JP4585765B2 - 壊死性腸炎の治療方法 - Google Patents
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Description
本発明は、政府の助成のもとに行われた(米国立保健研究所助成金番号HL55330、同HL60234、および同AI42365)。米国政府は、本発明に関して、ある一定の権利を有するものである。
本発明は、胃腸疾患の治療に関するものである。
一酸化炭素(CO)は、重要なシグナル伝達分子であることが認められている(Vermaら, Science 259: 381-384,1993)。COは、脳においては神経細胞伝達分子として作用し(同上文献)、視床下部においては神経内分泌系修飾物質として作用すること(Pozzoliら, Endocrinology 735: 2314-2317,1994)も示唆されている。一酸化窒素(NO)同様、COは、平滑筋弛緩薬であり(Utzら, Biochem Pharmacol. 47: 195- 201, 1991; Christodoulidesら, Circulation 97: 2306-9,1995)、血小板の凝集を阻害する(Mansouriら, Thromb Haemost. 48: 286-8, 1982)。いくつかのモデル動物では、低レベルのCOの吸入が抗炎症効果を有することも示されている。
本発明は、部分的には、COの投与によって、壊死性腸炎の発症を防ぎうることを見いだしたことに基づくものである。
本明細書で使用する「一酸化炭素」(または「CO」)という用語は、気体状態にあるCO分子、液体状態に圧縮されたCO分子、または、水溶液に溶解したCO分子にを表すものである。「一酸化炭素組成物」および「一酸化炭素を含む薬学的組成物」という用語は、本明細書の全体を通じて、患者および/または器官、たとえば、壊死性腸炎を生じた器官に投与が可能なCOを含む気体状または液状の組成物を表すものである。当業者であれば、所定の用途に関して、薬学的組成物をどの形態、たとえば気体状、液状、または気体状および液状の両方のどの形態とするのが好適であるかがわかると思われる。
CO組成物は、気体状のCO組成物とすることができる。本発明の方法で有用な圧縮または加圧ガスは、任意の市販の供給源から、圧縮ガスの貯蔵に適した任意のタイプの容器に入ったものを入手することができる。たとえば、圧縮または加圧ガスは、医用の圧縮ガス、たとえば、圧縮酸素を供給する任意の供給源から入手することができる。本明細書で使用する場合には、「医薬品等級の」ガスという用語は、本明細書に定義した患者に対して投与するのに適したガスを称するものである。本発明の方法で使用するCOを含む加圧ガスは、NOとO2は一緒に貯蔵できない以外は、所望の最終組成物中のすべての気体(たとえば、CO、He、NO、CO2、O2、N2)が同じ容器に入っているようなかたちで提供することができる。本発明の方法は、任意で、個々のガスの入った複数の容器を使用することによっても実施することができる。たとえば、COが他の気体とともに、または他の気体なしで入った単一の容器を用意し、この容器の内容物を、任意で、室内の雰囲気と混合したり、または、他の容器、たとえば、酸素、窒素、二酸化炭素、圧縮空気、または他の適当な気体、もしくはこれらの混合物の入った容器の内容物と混合することができる。
CO組成物は、液状CO組成物とすることもできる。液体は、気体を液体に溶解するようにする当技術分野において周知の任意の方法によって、CO組成物とすることができる。たとえば、液体を、いわゆる「CO2インキュベータ」に入れて、液体が所望のCO濃度に達するまで、好ましくは二酸化炭素と平衡にさせたCOの連続流と接触させることができる。別の例としては、COガスを、直接、液体が所望のCO濃度に達するまで「バブリングさせる」こともできる。所定の水溶液に溶解しうるCOの量は、温度の低下とともに増大する。さらに別の例では、適当な液体を、(たとえば、体外膜型酸素付加装置のような装置によって、)気体拡散性のチューブに通過させ、このチューブを、COを含む雰囲気を通るように配管しておくことができる。こうすると、COが液中に拡散して、液状のCO組成物が形成される。
患者は、当技術分野において気体および/または液体を患者に投与する方法として周知の任意の方法を用いて、CO組成物によって治療することができる。CO組成物 は、壊死性腸炎であると診断された患者、または壊死性腸炎の危険性があると判断された患者、たとえば、新生児または早産児に投与することができる。本発明は、液状またはガス状のCO組成物の患者への(たとえば、吸入、および/または経口摂取による)全身投与、ならびに組成物の患者の胃腸管への(たとえば、経口摂取、ガス注入、および/または複腔への導入による)局所投与を意図している。
ガス状CO組成物は、患者、たとえば壊死性腸炎であると診断された患者、または壊死性腸炎の危険性があると判断された患者に全身的に送達することができる。ガス状CO組成物は、通常、口または鼻経由で肺まで吸入させることによって投与され、COは、肺で、患者の血流に容易に吸収される。治療用気体状組成物で使用される活性化合物(CO)の濃度は、COの吸収、分配、非活性化、および排出(通常は、呼吸による)の速度、ならびに当業者に周知の他の要因に応じて決まる。また、任意の特定の対象に関しても、具体的な投与計画については、個別の必要性、および組成物の投与を管理または監督している人物による専門的な判定にしたがって経時的に調整していく必要があるものであり、かつ、本明細書に記載する濃度範囲は一例を示したにすぎず、それらによって、特許請求の範囲に記載した組成物の範囲や実施が限定されることはないものと理解すべきである。COの急性、亜急性、および慢性の投与については、本発明では、たとえば、患者の壊死性腸炎の重篤さまたは持続性に応じて考慮する。COは、症状を治療し、意図した薬学的または生物学的な効果を発揮するのに十分な期間(永続的期間を含む)にわたって、患者に送達することができる。
医薬品等級のCO(各種濃度)は、空気または圧縮ガス用の標準的なタンク入りの他の酸素含有ガス(たとえば、21%のO2、79%のN2)と混合したものを購入することができる。COは非反応性であり、本発明の方法で必要とされる濃度は、可燃性の範囲(空気中で10%)より、はるかに低い。病院の場で使用する場合には、ガスは、ベッドサイドまで供給され、その場で、混合装置中で酸素または室内の空気と所望のppm(百万分率)濃度まで混合されることになる。患者は、人口呼吸器を通してガス混合物を吸入することになり、人工呼吸器の流速は、患者の快適さと必要性にもとづいて設定した値に設定されることになる。この流速は、肺のグラフィクス(すなわち、呼吸数、一回呼吸気量など)によって決定される。送達システムには、患者が、所望量を越える量のCOを不必要に受け入れることを防止するフェイルセーフ機構を設計段階で組み込んでおくことができる。患者のCOレベルは、(1)静脈血で測定が可能なカルボキシヘモグロビン(COHb)、および(2)人工呼吸器の側面開口部から取り出した吐出COを調べることによって監視することができる。COへの曝露の度合いは、患者の健康状態および、マーカーにもとづいて調節することができる。COは、必要に応じて、100%のO2吸入に切り替えることによって、患者から排出させることができる。COは代謝されないので、吸入された分は、CO2に転化されるごく低率の部分を除いては、最終的には排出されることになる。また、COは、任意のレベルのO2と混合して、低酸素状態を招くことなく治療目的でCOの送達しうるようにすることもできる。
CO含有ガス混合物を上述のようにして製造して、フェースマスクまたはテント使用して、患者が受動的に吸入できるようにする。吸入濃度は、単に100%のO2に切り替えるだけで、変更、かつ全面的に排出させることができる。COレベルの監視は、高すぎる濃度のCOが吸入されることを防止するフェイルセーフ機構を備えたマスクまたはテントの近傍で行うことになる。
圧縮COを携帯型の吸入装置に梱包して計量された用量を吸入するようにして、たとえば、入院していない患者でも、断続的に治療を受けられるようにすることもできる。容器には、各種濃度のCOを梱包することができる。装置は、適度に希釈したCOの入った小型タンク(たとえば、5 kg未満)のような簡単なものとすることができ、この小型タンクには、オン・オフバルブと、患者が標準的な投与計画にしたがって、または必要時にCOを吸入するチューブが装着されている。
O2の送達およびCO2の除去のために設計された人工肺(血中ガス交換のためのカテーテル装置)を、COの送達のために使用することもできる。カテーテルは、移植時には、大静脈の一方にはめ込まれ、所定濃度のCOを全身または局所部位に送達しうるものである。送達は、高濃度のCOを短時間、処置部位、たとえば小腸近傍に局所的に送達するものとすることも(この場合の高濃度は、血流中で、急速に希釈されることになる)、または相対的に低い濃度のCOへの相対的に長時間の曝露とすることもできる(たとえば、Hattlerら, Artif. Organs 18 (11): 806-812 (1994);およびGolobら, ASAIO J., 47 (5): 432-437 (2001)を参照されたい)。
場合によっては、患者の全身をCOと接触させることが望ましいこともある。患者を、気密チャンバー内に入れ、このチャンバー内を(患者に危険を生じることのないレベル、または、立会人が曝露される危険性のない許容範囲内のレベルのCO)で満たす。曝露が完了したら、チャンバーの大気を空気(たとえば、21%のO2、79%のN2)を流し、試料をCO分析装置で分析して、患者を曝露装置から出す前にCOが残存していないことを確実にする。
本発明は、また、液状CO組成物を、たとえば、輸液として患者に投与することによる患者への全身的送達用に調製することも想定している。たとえば、COで飽和させたリンゲル液のような液状CO組成物を、壊死性腸炎の患者または壊死性腸炎の危険性のある患者に注入することができる。その代わりに、またはさらに、COで部分的に、または完全的に飽和させた全血(または部分血)を患者に注入することもできる。本発明ではまた、ある投与量のガス状または液状のCOを送達しうる媒体(たとえば、CO放出性のガム、クリーム、軟膏、またはパッチ)の使用も想定している。
その代わりに、またはさらに、CO組成物は、胃腸管に、たとえば胃腸管全体の内部および/または外部に、またはその任意の一部に直接適用することもできる。気体状組成物は、ガスを患者に注入する方法として当技術分野で周知の任意の方法によって、患者、たとえば早産児または新生児の胃腸管に直接適用することができる。たとえば、二酸化炭素のような気体は、内視鏡および腹腔鏡を用いた処置の間に、検査を行いやすいように、患者の胃腸管および複腔にそれぞれ注入することも多い(たとえば、MorrisおよびMalt編、Oxford Textbook of Surgery、Oxford大学出版局(1994)を参照されたい)。熟練した医師であれば、患者の胃腸管にCO組成物を直接投与する際に、同様の手順を使用しうることがわかると思われる。本発明では、腹腔鏡検査および内視鏡検査、たとえば、結腸鏡検査および食道胃十二指腸鏡検査の結果として生じる壊死性腸炎を予防することを促進する目的で、本発明を使用することも考慮している。
本発明では、COの投与と組み合わせて、ヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)を誘導または発現させることも想定している。たとえば、HO-1を、壊死性腸炎の患者または壊死性腸炎の危険性のある患者で誘導することができる。本明細書で使用する場合には、「誘導」という用語は、単離された細胞、または組織、器官、もしくは動物の細胞で、タンパク質、たとえばHO-1の生産を、タンパク質をコードする細胞自体の内在的(たとえば非組換え)遺伝子を使用して増大させることを意味する。
ヒトの腸の試料の採取
ヒトの腸の試料を採取し、手術時に瞬時に凍結させた。
妊娠時期が推定されるの妊娠したSDラットの出産を、ピトシン(1 U)の皮下注射を使用して、出産予定日に誘発した。出生直後(0日目)に、新生ラットを秤量し、2つの主要な群にランダムに振り分けた。ラットは、母ラットとともに残して母乳栄養とするか、または母ラットから分離してインキュベータ(Ohio Medical Products、ワイオミング州マディソン(Madison))に収容して、1日2回齧歯類用の特殊な人工栄養を胃管栄養で与え、各給餌の前に、10分間の低酸素状態(5%のO2、95%のN2(PraxAir)、ペンシルバニア州ピッツバーグ(Pittsburgh))においた。この人工栄養は、15gのシミラック(Similac)(登録商標) 60/40 (Ross Pediatrics)、オハイオ州コロンバス(Colombus))を、75 mLのエスビラック(Esbilac)(登録商標)ネコ用代用乳(Pet-Ag Inc.、イリノイ州ハンプシャー(Hampshire))に溶かしたものであった。各グループのラットは、さらに、それ以上の処置を行わないものと、1日あたり1時間のCOによる処置(250百万分率(ppm)、1〜3日目)を行うものとに、ランダムに振り分けた。COは、後述するようにして送達した。新生ラットは、4日目に屠殺した。腸を、全体的な壊死的変化および腸壁気腫について調べた。回腸終端部の最後の2 cmを形態学的研究用に採取し、粘膜掻爬物を、タンパク質の検出用に採取した。
ラットを、濃度250 ppmのCOに曝露した。略述すると、空気中に1%としたCOを、ステンレス鋼製の混合用シリンダー中で空気(酸素21%)と混合し、3.70 ft3のガラス製曝露用チャンバに、流速12 L/minで導入した。CO分析装置(Interscan、カリフォルニア州Chatsworth)を使用して、チャンバ中のCOのレベルを連続的に測定した。CO濃度は、常時250 ppmに保った。必要に応じて、曝露用チャンバ内にラットを入れた。
腸の試料を、上述したようにして採取した。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色したスライド標本を、標準的なプロトコールにしたがって調製し、光学顕微鏡で観察した。腸上皮の形態学的変化、たとえば、絨毛芯部の分離、粘膜下の浮腫、および上皮の脱落の有無について、病理の専門家が盲検のかたちで判定を行った。
血清を、採取し、ラットのTNF-αおよびIL-1βのレベルを、クォンティキン(Quantikine)(登録商標) ELISA (R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス(Minneapolis))を製造業者の指示にしたがって使用することによって測定した。
ラットの小腸上皮の株化細胞であるIEC-6を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection) (Manassas、VA)から入手した。細胞を、5%ウシ胎児血清、0.02 mMグルタミン(Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド(Grand Island))、0.1 U/mLのインスリン、および100 U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシンを加えた、4.5 g/Lグルコース含有ダルベッコ改変イーグル培地(Bio-Whittaker、メリーランド州ウォーカーズビル(Walkersville))中で、37℃にて、10%のCO2で培養した。3〜20代目の細胞を実験に使用した。
細胞の生存率を、ATPのレベル(セルタイター-グロ(CellTiter-Glo)(商標)、Promega)を製造業者のプロトコールにしたがって測定することによって判定した。
IEC-6細胞または回腸粘膜の掻爬物を、20 mmol/L トリスを、100μmol/Lのフッ化フェニルメチルスルホニル(Sigma)、lμmol/Lのロイペプチン(Sigma)、および1μmol/Lのオルトバナジン酸ナトリウム(Sigma)とともに含有する溶解用バッファーに採取した。タンパク質を、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質検定法(Pierce、イリノイ州Rockford)で定量した。溶解物(30μg)を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動にかけた。
Beckら、FEBS Lett 435: 35-38 (1998)の記載にしたがって、pGL3/2ラットのiNOSプロモーター-ルシフェラーゼ・レポーターを構築した。35 mmのウェルで培養したIEC-6細胞を、4μLのリポフェクタミン2000(登録商標)(Invitrogen)、0.15μgのpGL3/2 DNA、および0.5μgのpIEP-LacZ DNA(トラスフェクション効率の対照用に使用)でトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を6時間処理し、次に溶解物を採取し、ルミノメーター(ドイツ、ベルトルド(Berthold))を使用してルシフェラーゼ検定法(Promega)を行った。
亜硝酸イオン(NO2-)を、培養液中で、グリース法を使用して測定した。
結果を、平均±平均値の標準誤差で示す。群間の差は、すべての対ごとの比較について、スチュデント-ニューマン-コイルス多重比較(post-doc)検定で一元配置分散分析を行って(SigmaStat、SPSS、イリノイ州シカゴ(Chicago))解析した。Pが0.05未満の場合に、統計的有意性を想定した。
壊死性腸炎の患者から得たヒトの腸の試料と、非炎症状態の患者から得た腸の対照標本を、HO-1の発現に関して分析した。壊死性腸炎の試料から得た全細胞溶解物は、対照と比較して、HO-1の発現が増大していた(図1A)。
母乳栄養群とH/F群の新生ラットをランダムに振り分けて、一方には、1日目、2日目、および3日目に1日あたり1時間のCO(250 ppm)を与え、もう一方には、それ以上の治療を行わなかった。ラットは、いずれも、生後4日目に屠殺した。H/F群では、母乳栄養の対照と比較して、実験的な壊死性腸炎と一致する、腸壁気腫、および壊死をはじめとする全体的な病的特徴(下記表1を参照のこと)ならびに組織的な変化が特定された(図2A、2B、2C、および2D)。COによる治療は、母乳栄養のラットでは、全体的または微視的な評価に影響することはなく、H/F群のラットでは、実験的な壊死性腸炎の発症に対して有意に保護した。細胞死に関するTUNEL法による染色は、H/F群では増大していたが、COによる処置を行うと低減した(図3A、3B、3C、および3D).
屠殺時に、組織の炎症についての全身的マーカーであるTNF-αおよびIL-1βのレベルを測定するために、血清を採取した。H/F群では、母乳栄養の対照と比較して、TNF-αとIL-1βの双方のレベルとも、33.2倍と18.5倍の上昇を示した(図4Aおよび4B、P < 0.05)。COは、こうした上昇を有意に弱め、その結果、TNF-αとIL-1βの上昇が、3倍および2.5倍のみとなった(それぞれP < 0.05)。これらの知見から、この動物モデルでは、外因性のCOが全身的な結果の一部を取り消すことがわかる。
双方ともに腸の炎症のマーカーであり、壊死性腸炎と関連性を有することが示されているシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)とインターロイキン1β(IL-1β)について、検定を行った。回腸粘膜のタンパク質の溶解物を、ウェスタンブロット分析で、COX-2とIL-1βについて評価した。この検定法では、H/Fは、ほぼ半分の動物で、回腸でのCOX-2とIL-1βのタンパク質レベルでの増大と関連していた(図5)。組織学的性質および血清サイトカインに対する保護的な効果と同じく、COによる処置は、これらのタンパク質の双方の発現を低減させた。COは、このモデルにおいて、回腸でのHO-1の発現も低減させ(データ示さず)、このことは、腸の侵襲が少なくなり、この侵襲に対して補償的な変化が生じていることを表している可能性が高い。
iNOSは、壊死性腸炎の新生児から得たヒトの腸の試料でも、壊死性腸炎の実験モデルのラットの腸でも上昇している。iNOSの誘導とNOの生成は、反応性の窒素種の生成を介して、組織の侵襲に直接寄与するものと考えられる。この研究における回腸の粘膜の試料をウェスタンブロット分析により、H/Fの結果、iNOSのレベルとタンパク質のニトロ化が増大することが示される(図6)。ニトロ化またはニトロチロシンの形成は、NOとスーパーオキシドの相互作用によって生じた毒性の産物である過酸化亜硝酸によって生じるものと考えられる。iNOSタンパク質とニトロソチロシンの双方とも、COでの治療を行った動物では著しく低減しており、COが、腸では、NOの生成を低減/防止することにより保護的に作用していることが示唆された。
HO-1またはCOがインビトロでの細胞死を阻害するかどうかを判定するために、ラットの腸の上皮の株化細胞であるIEC-6を使用した。細胞死は、これらの細胞を、TNF-α(10 ng/ml)とアクチノマイシンD(ActD、200 ng/ml)で処置することによって誘導した。細胞の生存率を、付着細胞をクリスタルバイオレットで染色し、細胞のATP含量を検定することによって分析した。TNF-α/ActDは、IEC-6 細胞の生存率を、未処置の対照と比べて、24±2.1%まで低減させた(図7、P < 0.05)。COは、TNF-α/ActDで誘導した細胞死を有意に阻害し、その結果、未処理の対照と比較して、生存率が、54±5.6%となった(P < 0.05)。CO単独では、インビトロでのIEC-6細胞の生存率に測定可能な効果が生じることはなかった。CoPPによるHO-1の誘導も、同様の保護効果を有していた。
COが、iNOSの上方制御を阻害できるかどうかを調べるために、腸の上皮細胞をインビトロで調べた。LPSおよび/または1%の酸素(低酸素状態)のiNOSタンパク質に対する作用を、ウェスタンブロッティングによって調べた。その結果、LPS/低酸素状態によって、iNOSタンパク質が増大し、かつ、こうした作用が、COによって阻害されることが示された(図8A)。COが、ラットのiNOSプロモーターの転写活性化能に対して及ぼす作用を、LPSおよび低酸素状態で刺激したIEC-6細胞で調べた(図8B)。LPSと低酸素状態の組み合わせでは、ルシフェラーゼアッセイ法を用いると、iNOSプロモーターの転写活性化能が、4.9±0.3倍増大していた(P < 0.05)。COは、この転写活性化能を、わずか1.7±0.2倍の増大まで抑制した(P < 0.05)。さらに、IEC-6細胞によるNOの生成に対するCOの影響を、亜硝酸を測定することによって調べた。IEC-6細胞を、iNOSを上方制御することが周知のサイトカイン混合物(TNF-α、IL-1β、インターフェロン-γ)によって、刺激した。サイトカインによる刺激は、iNOSタンパク質を増大させるばかりでなく(図8C)、亜硝酸も、非刺激の対照での1.4±0.3μMと比較して、17.2±0.9μMまで増大させた(P < 0.01、図8D)。COとCoPPは、サイトカインの効果を有意に阻害し、その結果、亜硝酸のレベルは、それぞれ、9.8±0.7と10.4±1.0になった(P < 0.05)。
以下の実施例は、壊死性腸炎の患者または壊死性腸炎の危険性のある患者を治療する際に使用するプロトコールを示すものである。実施例はまた、外科的処置、たとえば、手術中に腸の一部が切除されるような手術の前、最中、および/または後に、患者を治療するためのプロトコールも示すものである。熟練した医師であれば、本明細書に記載したプロトコールは、いずれも、患者の個々の必要性にもとづいて適応させたり、壊死性腸炎の他の任意の治療とともに使用するべく適応させたりしうるものであることがわかると思われる。
Claims (10)
- 有効成分として一酸化炭素を含む、患者の壊死性腸炎の治療または予防用の薬学的組成物。
- 経口投与、吸入による投与、または患者の腹腔への直接投与に適した、請求項1記載の薬学的組成物。
- 患者が乳児もしくは早産児であるか、または患者が、低出生体重、低酸素状態、低体温状態、低血圧状態、血液の過粘稠度状態もしくはアシドーシスを示すか、または患者が、交換輸血、少なくとも1種の高浸透圧の輸液、濃縮赤血球の輸血もしくはカルシウム拮抗薬の過剰投与を受けているか、または患者が、腸間膜の虚血もしくは腸壁の細菌感染を生じているか、または患者が、外科手術を経験している、外科手術を受けようとしている、もしくは外科手術を受けている、請求項1または2記載の薬学的組成物。
- 壊死性腸炎を治療する過程が、経静脈栄養補給、経静脈水分補給、少なくとも1つの抗菌剤、患者に対する経鼻胃管による減圧術、患者に対する外科手術、および患者の腹膜腔の排液からなる群より選択される治療を患者に対して適用する過程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 人工肺または体外の膜型ガス交換装置によって投与される、請求項1〜4のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 腸の患部の切除を受けている最中か、受けた後か、または受ける前に患者に投与するための、請求項1記載の薬学的組成物。
- 気体状である、請求項1〜6のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 液状である、請求項1〜6のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 前記薬学的組成物が、患者が吸入するのに適した、一酸化炭素ガスを含む雰囲気である、請求項1記載の薬学的組成物。
- 患者がヒトである、請求項1〜9のいずれか一項記載の薬学的組成物。
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