RS91104A

RS91104A - Postupci za lečenje nekrotizujućeg enterokolitisa

Info

Publication number: RS91104A
Application number: YUP-911/04A
Authority: RS
Inventors: Leo Otterbein; Brian Zuckerbraun
Original assignee: University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education,
Priority date: 2002-04-15
Filing date: 2003-04-15
Publication date: 2007-02-05
Also published as: EP1499328A1; ES2554108T3; HRP20040973A2; WO2003088981A1; US7981448B2; US20040005367A1; PL374241A1; NO20044564L; CA2481786A1; EA200401366A1; EP1499328B1; UA86570C2; MXPA04010242A; JP4585765B2; AU2003223562A1; CN1652802A; JP2005530737A; EP1499328A4; AU2003223562B2

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za lečenje nekrotizujućeg enterokolitisa kod pacijenta, koji obuhvata primenu na pacijentu farmaceutskog preparata koji sadr-i ugljen monoksid.

Description

POSTUPCI ZA LEČENJE NEKROTIZUJUĆEG ENTEROKOLITISA

Izjava o istraživanju sponzorisanom od strane federalne vlade

Ovaj pronalazak je ostvaren uz podršku Vlade SAD, prema odobrenjima nacionalnih instituta za zdravlje br. HL55330, HL60234 i AI42365. Vlada polaže izvesna prava na predmetni pronalazak.

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na lečenje gastrointestinalnih poremećaja.

Stanje tehnike

Ugljen monoksid (CO) je poznat kao važan signalni molekul (Verma et al, Science 259 : 381 - 384, 1993). Sugerisano je da CO služi kao neurotransmiter u mozgu (Pozzoli et al, Endocrinologv 735 : 2314 - 2317, 1994). Kao i azot oksid (NO), CO je relaksant glatkih mišića (Utz et al., Biochem. Pharmacol. 47 : 195 - 201, 1991; Christodoulides et al., Circulation 97 : 2306 - 9, 1995) i inhibira agregaciju trombocita (Mansouri et al., Thromb Haemost. 48 : 286 - 8, 1982). Pokazano je da inhalacija malih količina CO ima antiinflamatorna dejstva u nekim modelima.

Nekrotizujući enterokolitis (NEC) je oboljenje novorođenčadi koje se karakteriše nefunkcionalnošću crevne barijere, nekrozom creva, sepsom i višesistemskim otkazivanjem organa (videti, npr. Oxford Textbook of Surgery, Morris & Malt, urednici, Oxford University Press (1994)).

Suštinapronalaska

Predmetni pronalazak se delimično zasniva na otkriću da primena CO može da zaštiti od razvoja NEC.

Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja, sprečavanja nastanka ili smanjenja rizika od enterokolitisa kod određenog pacijenta. Postupak obuhvata identifikaciju pacijenta koji boluje ili koji poseduje rizik za razvoj nekrotizujućeg enterokolitisa, kao i primenu kod ovih pacijenta farmaceutskog preparata koji sadrži količinu CO koja je efikasna u lečenju nekrotizujućeg enterokolitisa. Postupak može da obuhvati i korak praćenja razvoja NEC kod pacijenta i/ili određivanja poboljšanja stanja pacijenta ili smanjenja rizika od nastanka NEC.

Farmaceutski preparat može da se primeni kod pacijenta na bilo koji način za primenu gasova, tečnosti i/ili čvrstih supstanci koji je poznat u struci, npr. putem inhalacije, insuflacije, infuzije, injekcije i/ili ingestije. U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, farmaceutski preparat se primenjuje kod pacijenta putem inhalacije. U drugom rešenju, farmaceutski preparat se primenjuje kod pacijenta oralno. U još jednom rešenju, farmaceutski preparat se primenjuje kod pacijenta direktno u abdominalnu duplju. U još jednom rešenju, farmaceutski preparat se primenjuje putem uređaja za ekstrakorporalnu membransku razmenu gasova ili putem veštačkih pluća.

Pacijent može biti dete, npr. terminsko novorođenče, preterminsko novorođenče i/ili novorođenče sa malom telesnom masom na rođenju. Dete može biti novorođenče, ili može biti, na primer, starosti do jedne godine (na primer, starosti do šest meseci, do četiri meseca, do tri meseca ili do dva meseca). Dete može biti mlađe od šest nedelja, na primer, mlađe od četiri nedelje. NEC može biti posledica brojnih činilaca, na primer, hipoksije, hipotermije, hipotenzije, hiperviskoznosti krvi i/ili acidoze i/ili može nastati onda kada pacijent primi izmenjivačku transfuziju, najmanje jednom se hrani hiperosmolarnom hranom, kada primi transfuziju ćelijskih derivata i/ili ukoliko se predozira antagonistima kalcijuma. Dalje, NEC može biti posledica stanja u kome pacijent pati od ishemije mezenterijuma i/ili bakterijske infekcije crevnog zida (videti, na primer, Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)). Alternativno, NEC može nastati kao posledica hirurške intervencije, na primer, onda kada je pacijent podvrgnut ili kada treba da bude podvrgnut ili u toku same hirurške intervencije. Farmaceutski preparat može da se nalazi u bilo kom obliku, na primer, u gasovitom ili u tečnom obliku.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak lečenja ili sprečavanja nastanka nekrotizujućeg enterokolitisa kod pacijenta, koji obuhvata identifikaciju pacijenta koji pati od ili koji poseduje rizik za razvoj nekrotizujućeg enterokolitisa, pri čemu postupak obuhvata sud koji sadrži CO gas pod pritiskom, otpuštanje gasa pod pritiskom iz suda kako bi nastala atmosfera koja sadrži gasoviti CO, kao i izlaganje pacijenta navedenoj atmosferi, pri čemu je količina CO u toj atmosferi dovoljna za lečenje nekrotizujućeg enterokolitisa kod pacijenta.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak izvođenja abdominalne hirurške intervencije kod pacijenta (npr. deteta), koji obuhvata identifikaciju pacijenta kome je potrebna abdominalna hirurška intervencija, pri čemu nekrotizujući enterokolitis predstavlja značajan rizik ove intervencije; izvođenje abdominalne hirurške intervencije na pacijentu, pri čemu pre, tokom ili nakon intervencije pacijent inhalira količinu CO gasa koja je dovoljna da smanji rizik od nastanka nekrotizujućeg enterokolitisa.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak lečenja nekrotizujućeg enterokolitisa kod pacijenta koji obuhvata: (a) identifikaciju pacijenta koji boluje od nekrotizujućeg enterokolitisa; (b) izvođenje hirurške intervencije na pacijentu u cilju resekcije zahvaćenog dela creva; i (c) primenu kod pacijenta farmaceutskog preparata koji sadrži količinu ugljen monoksida koja je efikasna u lečenju enterokolitisa nakon koraka (a), kao i pre, tokom ili nakon koraka (b).

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje sud koji sadrži CO gas koji je komprimovan do stepena koji je potreban za medicinske primene. Sud može da nosi oznaku koja naznačava da gas može da se koristi za lečenje NEC kod pacijenta, na primer, kod deteta. CO gas može biti u smeši sa gasovitim azotom, sa azot oksidom i gasovitim azotom, ili sa gasom koji sadrži kiseonik. CO gas može da bude prisutan u smeši u koncentraciji od najmanje oko 0,025%, na primer, od najmanje oko 0,05%, 0,10%, 0,50%, 1,0%, 2,0%, 10%, 50% ili 90%.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja NEC kod pacijenta, koji obuhvata identifikaciju pacijenta koji boluje od nekrotizujućeg enterokolitisa i primenu najmanje jednog od sledećih tretmana uz tretman sa CO: indukcija HO-1 ili feritina kod pacijenta; ekspresija rekombinantnog HO-1 ili feritina kod pacijenta; i primena farmaceutskog preparata koji sadrži HO-1, bilirubin, biliverdin, feritin ili apoferitin, gvožđe, desferoksamin ili gvožđe dekstran. Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje korišćenje CO i bilo kog gore navedenog sredstva u pripremi preparata namenjenog lečenju NEC.

Dalje, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja NEC kod pacijenta koji obuhvata identifikaciju pacijenta koji boluje ili poseduje rizik za razvoj nekrotizujućeg enterokolitisa i primenu najmanje jednog od sledećih tretmana uz tretman sa CO: intrevenska ishrana; intravenska hidracija; antimikrobna sredstva; izvođenje nazogastrične dekompresije kod pacijenta, izvođenje hirurške intervencije kod pacijenta; i drenaža peritonealne duplje kod pacijenta.

Takođe, obimom zaštite predmetnog pronalaska je obuhvaćeno korišćenje CO u proizvodnji preparata namenjenog lečenju ili sprečavanju nastanka NEC. Preparat može da se koristi u postupku za lečenje NEC kod pacijenta koji pati od ili koji poseduje rizik za razvoj NEC, shodno postupcima koji su ovde opisani. Medikament može biti u bilo kom obliku koji je ovde opisan, na primer, u obliku tečnog ili gasovitog preparata CO.

Osim ako nije drugačije defmisano, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste poseduju isto značenje koje je uobičajeno među stručnjacima, kojima je ovaj pronalazak i namenjen. Odgovarajući postupci i materijali su opisani u tekstu koji sledi, pri čemu se u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska mogu koristiti postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani. Sve publikacije, patentne prijave, patenti i druge reference koje su ovde spomenute, u potpunosti su inkorporirane po referenci. U slučaju konflikta, predmetna specifikacija, uključujući definicije, ima prednost. Materijali, postupci i primeri su isključivo ilustrativni i ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.

Detalji jednog ili više rešenja prema predmetnom pronalasku su prikazani u opisu koji sledi. Druge karakteristike, ciljevi i prednosti pedmetnog pronalaska će biti jasni na osnovu opisa i patentnih zahteva.

Opiscrteža

Slika 1A predstavlja rezultate Western blot analize, koji pokazuju daje ekspresija HO-1 povećana u intestinalnim uzorcima humanih neonatusa koji su oboleli od NEC, u poređenju sa pacijentima koji ne boluju od NEC (kontrola) (n = 3).

Slika 1B predstavlja rezultate Western blot analize, koji pokazuju daje nivo HO-1 proteina iz ileuma povišen tokom četvrtog dana kod neonatusa pacova koji su podvrgnuti intermitentnoj hipoksiji i koji se hrane veštačkom hranom (NEC), u poređenju sa kontrolnim pacovima koji sisaju (kontrola) (n = 4).

Slika 2A je fotomikrografija (uvećanje 40x) hematoksilinom i eozinom obojenog preparata ileuma, koja ilustruje dejstvo ishrane sisanjem kod neonatusa pacova. Uzorak je uzet tokom četvrtog dana.

Slika 2B je fotomikrografija (uvećanje 40x) hematoksilinom i eozinom obojenog preparata ileuma, koja ilustruje dejstvo ishrane sisanjem i izlaganja CO kod neonatusa pacova. Uzorak je uzet tokom četvrtog dana.

Slika 2C je fotomikrografija (uvećanje 40x) hematoksilinom i eozinom obojenog preparata ileuma, koja ilustruje dejstvo ishrane veštačkom hranom uz izlaganje hipoksiji kod neonatusa pacova. Uzorak je uzet tokom četvrtog dana. Mogu se primetiti promene građe, uključujući atrofiju crevnih resica i ćelijsku vakuolizaciju.

Slika 2D je fotomikrografija (uvećanje 40x) hematoksilinom i eozinom obojenog preparata ileuma, koja ilustruje dejstvo ishrane veštačkom hranom uz izlaganje hipoksiji i izlaganje CO kod neonatusa pacova. Javlja se manje promena u građi, u poređenju sa uzorkom koji je prikazan na Slici 2C. Uzorak je uzet tokom četvrtog dana.

Slika 3A je fotomikrografija (uvećanje 60 x) preparata ileuma obojenog tehnikom terminalnog dUTP obeležavanja krajnjeg useka koje je posredovano deoksinukleotidil transferazom (TUNEL - terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling), koja ilustruje dejstvo ishrane sisanjem kod neonatusa pacova. Uzorak je uzet tokom četvrtog dana.

Slika 3B je fotomikrografija (uvećanje 60 x) preparata ileuma obojenog tehnikom TUNEL, koja ilustruje dejstvo ishrane sisanjem uz izlaganje CO kod neonatusa pacova. Uzorak je uzet tokom četvrtog dana.

Slika 3C je fotomikrografija (uvećanje 60 x) preparata ileuma obojenog tehnikom TUNEL, koja ilustruje dejstvo ishrane veštačkom hranom uz izlaganje hipoksiji kod neonatusa pacova. Uzorak je uzet tokom četvrtog dana. Uzorci ileuma kod pacova koji su tretirani hipoksijom i veštačkom hranom pokazuje pojačano TUNEL bojenje, u poređenju sa životinjama koje su hranjene sisanjem.

Slika 3D je fotomikrografija (uvećanje 60x) preparata ileuma obojenog tehnikom TUNEL, koja ilustruje dejstvo ishrane veštačkom hranom uz izlaganje hipoksiji i izlaganje CO kod neonatusa pacova. Uzorak je uzet tokom četvrtog dana. Može se primetiti smanjenje TUNEL pozitivnih ćelija.

Slika 4A je fotomikrografija koja pokazuje da tretiranje sa CO sprečava povećanje nivoa IL1-J3 u serumu kod neonatusa pacova izlaganih hipoksiji koji su hranjeni veštačkom hranom, u poređenju sa kontrolom (p<0,05). Podaci su dobijeni korišćenjem ELISA. Crne prečke = pacovi izloženi vazduhu; sive prečke = pacovi izloženi CO.

Slika 4B je fotomikrografija koja pokazuje da tretiranje sa CO sprečava povećanje nivoa TNF-a u serumu kod neonatusa pacova izlaganih hipoksiji koji su hranjeni veštačkom hranom, u poređenju sa kontrolom (p<0,05). Podaci su dobijeni korišćenjem ELISA. Crne prečke = pacovi izloženi vazduhu; sive prečke = pacovi izloženi CO.

Slika 5 predstavlja rezultate Western blot analize, koji pokazuju da tretman sa CO smanjuje ekspresiju COX-2 i IL-1|3 u ileumu kod neonatusa pacova koji su izloženi hipoksiji i koji su hranjeni veštačkom hranom, u poređenju sa kontrolom. Prisustvo (+) ili odsustvo (-) nekog od tretmana (ishrana sisanjem (BF - breast feeding), ishrana veštačkom hranom uz izlaganje hipoksiji (FF/hipoksija) i izlaganje CO (CO)) je naznačeno ispod svake od staza Western blot analize. Analiza obuhvata 3-4 životinje po grupi i reprezentativna je za sve životinje u studiji.

Slika 6 predstavlja rezultate Western blot analize, koji pokazuju da izlaganje CO smanjuje nekrotizujućim enterokolitisom eksperimentalno izazvanu ekspresiju iNOS u ileumu i povećanje nivoa nitrita kod neonatusa pacova. Prisustvo (+) ili odsustvo (-) nekog od tretmana (ishrana sisanjem (BF - breast feeding), ishrana veštačkom hranom uz izlaganje hipoksiji (FF/hipoksija) i izlaganje CO (CO)) je naznačeno ispod svake od staza Western blot analize.

Slika 7 predstavlja grafikon sa prečkama koji pokazuje da izlaganje CO i indukcija HO-1 smanjuju smrt IEC-6 ćelija indukovanu TNFa/aktinomicinom D (TNF/ActD). Vijabilnost IEC-6 ćelija koje su tretirane sa TNFa (TNF; 10 ng/ml)/aktinomicinom D (ActD; 200 ng/ml)je ispitivana nakon 18 časova merenjem ćelijskog sadržaja ATP. Tretman sa CO (CO; sive prečke; 250 ppm) je započet 1 čas pre primeneTNFa/ActD i održavan je tokom trajanja eksperimenta. Išrafirane prečke = ćelije koje su izložene dejstvu kobalt protoporfirina (CoPP) 16 časova pre izlaganja TNFa/ActD. Crne prečke = ćelije izložene vazduhu. I CO i CoPP značajno smanjuju smrt IEC-6 ćelija indukovanu TNF-a/ActD (p<0,05). Rezultati su dati kao srednje vrednosti ± standardna greška kod 3 nezavisne studije koje su izvedene u triplikatu.

Slika 8A predstavlja rezultate Western blot analize, koji pokazuju (tokom 24 časa) da je ekspresija iNOS proteina inhibirana kod lipopolisaharidom (LPS) i hipoksijom (1% kiseonika) tretiranih IEC-6 ćelija. Tretman sa CO (250 ppm) je započet 1 čas pre dodavanja LPS u uslovima hipoksije i održavanje tokom čitavog eksperimenta. Kombinacija LPS (10 ili 100 ng/ml) i hipoksije povećava ekspresiju iNOS proteina, što je dejstvo koje je inhibirano sa CO. Prisustvo (+) ili odsustvo (-) nekog od tretmana (lipopolisaharid (LPS), izlaganje hipoksiji i izlaganje CO (CO)) je naznačeno ispod svake od staza Western blot analize.

Slika 8B je grafikon sa prečkama koji pokazuje da je aktivnost iNOS promotera pacova kod IEC-6 ćelija koje su tretirane sa LPS (100 ng/ml) i izlagane hipoksiji (1% kiseonika) (LPS/hipoksija) ograničena izlaganjem CO. Ćelije su ispitivane na aktivnost luciferaze. Kombinacija LPS i hipoksije je dovela do povećanja transkripcione aktivnosti iNOS promotera od 4,0 ± 0,3 puta (p<0,05). CO ograničava navedenu transkripcionu aktivnost na povećanje od 1,7 ± 0,2 puta (p<0,05). Rezultati su dati kao srednje vrednosti ± standardna greška kod 3 nezavisne studije koje su izvedene u triplikatu.

Slika 8C predstavlja rezultate Western blot analize, koji pokazuju da je citokinima indukovana ekspresija proteina iNOS inhibirana kod IEC-6 ćelija indukcijom HO-1 ili tretmanom sa CO. IEC-6 ćelije su tretirane smešom citokina (SC) koja sadrži TNF-a (10 ng/ml), IL-1B (500 j/ml) i IFN-y (1000 j/ml) tokom 24 časa. Tretman sa CO (250 ppm) je započet 1 čas pre primene SC i održavan je tokom čitavog trajanja eksperimenta. Kobalt protoporfirin (CoPP) je primenjen 16 časova pre tretmana sa SC. SC povećava nivo iNOS proteina kod IEC-6 ćelija. I CO i CoPP inhibiraju citokinima indukovano povećanje nivoa iNOS proteina. Prisustvo (+) ili odsustvo (-) nekog od tretmana (smeša citokina (SC), tretman sa CO (CO) i sa kobalt protoporfirinom (CoPP)) je naznačeno ispod svake od staza Western blot analize.

Slika 8D predstavlja grafikon sa prečkama, koji pokazuje da je nivo nitrita u supematantima IEC-6 ćelijskih kultura koje su izložene SC i tretmanu ili sa CO ili sa CoPP niži u odnosu na supernatante IEC-6 ćelija koje su izložene SC i vazduhu (što je određeno Griess testom). Stimulacija citokinima povećava koncentraciju nitrita do 17 ± 0,9 uM u poređenju sa koncentracijom od 1,4 ± 0,3 uM kod nestimulisanih kontrolnih životinja (p<0,01). CO i CoPP značajno inhibiraju ovaj efekat citokina, što rezultuje nivoima nitrita od 9,8 ± 0,7 i 10,4 ± 1,0, respektivno (p<0,05 u poređenju sa ćelijama stimulisanim sa SC). Crne prečke = ćelije izložene vazduhu; sive prečke = ćelije izložene CO; išrafirane prečke = ćelije izložene CoPP.

Detaljan opis pronalaska

Pojam "ugljen monoksid" (ili "CO"), kao što se ovde koristi, označava molekulski oblik CO u stanju gasa, komprimovanom u tečnost ili rastvorenom u vodenom rastvoru. Pojmovi "preparat sa ugljen monoksidom" i "farmaceutski preparat koji sadrži ugljen monoksid" se koriste u predmetnoj specifikaciji da opišu gasoviti ili tečni preparat koji sadrži CO i koji može biti primenjen kod pacijenta i/ili na organu, npr. na organu koji je zahvaćen sa NEC. Iskusni stručnjak će znati koji je oblik farmaceutskog preparata, npr. gasoviti, tečni ili gasoviti i tečni, poželjan u datoj primeni.

Pojmovi "efikasna količina" i "efikasan u lečenju", kao što se ovde koriste, označavaju količinu ili koncentraciju CO koja se koristi tokom određenog vremenskog perioda (uključujući akutnu ili hroničnu primenu, kao i periodičnu ili kontinuiranu primenu) koja je efikasna u kontekstu izazivanja željenog dejstva ili fiziološkog ishoda kod datog pacijenta. Efikasne količine CO kod primene u predmetnom pronalasku obuhvataju, na primer, količine koje umanjuju simptome NEC kod pacijenta, ili koje poboljšavaju ishod stanja.

Za gasove, efikasne količine CO se generalno nalaze u opsegu od oko 0,0000001% do oko 0,3% (maseni procenti), npr. od 0,0001% do oko 0,25% (maseni procenti), poželjno najmanje od oko 0,001%, na primer, najmanje 0,005%, 0,010%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,22% ili 0,24% (maseni procenti) CO. Za tečne rastvore CO, efikasne količine se generalno nalaze u opsegu od oko 0,0001 do oko

> 0,0044 g CO/lOOg tečnosti, na primer, najmanje 0,0001, 0,0002, 0,0004, 0,0006, 0,0008, 0,0010, 0,0013, 0,0014, 0,0015, 0,0016, 0,0018, 0,0020, 0,0021, 0,0022, 0,0024, 0,0026, 0,0028, 0,0030, 0,0032, 0,0035, 0,0037, 0,0040 ili 0,0042 g CO/100 g tečnog rastvora. Poželjne količine obuhvataju, na primer, od oko 0,0010 do oko 0,0030 g CO/100 g tečnosti, od oko 0,0015 do oko 0,0026 g CO/100 g tečnosti ili od oko 0,0018 do oko 0,0024 g CO/100 g tečnosti. Iskusni stručnjak shvata da se mogu primeniti i doze koje izlaze iz navedenih opsega, što zavisi od same primene.

Pojam "pacijent" se koristi u predmetnoj specifikaciji da opiše životinju, čoveka ili organizam koji nije ljudski, za koga je obezbeđen tretman prema postupcima predmetnog pronalaska. Predmetnim pronalaskom su jasno obuhvaćene primene u veterinarskoj medicini. Navedeni pojam obuhvata, bez ograničenja, sisare, na primer, ljude, druge primate, svinje, glodare, kao što su miševi i pacovi, zečeve, zamorce, hrčke, krave, konje, mačke, pse, ovce i koze. Pojam "tretirati/tretman" se ovde koristi da opiše odlaganje pojave, inhibiciju ili ublažavanje efekata stanja, na primer, NEC, kod pacijenta.

Pojam "nekrotizujući enterokolitis" ili "NEC" je u struci poznati pojam i ovde se koristi da označi oboljenje kod pacijenta, posebno kod preterminskog ili terminskog novorođenčeta, koje se karakteriše nefunkcionalnošću crevne barijere, intestinalnom nekrozom, sepsom i nefunkcionalnošću organa više sistema (Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)). NEC može da zahvati bilo koji deo creva, na primer, donji deo tankog crva (ileum), debelo crevo i/ili gornji deo tankog creva. Rizik od nastanka nekrotizujućeg enterokolitisa je udružen sa mnogim činiocima, na primer, sa malom masom pri rođenju, hipoksijom, hipotermijom, hipotenzijom, hiperviskoznošću, acidozom, ili prisustvom slobodnih radikala kiseonika( Id.).Drugi faktori rizika uključuju postojanje kanile u umbilikalnoj arteriji, izmenjivačke transfuzije, ishranu hiperosmolarnom hranom, transfuzije ćelijskim derivatima krvi ili predoziranje antagonistima kalcijuma( Id.).Navedeni činioci mogu da izazovu ishemiju mezenterijuma, koja može dovesti do bakterijske infekcije crevnog zida, što vodi nekrozi inficiranog tkiva i/ili perforaciji crevnog zida i septikemiji( Id.).NEC takođe može da se javi kod neonatusa nakon hirurške intervencije zbog gastrointestinalnih ili drugih stanja( Id.).

Iskusni stručnjak zna da NEC kod pacijenta može da bude dijagnostikovan primenom bilo kog poznatog postupka u struci, na primer, lekar može postaviti dijagnozu (npr. korišćenjem tehnika vizuelizacije, kao što su ultrazvuk, rentgenografija i/ili testova krvi).

Od predmetnog pronalaska posebno mogu da imaju koristi pojedinci za koje se smatra da poseduju rizik za razvoj NEC, primarno zbog toga što profilaktički tretman može da započne pre pojave bilo kakvih znakova NEC. Pojedinci "koji poseduju rizik" za razvoj NEC obuhvataju, na primer, preterminsku ili terminsku novorođenčad, ili pojedince koji boluju od bilo kog stanja navedenog gore ili koji poseduju faktore rizika koji su gore navedeni. Iskusni stručnjak zna da rizik od razvoja NEC kod pacijenta može da bude dijagnostikovan primenom bilo kog poznatog postupka u struci, na primer, lekar može postaviti dijagnozu (npr. procenom pacijentovih faktora rizika).

Dobijanje gasovitih preparata

CO preparat može biti gasoviti CO preparat. Komprimovani gas ili gas pod pritiskom koji se može koristiti u postupcima prema predmetnom pronalasku može da se pribavi posredstvom bilo kog komercijalnog izvora, kao i u bilo kom tipu suda koji služi za skladištenje komprimovanog gasa. Na primer, komprimovani gas ili gas pod pritiskom može da se pribavi od bilo kog izvora koji proizvodi komprimovane gasove, na primer, kiseonik, za medicinske primene. Pojam "gas za medicinsku primenu", kao što se ovde koristi, označava gas koji je pogodan za primenu kod pacijenata, kao što je ovde definisano. Gas pod pritiskom, uključujući CO koji se koristi u postupcima prema predmetnom pronalasku, može da se pribavi u obliku u kome se svi gasovi (npr. CO, He, NO, C02, 02, N2), koji su poželjni u konačnom obliku preparata, nalaze u istom sudu, s tim da NO i O2ne mogu da se skladište zajedno. Opciono, postupci prema predmetnom pronalasku mogu da se sprovedu korišćenjem više sudova koji sadrže pojedinačne gasove. Na primer, može biti obezbeđen jedan sud koji sadrži CO, sa ili bez drugih gasova, čiji sadržaj može opciono da se meša sa sobnim vazduhom ili sa sadržajem drugih sudova, na primer, sudova koji sadrže kiseonik, azot, ugljen dioksid, komprimovani vazduh ili bilo koji drugi pogodni gas ili smešu gasova.

Gasoviti preparati koji se primenjuju na pacijentu prema predmetnom pronalasku tipično sadrže od 0% do 79% azota (maseni procenti), od oko 21% do oko 100% kiseonika (maseni procenti) i od oko 0,0000001% do oko 0,3% (maseni procenti) CO (što odgovara od oko 1 ppb ili 0,001 ppm do oko 3000 ppm). Poželjno, količina azota u gasovitom preparatu je oko 79% (maseni procenti), količina kiseonika je oko 21% (maseni procenti), a količina CO je od oko 0,0001% do oko 0,25% (maseni procenti). Količina CO je poželjno najmanje oko 0,001%, najmanje oko 0,0005%, 0,010%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,08%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,22% ili 0,24% (maseni procenti). Poželjna količina se nalazi u opsegu od oko 0,005% do oko 0,24%, od oko 0,01% do oko 0,22%, od oko 0,015% do oko 0,20%, od oko 0,08% do oko 0,20%, od oko 0,025% do oko 0,1% (maseni procenti). Primećeno je da gasoviti CO preparati koji poseduju koncentraciju CO veću od 3% (kao što je konc. od 1% ili veća) mogu da se koriste tokom kratkog perioda (npr. jedan ili dva udana), u zavisnosti od primene.

Gasoviti CO preparat može da se koristi za stvaranje atmosfere koja sadrži CO gas. Atmosfera koja sadrži odgovarajuće nivoe CO gasa može da se formira, na primer, obezbeđivanjem suda koji sadrži gas pod pritiskom u kome se nalazi CO i otpuštanjem gasa pod pritiskom iz suda u komoru ili određeni prostor, kako bi nastala atmosfera koja sadrži CO gas unutar komore ili određenog prostora. Alternativno, gasovi mogu da se otpuštaju u aparat koji se završava maskom za disanje ili tubusom za disanje, čime se na taj način stvara atmosfera koja sadrži CO gas u maski ili tubusu za disanje, što obezbeđuje da pacijent bude jedina osoba .u prostoriji koja je izložena značajnim nivoima CO.

Nivoi CO u atmosferi mogu da se mere ili prate korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci. Navedeni postupci obuhvataju elektrohemijsku detekciju, gasnu hromatografiju, određivanje radioaktivnosti izotopa, infracrvenu apsorpciju, kolorimetriju i elektrohemijske postupke koji se zasnivaju na selektivnim membranama (videti, na primer, Sunderman et al., Clin. Chem. 28 : 2026 - 2032, 1982; Ingi et al., Neuron 16 : 835 - 842, 1996). Sub-ppm nivoi CO mogu da se detektuju, na primer, gasnom hromatografijom i merenjem radioaktivnosti radioizotopa. Dalje, u struci je poznato da nivoi CO u sub-ppm opsegu mogu da se mere u biološkom tkivu senzorom za gas koji radi u srednjem infracrvenom delu spektra (videt, na primer, Morimoto et al., Am, J. Phvsiol. Heart Circ. Phvsiol. 280 : H482 - H488, 2001). CO senzori i uređaji za detekciju gasa su široko dostupni kod brojnih komercijalnih izvora.

Dobijanje tečnih preparata

CO preparat takođe može biti tečni CO preparat. Tečni CO preparat može da se dobije bilo kojim postupkom koji je poznat u struci kojim se gasovi čine rastvorljivim u tečnostima. Na primer, tečnost može da se postavi u takozvani "CO2inkubator" i da se izloži kontinuiranom protoku CO, poželjno balansiranom ugljen dioksidu, sve dok se ne postigne željena koncentracija CO u tečnosti. Drugi primer je propuštanje CO gasa u vidu mehurića direktno kroz tečnost sve do postizanja željene koncentracije CO. Količina CO koja može da se rastvori u datom vodenom rastvoru se povećava sa snižavanjem temperature. Još jedan primer je da odgovarajuća tečnost može da se propušta kroz cev koja dozvoljava gasnu difuziju, pri čemu se cev dovodi u atmosferu koja sadrži CO (na primer, korišćenjem uređaja kao što je membrana ekstrakorporalnog oksigenatora). CO difunduje u tečnost, kako bi nastao tečni CO preparat.

Verovatno je daje takav tečni preparat namenjen korišćenju na živoj životinji i da će njegova temperatura iznositi oko 37 °C u vreme njegove primene.

Tečnost može biti bilo koja tečnost koja je poznata stručnjacima i koja je pogodna za primenu kod pacijenata (videti, na primer, Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)). Generalno, tečnost može biti vodeni rastvor. Primeri rastvora obuhvataju fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS - Phosphate Buffered Saline), Celsior™, Perfadex™, Collins-ov rastvor, rastvor citrata i rastvor Univerziteta u Viskonsinu (Universitv of Wisconsin solution - UWS) (Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)). U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, tečnost je Ringerov rastvor, na primer, Ringer - laktatni rastvor, ili bilo koja druga tečnost koja može da bude primenjena u vidu infuzije kod pacijenta. U drugom rešenju, tečnost obuhvata krv, na primer, punu krv.

Svaka pogodna tečnost može biti zasićena do odgovarajuće koncentracije CO putem difuzera za gas. Alternativno, mogu se koristiti prethodno napravljeni rastvori koji su prošli kontrolu kvaliteta o posedovanju odgovarajućih nivoa CO. Precizna kontrola doze može da se postigne merenjima membranom koja je propusna za gas, a koja je nepropusna za tečnost i koja je povezana sa analizatorom za CO. Rastvori mogu biti zasićeni do željenih efikasnih koncentracija koje se održavaju na datim nivoima.

Tretman pacijenata preparatima ugljen monoksida

Pacijent može biti tretiran sa preparatom CO primenom bilo kog postupka koji je poznat u struci za primenu gasova i/ili tečnosti kod pacijenata. CO preparati mogu da se primenjuju kod pacijenta kod koga je dijagnostikovan ili za koga je procenjeno da postoji rizik od razvoja nekrotizujućeg enterokolitisa, na primer kod terminskih ili preterminskih novorođenčadi. Predmetni pronalazak obuhvata sistemsku primenu tečnih ili gasovitih CO preparata kod pacijenata (na primer, inhalacijom i/ili ingestijom), kao i topijsku primenu preparata na gastrointestinalnom traktu pacijenta (npr. ingestijom, insuflacijom i/ili unošenjem u abdominalnu duplju).

Sistemskaprimena ugljen monoksida

Gasoviti CO preparati mogu da se sistemski primene kod pacijenta, na primer, kod pacijenta kod koga je dijagnostikovan ili za koga je procenjeno da postoji rizik od razvoja nekrotizujućeg enterokolitisa. Gasoviti CO preparati se tipično primenjuju inhalacijom kroz usta ili nosne hodnike do pluća, gde se CO brzo apsorbuje u cirkulaciju pacijenta. Koncentracija aktivnog jedinjenja (CO) koja se koristi u terapijskom gasovitom preparatu zavisi od brzine apsorpcije, distribucije, inaktivacije i ekskrecije CO (generalno, putem respiracije), kao i od drugih činilaca koji su poznati stručnjacima. Treba primetiti da kod svakog subjekta tokom vremena specifični dozni režim treba da bude podešen shodno individualnim potrebama i profesionalnoj proceni osobe koja primenjuje ili koja nadgleda primenu preparata, a takođe treba primetiti da su ovde navedeni opsezi koncentracija isključivo ilustrativne prirode i da ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite ili primenu preparata prema predmetnom pronalasku. Obimom zaštite predmetnog pronalaska su obuhvaćene akutna, subakutna i hronična primena CO, i ona zavisi, na primer, od ozbiljnosti ili trajanja NEC kod pacijenta. CO može da se primeni kod pacijenta tokom vremena (uključujući i neograničeno dugu primenu) koje je dovoljno za lečenje stanja i za ispoljavanje željenog farmakološkog ili biološkog dejstva.

Slede primeri nekih od postupaka i uređaja koji se mogu koristiti za primenu gasovitih preparata CO kod pacijenata.

Respiratori

CO za medicinske primene (koncentracije mogu da variraju) može da se naruči pomešan sa vazduhom ili drugim gasom koji sadrži kiseonik u standardnom rezervoaru za komprimovani gas (npr. smeša 21% O2 i 79% N2). Gas je nereaktivan, a koncentracije koje su potrebne za postupke prema predmetnom pronalasku se nalaze dosta ispod opsega zapaljivosti (10% u vazduhu). U bolničkom okruženju, gas se verovatno primenjuje uz krevet pacijenta, gde se meša sa kiseonikom ili sobnim vazduhom, u posudi za mešanje, do postizanja željene koncentracije izražene u ppm (delovi na milion). Pacijent inhalira gasnu smešu putem respiratora, kod koga je brzina protoka podešena u odnosu na komfor i potrebe pacijenta. Ovo se određuje na osnovu grafikona plućnih funkcija (tj. frekfence disanja, zapremine udana i izdana itd.). Na sistemu za primenu se mogu dizajnirati sigurnosni mehanizmi koji bi sprečili da pacijent nepotrebno primi veću količinu CO od željene. Nivo CO koji pacijent prima može se pratiti posmatranjem: (1) karboksihemoglobina (COHb), koji se određuje u venskoj krvi i (2) izdahnutog CO koji se prikuplja na sporednom portu respiratora. Izlaganje CO može da se podesi na osnovu zdravstvenog stanja pacijenta i na osnovu drugih pokazatelja. Ukoliko je potrebno, CO može biti istisnut iz organizma pacijenta primenom inhalacije sa 100% 02. CO se ne metaboliše; stoga, količina koja se udahne će na kraju biti potpuno izdahnuta, izuzev veoma malog procenta koji se prevede u C02. CO može da se meša u bilo kom odnosu sa 02, kako bi se obezbedila terapijska primena CO bez posledičnih hipoksičnih stanja.

Maska za lice i šator za inhalaciju

Gasovita smeša koja sadrži CO može da se pripremi kao što je gore navedeno kako bi se omogućila pasivna inhalacija od strane pacijenta koji koristi masku za lice ili šator za inhalaciju. Koncentracija koja se inhalira može da se menja i može biti istisnuta iz organizma pacijenta prostim prebacivanjem na 100% 02. Praćenje nivoa CO može da se izvede na ili blizu maske ili šatora uz sigurnosni mehanizam koji sprečava da suviše velika koncentracija CO bude inhalirana.

Prenosivi inhalator

Komprimovani CO može da se upakuje u prenosivi uređaj za inhalaciju i da bude inhaliran u određenoj dozi, na primer, kako bi se obezbedio intermitentni tretman kod pacijenta koji se ne nalazi u bomičkim uslovima. U kontejnere mogu biti upakovane različite koncentracije CO. Uređaj može biti jednostavan, u obliku malog rezervoara (npr. nosivosti ispod 5 kg) sa odgovarajuće razblaženim CO, sa ventilom za otvaranje/zatvaranje i sa cevkom iz koje pacijent uzima udah CO prema standardnom režimu ili po potrebi.

Intravenska veštačka pluća

Veštačka pluća (uređaj u vidu katetera za izmenu gasova u krvi) koji je dizajniran za dopremanje 02i uklanjanje C02, može biti upotrebljen za dopremanje CO. Kada je implantiran, kateter se nalazi u jednoj od većih vena i sposoban je za dopremanje CO u datim koncentracijama sistemski ili lokalno. Dopremanje može biti lokalno dopremanje visokih koncentracija CO tokom kratkog perioda na mestu izvođenja intervencije, npr. u blizini tankog creva (ova visoka koncentracija brzo biva razblažena u cirkulaciji) ili tokom dužeg perioda u niskoj koncentraciji (videti, na primer, Hattler et al., Artif. Organs 18 (11) : 806 - 812 (1994); i Golob et al., ASAIO J., 47 (5) : 432 - 437 (2001)).

Komora sa normalnim pritiskom

U određenim slučajevima, poželjno je da se čitav pacijent izloži dejstvu CO. Pacijent treba da se nalazi unutar hermetički zatvorene komore u koju je ubačen CO (u koncentraciji koja ne ugrožava pacijenta, ili u koncentraciji koja nosi prihvatljiv rizik, bez rizika da posmatrači budu izloženi dejstvu gasa). Nakon okončanja izloženosti, komora može biti isprana vazduhom (npr. 21% O2, 79% N2), a uzorci mogu biti analizirani primenom CO analizatora, kako bi se osiguralo da CO nije ostao u komori pre nego se pacijent izvede iz sistema za izlaganje.

Sistemska primena tečnih CO preparata

Predmetni pronalazak dalje obuhvata stvaranje tečnih CO preparata za sistemsku primenu kod pacijenta, npr. infuzijom. Na primer, tečni CO preparati, kao što je Ringerov rastvor zasićen sa CO, mogu da se primene infuzijom kod pacijenta koji boluje od ili poseduje'rizik za razvoj NEC. Alternativno, ili kao dodatak, kod pacijenta može da se primeni i puna krv (ili njene frakcije) koja je delimično ili potpuno zasićena sa CO. Predmetni pronalazak takođe obuhvata primenu sredstava koja su sposobna za dopremanje doza CO gasa ili tečnosti (npr. gume, kremove, masti ili flastere koji otpuštaju CO).

Topijski tretman gastrointestinalnog trakta ugljen monoksidom

Alternativno, ili kao dodatak, CO preparati mogu da se primene direktno u gastrointestinalnom traktu, npr. unutar ili izvan celog gastrointestinalnog trakta, ili na nekom njegovom delu. Gasoviti preparat može da se primeni direktno na gastrointestinalni trakt pacijenta, na primer, kod preterminskog ili terminskog novorođenčeta, primenom bilo kog

<*>postupka u struci koji se koristi za insuflaciju gasova kod pacijenta. Na primer, gasovi, kao ugljen dioksid, se često insufliraju u gastrointestinalni trakt i u abdominalnu duplju pacijenta

kako bi olakšali pregled tokom endoskopskih i laparoskopskih procedura, respektivno (videti, na primer, Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press

(1994)). Iskusni stručnjak zna da se slične procedure mogu primeniti za dopremanje CO preparata direktno u gastrointestinalni trakt pacijenta. Predmetni pronalazak takođe može da se primeni radi sprečavanja nastanka NEC kao posledice laparoskopije ili endoskopije, npr. kolonoskopije i ezofagogastroduodenoskopije.

Vodeni CO preparati takođe mogu da se primene topijski u gastrointestinalnom traktu pacijenta. Vodeni oblici preparata mogu da se primene korišćenjem bilo kog postupka koji je poznat u struci za primenu tečnosti kod pacijenta. Kao i u slučaju gasovitih preparata, vodeni preparati mogu da se primene direktno u unutrašnjosti i/ili spolja na gastrointestinalni trakt. Na primer, vodeni oblik preparata može da se primeni oralno, na primer, tako što pacijent proguta enkapsuliranu ili ne-enkapsuliranu dozu vodenog CO preparata. U drugom primeru, tečnosti, na primer, fiziološki rastvor koji sadrži rastvoreni CO, može da se injektira u gastrointestinalni trakt i u abdominalnu duplju pacijenta tokom endoskopskih i laparoskopskih procedura, respektivno. Dalje, izlaganjein situmože da se izvede ispiranjem gastrointestinalnog trakta ili njegovog dela tečnim CO preparatom (videti Oxford Textbook of Surgerv, Morris & Malt, urednici, Oxford Universitv Press (1994)).

Primena hemoksigenaze- 1, drugih jedinjenja i drugih tretmana za NEC

Predmetni pronalazak takođe obuhvata indukciju ekspresije hemoksigenaze-1 (HO-1) zajedno sa primenom CO. Na primer, HO-1 može biti indukovana kod pacijenta koji boluje ili koji poseduje rizik za razvoj NEC. Kao što se ovde koristi, pojam "indukovati (indukovan)" označava povećanje proizvodnje proteina, na primer, HO-1, u izolovanim ćelijama ili u ćelijama tkiva, organa ili organizma životinje, korišćenjem ćelijskog endogenog (npr. ne-rekombinantnog) gena koji kodira dati protein.

Ekspresija HO-1 može biti indukovana kod pacijenta bilo kojim postupkom poznatim u struci. Na primer, ekspresija HO-1 može biti indukovana heminom, gvožđe protoporfirinom ili kobalt protoporfirinom. Takože, različita sredstva koja se razlikuju od nema, u koja spadaju teški metali, citokini, hormoni, NO, COCI2, endotoksin i toplotni udar, predstavljaju snažne induktore ekspresije HO-1 (Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15 : 9 - 19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 : 517 - 554, 1997; i Tenhunen et al., J. Lab. Clin. Med. 75 : 410 - 421, 1970). Ekspresija HO-1 je takođe snažno indukovana raznim sredstvima koja izazivaju oksidativni stres, uključujući vodonik peroksid, supstance koje smanjuju količinu glutationa, UV radijaciju, endotoksin i hiperoksiju (Choi et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15 : 9 - 19, 1996; Maines, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 : 517 - 554, 1997; i Keyse et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 99 - 103, 1989). Pojam "farmaceutski preparat koji sadrži induktor HO-1" označava farmaceutski preparat koji sadrži neko od sredstava koje je sposobno da indukuje ekspresiju HO-1 kod pacijenta, na primer, neko od sredstava koja su opisana gore, npr. hemin, gvožđe protoporfirin i/ili kobalt protoporfirin.

Ekspresija HO-1 u ćeliji može biti povećana transferom gena. Kao što se ovde koristi, pojam "ekspresija (eksprimiran)" označava izazivanje povećanja proizvodnje proteina, npr. HO-1 ili feritina, u izolovanim ćelijama ili u ćelijama tkiva, organa ili organizma životinje, korišćenjem egzogeno primenjenog gena (npr. rekombinantnog gena). Poželjno je da HO-1 ili feritin budu poreklom iz iste vrste (npr. od čoveka, miša, pacova itd.) od koje je recipijent, kako bi se verovatnoća imune reakcije svela na minimum. Ekspresija može da se pokrene konstitutivni promoterom (npr. citomegalovirusnim promoterima) ili tkivno specifičnim promoterom (npr. promoterom proteina tečne komponente mleka koji proizvode ćelije mlečne žlezde ili albuminskim promoterom ćelija jetre). Odgovarajući vektor za gensku terapiju (npr. retrovirus, adenovirus, virus udružen sa adeno virusom (AAV - Adeno Associated Virus), poks virus (npr. virus vakcinije), HIV, minutni virus miša, virus hepatitisa B, virus influence, herpes simpleks virus 1 i lentivirus) koji kodira HO-1 ili feritin, može da se primeni kod pacijenta koji boluje od ili za koga je procenjeno da poseduje rizik od razvoja nekrotizujućeg enterokolitisa, i to oralno, inhalacijom ili injekcijom u crevni zid, lumen creva ili u abdominalnu duplju. Slično tome, plazmidni vektori koji kodiraju HO-1 ili apoferitin mogu da se primene, na primer, u vidu gole DNK, ili lipozoma ili mikročestica.

Dalje, egzogeni HO-1 protein može direktno da se primeni kod pacijenta bilo kojim postupkom koji je poznat u struci. Egzogeni HO-1 može da bude direktno primenjen kao dodatak, ili kao alternativa, uz indukciju ekspresije HO-1 kod pacijenta kao što je opisano gore. HO-1 protein može da se primeni kod pacijenta, na primer, u vidu lipozoma i/ili fuzionog proteina, npr. u vidu TAT-fuzionog proteina (videt, na primer, Becker-Hapak et al, Methods 24 : 247 - 256, 2001).

Alternativno, ili kao dodatak, bilo koji od metabolita HO-1, na primer, bilirubin, biliverdin, gvožđe i/ili feritin, može da se primeni kod pacijenta zajedno sa CO kako bi se sprečio nastanak ili da bi se lečio NEC. Dalje, predmetni pronalzak obuhvata molekule koji vezuju gvožđe, a koji se razlikuju od feritina, npr. desferoksamin (DFO), gvožđe dekstran i/ili apoferitin i koji se mogu primeniti kod pacijenta. Dalje, predmetni pronalazak podrazumeva da enzimi koji katalizuju razgradnju do bilo kog od ovih proizvoda (npr. biliverdin reduktaza) mogu biti inhibirani u cilju stvaranja/pospešivanja željenog dejstva. Sva gore navedena sredstva mogu biti primenjena, na primer, oralno, intravenski, intraperitonealno ili direktno unutar ili van creva.

Predmetni pronalazak podrazumeva da jedinjenja koja otpuštaju CO u telu nakon primene (npr. jedinjenja koja otpuštaju CO, npr. fotoaktivirajuća jedinjenja koja otpuštaju CO), na primer, dimangan dekakarbonil, trikarbonildihlororutenijum (II) dimer i metilen hlorid (npr. u dozi između 400 do 600 mg/kg, npr. oko 500 mg/kg), mogu takođe biti upotrebljena u postupcima prema predmetnom pronalasku, kao što je to slučaj sa karboksihemoglobinom i supstituentima hemoglobina koji vezuju CO.

Gore navedena sredstva mogu da budu primenjena na bilo koji način, na primer, oralno, intraperitonealno, intravenski ili intraarterijski. Svako od gore nevdenih jedinjenja može da se primeni kod pacijenta lokalno i/ili sistemski, kao i u bilo kojoj kombinaciji.

Predmetni pronalazak dalje obuhvata tretiranje NEC primenom CO kod pacijenta u kombinaciji sa bilo kojim drugim poznatim postupcima ili jedinjenjima za lečenje NEC, npr. sa prekidom ili smanjenjem učestalosti oralne ishrane, na primer, barem tokom jednog dana, na primer, barem tokom 2, 3, 5 ili 10 dana, ili duže; primenom intravenske hidracije i/ili ishrane; sa nazogastričnom dekompresijom ili primenom antimikrobnih sredstava kod pacijenta; sa hirurškom intervencijom; i/ili sa dreniranjem peritonealne duplje pacijenta. Hirurške tintervencije obuhvataju, na primer, resekciju zahvaćenog dela creva. Takođe, obuhvaćen je preventivni tretman pacijenata kod kojih postoji rizik od NEC primenom CO kod pacijenta u kombinaciji sa drugim poznatim postupcima za sprečavanje nastanka NEC, npr. sa promenom načina ishrane pacijenta.

Predmetni pronalazak je delimično ilustrovan primerima koji slede i koji ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.

Primeri

Primer 1: CO usporava razvoj NEC

Kolekcija uzoraka humanih creva

Uzorci humanih creva su prikupljani i brzo zamrznuti tokom operacije.

Životinjski model nekrotizujućeg enterokolitisa

Kod trudnih ženki Sprague - Dawley pacova, čija je starost trudnoće poznata, indukovan je porođaj u terminu, korišćenjem subkutane injekcije Pitocina (1 U). Neposredno nakon rađanja (dan 0.), novorođenčad su izmerena i randomizirana u dve glavne grupe. Životinje su ili ostavljene sa njihovim majkama i hranjene sisanjem, ili su odvojene od majki, postavljene u inkubator (Ohio Medical Products, Madison, WI), hranjene korišćenjem specijalne veštačke hranom za mladunče glodara dva puta dnevno i pre hranjenja su izlagane hipoksiji tokom 10 minuta (5% O2, 95% N2; PraxAir, Pittsburgh, PA). Sastav veštačke hrane: 15 g Similac<®>60/40 (Ross Pediatrics, Colombus, OH) u 75 ml Esbilac<®>zamene za pseće mleko (Pet-Ag Ine, Hampshire, IL). Pacovi iz svake od grupa su dalje randomizirani da ne prime dalji tretman ili da prime jednočasovni dnevni tretman sa CO (250 ppm, tokom dana 1 - 3). CO je primenjivan kao što je opisano dole. Neonatusi pacova su žrtvovani tokom 4. dana. Njihova creva su pregledana na prisustvo makroskopskih nekrotičnih promena i na postojanjepneumatosis intestinalis.Prikupljeno je po 2 cm terminalnog ileuma radi morfoloških studija, a uzeti su i uzorci mukoze radi detekcije proteina.

Izlaganje CO

Životinje su izlagane CO u koncentraciji od 250 ppm. Ukratko, 1% CO u vazduhu je mešan sa vazduhom (21% kiseonika) u cilindru za mešanje od nerđajućeg čelika, a zatim je smeša prrebačena u staklenu komoru za izlaganje od 3,70 ft<3>, pri brzini protoka od 12 l/min. Za kontinuirano merenje nivoa CO u komori korišćen je CO analizator (Interscan, Chatsworth, CA). Sve vreme su koncentracije CO održavane na 250 ppm. Pacovi su stavljani u komore za izlaganje po potrebi.

Morfološke studije

Uzorci creva su prikupljeni kao što je opisano gore. Hematoksilinom i eozinom (H&E) obojeni preseci su pripremani prema standardnom protokolu i ispitivani svetlosnim mikroskopom. Prisustvo morfoloških promena u epitelu creva, uključujući razdvajanje osnove resica, submukozni edem i odljuštenje epitela, prepoznavani su od strane patologa po principu slepe studije.

Određivanje citokina u serumu

Prikupljan je serum radi određivanja nivoa pacovskog TNF-a i IL-1(3 korišćenjem Quantikine® ELISA (R&D Svstems, Mineapolis, MN), poštujući uputstva proizvođača.

Celijska kultura

Ćelijska linija epitela pacovskog tankog creva IEC-6 je dobijena iz Američke kolekcije tipskih kultura (Manassas, VA). Ćelije su uzgajane na Dulbeco modifikovanoj Eagle podlozi sa 4,5 g/l glukoze (Bio-Whittaker, Walkersville, MD) uz dodatak 5% fetalnog goveđeg seruma, 0,02 mM glutamina (Gibco, Grand Island, NY), 0,1 U/ml insulina i 100 U/ml penicilina i 100 ug/ml streptomicina na 37 °C i u atmosferi sa 10% CO2. Za eksperimente su korišćene ćelije iz pasaža od 3 do 20.

Vijabilnost

Ćelijska vijabilnost je određivana merenjem nivoa ATP (CellTiter-Glo™; Promega), prema uputstvu proizvođača.

JVestern blot analiza

IEC-6 ćelije ili brisevi mukoze su prikupljeni u puferu za lizu koji sadrži 20 mmol/1 Tris sa 100 umol/1 fenilmetilsulfonilfluorida (Sigma), 1 umol/1 leupeptin (Sigma) i 1 umol/1 natrijum ortovanadat (Sigma). Protein je kvantifikovan proteinskim testom sa 4,4-dikarboksi-2,2'-bihinolinom (BCA-bicinchoninic acid) (Pierce, Rockford, IL). Lizati (30 ug) su izloženi dejstvu elektroforezi u natrijum dodecilsulfat-poliakrilamid gelu.

Reporter test

Konstruisan je pGL3/2 pacovski iNOS promoter-luciferaza reporter gen na način koji

je opisan u Beck et al, FEBS Le.tt. 435 : 35 - 38 (1998). IEC-6 ćelije koje su uzgajane na pločama od 35 mm su transficirane sa 4 ul Lipofectamine2000® (Invitrogen), 0,15 ug pGL3/2 DNK i 0,5 p.g pIEP-LacZ DNK, koja je korišćena kao kontrola efikasnosti transfekcije. Nakon 24 časa od transfekcije, ćelije su tretirane tokom 6 časova, a potom su prikupljeni lizati i izveden je test na luciferazu (Promega) korišćenjem luminometra (Berthold, Nemačka).

Određivanje nitrita

Koncentracija nitrita (NO2") je merena u podlozi kulture korišćenjem Griess postupka.

Statistička analiza

Rezultati su navedeni u vidu srednjih vrednosti ± standardna greška merenja. Razlike između grupa su analizirane jednosmernom analizom varijanse sa Student - Newman - Keuls post-hoc testom za sva poređenja (SigmaStat: SPSS, Chicago, IL). Statistička značajnost je pretpostavljena kada je p manje od 0,05.

Nivo HO- 1 proteina u crevima je povišen kod NEC

Uzorci humanih creva dobijenih od pacijenata sa NEC i kontrolni uzorci creva od pacijenata sa neinflamatornim stanjima su analizirani na ekspresiju HO-1. Lizati celih ćelija iz uzoraka sa NEC pokazuju povišenu ekspresiju HO-1 u poređenju sa kontrolom (Slika 1 A).

Da bi se odredilo da li bi nivoi HO-1 proteina u crevima bili povišeni u eksperimentalnom modelu NEC, novorođenčad pacova su randomizirana u grupu koja se hrani sisanjem po želji ili u grupu koja je podvrgnuta intermitentnoj hipoksiji i ishrani veštačkom hranom (H/F grupa), kao što je opisano iznad. Sve životinje su žrtvovane tokom 4. dana života, pa su prikupljeni uzorci mukoze terminalnog ileuma, koji su analizirani Western blot tehnikom. Ekspresija HO-1 proteina je povišena u H/F grupi u poređenju sa kontrolnim životinjama koje su hranjene sisanjem (Slika 1B). Ovaj nalaz je konzistentan sa prethodnim nalazima u crevima i drugim organima koji ilustruju regulaciju na gore HO-1 koja se javlja nakon raznih ozleda.

CO štiti od razvoja NEC

Novorođenčad pacova iz grupe koja se hrani sisanjem i H/F grupe su randomizirani za primanje ili doza CO (250 ppm) tokom jednog časa dnevno tokom dana 1, 2 i 3, ili da ne primaju dodatnu terapiju. Sve životinje su žrtvovane tokom 4. dana života. Identifikovane su sve makroskopske patološke promene, uključujućipneumatosis intestinalisi nekrozu (videti Tabelu 1, ispod), kao i histološke promene koje su konzistentne sa eksperimentalnim NEC u H/F grupi, i upoređene su sa kontrolnim životinjama koje su sisale (Slike 2A, 2B, 2C i 2D). Tretman sa CO nije imao efekta na makroskopsku ili mikroskopsku promene kod životinja hranjenih sisanjem, a značajno je zaštitio pacove iz H/F grupe od razvoja eksperimentalnog NEC. TUNEL bojenje na mrtve ćelije, koje je pojačano u H/F grupi, umanjeno je tretmanom sa CO (Slike 3A, 3B, 3C i 3D).

CO smanjuje nivoe sistemskih markera inflamacije

U vreme žrtvovanja, prikupljen je serum radi merenja nivoa TNF-a i IL-1(3, kao sistemskih markera tkivne inflamacije. Nivoi TNF-a i IL-1|3 su povišeni za 33,2 i 18,5 puta u H/F grupi u poređenju sa kontrolnim životinjama hranjenim sisanjem (Slike 4A i 4B; p<0,05). CO značajno ublažava ovo povišenje, što rezultuje povišenjem od samo 3 i 2,5 puta u nivoima TNF-a i IL-ip, respektivno (p<0,05). Ovi nalazi pokazuju da egzogeni CO može da umanji neke od sistemskih posledica inflamacije u ovom životinjskom modelu.

CO smanjuje nivoe lokalnih intestinalnih markera inflamacije

Izveden je test na ciklooksigenazu 2 (COX-2) i interleukin 1(3 (IL-1(3), markere intestinalne inflamacije za koje je pokazano da su udruženi sa NEC. Lizati proteina mukoze ileuma su analizirani Western blot postupkom na COX-2 i IL-1(3. U ovoj studiji, ishrana veštačkom hranom i izlaganje hipoksiji je udruženo sa povećanjem nivoa ileumskih COX-2 i IL-1(3 kod oko polovine životinja (Slika 5). Tretman sa CO samnjuje ekspresiju oba navedena proteina. CO takođe smanjuje ekspresiju ileumske HO-1 u ovom modelu (podaci nisu prikazani), što je konzistentno sa protektivnim efektima predstavljenim histološkim nalazima i nivoima serumskih citokina i što verovatno predstavlja smanjenje intestinalne povrede i kompenzatornih promena koje nastaju kao odgovor na ovu povredu.

CO inhibira stvaranje intestinalne inducibilne sintaze azot monoksida ( iNOS)

Nivo iNOS je povećan u uzorcima humanih creva kod novorođenčadi sa NEC, kao i kod novorođenčadi pacova u eksperimentalnim modelima NEC. Smatra se da indukcija iNOS i stvaranje NO direktno doprinosi oštećenju tkiva putem stvaranja reaktivnih jedinjenja azota. Western blot analiza uzoraka mukoze ileuma u ovoj studiji pokazuje da tretman hipoksijom i veštačkom hranom dovodi do povećanja nivoa iNOS i nitracije proteina (Slika 6). Smatra se da su nitracija ili stvaranje nitrotirozina izazvani peroksinitritom, toksičnim proizvodom interakcije NO i superoksida. Nivoi iNOS proteina i nitrozotirozina su naglašeno smanjeni kod životinja koje su tretirane sa CO, što sugeriše da CO može imati zaštitno dejstvo u crevima tako što smanjuje proizvodnju/sprečava nastanak NO.

Tretman sa HO- l/ CO smanjuje ćelijsku smrt kod IEC- 6 ćelija

Da bi se odredilo da li HO-1 ili CO umanjuju ćelijsku smrtin vitro,korišćena je pacovska ćelijska linija crevnog epitela IEC-6. Ćelijska smrt je indukovana tretiranjem ovih ćelija sa TNF-a (10 ng/ml) uz aktinomicin D (ActD; 200 ng/ml). Ćelijska vijabilnost je analizirana kristal-violet bojenjem adherentnih ćelija i procenom količine ćelijskog ATP. Tretman sa TNF-a/ActD umanjuje ćelijsku vijabilnost IEC-6 ćelija do 24 ± 2,1 %, u odnosu na netretiranu kontrolnu grupu (Slika 7; p<0,05). CO značajno inhibira TNF-a/ActD indukovanu ćelijsku smrt, što rezultuje vijabilnošću od 54 ± 5,6% u poređenju sa netretiranim kontrolama (p<0,05). Sam CO nema merljiv efekat na vijabilnost IEC-6 ćelijain vitro.Indukcija ekspresije HO-1 sa CoPP ima slične zaštitne efekte.

CO sprečava povećanje ekspresije iNOS/ stvaranje NO

Ispitivano je da li CO može da inhibira povećanje ekspresije iNOS kod intestinalnih epitelnih ćelijain vitro.Efekti LPS i/ili 1% kiseonika (hipoksija) su ispitivani na iNOS pomoću Western blot analize. Ove studije pokazuju da LPS/hipoksija povećavaju nivoe iNOS, što predstavlja efekat koji je inhibiran dejstvom CO (Slika 8A). Efekti CO na transkripcionu aktivaciju pacovskog iNOS promotera su ispitivani na IEC-6 ćelijama stimulisanim sa LPS i hipoksijom (Slika 8B). Kombinacija LPS i hipoksije izaziva povećanje od 4,9 ± 0,3 puta u transkripcionoj aktivaciji iNOS promotera, što se detektuje korišćenjem luciferaza testa (p<0,05). CO ograničava ovu transkripcionu aktivaciju na povećanje od samo 1,7 ± 0,2 puta (p<0,05). Dodatno, efekat CO na stvaranje NO od strane IEC-6 ćelija je ispitivano merenjem nivoa nitrita. IEC-6 ćelije su stimulisane smešom citokina (TNF-a, IL-ip, interferon-y), za koju se zna da povećava ekspresiju iNOS. Stimulacija citokinima povećava nivoe iNOS (Slika 8C), kao i nitrita na 17,2±0,9 uM u poređenju sa koncentracijom od 1,4 ± 0,3 uM kod nestimulisane kontrolne grupe (p<0,01; Slika 8D). CO i CoPP značajno inhibiraju ovaj efekat citokina, što rezultuje nivoima nitrita od 9,8 ± 0,7 i 10,4±1,0, respektivno (p<0,05).

Gore navedeni podaci ukazuju da je ekspresija HO-1 povećana u uzorcima creva ljudske novorođenčadi sa NEC, kao i u uzorcima mukoze ileuma novorođenčadi pacova u modelu eksperimentalnog NEC. Dnevni jednočasovni tretman egzogenim CO sprečava razvoj NEC. Ovo je udruženo sa smanjenjem sistemske inflamacije, što se vidi na osnovu nivoa serumskog TNF-a i IL-1P, kao i pokazatelja lokalne inflamacije, kao što su ekspresija IL-1(3 i COX-2 u mukozi ileuma. Razvoj NEC je takođe udružen sa povećanom ekspresijom iNOS u mukozi ileuma i nitracijom proteina. Terapija sa CO umanjuje povećanje iNOS i nitracije.In vitro,indukcija ekspresije HO-1 ili tretman sa CO pokazuje zaštitni efekat protiv TNF-a/ActD indukovane ćelijske smrti kod IEC-6 ćelija. Dodatno,in vitro,CO sprečava indukciju iNOS i stvaranje NO.

HO-1 i njegovi katalitički sporedni proizvodi, uključujući CO, verovatno igraju defanzivnu ulogu nakon ozlede creva. Gore predstavljeni podaci pokazuju da su nivoi HO-1 proteina povećani u mukozi ileuma kod životinja sa NEC, što je konzistentno sa prethodnim studijama koje pokazuju povećanje nivoa initestinalnog HO-1 u modelima ishemije/reperfuzije i hemoragijskog šoka. Indukcija HO-1, izazvana prethodnim uslovljavanjem ili farmakološki, ima citoprotektivno dejstvo nakon transplantacije creva i ishemije/reperfuzije. Tretman sa CO, koji ima zaštitni efekat protiv razvoja NEC, takođe sprečava nastanak povećanja ekspresije HO-1. Ova inhibicija ekspresije HO-1 može biti posledica direktne negativne povratne sprege; međutim, ona je verovatno sekundarna posledica zaštite od ozlede creva sa posledičnom regulacijom HO-1 na gore.

Dnevna jedanočasovna inhalaciona terapija sa CO (250 ppm) je dovoljna da se spreči razvoj NEC. Zaštitni efekti CO kod navedenog životinjskog modela NEC su verovatno multifaktorijalni. Gore predstavljeni podaci pokazuju da primena CO izaziva smanjenje apoptoze u crevima, što se vidi na osnovu TUNEL bojenjain vivoi umanjenja TNF-a/ActD indukovane ćelijske smrtiin vitro.Terapija sa CO je takođe udružena sa smanjenjem nastanka sistemskih i lokalnih medijatora inflamacije.

iNOS/NO su udruženi sa oštećenjem mukoze i nefunkcionalnošću crevne barijere u inflamatornoj bolesti creva, eksperimentalnom ileitisu, endotoksičnom šoku i NEC. Gore prikazani podaci pokazuju da CO smanjuje regulaciju na gore iNOSin vitroiin vivo,a dodatno umanjuje nastanak nitrozotirozinain vivo.Peroksinitrit, za koji se smatra da je reaktivna azotna vrsta odgovorna za toksične efekte prema enterocitima i njihovu apoptozu, reaguje sa proteinima, što dovodi do nitracije tirozinskih ostataka. Smatra se da se ovo jedinjenje stvara interakcijom NO i superoksida. Sa CO posredovana zaštita enterocita može biti posredovana inhibicijom povećanja ekspresije iNOS proteina, što smanjuje nivo NO i stvaranje peroksinitrita.

Sprečavanje razvoja NEC putem CO obuhvata održavanje motiliteta gastrointestinalnog trakta i sprečavanje nastanka neodgovarajuće bakterijske kolonizacije. Poznato je da izmenjena bakterijska kolonizacija doprinosi razvoju NEC.

U zaključku, primeri prema predmetnom pronalasku pokazuju da jednočasovni dnevni tretman sa CO štiti novorođenčad pacova koja su izlagana hipoksiji i hranjena veštačkom hranom od razvoja eksperimentalnog NEC. Izgleda da mehanizam zaštite obuhvata inhibiciju ekspresije iNOS i nitracije proteina.

Primer 2: Protokol za lečenje NEC

Sledeći primer ilustruje protokol koji se koristi za lečenje pacijenta koji boluje ili koji poseduje rizik za razvoj NEC. Primer takođe ilustruje protokole za lečenje pacijenata pre, tokom i/ili nakon hirurških intervencija, na primer, hirurške intervencije za lečenje NEC, na primer, hirurške intervencije u kojoj se resecira deo creva. Iskusni stručnjaci shvataju da svaki ovde opisani protokol može biti prilagođen individualnim potrebama pacijenta i da može biti prilagođen tako da se koristi zajedno sa bilo kojim drugim tretmanom za NEC.

Tretman pacijenata sa CO može da započne na dan kada se pacijentu dijagnostiku]e NEC ili bilo koje stanje koje je udruženo sa NEC, ili bilo koji faktor rizika koji je udružen sa povišenom verovatnoćom da će pacijent razviti NEC. Pacijenti mogu da inhaliraju CO u koncentracijama koje se nalaze u opsegu od 10 ppm do 1000 ppm, na primer, od oko 100 ppm do oko 800 ppm, od oko 150 ppm do oko 600 ppm, ili od oko 200 ppm do oko 500 ppm. Poželjne koncentracije obuhvataju, na primer, 30 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm ili oko 1000 ppm. CO može biti primenjen kod pacijenta intermitentno ili kontinuirano. CO može biti primenjivan tokom 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 ili 20 dana, ili duže od 20 dana, na primer, tokom 1, 2, 3, 5 ili 6 meseci, ili sve dotle dok pacijent ne prestane da pokazuje znake NEC, ili dok se ne dijagnostikuje da pacijent više ne poseduje rizik od razvoja NEC. Datog dana, CO može biti primenjivan kontinuirano tokom celog dana ili intermitentno, na primer, u vidu samo jednog udana CO dnevno (kada se koristi velika koncentracija CO), ili sve do 23 časa dnevno, na primer do 20, 15, 12, 10, 6, 3 ili 2 časa dnevno ili do 1 časa dnevno.

Kada se CO primenjuje zajedno sa hirurškim postupcima za lečenje NEC, CO može da se primeni sistemski ili lokalno kod pacijenta pre, tokom i/ili nakon izvođenja hirurške intervencije. Pacijenti mogu da inhaliraju CO u koncentracijama u opsegu od oko 100 ppm do oko 800 ppm, od oko 150 ppm do oko 600 ppm, ili od oko 200 ppm do oko 500 ppm. Poželjne koncentracije obuhvataju, na primer, 30 ppm, 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm ili oko 1000 ppm. CO može biti primenjen intermitentno ili kontinuirano tokom 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18 ili 20 dana, ili duže od 20 dana pre procedure. Alternativno, ili kao dodatak, CO može da se primeni kod pacijenta tokom postupka, na primer, inhalacijom i/ili topijski. Alternativno, ili kao dodatak, CO može da se primeni kod pacijenta nakon procedure, na primer, počevši neposredno nakon okončanja procedure i da se nastavi tokom 1, 2, 3, 5, 7, ili 10 časova, ili tokom 1, 2, 5, 8, 10, 20, 30, 50 ili 60 dana, ili neograničeno dugo, ili sve dok pacijent ne prestane da boluje od ili da bude u riziku od nastanka NEC nakon okončanja procedure.

Opisana su brojna rešenja prema predmetnom pronalasku. Pored toga, treba napomenuti daje moguće načiniti različite modifikacije, bez narušavanja duha i obima zaštite predmetnog pronalaska. Shodno tome, i druga rešenja su obuhvaćena obimom zaštite predmetnog pronalaska, koji je definisan u patentnim zahtevima.

Claims

1. Upotreba ugljen monoksida za pripremanje farmaceutskog preparata za lečenje ili prevenciju nekrotizujućeg enterokolitisa kod pacijenta.

2. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što se farmaceutski preparat pacijentu daje oralnim putem, inhalacijom ili direktnom primenom u abdominalnoj duplji pacijenta.

3. Upotreba prema zahtevu 1 ili 2, naznačena time što pacijent je novorođenče ili preterminsko novorođenče; ili pacijent poseduje malu težinu prilikom rođenja, ili ima hipoksiju, hipotermiju, hipotenziju, hiperviskoznost krvi ili ima acidozu; ili je pacijent primio izmenjivačku transfuziju, bar jedan hiperosmolarni obrok, transfuziju ćelijskih derivata, ili je pacijent primio prekomernu dozu antagonista kalcijuma; ili pacijent pati od ishemije mezenterijuma ili bakterijske infekcije zida creva; ili je pacijent bio ili će biti ili se upravo podvrgava hirurškoj operaciji.

4. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1 do 3, naznačena time što lečenje nekrotizujućeg enterokolitisa dodatno obuhvata primenu na pacijentu tretmana koji je izabran iz grupe koju čine: intravenozna hidratacija, bar jedan antimikrobni agens, sprovođenje nazogastrične dekompresije na pacijentu, izvođenje operacije na pacijentu i drenaža peritonealne duplje pacijenta.

5. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1 do 4, naznačena time što se farmaceutski preparat primenjuje putem veštačkih pluća, ili putem uređaja za ekstrakorporalnu membransku razmenu gasova.

6. Upotreba ugljen monoksida za pripremanje farmaceutskog preparata za lečenje nekrotizujućeg enterokolitisa kod pacijenta, naznačena time što: (a) na pacijentu se sprovodi hirurška operacija radi uklanjanja obolelog dela creva; i (b) farmaceutski preparat se primenjuje pre, tokom i posle operacije pomenute pod (a).

7. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1 do 6, naznačena time što je farmaceutski preparat u obliku gasa.

8. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1 do 6, naznačena time što je farmaceutski preparat u obliku tečnosti.

9. Upotreba ugljen monoksida za pripremanje farmaceutskog preparata za lečenje nekrotizujućeg enterokolitisa kod pacijenta, naznačena time što: (a) obezbeđen je sud koji sadrži farmaceutski preparat u vidu komprimovanog gasa koji sadrži ugljen monoksid; (b) farmaceutski preparat se oslobađa iz suda, kako bi se formirala atmosfera koja sadrži ugljen monoksid u gasnom stanju; i (c) pacijent se izlaže ovoj atmosferi.

10. Upotreba prema bilo kome od zahteva 1 do 9, naznačena time što je pacijent čovek.

11. Sud koji sadrži komprimovan gas ugljen monoksida, medicinske čistoće, naznačen time što sud nosi oznaku koja ukazuje da se gas može koristiti za lečenje ili prevenciju nekrotizujućeg enterokolitisa kod pacijenta.

12. Sud prema zahtevu 11, naznačen time što je ugljen monoksid u smeši sa gasom koji sadrži kiseonik.

13. Sud prema zahtevu 12, naznačen time što je ugljen monoksid prisutan u smeši, u koncentraciji od najmanje oko 0,025%, najmanje 0,05%, najmanje oko 0,10%, najmanje oko 1,0% ili najmanje oko 2,0%.