoleiseen etumaiseen alenevaan sepel-35 valtimoon oli saatu aluksi uudelleen veri virtaamaan. Ava-usajäh/kokönaisajan suhde mitattiin primäärisenä tulos- 17 muuttujana, EKG, systeeminen valtimonpaine, vasemman eteisen paine ja koronaarinen veren virtaus mitattiin jatkuvasti. Eläimet, joilla 1) ei ollut reperfuusiota, 2) re-perfuusio ilman tukkeutumista, 3) alle 3 sykliä ensimmäi-5 sen 45 minuutin tarkkailuajanjakson aikana, tai 4j kuolema ennen ensimmäisen tarkkailu jakson loppua, suljettiin pois jatkotutkimuksista.

NO-kaasua (800 miljoonasosaa NO: ta typessä, Airco,

Murray Hill, N0‘) sekoitettiin huoneilman kanssa käyttämäl-10 lä stanäardinomaista "low-flow" sekoitinta (Bird Blender,

Palm; Springs, CA) ja titrattiin sitten vaihtelevien NO-mäafien kanssa jotta saatiin pidettyä yllä vakio F1O2 juuri ennen ventilaattoriin antoa. Sisäänhengitetyn NO:h tasoa monitoroitiin jatkuvasti: NO-NOx-kemiluminesenssianaly-15 saattorilla (Model 14A, Thermo Environmental Instruments,

Franklin, MA; Fontijin ylti., edellä) . F1O2 mitattiin (hap-pimittari nro 5590:, Hudson, Temecula, California) distaa-lisesti varastopussista sen jälkeen kun NO:ta sisältävät kaasut sekoitettiin. Uloshengitetyt kaasut, samoin kuin ne 20 jotka oli poistettu kerailaminesenssianalys aa t tor is ta, otettiin talteen käytettäväksi uloshehgitysloukulla {"venturi exhalation trap"), joka pidettiin alipaineessa laboratorion keskusalipainejärjestelmän paineistainana. Huoneilman NG/NO2-tasot, mitattuna ajoittain kemiluminesens- !

25 silla, eivät lisääntyneet kokeiden aikana. Kussakin aika- I

pisteessä otettiin näytteitä ja methemoglobiinitasot mitattiin, Sydämen lyöntitiheyttä, verenpainetta ja koronaa-rista veren virtausta monitoroitiin ja mitattiin jatkuvasti.

45 minuutin perustason tutkimusajänjakson ajan: 30 (esikäsittelyäjanjakso) eläimet jaettiin neljään ryhmään: ryhmälle A (n = 6) annettiin 0 miljoonasosaa sisään hengitettyä NO: ta (eli ilmaa) 45 minuuttia; ryhmälle B (n = 6) annettiin 20 miljoonasosaa sisään hengitettyä NO:.ta 45 minuuttia; ryhmälle C (n = 6) annettiin 80 miljoonasosaa si-35 sään hengitettyä NO : ta 45 minuuttia ja ryhmälle D (n = 6 } annettiin. 200 miljoonasosaa 45 minuuttia:. Kaikkia eläin- 18 ryhmiä tarkkailtiin sitten kolmannen tutkimusajänjakson ajan, joka alkoi NO:n antamisen loputtua ja kesti 45 minuuttia (käsittelyn jälkeinen ajanjakso).

Verihiutaleiden kasaantumisen mittaus in vitro 5 8 koirasta kerättiin verta 0,01 M sitraattiin ja sentrifugoitiin huoneenlämpötilassa 37 0 g:n kiihtyvyyde11ä 5 minuuttia verihiutalepitoisen plasman (PRP) valmistamiseksi ja 1 200 g:n kiihtyvyydellä 10 minuutin ajan vähän verihiutaleita sisältävän, plasman (PPP) valmistamiseksi. 10 PRP altistettiin vain muoviastioille tai testauksen aikana silikonoidulie lasitavaralle. PRP:n verihiutalelaskenta (verihiutaleiden läskentalaite Thrombocounter C, Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL·) säädettiin laimentamalla PPP:tä, jolloin saatiin 300 000/mm3 ± 10 %. PRP jaettiin 15 sitten kyvetteihin, joita inkuboitiin 37 öC:n lämpötilassa magrieettisekoittajalla (1000 rpm) kaksikanavaisella aggre~ gömetrillä (Model 440, Chrono-Log Corp., Havertown, PA). Valon läpäisy mitattiin jatkuvasti mittauslaitteella (Model 707, Chrono-Log Corp., Havertown, PA). Aggr egaa t ionäy-20 peputki tukittiin kumitulpalla ja kaksi 19 gaugen neulaa (Sherwood Medical, St. Louis, MO) sijoitettiin tämän tulpan läpi, mikä mahdollisti NO-kaasun ja hapen seoksen antamisen PRP: n yläpuolelle. Sisäänsyöttöneula kytkettiin virtausmittarin kautta kaasusäiliöön, johon pantiin Nö-25 kaasun, ilman ja hapen seos, joka oli titrattu edellä kuvatulla tavalla. NO-konsentraatiota monitoroitiin jatkuvasti NÖ-NOx-kemiluminesenssianalysaattori11a. Neulavent-tiili mahdollisti virtauksen säätelyn näytteen läpi noin nopeuteen 40 ml/min. Positiivista painetta pidettiin yllä 30 järjestelmässä niin että ulostuloneula oli kytketty vas-taanottosäiliöön, johon oli pantu 5 cm vettä, jossa pidettiin yllä jatkuvaa kuplintaa.

ADP: rt indusoimaa verihiutaleiden aggr egaa t i o t a mittaavia tutkimuksia suoritettiin sen jälkeen kun testi-35 kyvetti, joka sisälsi 450 μΐ sovitettua PRP:tä, altistettiin NO-kaasuseokselle 10 minuutin ajan. Kaasun antamista 19 jatkettiin ADP:n indusoiman aggregoitumisen mittauksen aikana. Verihiutaleiden aggregoitumista tutkittiin käyttämällä eri PRP-eriä, joita oli käsitelty 20, 80, 200 ja 400 miljoonasosalla NO:ta, satunnaisessa järjestyksessä. Ennen 5 ja jälkeen NO:n antamisen, PRP-valmisteen stabiiliuden arvioimiseksi tutkittiin kontrollina ADP;n indusoimaa verihiutaleiden aggregoitumista ilman NO;ta. Kaikki kokeet vietiin loppuun 4 tunnin sisällä veren keräämisestä.

Tulosten analysointi 10 Valtimon avoimuus määritellään sinä osana koko tarkkailuajankohdasta, jonka aikana virtaus oli yli 25 % perusvirtauksesta sen jälkeen kun alkuperäinen ahtautuminen saatiin aikaan. Ellei toisin ilmaista, tulokset ilmaistaan keskiarvona + keskiarvon keskivirhe. Ryhmien vä~ 15 listen erojen merkitsevyys määritettiin Studentin. t-testillä parillisille ja parittomille arvoille, soveltuvuuden mukaan, ADP:n indusoimaa verihiutaleiden aggregoi-tumista koskevan NO:n vaikutuksen annqsresponssin merkitsevyys arvioitiin kaksireunaisella varianssianalyysillä.

20 p-arvoa < 0,05 pidettiin merkitsevänä.

Koiraa käyttävän trombolyysi- ja reperfuusiomallin tulokset

Kussakin kokeellisessa ryhmässä ulkoinen kuristin vähensi vasemmanpuoleisen etumaisen laskevan valtimon ve~ 25 ren virtausta 54 ± 2 % perusarvosta, 22 ± 2:sta 10 ± 1:een ml/min. Niiden tPA-kerta-annos ten mediaani lukumäärä,; jotka tarvittiin saamaan aikaan reperfuusio, oli kaksi, välillä 1-4 (taulukko 1), Syklinen uudelleenvirtaus ja uudelleen tukkeutuminen, mihin liittyi elektrokardiografisiä todis-30 teitä sydänlihaksen vaurioitumisesta, tapahtui kaikissa eläimissä, paitsi: yhdessä missä uudelleen tukkeutumista ei tapahtunut; tämä eläin poistettiin jatkotutkimuksesta.

20 a fl m* I ·· VD <Ti OO m £3 0 «3 - 0 0¾ - ~s-o n H - Μ <r> m m 0 B H a oh +1 n H flj 41 +1 +1 +t :g g m +1+1 in +1 E 0 ID 10 vo cm cn vo flora n- 0 vd - * - t- cm S>,a a d M' · cnHinosn cm fl '—” in cm h m a1 h cm o t m m a CD m ~ d a o moi'. 0 ΰ O fl - m m - - 0 r 0 *· m1 . * h cm in 0 3 ; u ·η θ o m -H m ™ H 8 +1 4! +! 41 1 fl — -H +1 co +1

Esaa vo vo cMcoo ra

.2 fl Id II * CD VO >· * " t" H

H So SI ö H - ΓΠ CM CO fl E" £|. K «s 0 in «h oi m a h cm 0 m---—— -----—.—------ s ai tn m ft a co vo h R d t> o cn 0

Ö 0 fl - M O

Π a) o '* £3 - *3« i~t VO m 0 fl -H ffl *0 O OH 41 cm fl fl H j§ +1 -H 4) 41 fl fl :at fl .— 41 41 co 4!

H ® 0 Ö a VO CM 1Π VJ Oi O

fl s fl a it c- ov *· - .- m h a a >ιθ ra β in - h r- 0 fl σι ^ h w CM 0 -- tn H CM CM ΙΠ H OI O ; a..........L------— ft rt f i R 10 m1 ] ® a m r- 1 t: fl a LT) H m ' H j

5 0 fl -- fl · ~ H - I

‘j* o " m * vo h aa in 0 g1 «joo σ H 41 tn Q -n K 41 41 41 41 ^ ig r4 41 +1 VD 41 2 s fl a vo r- o e-- cm m

*" fl g a il O OI -- - H CM

P* S B ti H - h tn in m P -; « KO 0 " m cm cm cm tn H m o

Pf __. ______________ _ ___ Ή i dp 1 k 1-4m i fl =a ή m e a> -n m e o a a d 3 d :fl a 'ö a d a α q k ή h k a α a a .a fl a

fl IS li® Ui ύ —.rH

ft -H -rl fl a E fl - fl R iTSm — S

E > A α A A Λ A» Ό fl k g i

A fl ® hi; <1 # - \ - I

A A R a a m — tn fl =a s fl 3 a d fl fl ^ m E Λ En fl s a a d a 1 H τι —· -h 3 o di 5 a -u-Hd—adHOfl maha s ή fl cu 3 a ft a u h a fl a fl H a i g ^ fl a fl αα (M! ft en in > fl -- S |

Li; ,;:;..rr;:;,-rr-^ " A-‘“..... =; ........ ... *" rr·:.,,,,.!.^' 1 -- $ ! } 21

Taulukossa 1: "tPA-kerta-annosten lukumäärä" viit taa injektoitujen kerta-annosten lukumäärään; 11 ACT” viittaa aktivoituun hyytymisaikaan, "FiCh" viittaa sisäänhen-gitettyyn O2-fraktioon; "Suhde" viittaa tukkeutumattomaan/ 5 tukkeutuneeseen sepelvaltimoon perusviivalla; ''verihiuta-leiden lukumäärä’' vi it taa verihiutaleiden lukumäärään; ja "Metl-Ib” viittaa methemoglobiiniin (prosenttiosuus kokona i shemoglobi inistä). Perusviivan virtausnopeuksien suhteilla ei ole merkitsevää eroa seuraavien ryhmien välillä: 10 0 miljoonasosaa {kontrolli), 20 miljoonasosaa, 80 miljoo nasosaa ja 800 miljoonasosaa Sisään hengitettyä NO:ta (n = 6 kullekin ryhmälle).

Sisäänhengitetyn NO:n vaikutus valtimon avoimuuteen 15 Eläimillä, jotka saivat 0 miljoonasosaa sisään hengitettyä NO:ta (ryhmä A), valtimon avoimuus ei muuttunut kolmen käsittelyjakson aikana (kuvio IA) . Eläimillä, jotka saivat 20 miljoonasosaa sisään hengitettyä NO: ta (ryhmä B) valtimon avoimuus kasvoi 50,6 ± 6,9 %:sta sisään 20 hengitystä edeltävän perustason ajanjakson aikana 63,8 ± 7,9 %:iin sisäänhengitysäjänjakson aikana (p < 0,01) (kuvio IB) . Eläimillä, jotka saivat 80 miljoonasosaa sisään hengitettyä NO:ta (ryhmä G), valtimon avoimuus kasvoi 48,8 ± 2,9 %:ista sisään hengitystä edeltävän perustason ajan-25 jakson, aikana 75,1 + 6,7 %:iin sisäänhengitysajanjaksQn aikana (p < 0,01) (kuvio 1C), Eläimillä, jotka saivat 200 miljoonasosaa sisään hengitettyä NO:ta (ryhmä D), valtimon avoimuus kasvoi 45,27 ± 5,6 %:sta sisään hengitystä edeltävän perustason ajanjakson aikana 54,8 ± 10,4 %:iin si-30 säänhengitysajarijakson aikana (p = ei merkitsevä) (kuvio

ID) . Ryhmässä C lisääntynyt valtimon avoimuus, joka havaittiin NO:n inhalaatioajänjakson aikana, pysyi yllä si-säänhengitykseh jälkeisen 45 minuutin ajanjakson aikana (70,1 ±7,1 % verrattuna perustasoon, p < 0,05). I

35 Kun sisäänhengitysajänjakson aikaiset valtimon avoimuutta koskevat tulokset ryhmistä B, G ja D yhdistet- 22 tiin, yhdistettyjen käsittelyryhmien ja kori tr o 11 ί ryhmi en välillä oli tilastollisesti merkitsevä ero (p < 0,005). Kun sisään hengitystä: seuraavan 45 minuutin ajanjakson aikaiset valtimon avoimuutta koskevat tulokset ryhmistä B, C 5 ja D yhdistettiin, yhdistettyjen käsittelyryhmien ja kontrolliryhmän välillä oli myös tilastollisesti merkitsevä ero (p < 0,005) .

Verihiutaleiden lukumäärä tai veren hemoglobiini eivät muuttuneet NO: n antamisen aikana tai sen jälkeen 10 missään eläinryhmässä (taulukko 3). Methemoglobiinitasot kasvoivat 0,2 ± 0,1 %:sta 1,1 ± 0,4 %:iin koirissa, jotka hengittivät 200 miljoonasosaa Sisään hengitettyä NO: ta (taulukko 3). Tämä lisäys pysyi yllä sen jälkeen kun NO:n antaminen lopetettiin, eikä sitä nähty koirissa, jotka 15 saivat alempia annoksia NO:ta.

Systeeminen vaitimonpaine aleni kaikissa koiraryh-missä tässä tutkimuksessa eikä se eronnut niiden koirien välillä, jotka saivat NO:ta, ja niiden koirien jotka eivät saaneet (taulukko 2A) , Vasemman eteisen paine oli muuttu-20 maton kaikissa eläinryhmissä koko tutkimuksen ajan (taulukko 23) .

23

Taulukko 2Ά

Systeemisen valtimonpaineen (SAP) (mmHg) keskiarvo ennen KfOsn s i säähhengitystä, sen aikana ja sen jälkeen NQ~käs i ttely_ Ennen__Aikana__Jälkeen 0 miljoonasosaa NO:ta 89 ± 8 82 ± 6 80 ± 7 (n = 6)

Ryhmä A_________ 20 miljoonasosaa NO:ta 105±6 96±6 82±6 (n = 6)

Ryhmä B_____ 80 miljoonasosaa NO:ta 91 ± 5 81 + 9 78 ± 7 (n = 6)

Ryhmä C____ 200 miljoonasosaa 94+3 95 ± 4 93 ± 4 NO: ta (n - 6)

Ryhmä D [lii 5 Arvot ilmaistaan keskiarvoina ± keskiarvon keskivirhe

Taulukko 2B

Vasemman eteisen paineen (LAP) (mmHg) keskiarvo ennen NO:n sisäänhengitystä, sen aikana ja sen jälkeen NO-käsi t hely __Ennen__Aikana__Jälkeen 0 miljoonasosaa NO:ta 5,5 ± 0,6 5,4+0,7 5,4+0,7 (n = 6)

Ryhmä A_______ 20 miljoonasosaa NO:ta 5,2 ± 1,6 4,7 ± 1,4 4,6 ± 1,1 (n - 6)

Ryhmä B__________ 80 miljoonasosaa NO:ta 5,3 ± 0,6 5,2 ± 0,6 4,9 ± 0,6 {n - 6)

Ryhmä C____ 200 miljoonasosaa 4,6 ± 1,1 4,2 + 0,9 3,7 + 0,8 NO: ta in s; 6)

Ryhmä D__ 10

Arvot ilmoitetaan keskiarvoina ± keskiarvon keskivirhe: t 24 NO ίΐϊ vaikutukset ADI? :n indusoimaan verihiutaleiden aggregoitumiseen in. vitro :NO:m lisäys kaasuseokseen (;'20, 80, 200 ja 400 miljoonasosaa) PRP:n yläpuolelle johti annokseen liittyvään 5 vähenemiseen ADP:n aikaansaaman valon transmission maksimaalisessa muutoksessa {kuvio 3), Kahdessa kontrolliaggre-gaatiokäyrässä, jotka suoritettiin kunkin tutkimuksen alussa ja lopussa, ei ollut muutosta ADP:n indusoimassa valon transmission alenemisessa (30,57 + 5,57 % verrattuna 10 31,1 ± 4,31 %).

25 Τ" (Μ ίο Η ^ 03 Ο - Η π> OLO' MD - Ο Ο- - « d m ο HQ no μ ai ή +!' 3 a) +! +] η +ι +ι +] +ι Q -y 'cm h „i H ~ \o ra +1 rn h - mm O- - m - H O -

pj Ha H CM O CM «OH CM O

a>---—-----— m rt -co i> m *t~! " H CM - H ' o m - o cv - o cv -ra m o oi Q m o jä fij +! +1 Ή HS {h +1+1 +1 +Ϊ +1 +! jä id· i> !> m rt X - ra* cm - m -ai - oi ra*

HS ·Η Π EC - Oi VO - H M

rtj H CM O H CV Q H CV O

d--—--- Φ ra tn m cv co ra

“ - - - H - H

std h tn o o m - o m 4J in cv o m o p +i +i +i +s S>i d +i +ί Ή +1 +1 +J a> oa rv m o en -H β - h cv - (Ί ri - f- CM Öi p m 0--31 m - v r- -

O d (¾ H m or-i CM Q H CM O

,¾ Q) ! _;__________ f , \ , rH »Π3 <-t *-f rj S fn M S' .3

H 3 P P P

B m M ^ "» *—” Γ-* *">· r-ί h P tn m n P ei

0 Hl E 0) E JS

” *0 g T) E 'ö E

M -H _ -rt *-v_ Ή H su h ta rn ci) rt

1 — HO — r-l O — HO

H 1—t SJ H — H IÖ rl - rf lj H r,

H -Ö JJ X οψ Tj JJ X oV> Ti JJ 14 dP

E ra ---. p ·— — 'v.p"'-' *--- p g <3 m -h tn -h tn -h ® ra E P '«ί fl E Λ ;ΐί Λ E Ä tm Λ

+) *— -H M K -— -rt M ffi -H P M

ti +j s-s >ra +) n >iö +j M tns jj P -n ,q tu »ra οι λ o) =ra ra Λ ra =ra o» g k S > e ss S > e s w > e s $---—-™——- -o J3 ra „ 50 o

Ή H

ö) ra ra o ra ra ra ^ : ra m ra o ; m 0 0 ti i tn o ra ra § ; h ra ra ra S ra ra e ö J , jj a o o K 4J o o o

•H O <1 -n ffl -r-ι O

10 Ό 1—t Ή sfö t—s =rd — h ra «a -rt ra -ra — 11 -H E m EiJEifl E υ E vo s E n · -3 11 - £ il O Sd ooirtö o g >, p & o ai - cv £ « —- o S tt! ^ 26

Edellä mainitut tulokset osoittavat, että sisään hengitetty NO lisää sepelvaltimon avoimuutta tukoksen hajottamisen jälkeen kriittisen ahtautuman kohdalla tuottamatta mitään systeemisiä hemödynaamisia vaikutuksia. Ne 5 osoittavat myös, että sisäänhengitetyn NO tn anti tromboot-tiset vaikutukset säilyvät ainakin 45 minuuttia NO:n si-säänhengityks en loppumisesta. Niillä NO-pitoisuuksilla jotka ovat samanlaisia kuin in vivo saadut, kaasumainen NO inhiboi merkittävästi ADP;n indusoimäa Verihiutaleiden: ag-10 gregaatiota in vitro.

Intiman 1iikakasvukokeet

Neointiman sileän lihassolun liikakasvu on tärkein patologinen tapahtumasarja ihmisen valtimon uudelleen ahtautumisessa. Niinpä, jotta saataisiin selville, mikä vai-15 kutus uudelleen ahtautumisen prosessiin sisään hengitetyllä NO: Ha on verisuprieen kohdistuvan interventiömeuetel-män, kuten FTCA:n, jälkeen, tutkittiin sisäänhengitetyn. NO:n vaikutusta intiman liikakasvuun käyttämällä rotan yhteistä päänvaltimoa käyttävää valtimovaurion mallia (Clo-2 Q wes ym., Laboratory Invest. 49:327 (1983)), standardi- eläinmallia ihmisen neointimän sileän lihassolun liikakasvulle .

Valtimovaurio

Aikuiset urospuoliset Sprague-Dawley rotat (Char-25 les River Laboratories, Wilmington, MA) kävivät läpi yhteisen päänvaltimon pallovaurion tavalla, jonka on aikaisemmin osoitettu saavan aikaan neointiman liikakasvua (Clpwes ym. , edellä). Rotat, jotka painolvat 300 - 350 g, nukutettiin antamalla vatsaontelon sisäisesti ketamiinia 30 (60 - 80 mg/kg) ja asepromatsiinia (0,1 mg/kg) . Kun oli kerran saatu aikaan tyydyttävä anestesia, tehtiin pitkittäinen keskiviivan viilto ja vasen päänvaltimo eristettiin tylpällä dissektiölla. Sen jälkeen kun sisäisen ja ulkoisen päänvaltimon haarauma oli vielä dissektoitu huolelli-35 sesti, distaalinen ulkoinen päänvaltimon segmentti liga-toitiin 4-0 silkkiompeleella. Pieni valtimon avaus tehtiin 27 ulkoiseen päänyaltimoon käyttämällä mikrodissektiosaksia, ja "2 French Fogarty1' -pallokatetri (Baxter .Edwards LIS) työnnettiin valtimonauauksen läpi ja ’vietiin noin kahden senttimetrin päähän yhteisen päänvaltimon haar aumasta.: 5 Pallo täytettiin r.iihyvällä määrällä suolaliuosta, jotta saatiin aikaan näkyvä laajeneminen yhteisessä piänvalhimossa, jä vedettiin hellävaraisesti haaraumah tasolle. Pallokatetri vedettiin sitten pois ja sen jälkeen kun oli annettu veren vuotaa takaisin valtimonavauskohdan läpi ID mahdollisen tukoksen ja ilmakuplien poistamiseksi, ulkoinen päänvaltimG ligatoitiin proksimaalisesti Valti-monavauskohdasta käyttämällä 4-0 silkkiompeleita. Sen jälkeen kun oli tutkittu visuaalisesti yhteisen päänvaltimon riittävän sykkimisen varmistamiseksi, kirurginen vaurio 15 suljettiin ja eläinten annettiin toipua anestesiasta. Krooninen MO:n sisäänhengitys

Krooninen NO:n sisäänhengitys suoritettiin erityisesti valmistetuissa 40 litran akryylisissä inha laa ti okain-mioissa. KaasuseokSet sekoitettiin käyt t jämällä erikseen 20 säädeltyjä ja kalibroituja virtausmittareita happi-, paineilma- ja NÖ-kantakaasuille (800 pm ja 10 000 miljoonasosaa NO:ta N2.iss.a-, Airco, Murray Hill, NJ), Kammiosta ulos virtaava kaasu analysoitiin ajoittain koko kokeen ajan stabiilien FiCk- ja NO-tasojen varmistamiseksi. F1Q2 mi-25 tattiin käyttämällä polarografista elektrodia (Hudson Oxygen Meter 5590, Temecula, CA); NO-pitoisuus mitattiin kerni luminesens s ilia (Model 14A, Thermo Environmental Instruments, Inc., Franklin, MA); ja typpidioksidi ja typen korkeammat hapetustilat (NOx) mitattiin kemiluminesenssilla 30 sen jälkeen kun NOx oli muutettu NO:ksi kuumennetussa, ruostumattomasta teräksestä valmistetussa uunissa (850 °C) 98 % tehokkuudella (Malli 10 OB NOx-generaattori, Thermo

Environmental Instruments, Inc., Franklin, MA) . Tuoretta natronkalkkia pidettiin kammioissa NOK:n pelkistämiseksi. 35 NO-pitoisuus pidettiin 20 - 80 miljoonasosan pitoisuudessa kokeesta riippuen. Mittaussarjät paljastivat FiO:>:n olevan 28 21 % ja N0C: n olevan 3-4 miljoonasosaa, Alt istuskanani -öistä poistuvat kaasut, samoin kuin ne jotka poistuivat kerniluminesenssi-laitteesta, otettiin taiteen käyttämällä kuristusloukkua, joka pidettiin alipaineessa käyttämällä .5. laboratorion keskusalipainejärjestelmää.

Kontrollieläimet pidettiin suodatetuissa näkeissä samassa huoneessa kuin NO-käsitellyt eläimet, NO-altistus alkoi 30 - 120 minuuttia ennen kirurgiasta toimenpidettä, kirurgian aikana :M>-käsitelty ryhmä otettiin pois kammios-10 ta ja altistettiin NO:Ile modifioidulla; naamarilla, johon syötettiin kaasua kammioiden kaasunsyöttöputkista. Sisään-heng.it e tyn kaasun analyysi paljasti NO-tasot 50 - 80 miljoonasosaa 80 miljoonasosan kokeiden aikana ja 10 - 20 miljoonasosaa 20 miljoonasosan kirurgisten kokeiden aika-15 na, Kunkin eläimen kokonaisaika, jonka se vietti ulkona kammiosta ja naamarin alla, oli 20 - 40 minuuttia.

Morfometrinen analyysi 1, 3 ja 14 päivää pallolla tehdyn vaurion jälkeen rotille tehtiin eutanasia antamalla tappava: vatsaontelon 20 sisäinen injektio natriumpentobarbitaalla tai ketamiinia.

”16 gauge" -katetri vietiin nousevaan aorttaan vasemman kammion kärjen kautta. Laskeva rinta-aortta ligatoitiin.

Eläin perfusoitiin sitten paineella 1GQ mm Hg 100 ml:11a normaalia suolaliuosta, jota seurasi 50 ml 2 % paraformal-25 dehydiä fosfaattipuskuroidussa: suolaliuoksessa (PBS). 15 -30 minuutin in vivo fiksaation jälkeen molemmat yhteiset päänväitimot eristettiin ja ne pantiin edelleen yön yli kestäyöintiin upottamalla 1 % parafofmaläehydiliuokseen PBSissä, Kudos dehydratoitiin käyttämällä asteittain nou- ; 30 savia etanolipitoisuuksia, mitä seurasi ksyleeni, ja sitten upotettiin parafiiniin. Poikki leikkeitä (6 μιη) leikattiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja/tai elastiinilla analyysiä varten. Kussakin eläimessä analyysiin käytettiin yksittäinen leike, joka oli 7 - 8 mm prok-35 simaalisest.i päänvaitimon haarautumasta. Analysoitava leike valokuvattiin 100 x suurennoksella. Kuva digitoitiin 29 käyttämällä Kodak 2135™ skanneria, Intiman ja keskikalvon alueiden analyysit suoritettiin Power Macintosh 8100/80™ tietokoneella käyttämällä NiH;:n public domain -ohjelmaa (kirjoittanut Wayne Rasband, UiS, National Institutes of 5 Health, saatavilla internetistä anonyymillä ftp:llä osoitteesta zippy. nimh, nih, gov tai levykkeellä. :NTIS:stä, 5285 Port Royal Rd, , Springfield, VA 22151; osa numero PB93-504868) . Morfometrisen analyysin suoritti tutkija, joka oli sokko koeryhmään nähden, 10 Tilasto-analyysi

Tilastoanalyysit suoritettiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa Statview™ (Abacus Concepts) ohjelmaa Macintosh™ tietokoneille. Koeryhmää verrattiin kontrolliryhmään käyttämällä paritonta kaksireunaista t-15 testiä. Arvoa F < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä. Kaikki tulokset esitetään keskiarvona ± keskiarvon keskivirhe, n-arvo viittaa eläinten lukumäärään per ryhmä.

Tulokset jyrsijöitä käyttävästä uudelleen ahtautumisen mallista 20 Kaikkiaan 62 rottaa kävi läpi päänvaitimon vaurio- mallin. Rotista viisi kuoli johtuen verisuonikomplikaati-oista valtimonavauksen tai pallolla tehdyn vaurion aikana;, mikä antoi menetelmälle: mortal i teet tiasteeksi 8 %. Eri koeryhmien välillä ei ollut tilastollisesti merkitsevää 25 vinoutumaa kuolemien jakautumassa. Niiden 57 rotan keskuudessa, jotka selvisivät alkuperäisestä menetelmästä, ei ollut menetelmän jälkeisiä kuolemantapauksia. Kaikki rotat, riippumatta niiden koeryhmästä, osoittivat normaalia itsensä puhdistamiskäyttäytymistä ja aktiivisuustasoja ko-30 ko tutkimuksen ajan. Lukuun ottamatta satunnaista laskeumaa ("ptosis") päävaltimon vaurion puolella, millään rotalla ei ollut näkyvää neurologista vikaa. Koeryhmien alajoukon analyysi paljasti painon nousun ilman tilastollista eroa ilmalle, NO:lie (20 miljoonasosaa) ja NO·:Ile. 35 (80 miljoonasosaa) altistuksen aikana.

30

Ensimmäisessä koesarjassa rotat jotka olivat käymässä läpi pallolla tehdyn vaurion, altistettiin joko huoneilmalle (n = 12) tai 80 miljoonasosalle MO:ta (n = 13) ilmassa koko tutkimuksen ajan. Eläimet uhrattiin 14 päivää 5 vaurion jälkeen vaurioituneen päänvaltimon morfometristä analyysiä varten. Tutkimus valomikroskoopilla paljasti, että kolmella rotalla ilma (kontrolli} -ryhmästä ja yhdellä rotalla MO-käsitellyssä ryhmässä oli tromboottinen tukkeutuma vaurioituneen päänvaltimon lumenissa. Nämä eläimet 10 suljettiin pois jatkoanalyysistä. Molemmista ryhmistä peräisin olevissa verisuonissa näkyi odotetusti endoteelin katoamista ja neointiman liikakasvun kehittymistä. Valo-mikroskopiatutkimus ei paljastanut kvalitatiivista eroa neointiman solumorfologiassa (tuloksia ei esitetä). Kvan-15 titatiivinen analyysi paljasti kuitenkin, että käsittely sisään hengitetyllä NO:11a (80 miljoonasosaa) sai aikaan neointiman liikakasvun 38-prosenttisen inhibition, se on: intima/kesfcikalvo-suhde 0,932 ± 0,13 80 -miljoonasosan eläimissä, verrattuna 1,512 ± 0,147:ään 0 miljoonasosan NO 20 (kontrolli) eläimissä {P = 0,008) (kuvio 4).

Beuraavassa koesarjassa testattiin yhden viikon altistuksen vaikutusta NÖ.rhon, Koeryhmä (n = 7) altistettiin 80 miljoonasosalle NO:ta seitsemän päivän ajan ja siirrettiin sitten äimään vielä seitsemäksi päiväksi, en-25 nen uhraamista,: Kontrolliryhmä (h = 5} altistettiin ilmalle koko 14 päivän ajan. Ryhmien välillä ei ollut kvalitatiivista morfologista eroa. Lisäksi intiman/keskikalvpn suhteen kvantitatiivinen analyysi ei paljastanut merkitsevää eroa neointiman liikakasvussa kahden ryhmän välillä, 3:0 se on: X,D59 ± 0,239 NÖ-käsitellyissä eläimissä, verrattuna 1,217 ± 0,309:aan kontrolleissa. (P = ei merkitsevä) (Kuvio 4).

Kolmannessa koesarjassa tutkittiin matalampaa Sisään: hengitettyä NÖ-tasoa:: rotat hengittivät joko 20 mil-35 jopnasosaa NO:ta (n = 8) tai ilmaa (n = 8) . 2 ryhmän, välillä: ei taaskaan voitu löytää kvantitatiivista tai kvali- 31 tatiivista eroa neöintiman liikakasvun asteessa, se on: intiman/keskikalvon suhde 0,917 ± 0,233 20 miljoonasosalla NO:ta käsitellyille eläimille, verrattuna 0,985 ± 0,149:ään ilmaa hengittäville kontrolleille (P = ei mer~ 5 kitsevä) (kuvio 4).

Edellä mainitut tulokset osoittavat, että 80 miljoonasosan NO:n sisäänhengittäminen kahden viikon ajan inhiboi merkitsevästi neöintiman liikakasvua pallolla aikaansaadun yhteisten päänva11imoiden vaurion jälkeen jyr-10 sijämallissa.

Muut keksinnön suoritusmuodot ovat seuraavissa patenttivaatimuksissa.

| j j | i

Claims (15)

1. 32
2. 1. Kaasumaisen typpioksidin {KO) käyttö lääkkeen valmistamiseksi valtimon sellaisen uudelleen ahtautumisen 5 hoitamiseksi tai estämiseksi, joka johtuu liiallisesta in-timan liikakasvusta nisäkkäässä.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö.,· tunnettu siitä, että hoito tai estäminen tehdään menetelmällä, joka käsittää vaiheen, jossa tunnistetaan nisäkäs, jol- 10 la on olemassa valtimon uudelleen ahtautuminen tai jolla on riski kehittää valtimon uudelleen ahtautuminen.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu nisäkäs on ihminen.
5. 4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen 15 käyttö, tunnettu siitä, että mainittu nisäkäs on käynyt läpi tai valmistautuu käymään läpi verisuoneen kohdistuvan interventiomenetelmän,
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu verisuoneen kohdistuva inter- 20 ventiomeneteimä valitaan ryhmästä, joka koostuu angiqplas-tista, sepelvaltimokirurgiasta ja sepelvaltimon stenteistä.
7. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu menetelmä on perkutaaninen transluminaalinen sepelvaltimon angioplastia (PTCA).
8. 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu NO hengitetään sisään ennalta määrätyllä pitoisuusalueella.
9. 8. Patentt.ivaatimuksen 7 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu pitoisuusalue on Q,1 ppm - 300 ppm.
10. 9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 8 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu kaasumainen NO sisäänhengitetään seoksena, joka käsittää NO-, O?- ja N2-kaasu j a. 1Q . Patenttivaatimuksen 9 mukainen käyttö, t. u n - 35. e t t u siitä, että mainittu seos käsittää 20 - 99 tilavuusprosenttia Qo-kaasua. 33
11. 11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen .käyttö:, tunnettu siitä, että mainittu Cb sekoitetaan mainitun Nö:tn kanssa juuri ennen kuin mainittu nisäkäs sisään hengittää mainitun seoksen.
12. 12. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 11 mukai nen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu kaasumainen NO käytetään yhdessä terapeuttisesti tehokkaan määrän kanssa toista yhdistettä, joka voimistaa kaasumaisen NO:n terapeuttista vaikutusta.
13. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että mainittu toinen, yhdiste valitaan ryhmästä, joka koostuu fasfo.äiesfceraasin inhibiittorista ..ja s up eroks i di di smut aas x s t a.
14. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen käyttö, t unia netto siitä, että mainittu toinen yhdiste on fosfodies.te- raasin inhibiittori, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu 2~ö-propoksifehyyli-8-atsapurin-6-önista (Zaprinast™) , di-pyridamolista ja teofyliinistä.
15. 15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 14 mukai-20 nen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu kaasumainen NO sisäänhengitetään tupakansavun poissa ollessa. 34