ES2263159T3

ES2263159T3 - Tratamientos de restenosis vascular con oxido nitrico inhalado.

Info

Publication number: ES2263159T3
Application number: ES96903806T
Authority: ES
Inventors: Warren M. Zapol; Kenneth D. Bloch
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1995-02-16
Filing date: 1996-02-08
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2016-02-08
Also published as: HUP9802093A3; NO315355B1; EP0810884A1; US5904938A; HUP9802093A2; BR9607616A; EP0810884A4; PT810884E; ZA961183B; AU4777596A; FI973357A0; MX9706257A; AU690425B2; US6063407A; DE69636096T2; CN1174513A; FI973357A; EP0810884B1; CZ259897A3; NO973768L

Abstract

SE DESCUBREN METODOS PARA TRATAR, INHIBIR O PREVENIR LA TROMBOSIS VASCULAR O LA RESTENOSIS ARTERIAL EN MAMIFEROS. LOS METODOS DESCUBIERTOS COMPRENDEN LA INHALACION POR EL MAMIFERO DE UNA CONCENTRACION TERAPEUTICAMENTE EFICAZ DE OXIDO NITRICO GASEOSO (NO). SE DESCUBREN ASIMISMO METODOS QUE INCLUYEN LA ADMINISTRACION DE LOS SIGUIENTES TIPOS DE AGENTES EN CONJUNCION CON OXIDO NITRICO INHALADO: COMPUESTOS QUE POTENCIAN LOS EFECTOS BENEFICIOSOS DEL OXIDO NITRICO Y AGENTES ANTITROMBOTICOS QUE COMPLEMENTAN O SUPLEMENTAN LOS EFECTOS BENEFICIOSOS DEL OXIDO NITRICO INHALADO. LA FIGURA MUESTRA UN GRAFICO QUE COMPARA LA RELACION INTIMA/MEDIA EN RATAS DE CONTROL, RATAS EXPUESTAS DURANTE DOS SEMANAS A 20 PPM DE NO Y RATAS EXPUESTAS UNA SEMANA A 80 PPM DE NO, SEGUIDO DE UNA SEMANA RESPIRANDO AIRE. EL ASTERISCO INDICA VALORES SIGNIFICATIVAMENTE DIFERENTES DE LOS BASALES (P<0,05).

Description

Tratamiento de restenosis vascular con óxido nítrico inhalado.

Declaración como investigación federal patrocinada

El trabajo sobre esta invención fue patrocinada, en parte, con fondos del gobierno de los Estados Unidos (USPHS concede HL42397 y HL45895). E gobierno por lo tanto tiene ciertos derechos en esta invención.

Antecedentes de la invención

Esta invención se relaciona con el uso de óxido nitroso acuoso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento, la inhibición o la prevención de la restenosis arterial resultante de hiperplasia intimal excesiva.

Un resultado no deseado de una lesión arterial por procedimientos de intervenciones vasculares es la restenosis arterial. Por ejemplo, PTCA ha sido utilizado extensamente para abrir arterias ocluidas tanto en el sistema vascular coronario como en el sistema vascular periférico. Aunque inicialmente exitoso por encima del 95 por ciento de los casos, ocurre un nuevo proceso de angostamiento o de reoclusión, conocido como restenosis, que ocurre dentro de los seis meses en un 30 a 50 por ciento de los pacientes.

Los procedimientos de intervención vascular tienden a dañar la pared vascular. Tales lesiones disparan la proliferación de células vasculares de músculo liso, que resulta en hiperplasia intimal. La proliferación puede deberse en parte a los efectos de los factores de crecimiento derivados de las plaquetas liberados por las plaquetas que se adhieren al sitio de la lesión arterial. La hiperplasia intimal excesiva conduce a restenosis, esto es, un nuevo estrechamiento del lumen arterial. Así, la restenosis arterial puede limitar severamente la efectividad a largo plazo de los procedimientos de intervención vascular.

Lee y colaboradores (Coronary Artery Disease, marzo 1993, Vol. 4, No.3, pág. 254), describen los rasgos histopatológicos de la hiperplasia neointimal (la causa de la restenosis), revisan los procesos patobiológicos que median el desarrollo de esta lesión, y examinan las estrategias terapéuticas potenciales para prevenir la restenosis.

Resumen de la invención

Se ha descubierto que el NO inhalado inhibe la restenosis arterial resultante de la hiperplasia intimal excesiva.

Por lo tanto, la invención se ocupa del uso del óxido nítrico gaseoso para la fabricación de un medicamento para tratar, inhibir o prevenir la restenosis arterial en un mamífero, haciendo que el mamífero inhale una cantidad terapéuticamente efectiva de NO gaseoso. La restenosis arterial puede estar asociada a una enfermedad o lesión.

Un segundo compuesto que potencia los efectos benéficos del NO inhalado puede ser administrado a un mamífero, junto con la inhalación de NO. Un medio por el cual el segundo compuesto podría potenciar los efectos benéficos de la inhalación de NO es por medio de la prolongación del efecto del NO inhalado en tejidos objetivo, o de células que interactúan con los tejidos objetivo, sin causar vasodilatación sistémica indeseable y la disminución concomitante en la presión sanguínea sistémica. Más particularmente, la prolongación del efecto inhibidor de la hiperplasia intimal del NO inhalado puede lograse por medio de la administración de un agente inhibidor de la fosfodiesterasa junto con (esto es, antes, durante o inmediatamente después) de la inhalación de NO. Los inhibidores preferidos de fosfodiesterasa son aquellos que inhiben selectivamente a las fosfodiesterasas específicas para el cGMP, mientas que afectan en forma mínima la descomposición del monofosfato 3',5'-cíclico de adenosina (cAMP) por medio de otras fosfodiesterasas. Un inhibidor preferido de fosfodiesterasa que muestra la especificidad anteriormente mencionada es Zaprinast^{TM} (M&B 22948; 2-o-propoxifenil-8-azaputin-6-ona, Rhone-Poulenc Rorer, Dagenham Essex, Reino Unido). Se conocen otros inhibidores de fosfodiesterasa específicos para el cGMP y pueden ser sustituidos por Zaprinast^{TM}.

Otros medios a través de los cuales el segundo compuesto podría potenciar los efectos benéficos de la inhalación de NO es por medio de la prolongación de la vida media in vivo del NO. Esto pude lograse, por ejemplo, por medio de la administración de superóxido dismutasa. La superóxido dismutasa remueve a los radicales superóxido, que reaccionan con NO.

Como se lo utiliza aquí, "el síndrome isquémico coronario agudo" significa la oclusión aguda de una arteria coronaria, por ejemplo, infarto agudo del miocardio, angina inestable, angina progresiva, angina de pecho, síndrome coronario intermedio, estado de la angina de pecho posterior a una trombosis y estado de la angina de pecho posterior a PTCA.

Como se lo utiliza aquí, "hiperplasia intimal (o neointimal)" significa la proliferación de células en el músculo liso arterial en la íntima, en respuesta a la denudación endotelial arterial.

Como se lo utiliza aquí, "revascularización" significa el restablecimiento del suministro de sangre a una parte del cuerpo de un mamífero.

Como se lo utiliza aquí, "células objetivo" significa células no pulmonares que interactúan directamente con NO, después de la inhalación de NO, para mediar un efecto benéfico en la inhibición, la prevención o el tratamiento de trombosis o restenosis arterial.

Como se lo utiliza aquí, una "concentración terapéuticamente afectiva de NO gaseoso" es una concentración que induce uno o más de lo siguiente en un paciente: alivio del dolor torácico, alivio de la respiración entrecortada, resolución de los cambios electrocardiográficos isquémicos, y flujo mejorado de la sangre arterial coronaria (que puede manifestarse por medio de una angiografía).

Como se lo utiliza aquí, una cantidad "terapéuticamente efectiva" de un inhibidor de fosfodiesterasa es una cantidad que incrementa la duración (esto es, el tiempo medio) o la magnitud del efecto terapéutico del NO gaseoso.

Como se lo utiliza aquí, "restenosis arterial" significa un estrechamiento anormal de un lumen arterial como resultado de hiperplasia neo(intimal) excesiva.

Como se lo utiliza aquí, "procedimiento de intervención vascular" significa cualquier procedimiento quirúrgico que involucra un rompimiento anatómico o perforación mecánica de un vaso sanguíneo. Un listado no exclusivo de procedimientos de intervención vascular incluyen angioplastia con balón, angioplastia con láser, cirugía de arteria coronaria, aterectomía y espirales arteriales coronarias.

Los usos revelados aquí se relacionan con el tratamiento, inhibición o prevención de la restenosis arterial resultante de hiperplasia intimal excesiva. Tal restenosis arterial es una complicación frecuente asociada con procedimientos de intervención vascular, tales como PTCA, o cirugía de by-pass coronario.

De acuerdo con esta invención, puede administrarse gas de NO:

(a): en forma continua o intermitente;

(b): en ausencia de humo de tabaco;

(c): a una concentración entre 0,1 y 300 partes por millón (ppm), preferiblemente entre 1,0 y 200 ppm, y más preferiblemente entre 20 y 100 ppm;

(d): como una mezcla que incluye NO, oxígeno (O_{2}), y nitrógeno (N_{2}) u otros gases inertes, que tienen preferiblemente un FIO_{2} (esto es, proporción de O_{2}, en volumen) de 0,20 a 0,99, siendo la proporción de O_{2} en aire de 0,21, y donde el gas NO se mezcla con el gas que contiene O_{2} poco antes de la inhalación (por ejemplo, menos de 5 minutos antes de la inhalación, y preferiblemente menos de 1 minuto antes de la inhala-ción); y

(e): en tal forma que se hace seguimiento a la concentración de NO_{2} y se mantiene dentro de límites seguros (por ejemplo, menos de 1 ppm).

Una importante ventaja de esta invención es que el NO inhalado no induce vasodilatación sistémica e hipotensión sistémica aguda concomitante. La vasodilatación sistémica es un efecto lateral indeseable potencialmente peligroso, asociado con la liberación sistémica sostenida de NO a partir de compuestos donantes de NO administrados en forma oral o intravenosa que han sido utilizados para inhibir trombosis o hiperplasia intimal excesiva.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas de la misma, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica que compara la relación íntima/media en ratas de control; las ratas se exponen durante dos semanas a 20 ppm de NO; las ratas expuestas durante dos semanas a 80 ppm de NO; y ratas expuestas durante una semana a 80 ppm de NO, seguido por una semana de aire respirable. El asterisco indica un valor que difiere significativamente de la línea base (p < 0,05).

Descripción detallada Restenosis Arterial

La invención provee un método simple, rápido, selectivo y eficaz para tratar, inhibir o prevenir restenosis arterial resultante de hiperplasia intimal excesiva. La hiperplasia intimal excesiva y la restenosis arterial frecuentemente ocurren después de procedimientos de intervención vascular tales como angioplastia de cualquier vaso (por ejemplo, carótida, femoral, coronaria, etc.); o cualquier procedimiento de revascularización coronaria, incluida la angioplastia con balón, la angioplastia con láser, el injerto de by-pass de la arteria coronaria, aterectomía o espirales en la arteria coronaria.

El NO inhalado puede ser utilizado, de acuerdo con esta invención, para tratar a un mamífero que ha sido identificado por tener una restenosis arterial existente. Los mamíferos son conocidos por mostrar diferentes señales y síntomas relacionados con la existencia de una restenosis arterial, y con lo cual pueden ser identificados. El reconocimiento de tales señales y síntomas está en la habilidad del médico. Las señales y los síntomas de una restenosis arterial en un mamífero incluyen, pero no se limitan a los siguientes: dolor de pecho, respiración entrecortada, cambios electrocardiográficos y hallazgos angiográficos coronarios. El objetivo de tratar una restenosis arterial existente con No inhalado es la de reducir el espesor de la íntima de una arteria restenosa, para incrementar el diámetro del lumen arterial, esto es, reducir la estrechez patológica.

Alternativamente, puede usarse el NO inhalado, e acuerdo con esta invención, para inhibir o prevenir la restenosis arterial en un mamífero (por ejemplo, un humano) que no tenga una restenosis arterial existente pero que haya sido identificada por tener riesgo de desarrollar una restenosis arterial. Ciertos procedimientos de intervención vascular, por ejemplo, PTCA y cirugía de by-pass coronario, pueden causar trauma arterial. El trauma arterial es conocido por conducir a una hiperplasia intimal excesiva y restenosis arterial. Por lo tanto, aquellos procedimientos ponen al paciente en riesgo de desarrollar una restenosis arterial. Por consiguiente, los individuos que han sufrido uno o más procedimientos de intervención vascular, y los individuos para quienes son inminentes uno o más procedimientos de intervención vascular, pueden ser convenientemente tratados de acuerdo con esta invención.

El NO inhalado es, por ejemplo, administrado a un paciente humano que está programado para ser sometido a un procedimiento de intervención vascular. El NO inhalado puede ser administrado por anticipado en un procedimiento de intervención vascular, para minimizar la cantidad de espesamiento intimal que tiene lugar después del trauma arterial normalmente asociado con los procedimientos de intervención vascular. Un paciente que reciba NO inhalado como medida preventiva antes de un procedimiento de intervención vascular puede o no tener una restenosis arterial existente. Alternativamente, el NO inhalado puede ser administrado a un paciente que ya ha sido sometido a un procedimiento de intervención vascular. En esa situación, la administración del NO inhalado se iniciará preferiblemente dentro de las siguientes horas después del procedimiento de intervención vascular. Por supuesto, alguien entrenado en la técnica reconocerá que el NO inhalado puede ser administrado antes, durante y después de un procedimiento de intervención vascular. Haciendo caso omiso de si el NO inhalado se administra antes, durante o después del procedimiento o en los tres casos, el NO inhalado puede ser administrado en forma continua o intermitente.

Administración del NO inhalado

El NO inhalado se administra preferiblemente a partir de una fuente de gas de NO almacenado en forma comprimida. El gas NO comprimido puede obtenerse a partir de un proveedor comercial tal como Airco (Murria Hill, NJ), típicamente como una mezcla de 200-800 ppm de NO en gas N_{2} puro. La fuente de NO puede ser 100% NO, o diluido con N_{2} o cualquier otro gas inerte (por ejemplo, helio). Es vital que el NO se obtenga y almacene como una mezcla libre de cualquier O_{2} contaminante u óxidos de nitrógeno superiores, debido a que tales óxidos superiores de nitrógeno (que se pueden formar por reacción del O_{2} con NO) son potencialmente nocivos para los tejidos pulmonares. Si se desea, puede demostrarse la pureza del NO con análisis de quimioluminiscencia, utilizando métodos conocidos, antes de la administración al paciente. Los analizadores de quimioluminiscencia NO-NO_{x} se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, el Modelo 14A, de Termo Environmental Instruments, Franklin, MA). La mezcla NO-NO_{x} puede mezclarse con aire u O_{2} a través, por ejemplo, de rotámetros calibrados que han sido validados previamente con un espirómetro. La concentración final de NO en la mezcla respirable puede verificarse con una técnica química o de quimioluminiscencia bien conocida por aquellos involucrados en estas materias (por ejemplo, Fontijin y colaboradores, Anal. Chem, 42:575 (1970)). Alternativamente, las concentraciones de NO y de NO_{2} pueden ser revisadas por medio de un analizador electroquímico. Cualquier impureza tal como NO_{2} puede ser depurada por medio de exposición a soluciones de NaOH, baralyme, o cal sodada. Como control adicional, el FIO_{2} de la mezcla final de gas puede ser evaluada también. Si se desea, el ventilador puede tener un gas limpiador añadido a la salida espiratoria para asegurar que no se escaparán cantidades significativas de NO hacia el ambiente adyacente. En un hospital o situación de emergencia, la administración de gas NO puede lograrse, por ejemplo, por medio de la unión de un tanque de gas NO comprimido en N_{2}, y un segundo tanque de oxígeno o una mezcla de oxígeno/N_{2} a un inhalador diseñado para mezclar gas a partir de dos fuentes; por medio del control del flujo de gas de cada fuente, la concentración inhalada de NO por parte del paciente se puede mantener en un nivel óptimo. El gas NO puede mezclarse también con aire del ambiente, utilizando un mezclador estándar de bajo flujo (por ejemplo, Bird Blender, Palm Springs, CA). El NO puede generarse a partir de N_{2} y O_{2} (esto es, aire) por medio del uso de un generador eléctrico de NO. Tal generador es descrito en la solicitud estadounidense de patente de Zapol 07/850.383 (anuncio de permiso publicado), que se incorpora aquí por referencia. Además, el NO puede ser suministrado en forma intermitente a partir de un inhalador. El uso de un inhalador puede ser particularmente conveniente si se administra un inhibidor fosfodiéster, en forma oral o por inhalación, junto con el NO.

NO puede ser administrado a un mamífero identificado por tener restenosis arterial, o a un mamífero identificado por estar en riesgo de desarrollar restenosis arterial, en una concentración entre 0,1 ppm hasta 300 ppm en aire, oxígeno puro, u otro gas adecuado o mezcla gaseosa, durante tanto tiempo como se requiera. Preferiblemente, la concentración estará entre 1,0 y 200 ppm; y más preferiblemente entre 20 y 100 ppm (por ejemplo, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm u 80 ppm). La concentración puede incrementarse temporalmente por cortos períodos de tiempo: por ejemplo, 5 min a 300 ppm de NO, cundo se desee un efecto dramático inmediato. Por las razones explicadas más abajo, el tratamiento concomitante con un inhibidor de fosfodiesterasa puede disminuir la dosis total de NO requerida (o permitir una dosis intermitente) para producir un efecto antirestenosis satisfactorio.

Para el tratamiento, inhibición o prevención de restenosis arterial, puede ser necesario administrar NO inhalado por medio de puntas nasales, mascara, toldo, catéter intratraqueal o tubo endotraqueal, durante un período largo, esto es, días o semanas. La administración puede ser continua durante un período prolongado. Alternativamente, la administración podría ser intermitente durante un período prolongado. La administración de NO gaseoso puede ser a través de ventilación espontánea o mecánica.

Evaluación de los Efectos del NO Inhalado

Cuando se administra NO inhalado para tratar, inhibir o prevenir restenosis arterial, es deseable hacer seguimiento a los efectos de la inhalación del NO. Tal seguimiento puede utilizarse, en un individuo particular, para verificar los efectos deseables y para identificar los efectos secundarios indeseables que pueden ocurrir. Tal seguimiento es también útil para ajustar el nivel de dosis, la duración y la frecuencia de la administración del NO inhalado en un individuo dado.

Preferiblemente, los efectos del NO inhalado sobre un paciente se evaluarían por medio de uno o más entre: manifestaciones clínicas tales como dolor de pecho, electrocardiografía, análisis seriales de patencia vascular por medio de ultrasonido, angiografía coronaria u otros medios; e incremento en los niveles de cGMP en plasma o en plaquetas.

Inhibidores de Fosfodiesterasa

El NO se descompone rápidamente por reacción con oxígeno molecular para producir nitrito y nitrato. Además, el No que entra a la sangre se inactiva rápidamente por un estrecho enlazamiento con la hemoglobina. Por estas razones, el NO solamente tiene una vida media corta en la sangre arterial. Esto significa que el NO inhalado evita convenientemente la vasodilatación sistémica, un efecto secundario indeseable potencialmente peligroso asociado con la liberación de NO sistémica sostenida a partir de compuestos donantes de NO.

Puede ser deseable prolongar los efectos benéficos del NO inhalado dentro de las células objetivo o dentro de células objetivo o dentro de células que interactúan con las células objetivo en el pulmón. En el contexto de la inhibición, prevención y tratamiento de la restenosis arterial, las plaquetas circulantes (y posiblemente los glóbulos blancos) son las células que interactúan con las células objetivo en la vasculatura.

En la determinación de cómo prolongar los efectos benéficos del NO inhalado, es útil considerar que uno de los efectos in vivo del NO es la activación de la guanilato ciclasa soluble, que estimula la producción del monofosfato cíclico de 3',5'-guanosina (cGMP). Al menos algunos de los efectos benéficos del NO parecen resultar de la estimulación del NO de la biosíntesis de cGMP. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, se administra un inhibidor de fosfodiesterasa junto con la inhalación de NO, para inhibir la descomposición del cGMP por medio de fosfodiesterasas endógenas.

El inhibidor de fosfodiesterasa puede introducirse en un mamífero por medio de cualquier método adecuado, incluida una vía oral, a través de mucosa, intravenosa, intramuscular, subcutánea o una ruta intraperitoneal. Alternativamente, el inhibidor puede ser inhalado por el mamífero. Para inhalación, se formula convenientemente un inhibidor de fosfodiesterasa como un polvo seco o una solución en aerosol que tiene un tamaño de partícula o de gotita menor de 10 \mum para deposición óptima en los alvéolos, y opcionalmente puede ser inhalado en un gas que contenga NO.

Un inhibidor preferido de fosfodiesterasa es Zaprinast^{TM} (M&B 22948; 2-o-propoxifenil-8-azaputin-6-ona, Rhone-Poulenc Rorer, Dagenham Essex, Reino Unido). Zaprinast^{TM} inhibe selectivamente la hidrólisis de cGMP con efectos mínimos sobre la descomposición de cAMP en células vasculares de músculo liso (Trapani y colaboradores, J. Pharmacol. Exp. Ther, 258:269 (1991); Harris y colaboradores, J. Pharmacol. Exp. Ther. 249:394 (1989); Lugnier y colaboradores, Biochem. Pharmacol. 35:1743 (1986); Souness y colaboradores, Br, J. Pharmacol. 98:725 (1989)). Cuando se utiliza Zaprinast^{TM} de acuerdo con esta invención, las rutas preferidas de administración son la intravenosa o la oral. El rango adecuado de la dosis lo puede determinar alguien normalmente entrenado en la técnica. Se puede preparar una solución patrón de Zaprinast^{TM} en NaOH 0,05 N. El patrón se puede diluir entonces con solución de lactato de Ringer hasta la concentración final deseada de Zaprinast^{TM}, inmediatamente ante de su uso.

Esta invención puede ser ejercitada con otros inhibidores de fosfodiesterasa. Se conocen diferentes inhibidores de fosfodiesterasa en el estado de la técnica, incluidos dipiridamol y teofilina. Como con Zaprinast^{TM}, la ruta de administración y el rango de dosis adecuada lo puede determinar alguien entrenado en la técnica.

Información experimental Experimentos de Hiperplasia Intimal

La hiperplasia neointimal de células de músculo liso es el principal proceso patológico en la restenosis arterial humana. Por lo tanto, para elucidar el efecto del NO inhalado sobre el proceso de restenosis después de un procedimiento de intervención vascular tal como PTCA, se estudió el efecto del NO inhalado sobre la hiperplasia intimal (Clowes y colaboradores, Laboratory Invest. 49:327 (1983)), un modelo animal estándar para la hiperplasia neointimal humana de las células de músculo liso.

Lesión Arterial

Las ratas macho adultas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) fueron sometidas a lesión por el balón de la arteria carótida común en una forma que previamente mostró que daba origen a hiperplasia neointimal (Cloves y colaboradores, supra). Las ratas que pesaban de 300 a 350 g fueron anestesiadas por medio de una inyección intraperitoneal de ketamina (60-80 mg/kg) y acepromazina (0,1 mg/kg). Una vez que se había logrado anestesiarlos en forma satisfactoria, se les hizo una incisión longitudinal en la línea media y se aisló la arteria carótida izquierda a través de disección con extremo romo. Después de una cuidadosa disección adicional de la bifurcación de la carótida interna y externa, se ligó un segmento de la carótida distal externa con sutura de seda 4-0. Se realizó una arteriotomía pequeña en la carótida externa utilizando tijeras de microdisección y se insertó una sonda balón Fogarty calibre 2 French (Baxter Edwards LIS) a través de la arteriotomía y se avanzó aproximadamente dos centímetros por debajo de la bifurcación de la carótida. Se llenó el balón con suficiente suero fisiológico para causar una distensión visible de la arteria carótida común y se la retiró cuidadosamente hasta el nivel de la bifurcación. Se retiró entonces la sonda balón y después de permitir un sangrado en la parte posterior a través del sitio de la arteriotomía para eliminar trombos potenciales y burbujas de aire, se ligó la carótida externa en forma próxima al sitio de la arteriotomía utilizando suturas de seda 4-0. Después de inspección visual para asegurar la adecuada pulsación de la arteria carótida común, se cerró la lesión quirúrgica y a los animales se les permitió recuperarse de la anestesia.

Inhalación Crónica de NO

La inhalación crónica de NO se llevó a cabo en cámaras acrílicas de inhalación de 40 litros especialmente preparadas. Las mezclas de gas se combinaron utilizando medidores de flujo calibrados y regulados en forma separada para oxígeno, aire presurizado y gases patrón de NO (800 ppm y 10.000 ppm de NO en N_{2}, Airco, Murray Hill, NJ). El gas efluente de la cámara se analizó periódicamente durante todo el período del experimento, para asegurar niveles estables de FIO_{2} y NO. El FIO_{2} se midió utilizando un electrodo polarográfico (Hudson Oxygen Meter 5590, Temecula, CA); se midió la concentración de NO por medio de quimioluminiscencia (Modelo 14A, Termo Environmental Instruments, Inc., Franklin, MA); y se midieron el dióxido de nitrógeno y el nitrógeno con estados de oxidación altos (NO_{x}) por medio de quimioluminiscencia seguido por la conversión del NO_{x} a NO por medio de un horno calentado de acero inoxidable (850ºC) con 98% de eficiencia (Modelo 100B generador de NO_{x}, Termo Environmental Instruments, Inc., Franklin, MA). Se mantuvo soda cáustica fresca en las cámaras para reducir el NO_{x}. La concentración de NO se mantuvo entre 20 y 80 ppm, dependiendo del experimento. Las medidas seriales revelaron que FIO_{2} era del 21% y NO_{x} era de 3-4 ppm. Los gases que salen de las cámaras de exposición, así como aquellos que se descargan del instrumento de quimioluminiscencia, fueron liberados utilizando una trampa venturi mantenida a presión atmosférica negativa con referencia al sistema central del vacío del laboratorio.

Los animales de control se mantuvieron en jaulas filtradas en la misma habitación que los animales tratados con NO. La exposición al NO se inició 30 a 120 minutos antes del procedimiento quirúrgico. Durante el procedimiento quirúrgico, el grupo tratado con NO fue retirado de la cámara y expuesto al NO por medio de una máscara facial modificada alimentada a partir del tubo para ingreso de gas de las cámaras. El análisis del gas inhalado reveló niveles de NO de 50-80 ppm durante los experimentos con 80 ppm y 10-20 ppm durante los experimentos quirúrgicos con 20 ppm. El tiempo total que cada animal estuvo fuera de la cámara y bajo la máscara facial estuvo en el rango de 20 a 40 minutos.

Análisis Morfométrico

A los 1, 3 y 14 días después de la lesión con el balón, se les practicó la eutanasia a las ratas por medio de una inyección intraperitoneal letal de pentobarbital sódico o ketamina. Se introdujo una sonda de calibre 16 dentro de la aorta ascendente a través del ápice ventricular izquierdo. Se ligó la aorta toráxica descendente. Se hizo entonces perfusión al animal a una presión de 100 mm de Hg con 100 ml de suero fisiológico normal seguido por 50 ml de paraformaldehído al 2% en suero fisiológico amortiguado con fosfato (PBS). Después de fijación in vivo durante 15 a 30 minutos, ambas arterias carótidas comunes fueron aisladas y sometidas a fijación adicional durante la noche por inmersión en paraformaldehído al 1% en PBS. Se deshidrató el tejido utilizando concentraciones crecientes en forma secuencial de etanol seguido por xileno, y luego embebidos en parafina. Se cortaron secciones transversales (6 \mum) y se colorearon con hematoxilina y eosina y/o elastina para el análisis. Se utilizó una única sección de 7 a 8 mm próxima a la bifurcación de la carótida para el análisis en cada animal. La sección que está siendo analizada se fotografió con un aumento de 100X. La imagen se digitalizó utilizando un escáner 2135'' de Kodak. Los análisis de área medial e intimal se llevaron a cabo sobre un computador Power Macintosh 8100/80'' utilizando el programa NIH Image de dominio público (escrito por Wayne Resband de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos y disponibles en Internet por medio del ftp anónimo zippy.nimh.nih.gov o en disquete de NTIS, 5285 Port Royal Rd., Springfield, VA 22161; número de parte PB93-504868). El análisis morfométrico se llevó a cabo con el investigador blindado como el grupo experimental.

Análisis Estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el programa comercialmente disponible Statview^{TM} (Abacus Concepts) para computadores Macintosh^{TM}. El grupo experimental se comparó con el grupo de control utilizando una prueba t impar de dos colas. Un valor de P<0,05 fue considerado como estadísticamente significativo. Todos los datos se representan como la media +/- SEM. El valor n se refiere al número de animales por grupo.

Resultados del Modelo de Roedor de la Restenosis

Se sometió a un total de 62 ratas a procedimientos de heridas en la carótida. Cinco de las ratas murieron debido a complicaciones vasculares durante la arteriotomía o la lesión por el balón, obteniéndose una rata de mortalidad en el procedimiento del 8%. No hubo una mala distribución estadísticamente significativa de las muertes entre los diferentes grupos experimentales. No hubieron muertes posteriores al procedimiento entre las 57 ratas que sobrevivieron al procedimiento inicial. Todas las ratas, independientemente de su grupo experimental, exhibieron un comportamiento normal en los cuidados y en los niveles de actividad durante todo el estudio. Aparte de ptosis ocasional sobre el costado de la lesión de la carótida, ninguna de las ratas exhibió un déficit neurológico total. Los análisis de un subconjunto de los grupos experimentales reveló ganancia en peso sin una diferencia estadística durante la exposición al aire, NO a 20 ppm y NO a 80 ppm.

En la primera serie de experimentos, las ratas que experimentaron una lesión de la carótida por el balón fueron expuestas ya sea al aire del ambiente (n = 12) o a 80 ppm de NO (n = 13) en aire, a todo lo largo de la duración del estudio. Los animales fueron sacrificados 14 días después de la lesión para análisis morfométrico de la arteria carótida lesionada. El examen a través del microscopio de luz reveló que tres ratas del grupo al aire (control) y una rata del grupo tratado con NO tenían oclusión trombótica del lumen de la carótida lesionada. Estos animales fueron excluidos de análisis adicionales. Como se esperaba, los vasos sanguíneos de ambos grupos exhibieron una perdida de endotelio y el desarrollo de hiperplasia neointimal. El examen a través de microscopio de luz no reveló una diferencia cualitativa en la morfología celular de la neoíntima (no se muestran los datos). El análisis cuantitativo, sin embargo, reveló que el tratamiento con las 80 ppm inhaladas de NO resultaron en una inhibición del 38% de la hiperplasia neointimal, esto es, una relación íntima/medios de 0,932 +/- 0,13 en animales con 80 ppm, comparado con 1,512 +/- 0,147 en animales con 0 ppm de NO (control) (P = 0,008) (Figura 4).

En la siguiente serie de experimentos, se examinó el efecto de una semana de exposición al NO. El grupo experimental (n = 7) fue expuesto a 80 ppm de NO durante siete días y luego transferido al aire durante siete días adicionales, antes del sacrificio. El grupo de control (n = 5) fue expuesto al aire durante el período completo de 14 días. No hubo diferencia morfológica cualitativa entre los grupos. Además, el análisis cuantitativo de la relación íntima/medios no reveló una diferencia significativa en hiperplasia neointimal entre los dos grupos, esto es, 1,059 +/- 0,239 en animales tratados con NO, comparado con 1,217 +/- 0,309 en los controles (P = no significativo) (Figura 4).

En una tercera serie de experimentos, se estudió una dosis inhalada menor de NO: las ratas respiraron o bien 20 ppm de NO (n = 8) o aire (n = 8). Nuevamente, no se pudo encontrar una diferencia cuantitativa o cualitativa en el grado de hiperplasia neointimal entre los dos grupos, esto es, la relación íntima/medios de 0,917 +/- 0,233 para animales tratados con 20 ppm de NO, comparado con 0,985 +/- 0,149 para los controles que respiraron aire (P = no significativo) (Figura 4).

Los anteriores resultados demuestran que la inhalación de 80 ppm de NO, durante un período de dos semanas, inhibe significativamente la hiperplasia neointimal después de la lesión inducida por el balón a las arterias carótidas, en un modelo de roedor.

Otras modalidades de la invención se encuentran dentro de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. El uso de óxido nítrico (NO) gaseoso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de restenosis arterial resultante de hiperplasia intimal excesiva en un mamífero.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde el tratamiento o la prevención es por medio de un método que comprende la etapa de identificar un mamífero que tiene una restenosis arterial existente o está en riego de desarrollar restenosis arterial.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho mamífero es un humano.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho mamífero ha sido sometido o se prepara para ser sometido a un procedimiento de intervención vascular.

5. El uso de la reivindicación 4, en donde dicho procedimiento de intervención vascular se selecciona del grupo que consiste de angioplastia, cirugía de la arteria coronaria y espirales arteriales coronarias.

6. El uso de la reivindicación 5, en donde dicho procedimiento es una angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA).

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho NO se inhala en un rango de concentración predeterminado.

8. El uso de la reivindicación 7, en donde dicho rango de concentración es de 0,1 ppm hasta 300 ppm.

9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho NO gaseoso se inhala como una mezcla que comprende a los gases NO, O_{2}, y N_{2}.

10. El uso de la reivindicación 9, en donde dicha mezcla comprende entre el 20% y el 99% de gas O_{2} en volumen.

11. El uso de la reivindicación 9, en donde dicho O_{2} se mezcla con dicho NO inmediatamente antes de que dicha mezcla sea inhalada por dicho mamífero.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho NO gaseoso se utiliza junto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo compuesto que potencia el efecto terapéutico del No gaseoso.

13. El uso de la reivindicación 12, en donde dicho segundo compuesto se selecciona del grupo que consiste de un inhibidor de fosfodiesterasa y de superóxido dismutasa.

14. El uso de la reivindicación 13, en donde dicho segundo compuesto es un inhibidor de fosfodiesterasa seleccionado del grupo que consiste de 2-o-propoxifenil-8-azapurín-6-ona (Zaprinast^{TM}), dipiridamol y teofilina.

15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicho NO gaseoso se inhala en ausencia de humo de tabaco.