ES2554108T3 - Métodos de tratamiento de la enterocolitis necrosante - Google Patents

Abstract

Monóxido de carbono para usar en el tratamiento o la prevención de la enterocolitis necrosante en un paciente.

Description

DESCRIPCION

Metodos de tratamiento de la enterocolitis necrosante

5 Declaracion en cuanto a investigacion patrocinada por el gobierno federal

La presente invencion se realizo con el apoyo gubernamental con las subvenciones de los Institutos Nacionales de la Salud n.° HL55330, HL60234 y AI42365. El gobierno ostenta ciertos derechos sobre esta invencion.

10 Campo tecnico

La presente invencion se refiere al tratamiento de trastornos gastrointestinales.

Antecedentes

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El dioxido de carbono (CO) es reconocido como una importante molecula de senalizacion (Verma et al., Science 259: 381-384,1993). Tambien se ha sugerido que el CO actua como una molecula mensajera neuronal en el cerebro (Id.) y como modulador neuroendocrino en el hipotalamo (Pozzoli et al., Endocrinology 735: 2314-2317,1994). Al igual que el oxido mtrico (NO), el CO es un relajante del musculo liso (Utz et al., Biochem Pharmacol. 47: 19520 201,1991; Christodoulides et al., Circulation 97: 2306-9, 1995) e inhibe la agregacion de plaquetas (Mansouri et al., Thromb Haemost. 48: 286-8,1982). Se ha demostrado que la inhalacion de bajos niveles de CO tiene efectos antiinflamatorios en algunos modelos.

La enterocolitis necrosante (ECN) es una enfermedad de recien nacidos caracterizada por insuficiencia de la barrera 25 intestinal, necrosis intestinal, sepsis e insuficiencia multiorganica (vease, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). El documento WO98/13058 desvela el uso de monoxido de carbono para el tratamiento de trastornos isquemicos. El documento WO98/13058 no menciona el uso de monoxido de carbono para tratar/prevenir enterocolitis necrosante.

30 Resumen

La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que la administracion de CO puede proteger contra el desarrollo de ECN.

35 Por consiguiente, la presente invencion presenta un metodo de tratamiento, prevencion o reduccion del riesgo de enterocolitis necrosante en un paciente. El metodo incluye identificar un paciente que padece o en riesgo de enterocolitis necrosante y administrar al paciente una composicion farmaceutica que comprende una cantidad de CO eficaz para tratar enterocolitis necrosante en el paciente. El metodo puede incluir la etapa adicional de monitorizar el estado de ECN del paciente y/o determinar si el estado del paciente ha mejorado o el riesgo de ECN se ha reducido. 40

La composicion farmaceutica puede ser administrada al paciente mediante cualquier metodo conocido en la tecnica para administrar gases, lfquidos y/o solidos a pacientes, por ejemplo, por inhalacion, insuflado, infusion, inyeccion y/o ingestion. En una realizacion de la presente invencion, la composicion farmaceutica es administrada al paciente por inhalacion. En otra realizacion, la composicion farmaceutica es administrada al paciente por via oral. En otra 45 realizacion mas, la composicion farmaceutica es administrada directamente a la cavidad abdominal del paciente. En aun otra realizacion, la composicion farmaceutica es administrada mediante un dispositivo extracorporeo de intercambio de gases a traves de una membrana o un pulmon artificial.

El paciente puede ser un lactante, por ejemplo, un lactante nacido a termino, un lactante prematuro y/o un lactante 50 que muestra bajo peso al nacer. El lactante puede ser un recien nacido o puede ser, por ejemplo, de hasta un ano de edad (por ejemplo, hasta seis meses, cuatro meses, tres meses o dos meses de edad). El lactante puede tener menos de seis semanas de edad, por ejemplo, menos de cuatro semanas de edad. La ECN puede ser el resultado de cualquiera de una serie de factores, por ejemplo, hipoxia, hipotermia, hipotension, hiperviscosidad de la sangre, y/o acidosis, y/o donde el paciente ha recibido una exanguinotransfusion, al menos una alimentacion hiperosmolar, 55 una transfusion de concentrado de eritrocitos y/o una sobredosis de antagonistas de calcio. Ademas, la ECN puede ser el resultado de una situacion en la que el paciente padece isquemia mesenterica y/o infeccion bacteriana de la pared intestinal (vease, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). Como alternativa, la ECN puede ser el resultado de una intervencion quirurgica, por ejemplo, donde el paciente se ha sometido, esta a punto de someterse, o se esta sometiendo a una intervencion quirurgica. La 60 composicion farmaceutica puede estar en cualquier forma, por ejemplo, forma gaseosa o lfquida.

La invencion tambien presenta un metodo de tratamiento o prevencion de enterocolitis necrosante en un paciente, que incluye identificar a un paciente que padece o en riesgo de enterocolitis necrosante, proporcionar un recipiente que contiene un gas presurizado que comprende CO gaseoso, liberar el gas presurizado del recipiente para formar 65 una atmosfera que comprende CO gaseoso, y exponer al paciente a la atmosfera, en el que la cantidad de CO en la

atmosfera es suficiente para tratar enterocolitis necrosante en el paciente.

En otro aspecto, la invencion presenta un metodo de realizacion de una intervencion quirurgica abdominal en un paciente (por ejemplo, un lactante), que incluye identificar a un paciente que necesita una intervencion quirurgica 5 abdominal, en el que la enterocolitis necrosante es un riesgo significativo de la intervencion quirurgica abdominal; realizar una intervencion quirurgica abdominal en el paciente y antes, durante o despues de la etapa de realizacion, hacer que el paciente inhale una cantidad de CO gaseoso suficiente para reducir el riesgo de enterocolitis necrosante en el paciente.

10 En la invencion tambien se incluye un metodo de tratamiento de enterocolitis necrosante en un paciente, que incluye: (a) identificar a un paciente que padece enterocolitis necrosante; (b) realizar una intervencion quirurgica en el paciente para extirpar una parte afectada del intestino del paciente; y (c) administrar al paciente una composicion farmaceutica que comprende una cantidad de monoxido de carbono eficaz para tratar enterocolitis necrosante en el paciente despues de la etapa (a) y antes, durante o despues de la etapa (b).

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En otro aspecto, la invencion proporciona un recipiente que comprende CO gaseoso comprimido de calidad medica. El recipiente puede llevar una etiqueta que indica que el gas puede usarse para tratar ECN en un paciente, por ejemplo, un lactante. El CO gaseoso puede estar mezclado con nitrogeno gaseoso, con oxido mtrico y nitrogeno gaseoso, o con un gas que contiene oxfgeno. El CO gaseoso puede estar presente en la mezcla a una 20 concentracion de al menos aproximadamente el 0,025 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 0,05 %, 0,10 %, 0,50 %, 1,0 %, 2,0 %, 10 %, 50 % o 90 %.

En otro aspecto mas, la invencion proporciona un metodo de tratamiento de ECN en un paciente, que incluye identificar a un paciente que padece o en riesgo de ECN y administrar al paciente al menos uno de los siguientes 25 tratamientos junto con tratamiento con CO: inducir HO-1 o ferritina en el paciente; expresar HO-1 recombinante o ferritina en el paciente; y administrar una composicion farmaceutica que comprende HO-1, bilirrubina, biliverdina, ferritina o apoferritina, hierro, desferoxamina o dextrano de hierro al paciente. Tambien esta contemplado el uso de CO y cualquiera de los agentes enumerados anteriormente en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de ECN.

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Ademas, la invencion proporciona un metodo de tratamiento ECN en un paciente, que incluye identificar a un paciente que padece o en riesgo de ECN y administrar al menos uno de los siguientes tratamientos junto con tratamiento con CO: alimentacion intravenosa; hidratacion intravenosa; agentes antimicrobianos; realizar descompresion nasogastrica en el paciente, realizar una intervencion quirurgica en el paciente; y drenar la cavidad 35 peritoneal del paciente.

Tambien esta dentro de la invencion el uso de CO en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de ECN. El medicamento puede usarse en un metodo para tratar ECN en un paciente que padece o en riesgo de ECN de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento. El medicamento puede estar en 40 cualquier forma descrita en el presente documento, por ejemplo, una composicion de CO lfquida o gaseosa.

A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invencion. Los metodos y materiales adecuados se describen a continuacion, aunque pueden usarse metodos y 45 materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la puesta en practica o ensayos de la presente invencion. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecera la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Los materiales, metodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

50

Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se describen en la descripcion a continuacion. Otras caracteristicas, objetos y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la descripcion y las reivindicaciones.

Descripcion de los dibujos

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La figura 1A es una foto de una transferencia de Western que ilustra que la expresion de HO-1 se incrementa en muestras intestinales de recien nacidos humanos que padecen ECN (ECN) en comparacion con pacientes sin ECN (control) (n = 3).

60 La figura 1B es una foto de una transferencia de Western que ilustra la proterna HO-1 ileal se incrementa el dfa cuatro en ratas recien nacidas sometidas a hipoxia intermitente y alimentacion con la formula (ECN) en comparacion con ratas de control amamantadas (control) (n=4).

La figura 2A es una microfotograffa (40 aumentos) de una preparacion compleja ileal tenida con hematoxilia y eosina 65 que ilustra el efecto de la lactancia materna en una rata recien nacida. La muestra se obtuvo el dfa cuatro.

La figura 2B es una microfotograffa (40 aumentos) de una preparacion compleja ileal tenida con hematoxilia y eosina que ilustra el efecto de la lactancia materna y la exposicion a CO en una rata recien nacida. La muestra se obtuvo el dfa cuatro.

5 La figura 2C es una microfotograffa (40 aumentos) de una preparacion compleja ileal tenida con hematoxilia y eosina que ilustra el efecto de la alimentacion con la formula mas exposicion a hipoxia en una rata recien nacida. La muestra se obtuvo el dfa cuatro. Pueden observarse cambios arquitectonicos que incluyen atrofia de las vellosidades y vacuolizacion celular.

10 La figura 2D es una microfotograffa (40 aumentos) de una preparacion compleja ileal tenida con hematoxilia y eosina que ilustra el efecto de la alimentacion con la formula, mas exposicion a hipoxia y exposicion a CO en una rata recien nacida. Se producen menos cambios arquitectonicos en comparacion con la muestra mostrada en la figura 2C. La muestra se obtuvo el dfa cuatro.

15 La figura 3A es una microfotograffa (60 aumentos) de una preparacion compleja ileal tenida mediante marcado del extremo libre con dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) que ilustra el efecto de la lactancia materna en una rata recien nacida. La muestra se obtuvo el dfa cuatro.

La figura 3B es una microfotograffa (60 aumentos) de una preparacion compleja ileal tenida mediante TUNEL que 20 ilustra el efecto de la lactancia materna y exposicion a CO en una rata recien nacida. La muestra se obtuvo el dfa cuatro.

La figura 3C es una microfotograffa (60 aumentos) de una preparacion compleja ileal tenida mediante TUNEL que ilustra el efecto de la alimentacion con la formula mas exposicion a hipoxia en una rata recien nacida. La muestra se 25 obtuvo el dfa cuatro. El fleon de ratas tratadas con hipoxia/alimentadas con la formula muestra tincion mediante TUNEL incrementada en comparacion con la de animales amamantados.

La figura 3D es una microfotograffa (60 aumentos) de una preparacion compleja ileal tenida mediante TUNEL que ilustra el efecto de la alimentacion con la formula mas exposicion a hipoxia y exposicion a CO en una rata recien 30 nacida. La muestra se obtuvo el dfa cuatro. Puede observarse disminucion de celulas positivas para TUNEL.

La figura 4A es un histograma que ilustra que el tratamiento con CO previene un incremento de la concentracion serica de EL-1p en ratas recien nacidas expuestas a hipoxia y alimentadas con la formula en comparacion con controles (P<0,05). Los datos se generaron usando un ensayo ELISA. Barras negras = ratas expuestas al aire; 35 barras grises = ratas expuestas a CO.

La figura 4B es un histograma que ilustra que el tratamiento con CO previene un incremento de la concentracion serica de TNF-a en ratas recien nacidas expuestas a hipoxia y alimentadas con la formula en comparacion con controles (P<0,05). Los datos se generaron usando un ensayo ELISA. Barras negras = ratas expuestas al aire; 40 barras grises = ratas expuestas a CO.

La figura 5 es una foto de una transferencia de Western que ilustra que el tratamiento con CO reduce la expresion ileal de COX-2 e IL-1p en ratas recien nacidas expuestas a hipoxia y alimentadas con la formula, en comparacion con controles. La presencia (+) o ausencia (-) de cada tratamiento (lactancia materna (BF), alimentacion con la 45 formula mas exposicion a hipoxia (FF/Hipoxia) y exposicion a CO (CO)) se indica debajo de cada carril de la transferencia de Western. La transferencia demuestra 3-4 animales por grupo y es representativa de todos los animales en el estudio.

La figura 6 es una foto de una transferencia de Western que ilustra que la exposicion a CO suprime la expresion de 50 iNOS ileal y la nitracion de protemas inducida por ECN experimental en ratas recien nacidas. La presencia (+) o ausencia (-) de cada tratamiento (lactancia materna (BF), alimentacion con la formula mas exposicion a hipoxia (FF/Hipoxia) y exposicion a CO (CO) se indica debajo de cada carril de la transferencia de Western.

La figura 7 es un histograma que ilustra que la exposicion a CO y la induccion de HO-1 disminuye la muerte de 55 celulas IEC-6 inducida por TNF-a/Actinomicina D (TNF/ActD). La viabilidad de las celulas IEC-6 tratadas con TNF-a (TNF; 10 ng/ml)/Actinomicina D (ActD; 200 ng/ml) se ensayo despues de 18 horas midiendo el contenido celular de ATP. El tratamiento con CO (CO; barras grises; 250 ppm) se inicio 1 hora antes de la administracion de TNF-a/ActD y se mantuvo durante toda la duracion del experimento. Barras rayadas = celulas expuestas a protoporfirina de cobalto (CoPP) 16 horas antes de la exposicion a TNF-a/ActD. Barras negras = celulas expuestas al aire. Tanto CO 60 como CoPP redujeron significativamente la muerte de celulas IEC-6 inducida por TNF-a/ActD (P<0,05). Los resultados son la media ± el error ffpico de 3 estudios independientes realizados por triplicado.

La figura 8A es una foto de una transferencia de Western que ilustra (a las 24 horas) que la expresion de protema iNOS es inhibida en celulas IEC-6 tratadas con lipopolisacaridos (LPS) y/o hipoxia (oxfgeno al 1 %). El tratamiento 65 con CO (250 ppm) se inicio 1 hora antes de la adicion de LPS/hipoxia y se mantuvo durante todo el experimento. La

combinacion de LPS (10 o 100 ng/ml) mas hipoxia incrementaba la expresion de protema iNOS, un efecto que fue inhibido por CO. La presencia (+) o ausencia (-) de cada tratamiento (lipopolisacarido (lps), exposicion a hipoxia (hipoxia) y exposicion a CO (CO)) se indica debajo de cada carril de la transferencia de Western.

5 Fig. 8B es un histograma que ilustra que la actividad promotora de iNOS de rata en celulas IEC-6 tratadas con LPS (100 ng/ml)/hipoxia (oxfgeno al 1%; lps/hipoxia esta limitada por la exposicion a CO. Se ensayo la actividad luciferasa de las celulas. La combinacion de LPS mas hipoxia dio como resultado un incremento de 4,9 ± 0,3 veces en la activacion transcripcional del promotor de iNOS (P<0,05). El CO limitaba esta activacion transcripcional a un incremento de 1,7 ± 0,2 veces (P<0,05). Los resultados son la media ± el error tfpico de 3 estudios independientes 10 realizados por triplicado.

La figura 8C es una foto de una transferencia de Western que ilustra que la expresion de la protema iNOS inducida por citoquinas es inhibida en celulas IEC-6 mediante la induccion de HO-1 o el tratamiento con CO. Las celulas IEC- 6 fueron tratadas con una mezcla de citoquinas (CM) que contema TNF-a (10 ng/ml), IL-1p (500 U/ml) e IFN-y (1000 15 U/ml) durante 24 horas. El tratamiento con CO (250 ppm) se inicio 1 hora antes de la administracion de CM y se mantuvo durante toda la duracion del experimento. La protoporfirina de cobalto (CoPP) se administro 16 horas antes del tratamiento con CM. Las CM incrementaban la protema iNOS en celulas IEC-6. Tanto CO como CoPP inhibfan el incremento inducido por citoquinas de protema iNOS. La presencia (+) o ausencia (-) de cada tratamiento (mezcla de citoquinas (CM), exposicion a CO (CO), y exposicion de protoporfirina de cobalto (CoPP)) se indica debajo de cada 20 carril de la transferencia de Western.

La figura 8D es un histograma que ilustra que las concentraciones de nitrito en sobrenadantes de celulas IEC-6 que son expuestas a CM y CO o CoPP son menores que los de celulas IEC-6 expuestas a CM y aire (segun lo determinado mediante ensayo de Griess). La estimulacion con citoquinas incrementaba el nitrito a 17,2 ± 0,9 pM en 25 comparacion con 1,4 ± 0,3 pM en controles no estimulados (P<0,01). CO y CoPP inhibfan significativamente el efecto de las citoquinas dando como resultado concentraciones de nitrito de 9,8 ± 0,7 y 10,4 ± 1,0, respectivamente (P<0,05 en comparacion con celulas estimuladas con CM). Barras negras = celulas expuestas al aire; barras grises = celulas expuestas a CO; y barras rayadas = celulas expuestas a CoPP.

30 Descripcion detallada

La expresion “monoxido de carbono” (o “CO”), tal como se usa en el presente documento, describe CO molecular en su estado gaseoso, comprimido en forma lfquida o disuelto en solucion acuosa. Las expresiones “composicion de monoxido de carbono” y “composicion farmaceutica que comprende monoxido de carbono” se usan durante toda la 35 memoria descriptiva para describir una composicion gaseosa o lfquida que contiene CO que puede administrarse a un paciente y/o un organo, por ejemplo un organo afectado por ECN. El experto en la materia reconocera la forma de la composicion farmaceutica, por ejemplo, gaseosa, lfquida o tanto gaseosa como lfquida, que se prefiere para una aplicacion dada.

40 Las expresiones “cantidad eficaz” y “eficaz para tratar”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una cantidad o concentracion de CO utilizada durante un periodo de tiempo (incluyendo la administracion aguda o cronica y la administracion periodica o continua) que es eficaz dentro del contexto de su administracion para producir un efecto o resultado fisiologico deseado en un paciente. Las cantidades eficaces de CO para uso en la presente invencion incluyen, por ejemplo, cantidades que reducen los smtomas de ECN en un paciente, o mejoran el 45 resultado.

Para los gases, las cantidades eficaces de CO generalmente estan dentro del intervalo de aproximadamente el 0,0000001 % a aproximadamente el 0,3 % en peso, por ejemplo, del 0,0001 % a aproximadamente el 0,25 % en peso, preferentemente al menos aproximadamente el 0,001 %, por ejemplo, al menos el 0,005 %, 0,010 %, 0,02 %, 50 0,025 %, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,08 %, 0,10 %, 0,15 %, 0,20 %, 0,22 % o 0,24 % en peso de CO. Para soluciones lfquidas de CO, las cantidades eficaces generalmente estan dentro del intervalo de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,0044 g de CO/100 g de lfquido, por ejemplo, al menos 0,0001, 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040 o 0,0042 g de CO/100 g de solucion acuosa. Los intervalos preferidos incluyen, por 55 ejemplo, de aproximadamente 0,0010 a aproximadamente 0,0030 g de CO/100 g de lfquido, de aproximadamente 0,0015 a aproximadamente 0,0026 g de Co/100 g de lfquido, o de aproximadamente 0,0018 a aproximadamente 0,0024 g de CO/100 g de lfquido. Un experto en la materia apreciara que pueden usarse cantidades fuera de estos intervalos, dependiendo de la aplicacion.

60 El termino “paciente” se usa durante toda la memoria descriptiva para describir un animal, humano o no humano, al que se le proporciona el tratamiento de acuerdo con los metodos de la presente invencion. La presente invencion contempla claramente aplicaciones veterinarias. El termino incluye, aunque sin limitacion, mairnferos, por ejemplo, seres humanos, otros primates, cerdos, roedores tales como ratones y ratas, conejos, cobayas, hamsteres, vacas, caballos, gatos, perros, ovejas y cabras. El termino “tratar/tratamiento” se usa en el presente documento para 65 describir el retraso del inicio, la inhibicion o el alivio de los efectos de una afeccion, por ejemplo ECN, en un

paciente.

La expresion “enterocolitis necrosante” o “ECN” es una expresion reconocida en la tecnica y se usa en el presente documento para hacer referencia a una enfermedad de pacientes, particularmente lactantes prematuros y nacidos a 5 termino recien nacidos, que se caracteriza por insuficiencia de la barrera intestinal, necrosis intestinal, sepsis e insuficiencia multiorganica (Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). La ECN puede afectar a cualquier parte del intestino, por ejemplo, la parte inferior del intestino delgado (fleo), el colon y/o el intestino delgado superior. El riesgo de desarrollar enterocolitis necrosante esta asociado con muchos factores, por ejemplo, bajo peso al nacer, hipoxia, hipotermia, hipotension, hiperviscosidad, acidosis o la presencia 10 de radicales de oxfgeno libres (Id.). Otros factores de riesgo incluyen canula en la arteria umbilical, exanguinotransfusion, alimentaciones hiperosmolares, transfusion de concentrado de eritrocitos o sobredosis con antagonistas de calcio (Id.). Dichos factores pueden causar isquemia mesenterica, que pueden permitir infeccion bacteriana de la pared intestinal, que da como resultado necrosis del tejido infectado y/o perforacion de la pared intestinal y septicemia (Id.). La eCn tambien puede producirse en recien nacidos despues de una intervencion 15 quirurgica para afecciones gastrointestinales u otras (Id.).

Los expertos en la materia apreciaran que a un paciente se le puede diagnosticar que padece ECN mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante diagnostico por parte de un facultativo (por ejemplo, usando tecnicas de imaginologfa tales como ultrasonograffa, rayos X y/o analisis de sangre).

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Los individuos considerados en riesgo de desarrollar ECN pueden beneficiarse particularmente de la invencion, principalmente porque el tratamiento profilactico puede comenzar antes de que haya cualquier indicio de ECN. Los individuos “en riesgo” incluyen, por ejemplo, lactantes prematuros y recien nacidos, o individuos que padecen cualquiera de las afecciones o que presentan los factores de riesgo descritos anteriormente. Los expertos en la 25 materia apreciaran que a un paciente se le puede diagnosticar que esta en riesgo de ECN mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante diagnostico por parte de un facultativo (por ejemplo, mediante la valoracion por parte de un facultativo de los factores de riesgo de un paciente).

Preparacion de composiciones gaseosas 30

Una composicion de CO puede ser una composicion gaseosa de CO. El gas comprimido o presurizado util en los metodos de la invencion puede obtenerse a partir de cualquier fuente comercial y en cualquier tipo de recipiente apropiado para el almacenamiento de gas comprimido. Por ejemplo, pueden obtenerse gases comprimidos o presurizados a partir de cualquier fuente que suministre gases comprimidos, tales como oxfgeno, para uso medico. 35 La expresion gas de “calidad medica”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un gas adecuado para administracion a los pacientes, tal como se define en el presente documento. El gas presurizado, incluyendo el CO usado en los metodos de la presente invencion, puede proporcionarse de modo que todos los gases de la composicion final deseada (por ejemplo, CO, He, NO, CO2, O2, N2) esten en el mismo recipiente, con la excepcion de que el NO y O2 no pueden almacenarse juntos. Opcionalmente, los metodos de la presente invencion pueden 40 realizarse usando multiples recipientes que contienen gases individuales. Por ejemplo, puede proporcionarse un solo recipiente que contiene CO, con o sin otros gases, cuyo contenido opcionalmente puede mezclarse con aire ambiental o con los contenidos de otros recipientes, por ejemplo, recipientes que contienen oxfgeno, nitrogeno, dioxido de carbono, aire comprimido o cualquier otro gas adecuado o mezclas de los mismos.

45 Las composiciones gaseosas administradas a un paciente de acuerdo con la presente invencion tipicamente contienen del 0 % a aproximadamente el 79 % en peso de nitrogeno, de aproximadamente el 21 % a aproximadamente el 100 % en peso de oxfgeno y de aproximadamente el 0,0000001 % a aproximadamente el 0,3 % en peso (correspondiente a aproximadamente 1 ppb o 0,001 ppm a aproximadamente 3.000 ppm) de CO. Preferentemente, la cantidad de nitrogeno en la composicion gaseosa es de aproximadamente el 79 % en peso, la 50 cantidad de oxfgeno es de aproximadamente el 21 % en peso y la cantidad de Co es de aproximadamente el 0,0001 % a aproximadamente el 0,25 % en peso. La cantidad de CO es preferentemente al menos aproximadamente el 0,001 %, por ejemplo, al menos aproximadamente el 0,005 %, 0,010 %, 0,02 %, 0,025 %, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,08 %, 0,10 %, 0,15 %, 0,20 %, 0,22 % o 0,24 % en peso. Los intervalos preferidos incluyen de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,24 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 55 0,22 %, de aproximadamente el 0,015 % a aproximadamente el 0,20 %, de aproximadamente el 0,08 % a aproximadamente el 0,20 %, y aproximadamente el 0,025 % a aproximadamente el 0,1 % en peso. Se observa que las composiciones de CO gaseosas que tienen concentraciones de CO mayores del 0,3 % (tales como del 1 % o mayor) puede usarse durante cortos periodos (por ejemplo, una o unas pocas respiraciones), dependiendo de la aplicacion.

60

Puede usarse una composicion gaseosa de CO para crear una atmosfera que comprenda CO gaseoso. Puede crearse una atmosfera que incluya niveles apropiados de CO gaseoso, por ejemplo, proporcionando un recipiente que contenga un gas presurizado que comprende CO gaseoso, y liberando el gas presurizado desde el recipiente a una camara o espacio para formar una atmosfera que incluya Co gaseoso dentro de la camara o espacio. Como 65 alternativa, los gases pueden liberarse en un aparato que culmine en una mascara de respiracion o tubo de

respiracion, creando de esta manera una atmosfera que comprende CO gaseoso en la mascara de respiracion o tubo de respiracion, garantizando que el paciente es la unica persona en la sala expuesta a niveles significativos de CO.

5 Los niveles de CO en una atmosfera pueden medirse o monitorizarse usando cualquier metodo conocido en la tecnica. Dichos metodos incluyen deteccion electroqmmica, cromatograffa de gases, recuento de radioisotopos, absorcion infrarroja, colorimetna y metodos electroqmmicos basados en membranas selectivas (vease, por ejemplo, Sunderman et al., Clin. Chem. 28: 2026-2032, 1982; Ingi et al., Neuron 16: 835-842, 1996). Pueden detectarse niveles de subpartes por millon de CO, por ejemplo, por cromatograffa de gases y recuento de radioisotopos. 10 Ademas, en la tecnica se sabe que pueden medirse niveles de CO en el intervalo sub-ppm en tejidos biologicos por un sensor de gas infrarrojo medio (vease, por ejemplo, Morimoto et al., Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol 280:H482-H488. 2001). Estan ampliamente disponibles de muchas fuentes comerciales sensores de CO y dispositivos de deteccion de gas.

15 Preparacion de composiciones liquidas

Una composicion de CO tambien puede ser una composicion lfquida de CO. Un lfquido puede convertirse en una composicion de CO mediante cualquier metodo conocido en la tecnica para hacer que los gases se disuelvan en lfquidos. Por ejemplo, el lfquido puede ponerse en un denominado “incubador de CO2” y exponerse a un flujo 20 continuo de CO, preferentemente equilibrado con dioxido de carbono, hasta que se alcance una concentracion deseada de CO en el lfquido. Como otro ejemplo, puede “burbujearse” CO gaseoso directamente en el lfquido hasta que se alcance la concentracion deseada de CO en el lfquido. La cantidad de CO que puede disolverse en una solucion acuosa dada aumenta al reducirse la temperatura. Como otro ejemplo, puede hacerse pasar un lfquido apropiado a traves de un tubo que permite la difusion de gas, donde el tubo pasa a traves de una atmosfera que 25 comprende CO (por ejemplo, utilizando un dispositivo tal como un oxigenador de membrana extracorporeo). El Co se difunde en el lfquido creando una composicion lfquida de CO.

Es probable que dicha composicion lfquida destinada a introducirse en un animal vivo este a una temperatura de 37 °C o aproximadamente a esta temperatura en el momento en el que se introduce en el animal.

30

El lfquido puede ser cualquier lfquido conocido por los expertos en la materia y adecuado para la administracion a pacientes (vease, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). En general, el lfquido sera una solucion acuosa. Los ejemplos de soluciones incluyen Solucion Salina Tamponada con Fosfato (PBS), Celsior™, Perfadex™, solucion de Collins, solucion de citrato y solucion de la Universidad de 35 Wisconsin (UW) (Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). En una realizacion de la presente invencion, el ffquido es solucion de Ringer, por ejemplo, Solucion de Ringer con lactato, o cualquier otro lfquido que pueda usarse infundido en un paciente. En otra realizacion, el lfquido incluye sangre, por ejemplo, sangre completa.

40 Cualquier lfquido adecuado puede saturarse a una concentracion establecida de CO a traves de difusores de gas. Como alternativa, pueden usarse soluciones prefabricadas que se han sometido a control de calidad para contener niveles establecidos de CO. El control preciso de la dosis puede conseguirse mediante mediciones con una membrana impermeable a lfquidos y permeable a gases conectada a un analizador de CO. Las soluciones pueden saturarse a concentraciones eficaces deseadas y mantenerse a esos niveles.

45

Tratamiento de pacientes con composiciones de monoxido de carbono

Un paciente puede tratarse con una composicion de CO mediante cualquier metodo conocido en la tecnica de administracion de gases y/o lfquidos a pacientes. Las composiciones de CO pueden administrarse a un paciente al 50 que se le ha diagnosticado, o al que se ha determinado que esta en riesgo de, ECN, por ejemplo, lactantes recien nacidos o prematuros. La presente invencion contempla la administracion sistemica de composiciones lfquidas o gaseosas de CO a pacientes (por ejemplo, mediante inhalacion y/o ingestion), y la administracion topica de las composiciones al el tracto gastrointestinal del paciente (por ejemplo, mediante ingestion, insuflado y/o introduccion en la cavidad abdominal).

55

Administracion sistemica de monoxido de carbono

Las composiciones gaseosas de CO pueden administrarse sistemicamente a un paciente, por ejemplo, un paciente al que se le ha diagnosticado o que se ha determinado que esta en riesgo de ECN. Las composiciones gaseosas de 60 CO ffpicamente se administran mediante inhalacion a traves de la boca o las vfas nasales a los pulmones, donde el CO se absorbe facilmente al torrente sangumeo del paciente. La concentracion de compuesto activo (CO) utilizada en la composicion gaseosa terapeutica dependera de las velocidades de absorcion, distribucion, inactivacion y excrecion (generalmente, mediante la respiracion) del CO, asf como de otros factores conocidos por los expertos en la materia. Se entendera adicionalmente que, para cualquier sujeto particular, los regfmenes de dosificacion 65 espedficos deben ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el criterio

profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones, y que los intervalos de concentracion descritos en el presente documento son solo ejemplares y no deben considerarse limitantes del alcance o practica de la composicion reivindicada. La presente invencion contempla la administracion aguda, subaguda y cronica del CO, dependiendo, por ejemplo, de la gravedad o persistencia de ECN en el paciente. El CO 5 puede administrate al paciente durante un tiempo (incluyendo indefinidamente) suficiente para tratar la afeccion y ejercer el efecto farmacologico o biologico deseado.

A continuacion se proporcionan ejemplos de algunos metodos y dispositivos que pueden utilizarse para administrar composiciones gaseosas de CO a pacientes.

10

Respiradores

El CO de calidad medica (las concentraciones pueden variar) puede adquirirse mezclado con aire u otro gas que contenga oxfgeno en un deposito convencional de gas comprimido (por ejemplo, 21 % de O2, 79 % de N2). Es no 15 reactivo y las concentraciones necesarias para los metodos de la presente invencion estan muy por debajo del intervalo combustible (10 % en aire). En un entorno hospitalario, el gas supuestamente se suministrara en la cabecera, donde se mezclara con oxfgeno o aire domestico en un mezclador hasta una concentracion deseada en ppm (partes por millon). El paciente inhalara la mezcla de gas a traves de un respirador, que se ajustara a un caudal basado en la comodidad y las necesidades del paciente. Esto se determina mediante graficos pulmonares (es decir, 20 frecuencia respiratoria, volumenes corrientes, etc.). En el sistema de liberacion pueden disenarse mecanismos a prueba de fallos para impedir que el paciente reciba innecesariamente cantidades mayores que las deseadas de CO. El nivel de CO del paciente puede supervisarse estudiando (1) la carboxihemoglobina (COHb), que puede medirse en la sangre venosa, y (2) el CO exhalado recogido de un orifico lateral del respirador. La exposicion al CO puede ajustarse basandose en el estado de salud del paciente y basandose en los marcadores. Si es necesario, 25 puede retirarse el CO del paciente cambiando a una inhalacion de O2 al 100 %. El CO no se metaboliza; de esta forma, lo que se inhale finalmente se exhalara con la excepcion de un porcentaje muy pequeno que se convierte en CO2. El CO tambien puede mezclarse con cualquier nivel de O2 para proporcionar una liberacion terapeutica de monoxido de carbono sin que se produzcan condiciones hipoxicas.

30 Mascara facial y tienda

Se prepara una mezcla de gas que contiene CO tal como se ha indicado anteriormente para permitir la inhalacion pasiva por el paciente usando una mascara facial o tienda. La concentracion inhalada puede cambiarse y eliminarse simplemente cambiando al 100 % de O2. La supervision de los niveles de CO se producina en o cerca de la mascara 35 o tienda con un mecanismo a prueba de fallos que impedina que se inhalara una concentracion demasiado elevada de CO.

Inhalador portatil

40 El CO comprimido puede envasarse en un dispositivo inhalador portatil e inhalarse en una dosis medida, por ejemplo, para permitir el tratamiento intermitente de un receptor que no esta en un entorno hospitalario. En los recipientes podnan envasarse diferentes concentraciones de CO. El dispositivo podna ser tan sencillo como un pequeno deposito (por ejemplo, de menos de 5 kg) de CO diluido apropiadamente con una valvula de apertura-cierre y un tubo a partir del cual el paciente realiza una inspiracion de CO de acuerdo con un regimen estandarizado o 45 cuando sea necesario.

Pulmon artificial intravenoso

Puede usarse un pulmon artificial (un dispositivo de cateter para el intercambio de gas en la sangre) disenado para 50 la administracion de O2 y la eliminacion de CO2, para la administracion de monoxido de carbono. El cateter, cuando se implanta, reside en una de las venas grandes y podna suministrar CO a concentraciones dadas para la administracion sistemica o en un sitio local. La administracion puede ser una administracion local de una alta concentracion de monoxido de carbono durante un corto periodo de tiempo en el sitio del procedimiento, por ejemplo, en las inmediaciones del intestino delgado (esta alta concentracion se diluina rapidamente en el torrente 55 sangumeo), o una exposicion relativamente mas prolongada a una menor concentracion de CO (vease, por ejemplo, Hattler et al., Artif. 45 Organs 18(11): 806-812 (1994); y Golob et al., ASAIO J., 47(5): 432-437 (2001)).

Camara normobarica

60 En ciertos casos, sena deseable exponer a todo el paciente a CO. El paciente estana dentro de una camara hermetica inundada con CO (a un nivel que no ponga en peligro al paciente, o a un nivel que suponga un riesgo aceptable para el paciente sin exponer a riesgos a los espectadores. Una vez completada la exposicion, la camara podna inundarse con aire (por ejemplo 21% de O2 y 79% de N2) y podnan analizarse muestras con analizadores de CO para asegurarse de que no queda CO antes de permitir que el paciente salga del sistema de exposicion.

Administracion sistemica de composiciones liquidas de CO

La presente invencion contempla, ademas, que pueden crearse composiciones liquidas de CO para la administracion sistemica a un paciente, por ejemplo, por infusion en el paciente. Por ejemplo, pueden infundirse 5 composiciones lfquidas de CO, tales como Solucion de Ringer saturada con CO, en un paciente que padece o en riesgo de padecer ECN. Como alternativa o ademas, en el paciente puede infundirse sangre completa (o parcial), parcial o completamente saturada con CO. La presente invencion tambien contempla que pueden utilizarse agentes capaces de administrar dosis de composiciones gaseosas de CO o composiciones lfquidas de CO (por ejemplo, gomas de liberacion de CO, cremas, pomadas o parches).

10

Tratamiento topico del tracto gastrointestinal con monoxido de carbono

Como alternativa o ademas, pueden aplicarse composiciones de CO directamente en el tracto gastrointestinal, por ejemplo, en el interior y/o exterior de todo el tracto gastrointestinal o en cualquier parte del mismo. Una composicion 15 gaseosa puede aplicarse directamente al tracto gastrointestinal de un paciente, por ejemplo un lactante prematuro o recien nacido, mediante cualquier metodo conocido en la tecnica para insuflar gases en un paciente. Por ejemplo, con frecuencia se insuflan gases, por ejemplo dioxido de carbono, en el tracto gastrointestinal y la cavidad abdominal de pacientes para facilitar el examen durante procedimientos endoscopicos y laparoscopicos (vease, por ejemplo, Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)). El experto en la 20 materia apreciara que podnan usarse procedimientos similares para administrar composiciones de CO directamente al tracto gastrointestinal de un paciente. Tambien se contempla que la presente invencion pueda aplicarse para ayudar a prevenir ECN que resulta de laparoscopia y endoscopia, por ejemplo, colonoscopia y esofagogastroduodenoscopia.

25 Tambien pueden administrarse por via topica composiciones acuosas de CO al tracto gastrointestinal de un paciente. Pueden administrarse formas acuosas de las composiciones mediante cualquier metodo conocido en la tecnica para administrar lfquidos a pacientes. Como ocurre con las composiciones gaseosas, las composiciones acuosas pueden aplicarse directamente al interior y/o exterior del tracto gastrointestinal. Por ejemplo, la forma acuosa puede administrarse por via oral, por ejemplo haciendo que el paciente ingiera una dosis encapsulada o sin 30 encapsular de la composicion acuosa de CO. Como otro ejemplo, pueden inyectarse lfquidos, por ejemplo soluciones salinas que contienen CO disuelto, en el tracto gastrointestinal y la cavidad abdominal de pacientes durante procedimientos endoscopicos y laparoscopicos, respectivamente. Ademas, puede realizarse una exposicion in situ lavando el tracto gastrointestinal o una parte del mismo con una composicion lfquida de CO (vease Oxford Textbook of Surgery, Morris and Malt, Eds., Oxford University Press (1994)).

35

Uso de hemoxigenasa-1, otros compuestos y otros tratamientos para ECN

Tambien se contempla por la presente invencion la induccion o expresion de la hemoxigenasa-1 (HO-1) junto con la administracion de CO. Por ejemplo, la HO-1 puede inducirse en un paciente que padece o en riesgo de padecer 40 ECN. Tal como se usa en el presente documento, el termino “inducir/inducido” significa producir una mayor produccion de protema, por ejemplo HO-1, en celulas aisladas o las celulas de un tejido, organo o animal usando el gen endogeno de las propias celulas (por ejemplo, no recombinante) que codifica la protema.

La HO-1 puede inducirse en un paciente mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, la 45 produccion de HO-1 puede inducirse mediante hemina, mediante protoporfirina de hierro o mediante protoporfirina de cobalto. Una diversidad de agentes no hemo incluyendo metales pesados, citoquinas, hormonas, NO, COCI2, endotoxinas y choque termico tambien son fuertes inductores de la expresion de HO-1 (Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15: 9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37: 517-554, 1997; y Tenhunen et al., J. Lab. Clin. Med 75: 410-421, 1970). La HO-1 tambien es inducida en gran medida por una diversidad de agentes que 50 producen estres oxidativo, incluyendo peroxido de hidrogeno, agentes para reducir los niveles de glutation, irradiacion UV, endotoxinas e hiperoxia (Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15: 9-19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37: 517-554,1997; y Keyse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 99-103, 1989). Una “composicion farmaceutica que comprende un inductor de HO-1” significa una composicion farmaceutica que contiene cualquier agente capaz de inducir HO-1 en un paciente, por ejemplo, cualquiera de los agentes descritos 55 anteriormente, por ejemplo hemina, protoporfirina de hierro y/o protoporfirina de cobalto.

La expresion de HO-1 en una celula puede aumentarse mediante transferencia genica. Tal como se usa en el presente documento, el termino “expresar/expresado” significa producir una mayor produccion de una protema, por ejemplo HO-1 o ferritina, en celulas aisladas o las celulas de un tejido, organo o animal usando un gen administrado 60 exogenamente (por ejemplo, un gen recombinante). La HO-1 o ferritina preferentemente es de la misma especie (por ejemplo, ser humano, raton, rata, etc.) que el receptor, para minimizar cualquier reaccion inmunitaria. La expresion podna estar dirigida por un promotor constitutivo (por ejemplo, promotores de citomegalovirus) o un promotor espedfico de tejido (por ejemplo, promotor del suero de leche para celulas de mairnfero o promotor de albumina para celulas hepaticas). Un vector de terapia genica apropiado (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, virus 65 adenoasociado (VAA), poxvirus (por ejemplo, vaccinia), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus

diminuto de raton, el virus de la hepatitis B, virus de la gripe, Virus Herpes Simplex-1 y lentivirus) que codifica HO-1 o ferritina se administrana a un paciente que padece o en riesgo de padecer ECN, a traves de la boca, mediante inhalacion o inyeccion en el la pared intestinal, la luz intestinal o la cavidad abdominal. De forma similar, pueden administrarse vectores plasirndicos que codifican HO-1 o apoferritina, por ejemplo, como ADN desnudo, en 5 liposomas, o en micropartmulas.

Ademas, puede administrarse protema HO-1 exogena directamente a un paciente mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. La HO-1 exogena puede administrarse directamente ademas, o como alternativa, a la induccion o expresion de HO-1 en el paciente tal como se ha descrito anteriormente. La protema HO-1 puede 10 administrarse a un paciente, por ejemplo, en liposomas, y/o como una protema de fusion, por ejemplo, como una protema de fusion con TAT (vease, por ejemplo, Becker-Hapak et al., Methods 24: 247-256, 2001).

Como alternativa o ademas, pueden administrarse cualquiera de los productos del metabolismo por HO-1, por ejemplo, bilirrubina, biliverdina, hierro y/o ferritina a un paciente junto con CO para prevenir o tratar ECN. Ademas, la 15 presente invencion contempla que pueden administrarse al paciente moleculas de union a hierro distintas de ferritina, por ejemplo, desferoxamina (DFO), dextrano de hierro y/o apoferritina. Ademas, la presente invencion contempla que pueden inhibirse enzimas (por ejemplo, biliverdina reductasa) que catalizan la degradacion de cualquiera de estos productos para crear/aumentar el efecto deseado. Cualquiera de los anteriores puede administrarse, por ejemplo, por via oral, intravenosa o intraperitoneal, o por administracion directa al interior o al 20 exterior del intestino.

La presente invencion contempla que, en los metodos de la presente invencion, tambien pueden usarse compuestos que liberan CO en el cuerpo despues de la administracion del compuesto (por ejemplo, compuestos de liberacion de Co, por ejemplo compuestos de liberacion de CO fotoactivables), por ejemplo, dimanganeso decacarbonilo, dfmero 25 de tricarbonildiclororrutenio (II) y cloruro de metileno (por ejemplo, a una dosis de entre 400 y 600 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 500 mg/kg), asf como carboxihemoglobina y sustitutos de hemoglobina donadores de CO.

Lo anterior puede administrarse a un paciente de cualquier forma, por ejemplo, mediante administracion oral, 30 intraperitoneal, intravenosa o intraarterial. Cualquiera de los compuestos anteriores puede administrarse al paciente local y/o sistemicamente, y en cualquier combinacion.

La presente invencion contempla ademas tratar ECN administrando CO al paciente en combinacion con cualesquiera otros metodos o compuestos conocidos para tratar ECN, por ejemplo, cese o reduccion de la velocidad 35 de alimentacion por la boca, por ejemplo, durante al menos 1 dfa, por ejemplo, al menos 2, 3, 5 o 10 dfas, o mas); administrar hidratacion y/o nutricion intravenosa, descompresion nasogastrica o agentes antimicrobianos al paciente; intervencion quirurgica; y/o drenar la cavidad peritoneal del paciente. Las intervenciones quirurgicas incluyen, por ejemplo, extirpar la parte afectada del intestino. Tambien se contempla el tratamiento preventivo de pacientes en riesgo de ECN administrando CO al paciente en combinacion con cualesquiera otros metodos conocidos para 40 prevenir ECN, por ejemplo, cambiar la dieta del paciente.

La invencion se ilustra, en parte, mediante los siguientes ejemplos, que no deben considerarse limitantes de la invencion de forma alguna.

45 Ejemplo 1. El CO atenua el desarrollo de ECN

Recogida de muestras intestinales humanas

Se recogieron muestras intestinales humanas y se congelaron instantaneamente en el momento de la operacion.

50

Modelo animal de enterocolitis necrosante

A ratas Sprague-Dawley con fecha y hora embarazadas se les provoco el parto usando inyeccion subcutanea de Pitocina (1 U). Inmediatamente despues del parto (dfa cero), los recien nacidos se pesaron y se asignaron 55 aleatoriamente a dos grupos principales. Los animales se dejaron con sus madres y de este modo fueron amamantados, o se separaron de sus madres, se alojaron en una incubadora (Ohio Medical Products, Madison, WI), se alimentaron con sonda con una formula especial para roedores dos veces al dfa, y se sometieron a 10 minutos de hipoxia (5 % de O2, 95 % de N2; PraxAir, Pittsburgh, PA) antes de cada alimentacion. La formula constaba de 15 g de Similac® 60/40 (Ross Pediatrics, Colombus, OH) en 75 ml de sustituto de leche para perros Esbilac® (Pet-Ag 60 Inc., Hampshire, IL). Ratas de cada grupo fueron asignadas aleatoriamente adicionalmente para no recibir ningun tratamiento adicional o tratamiento con CO una hora al dfa (250 partes por millon; ppm, dfas 1-3). El CO se administro tal como se describe a continuacion. Las ratas recien nacidas se sacrificaron el dfa cuatro. Los intestinos fueron inspeccionados en busca de cambios necroticos macroscopicos y neumatosis intestinal. Los ultimos 2 cm de fleon terminal se recogieron para estudios morfologicos, y se recogieron raspados mucosales para deteccion de 65 protema.

Exposicion a CO

Los animales se expusieron a CO a una concentracion de 250 ppm. En resumen, CO al 1 % en aire se mezclo con aire (21 % de oxfgeno) en un cilindro mezclador de acero inoxidable y a continuacion se dirigieron al interior de una 5 camara de exposicion de vidrio de 3,70 pies3 a un caudal de 12 l/min. Se uso un analizador de CO (Interscan, Chatsworth, CA) para medir los niveles de CO de forma continua en la camara. Las concentraciones de CO se mantuvieron a 250 ppm en todo momento. Las ratas se introdujeron en la camara de exposicion segun se requirio.

Estudios morfologicos

10

Se recogieron muestras intestinales tal como se ha descrito anteriormente. Se prepararon portaobjetos con hematoxilina y eosina (H&E) segun el protocolo estandar y se examinaron mediante microscopfa optica. La presencia de cambios morfologicos en el epitelio intestinal, incluyendo la separacion del nucleo velloso, edema submucoso, y desprendimiento epitelial, fueron determinados por un patologo de manera enmascarada.

15

Determinacion de citoquinas sericas

Se recogio suero para la determinacion de los niveles de TNF-a e IL-1p en rata usando Quantikine® ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

20

Cultivo celular

La lmea celular epitelial del intestino delgado de rata IEC-6 se obtuvo de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo “American Type Culture Collection" (Manassas, VA). Las celulas se cultivaron en medio Eagle modificado por 25 Dulbecco con 4,5 g/l de glucosa (Bio-Whittaker, Walkersville, MD) suplementado con suero fetal bovino al 5 %, glutamina 0,02 mM (Gibco, Grand Island, NY), 0,1 U/ml de insulina, y 100 U/ml de penicilina/100 pg/ml de estreptomicina a 37 °C y CO2 al 10 %. Las celulas de los pases 3 a 20 se usaron para experimentos.

Viabilidad

30

La viabilidad celular se determino midiendo los niveles de ATP (CellTiter-Glo™; Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Analisis por transferencia de Western

35

Se recogieron celulas IEC-6 o raspados de la mucosa ileal en tampon de lisis que contema 20 mmol/l de Tris con 100 pmol/l de fenilmetilsulfonilfluoruro (Sigma), 1 pmol/l de leupeptina (Sigma), y 1 pmol/l ortovanadato sodico (Sigma). La protema se cuantifico mediante ensayo de protemas con acido bicinconirnco (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Los lisados (30 pg) se sometieron electroforesis en gel de dodecilsulfato sodico-poliacrilamida.

40

Ensayo informador

El informador de lucifersasa del promotor iNOS de rata pGL3/2 se construyo tal como se describe en el documento Beck et al., FEBS Lett 435: 35-38 (1998). Celulas IEC-6 cultivadas en pocillos de 35 mm se transfectaron con 4 pl de 45 Lipofectamine2000® (Invitrogen), 0,15 pg de ADN de pGL3/2 y 0,5 pg de ADN de pIEP-LacZ, que se uso como control para la eficiencia de transfeccion. Veinticuatro horas despues de la transfeccion, las celulas fueron tratadas durante 6 horas, a continuacion se recogieron lisados y se realizo un ensayo de luciferasa (Promega) con un luminometro (Berthold, Alemania).

50 Determinacion de nitrito

El nitrito (NO2") se midio en el medio de cultivo usando el metodo de Griess.

Analisis estadistico

55

Los resultados se expresan como la media ± ETM. Las diferencias entre los grupos se analizaron con analisis de la varianza de una via con test de Student-Newman-Keuls post-hoc para todas las comparaciones emparejadas (SigmaStat; SPSS, Chicago, IL). Se supuso significacion estadfstica cuando P era menor de 0,05.

60 La protema HO-1 intestinal se incrementa en ECN

Muestras intestinales humanas de pacientes con ECN y muestras intestinales de control de pacientes con afecciones no inflamatorias se analizaron para la expresion de HO-1. Lisados de celulas completas de muestras con ECN demostraron una mayor expresion de HO-1 en comparacion con los controles (figura 1A).

Para determinar si los niveles de protema HO-1 intestinal se incrementanan en un modelo de ECN experimental, ratas recien nacidas se asignaron aleatoriamente a lactancia materna ad libitum o a ser sometidas a hipoxia intermitente y alimentadas con la formula (H/F), tal como se ha descrito anteriormente. Todos los animales fueron sacrificados el 4° dfa de vida y mucosas ileales terminales se recogieron y se analizaron mediante transferencia de 5 Western. La expresion de la protema HO-1 se incremento en el grupo de H/F en comparacion con los animales de control amamantados (figura 1B). Esto es coherente con descubrimientos previos en el intestino y otros organos que ilustran la regulacion positiva de HO-1 despues de diversas lesiones.

El CO protege contra el desarrollo de ECN

10

Ratas recien nacidas de los grupos de lactancia materna y H/F se asignaron aleatoriamente para recibir dosis de una hora de CO (250 ppm) al dfa los dfas 1, 2 y 3, o ninguna terapia adicional. Todos los animales fueron sacrificados el 4° dfa de vida. Las caractensticas patologicas macroscopicas incluyendo neumatosis intestinal y necrosis (vease la tabla 1, a continuacion) asf como cambios histologicos coherentes con ECN experimental se

15 identificaron en el grupo de H/F en comparacion con controles amamantados (figura 2A, 2B, 2C y 2D). El tratamiento con CO no tema ningun efecto sobre la evaluacion macro o microscopica de animales amamantados y protegfa significativamente contra el desarrollo de ECN experimental en ratas en el grupo de H/F. La tincion TUNEL para muerte celular, que se incremento en el grupo de H/F, disminuyo mediante tratamiento con CO (figura 3A, 3B, 3C y 3D).

20

Tabla 1. Cambios patologicos desde el Aeon de rata recien nacida el 4° dia de vida.

Lactancia Lactancia + CO Alimentados con la formula/Hipoxia Alimentados con la formula /Hipoxia + CO

Numero total (n)

7 7 8 8

Cambios macroscopicos (n)

Necrosis de la pared intestinal

0 0 5 2

Neumatosis intestinal

0 0 5 1

Cambios microscopicos (n)

Atrofia vellosa

0 0 7 2

Vacuolizacion

0 1 6 3

Neutrofilos del estroma

0 0 6 1

El CO disminuye los marcadores sistemicos de inflamacion.

25 En el momento del sacrificio, se recogio suero para la medicion de los niveles de TNF-a e IL-1p como marcadores sistemicos de la inflamacion tisular. Los niveles tanto de TNF-a como de IL-1p se incrementaron en 33,2 y 18,5 veces en el grupo de H/F en comparacion con controles amamantados (figuras 4A y 4B; P<0,05). El CO atenuaba significativamente estos incrementos, dando como resultado incrementos de solamente 3 y 2,5 veces de TNF-a y IL- 1p, respectivamente (P<0,05). Estos descubrimientos demuestran que el CO exogeno puede suprimir algunas de las 30 consecuencias sistemicas en este modelo animal.

El CO disminuye los marcadores intestinales locales de inflamacion.

Se realizaron analisis para ciclooxigenasa-2 (COX-2) e interleuquina-1p (IL-1 p), ambos de los cuales son 35 marcadores de inflamacion intestinal y se habfa demostrado que estan asociados con ECN. Se evaluaron lisados de protema mucosa ileal mediante analisis por transferencia de Western para COX-2 e IL-1 p. En este estudio H/F se asocio con un incremento de los niveles de protemas COX-2 e IL-1p ileales en aproximadamente la mitad de los animales (figura 5). Coherente con los efectos protectoras sobre la histologfa y las citoquinas sericas, el tratamiento con CO disminuyo la expresion de ambas de estas protemas. El CO tambien disminma la expresion de HO-1 ileal en 40 este modelo (datos no mostrados), que probablemente representa una disminucion de la lesion intestinal y los cambios compensatorios que se producen en respuesta a la lesion.

El CO inhibe la generacion de oxido nitrico sintasa inducible intestinal (iNOS)

45 La iNOS se incrementa en muestras intestinales humanas de recien nacidos con ECN asf como en los intestinos de ratas en modelos experimentales de ECN. Se cree que la induccion de la generacion de iNOS y NO contribuye directamente al dano tisular mediante formacion de especies de nitrogeno reactivas. Los analisis por transferencia de Western de muestras mucosas ileales en este estudio demuestran que H/F da como resultado niveles incrementados de iNOS y nitracion de protemas (figura 6). Se cree que la nitracion o formacion de nitrotirosina esta 50 causada por peroxinitrito, el producto toxico de la interaccion de NO y superoxido. Tanto la protema iNOS como las nitrosotirosinas disminuyeron marcadamente en animales tratados con CO, sugiriendo que el CO puede ser

12

protector en los intestinos disminuyendo/previniendo la generacion de NO.

HO-1/CO inhibe la muerte celular de IEC-6

5 Para determinar si HO-1 o CO inhibe la muerte celular in vitro, se utilizo la lmea celular epitelial intestinal de rata IEC-6. Se indujo la muerte celular tratando estas celulas con TNF-a (10 ng/ml) mas actinomicina D (ActD; 200 ng/ml). La viabilidad celular se analizo mediante tincion con cristal violeta de celulas adherentes y valoracion del contenido de ATP celular. TNF-a/ActD disminrna la viabilidad celular de IEC-6 hasta el 24 ± 2,1 % el de los controles no tratados (figura 7; P<0,05). El CO inhibfa significativamente la muerte celular inducida por TNF-a/ActD dando 10 como resultado un 54 ± 5,6 % de viabilidad en comparacion con controles no tratados (P<0,05). El CO en solitario no presentaba ningun efecto medible sobre la viabilidad de celulas IEC-6 in vitro. La induccion de HO-1 mediante CoPP presentaba efectos protectores similares.

El CO previene la regulacion positiva de iNOS/generacion de NO

15

Se investigo si el CO puede inhibir la regulacion positiva de iNOS en celulas epiteliales intestinales in vitro. Los efectos de LPS y/u oxfgeno al 1 % (hipoxia) se investigaron sobre la protema iNOS mediante transferencia de Western. Estos estudios demuestran que LPS/hipoxia incrementaba la protema iNOS, que es un efecto que fue inhibido por CO (figura 8A). Los efectos de CO sobre la activacion transcripcional del promotor de iNOS de rata se 20 ensayaron en celulas IEC-6 estimuladas con LPS e hipoxia (figura 8B). La combinacion de LPS mas hipoxia dio como resultado un incremento de 4,9 ± 0,3 veces de la activacion transcripcional del promotor de iNOS utilizando un ensayo de luciferasa (P<0,05). El CO limitaba esta activacion transcripcional a solamente un incremento de 1,7 ± 0,2 veces (P<0,05). Adicionalmente, el efecto de CO sobre la generacion de NO por celulas IEC-6 se ensayo midiendo el nitrito. Las celulas IEC-6 se estimularon con una mezcla de citoquinas (TNF-a, IL-1p, Interferon-Y) que se sabe 25 que regula positivamente iNOS. La estimulacion con citoquinas incrementaba la protema iNOS (figura 8C) asf como el nitrito a 17,2±0,9 pM en comparacion con 1,4±0,3 pM en controles no estimulados (P<0,01; figura 8D). CO y CoPP inhibfan significativamente este efecto sobre las citoquinas que da como resultado los niveles de nitrito de 9,8 ± 0,7 y 10,4 ± 1,0, respectivamente (P<0,05).

30 Los datos presentados anteriormente indican que HO-1 esta regulada positivamente en muestras intestinales de recien nacidos humanos con ECN asf como en la mucosa ileal de ratas recien nacidas en un modelo de ECN experimental. Una hora al dfa de administracion de CO exogeno prevema el desarrollo de ECN. Esto estaba asociado con una disminucion de la inflamacion sistemica segun lo evaluado mediante TNF-a e IL-1p sericos, e inflamacion local segun lo ensayado mediante expresion en la mucosa ileal de IL-1 p y COX-2. El desarrollo de ECN 35 tambien estaba asociado con expresion de iNOS en la mucosa ileal y nitracion de protemas incrementadas. La terapia con CO atenuaba el incremento de iNOS y el estres nitrosativo. In vitro, la induccion de HO-1 o CO es protectora contra la muerte celular inducida por TNF-a/ActD en celulas IEC-6. Adicionalmente in vitro, el CO prevema la induccion de iNOS y la generacion de NO.

40 HO-1 y sus subproductos cataltticos, incluyendo CO, probablemente desempenan un papel defensivo despues de una lesion intestinal. Los datos presentados anteriormente demuestran que los niveles de protema HO-1 se incrementan en la mucosa ileal de animales con ECN, lo que es coherente con estudios previos que demuestran HO-1 intestinal incrementada en modelos de isquemia/reperfusion y choque hemorragico. La induccion de HO-1, mediante pre-acondicionamiento o farmacologicamente, es citoprotectora despues del trasplante intestinal e 45 isquemia/reperfusion. El tratamiento con CO, que es protector contra el desarrollo de ECN, tambien prevema la regulacion positiva de HO-1. Esta inhibicion de la expresion de HO-1 puede deberse a un bucle de retroalimentacion negativa directa; sin embargo, esto es probablemente secundario a la proteccion contra lesion intestinal con la posterior regulacion positiva de HO-1.

50 Una hora de terapia por inhalacion de CO (250 ppm) al dfa fue suficiente para prevenir el desarrollo de ECN. Es probable que los efectos protectores de CO en este modelo animal de ECN sean multifactoriales. Los datos presentados anteriormente demuestran que la administracion de CO causa una disminucion de la apoptosis intestinal segun lo ensayado mediante tincion TUNEL in vivo y una mejora de la muerte celular de IEC-6 inducida por TNF-a/ActD in vitro. La terapia con CO tambien estaba asociada con una menor elaboracion de mediadores tanto 55 sistemicos como inflamatorios.

iNOS/NO estan asociados con dano a la mucosa e insuficiencia de la barrera intestinal en enfermedad intestinal inflamatoria, ileitis experimental, choque endotoxico y ECN. Los datos presentados anteriormente muestran que el CO disminuye la regulacion positiva de iNOS in vitro e in vivo, ademas de disminuir la formacion de nitrosotirosina in 60 vivo. El peroxinitrito, que se cree que es la especie de nitrogeno reactiva responsable de la toxicidad y la apoptosis de enterocitos, reacciona con protemas para dar como resultado la nitracion de residuos de tirosina. Se cree que esta especie se forma mediante la interaccion de NO y superoxido. La proteccion de enterocitos mediada por Co puede mediarse mediante la inhibicion de la regulacion positiva de la protema iNOS, disminuyendo la posterior generacion de NO y peroxinitrito.

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La prevencion del desarrollo de ECN por CO puede implicar una motilidad gastrointestinal sostenida y prevencion de colonizacion bacteriana inapropiada. Es conocido que la colonizacion intestinal alterada contribuye al desarrollo de ECN.

En conclusion, el presente ejemplo demuestra que una hora de terapia con CO al dfa protegfa a ratas recien nacidas alimentadas con la formula/hipoxica del desarrollo de ECN experimental. El mecanismo parece implicar la inhibicion de la expresion de iNOS y la nitracion de protemas.

Ejemplo 2. Protocolo para el tratamiento de ECN

El siguiente ejemplo ilustra protocolos para uso en el tratamiento de un paciente que padece o en riesgo de ECN. El ejemplo tambien ilustra protocolos para tratar a pacientes antes, durante y/o despues de procedimientos quirurgicos, por ejemplo, un procedimiento quirurgico para tratar ECN, una intervencion quirurgica en la que se extirpa una parte del intestino. Los expertos en la materia apreciaran que puede adaptarse cualquier protocolo descrito en el presente documento basandose en las necesidades individuales del paciente, y puede adaptarse para usarse junto con cualquier otro tratamiento para ECN.

El tratamiento de un paciente con CO puede comenzar el dfa que al paciente se le diagnostica que padece ECN o cualquier afeccion asociada con ECN, o que presenta cualquier factor de riesgo asociado con una mayor probabilidad de que el paciente desarrolle eCn. Los pacientes pueden inhalar CO a concentraciones que vanan entre 10 ppm y 1000 ppm, por ejemplo, de aproximadamente 100 ppm a aproximadamente 800 ppm, de aproximadamente 150 ppm a aproximadamente 600 ppm, o de aproximadamente 200 ppm a aproximadamente 500 ppm. Las concentraciones preferidas incluyen, por ejemplo, de aproximadamente 30 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, o aproximadamente 1000 ppm. El CO puede administrarse al paciente de forma intermitente o de forma continua. El CO puede administrarse durante aproximadamente 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 o 20 dfas, o mas de 20 dfas, por ejemplo, 1 2,3,5 o 6 meses, o hasta que el paciente ya no muestra smtomas de ECN, o hasta que al paciente se le ha diagnosticado que ya no esta en riesgo de ECN. En un dfa dado, el CO puede administrarse de forma continua durante todo el dfa, o intermitentemente, por ejemplo, una unica aspiracion de CO al dfa (donde se usa una concentracion elevada), o durante hasta 23 horas al dfa, por ejemplo, hasta 20, 15, 12, 10, 6, 3 o 2 horas al dfa, o hasta 1 hora al dfa.

Con respecto a la administracion de CO junto con procedimientos quirurgicos para tratar ECN, el CO puede administrarse de forma sistemica o de forma local a un paciente antes de, durante y/o despues de que se ha realizado un procedimiento quirurgico. Los pacientes pueden inhalar CO a concentraciones que vanan de 10 ppm a 1000 ppm, por ejemplo, de aproximadamente 100 ppm a aproximadamente 800 ppm, de aproximadamente 150 ppm a aproximadamente 600 ppm, o de aproximadamente 200 ppm a aproximadamente 500 ppm. Las concentraciones preferidas incluyen, por ejemplo, aproximadamente 30 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm o aproximadamente 1000 ppm. El Co puede administrarse al paciente de forma intermitente o de forma continua, durante aproximadamente 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 o 20 dfas, o mas de 20 dfas, antes del procedimiento. Como alternativa o ademas, el CO puede administrarse al paciente durante el procedimiento, por ejemplo, por inhalacion y/o administracion topica. Como alternativa o ademas, el CO puede administrarse al paciente despues del procedimiento, por ejemplo, empezando inmediatamente despues de la complecion del procedimiento, y continuando durante aproximadamente 1, 2, 3, 5, 7 o 10 horas, o aproximadamente 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 o 60 dfas, indefinidamente, o hasta que el paciente ya no padece, o esta en riesgo de, ECN despues de la complecion del procedimiento.

Se han descrito una serie de realizaciones de la invencion que estan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Monoxido de carbono para usar en el tratamiento o la prevencion de la enterocolitis necrosante en un paciente.

   5 2. Uso del monoxido de carbono para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar o prevenir la enterocolitis necrosante en un paciente.
2. 3. El uso de las reivindicaciones 1o2, en el que la composicion farmaceutica se administra al paciente por via oral, por inhalacion o mediante administracion directa a la cavidad abdominal del paciente.

   10
3. 4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el paciente es un lactante, o un lactante prematuro; muestra bajo peso al nacer, hipoxia, hipotermia, hipotension, hiperviscosidad de la sangre o acidosis; ha recibido una exanguinotransfusion, al menos una alimentacion hiperosmolar, una transfusion de concentrado de eritrocitos, o una sobredosis de antagonistas de calcio; padece isquemia mesenterica o una infeccion bacteriana de la pared

   15 intestinal; o se ha sometido, esta a punto de someterse o se esta sometiendo a una intervencion quirurgica.
4. 5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que tratar o prevenir la enterocolitis necrosante comprende, ademas, administrar al paciente un tratamiento seleccionado del grupo que consiste en: alimentacion intravenosa; hidratacion intravenosa; un agente antimicrobiano; y realizar descompresion nasogastrica en el

   20 paciente.
5. 6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la composicion farmaceutica se administra por un pulmon artificial o un dispositivo extracorporeo de intercambio de gases a traves de una membrana.

   25 7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la composicion farmaceutica se administra antes, durante o despues de realizar una intervencion quirurgica en el paciente para extirpar una parte afectada del intestino del paciente.
6. 8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la composicion farmaceutica esta en forma gaseosa. 30
7. 9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la composicion farmaceutica esta en forma lfquida.
8. 10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el tratamiento o prevencion de la enterocolitis necrosante comprende

   35

   (a) liberar la composicion farmaceutica desde un recipiente que contiene un gas presurizado que comprende monoxido de carbono, para formar una atmosfera que comprende monoxido de carbono gaseoso; y

   (b) exponer al paciente a dicha atmosfera.

   40 11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el paciente es un ser humano.
9. 12. El uso de la reivindicacion 10, en el que el monoxido de carbono gaseoso esta presente en el gas presurizado a una concentracion de al menos aproximadamente el 0,025 %, al menos aproximadamente el 0,05 %, al menos aproximadamente el 0,10 %, al menos aproximadamente el 1,0 % o al menos aproximadamente el 2,0 %.

   45
10. 13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la composicion farmaceutica comprende monoxido de carbono a una concentracion de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,24 %, de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 0,22 %, de aproximadamente el 0,015 % a aproximadamente el 0,20 %, o de aproximadamente el 0,025 % a aproximadamente el 0,1 %.

    50