JP2001501612A - 虚血性疾患を治療する方法及び発作後の症状を改善する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者の虚血性疾患を治療する方法であって、患者の虚血性疾患を治療するために、十分な期間、十分な量の薬学的に許容される型のセレクチンアンタゴニストを患者に投与して白血球細胞の蓄積を妨げることを具備する方法を提供する。さらに、本発明は、患者の虚血性疾患を治療する方法であって、十分な期間、十分な量の一酸化炭素ガスを患者に投与することによって患者の虚血性疾患を治療することを具備する方法を提供する。さらに、本発明は、患者の虚血性疾患を治療する方法であって、患者の虚血性疾患を治療するために、十分な期間、十分な量の薬学的に許容される型の不活化された第IX因子を患者に投与して凝固を阻害することを具備する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 虚血性疾患を治療する方法及び発作後の症状を改善する方法 本明細書に開示されている発明は、保健社会福祉省による国立衛生研究所、国 立心臓、肺、血液研究所のグラントHL55397の補助によってなされた。従って、 合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。 本願を通じて、様々な参照文献が括弧内に引用されている。本明細書に記載さ れ、請求の範囲に掲載されている本発明がなされた時点において、当業者に公知 であった本分野の状況をより完全に記述するために、これらの文献の開示内容全 体を本願明細書に参照文献として取り込む。発明の背景 虚血性疾患の治療は、長年の間、研究の焦点となってきた。近年、トランスジ ェニックマウスの利用が可能となったことにより、特定の遺伝子産物が発作の病 態生理に対して与える影響について数多くの報告がなされ始めている。ラットで の局所性脳虚血モデルは多数記載されているが、中大脳動脈閉塞のマウスモデル に関する記載は少なく、実験結果のばらつきに対する原因も未だ明らかではない 。 虚血後の心臓組織又は肺組織への急速な好中球の招集（recruitment）は、再 灌流の初期に有害な影響を与えるが、発作の発病における好中球流入の機序及び 影響は、現在も議論の対象となっている。発明の概要 本発明は、患者の虚血性疾患を治療する方法であって、患者の虚血性疾患を治 療するために、十分な期間、十分な量の薬学的に許容される型のセレクチンアン タゴニストを患者に投与して白血球細胞の蓄積を妨げることを具備する方法を提 供する。さらに、本発明は、患者の虚血性疾患を治療する方法であって、十分な 期間、十分な量の一酸化炭素ガスを患者に投与することによって患者の虚血性疾 患を治療することを具備する方法を提供する。さらに、本発明は、患者の虚血性 疾患を治療する方法であって、患者の虚血性疾患を治療するために、十分な期間 、十分な量の薬学的に許容される型の不活化された第IX因子を患者に投与して凝 固を阻害することを具備する方法を提供する。図の簡単な記述 図１ マウスにおける、局所性脳虚血及び再灌流後の好中球の蓄積。雄のC57B1/ J6マウスで、右中大脳動脈閉塞を45分間行った後、23時間再灌流した。中大脳動 脈閉塞の１時間前に、〜3.3×10⁵の¹¹¹Inラベルした好中球を尾静脈に投与した 。同側（右半球）及び反対側（左半球）のカウントを計測して、グラム組織当た りに標準化した（n=7、^**=p<0.01）。 図2A、2B、2C、及び2D 発作後の症状（stroke outcome）の指標に対する術前好 中球除去の影響。上述のごとく、雄のC57B1/J6マウスに一過性中大脳動脈閉塞を 施し（野生型、n=16）、手術前の３日間、好中球を免疫除去した（immunodeplet ed）マウスに同様の処置を施したものと比較した（ＰＭＮ−、n=18）。図2A． ＴＴＣ染色した脳の連続切片に基づいて算出し、％同側半球容積として表した梗 塞容積。図2B．神経欠損スコア、一過性中大脳動脈閉塞の24時間後に、麻酔に先 立って評価を行った。４匹が、最も重症な神経欠損を示している。図2C．大脳血 流量、ブレグマから2mm後ろにおいて、レーザードップラー流量測定法によって 測定し、反対側半球の血流量の％として表した。図2D．一過性中大脳動脈閉塞か ら24時間後の死亡率（^*＝p<0.05、^**＝p<0.01、^***＝p<0.001）。 図３ 中大脳動脈閉塞から24時間後における細胞間接着分子-1（ＩＣＡＭ−１） 転写物の発現。同じマウスの同側半球（梗塞）及び反対側半球（非梗塞）からRN Aを調製し、レーン当たり合計20μｇのRNAをアガコースゲルにかけた。一晩ナイ ロン膜に転写した後、³²Pラベルした1.90kbマウスＩＣＡＭ−１cDNA³³を用いて ノーザンブロットのプロービングを行った。対照として、βアクチンのプローブ を用いた。 図4A及び4B 中大脳動脈閉塞から24時間後における、大脳毛細血管系での細胞間 接着分子-1(ＩＣＭＡ−１)抗原の発現。同じ脳からの梗塞が生じていない半球と 梗 塞が生じた半球が、同一の染色条件下で比較できるように、ＩＣＡＭ−１免疫染 色用の脳冠状切片を得た。ラット抗マウスＩＣＡＭ−１抗体を用いて染色を行い 、アルカリホスファターゼによって一次抗体結合部位を可視化した。図4A.中大 脳動脈閉塞から24時間後に得た脳の反対側（非梗塞）切片中の大脳毛細血管。図 4B．図4Aに示されている脳の同一切片から得られた同側（梗塞）半球の大脳毛細 血管。 同側大脳毛細血管から得た内皮細胞は、ＩＣＡＭ−１（明るい赤色に染まる）の 発現が増大することを示している。倍率×250。 図5A及び5B ホモ接合ヌルＩＣＡＭ−１マウス（図5B）と野生型対照（図5A）の 大脳血管の解剖学的構造。ウィリス輪の下方から見た、大脳血管解剖学的構造の インディアインク染色は、大脳循環の血管パターンに大きな解剖学的差異はない ことを示しており、両者ともに後交通動脈は正常である。 図6A及び6B −活性中大脳動脈閉塞を行った代表的な野生型マウス（図6A）又は ホモ接合ヌルＩＣＡＭ−１マウス（図6B）から得た、24時間時点でのＴＴＣ染色 した連続切片。中大脳動脈領域中の青白色の部分は、梗塞された脳組織を表し、 生きた組織は煉瓦色に染まっている。複数の実験における連続大脳切片の面積測 定による梗塞容積の定量を図7Aに示す。 図7A、7B、7C、及び7D 発作後の症状におけるＩＣＡＭ−１の役割。既述のごと く、ＩＣＡＭ−１+/+（野生型、n=16）又はＩＣＡＭ−１−/−（n＝13）マウス に一活性中大脳動脈閉塞を行い、図２に記載されているように発作後の症状の指 標を測定した。図7A．梗塞容積に対するＩＣＡＭ−１の効果、図7B．神経欠損ス コア、図7C．大脳血流量、及び図7D．死亡率（^*＝p<0.05、^**＝p<0.01）。 図8A及び8B ヴァイベル−パラーデ体エキソサイトーシスに対する低酸素の影響 。図8A． 表記の期間、ヒト臍帯静脈を低酸素状態（pO₂15〜20Torr）又は正常 酸素状態に曝し、フォンビルブラント因子（vWF）分泌をELISAによって定量した 。低酸素ｖｓ正常酸素で、^***＝Ｐ＜0.001。図8B．2mM Ca⁺⁺(Ca⁺⁺2mM)、0mM Ca^{+ +} (Ca⁺⁺なし)、又は残存細胞外Ca⁺⁺をキレートするために0mM Ca⁺⁺に2mM EGTAを 添加（Ca⁺⁺なし＋EGTA）の存在下で、同様の実験を８時間行った。 図9A、9B、9C、及び9D Ｐ−セレクチン発現及び好中球の接着に対する内皮低 酸素の影響。図9A． 正常酸素又は低酸素に暴露したHUVEC上でのＰ−セレクチ ンの発現、放射性ラベルしたモノクローナル抗-Ｐ−セレクチンIgG（WAPS12.2ク ローン）の特異的結合によって測定した。データは、正常酸素４時間の時点との 比較による相対結合として表されている。図9B． 低酸素によって誘導されたＰ −セレクチン発現に対するタンパク質合成阻害の影響。４時間の正常又は低酸素 期間の開始時に添加したシクコヘキシミド（10μｇ/mL+CHX）のＰ−セレクチン 発現に対する影響が示されている。シクコヘキシミドの非存在下（-HEX）で同時 に行った実験との比較がなされており、データは、正常酸素（-CHX）結合との比 較による相対結合として表されている。平均±ＳＥＭが示されている;:^*＝p<0.0 5ｖｓ正常酸素(-CHX)；^†＝p<0.05ｖｓ正常酸素(+CHX)。 挿入図：４時間の時点における、タンパク質合成に対するシクロヘキシミド（10 μｇ/mL）の影響、³⁵Sメチオニン及び³⁵Sシステイン投与後に、トリクロロ酢酸 で沈殿し得る³⁵Sラベルしたタンパク質を測定した。図9C．ブロッキング抗Ｐ− セレクチン抗体（WAPS 12.2クローン）又はノンブロッキング抗Ｐ−セレクチン 抗体（AC1.2クローン）の存在下における、４時間の時点での、正常酸素（Ｎ） 又は低酸素（Ｈ）状態のヒト臍体静脈内皮単層への¹¹¹インジウムラベルされた 好中球の結合。平均±SEMが示されている；^**＝p<0.01。 図10A、10B、及び10C げっ歯類の心臓保存後の異所性移植における好中球及び 内皮細胞Ｐ−セレクチンの役割。図10A．ラットの心臓保存。採取直後（直後、n =8）に心臓を移植するか、又は４℃のリンゲル溶液中に16時間保存した後移植し た(保存、n=4)。心臓移植片の生存率(白抜きバー)及び白血球滞留(leukostasis) （ミエロペルオキシダーゼ、黒バー）に対する、再灌流10分前のノンブロッキン グ抗Ｐ−セレクチン抗体の投与(ACI.2、n=3)、ドナーの心臓移植前におけるレシ ピエント好中球の免疫除去（−ＰＭＮ、n=4）、又はブロッキング抗Ｐ−セレク チンIgG250μｇの投与（n=4）。平均±ＳＥＭが示されている；移植片の生存率 に関しては、c ｖｓ a、p<0.0001；g ｖｓ c,p<0.05；i ｖｓ又はc、p<0.05。移 植片の好中球浸潤については、d ｖｓ b、p<0.01；h ｖｓ d、p<0.05;J ｖｓ d 又はf、p<0.05。図10B． 心臓保存における冠状内皮Ｐセレクチンの役割、保存 前に血液を灌流除去したＰ−セレクチンヌル（又は野生型対照）マウスがらのド ナー心蔵を用いた。 移植片の生存は、血流が再開してから正確に10分後の心臓の電気的／機械的活動 の存在又は不存在によって評価した。図10C：参照文献15,18の記載に従ったミエ コペルオキシダーゼ活性（dABs 460nm/分）の測定による好中球浸潤の定量。（ 示されているバーの右から左に、それぞれn=14、8、13、及び7であり、Ｐ値が記 載してある） 図11A及び11B 患者32人でのヒトの心蔵手術中におけるヴァイベル−パラーデ体 の放出。図11A 虚血期間（大動脈をクランプする）の開始時（CS₁）及び終了時 （CS₂）に冠状静脈洞血液を採取した。トロンボモジュリン（TM）及びvWFについ てELISAを行った。図11B． 同じ患者から得たCS₁及びCS₂血液の代表的サンプル のvWF免疫電気泳動（希釈倍率が示されている）。CS₂サンプル中に検出される高 分子量の多量体の増加がみられる。 図12A、12B、12C、及び12D マウス局所大脳虚血モデルの手術の様子。図12A． 縫合に基づく開創システムを摸式的に示している。図12B．手術用顕微鏡の像。 大きい血管の肢端は、外頚動脈であり、これは、手術領域の後内側に位置する。 図12C．表記されたゲージの、熱で平坦化された閉塞用縫合糸の写真（5-0[下]又 は6-0ナイロン[上])。図12D．マウス心臓血管の解剖学的構造、前大脳動脈中の 糸、中大脳動脈起始点の閉塞を行っている状態の摸式図。 図13． マウス系統間の大脳血管解剖学的構造の比較。麻酔後、マウスに、イ ンディアインクを心臓内投与した後、人道的に安楽死させた。全ての系統で、両 側の後交通動脈を含む正常なウィリス輪を観察することができ、大脳血管系の解 剖学的構造に系統に関する差異がないことを示している。。 図14A、14B、及び14C 発作後の症状に対するマウス系統の影響。マウス（20〜2 3g、オス）に、45分のＭＣＡ閉塞（12mmの6.0閉塞縫合糸を用いた）を施した後 、24時間再潅流し、発作後の症状の指標を決定した。図14A．梗塞容積に対する 系統の影響、方法の部に記載されているように、同側半球容積のパーセントとし て求めた。図14B．神経欠損スコアに対する系統の影響、方法の部に記載されて いるようにスコアを決定して、神経欠損なし(0)から著しい神経欠損（4）までの 評点を付した。図14C．大脳血流量に対する系統の影響、レーザードップラー流 速計により、反対側（梗塞されていない）皮質の血流との比較よる梗塞し た頭域全体の相対流量を測定した。系統には、129J(n=9)、CDI(n=11)、及びC57/ B16マウス(n=11);^*＝p＜0.05 ｖｓ 129Jマウス。 図15A、15B、及び15C． 発作後の症状に対する動物の大きさ及び閉塞用縫合糸 の直径の影響。表記のサイズのオスCD-1マウスに、中大脳動脈閉塞（45分）を行 った後、方法の部で記載されているように再灌流（24時間）した。縫合糸のサイ ズ（ゲージ）が、各パネルに示されている。小さな動物は、20〜25グラム（平均 23グラム）であり、大きな動物は28〜35グラムであった（平均32グラム；6.0の 縫合糸ではn=14、5.0の縫合糸ではn=9）。図15A．動物／縫合糸サイズの梗塞容 量に対する影響。図15B．神経欠損スコア、及び図15C．大脳血流量、図14に記載 のごとく測定。Ｐ値が示されている。 図16A、16B、及び16C． 発作後の症状に対する温度の影響。オスC57/B16マウス に、45分間ＭＣＡ閉塞（6.0の縫合糸）を行った後再潅流した。熱電対によって 制御された加温装置が付いた直腸内プローブを用いて、37℃で90分間、体芯温度 （core temperature）を維持した（正常体温、n=11）。第二のグループでは（低 体温n=12）、最初10分間正常体温にした後、室温に保持したケージの中に、動物 を入れた（90分時点での平均体芯温度は、31℃）。両グループともに、90分の観 察期間終了後に、観察期間中37℃の外気温に保たれたケージに動物を戻した。Ｍ ＣＡ閉塞から24時間後に、発作後の症状の指標を記録した；図16A．梗塞容積、 図16B．神経欠損スコア、及び16C．大脳血流量、図３に記載のとおりに測定。^*= p＜0.05値が示されている。 図17A、17B、及び17C 永久局所大脳虚血と一過性局所大脳虚血後の再潅流の後 の症状の比較。方法の部に記載されているように、6.0ゲージの縫合糸を用いて 、永続的（n=11）又は一過性に（45分、n=17）、22グラムのオスのC57/B16マウ スを閉塞せしめた。ＭＣＡ閉塞から24時間後に、発作後の症状の指標を記録した ；図17A．梗塞容量、図17B．神経欠損スコア；及び17C．大脳血流量、図14に記 載されているごとく測定。 図18A及び18B マウスの中大脳動脈閉塞(ＭＣＡＯ)後のＰ−セレクチン発現及び 好中球(ＰＭＮ)蓄積。図18A．ＭＣＡＯ及び再潅流後のｐ−セレクチン発現。¹²⁵ Iラベルされたラットモノクコーナル抗Ｐ−セレクチンIgG又は¹²⁵Iラベルされた 非免 疫ラットIgG（非特異的溢血のためのコントロール）の何れかを用いて、中大脳 動脈閉塞後の、同側大脳半球中でＰ−セレクチン抗原の相対発現を実証した。実 験は、図18の脚注に記載されているように行った。値は、同側cpm／反対側cpmと して表した。対照の30分（n=4）以外は、各群n=6；‡=p<0.001．30分再潅流vs閉 塞直前；^*＝p<0.025、Ｐ−セレクチン蓄積の変化ｖｓ対照IgG蓄積の変化。図18B ．マウスの局所的大脳虚血及び再潅流後のＰＭＮ蓄積の経時変化。これらの実験 では、中大脳動脈閉塞(ＭＣＡＯ)の15分前に、ＰＳ野生型（ＰＳ+/+）マウスに 〜3.3×10⁵の¹¹¹InラベルしたＰＡＮＳを静脈内投与した。¹¹¹Inの蓄積は、屠殺 直後に測定し、以下の実験条件（ＭＣＡＯの前（プレ-O、n=4)、ＭＣＡＯの直後 （ポスト-O、n=6）、及びＭＣＡＯの10分後であるが、再潅流の前（：10ポスト- O、n=6））で、同側／反対側cpmの比率として表した。ＰＭＮ蓄積に対する再潅 流の影響を確定するために、虚血の45分後に、再潅流を開始した。再潅流の30分 後（n=6）、300分後(n=3)、及び22時間後(n=8)に、ＰＭＮの蓄積を測定した。同 一条件下で、虚血の45分後及び再潅流の22時間後に、Ｐ−セレクチンヌル（ＰＳ −／−）マウスでＰＭＮ蓄積を測定した（n=7＊、^*=p<0.05ｖｓＰＳ+/+の動物で の45分ＭＣＡＯ/22時間再潅流）。 図19 大脳血管の再流停止（no-reflow）におけるＰ−ヤレクチンの役割。レー ザードップラーフロープローブを用いて、ＰＳ+/+（上のバネル）及びＰＳ-／- （真ん中のパネル）マウスで、大脳血流量を測定し、反対側(非虚血)半球血流量 （±SEM）のパーセントとして表した。以下の時点で、血流量を測定した：a,Ｍ ＣＡＯの前（ＰＳ+/+、n=16;ＰＳ−／−、n=23）;b,ＭＣＡＯ直後（ＰＳ+/+、n= 42；ＰＳ−／−、n=40）；c,ＭＣＡＯから10分後であるが、再潅流前（ＰＳ+/+ 、n=36；ＰＳ−／−、n=34）；d,細潅流直後（ＰＳ+/+、n=36,ＰＳ−／−、n=34 ）；e，再潅流後30分（ＰＳ+/+、n=8；ＰＳ−／−、n=5）；及びf,再潅流後22時 間（ＰＳ+/+、n=15；ＰＳ−／−、n=5）。下のパネルは、上２つのパネルを重ね あわせたものであり、分かりやすくするために、エラーバーは省略してある。 図20 ホモ接合ヌルＰ−セレクチンマウス、ＰＳ−／−（右）及び野生型ＰＳ+/ +対照の脳血管解剖学的構造。ウィリス輸を下方から見た脳血管構造のインディ アインク／カーボンブラック染色は、大脳循環の血管パターンに大きな解剖学的 差異がな いことを示しており、両者ともに後交通動脈は正常である。 図21A 発作後の症状に対するＰ−セレクチンの影響。中大脳動脈閉塞を45分間 行った後、Ｐ−セレクチン+/+（n=10）又はＰ−セレクチン-/-（n=7）マウスで2 2時間再潅流した。図21A．梗塞容積（2％の2,3,5,トワフェニル,2H-テトラゾリ ムクロライド(ＴＴＣ)染色によって測定し、同側半球のパーセントとして算出し た），図21B.神経欠損スコア、(1=正常な自発的運動;2=時計回りの環状化(circl ing)；3=時計回りの回転；4=有害な刺激に対して無反応）；図21C．屠殺時での 生存率（^*＝p<0.05）に対するＰ−セレクチンの影響。 図22A、22B、22C、及び22D 発作後の症状に対するＰ−セレクチンのブロッキン グの影響。手術直前に、ＰＳ+/+マウスにブロッキング用ラット抗マウス抗Ｐ− セレクチンIgG（クローンRB40.34、30μｇ/マウス）又は同量の非免疫ラットIgG の何れかを投与した。図22A．再潅流30分後の大脳血流量；再潅流から22時間後 の梗塞容積図22B、神経欠損スコア図22C、及び死亡率図22Dが示されている。（ 各群につきn=7、^*=p<0.05） 図23A及び23B 図23A．大脳梗塞容積に対する一酸化炭素吸入の影響。釣鐘型ガ ラス器の中にマウスを入れて、12時間マウスを0.1％のＣＯに暴露せしめた。該 処理後、釣鐘型ガラス器からマウスを取り出して、中大脳動脈の管内閉塞を施し た。24時間の時点で、動物を屠殺し、図25に示されているように、トリフェニル テトラゾリウムクコライド(ＴＴＣ)染色によって梗塞容積を測定した。梗塞容積 （平均±SEM）の定量は、同側半球の梗塞のパーセントとして表した。これらの データは、吸入されたＣＯが、発作後の梗塞容積を減らすことを示している。 図24A、24B、及び24C 図24A．発作後の症状に対する一酸化炭素吸入の用量反応 。実験は、上述のとおりである。表記の用量のＣＯを吸入させた。これらのデー タは、吸入されたＣＯが梗塞容積を用量依存的に減らすことを示しており、0.1 ％が最適な保護を与える。図24B及び24C．発作におけるヘムオキシゲナーゼ（該 酵素はＣＯを産生する）の役割。動物には、対照としてビークル（DMSO）のみ又 は亜鉛プロトポルフィリンIX（ZnPP）又は錫プロトポルフィリンIX（SnPP）の何 れかを与えた。最後のグループでは、マウスにビリベルジン（Bill）（ヘムオキ シゲナーゼによるヘム分解の過程で、ＣＯとともに形成される化合物） を与えた。左側のパネルは、梗塞容積を示している。右側のパネルは、死亡率を 示している。これらの実験は、ヘムオキシゲナーゼ活性が阻害されると、発作後 の症状が悪化する（梗塞がより大きくなり、死亡率がより高くなる）ことを実証 している。ビリベルジン投与では保護されないので、これらのデータは、ヘムオ キシゲナーゼ活性の共産物であるＣＯが保護能力を有することを示唆している。 図25 図23の動物に対する連続大脳切片のＴＴＣ染色。梗塞された組織は白く見 え、生きている組織は煉瓦色に見える。 図26A−26F ヘムオキシケナーセI(ＨＯ−Ｉ)誘導に対する局所大脳虚血の影響 。図26A-26Cは、発作(図26B)及び対照(図26A及び26C)におけるＨＯ−Ｉ ｍＲＮ Ａのインシチュハイブリダイゼーションを示している。図26D-26Fは、ＨＯ−Ｉ タンパク質の免疫組織化学を示している。図26Eは、発作後、該タンパク質が血 管及び星状膠細胞に発現していることを示す。図26D及び26Fは、対照では、該タ ンパク質が血管及び星状膠細胞中で発現されていないことを示している。 図27 ヘムオキシゲナーゼＩ（ＨＯ−Ｉ）ｍＲＮＡ誘導に対する局所大脳虚血 の影響。反対側（contralateral）は、該脳の発作が起こっていない側である。 同側（ipsilateral）は、該脳の発作が起こった側である。両動物ともに、発作 が生じた側の脳では、ＨＯ−Ｉが増加しているが、発作が生じなかった側では増 加していないことが明らかである。 図28 ヘムオキシゲナーゼ(ＨＯ)Ｉ誘導に対する低酸素の影響。12時間の低酸素 環境に曝されたマウスは、正常酸素の対照と比べてヘムオキシゲナーゼＩ ｍＲ ＮＡの増加を示す。これらのデータは、低酸素へのプレ暴露が、その後の虚血性 現象に対する防御を与え得る潜在的機序を示しており、これは、低酸素にした後 、発作を起こしたマウスにおいて正しいことが見出された。 図29 マウス脳内皮細胞中でのヘムオキシゲナーゼＩ(ＨＯ−１)タンパク質発現 に対する低酸素の影響。低酸素によって、これらの脳由来の内皮細胞で、ＨＯ− Ｉタンパク質レベルの増加が引き起こされる。 図30 マウス脳内皮細胞内でのヘムオキシゲナーゼI(ＨＯ−Ｉ)ｍＲＮＡの誘 導に対する低酸素の影響。低酸素は、脳由来の内細胞中に、ＨＯ−Ｉ ｍＲＮＡ レベルを引き起こす。 図31A-31D マウスでの中大脳動脈閉塞(ＭＣＡＯ)後のＰ−セレクチン発現及 び好中球（ＰＭＮ）蓄積 図31A．ＭＣＡＯ及び再潅流後のＰ−セレクチン発現 。¹²⁵Iラベルされたラットモノクローナル抗Ｐ−セレクチンIgG又は¹²⁵Iラベル された非免疫ラットIgG（非特異的溢血のためのコントコール）を用いて中大脳 動脈閉塞後の同側大脳半球中でのＰ−セレクチンの相対的発現を実証した。値は 、同側cpm 30分再潅流ｖｓ閉塞直前;^*=p<0.025、Ｐ−セレクチン蓄積の変化ｖｓ対照IgG蓄 積の変化。 図31B及び31C 45分のＭＣＡＯの後に、１時間の再潅流を行ったマウスから得た 脳切片におけるＰ−セレクチン発現の免疫組織化学的分布。同側及び反対側大脳 皮質切片は、同じマウスのものが示してある。矢印は、大脳毛細血管を示してお り、濃い茶色は、内皮細胞表面におけるＰ−セレクチン発現を表している。¹¹¹I nの蓄積は、屠殺直後に測定し、以下の実験条件(ＭＣＡＯの前(プレ-O、n=4)、 ＭＣＡＯの直後（ポスト-O、n=6）、及びＭＣＡＯの10分後であるが、再潅流の 前（：10ポスト-O、n=6）)で、同側／反対側cpmの比率として表した。ＰＭＮ蓄 積に対する再潅流の影響を確定するために、虚血の45分後に、再潅流を開始した 。再潅流の30分後（n=6）、300分後(n=3)、及び22時間後(n=8)に、ＰＭＮの蓄積 を測定した。同一条件下で、虚血の45分後及び再潅流の22時間後に、Ｐ−セレク チンヌル（ＰＳ−／−）マウスでＰＭＮ蓄積を測定した（n=7、^*=p<0.05 ｖｓ ＰＳ+/+の動物での45分ＭＣＡＯ/22時間再潅流）。 図32A〜32C 大脳血管の再流停止におけるＰ−セレクチンの役割。レーザードッ プラーフロープローブを用いて、ＰＳ+/+（上のパネル）及びＰＳ−／−（真ん 中のパネル）マウスで、大脳血流量を測定し、反対側（非虚血）半球血流量（± SEM）のパーセントとして表した。以下の時点で、血流量を測定した:a,ＭＣＡＯ の前(ＰＳ+/+、n=16；ＰＳ−／−、n=23)；b,ＭＣＡＯ直後（ＰＳ+/+、n=42；Ｐ Ｓ−／−、n=40）;c,ＭＣＡＯから10分後であるが、再潅流前（ＰＳ+/+、n=36； ＰＳ−／−、n=34）；d，細潅流直後（ＰＳ+/+、n=36；ＰＳ−／−、n=34）；e ，再潅流後30分（ＰＳ+/+、n=8；ＰＳ−／−、n=5），及びf、再潅流後22時間（ ＰＳ+/+、n=15；ＰＳ−／−、n=５）。下のパネルは、上２つのパネルを重ねあ わせたものでめり、分かりやすくするために、エラーバ ーは省略してある。 図33A〜33C 発作後の症状に対するＰ−セレクチン遺伝子の影響。中大脳動脈閉 塞を45分間行った後、Ｐ−セレクチン+/+（n=10）又はＰ−セレクチン−／−（n =7）マウスで22時間再潅流した。図33A．梗塞容積（2％の2,3,5,トリフェニル,2 H-テトラゾリムクロライド(ＴＴＣ)染色によって測定し、同側半球のパーセント として算出した）；図33B．屠殺時の生存百分率、に対するＰ−セレクチンの影 響。生存百分率を算出するのに用いた動物数ともに、平均±SEMが生存率のバー の上に示されている（^*＝p<0.05）。 図34 発作後の症状に対するＰ−セレクチンのブロッキングの影響。中大脳動脈 閉塞直前（プレＭＣＡＯ；各群につきn=7）又は中大脳動脈の閉塞直後（ポスト- ＭＣＡＯ；対照抗体につきn=9、機能的にブロッキングする抗Ｐ−セレクチン抗 体につきn=6）に、ＰＳ+/+マウスにブロッキング用ラット抗マウス抗Ｐ−セレク チンIgG（クローンRB40.34、30μｇ/マウス）又は同量の非免疫ラットIgGの何れ かを投与した。何れの場合にも、虚血期間から45分後に、臨床的再潅流を刺激す るために管内閉塞縫合を中止した。再潅後22時間における、梗塞容積（黒いバー ）、再潅流から30分後の大脳血流量（斜線が引かれたバー）；及び生存率（薄い 影が付いているバー）が示されている。生存百分率を算出するのに用いた動物数 ともに、平均±SEMが生存率のバーの上に示されている。^*＝p<0.05ｖｓ対照抗体 。 図35A〜35B 定量的分光光度的大脳内出血アッセイのバリデーション、脳組織非 存在下（図35A）又は脳組織存在下（図35B）。図35A．既知濃度のヘモグロビン をシアノメエトヘモグロビンに還元した後、550nmでＯＤを測定した標準曲線。 各点でN=5の測定、平均+ＳＥＭが示されている。最適合曲線の式及びｒ値が示さ れている。図35B．一定量の新鮮な脳組織ホモジネートに既知濃度のヘモグロビ ン（生理的食塩水中に希釈した自己の血液を用いる）を加え、分光学的ヘモグロ ビンアッセイを行った。脳を半球に分割した；各動物について、一方の半球は、 20分間生理的食塩水中に液浸せしめ（NS、実線）、他方の半球はトリフェニルテ トラゾリムクロライド中に（ＴＴＣ、破線）20分間液浸せしめた（大脳梗塞容積 を測定するために行う操作と似ている）。添加したヘモグロビンの各濃度に ついて、6個の半球に対して分光学的ヘモグロビンアッセイを行った。平均±SEM が示されている。 図36A〜36B 定量的分光学的ヘモグロビンアッセイ。図36A．マウスの定量的ICH に対するコラーゲナーゼ及びrt-PAの注入の影響。マウスの右深皮質／基底核の 中に、定位法により、ＩＣＨ誘導因子を注入した。24時間後に脳を取り出し、分 光学的ヘモグロビンアッセイを行って、ＩＣＨを定量した。マウスには、1)未処 置（対照）、2)1μＬの正常生理食塩水溶液（シャム）の定位的注入、3)μＬの 正常生理的食塩水溶液中のコラーゲナーゼB0.024μｇの定位的注入（コラーゲナ ーゼ）、又は4)コラーゲナーゼＢ（上記のとおり）の定位的注入の後、背側陰茎 静脈への注入によるプラスミノーゲン活性化因子(0.2μＬの正常生理的食塩水溶 液中に1mg/kg)の注入(コラーゲナーゼ÷rt-PA）を行った。^**p<0.001ｖｓ.シャ ム又は対照。図36B．マウスの定量的ＩＣＨに対する局所的虚血発作後のrt-PAの 影響。マウスには、45分のＭＣＡ閉塞に続く再潅流を行った後、1)静脈内に正常 な生理的食塩水溶液0.2μＬ（発作＋生理的食塩水）又は2)静脈内に組織プラス ミノーゲン活性化因子（0.2μＬの正常な生理的食塩水中に15mg/kg）(発作+rt-P A)を与えた。24時間後に脳を取り出し、分光学的ヘモグロビンアッセイを行って 、ＩＣＨを定量した。^**p<0.05。 図３７ 発作後のＩＣＨの視覚的な定量に用いたスコアリングシステムを示した もの。発作を起こした異なる動物から得た各スライスは、最大の出血直径を示し ている脳の冠状スライスを表している。数字は、方法の部で定義されている視覚 的に定義された出血スコアに対応している。 図38A−38B 視覚的ＩＣＨスコア 図38A．マウス視覚的ＩＣＨスコアに対する コラーゲナーゼ注入及びrt-PAの影響。定位法により、マウスの右深皮質／基底 核にＩＣＨ誘導因子を注入した。マウスには、1)未処置（対照）、2)1μＬの正 常生理食塩水溶液（シャム）の定位的注入、3)1μＬの正常生理的食塩水溶液中 のコラーゲナーゼB0.024μｇの定位的注入（コラーゲナーゼ）、又は4)コラーゲ ナーゼＢ（上記のとおり）の定位的注入の後、背側陰茎静脈への注入によるプラ スミノーゲン活性化因子（0.2μＬの正常生理的食塩水溶液中に1mg/kg）の注入 （コラーゲナーゼ＋rt,-PA）を行った。24時間後に脳を採取し、1mmの冠状スラ イスに切断して、方法の部に記載したように、何も知らせていない観察者にスコ アを付けさせた。^**p<0.05ｖｓコラーゲナーゼ、p<0.005ｖｓ．シャム又は対照 。図38B.マウスの視覚的ＩＣＨスコアに対する局所的虚血発作後のrt-PAの影響 。マウスには、45分のＭＣＡ閉塞に続く再潅流を行った後、1)静脈内に正常な生 理的食塩水溶液0.2μＬ（発作÷生理的食塩水）又は2)静脈内に組織プラスミノ ーゲン活性化因子（0.2μＬの正常な生理的食塩水中に15mg/kg）（発作+rt-PA） を与えた。24時間後に脳を取り出し、1mmの冠状スライスに切断し、方法の部に 記載されているように何も知らせていない観察者にスコアを付けさせた^**p<0.01 。水平線によって表記されている各群の中央値とともに、視覚的ＩＣＨスコアの 各値が示されている。 図３９ 視覚的ＩＣＨと分光学的ヘモグロビンアッセイの相関。550nmでの光学 密度（縦軸）は、（全ての実験からの）脳組織を分析した分光学的ヘモグロビン アッセイから得られた結果を表している。対応する視覚的ＩＣＨスコア（図38に 示されている）を横軸にプロットしてめる。各点に対して、平均±SEMが示され ている。ピアソンの線形相関を用いて線形相関を行い、直線の式及びｒ値が示さ れている。 図40A−40F 図40A．放射線ラベルした血小板の蓄積に対する発作及び発作時に おける因子IXai投与の影響。発作なしの対照動物（n=4）、又は発作直前に因子I Xaiの術前投与（300μｇ/kg、n=7）を行った若しくは行わなかった（n=7）動物 の何れかに¹¹¹In血小板を投与した。血小板の蓄積は、同側cpm／反対側cpmとし て表されている。平均±SEMが示されている。^*p<0.05ｖｓ発作なし；^**p<0.05ｖ ｓ発作＋ビークル。図40B．梗塞した大脳組織中へのフィブリンの蓄積。局所大 脳虚血及び再潅流から22時間後に、ビークル（左側の２レーン）又は因子IXai（ 300μｇ/kg、右側の２レーン）の何れかを術前に前処理した代表的なマウスから 脳を採取した。脳を同側(R)及び反対側(L)半球に分割して、蓄積したフィブリン を可溶化するためにプラスミン消化を行った。クロスリンクしたフィブリンのガ ンマ−ガンマ鎖二量体上に発現されたネオエピトープ(neoepitope)に対して誘導 された一次抗体を用いて、イムノブロッティングを行った。図40C−40F.発作に おけるフィブリン形成部位の免疫組織化学的同定。図2bに記載さ れたものと同一のフィブリンを検出するための抗体を用いて、発作後のマウス２ 匹から脳を採取した（上及び下のパネルは、各々１匹のマウスを示している）。 矢印は、大脳毛細血管を示す。両同側半球（右パネル）中に、赤色の染色によっ て、血管内フィブリンを明瞭に同定することができるが、これは虚血が起こって いない半球である反対側（左パネル）には見られないことに注意されたい図41A −41C 図41A．レーザードップラーによって測定されたマウス発作モデルにおけ る相対ＣＢＦに対する因子IXaiの影響。因子IXai処置した動物（300μｇ/kg、n= 48、破線）中のＣＢＦは、24時間の時点で、ビークル処置した対照(n=62)に比べ て有意に高い。平均±SEMが示されている。^*p<0.05。図41B．連続冠状切片のＴ ＴＣ染色によって測定したマウス発作モデル中の梗塞容積に対する因子IXaiの影 響。動物には、ビークル（n=62）又は因子IXai（300μｇ/kg、n=48）を与えた。 平均±SEMが示されている。^*p<0.05。図41C.発作における因子IXaiの用量反応。 発作開始の直前に、因子IXaiを投与し、上記図41Bに記載されているように大脳 梗塞容積を決定した。ビークル、300μｇ/kg、600μｇ/kg、及び1200μｇ/kgの 用量に対して、N=62、48、6、及び6。平均±SEMが示されている。^*p<0.05ｖｓビ ークル処置された動物。 図42A−42B 大脳内出血に対する因子IXaiの影響。図42A．分光学的ヘモグロビ ンアッセイは、方法の部に記載されているように行った。550nmのO.D.は、脳ヘ モグロビン含量に線形的に相関する^11,12。図42B．方法の部に記載されているよ うに、何も知らされていない観察者によって、視覚的に決定されたＩＣＨスコア は、分光学的に決定された脳ヘモグロビン含量と相関する^11,12。平均±SEMが示 されている。^*p<0.05ｖｓビークル処置した動物。 図43 発作の開始後に与えられたときの、大脳梗塞容積に対する因子IXai投与の タイミングの影響。方法の部に記載されているように、マウスに局所的脳内虚血 及び再潅流を行った。閉塞前投与のデータ（左側２つのバー）は、図42B．に示 されているものである。発作後に投与された因子IXaiの影響を決定するための別 の実験では、管内閉塞縫合の中止直後に、ビークル(正常な生理的食塩水、n=13) 又は因子IXai（300μｇ/kg、n=7）を静脈内投与した。（22時間の時点で得られ たＴＴＣ染色された連続切片に基づいて）大脳梗塞容積を決定した。平均±SEM が示されている。^*p<0.05、^**p<0.05ｖｓビークル処置した動物。発明の詳細な記述 本発明は、患者の虚血性疾患を治療する方法であって、患者の虚血性疾患を治 療するために、十分な期間、十分な量の薬学的に許容される型のセレクチンアン タゴニストを患者に投与して白血球細胞の蓄積を妨げることを包含する方法を提 供する。セレクチンアンタゴニストは、ペプチド類似物（peptide mimetic）、 核酸分子、リボザイム、ポリペプチド、小分子、炭水化物分子、単糖、オリゴ糖 、又は抗体であり得る。セレクチンは、Ｐ−セレクチン、E-セレクチン、又はL- セレクチンであり得る。抗体は、Ｐ−セレクチン抗体であり得る。抗体は、さら にポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を包含し得る。Ｐ−セレクチンア ンタゴニストには、L-アルギニンのようなNO（Nitric oxide）前駆体、ニトログ リセリン又はニトロプルシドのようなNOドナー、サイクリックGMP又はサイクリ ックAMP類縁体のようなサイクリックンクレオチド類縁体、又はホスホジエステ ラーゼ阻害剤が含まれ得る。 薬学的に許容される型のＰ−セレクチンアンタゴニストには、Ｐ−セレクチン アンタゴニスト及び薬学的に許容される担体が含まれ得る。担体には、エアロゾ ル、静脈内、経口、又は局所担体が含まれ得る。 白血球細胞は、好中球又は単球であり得る。患者は、哺乳動物であり得る。哺 乳動物は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、家禽（fowl）、又は ヒトの疾病若しくは疾患の任意の動物モデルであり得る。 虚血性疾患には、末梢血管疾患、静脈血栓、肺塞栓、心筋梗塞、一過性虚血発 作（transient ischemic attack）、不安定狭心症、鎌形赤血球貧血症、可逆性 虚血性神経欠損（reversible ischemic neurological deficit）又は発作性疾患 が含まれ得るが、これらに限定されない。 患者は、心臓手術、肺手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、腹部手術、又は臓 器移植手術中であり得る。臓器移植手術には、心臓、肺、膵臓、又は肝臓移植手 術が含まれ得る。 さらに、本発明は、患者の虚血性疾患を治療する方法であって、十分な期間、 十分な量の一酸化炭素ガスを患者に投与することによって患者の虚皿性疾患を治 療することを具備する方法を提供する。 一酸化炭素の投与は、患者による吸入、又は血液若しくは患者の体液への体外 暴露を介してなし得る。 患者を治療するのに十分であり得る一酸化炭素の量には、不活性ガス中の約0. 0001〜2％の一酸化炭素が含まれるが、これに限定されない。不活性ガスは、酸 素、窒素、アルゴン、又は空気であり得る。本発明のある実施態様では、投与さ れる一酸化炭素の量は、空気中の0.1％一酸化炭素であり得る。 虚血性疾患を治療するために患者に一酸化炭素を投与するのに十分な時間は、 手術約１日前から手術約１日後が含まれるが、これらに限定されない。該時間は 、手術約12時間前から手術約12時間後であり得る。さらに、該時間は、手術約12 時間前から手術約１時間後であり得る。さらに、該時間は、手術約１時間前から 手術約１時間後であり得る。手術約20分前から手術約１時間後が含まれ得る。手 術がなされていない患者の虚血性疾患を治療するのに十分な時間は、このような 疾患が肉体的に現れる前又は現れている間が含まれ得る。このような虚血性疾患 の兆候を減弱させるために、一酸化炭素は、兆候の前に投与することが好ましい 。以下に記載されているように、手術前に投与すれば、一酸化炭素の投与は、患 者の虚血を予防できる。 本明細書で使用する「虚血性疾患」には、末梢血管疾患、静脈血栓、肺塞栓、 心筋梗塞、一過性虚血発作、肺虚血、不安定狭心症、可逆性虚血性神経欠損、付 加的血栓溶解活性（adjunct thoromolytic acitivity）、過剰な凝固状態、鎌形 赤血球貧血症、又は発作性疾患が含まれ得るが、これらに限定されない。 患者は、心臓手術、肺手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、腹部手術、又は臓 器移植手術中であり得る。臓器移植手術には、心臓、肺、膵臓、又は肝臓移植手 術が含まれ得る。 一酸化炭素は、間接的態様で投与し得る。患者に一酸化炭素ガス又はガス混合 物を直接吸入又は付与するよりも、患者には、一酸化炭素のインビボでの産生を 刺激する化合物を与え得る。このような化合物には、ヘム、フェリチン、ヘマチ ン、ヘムオキシゲナーゼに対する内在性前駆体又はヘムオキシゲナーゼ刺激因子 が含まれ得るが、これらに限定されない。さらに、患者は、正常な大気に比べて 低い酸素レベルの環境に暴露され得る。 ヘムオキシゲナーセは、前駆体ヘムから一酸化炭素を合成する内在性酵素であ る（これは、ヘムが体内で分解され、代謝される通常の経路の一部である）。マ ウスが低酸素又は組織の虚血の何れかに曝されると、ヘムオキシゲナーゼタンパ ク質をコードするメッセンジャーRNA及びタンパク質自体が何れも増加した。さ らに、組織中の一酸化炭素の測定により示されたように、酵素の活性が増加した 。本発明の別の態様は、患者の虚血性疾患を治療する方法であって、患者の虚血 性疾患を治療するために、十分な期間、十分な量の薬学的に許容される型の不活 化された第IX因子を患者に投与して凝固を阻害することを具備する方法である。 十分な量には、約75〜550μｇ/kgが含まれ得るが、これに限定されない。量は、 300μｇ/kgであり得る。薬学的に許容される型の不活化された第IX因子には、不 活化された第IX因子及び薬学的に許容される担体が含まれる。 第IX因子は、熱失活のような、当業者に公知の標準的方法によって不活化し得 る。第IX因子は不活化されるか、又は第IX因子はアンタゴニストによって阻害し てもよい。このようなアンタゴニストは、ペブチド類似物、核酸分子、リボザイ ム、ポリペプチド、小分子、炭水化物分子、単糖、オリゴ糖、又は抗体であり得 る。 本発明は、患者の虚血性疾患を改善し得る化合物を同定する方法であって、 ａ）発作動物モデルである動物に化合物を投与することと、 ｂ）該動物の発作後の症状を測定することと、 ｃ）ステップ(b)の発作後の症状を該化合物非存在下の発作動物モデルの発作 後の症状と比較して患者の虚血性疾患を改善し得る化合物を同定すること と、 を含む方法を提供する。発作動物モデルには、局所大脳虚血及び再潅流のマウス モデルが含まれる。発作後の症状は、身体の調査、MRI、レーザードップラーフ ローメトリー、トリフェニルテトラゾリウムクロライド染色、神経欠損の化学的 評価、CTスキャン、又は大脳皮質血流量によって測定し得る。ヒトの発作後の症 状は、臨床的測定、QOLスコア、及び神経心理測定テストによっても測定し得る 。化合物には、Ｐ−セレクチンアンタゴニスト、E-セレクチンアンタゴニスト、 又はL-セレクチンアンタゴニストが含まれ得る。 さらに本発明は、患者に白血球細胞が蓄積するのを防ぎ得る化合物を同定する 方法であって、 ａ）発作動物モデルである動物に化合物を投与することと、 ｂ）該動物の発作後の症状を測定することと、 ｃ）ステップ(b)の発作後の症状を該化合物非存在下の発作動物モデルの発作 後の症状と比較して患者に白血球細胞が蓄積するのを防ぎ得る化合物を同 定することと、 を含む方法を提供する。 白血球細胞は、好中球、血小板、又は単球であり得るが、これらに限定されな い。化合物は、セレクチン阻害剤、単球阻害剤、血小板阻害剤、又は好中球阻害 剤であり得るが、これらに限定されない。セレクチン阻害剤は、Ｐ−セレクチン 、E-セレクチン、又はL-セレクチン阻害剤であり得るが、これらに限定されない 。セレクチンは、血小板の表面上に発現され、本明細書に記載されているこのよ うなセレクチン阻害剤又はアンタゴニストは、細胞の表面上でのこのようなセレ クチンの発現を阻害し得る。発現の阻害は、転写レベル、翻訳レベル、翻訳後レ ベルであり得、又は細胞質中でのこのようなセレクチンの移動の阻害、及び細胞 表面上への移行の阻害であり得る。 本発明は、好中球、単球、又は他の白血球細胞が適切に付着する能力を阻害す ることによって、虚血性疾患の治療を提供する。これは、CD18のようなカウンタ ーリガンドを除去することによって達成し得る。以下で論述されているように、 「ノックアウト」CD18マウス（正常なCD18遺伝子を発現しないマウス）は、有害 な虚血性症状から守られることが実証された。患者の血管表面上に存在する内皮 細胞も治療のターゲットとなり得る。マウスの発作モデルでは、血栓溶解因子と してTPAを投与すると、発作疾患の改善とともに、幾つかの目に見える出血が引 き起こされた。しかし、Ｐ−セレクチンアンタゴニストの投与も動物モデルの発 作疾患を改善したが、出血は併発しなかった。本発明は、血栓溶解療法の効果を 増大させるために、又は患者に投与すべきこのような治療の用量を下げて、血栓 溶解療法の副作用を減少させ得るようにするために血栓溶解療法と併用しても よい。 本明細書で用いる、「適切な薬学的に許容される担体」という語には、ＰＢＳ 溶液（phosphate buffered saline solution）、水、油／水エマルジョン又はト リグリセリドのようなエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤（wetting agent） 、錠剤、被覆された錠剤、及びカプセルのような任意の標準的な薬学的に許容さ れる担体が含まれる。化合物の静脈内及び腹腔内投与に有用な許容されるトリグ リセリド のトリグリセリドエマルジョンである。 典型的には、このような担体には、デンプン、ミルク、糖、ある種の粘土、ゼ ラチン、ステアリン酸、タルク、植物性脂肪又はオイル、ガム(gum)、グリコー ル、又は他の公知の賦形剤のような賦形剤が含まれる。このような担体には、香 料及び着色用添加物、又は他の成分も含有される得る。 本発明は、患者の発作疾患を治療し得る又は発作後の症状を改善し得る治療的 有効量の本発明のタンパク質組成物及び化合物とともに、適切な希釈剤、防腐剤 、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、及び／又は担体を含有し、加齢による神経 の崩壊、記憶障害、又は神経疾患の治療に有用な薬学的組成物も提供する。この ような組成物は、液体、若しくは凍結乾燥、若しくはその他の乾燥した処方であ り、様々な緩衝液含量（例えば、Tris-HCl、アセテート、ホスフェート）、pH、 及びイオン強度の希釈剤、表面への吸収を防ぐためのアルブミン若しくはゼラチ ンのような添加物、界面活性剤（例えば、Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、 胆汁酸塩）、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、 抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例え ば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、巨大物質すなわち浸透圧 調節物質（例えば、ラクトース、マニトール）、該化合物に共有結合したポリエ チレングリコールのようなポリマー、金属イオンとの複合体化、又はポリ乳酸、 ポリグリコール酸、ハイドロゲル等のようなポリマー性化合物中若しくはポリマ ー性化合物上への化合物の取り込み、又はリポソーム、ミクロエマルジョン、ミ セル、単層若しくは多層状小胞、赤血球のゴースト、若しくはスフェロプラスト が含まれる。このような組成物は、化合物又は組成物の物理的状態、溶解度、安 定性、 インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を与えるであ ろう。組成物の選択は、発作疾患の症候を軽減し得る、又は患者の発作後の症状 を改善し得る化合物の物理的性状及び化学的性状に依存する。 制御された、又は持続的な放出組成物には、親油性貯留物（depot）中への（ 例えば、脂肪酸、ワックス、オイル）処方が含まれる。ポリマー（例えば、ポロ キサマー（poloxamers）又はポロキサミン（poloxamines））でコートされた粒 状組成物、組織特異的受容体に対して誘導された抗体、リガンド、若しくは抗原 に結合された化合物、又は組織特異的受容体のリガンドに結合された化合物も本 発明に包含される。本発明の組成物の他の態様には、粒子形態保護コーティング 、プロテアーゼ阻害剤、又は非経口、肺、鼻、及び経口を含む様々な投与ルート の浸透増強剤が取り込まれる。 化合物、又はその受容体を有する細胞、又は固形組織及び血液、脳脊髄液、又 は尿のような液体サンプル中の誘導体の検出及び定量に有用な試薬を提供するた めに、本発明の化合物の一部は、検出可能なマーカー物質（例えば、¹²⁵Iで放射 性ラベルされるか、又はビオチン化される）と会合させることによってラベルし てもよい。 投与されると、多くの場合、化合物は循環から迅速に除去され、それ故、相対 的に短寿命の薬理学的活性を示し得る。従って、治療効果を維持するために、相 対的に多量の生物活性化合物をしばしば投与する必要がめるだろう。ポリエチレ ングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体 、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビ ニルピロリドン、又はポリプロリンのような水溶性ポリマーを共有結合させるこ とによって修飾した化合物は、対応する未修飾の化合物に比べて、静脈内投与後 の血中において相当長い半減期を示すことが知られている(Abuchowsklら、1981 ；Newmarkら、1982；及びKatreら、1987)。このような修飾は、水性溶液中での 化合物の溶解度も増加させ、凝集をなくし、化合物の物理的及び化学的安定性を 増大し、化合物の免疫原性及び反応性を大きく減少せしめ得る。結果として、こ のようなポリマー化合物の付加物を投与することによって、未修飾の化合物を用 いた場合に比べて、より少ない回数又はより少ない用量で所望のインビボでの 生物学的活性が達成され得る。 ポリエチレングリコール（PEG）は、哺乳動物中で極めて低い調性を有するの で、ポリエチレングリコールを化合物に付着させると特に有用である(Carpenter ら、1971)。例えば、アデノシンデアミナーゼのPEG付加物は、ヒトの重症複合免 疫不全症候群の治療に対する使用について米国で承認された。PEGを抱合させる ことによって得られる第二の利点は、異種性化合物の免疫原性及び抗原性を効率 的に減少することである。例えば、ヒトタンパク質のPEG付加物は、重篤な免疫 応答を引き起こすリスクなしに、他の哺乳類種の疾病を治療するのに有用である かもしれない。記憶又は学習の認知疾患の症候を緩和することができる本発明の 化合物は、マイクロカプセル用具に入れて輸送して、該化合物、又は該化合物を 産生し得る細胞に対する宿主の免疫応答を減少又は阻止し得る。本発明の化合物 は、リポソームのような膜の中にミクロカプセル化して輸送してもよい。 PEGのようなポリマーは、アミノ末端アミノ酸のαアミノ基、リシン側鎖のε アミノ基、システイン側鎖のスルフヒドリル基、アスパラギン酸及びグルタミン 酸側鎖のカルボキシル基、カルボキシ末端アミノ酸のαカルボキシル基、チロシ ン残基のようなタンパク質中の一以上の反応性アミノ酸残基、又はあるアスパラ ギン、セリン、トレオニン残基に付着したグリコシル鎖の活性化された誘導体に 共有結合させ得る。 タンパク質との直接反応に適した多数の活性化された形態のPEGが記載されて きた。タンパク質アミノ基との反応に有用なPEG試薬には、カルボン酸又はカー ボネート誘導体の活性エステル、特に、脱離基がN-ヒドコキシスクシンイミド、 p−ニトロフェノール、イミダゾール、又は1-ヒドロキシ-2-ニトロベンゼン-4- スルホネートであるものが含まれる。マレイミド又はハロアセチル基を含有する PEG誘導体が、タンパク質の遊離スルフヒドリル基の修飾に有用な試薬である。 同様に、アミノヒドラジン又はヒドラジド基を含有するPEG試薬は、タンパク質 中の炭水化物基の過ヨウ素酸酸化によって生成されるアルデヒドとの反応に有用 である。 滴定のような周知の手法により、及び各患者で観察された該物質の薬物動態特 性を考慮に入れることによって、当業者は、適切な用量計画を決定することがで きる。例えば、グッドマン＆ギルマン（Goodman and Gilman）の治療の薬理学的 基礎（The Pharmacological Basis of Therapeutics）、第８版、A.G.ギルマン （Gilman）ら編集（Pergamon、New York)の「臨床薬物動態学（Clinical Pharma cokinetics）」第１章（20〜32頁）、ベネットら（Benet et al.,）を参照され たい。 本発明は、発作疾患を治療し得る、又は発作後の症状を改善し得る物質及び薬 学的に許容される担体を具備する薬学的組成物を提供する。該担体には、希釈剤 、エアロゾル、局所担体、水性溶液、非水性溶液、又は固体担体が含まれ得るが 、これらに限定されない。 本発明は、以下に示す実験の詳細の部において説明される。これらの部は、本 発明の理解を助けるためのものであって、いかなる意味においても、その後の請 求の範囲に記載されている発明を限定することを意図したものではなく、また限 定するように解釈してはならない。実験の詳細 略号 ：EC、内皮細胞；ＰＭＮ、多形核白血球；WP、ヴァイベルーバラーデ体；vW F、フォンビルブラント因子；EGTA、エチレングリコールビス（アミノエチルエ ーテル）テトラ酢酸；HBSS、ハンクスの均衡塩溶液；CS、冠状洞；IL、インター ロイキン；PAF、血小板活性化因子；ＩＣＡＭ−１、細胞内接着分子-1；HUVEC、 ヒト臍静脈EC；LR、乳酸化リンゲル溶液；ＭＣＡＯ、中大脳動脈閉塞；rt-PA、 組換え組織プラスミノーゲン活性化因子；ＨＯ−Ｉ又はHOI又はHO I、ヘムオキ シゲナーゼＩ；ＩＣＨ、大脳内出血；OD、光学密度；ＭＣＡ、中大脳動脈；rt-P A、組換え組織型（tissue type）プラスミノーゲン活性化因子；TIA、一過性虚 血発作；ＴＴＣ、トリフェニルデトラゾリウムクロライド。例１：中大脳動脈閉塞後のホモ接合ヌルＩＣＡＭ−１マウス大脳における大脳の 保護 ：発作の発病における好中球接着の役割 多形核白血球（ＰＭＮ）が、発作後の有害な神経性後遺症及び死亡率に寄与し ているがどうかを調べるため、及び発作の発病における白血球接着分子細胞間接 着 分子-1（ＩＣＡＭ−１）の潜在的役割を研究するために、45分間中大脳動脈(Ｍ ＣＡ)を管内閉塞した後に22時間の再潅流を行うことからなる一過性局所的大脳 虚血のマウスモデルを用いた。虚血後の大脳組織内の¹¹¹InラベルされたＰＭＮ の堆積によってモニターしたＰＭＮの蓄積は、反対側（梗塞なし）半球に比べて 、同側（梗塞あり）半球では2.5倍増加した（p<0.01）。手術の前に好中球を免 疫除去したマウスでは、連続大脳切片のトリフェニルテトラゾリウムクロライド 染色に基づいて、梗塞容積が3.0倍減少している（p<0.001）ことが実証され、同 側の皮質大脳血流量（レーザードップラーによって測定）が改善され、対照に比 べて神経の欠損が減少していた。45分の虚血後に22時間の再潅流を行った野生型 マウスでは、ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡが同側半球で増加しており、免疫組織化学で は大脳毛細血管内皮上に限局してＩＣＡＭ−１発現が増加していた。野生型の対 照（ＩＣＡＭ−１+/+）と比較して、ホモ接合型ヌルＩＣＡＭ−１マウス（ＩＣ ＡＭ-/-）での発作におけるＩＣＡＭ−１発現の役割を調査した。ＩＣＡＭ−１- /-マウスは、ＩＣＡＭ−１+/+対照に比べて、3.7倍の梗塞容積の減少（p<0.005 ）、35％の生存率の増加（p<0.05）、及び神経欠損の減少を示した。ICAM-/-マ ウスでは、ＩＣＡＭ−１+/+対照と比較して、梗塞が生じた半球への大脳血流量 が3.1倍高く（p<0.01）、虚血後の大脳再流停止の発生におけるＩＣＡＭ−１の 重要な役割を示唆している。ＰＭＮ除去マウス及びＩＣＡＭ−１欠損マウスは、 相対的に大脳虚血−再潅流傷害に対して抵抗性であるので、これらの研究は、発 作発症の病態生理におけるＩＣＡＭ−１を介したＰＭＮ接着の重要な役割を示唆 している。序論 ： 好中球（ＰＭＮ）は、組織虚血後の炎症の最初期段階に中心的に関わっており 、スカベンジャー機能を開始し、その後該機能はマクロファージによって包摂さ れる。しかし、とりわけ、活性化されたＰＭＮが血管及び実質細胞要素(parench ymal cellular element)への損傷が増強され得る虚血後の組織^1-7においては、 好中球の流入には負の側面がある。実験的な証拠は、低酸素／虚血内皮細胞が炎 症強化性サイトカインIL-1⁸及び強力な好中球走化性誘起作用物質及び活性化因 子であるIL-8⁹を合成するため、虚血後のＰＭＮの招集を確立する上での内皮細 胞の中 心的な役割を示している。虚血後の血管環境中に存在する活性化された内皮への ＰＭＮの強固な付着は細胞表面へのＰ−セレクチンの転移¹⁰並びに血小板活性化 因子及びＩＣＡＭ−１¹¹の産生の増加によって促進される。 これらの各好中球招集機序をブロックする戦略は、様々な虚血及び再潅流傷害 モデルでは保護的に作用するが、大脳虚血／再潅流傷害におけるそれらの有効性 には、議論の余地が残されている。他の組織同様、脳でも虚血性エピソードの後 に、初期のＰＭＮ流入が起こるというかなりの証拠が存在する^12-17。免疫組織 化学的研究は、虚血後の大脳血管系で、ＰＭＮ接着分子であるＰ−セレクチン及 び分子間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現が増大することを記載している^{12 ,18-20} 。脳内での接着分子発現の発症における関連性には、議論の余地があるが 、ヒトの発作におけるモノクローナル抗ＩＣＡＭ−１抗本の試験からのデータは 、未だ得られていない。動物モデルでは、実験的発作の治療における抗接着分子 を用いた戦略の有効性に関して矛盾する実験データが存在する^21-23。虚血後大 脳傷害の発病にＩＣＡＭ−１が参与しているかどうかを決定するために、ここで 報告する実験は、単一の、主要なＰＭＮ接着メディエーター(ＩＣＡＭ−１)の役 割を決定できるように、局所的大脳虚血及び再潅流のマウスモデルで行った。こ れらの研究は、局所的大脳虚血のエピソードの後に、ＩＣＡＭ−１の発現及び好 中球の流入が増大することを示している。さらに、これらの研究は、好中球欠損 マウス及びトランスジェニックＩＣＡＭ−１ヌルマウスが共に、相対的に虚血及 び再潅流後の大脳梗塞に対して耐性を有することを示しており、発作の病態生理 におけるＩＣＡＭ−１の有害な役割に対する強力な証拠を与えている。物質と方法 マウス ： 以前報告したように²⁴、J1 ES細胞中での遺伝子ターゲッティング、 生殖細胞系（germline）伝達を得るためのC57BL/6胚盤胞への注入、及びホモ接 合ヌルＩＣＡＭ−１マウスを得るための戻し交雑によって作成したトランスジェ ニックＩＣＡＭ−１欠損マウスを用いて実験を行った。全ての実験は、C57BL/6 マウスと５世代戻し交雑したから得られたＩＣＡＭ−１-/-マウス又は野生型（ ＩＣＡＭ−１+/+）いとこマウスを用いて行った。動物は、実験の時点で、７〜 ９週齢、25〜36gで あった。ある種の実験では、C57BL/6マウスの好中球除去は、３日間毎日腹腔内 投与（0.3mLの1:12溶液）として、赤血球にプレ吸着させたポリクローナル抗マ ウス好中球抗体²⁵（Accurate Scientific,Westbury NY）の投与によって達成し た。これらのマウスでの実験は、ライト−ギムザ染色した末梢血液塗抹標本によ って顆粒球減少を確認してから４日後に行った。一活性中大脳動脈閉塞²⁶ :0.3mLのケタミン(10mg/cc)及びキシラジン(0.5mg/cc) を腹腔内投与して、マウスを麻酔した。動物は、直腸温度制御された手術面(Yel low Springs Instrumetns,Inc.,Yellow Springs,OH)上に仰向けの状態にした。 動物の体芯温度は、手術中及び手術後90分間、36〜38℃に維持した。中大脳動脈 閉塞は以下のように行った。右頚動脈鞘が露出されるように、手術用拡大鏡（16 〜25×ズーム、Zeiss,Thornwood,NY）正中肩部を切開した。総頚動脈の鞘を除去 し、4-0の絹糸で単離し、後頭動脈及び翼口蓋動脈をそれぞれ単離して、分割し た。内頚動脈の遠位の対照（control）を得て、舌動脈と上顎動脈への分岐点の 直ぐ近位で、外頚動脈を焼灼して分割した。一過性動脈閉塞は、外頚断端を経て 、中大脳動脈の起始部まで、13mmの熱で平坦化した5-0ナイロン縫合糸を前進さ せろことによって達成した。閉塞縫合糸を配置した後、動脈除去による出血を防 ぐために外頚動脈断端を焼灼し、動脈流を再開させた。全てのケースで、頚閉塞 の期間は２分未満であった。45分後に、再潅流するために閉塞用縫合糸を除去し た。これらの操作は、以前詳細に記載した²⁶。大脳皮質血流量の測定 ： 大脳血流量の脳横断（transcranial）測定は、以前記載したように²⁷、頭蓋冠 の上に存在する皮膚の反射（reflection）後に、レーザードップラー流量測定（ Perimecl,Inc.,Piscataway,NJ）を用いて行った（脳横断式読み取りは、パイロ ット研究での頭蓋切除術後に行ったものと常に同じように行った）。0.7mmのま っすぐなレーザードップラープローブ(モデル#PF303、Perlmed、Piscataway、NJ )及び以前公表した目印(ブレグマから2mm後ろ、正中の各サイドから6mm)を用い て、麻酔直後、中大脳動脈閉塞後、再潅流直後、及び24時間後（安楽死の直前） に相対大脳血流量の測定を行った。データは、非虚血半球と比較した虚血半球の ドップラーシグナル強度の比として表されている。該方法は、グラム組 織当たりの大脳血流量を定量するものではないが、正確に定義された解剖学的目 印でのレーザードップラー流量測定の使用は、ある時間にわたって連続的に、同 一の動物の大脳血流量を比較する手段として役立つ。手術操作／管内中大脳動脈 閉塞及び再潅流は、管内の閉塞用縫合糸を置いた直後に、相対大脳血流量が50％ 以上減少するのが観察され、閉塞用縫合糸を除去した直後に、ベースライン閉塞 に比べて流量に33％以上の増加が観察されれば、技術的に十分であると考えた。 これらの方法は、以前の研究で用いられている²⁶。 ¹¹¹In ラベルされたマウス好中球の調製及び投与 ： NaClで1:1に野生型マウスがら得たクエン酸処理した血液を希釈した後、フィ コール−ハイパーク（Pharmacia,Piscataway,NJ）上での勾配超遠心を行った。 残った赤血球細胞を低張溶血させた後（20秒蒸留水に暴露した後、1.8％NaClで 再構成した）、好中球をＰＢＳに懸濁した。37℃で15分間、100μCiの¹¹¹インジ ウムオキシン（oxine）（Amersham Mediphysics,Port Washimgton,NY）とともに 5〜7.5×10⁶好中球をＰＢＳ中に懸濁した。ＰＢＳで洗浄した後、好中球を静か に沈降せしめ（450g）、1.0×10⁶細胞／mLの最終濃度になるようにＰＢＳ中に再 懸濁した。手術直前に、100μＬの放射線ラベルされたＰＭＮと生理的食塩水を 全容量0.3mL（約3×10⁶cpm）になるように混合し、陰茎静脈に注射して投与した 。人道的に安楽死させた後、記載されているように脳を得て、cpm／グラム各半 球として好中球の蓄積を定量した。神経学的検査 中大脳動脈閉塞及び再潅流から24時間後、麻酔前に、４段階のランク付け²⁶を 用いて、マウスの神経欠損を調べた。動物が正常な自発的運動を示したら、スコ ア(1)を与え；上から見たときに（すなわち、反対側の方向）、動物が右（時計 回りの円）を向くことが顕著であれば、スコア(2)を与え；動物が体軸を中心と して回転することが観察されれば(尾から見たときに時計回り)、スコア(3)を与 え；動物がかがみ込み、有害な刺激に対して応答しないならば、スコア(4)を与 えた。このスコアシステムは、以前マウスで記載され²⁶、ラットで用いられた同 様のスコアシステム^28,29に基づいており、発作が起きた動物の反対測への運動 に基づくものである；大脳梗塞後、反対側サイドが「弱く」なるので、動物は、 弱くなっ たサイドの方に向かう傾向がある。ラット²⁸及びマウス²⁶での以前の研究は、動 物が応答できなくなるほど梗塞が大きくなる時点まで、大脳の梗塞が大きくなる と、反対側への運動の程度も大きくなることを実証している。梗塞容積の算出 ： 神経学的検査の後、0.3mLのケタミン(10mg/mL)及びキシラジン(0.5mg/mL)をマ ウスに与え、最後の大脳血流量の測定を行った。麻酔下での断頭により、人道的 に安楽死させ、脳を取り出して、1mm切片用のマウス脳マトリックス（Activatio nal Systems Inc.,Warren,MI）中に置いた。0.9％ＰＢＳ中の2％2,3,5トリフェ ニル,2H-テトラゾリウムクコライド（ＴＴＣ、Sigma Chemical Co.,St.Louis,M O）に切片を浸し、37℃で30分間インキュベートして、10％のホルマリン中に置 いた^26,30-32。梗塞した脳は、生きた組織とは逆に、未染色組織の領域として可 視化され、煉瓦色に染まる。梗塞容積は、連続切片を面積計にかけて算出し、同 側半球中の梗塞のパーセントとして表した。RNA 抽出及びノーザンブロット分析 局所虚血及び再潅流から24時間後、脳を得て、同側半球（梗塞）と反対側半球 （梗塞なし）に分割した。ＩＣＡＭ−１の転写物を検出するために、RNA単離キ ット（Stratagene,La Jolla,CA）を用いて、各半球から全RNAを抽出した。サイ ズ分画のために、2.2Mホルムアルデヒドを含有する1.4％のアガロースゲルに、 同量のRNA（20μｇ/レーン）をかけた後、毛管圧力により、10×SSC緩衝液を用 いて、ナイロン（Nytran）膜に一晩転写した。ランダムプライマーラベリング（ Prime-A-Gene kit,Promega）により、³²P-α-dCTPを用いてマウスＩＣＡＭ−１c DNAプローブ³³（1.90kb、ATCC、Rockville、MD）をラベルし、42℃でブロットに ハイブリダイズした後、1×SSC/0.05％SDSで３回洗浄した。-70℃で７日間、光 スクリーンに露光させたX-Omat ARフィルムでブロットを展開した。等しい量のR NAローディングを確かめるために、βアクチンプローブ（ATCC）を用いた。免疫組織化学 ： 中大脳動脈閉塞から表記の時間後に、脳を取り出して、10％ホルマリン中で固 定し、パラフィンの上に載せ、免疫組織化学のために切片を作成した。ラット抗 マウスＩＣＡＭ−１抗体（1:50希釈、Genzyme、Cambridge ＭＡ）で切片を染色 し、FastRed（TR/ナフトールAS-MX、Sigma Chemical Co.,St.Louis MO）で検出 される一次抗体結合の部位を可視化した。データ分析 ： 独立した変数のためのスチューデントのｔ検定を用いて、大脳血流量、梗塞容 積、及び神経後の症状スコアを比較した。注入されたカウント又は分配容量の変 動を調整するために、¹¹¹インジウム−好中球の蓄積は、ペアを成すデータとし て評価した［反対側半球（梗塞なし）と同側半球（梗塞あり）とを比較する］。 χ二乗検定を用いた偶発性分析を用いて、群間の生存率の相違をテストした。値 は、平均±SEMとして表されており、p<0.05を統計的に有意と考えた。結果 ：発作における好中球蓄積 ：以前の病理学的研究は、大脳梗塞後の好中球蓄積を示 してきた^15-17,34-36。局所大脳虚血及び再潅流のマウスモデルで好中球が蓄積 するかどうかを決定するために、虚血が起こる前に、野生型マウスに与えた¹¹¹I nラベルした好中球の堆積を測定することによって、一過性(45分）虚血及び再潅 流(22時間)後の好中球の蓄積を定量した。これらの実験は、反対側（梗塞なし） 半球(n=7、p<0.01；図１）と比較して、同側（梗塞あり）では、有意に高い好中 球の蓄積（2.5倍の増加）が示された。ミエロペルオキシダーゼアッセイによっ て、好中球の流入をモニターしたときにも、同様の結果が得られたが、本アッセ イでは低レベルの活性が記録された（データは示していない）。発作後の症状に対する好中球除去の影響 ： 発作後の症状の指標に対する好中球流入の影響を決定するために、手術の３日 前からマウスの好中球を免疫除去した。４日目に手術を行うと、末梢血の塗抹標 本に、ほぼ完全な顆粒球減少が見られた。好中球減少マウス（n=18）に、45分の 大脳虚血及び22時間の再潅流を施し、発作後の症状の指標を測定した。好中球減 少動物では、野生型対照に比べて、梗塞容積が３倍小さかった（11.1±1.6％ｖ ｓ33.1±6.4％、p<0.001；図2A）。好中球減少マウスの梗塞容積の減少は、神経 欠損スコアの減少（図2B）、再潅流後の大脳皮質血流の増加（図2C）、一晩 死亡率の減少傾向（好中球減少マウスでは22％の死亡率vs対照では50％の死亡率 、図2D）と一致していた。マウスの発作におけるＩＣＡＭ−１発現： マウスモデルでの大脳虚血／再潅流の影響を確立するために、野生型マウスの 大脳虚血及び再潅流後に、ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡレベルを定量した。同側（梗塞 あり）大脳半球では、同じ動物の反対側（梗塞なし）から得たＲＮＡに比べて、 ノーザンブロット分折によってＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの増加が示された（図３） 。該マウスモデルでのＩＣＡＭ−１抗原の発現を評価するために、野生型マウス に、45分の虚血に続いて23時間の再潅流を施し、免疫組織化学によって大脳毛細 血管系を調べた。梗塞に対して反対側の大脳毛細血管系ではＩＣＡＭ−１抗原の 発現が検出されなかったが（図4A）、同側サイドでは顕著に増加し、大脳内皮細 胞が顕著にＩＣＡＭ−１染色されていた（図４Ｂ）。発作におけるＩＣＡＭ−１の役割 ：発作におけるＩＣＡＭ−１の役割を探索する ために、局所大脳虚血及び再潅流のマウスモデルにおいて、ホモ接合ＩＣＡＭ− １欠損²⁴のトランスジェニックマウスを調べた。大脳血管の解剖学的構造には変 化があるために、マウスでは、実験的な発作に対する感受性に差異がもたらされ ると報告されている³⁷。ホモ接合ヌル（ＩＣＡＭ−１-/-）とＩＣＡＭ−１+/+マ ウスで、ウィリス輪のインディアインク染色を行った。これらの実験（図５）は 、大脳循環系の血管パターンに、大きな解剖学的差異が存在しないことを実証し た。局所大脳虚血及び再潅流後の好中球流入におけるＩＣＡＭ−１の役割を決定 するために、¹¹¹Inラベルした好中球を注入したホモ接合ヌルＩＣＡＭ−１マウ ス(ＩＣＡＭ−１-/-)マウス(n=14)及び野生型対照（n=7）で、好中球の蓄積を測 定した。ＩＣＡＭ−１+/+の対照に比べて（1.70＝0.26vs.2.9±0.52、ｐ<0.05） 、ＩＣＡＭ−１-/-マウスでは、相対好中球蓄積（同側cpm／反対側cpm）が減少 していた。 次に、ＩＣＡＭ−１の発現が、発作後の後の症状に病態生理的な役割を有して いるかどうかを調べるために、実験を行った。ＩＣＡＭ−１-/-マウス（n=13） は、梗塞容積（p<0.01）の3.7倍減少に基づき、ＩＣＡＭ−１+l+対照に比べて、 局所大脳虚血及び再潅流の影響から有意に保護されていた（図６及び7A）。この 梗塞容積の減少は、神経欠損の減少（図7B）及び再潅流後の大脳皮質血流量の増 加を伴っていた （図7C）。これらの結果から、ＩＣＡＭ−１+/+の対照に比べて、ＩＣＡＭ−１- /-のマウスで、死亡率が有意に減少していても（15％vs.50％、ｐ<0.05，図7D） 驚くべきことではなかった。考察 ： ヒトにおける疫学的な証拠は、好中球が、発作の開始³⁸並びに大脳組織の傷害 及び臨床的後の症状の不良³⁹の両者に寄与し、虚血後の低再潅流、神経の機能不 全、及び傷跡の形成^40-44における好中球の潜在的な役割を示唆している。好中 球が発作後の組織損傷を悪化させ得ることを示唆する実験データは相当存在する が^13,45-48、好中球の蓄積をブロックする因子と発作後の症状の指標との間に関 連性を見出し得ないために、幾つかの実験データは議論を巻き起こしてきた。ラ ットの発作モデルでは、発作前に抗体を介して好中球を除去すると、脳の水分含 量及び梗塞サイズを有意に減少した³⁰。しかし、アレチネズミのモデルでのシク ロホスファミドによる白血球減少症⁴⁹又は抗好中球抗体のイヌへの投与⁵⁰は、大 脳虚血の全体的モテルにおいて有益な効果を示さなかった。好中球−内皮の相互 作用の妨害をターゲットとした実験的治療も種々の結果をもたらしてきた。一過 性局所大脳虚血のネコのモデルでは、CD18に対する抗体を用いた治療（ＩＣＡＭ −１に結合する⁵¹β２インテグリンの共通サブユニット）は、大脳血流量の復活 、誘発電位、又は梗塞容積を変化させなかった²³。しかしながら、別の実験は、 霊長類での一過性局所虚血後の毛細血管の開通性が、CD18に対する抗体によって 改善される ことを見出している¹⁴。同様のラットモデルでは、抗CD11b/CD18抗 体は、好中球蓄積及び虚血関連神経障害⁵²を共に減少させることも示されている 。 ここで報告した実験は、マウスの局所大脳虚血及び再潅流モデルでは、虚血後 の大脳組織に好中球が蓄積することを示しており、虚血後の初期に、低大脳血流 量の領域中で、同様に顆粒球が増加したことを示す他のモデル^15,16,36.45を支 持する知見である。マウスでは、虚血後の期間中に好中球が蓄積するのみならず 、それらの存在は、発作後の症状の指標を悪化させる。虚血の前に、動物の好中 球を減少させると、大脳の梗塞が小さくなり、虚血が起こった後の大脳の潅流が 改善された。これらのデータは、好中球の免疫除去は、梗塞容積の減少と血流の 改善 とをもたらす³⁵という血栓塞栓性発作のウサギモデルで報告されたものと酷似し ている。好中球は、マウスの虚血後大脳傷害に寄与しているので、ＩＣＡＭ−１ 欠損変異マウス²⁴を用いて、発作の病態生理におけるＩＣＡＭ−１の役割を明ら かにするための戦略を逐行した。実験は、ホモ接合ヌルＩＣＡＭ−１マウスが、 大脳虚血及び再潅流の有害な効果に対して、相対的に耐性を有することを示して いる。 発作時の組織傷害の発症における好中球及びＩＣＡＭ−１両者の役割を実証す るために、ここで報告した研究は、発作後の症状を評価するための数個の方法を 用いた。大脳梗塞容積の定量を行うために、多くの研究者がＴＴＣ染色を用いて きたが^{26,30・32,37,53}、特に虚血現象直後に評価するときには、この方法の正確 さには、若干の議論が存在した。ＴＴＣ方では、2,3,5-トリフェニル、2H-テト ラゾリウムクロライド(ＴＴＣ)は、ミトコンドリアのクリステ上にそのままの状 態で存在している酸化酵素と反応し、それによって色を帯びたホルマザン⁵⁴に還 元される。ＴＴＣ染色は、２時間の虚血が経過するまでは信頼性がなく；36時間 を超えると、梗塞した組織に浸透した細胞が、ＴＴＣとポジティブに染色し得る ために、これ以前の染色でみられる梗塞した組織と梗塞していない組織との明瞭 な境界が不明瞭になる³¹。ＴＴＣ染色によって描出される梗塞のサイズは、ヘマ トキシリン及びエオシン染色によって描出される梗塞サイズと良好に相関するが^30,32 、直接的な形態的測定は、特に虚血が生じた後の最初の３日間には、大脳 の浮腫のために、梗塞容積を過大評価する傾向にある³²。これらの限界はあると しても、ここで報告した研究は、神経欠損スコア、冒された領域に対する相対大 脳血流量を含む発作後の症状における好中球及びＩＣＡＭ−１の役割を明らかに するために、さらに３つの方法を取り入れる。ＴＴＣ染色の精度には依存しない 追加したこれらの測定は、発作時の好中球とＩＣＡＭ−１の発病における役割の 同定に強く貢献している。 虚血後の組織への好中球の招集に対する機構の基礎を探索する科学的な研究が 近年多数なされている。内皮細胞は、好中球輸送の主要な制御因子であり、好中 球の化学走化性誘起作用、接着、及び血管系からの移動過程を制御しているよう である⁵⁵。 組織虚血の範例として低酸素環境に接触させると、内皮細胞は、好中球に強力 な化学走化性誘起作用を示して好中球を活性化する因子であるインターロイキン -8(IL-8)⁹を合成するので、これをブロックすれば、虚血及び再潅流の肺モデル⁶ で有益であると思われる。さらに、低酸素状態の内皮細胞は、炎症を引き起こす サイトカインであるインターロイキン-1を合成し⁸、自己分泌形式で、インター ロイキン-1が、好中球接着分子であるＥ-セレクチン及びＩＣＡＭ−１の内皮で の発現をアップレギュレートし得る^8,9,56。虚血後の脳では、ヴァイベル−パラ ーデ体の膜内に予め形成されていた貯蔵プールからＰ−セレクチンを放出すると いうような他の好中球接着機序が活性化されているかもしれない¹⁰。霊長類のモ デルでは、Ｐ−セレクチンの発現は、局所中大脳動脈虚血及び再潅流後に、迅速 且つ一貫して増大した¹⁸。Ｐ−セレクチン依存性の好中球招集は、心臓虚血及び 再潅流後では有害らしいが⁵⁷、発作状況における、その病態生理学的な関連性は 未だ決定されていない。低酸素状態は、脊髄の虚血再潅流モデルにおいて、生物 活性脂質である血小板活性化因子(PAF)¹¹のde novo合成を引き起こすが、CD11/C D18に対する抗体と同時に与えても、PAFの拮抗により有益性は何ら増大しない⁴⁸ 。 発作の病態生理におけるＩＣＡＭ−１の役割を理解することは、幾つかの理由 で、ヒトにとっても大きな関係があるであろう。脳血管ＩＣＡＭ−１発現の増加 は、４時間の虚血及び再潅流によって、霊長類、特にレンズ核線条体毛細血管系 において実証された¹⁸。ヒトの発作後の後の症状を改善し得ることを示唆してい る。最近のヒトでの大脳梗塞の剖検研究も、ＩＣＡＭ−１発現の増加を実証した²⁰ 。光化学にって誘導されたラット大脳虚血モデル¹⁹と中大脳動脈閉塞モデル12 の両者で、24時間以内に、ラットも大脳血管ＩＣＡＭ−１を発現するので、これ らのデータは、大脳虚血後の増加したＩＣＡＭ−１発現の病態生理学的な重要性 を明らかにする上でのトランスジェニックＩＣＡＭ−１欠損マウスの潜在的な有 用性を示唆している。 特に、これらのモデルにおけるＩＣＡＭ−１発現の時間枠（4〜24時間まで増 加）は、治療的介入（intervention）のための実際的な臨床の窓になるので、Ｉ ＣＡＭ−１を介した好中球−内皮相互作用は、ヒト発作後の症状を改善するため の将来の薬理学的戦略におけるターゲットとなるかもしれないということを示唆 している。 好中球減少動物は、対照と比較して、局所的大脳血流量が増加することが示さ れたが、ＩＣＡＭ−１欠損マウスは、好中球減少動物と比べて、24時間の時点で さらに高い同側大脳血流量を有する傾向があった。該観察は、一時的血管閉塞の 解除 後でさえも障害前のレベルに戻り得ないという再流停止に関与しているかもしれ ない。全本的脳虚血のモデルでは、循環系中の白血球計測数が85％減少しても再 流停止の発生又は重篤さが減らなかったが⁴⁹、きわめて多くの従来の研究が、該 プロセスにおいて毛細血管床に好中球の栓が生じることを示唆している⁵⁸。該デ ータは、（ＩＣＡＭ−１を含むけれども）非好中球依存性の機序が大脳血管の虚 血後再流停止に寄与しているかもしれないということを示唆する。マクロファー ジ及びリンパ球は、共にLFA-1(内皮細胞ＩＣＡＭ−１との接着的相互作用を仲介 する⁵¹)を発現するので、ＩＣＡＭ−１欠損マウスではこれらの単核細胞の招集 が減少している可能性があり、この可能性は、現在さらなる調査の対象となって いる。該仮定は、大脳梗塞後1〜3日までに、マクロファージとリンパ球の蓄積を 実証する複数の病理学的観察によって支持される^{12,17,19,34,59}。 総合すると、該研究は、局所大脳虚血及び再潅流のマウスモデルでは、梗塞し た半球中に好中球が蓄積すること、及び好中球が減少した動物は大脳が保護され ることを示している。大脳内皮細胞上へのＩＣＡＭ−１発現の増加は、このよう な好中球の招集を誘導する重要な機構であると思われ、ＩＣＡＭ−１を発現でき ないマウスでは、虚血後の血流が改善され、梗塞容積が減少し、死亡率も減少す ることを実証している。これらのデータは、好中球−内皮相互作用の妨害をター ゲットとした薬理学的な戦略が、ヒトでの発作後の後の症状を改善し得るかもし れないということを示唆している。参考文献 ： 例２：内皮性細胞ヴァイベル−パラーデ体の低酸素症により惹起されるエキソザ イトーシス：心臓保存後の迅速な好中球招集の機序 低酸素(Ｈ)の期間は、再潅流に伴う血管機能不全を引き起こす重要な現象であ り、内皮細胞(ＥＣｓ)及び好中球(ＰＭＮ)が中心的な役割を果たしている。臓器 保存期間中の低酸素／虚血期間におけるECウァイベル−パラーデ(WP)体のエキソ サイトーシスは、虚血後の組織中への活発なＰＭＮの招集を可能とし、これは酸 化剤が豊富な環境中でさらに増強されるプロセスである。ヒトの臍静脈ECを低酸 素環境（pO₂〜20torr）に曝すと、ECWP体に保存されているフォンビルブラント 因子（vWF）の放出を刺激し、併せてEC表面に存在する、WP由来のＰＭＮ接着分 子であるＰ−セレクチンの発現が増加した。低酸素EC−重層への¹¹¹Inラベルさ れたＰＭＮの結合の（正常酸素の対照と比較した）増加は、Ｐ−セレクチンに対 するブロッキング抗体でブロックされたが、ノンブロッキング対照抗体によって は影響を受けなかった。再酸素化中にもＰ−セレクチン発現及びvWF放出の増加 がみられたが、Ｈのみでも（抗酸化剤の存在下でさえも）WP体エキソサイトーシ スを増加させるのに十分であった。心臓の低温維持（この間に心臓の血管系内の pO2は、同じように低レベルに減少する）に対するこれらの観察の関連性を決定 するために、げっ歯類（ラット及びマウス）の心臓保存／臓器移植モデルで実験 を行った。レシピエントのＰＭＮの免疫除去、すなわち移植前のブロッキング抗 Ｐ−セレクチン抗体の投与は、対照レシピエント中に移植した同様に保存されて いた心臓に比べて、移植片の好中球の浸潤を減少させ、移植片の生存を改善した 。ドナー血管系上への内皮Ｐ−セレクチン発現の重要な役割を確立するために、 保存／移植前に血液／血小板を潅流除去したホモ接合Ｐ−セレクチン欠損ドナー 及び野生型対照ドナーの心臓を用いて、マウスの心臓移植を行った。野生型レシ ピエント中に移植されたＰ−セレクチンヌルの心臓は、野生型レシピエント中に 移植された野生型心臓に比べて、移植の好中球浸潤が顕著に（13倍）減少し、移 植片の生存が増加していた。ヒトの心臓保存中に、冠状内皮細胞ヴァイベル−パ ラーデ体のエキソサイトーシスが起こっているか否かを決定するために、切開心 臓手術中の32人の患者で、冠状洞中へのvWFの放出を測定した。虚血期間の開始 時及び終了時に得られた冠状洞のサンプルは、主として高分子量の多量体からな る（免疫電気泳動による）冠状洞vWF抗原（ELISAによる）の増加を示した。これ らのデータは、再潅流の間に血管系がＰＭＮを急速に招集する引き金となるECヴ ァイベル−パラーデ体のエキソサイトーシスが、心臓の低温維持中に起こること を示唆している。序論 内皮細胞(EC)は、エンドセリン発現の増加(2)から塩基性繊維芽細胞増殖因子( 3)にわたる特徴的なレパートリーの応答で低酸素症に適応する（1）。最近の研 究は、低酸素に対するEC応答の特性の多くが、炎症性応答の特性と類似している ことを示した：低酸素は、ECの選択的なIL-1(4)、IL-6(5)、及びIL-8(6)、血小 板活性化因子(PAF)(7,8)、並びにＩＣＡＭ−１(4)の発現をアップレギュレート し、これは虚血部位への好中球の(ＰＭＮ)招集、接着、及び活性化を補給する役 割を果たす。これらの機序は、再潅流傷害の後期を説明するかもしれないが、低 体温保存期間後の再潅流された心筋層にＰＭＮが招集される迅速さは、de novo タンパク質合成を必要としない機序が関与していることを示唆している。この点 、ECは、再潅流環境中で生成された豊富な酸素フリーラジカルに応答して(10-12 )、ヴァイベル−パラーデ体(9)の膜中の細胞膜保存部位から予め形成されたＰ− セレクチンを迅速に放出し得るので、Ｐ−セレクチンは、再潅流させた血管系へ のＰＭＮ接着の最初期相では顕著な役割を果たしているかもしれない。さらに、 最近のデータは、白血球滞留（leukostasls）、肺障害を伴う組織損傷(13)、及 び心臓虚血(14)におけるＰ−セレクチンを介した白血球の停止に対する役割を指 摘している。総合すると、これらの知見によって、低温での心筋保存に伴う低酸 素／虚血期間は、再潅流の前にＰ−セレクチンを特にEC表面に現出せしめること によって、再潅流中における血管系の特異的な応答を誘発し、その後に引き続く 炎症性応答を点火し、増幅する点火剤として働くという仮定が導かれた。 低酸素自体（又は心臓手術中に見られるような心臓の低温維持（ここでは冠状 床内のPO₂は、pO₂<20Torrに減少している））(15)が、WP体のエキソサイトーシ スをもたらすかどうかを確定するための実験をデザインした。さらに、低温保存 期間の延長後に特徴的に起こる心臓移植の失敗におけるＰ−セレクチン依存性の ＰＭＮ接着の役割を決定するための実験を実施した。この結果は、再酸素化が なくても（及び抗酸化剤の存在下でも）、低酸素がEC WP体エキソサイトーシス を引き起こすのに十分であり、生じたＰ−セレクチン発現が、ECのインビトロで のＰＭＮへの結合を引き起こすことを示している。 げっ歯類では、心臓の低温維持後におけるＰ−セレクチン発現の有害な結果は 、好中球の除去、Ｐ−セレクチンのブロック、又はＰ−セレクチンを発現できな い内皮細胞を持った心臓を移植することの何れかによって完全に消失させること ができる。WP体エキソサイトーシスは、心臓の低温維持期間中の切開心臓手術を 行っている患者でも起こるので、これらのデータは、Ｐ−セレクチンのブロック が、ヒトの心臓維持を改善するための薬理学的な介入に対するターゲットとなり 得ることを示唆している。方法 ：内皮細胞の培養及びＨ又はＨ/Ｒへの細胞の暴露 ヒトの臍静脈ECを臍帯から調製し、Thornton(17)によって改変されたJaffe(16 )の方法によって培養して増殖した。実験では、記載のごとく(17)ウシ胎児血清 （15％；Gemini、Calabasas、CA）、ヒト血清（5％；Gemini）、内皮増殖補充物 質（Sigma，St．Louls，MO）、ヘパリン（90μｇ/mL；Sigma）、及び抗生物質を 補充した199培地中で増殖させた融合性（confluent）EC（1〜4継代）を用いた。 ECが融合性を達成したときに、制御された温度(37℃)及び表記の量の酸素、二酸 化炭素(5％)、及び窒素からなる釣合いを有する大気を与える環境チャンバー（C oy Laboratory Products,Ann Arbor,MI）中に該培養を置くことによって実験を 行った。細胞培養実験への該チャンバーの使用は、以前に記載した(15,18)。低 酸素へのECの暴露中（最長16時間）に、培地中の酸素分圧は、14〜18torrでめり 、培地のpHには変化がなかった。二酸化炭素(5％)を含有する37℃の外気中にEC を置くことによって再酸素化を行った。ヴァイベル−パラーデ体エキソサイトーシスの測定 ： 24ウェルのプレート中にECを入れて、ハンクスのバランス塩溶液で３回リンス した後、表記の期間低酸素又は正常酸素に曝した。vWFを測定する実験では、細 胞は、無血清培地中に維持した。他の全てのEC実験は、EC増殖培地で行った。 vWFの測定では、表記の時点で、200μＬの培養上清を除去し、同じ販売者によっ て供給されている精製ヒトvWF抗原を用いて作成した標準曲線により、同じ試料 について二回、ヤギ抗ヒトvWFポリクローナル抗体に基づく市販のELISA（Americ an Diagnostica,Greenwlch,CT）を行った。ECP- セレクチン発現は、マウス抗ヒ トＰ−セレクチンモノクローナル抗体(WAPS 12.2クローン、Endogen、Cambridge 、MA；これは、カルシウム感受性エピトープを認識し、Ｐ−セレクチン依存性好 中球接着をブロックするIgG1である)の特異的結合を測定することによって決定 した。エンジモビーズ（Enzymobeads；BloRad,Hercules,CA）を用いて、ラクト ペルオキシダーゼ法(19)によって、抗体を¹²⁵Iで放射線ラベルし、4℃で保存し 、ラベリングがら１週間以内に使用した。各実験直前に0.1％ウシ血清アルブミ ン（Siguma,St.Louis,MO）を加えた新鮮なM199を添加した96ウェルプレート上の HUVECでバインディングアッセイを行った。37℃の湿気のある環境中に細胞を置 き、表記の期間、正常酸素又はＨに曝した（50μＭプロブコールの存在下又は非 存在下、記載のとおり、Sigma）。1％パラホルムアルデヒドで細胞の一重層を15 分間固定化し¹⁰（Ｈに曝した細胞は、未だ低酸素環境中にある間に固定化した） 、一重層がそのままの状態で保たれているか確認するために視覚的に検査し、0. 5％ウシ血清アルブミンを含有するHBSS(HBSS/A)で二度洗浄した。続いて、200μ ｇ/mLの未標識ブロッキング抗体(WAPS 12.2)又は同じアイソタイプのノンブロッ キング抗-Ｐ−セレクチンIgG(抗-GMP-140、AC1.2クローン、Becton-Dickinson、 San Jose、CA）のうちの何れかの存在下で、¹²⁵I-標識した10⁵cpmの抗-Ｐ−セレ クチン抗体(WAPS12.2)に、一重層を接触させた(20,21)。37℃で１時間結合させ た後、HBSS/Aで一重層を４回洗浄し、PBS中の1％ Triton Ｘ-100(200μＬ/ウェ ル)で、結合した抗体を溶出して、計数した。ある実験では、記載したように、 ４時間の正常酸素又は低酸素期間の開始時に、シクロヘキシミド（10μｇ/mL、S igma）を添加した。シクロヘキシミド処理によるタンパク質合成阻害の程度を決 定するためにデザインした別の実験では、³⁵Ｓ-メチオニン及び³⁵Ｓシステイン （10μｇ/mLのシクロヘキシミドの存在下又は非存在下の何れか）の存在下で、 メチオニン及びシステインを減らした最少必要培地（Gibco、Grand Island、Ｎ Ｙ）とともに、ECをインキュベートした(3)。 ４時間正常酸素に曝した後、トリクロロ酢酸で沈殿し得る物質を採集して、計数 した。ヒトＰＭＮの調製及び結合の測定 ： 簡潔にのべれば、健康なドナーから得られたクエン酸を加えた血液をNaCl(0.9 ％）で1:1に希釈した後、フィコール−ハイパーク（Ficoll-Hypaque；Pharmacia ，Piscataway，NJ）上で勾配超遠心した。残った赤血球を低張で溶解した後（蒸 留水に20秒接触させた後、1.8％NaClで再構成した）、5mg/mLのヒト血清アルブ ミン（HBSS/HSA）を加えたHBSS中にＰＭＮを懸濁した。37℃で15分間、0.2〜0.5 μ Ciの¹¹¹Inオキシン（Amersham Mediphysｉcs，Port Washington，NY）存在下 で、50〜200×10⁶のＰＭＮをHBSS/HSA中に懸濁した。HBSS/HSAで洗浄した後、Ｐ ＭＮを静かに沈降させ(450g)、5.5×10⁶ＰＭＮ/mLの最終濃度になるようにHBSS/ HSA中に再懸濁した。穏やかに攪拌した後、表記の時点で、100μＬの放射線ラベ ルしたＰＭＮ懸濁物を各ウェルに添加し、37℃で30分間インキュベートした後、 HBSS/HSAで４回洗浄した。続いて、一重層を１ＮNaOHで処理して、各ウェルの中 味を取り出して、カウントした。異所性ラット及びマウス心臓移植モデル 心臓移植のオノ−リンゼイ（Ono-Lindsey）異所性同種移植モデル(15,18,22) で、心臓移植を行った。簡潔に述べれば、オスのルイスラット（250〜300グラム 、Harlan Sprague Dawley,Indianapoplis,IN）麻酔し、ヘパリン処理して、低体 温での高カリウム心停止を行った後、ドナーの心臓を素早く採集した。4℃の乳 酸処理したリンゲル（LR）溶液（Baxter、Edison、NJ）を冠状動脈に流すことに よって心臓を保存し、4℃の同じ溶液中に16時間浸した後、ドナーとレシピエン トの大動脈、及びドナー肺動脈／レシピエント下大静脈の吻合を順次行って、性 ／系統をマッチさせたレシピエント中に異所性移植した。移植臓器の生存は、血 流の再確立から正確に10分後の心臓の電気的／機械的活性の存在／非存在によっ て評価し、その後移植臓器を切り出して、以前記載したように、ミエロペルオキ シダーゼ活性によって好中球の浸潤を定量した(15,18)。ある種の実験では、レ シピエントラットの好中球の除去は、移植操作の24時間前にウサギ抗ラット好中 球ポリクローナル抗体（Accurate Scientific,Westbury NY）を単回静脈 内投与することによって(23-25)達成した。これらの動物での好中球の除去を確 認し、残存する好中球を計数することによって定量し、ライト−ギムザ染色した 末梢血の塗抹標本上で同定した。他の実験では、再潅流開始の10分前に、ブロッ キング抗-Ｐ−セレクチンIgG(250μｇ/ラット、Cytel、San Diego、CA)(13,14,2 6)を静脈内投与した。C57BL/6Jを祖先とするホモ接合Ｐ−セレクチンヌル又は野 生型対照オスのマウスを用いて(27)、同様にマウスの心臓移植を行い、採取した 心臓を即座に潅流して、クロスクランプした大動脈根の下に投与した4℃のLR1.0 mLで元の血液を消失せしめた後に、4℃で乳酸処理したリンゲル溶液中に３時間 浸すことからなる低体温維持期間が来る。低温維持されたラット及びヒトの心臓から得た冠状流出液中のvWFの測定 ：ヒト冠状洞サンプル． インフォームドコンセントを得た後、非選別的な32人の 患者群から通常の心臓手術の開始及び終了時に得た冠状洞血液を採取し、同時に ６人の末梢（動脈）血のサンプリングを行った。心臓肺バイパスを施されていろ 患者に一般的に載置されているレトログレード潅流カテーテルから冠状洞サンプ ルを得た。５分間、1500×gで血漿サンプルを遠心して、細胞要素を沈降させ、 血漿を分取し、アッセイの時まで-70℃で凍結させた。vWF及びトロンボモジュリ ン（Asserchron Thrombomodulin，Diagnostica Stago）のELISA(上述のとおり） を行った。vWF 免疫電気泳動 ： アガロースゲル免疫電気泳動を行うことによって、冠状洞血漿サンプル及び内 皮細胞上清中のvWFの多量体組成を測定した。サンプルを1:10、1:20、及び1:30 に希釈し（記載したとおり）、ネイティブサンプルバッファー（Bio-Rad）中に て、37℃で30分間インキュベートした。次に、1.5％のアガロースケル(0.675g低 分子量アガロース、Bio-Rad；0.045g SDS；45mL TriS-Tricine SDS Buffer[Bio- Rad])でサンプル(20μＬ)を電気泳動した。アガロースゲル上に同時に流した分 子量マーカーをマーキングによって可視化して、ゲルを分割し、分子量マーカー の位置をクマシーブルー染色で決定した。ほう酸ナトリウム(0.01M)ゲルの残り 半分を30分間洗浄した後、ニトロセルロース膜に一晩電気泳動転写した。トリス で緩衝化され、0.05％のTween-20を加えた生理的食塩水（ｐＨ7.5） からなる洗浄用緩衝液により、該膜を洗浄した後、カーネーション（Carnation ）のインスタントミルク2.5gを含有する洗浄用緩衝液50mLで１時間ブロックした 。生理食塩水でリンスした後、1g/dLのゼラチン及び1:500に希釈したウサギ抗ヒ トvWF血清（American Bioproducts，Parsippany，NJ）を含有する洗浄用緩衝液 中に該膜を一晩浸した。洗浄用緩衝液で５回洗浄した後、静かに揺らしながら、 1g/dLのゼラチン及び16.6μＬのヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合I gG(Bio-Rad)を含有する洗浄用緩衝液の中に３時間該膜を浸し、60mLのHRP展開液 （HRP展開用粉末（Developer powder）30ｍｇ、Bio-Rad；メタノール10mL；トリ スで緩衝化された生理食塩水50mL；30％の過酸化水素50μＬ（使用直前に添加し た））で展開した。統計 ３以上の条件を比較するために、テューキーの操作を用いてテストしたポスト ホック（post-hoc）比較による分散分析を使用した。移植の生存データは、χ二 乗統計による偶然性分析（contingency analysis）を用いて分析した。連続測定 の１対比較法（心臓手術の開始時及び終了時のヒトCS及び末梢血液サンプル）は 、対になった変数のためのスチューデントのｔ検定を用いて比較した。値は、平 均±SEMとして表されており、ｐ<0.05を統計的に有意と考えた。結果 ：培養したECを低酸素に暴露することにより、vWFの放出及び細胞表面上へのＰ− セレクチンの転移がもたらされる。 以前の研究により、内皮細胞を低酸素にさらすと、細胞内カルシウムの上昇が もたらされることが示された(28)。トロンビン又はヒスタミンに応答したECヴァ イベル−パラーデ体のエキソサイトーシスに伴って細胞質カルシウムが増加する ことに鑑みて(29,30)、ECの低酸素への暴露が該プロセスを開始し得るかどうか について考えた。低酸素環境（pO₂20torr）中に置かれたECは、正常酸素のカウ ンターパートに比べて、培養上清中により多くのvWFを放出した（図8A．、ELISA ；免疫電気泳動によって確認、データは示していない）。１時間の低酸素では、 まずvWFのレベルが増大する傾向が見られたが、４時間の暴露までは、正 常酸素と低酸素の間のvWFレベルの差異は統計的に有意でなくなり、その後12時 間の観察まで徐々に増加していった。４時間の低酸素で見られたvWF放出の増加 が、予め形成されていたvWFの放出によるものだったかどうかを決定するために 、タンパク質合成を阻害する10μｇ/mLシクロヘキシミドの存在下で、同様の実 験を行った。これらの実験は、低酸素期の開始時にシクロヘキシミドを添加する と、低酸素によって誘導されたvWFの放出が12.5％減少することを示し、低酸素 への暴露によって放出されたvWFの大部分が予め形成されていたものであること を示唆する。 これらの実験は全て低酸素環境内で行われたものだが（すなわち、再酸素化が ない）、該Ｈを介したヴァイベル−パラーデ体のエキソサイトーシスが、反応性 酸素中間体の形成には依存していないことをさらに実証するために、Ｈの開始時 に、抗酸化剤プロブコール（50μＭ）ECに添加し、何ら影響がないことが見出さ れた（Ｈの６時間後、vWF4.7±0.31×10^-3Ｕ/mL）。プロブコールの存在は、低 酸素ECの再酸素化後に見られたvWFレベルのさらなる増加を鈍らせた。低酸素に よって誘導されるヴァイベル−パラーデ体のエキソサイトーシスのカルシウム依 存性は、低酸素への暴露を開始する時点でECを無カルシウム培地に置く実験によ って実証された。細胞外カルシウムの不存在によってＨに誘導されたvWFのEC放 出は減弱し、EGTAの添加はさらに強い抑制効果を有した（細胞外カルシウムを減 少させることによりvWFの内皮性放出のベースも減少した）(図8B)。 低酸素がEC細胞膜表面へのＰ−セレクチンの転移も誘導するかどうかを決定す るために、正常酸素又は低酸素のEC−重層への¹²⁵Iラベルされた抗Ｐ−セレクチ ンIgGの特異的結合を調べた。再酸素化期間中の酸素フリーラジカルによって生 じたＰ−セレクチンの発現を除去するために、まだ低酸素環境に置いたまま、パ ラホルムアルデヒドで固定化されたＥＣ−重層上において実験を行った。これら の研究は、正常酸素ECに比べて、低酸素によって¹²⁵I抗Ｐ−セレクチンIgGの結 合が増加することを実証した（図9A）。この結合は、未標識のブロッキング抗Ｐ −４セレクチンIgGによってブロックされたが、同じアイソタイプのノンブロッ キング対照抗Ｐ−セレクチンIgGによってはブロックされなかった。Ｐ−セレク チンの表面への発現は、観察した最も初期の時点（60分のＨ）で見られ、低酸素 への暴露 期間中にわたって（観察の４時間まで）同様のレベルが観察された。最初に分泌 されたvWFの一部は内皮下のマトリックスに強固に結合するので(31)、低酸素に よって生じた内皮性Ｐ−セレクチンの発現は、同じように処理された細胞中のvW Fの放出が統計的に有意に増加する前の時点で検出された可能性がある。 低酸素によって生じＰ−セレクチンの発現にタンパク質合成が必要であるかど うかを決定するために、標準酸素又はＨの開始時にシクロヘキシミドを与え、放 射線ラベルされた抗Ｐ−セレクチンIgGの結合を４時間の時点で決定する別の実 験を行った。該実験によって、85％を超えるタンパク質合成の阻害があっても（ 図9B、インセット）、減少したレベルであるが、まだ低酸素は内皮性Ｐ−セレク チンの発現を増加せしめる（図9B）ことが実証された。低酸素によって生じた細 胞表面Ｐ−セレクチンが、好中球結合に参与しているかもしれないということを 確かめるために、¹¹¹In−オキシンで放射線ラベルされたヒトの好中球を低酸素 状態のECとともにインキュベートした。低酸素一重層への結合の増加が観察され た。抗Ｐ−セレクチンIgGの添加によって、低酸素で誘導された¹¹¹In-ＰＭＮの 結合がブロックされたが、ノンブロッキング抗Ｐ−セレクチンIgGによってはブ ロックされなかった（図9C）。低温／虚血での心筋維持におけるＰ−セレクチン依存性好中球接着の役割 低体温心筋維持（冠状血管系内の維持用溶液のpO₂は20Torr以下に下げられて いる(15)）へのこれらの観察の関連性を確定するために、オスのルイスラットか ら心臓を採取し、方法の部に記載したように低体温維持を施した。心臓虚血後の 好中球を介した損傷は、十分に確立されているので(32-38)、低体温維持期間後 に再潅流を行った正常位のラット心臓移植モデルで、内皮性Ｐ−セレクチン発現 の病態生理学的な潜在的役割を調査した。採取直後に心臓移植を行えば、これら の実験は、優れた移植の生存と皆無に近い好中球の浸潤を示した（図10A、直後 ）。しかし、採取と移植操作の間に低体温維持の期間(16)を介在させて同様の実 験を行うと、移植の失敗率が高く(90％)、白血球の滞留が顕著であることが、組 織学的に確認され、ミエロペルオキシダーゼ活性によって確認された（図10、保 存）。少なくとも部分的には、延長した維持後の移植の失敗に好中球の接着が必 要であることを実証するために、レシピエントラットの好中球を除去した後に移 植を行 った。ウサギ抗ラットＰＭＮポリクローナル抗体(23-25)を用いると、レシピエ ント中の殆ど全ての循環ＰＭＮが除去され（対照及び免疫除去動物について、Ｐ ＭＮカウントがそれぞれ1471±56ｖｓ67±11ＰＭＮ/ｍｍ³、ｐ<0.001）、他の細 胞タイプには殆ど影響がなかった。無好中球再潅流環境を与えるために、好中球 を除去したレシピエントに、16時間維持した心臓を移植すると、移植臓器のミエ ロペルオキシダーゼ活性に顕著な減少があり、移植臓器の生存も増加していた（ 図10A、保存(-)ＰＭＮ）。血流を再開する10分前にブロッキング抗Ｐ−セレクチ ンIgGを正常なレシピエントラットに注入すると、好中球を除去したレシピエン トと同じ規摸で、移植生存率の改善（図10A、α-ＰＳ、ブロッキング）とミエロ ペルオキシダーゼ活性の減少が示された。このようなＰＭＮ浸潤の減少及び移植 生存率の改善は、ドナーの心臓に16時間の低温維持を行ったにもかかわらず観察 された。全く対照的に、ノンブロッキングな対照抗体(AC1.2)の投与は、移植臓 器の白血球滞留又は移植臓器の生存率に何ら有益な効果を与えなかった（図10A 、α-ＰＳ、ノンブロッキング）。 ECとＰＭＮとの相互作用に加えて、血小板もＰ−セレクチン依存性の機序を介 してPMNと相互作用するかもしれないので(39)、長い低温心臓維持後に起こる白 血球滞留と移植の失敗に対する内皮性Ｐ−セレクチンの寄与を単離するための実 験をデザインした。これらの実験のために、Ｐセレクチン含有血小板を有する野 生型レシピエント中に、Ｐ−セレクチンヌル冠状内皮性細胞を移植できるように 、ホモ接合Ｐ−セレクチン欠損マウスから得たドナー心臓の血液を潅流除去し得 る。ラットの手術に対して同様に行ったマウスの異所性心臓移植モデルを用いて 、ホモ接合Ｐ−セレクチンヌルマウス(27)又は野生型対照から得たドナー心臓を 得た全ての心臓は、野生型レシピエントに移植した。これらの実験によって、野 生型から野生型への移植に比べて、Ｐ−セレクチンヌルから野生型への移植にお ける移植臓器の生存率が有意に高いことが実証された（図10B）。前者のグルー プにおけるこのような移植臓器生存率の改善は、移植臓器の白血球滞留の顕著な (13倍)減少を伴っていた（図10C）。これらの心臓は、維持の開始時点で、血液 を潅流除去されているので、これらの研究は、低温での心筋維持後にみられる維 持の不良及び白血球の運動停止における冠状内皮性（血小板由来ではなく)Ｐ− セレクチン の役割を示唆する。ヒトの心臓手術中におけるヴァイベル−パラーデ体のエキソサイトーシス これらの知見のヒトへの関連を確定するために、通常の心臓手術に行われるよ うな低温での心臓維持の間に、冠状ECがヴァイベル−パラーデ体の内容物を放出 することを実証するための一群の実験を次にデザインした。大動脈のクロスクラ ンプ中に起こる心臓虚血の一定期間中に、冠状血管系からのvWF放出の測定を行 った。32人の患者で、動脈クロスクランプの開始時(CS₁)及び終了時(CS₂)(この インターバルが虚血期間に相当する)に冠状臍洞（心臓から排出させる）血液を 採取した。これらの患者（男性23人、女性９人）は、弁性の心疾患（n=11）又は 虚血性心疾患(n=21)の臨床歴を有しており、それぞれ弁の修復／置換又は冠状動 脈のバイパス移植の何れかを行われた。内在性膜タンパク質であるトロンボモジ ュリン捕捉ELISA（Capture ELISA）を行うことによって(40)、CS₁とCS₂サンプル の間にレベルの変化が全くないことが実証され（4.35±1.2ng/mL ｖｓ3.48±0.8 ng/mL、p=ＮＳ）、心臓維持の間に、ECは脱皮せず、細胞膜の完全性が維持され ていることが示唆された。vWFについて行った同様の測定は、心臓保存の間に分 泌されるvWFが一貫して有意に増加することを示した(0.68±0.06Ｕ/mL ｖｓ0.90 ±0.05Ｕ/mL、CS₁ｖｓCS₂、ｐ<0.01)（図11A）。該vWFが血小板由来ではなく、 むしろ冠状内皮由来であると思われ、このため単に心臓肺バイパスの結果ではな いということを実証するために、CS₁とCS₂サンプルから末梢血サンプルを同時に 得て、vWFのレベルが変化していない（0.813±0.52Ｕ/mLｖｓ0.900±0.41Ｕ/mL 、ｐ＝ＮＳ）ことが示され、心臓肺バイパス中の機械的な血小板の擾乱が原因で はないことを示唆した。vWFは、血漿中では、ある範囲の分子量を有する多量体 として存在しているので（（構成的に(constitutively)分泌されていない）刺激 可能なプールからのvWF多量体が最も高分子量である(45)）(41-44)、CSサンプル に免疫電気泳動を行った。これらのゲルは、CS₂サンプル中のvWFが全体的に増加 するのに加えて、高分子量の多量体も増加するようであるということを実証し、 内皮細胞で見出されたように、刺激可能なプールからの放出を示唆している（図 11Ｂ）考察 ： 血管系は、虚血及び再潅流を行った臓器の細胞外環境を維持する上で、きわめ て重要な役割を果たしており、この役割は、主として血管内の管腔に配列してい るECによって統合されている。ECは、著しい表現系の変化によって、ある期間の 酸素の除去に反応し、向血栓性（46）及び向炎症性(1,4,6)になる。低酸素に暴 露されたECは、向炎症性のサイトカインであるIL-1(4)及びIL-8(6)を分泌し、こ れが虚血領域への直接の白血球の輸送の誘導を担っているかもしれない。これら のプロセスは、de novoタンパク質合成を必要とするので、一定期間の低体温維 持後の迅速な現象を説明し得ない。ＩＣＡＭ−１発現の増加、及びE-セレクチン の誘導は、さらに後で、心臓移植における白血球の運動停止に寄与しているかも しれないが、これは、タンパク質合成ががなり遅いと思われる冷却維持の後に観 察された迅速な白血球滞留を説明できない。このため、シクロヘキシミドの前処 理は、ECの低酸素への暴露後に見られた初期(90-120分)のＰＭＮ接着を変化させ ず(7)、低酸素によって生じたＰＭＮ結合の増加にはde novoタンパク質合成が関 与する必要がないことを示唆している。血小板活性化因子(PAF)は低酸素によっ て生じるＰＭＮ接着(7,47)及び活性化(48,49)に参与しているかもしれないが、P AFは貯蔵されておらず、合成されなければならないので、心筋維持の低体温期間 中におけるその重要性は低いかもしれない。このような理由で、ヴァイベル−パ ラーデ体中に存在する細胞膜下の保存部位から迅速に予め形成されていたＰ−セ レクチンをECが発現することが(9,50,51)、低体温維持後の初期のＰＭＮ招集に 対する最も重要な機序であり得る。ヴァイベル−パラーデ体は、冠状毛細血管中 に豊富に見出されるので(52)、心臓の維持においてそれらが非常に重要であるこ とが示唆される。 データは、低酸素状態自体、及び低温維持中のヒトの心臓の両者において、ヴ ァイベル−パラーデエキソサイトーシスが起こることを示している。ヒトの冠状 洞サンプル中で観察されたvWFの内皮性分泌源を正確に同定することは困難であ るが、心肺バイパス後の血小板の研究は、表面のＰ−セレクチン発現又はα−顆 粒分泌(53,54)が増加しないことを実証している(53,54)。このことは、動脈のク ロスクランプ後に観察された冠状洞vWFの増加が、血小板由来ではないことを示 唆している。また、該データは２つの面から、虚血後のvWFの放出が内皮性由 来であることも示唆している；(1)冠状洞のvWFレベルは心筋虚血後に増加するが 、末梢のvWFレベルは不変であり、上昇したvWFが心臓から由来し、心肺バイパス 装置からではないこを示唆する；(2)野生型レシピエントに移植したとき、おそ らく冠状内皮（血小板ではない）のＰ−セレクチンがなくなるように、維持の開 始時点で、トランスジェニックＰ−セレクチンヌルドナーの心臓からドナーの血 液を潅流除去した。これらの実験は、再潅流に伴う好中球の招集に内皮細胞のＰ −セレクチンが重要な寄与を成していることを実証している。 低温での心筋維持後に、Ｐセレクチンが重要であることは驚くべきことではな い；ウサギの耳(26)及びネコの心臓虚血(14)で示されたように、モデル最近の研 究によって、Ｐ−セレクチンが、正常温虚血後の好中球を介した再潅流障害の重 要なメディエーターであることが実証されている。酸化剤は、EC表面に存在する Ｐ−セレクチンの発現を引き起こすので(10)、酸化剤がECに第一の波のＰＭＮを 招集せしめ、再潅流のミクロ環境中で生産された反応性酸素中間体の猛攻によっ てさらにＰＭＮが増幅されるように、低酸素期間の役割だけを評価することが重 要でありる。ある報告が、低酸素状態によって、ＥＣ Ｐ−セレクチン発現が引 き起こしされ得ることを示唆していたが、これらの実験(7)は、実際には、スー パーオキシド(18,55)及び培養したEC(56)への好中球の接着を共に誘導すること が知られている条件である、再酸素化後に行われたものである。対照的に、ここ で記載された実験は、再酸素化の可能性を完全になくすために、完全に低酸素な 環境で行われたものであり、抗酸化剤は、低酸素によって生じるＰ−セレクチン の発現をブロックできなかったことから、本実験で記載した観察は、再酸素化よ りも低酸素低酸素自体を反映していることを示唆している。 さらに、野生型血小板を有するレシピエントに、トランスジェニックＰ−セレ クチンヌルマウスの無血液維持された心臓を移植する戦略を用いて、本実験で実 証した心臓の保護は、内皮性Ｐ−セレクチンの発現が、低温での心臓の維持に有 害たり得ることを示している。ヒトの低温心臓維持の間に、ヴァイベル−パラー デ体のエキソサイトーシスが起こるので、内皮細胞の表面に発現されているＰ− セレクチンの活性をブロックするようにデザインされた治療戦略によって、心臓 の保存が増強され得ることを示唆している。参照文献 例３：手法上および系統関連の変動により、局所的大脳虚血のマウスモデルにお いて有意な症状が現れる 近年トランスジェニックマウスが利用可能になったことより、特定の遺伝子産 物が発作の病態生理学に与える影響を記載した報告の数が増大している。ラット における局所的大脳虚血モデルは、充分記載されているが、中大脳動脈閉塞のマ ウスモデルの記載は乏しく、潜在的な実験変動性の原因は、明らかにされていな い。わずかな技術的改良が、発作のマウスモデルにおいて大きく相違した結果に 至ること、並びに外科的および手法的条件を制御することが、再現性のある生理 学的および解剖学的発作後の症状につながり得ることが仮定された。この仮説を 調べるため、中大脳動脈（ＭＣＡ）の管内閉塞による永久的または一過性の局所 的大脳虚血を許容するマウスモデルを確立した。この研究により、外科的技術の 詳細な説明が提供され、トランスジェニックマウスの生産に一般に使用される系 統間の重要な違いが明らかにされる。系統関連の違いに加えて、梗塞体積、神経 学的症状、および大脳血流は、虚血期間および虚血後の温度、マウスのサイズ、 および血管の管腔をふさぐ縫合糸のサイズにより、重要な影響を受けると思われ る。これらの変動が一定に保たれると、発作後の症状が非常に一定していた。こ れらのデータは、発作における低体温の保護効果を強調し、種々の研究室の間の 技術を標準化してトランスジェニック動物の将来的な研究結果を評価するための 確固たる枠組みを提供する助けとなるはずである。 序論： 近年、遺伝的に変異したマウスが出現したことにより、発作の病態生理学にお いて、単一遺伝子産物の役割を評価するための唯一の機会が得られた。今日まで 、トランスジェニックマウスの大脳虚血の効果に関する報告数は増えているが、 関与するマウスモデルの詳細な説明はなく、また発作後の症状を生じさせ得る潜 在的に重要な手法上の変動に関する詳細な解析もない。マウスモデルの多くの説 明（1,4,8,9,14,17-19,23,24）は、局所的大脳虚血の広く使用されるラットモデ ルの説明に帰する（22,26）。大脳虚血に対するマウスの感受性において、系統 関連の違いに幾らか注意が払われているが（4）、技術的に考察すべきことが、 公 表された研究においてほとんど検討されていない。手術の手法または術後のケア における些細な違いが、発作後の症状における重大な違いに変わることが、試験 的なデータにより実証されたので、現在の研究は、局所的大脳虚血のマウスモデ ルにおいて終始一貫した結果を得るために必要とされる重要な外科的、技術的、 および解剖学的に考慮すべき事柄を体系的に見極めることに着手した。発作が厳 密に制御された方法で引き起こされたとき、単一遺伝子産物の非存在（または過 剰発現）に由来する違いは、容易に認識できるはずである。 本研究は、元来のラットモデルの改良に基づいた局所的大脳梗塞の再現可能な マウスモデルを詳細に描写している（26）。本研究は、マウスの発作モデルの技 術的説明において以前に報告されていない発作後の症状に対して大きな影響を有 する手法上の変動を確認している。これら変動には、縫合糸の長さおよびゲージ 、血管制御の方法、マウスにおける体温制御、およびトランスジェニック動物の 育種において一般に使用される系統間の違いを含む。記載したモデルが、永久的 または一過性の局所的大脳虚血の研究に適しているため、注意深く選択された虚 血回数、梗塞体積および再灌流させた動物における死亡率を、永久的閉塞により 観察されたものに近づけることができる証拠が提出された。発作後の症状におけ る変動性の、潜在的なモデル依存の原因を理解することは、種々の研究室間の異 なる結果を明らかにする助けとなり得る。終始一貫した結果を生む標準化モデル を採用することは、発作の病態生理学の研究においてトランスジェニックマウス を利用するための重要な第一のステップである。 材料および方法： 動物の購入および麻酔：３種類の系統のオスマウス（Ｃ−５７ ＢｌａｃｋＪ ６、ＣＤ−１および１２９Ｊ）を、Jackson研究所（Bar Harbor,ME）から購入し た。動物は、実験時に８〜１０週の年齢で、１８〜３７グラム（示したとおり） の体重であった。マウスは、0.3ｍＬの塩酸ケタミン（１０ｍｇ／ｃｃ）および キシラジン（0.5mg／cc）の腹腔内注射により麻酔をかけた。一過性虚血である 動物に、カテーテルを引き抜く前に、更に0.1ｃｃの投与量を与えた。外科手術 後、その日に、レーザードップラー流量測定および慈悲深い安楽死の直前に、 麻酔を繰り返しかけた。これら手法は、コロンビア大学のInstitional animal C are and Use Committeeにより承認されており、実験動物の慈悲深いケアおよび 利用に関するＡＡＬＡＣガイドラインに従っている。 外科手術のセットアップ： 動物を、温度制御された手術面上のガーゼパッド上に仰向けに置いた（Yellow Springs Instruments，Inc.[YSI]，Yellow Springs，OH）。手術面の温度を制 御して、36−38℃の動物体芯温度を一定に維持するために、直腸温度プローブ（ YSI）を挿入した。露出を容易にするため、右後足および左前足を手術面にテー プで付け、右前足を動物の胸にテープで付け、尾を直腸プローブにテープで付け た（図１２Ａ）。柄と顎との間のゆるんだ皮膚をゆっくり持ち上げ、皮膚の１ｃ ｍ²円を切除することにより、正中頸部切開を行った。この領域の直下にある一 対の正中顎下腺を、左腺をin situで左にして分割した。4.0シルクおよびテープ により台に固定された、小さな直立したSugita動脈瘤クリップ（Mizutto Americ a，Inc.，Baverly，MA）をつかって、右腺を頭蓋骨に引っ込めた。次いで、胸鎖 乳突筋を確認し、4.0シルク結紮糸を腹のまわりに置いた。この結紮糸を下外側 に引き、台にテープで付け、頸動脈鞘を覆う肩甲舌骨筋を露出した。その露出を 図１２Ｂに示す。 手術アプローチ： 頸動脈鞘を一且露出すると、マウスおよび温度制御表面を、手術用拡大鏡（16 −25×ズーム、Zeiss，Thornwood，NY）下に置き、視界を明るくするために同軸 光源を使用した。拡大下で、肩甲舌骨筋をピックアップを用いて注意深く分割し た。総頸動脈（ＣＣＡ）を、（ＣＣＡに対して横に走る）迷走神経に張力をかけ ないように注意して、その鞘から注意深く解放した。一旦解放すると、ＣＣＡを 4.0シルクをつかって単離し、手術台にゆるくテープで付けた。ＣＣＡの近位の 対照（control）が得られると、頸動脈の分枝が見えるように配置した。近位の 外頸動脈から派生し、近位の内頸動脈（ＩＣＡ）を横切って後外側に走り、顎二 腹筋に入る後頭動脈を、その起始部で単離し、Malis双極性ミクロコアギュレー ター（Codman−Schurtleff，Randolph，MA）を用いて分割した。これにより、Ｉ ＣＡが頭蓋ベースに対して茎突舌骨筋の下で後方および頭方向に走るので、ＩＣ Ａの可視化が可能になった。ＩＣＡが頭蓋に入る直前に、ＩＣＡは翼突口蓋の分 枝を派生し、これは外側および頭側に走る。この分枝を同定し、単離し、その起 始部で分割したが、その間、ＣＣＡ−ＩＣＡ軸は一直線である。次いで、4.0シ ルク縫合糸を、遠位の対照（control）のために内頸動脈のまわりに置き、その 末端を手術面にゆるくテープで付けた。 次に、外頸動脈を見えるように配置した。その頭蓋中央コースを骸骨にし、そ の第一分枝、上甲状腺動脈を焼灼し、分割した。骸骨化は、その後、動脈の分枝 が舌動脈および顎動脈へと露出するように、舌骨の隆起により遠位で行われた。 この分枝にごく近位で、外頸動脈を焼灼し、分割した。次いで、動脈壁を傷つけ ないように注意して血流を閉塞するため、近位総動脈、遠位内動脈、頸動脈を取 り囲むシルク縫合糸に、充分な張力をかけた。 序論および閉塞用管内縫合糸のスレッディング（threading）： 頸動脈の閉塞直後、焼灼領域にごく近位の遠位外動脈壁において、動脈切開を 行った。この動脈切開を通じて、（結果の部分で示したような）熱で平坦化した 5.0または6.0ナイロン縫合糸を導入した（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。その縫合糸 が動脈分枝のレベルに前進すると、縫合糸の先端を近位ＩＣＡに向けて、外断端 は、尾方向に徐々に引っ込んだ。閉塞用縫合糸が一旦ＩＣＡに入ると、近位およ び遠位対照（control）の縫合糸上の張力がゆるみ、直接目に見た状態で、頭蓋 ベースの方向に閉塞用縫合糸をゆっくり前進させた（頭蓋ベースのレベルを越え て、閉塞用縫合糸が視界から消える）。中大脳動脈（ＭＣＡ）の起始部を横切っ た閉塞用縫合糸の遠位先端の局在を、選択された縫合糸の長さ（結果の部分で示 したとおり１２ｍｍまたは１３ｍｍ、図１２Ｃに示す）により、レーザードップ ラー流量計（補助的な生理学的手法の部分を参照）により、および大脳血管系の 屠殺後の染色（以下参照）により測定した。閉塞用縫合糸の配置が完了した後、 動脈流が再度確立したとき動脈切開による出血を防ぐために、外頸動脈の断端を 焼灼した。 外科的手法の完了： 示された実験の全てに関して、動脈閉塞の時間は２分以内であった。切開を閉 じるために、近位および遠位ＣＣＡ、並びに胸鎖乳突筋を取り巻く縫合糸を、切 断し引き抜いた。動脈瘤クリップを顎下腺から除去し、その顎下腺を手術領域の 上に置いた。次いで、皮膚端を外科手術用糸で近づけて、動物を台から除去した 。 一過性大脳虚血を確立するための閉塞用縫合糸の除去： 一過性大脳虚血の実験は、閉塞用縫合糸を除去するため、創傷の再診査を必要 とした。これら実験に関して、最初の創傷の閉鎖は、動脈へ迅速に接近するため 、外科手術用糸よりむしろ一時的に動脈瘤クリップを使って行った。外動脈断端 からの出血を最小限にするため、閉塞用縫合糸を除去する前に、4.0シルク縫合 糸を用いて近位の対照（control）を再度確立した。閉塞用縫合糸を除去する間 、遠位縫合糸が完全に断端をクリアにする前に、外動脈断端の焼灼を始めた。縫 合糸が完全に除去されると、断端はより広範囲にわたって焼灼される。頭蓋外の 内動脈における流れが再度確立したことは、視覚的に確認され、上記永久的な局 所的虚血に関して創傷を閉じた。頭蓋内の再灌流の確認は、レーザードップラー 流量計（補助的な生理学的手法の部分を参照）を用いて行われた。 一回拍出量の計算： 中大脳動脈の閉塞から24時間後、生存マウスを、0.3ｃｃの塩酸ケタミン（10 ｍｇ／ｍＬ）およびキシラジン（0.5ｍｇ／ｍＬ）で再度麻酔をかけた。最終体 重、体温および大脳血流の示度を（以下で説明するように）読みとり、大脳動脈 を可視化するため、動物を５ｍＬの0.15％メチレンブルー溶液および食塩水で灌 流させた。次いで動物を断頭し、脳を除去した。次いで、ＭＣＡにより境界を示 される血管領域の負の染色により確認されたように、正しいカテーテルの配置に ついて脳を詳しく調べ、１ｍｍ切片作成のために、マウス脳基質（Activational Systems Inc.，Warren，MI）中に置いた。切片を、0.9％リン酸緩衝化食塩水中 の２％ 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）に浸し、３０分 間３７℃でインキュベートし、１０％ホルマリン中に置いた（5）。ＴＴＣ染色 後、生存（赤れんが色）組織の取り囲む背景の中に、未染色（白色）組織の領域 として、梗塞脳が可視化された。連続切片を写真に撮り、同様に拡大してトレー シングペーパー上に映写した：全ての連続切片をトレースし、切り取り、実験状 況に判断力のない技術者により、紙の重量を測定した。こうした状況の下、梗塞 体積は、梗塞領域の回りに境界線を描いたペーパーの合計重量に比例し、右半球 体積のパーセンテージとして表示される。この方法は、以前の研究において有効 であると認められている（3,12,15,16）。 補助的な生理学的研究： 補助的な生理学的研究を、手術処置の直前および直後に、本実験で使用した異 なる３系統の各々について行った。全身の血圧を、下腎腹大動脈のカテーテル法 により獲得し、Grassモデル７ポリグラフ（Grass Instrument Co.，Quincy，MA ）を用いて測定した。動脈血液のサンプルを、この下腎大動脈カテーテルから得 た；動脈ｐＨ、ｐＣＯ₂（ｍｍ Ｈｇ）、ｐＯ₂（ｍｍ Ｈｇ）およびヘモグロビ ン酸素飽和（％）を、Blood Gas AnalyserおよびHemoglobinometer（Grass Inst rument Co.，Quincy，MA）を用いて測定した。これら生理学的パラメーターを測 定するには動脈の穿刺および腹側操作を必要とするため、これら測定のためだけ に動物を使用した（一回拍出量、神経学的症状、および大脳血流は、これら同動 物において測定しなかった）。 以前に記載したように（10）、頭蓋冠の上に横たわる皮膚の反転後、大脳血流 の経頭蓋（transcranial）測定を、レーザードップラー流量計（Perimed，Inc. ，Piscataway，NJ）を用いて行った（経頭蓋の示度は、試験的な研究における頭 蓋局部切除後の示度と一貫して同じであった）。これら測定を成し逐げるため、 動物を定位の頭枠に置き、その後、ナジオンから上項線まで正中皮膚切開を行っ た。皮膚を外側に取り除き、0.7ｍｍの直線レーザードップラープローブ（モデ ル＃ＰＦ２Ｂ）を皮質表面に落とし、少量の生理学的食塩水で濡らした。プロー ブの角度を皮質表面に垂直に維持して、定位のマイクロマニピュレータを用いて 、ブレグマの２ｍｍ後ろ、正中の各側に３ｍｍおよび６ｍｍの示度を獲得した。 相対 的大脳血流測定を、麻酔直後、ＭＣＡの閉塞後、および安楽死の直前に行い、非 虚血半球と比較した虚血のドップラーシグナル強度の比として表示する。一過性 大脳虚血にかかった動物に関して、縫合糸の除去、再灌流の開始の直前および直 後に、追加測定を行った。 相対的大脳血流における＞５０％低下が、管内閉塞用カテーテルの配置直後に 観察されるなら、外科的手法／管内ＭＣＡ閉塞は、技術的に適切であると考えら れた（本研究で使用した１４２動物のうち１５（10.6％）が、閉塞時に血流の不 適切な低下のために除外された）。これら除外の判定基準は、ＴＴＣ染色により 一貫した梗塞体積を与えるために充分な虚血レベルを生じるように、予備実験で 明らかにされている。カテーテル除去時に大脳血流が、少なくとも２倍の閉塞大 脳血流であるとしたら、再灌流は、技術的に適切であると考えられた（本研究に おいて１３/１７動物（76％））。 体温： 梗塞周囲（Peri-infarct）期間のコア体温を、実験期間を通じて注意深く制御 した。外科手術に先だって、ベースラインの直腸体温を記録した（ＹＳＩモデル ７４ Thermistemp直腸プコーブ、Yellow Springs Instruments,Inc.，Yellow S prings，OH）。手術時に、熱電対制御された手術面を用いて、体温を制御した。 ＭＣＡ閉塞の後、動物を９０分間インキュベーター中に置き、熱電対を経てイン キュベーターの加熱源に接続された直腸プローブを用いて、動物の体温を３７℃ に維持した。一過性虚血にかかった動物について、インキュベーター中で、４５ 分（虚血）の間、並びに９０分の虚血後の期間も含めて、同様に体温を維持した 。動物をコア体温のインキュベーター中に置いた後、屠殺前の観察の残りの期間 、かごに戻した。 神経学的試験： マウスを安楽死の際、麻酔をかける前に、４つの旧式の採点システムを用いて 、明白な神経学的な欠陥について調べた：（１）正常な自発的移動、（２）動物 の右旋回、（３）動物の右回転、（４）動物が四つん這いになって前かがみの状 態 で、有害刺激に無反応。このシステムは、予備研究で、正確に梗塞サイズを予測 することが示されており、ラットでの使用のために開発されたシステムに基づい ている（6）。 データ解析： 一回排出量、神経学的症状のスコア、大脳血流および動脈血液のガスデータを 、スチューデントｔ検定を用いて比較した。値は、平均値±ＳＥＭで表示し、ｐ ＜0.05を統計学的に有意であると考える。得られた死亡率データは、カイ二乗解 析を用いて評価した。 結果： 系統の効果： ３種類の一般に使用されるマウス系統（ＣＤ１、Ｃ５７/Ｂ１６、および１２ ９Ｊ）を、永久的な局所的大脳虚血の後、発作後の症状における変動性を比較す るために使用した。大脳循環の側副枝化（collateralization）における全体的 な解剖学的違いが無いということを確認するため、全ての３系統にインディアイ ンクを用いて、ウィリス輪を可視化した（図１３）。これら研究は、全体的な解 剖学的違いを明らかにできなかった。次いで、同サイズのマウス（１２９Ｊ、Ｃ Ｄ１、およびＣ５７Ｂ１マウスに関して、それぞれ２０±0.8ｇ、２３±0.4ｇ、 および２３±0.5ｇ）を、１２ｍｍの長さの６−０ナイロン閉塞用縫合糸を用い て、適温条件下で永久的な局所的虚血にした。梗塞体積における系統関連の有意 な違いが認められ、１２９Ｊマウスの梗塞は、同一の実験条件にもかかわらず、 ＣＤ１およびＣ５７／Ｂ１６マウスで観察されたものより有意に小さかった（図 １４Ａ）。梗塞サイズにおける違いは、神経学的試験に匹敵し、最も高いスコア （即ち、最も厳しい神経学的損傷）は、Ｃ５７/Ｂ１６およびＣＤ１マウスで観 察された（図１４Ｂ）。 梗塞体積とコア領域への大脳血流との関係を決定するため、レーザードップラ ー流量測定を、薄いマウス頭蓋冠により行った。大脳血流における手術前の系統 関連の違いは観察されず、これは、血管解剖において全体的な解剖学的違いがな いことに対応する（図１３）。閉塞用カテーテルの挿入宣後に大脳血流を測定す ることにより、同程度の流量の低下が、その手法により引き起こされることが明 らかになった（閉塞用カテーテルの挿入直後における、同側／対側流量のパーセ ンテージは、１２９Ｊ、ＣＤ１、およびＣ５７/Ｂ１６マウスに関して、それぞ れ２３±２％、１９±２％、１７±３％であった）。驚くべきことでもないが、 安楽死の２４時間前に測定されたコア領域への血流は、最も厳しい神経学的損傷 を受けた動物の中で、最も低い血流であることが実証された（図１４Ｃ）。 マウスの解剖学的および生理学的特性： ベースラインの動脈血圧、並びに中大脳動脈の閉塞後の動脈血圧は、調べた全 マウスについてほぼ同じで、マウス系統またはサイズにより影響を受けなかった （表１）。同様に、動脈血液のｐＨ、ｐＣＯ₂、およびヘモグロビン酸素飽和（ ％）解析は、何ら有意な違いを示さなかった（表１）。 動物のサイズおよび閉塞用縫合糸の内径の効果： 発作後の症状に対するマウスサイズの効果を調査するため、２種類の異なるサ イズのマウス（２３±0.4ｇおよび３１±0.7ｇ）を、永久的な局所的大脳虚血に した。これら実験における他の潜在的な変動性原因を取り除くため、実験は、同 じ系統（ＣＤ１）のマウスで、適温条件下で、同じ長さおよび内径の閉塞用縫合 糸（１２ｍｍ ６−０ナイロン）を用いて行った。こうした条件の下、小さいマ ウス（２３±0.4ｇ）は、大きな梗塞体積を一貫して持続した（同側半球の２８ ±９％）。同じ実験条件下で、大きいマウス（３１±0.7ｇ）は、小さいマウス よりも、ずっと小さい梗塞であり（3.2±３％、ｐ＝0.02、図１５Ａ）、神経学 的試験についても病的状態が少なく（図１５Ｂ）、梗塞後の同側大脳血流を高く 維持する傾向（図１５Ｃ）が実証された。 これら大きい動物における梗塞サイズの低下は、閉塞用縫合糸と大脳血管との 間の直径／長さのミスマッチに関係していると仮定されるため、より長い／より 太い閉塞用縫合糸を、これら大きいマウスに使用するために作った（１３ｍｍ、 ５−０ナイロン）。これら大きい閉塞用縫合糸により永久的な閉塞を行った大き いＣＤ１マウス（３４±0.8ｇ）は、梗塞体積が著しく増加した（同側半球の５ ０±１０％、小さい閉塞用縫合糸で梗塞した大きいマウスと比べてｐ＜0.0001、 図１５Ａ）。大きい閉塞用縫合糸で梗塞したこれら大きいマウスは、小さい閉塞 用縫合糸で梗塞した大きいマウスと同様に比較して、神経学的欠損スコアが高い こと（図１５Ｂ）、および同側大脳血流が低いこと（図１５Ｃ）が実証された。 体温の効果： ＭＣＡ閉塞後の一回拍出量および神経学的症状に対する手術時の低体温の役割 を確立するため、小さいＣ５７/Ｂ１６マウス（２２±0.4ｇ）を、１２ｍｍ ６ −０ゲージ縫合糸を用いて、二つの異なる期間、適温を維持して、永久的なＭＣ Ａ閉塞にした。グループ１（「適温」）は、上記とおり手術し、手術前から閉塞 後９０分まで体温を３７℃に維持した。グループ２動物（「低体温」）は、以前 に記載したとおり（14）、手術前から閉塞後わずか１０分まで３７℃に維持した 。熱電対制御された加温インキュベーターから除去後４５分以内に、この第２グ ループの動物のコア体温は、33.1±0.4℃まで低下した(および９０分で31.3±0. 2℃までさらに低下した）。延長した適温条件下で手術した動物（グループ１） は、低体温（グループ２）動物（9.2±５％、ｐ＝0.03、図１６Ａ）より大きい 梗塞体積を示した（３２±９％）。梗塞体積における違いは、神経学的欠損にお ける違いに反映されるが（3.2±0.4ｖｓ2.0±0.8、ｐ＝0.02、図１６Ｂ）、主と して大脳血流とは無関係である（52±5ｖｓ52±７、ｐ＝ＮＳ、図１６Ｃ）。 一過性ＭＣＡ閉塞の効果： 再灌流障害は、脳血管閉塞後のニューロン損傷の重要な原因として関与してい るので（25）、上記したとおり、一過性（４５分）期間の虚血、その後の再灌流 を、一連の動物に行い、永久的ＭＣＡ閉塞を行った動物と比較した。閉塞の期間 は、予備研究（示さず）に基づいて選択し、これにより、180分の虚血で容認で きない高い死亡率（＞８５％）および１５分の虚血で稀な梗塞（＜１５％）が実 証された。他の変動が混同する影響を最小にするため、他の実験条件を一定に維 持した（小さい（22.5＝O.3ｇ）Ｃ５７/Ｂ１６マウスを使用し、閉塞用縫合糸は １２ｍｍ ６−０ナイロンから成り、実験は適温条件下で行った）。閉塞直後に おけるＣＢＦの最初の低下は、両グループとも同じであった（一過性ｖｓ永久的 閉塞グループに関して、各々、１６±２％ｖｓ１７±３％、ｐ＝ＮＳ）。再灌流 は、典型的な動物において、レーザードップラー（閉塞用縫合糸の除去後、６６ ±１３％への2.3倍の血流増加）により、およびメチレンブルー染料の心臓内注 入により可視的に確認された。梗塞サイズ（２９±１０％ｖｓ３２：９％）、神 経学的欠損スコア（2.5±0.5ｖｓ3.2±0.4）、および屠殺大脳血流（４６±１８ ％ｖｓ５３±５％）は、一過性の大脳虚血および再灌流させた動物と永久的な局 所的大脳虚血を受けた動物との間でかなり類似していた（ｐ＝ＮＳ、全グループ に対して）（図１７Ａ−１７Ｃ）。 考察： 遺伝的に変異したマウスの有効性が高まることにより、発作の病因に関して特 定の遺伝子産物に帰属させるため、局所的大脳虚血のマウスモデルの利用が高ま った。最近の公開は、マウスに永久的および／または一過性の大脳虚血を引き起 こすため、管内縫合糸が中大脳動脈を閉塞するための利用を記載しているが、ラ ットにおける本来の技術報告の必要な改良に関する記載は乏しかった（8,14,17- 19,24,26）。ここで記載した実験は、永久的または一過性の局所的中大脳動脈虚 血にとって適切なマウスモデルの詳細な技術的説明を提供するだけでなく、この モデルにおける有効性の潜在的な原因を検討している。 系統の重要性： ここで記載したマウス大脳虚血モデルにおける有効性のうち、最も重要な潜在 的原因の一つは、使用した動物の系統に関係する。このデータにより、調査した ３系統の中で、１２９Ｊマウスは、ＭＣＡ閉塞の後、特に神経学的損傷に特に耐 性があることが示される。バロン病は、マウスの３系統（ＢＤＦ、ＣＦＷおよび ＢＡＬＢ/Ｃ）の間の一回拍出量における違いが同様に見出されるが、これらの 違いは、これら系統における後交通動脈の変化に帰する（4）。脳血管の解剖に おける解剖学的違いは、本研究において明白ではなかったので（図１３）、この データにより、非解剖学的な系統関連の違いは、ＭＣＡ閉塞後の症状において重 要であることが示される。 胚幹細胞における相同組み換えによりトランスジェニックマウスを作り出すた めに一般に使用される２系統のマウス（１２９ＪおよびＣ５７/Ｂ１６）の間で 、発作後の症状は、有意に異なるので（11）、このデータは、トランスジェニッ クマウスで行われた実験に対して重要な警告を示している。これらの系統を用い たトランスジェニック動物の作成に由来する初期の子孫は、混合した１２９Ｊ／ Ｃ５７/Ｂ１６のバックグラウンドをもっているので、子孫コントロールを用い るか、または純系の確認のための充分な数の戻し交雑の後に、理想的には、実験 を行うべきである。 サイズの重要性： より大きい動物は、小さい閉塞用縫合糸をつかって小さい動物において得られ た梗塞体積と一致した梗塞体積を維持するため、より長く太い管内縫合糸を必要 とする。動物および縫合糸に見合うサイズは、一貫した大脳梗塞を作り出すだけ でなく、小さすぎる縫合糸は不十分な虚血に至る一方、大きすぎる縫合糸は頻繁 に大脳内出血および血管外傷につながるため、重要であると思われる（未公開観 察）。 同じサイズの動物の利用は、虚血性傷害に対するニューロン感受性において、 潜在的な年齢関連の変動を最小限にするだけでなく、動物サイズの小さな違いが 意味のあるデータ比較を混乱させないために、重要である。この例において、ほ んの９ｇのサイズの違いが、大脳虚血後の梗塞体積および神経学的症状に対して 大きな影響を及ぼし得る。小さな動物の方がより大きな発作になる傾向は、大き な動物の虚血性ニューロン損傷に対する相対的な耐性が理由ではなく、むしろ、 大きな動物でＭＣＡを閉塞するのに使用した縫合糸のサイズが小さいためである ことが、大きな動物に大きな内径の閉塞用縫合糸使用した更なる実験により示唆 される。これらのデータはＣＤ１マウスを用いて得られたが、同様の研究が行わ れ、これらの結果がＣ５７/Ｂ１６のような他のマウス系統にも当てはまること が見出された（非公開データ）。以前に公開された報告は、（２１ｇから３５ｇ まで）多くの様々なサイズのマウス、並びに、しばしば報告されない様々な直径 および長さの縫合糸を使用している。この研究は、動物および縫合糸のサイズが 、科学的報告において検討しなければならない重要な方法論的問題であることを 示している。 体温の重要性： 低体温が、虚血性損傷から脳など多くの器官を保護することが長い間認識され てきた。ＭＣＡ閉塞後１時間までの虚血内低体温は保護性があり（2,15）、34.5 ℃の体温で死亡率および梗塞体積ともに低下させることが、ラットで行われた研 究により実証された。これらの結果は、研究がしばしば動物における適温の維持 を説明しているため、大脳虚血のマウスモデルに推定されるが、ＭＣＡ閉塞後の 体温をモニターする期間は、非常に短かった（「外科手術直後」または「外科手 術１０分後」）（4,14）。この短い期間を越えると動物は体温を自動制御できず 、手術後の期間非常に低体温になること、およびＭＣＡ閉塞後９０分までの体温 の違いは、ＭＣＡ閉塞後における発作後の症状の指標に対して強い影響をもち得 ることが、結果により示される（より長い期間の適温は研究されなかった）。こ こで記載したものと同様の直腸体温に基づくフィードバックシステムを用いて、 他の人は適温を確証したが、適温の期間はしばしば明確に記していない（17）。 体温、並びに関与する期間をモニターし維持するための方法の明らかな証明につ いて、この結果は議論しており、その結果、実験結果を、発作の病態生理学を研 究しているセンター内およびセンター間で比較することができる。 一過性ｖｓ永久的閉塞： 永久的な大脳虚血の病態生理学のある局面は、大脳虚血後の再灌流によるもの とは異なることもあるため、各条件の解析を可能にしたモデルを記載することが 重要である。これら二つのモデル間の違いは、調べた状況下で（４５分の虚血後 、２３時間の再灌流）、現在の一連の実験において広範囲にわたって調べられな かったが、有意な違いが、何れの発作後の症状の指標にも見出された。虚血およ び再灌流の変動可能な期間は、一過性大脳虚血の他のマウスモデルで報告されて お り、虚皿時間は１０分から３時間にわたり、再灌流時間は３から２４時間にわた る（17,24）。ラットにおける研究により、短い期間の虚血後の再灌流は、永久 的閉塞より小さい梗塞と関連していることが示された（21,25）。しかし、虚血 の時間が臨界閾値を越えて増加するにつれ（120分から180分）、再灌流が大きい 梗塞と関連している（7,21,26）。現在の一連の実験に関して、虚血および再灌 流の時間は、永久的なＭＣＡ閉塞後に観察される梗塞に匹敵する梗塞が得られる ように選定され、このことは、なぜデータが永久的虚血と一過性の虚血との間の 違いを示さなかったかを説明してくれる。一過性モデルにおけるこれらの期間は 、短い虚血期間（１５分）はめったに梗塞に至らないことを明らかにした試験的 な実験の後に選択されたが、再灌流が後に続く180分の閉塞は、適温動物におい て４−６時間以内に巨大な梗塞に至り、ほぼ100％の致死率につながった（未公 開の観察）。発作後の症状の指標は、２４時間より前に測定され得るが、２４時 間の観察時間は、この時の観察が遅延性周縁部（penumbral）死の研究を可能に するという理由で選択され、このことは、ヒトにおける発作の病態生理学に対し て臨床的に適切であると思われる。その上、２４時間は、ラットモデルにおいて 、完全な梗塞の成熟に対して充分であることが示された（3,12,15,16）。 マウスモデルの技術的局面： マウスで局所的大脳虚血をつくるために必要な外科手術の技術的な面は、ある 重要な点において、ラットとは異なる。ラットにおける以前の報告において主張 された自留レトラクタ（26）は、マウスでは扱いにくい。テープで固定した縫合 糸ベースの収縮（retraction）は、優れた他の選択肢を提供する。ラットにおい て、外頸動脈の援動後における近位および遠位頸動脈のクリップ閉塞は、報告さ れているが（26）マウスでは頸動脈損傷および出血を引き起こす。マウスでは以 前に記載されていないが、遠位の内頸動脈コントロールなしでは、外頸動脈から の戻り出血は、一貫して制御不可能である。この文書の中で記載した技術を用い て、ほとんど血液を損失することなく外科手術を完了することができ、このこと は、マウスが少ない血液量の場合、特に重要である。 ラットモデルと違って、マウスモデルにおける外頸動脈分枝および翼突口蓋動 脈の閉塞および横断（transection）は、電気焼灼器のみで成し遂げられる。マ ウス外科手術の以前の報告は、翼突口蓋動脈を取るかどうかに関して不明瞭であ った（17,24）。他の人は、外頸動脈システムまたは翼突口蓋動脈に注意するこ となく、一般頸動脈の永久的閉塞および縫合糸の頸動脈横断挿入による方法を記 載していた。この後者の方法は、永久的閉塞に対して有効であるが、再灌流の研 究を不可能にする。 ラットにおいて最初に記載された再灌流の方法は、麻酔なしでブラインドカテ ーテルを引き抜くことを要求する（26）。マウスで試験的な研究を試みると、幾 つかの動物は出血した。従って、麻酔をかけた動物において、直接目で見て縫合 糸を除去する方法が開発され、このことは、頭蓋外頸動脈の再灌を目で確認でき るだけでなく、細心の注意を払って止血することができる。その上、麻酔をかけ た動物において、再灌流直前および直後のレーザードップラー流量計の読みとり を可能にする。 これらレーザードップラー流量計の読みとりは、読みとりを断続的および定位 のマイクロマニピュレータの使用により行った点で、KamiiらおよびYangらによ る記載と類似している（17,24）。しかし、使用した座標（ブレグマに対して２ ｍｍ後ろで、３ｍｍおよび６ｍｍ外側）は、以前に公開されたコアおよび周縁座 標（ブレグマに対して１ｍｍ後ろで、２ｍｍおよび4.5mm外側）より、わずかに 外側で後ろ側である点で、この読みとりは異なる。試験的な研究に基づいて採用 されたこれらの座標は、Huangら（14）により使用されたものと同じである。 結論 これらの研究により、異なる研究室間での測定の再現性を可能にする局所的大 脳虚血および再灌流のマウスモデルに関する特定の技術的な面が実証された。そ の上、これらの研究は、発作後の症状に対して強い影響をもち得る重要な方法上 の変動を理解するための枠組みを提供し、このことは、調査中である手法以外の 関連の違いを明確に理解することにつながるはずである。最も重要なことに、こ の研究は、マウス系統、動物および縫合糸のサイズ、および実験動物並びにコン トコール動物の体温を注意深く制御する必要性を指摘している。発作後の症状 が、永久的な局所的大脳虚血と一過性の局所的大脳虚血との間で類似しているた め、条件を確立することができ、このことが直接的な比較を容易にし、再灌流障 害の研究を可能にする。本研究で記載されたモデルは、トランスジェニック動物 の将来の研究結果を評価するための確固たる枠組みを提供し、発作の病態生理学 において特定遺伝子産物が貢献していることを理解し易くする。 表１ 手術前および手術後の生理学的パラメーター。ＭＡＰ、平均動脈圧；ｐＣＯ₂、 動脈ＣＯ₂の分圧（ｍｍＨｇ）；Ｏ₂Sat、Ｏ₂飽和（％）；Ｈｂ、ヘモグロビン濃 度（ｇ／ｄｌ）；手術前、頸動脈切開前の麻酔をかけた動物；Sham、閉塞用縫合 糸の導入直前に、本文記載の外科手術を行う麻酔をかけた動物；troke、閉塞用 縫合糸の導入直後に、本文記載の外科手術を行う麻酔をかけた動物。全てのグル ープ間比較のためｐ＝ＮＳ。（示したデータは、小さい２２グラムのＣ５７/Ｂ １６マウスに関する）。参照文献： 実施例４：Ｐ−セクレチン遺伝子を発現するマウスにおける大脳損傷の再燃：卒 中発作の治療用新ターゲットとしてのＰセクレチン封鎖の特定 卒中発作発生の治療には、現在純然たる治療的空白がある。Ｐ−セクレチンは 、低酸素状上皮細胞によって、インビトロで急激に発現されるけれども、卒中発 作におけるＰセクレチン発現の機能的重要性については未調査のままである。Ｐ −セクレチン発現の病態生理学的重要性を特定するため、およびＰ−セクレチン を封鎖する事が卒中発作の治療に対して可能性のある新しいアプローチである事 を特定するために、限局性大脳虚血および灌流のネズミモデルを使用して実験が 行われた。虚血後の大脳皮質においてＰ−セクレチン発現が初期にみられること が、放射能活性標識された抗ネズミＰ−セクレチンIgGが特異的に蓄積する事に よって示された。平行実験において、Ｐ−セクレチン遺伝子（ＰＳ＋／＋）を発 現しているマウスの虚血皮質における好中球の蓄積は、ホモ接合のＰ−セクレチ ンゼロのマウス（ＰＳ−／−）において示されるよりも著しく多かった。該マウ ス（ＰＳ−／−）においては、好中球の流入が減ると、それに伴って虚血後大脳 の再流（レーザードップラーによって測定された）大きくなった。加えて、該Ｐ Ｓ−／−マウスでは、梗塞体積（5倍、減少p<0.05）がより小さくなり、ＰＳ＋ ／＋と比較して生存率（88％、対44％、P<0.05）が良くなった。マウスＰ−セク レチンに対して向けられたモノクローナル抗体を使用してＰＳ＋／＋マウスにお けるＰ−セクレチンの作用を封鎖すると、コントロールと比べて、初期の再流お よび卒中発作の結果も改善された。これらのデータは、卒中発作におけるＰ−セ クレチンに対する生理病態的役割を実証する最初のデータであり、またＰ−セク レチンを封鎖することが、卒中発作治療にとって新治療ターゲットとなりうる事 を示唆している。 序 虚血性卒中発作は、今日合衆国における第三の主要死亡原因を構成している¹ 。ごく最近まで、卒中発作を発症の際の大脳組織の損傷を減らす直接的治療法は なかった。NINDS²およびECASS³rt-PA¹急性卒中発作研究では、初期の再灌流⁴の 治療的恩恵はあると示唆されるけれども、急性虚血性卒中発作⁵のストレプ トキナーゼ治療を行なった後に死亡率が増加する事は、卒中発作発症の明らかに 効果的な治療方法は、現在のところないという冷静な事実が強調される。卒中発 作の治療に当たって現在、医学的治療用品がないことが、多くの革新的研究方法⁶ が導き出しているが、rt-PA以外にはまだどれもその臨床的領域には至っていな い。安全で効能のある卒中発作発症に対する治療を特定するために、補充された 好中球が体に有害な役割を果たす事に注意が集中するようになってきた。再灌流 卒中発作のネズミモデルにおける最近の研究では、卒中発作の前に好中球（PMNs ）が枯渇すると大脳組織の損傷部が最小になり、機能的にみた結果が改善される 事が実証され⁷、特異的細胞付着分子ＩＣＡＭ−１を欠くマウスが同様にして保 護されること⁷が実証された。Ｐ−セクレチン、即ち先に形成された貯蔵部位⁸か ら低酸素性上皮細胞表面に急速に転移され得る分子は、好中球の働きに対する重 要な初期メデイエータ⁹であり、該メデエータは、ＩＣＡＭ−１に媒介される好 中球抑制を促進する。Ｐ−セクレチンは、霊長類卒中発作¹⁰において発現される けれども、再灌流された卒中発作にも非灌流卒中発作のいづれのモデルにおいて もＰ−セクレチン発現の機能的重要性に向けた公表データはない。 卒中発作におけるＰ−セクレチンの病態生理学的役割を調査するために、野生 型マウスおよびＰ−セクレチン遺伝子⁹に対してホモ接合のないマウスの両方を 使用した限局性的大脳虚血および再潅流¹¹のネズミモデル、および機能的封鎖を 行なうＰ−セクレチン抗体を投与する戦略を採用した。この研究では、正中大脳 動脈閉塞の後Ｐ−セクレチンが発現すると、これに伴って、再灌流後の大脳再流 が減少し、および卒中発作後の結果がより悪くなる事が確認されたのみならず、 Ｐ−セクレチン封鎖によって、虚血後大脳保護が顕著になされる。これらの研究 は、卒中発作におけるＰ−セクレチンの発現の病理生理学的役割を最初に実証し たものであり、抗Ｐ−セクレチンの戦略は、再灌流された卒中発作の治療に有用 であることを証明できるかもしれないという興味ある可能性を示唆する。 方法 マウス：実験はトランスジェニックＰ−セクレチン欠損マウスで行われた。該 マウスは、Ｊ１胚ステム細胞における遺伝子ターゲテイングによって以前報告さ れたように作成され、C57BL/6未分化胚芽細胞中に注入されて細菌系トランスミ ッションを得、バッククロスされてホモ接合のないＰ−セクレチンマウス（ＰＳ −／−）を得た。C57BL/6Jマウスでバッククロスさせた第三世代からの従兄弟マ ウスであるＰＳ−／−または野生型（ＰＳ＋／＋）で実験が行われた。実験時に 、動物は7−12週齢であり体重は25−36ｇであった。 一時的正中脳動脈閉塞：マウスには、麻酔がかけられ（10mg/ccのケタミン0.3cc 、0.5mg/ccのキシラジン、腹腔内）、直腸内体温を制御され手術面上に仰臥位さ せた（Yellow Spring Instruments，Inc.，Yellow Springs，OH）。動物の中心 部体温は、手術中および手術後90分間は37±１℃に維持された。正中頚部切開を 行い、右頚動脈鞘を手術用顕微鏡（16-25X ズーム、Zeiss，Thornwood，NY）下 に露出させた。共通の頚動脈を4−0シルクで単離し、後頭、翼突口蓋、および外 部頚動脈を夫々単離し分割した。正中大脳動脈閉塞(ＭＣＡＯ)は、13mmも熱平滑 化された5−0ナイロン縫合を外部頚動脈断端を介して進める事によって行なった 。閉塞縫合を行なった後、外部頚動脈断端は焼灼され、傷が閉じられた。45分後 、閉塞縫合を取り除いて、再灌流を行なった。これらの手法は先に詳しく述べて ある⁹。 大脳皮質血流の測定：大脳血流の経頭蓋測定は、レーザードップラー（Perimed ，fnc.，Piscataway，NJ）を使用して、先に述べたように行われた¹²。0.7mmの 直線レーザー・ドップラー・プローブ（モデル＃PF303、Perimed，Piscataway， NJ）および先般公表された目印（ブレグマに対して2mm後ろ、正中線の各サイド に対して6mm後ろ）^11、13を使用して、相対的大脳血流測定を、麻酔直後、正中大 脳動脈の閉塞後1および10分、および再灌流後30分、300分、および22時間後に、 指示されたように行なった。データは、無虚血半球と比較した虚血半球のドップ ラー信号強度の比として表された。本方法は組織グラム当たりの大脳血流を定量 化するものではないが、正確に規定された解剖学的目印におけるレーザードップ ラー血流測定値は、同一動物において系統的にある時間にわたって、大脳血流を 比 較する手段として利用される。該外科的手法は、もし相対的大脳血流において≧ 50％削減が、管内閉塞縫合の設置直後に観察されたならば、技術的に適切と考え られる。これらの方法は先般の研究で使用されている^7、11。 脳血管解剖は、下記の手法で代表的動物において行われた。マウスに麻酔をかけ 、インデイア・インク：カーボンブラック：メタノール：生理食塩水(1：1：1： 1、v:v:v:v:)の死前注入を左脳室穿刺によって行った。脳は、迅速断頭後、10％ のホルマリン中で４℃、２日間浸漬することによって調整され、その後、下方表 面を撮影し、ウイリス輪の血管パターンを表示した。¹²⁵ Ｉ標識蛋白および¹¹¹Ｉ標識ネズミ好中球の調整および投与：放射活性沃素と 結合した抗体は、下記のように調整された。モノクローナルラット抗ネズミＰ− セクレチンIgG（クローンRB40.34，Pharmingen CO.，San Diego，CA）¹⁴および 非免疫ラットIgG（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）を酵素ビーズ（Bio-ra d，Herculees，CA）を使用したラクトパーオキシダーゼ法によって¹²⁵Ｉで、放 射活性標識した。放射活性標識されたＰＭＮｓは、下記様式によって調整された 。野生型マウスからのクエン酸塩添加血液をNaCl(0.9％)で1：1に希釈し、続い て、フィコール・ハイパーク（Pharmacia，Piscataway，NJ）上にて階調度超遠 心分離にかけた。残留赤血球を低酸素溶解（蒸留水20秒間さらし、続いて1.8％N aClで再構成した）した後、ＰＭＮｓは燐酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中に懸濁さ れた。好中球（5―7.5x10⁶）を、ＰＢＳ中でインデイウム・オキシン（Amercham Mediphysics，Port Washignton NY）100μＣｉ¹¹¹と共に懸濁し、15分間３７℃ での静攪拌に供した。ＰＢＳで洗浄された後、ＰＭＮｓはゆっくりペレット化さ れ（450xg）、PBS中に最終濃度1.0x10⁶細胞/ｍｌとなるまで再懸濁された。 神経学的実験：麻酔を投与する前に、マウスを神経学的欠損について、4力価等 級システム¹¹を使用して再灌流後22時間して調査した。もし動物が通常の自然発 生的な動作をしたならば¹のスコアを与え、もし動物が、同側サイドに向かって 回転したと気づいたならば、²のスコアを与え、もし動物が長手方向（尻尾から みて時計方向）に回転することが観察されたなら、³のスコアを与え、動物が有 害性の刺激に反応しないなら、⁴のスコアを与えた。このスコアシステムは、マ ウス^7、11において先般記載されており、ラット^16、17において使用された同様な スコアシステムに基づいている。 梗塞体積の計算：神経学的実験の後、マウスを麻酔し、最終的大脳血流を測定し た。断頭により人為的に死に至らしめ、脳を除去し、1mm切片化のためマウス脳 の基質（Activational Systems Inc.，Warren，MI）中に載置した。切片を0.9％ の燐酸緩衝生理食塩水中2％の2、3、５トリフェニル2Hテトラゾリウム・クロラ イド（TTC，Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）中で、30分間37℃でインキュ ベートし、10％ホルマリン¹⁸中に載置した。梗塞の起こった脳は、無着色組織の 領域として視覚化された。梗塞体積は、平面面積測定された一連の切片から算出 され、同側半球における梗塞のパーセンテージで表わされた。梗塞体積を算出す る本方法は、先般使用されてきた^{7、11、13、18}、上記記載の卒中発作の結果の他の 機能的指標と相関していた。 未標識抗体の投与、放射活性標識されたPMNsおよび放射活性標識された抗体：未 標識の抗体を投与する実験のために、二つの異なる型の抗体のうちの一つ、封鎖 モノクローナルラット抗ネズミＰ−セクレチンIgG(Clone RB 40.34，Phamingen Co.，San Diego，CA）^14、19、20または非免疫ラットIgG（Sigma Chemical Co.，S t.，Louis,MO）を使用した。抗体を、0.1％牛血清アルブミンを含む0.2ml燐酸緩 衝生理食塩水中に30μｇとなるよう調整した。該アルブミンは次に、正中大脳動 脈閉塞の10分前に陰茎静脈に投与された。別個の実験では、正中大脳動脈閉塞10 分前に、放射活性標識された抗体（0.15ml，約2.6x10⁵cpm/μＬ）を静脈注入し た。第３の一組の実験では、放射活性標識されたＰＭＮｓが、正中大脳動脈閉塞 10分前に、100μＬ注入物（放射活性標識されたＰＭＮは生理食塩水と、全体積0 .15mL：約３ｘ１０⁶cpm/μＬとなるまで混合された）として静脈投与された。未 標識抗体を投与する実験では（測定された時間はテキスト中に示してある）、上 記に記載された方法を使用して、大脳血流、梗塞体積および死亡率を測定した。 放射活性標識 抗体または放射活性標識nPMNsのいづれかを投与する実験では、マウスは、指示 時間点で殺害され、脳は即時除去され、同側（虚血後）と反対側半球とに分割さ れた。放射活性標識された抗体または好中球の堆積が測定され、同側／反対側cp mとして表された。 テータ分析：大脳血流、梗塞体積、および¹¹¹InPMN堆積を非対変数についてのス チューデントＴ検定を使用して比較した。神経学的欠損スコアを、マン・ホイッ トニーＵ検定を使用して比較した。二方向ANOVAを行い、二つのグループ（実験 対偽装）間のベースラインと最終(30分)抗体の堆積の間にある著しい相違につい てテストした。非対変数に対するスチューデントＴ検定を行い、グループ内相違 (ベースライン対３０分 時点)を評価した。グループ間の生存率相違については、χ2統計による偶然性解 析を使用してテストされた。値は、統計的有為があると考えられるｐ値＜0.05で 、平均±ＳＥＭで表わした。 結果 ネズミ卒中発作におけるＰ−セクレチン発現：Ｐ−セクレチンは、活性化された 赤血球細胞²¹に対する白血球付着の初期段階を媒介するので、再灌流された卒中 発作のネズミモデルにおいて初期の大脳Ｐ−セクレチン発現が調べられた。手術 の前に¹²⁵Ｉ標識されたラットモノクローナル抗ネズミＰ−セクレチンIgGを与え られたネズミは、偽装手術動物（p＜0.001、図18A）と比べて、再灌流30分目で 、抗体蓄積が216％の増加となった。再灌流半球におけるこの程度の抗体蓄積は 、非特異的蓄積というよりはむしろＰ−セクレチン発現に起因するものであるこ とを実証するために、¹²⁵Ｉ標識ラット非免疫IgGを与えて同一に処置した動物と の比較を行なった。これらの実験で、非免疫IgGよりも抗Ｐ−セクレチンIgGの蓄 積の方が著しく大きい事が実証され（p＜0.025、図18A）、これによってＰ−セ クレチンが再潅流後30分以内に脳で発現される事が示唆される。 ネズミ卒中発作における好中球蓄積：卒中発作の後発生するPMN流入の時間経 過をはっきりさせるため、ＭＣＡＯ前、ＭＣＡＯ宣後および10分後、および再灌 流30分、300分、22時間目に、¹¹¹In標識ＰＭＮ蓄積を野生型(PS+/+)ネズミにお いて、測定した。PS-/-マウスにおいて、ＰＭＮｓの蓄積は、限局性虚血の開始 後初期に始まり、再潅流の期間中ずっと続いた（図18B）。虚血後の好中球蓄積 におけるＰ−セクレチンの役割を確立するために、Ｐ−セクレチン遺伝子に対し てホモ接合のないマウス（ＰＳ−／−）を使用して実験が行われた。PS-/-マウ スは、正中大脳動脈閉塞および潅流の後のＰＭＩＮ蓄積を著しく低下させた(図1 8B)。 大脳血管無再流におけるPSの役割：PS-/-マウスにおけるＰＭＮ蓄積の減少は、 結果として血流の再確立後の大脳血流を改善することになるかどうかを確定する ために、PS+/+,およびPS-/-の両マウスにおいて、レーザー・ドップラーによる 相対的CBFの連続測定値が得られた。虚血の開始前（図19A、ポイントa）は，相 対的大脳血流は、両グループ間でほぼ同一であった。正中大脳動脈閉塞(図19A、 ポイントb)には、両グループにおける大脳血流がほぼ同一に低下することが伴っ た。虚血の45分目（図19、ポイントc）で管内閉塞の閉塞縫合を除去する直前に 、大脳血流がわずかに上昇したが、血流はベースライン血流に比べて著しく抑圧 されたままであった。再灌流を開始するために閉塞縫合を除去した直後（図19 ポイントd）、両グループの大脳血流は、比較できる程度まで（PS-/-およびPS+/ +マウスにおいてベースラインの約60％）まで増加した。再灌流後の大脳血流が 閉塞前のレベルに達し得なかったことは、大脳血管系が無再流²²であることの特 徴であり、続いて再灌流後の大脳血流の低下が起こることは、虚血後の大脳の低 潅流²³が遅延したことを表している。再灌流30分目までに（図19 ポイントe）, 動物の二つのグループ間の大脳血流は分岐しており、PS-/-動物では、PS+/+コン トロールよりも著しく大きい相対的大脳血流を示した(ｐ＜0.05)(図19、ポイン トf)。この分岐は、遅延虚血後大脳低灌流において有為差がある事を反映してお り、22時間の観察期間の間持続した。 大脳血管系解剖学的構造が違うのは、結果としてマウス²⁴における実験的卒中 発作の起こりやすさの違いとなることが報告されているので、インデイアイン ク・カーボンブラック染色を行なってウイリスの輪の血管パターンをPS-/-,およ びPS+/+マウス両者において視覚化した。これらの実験によって、大脳循環の血 管パターンにおいて解剖学的構造における全体的差異はない事が実証され7-,(図 20)。 卒中発作の結果：Ｐ−セクレチン発現の機能的重要性については、PS-/-マウス における卒中発作の結果の指標をPS+/+コントロールの指標と比較することによ ってテストした。梗塞体積が77％の減少（ｐ＜0.01）したことに基づくと、PS-/ -マウスは、Ｐ−セクレチン+/+コントロール（図21A）と比べて限局性大脳虚血 および再灌流の影響から著しく保護されたことになる。梗塞体積のこの減少に付 随して、神経学的欠損も減少する傾向（ｐ＝0.06、図21B）にあり、またPS-/-動 物においては生存率が増加傾向となった（ｐ＜0.05、図21C）。 Ｐ−セクレチン封鎖の効果：卒中発作におけるＰ−セクレチン発現の機能的役割 を、欠損変異マウスを使用して観察した後、Ｐ−セクレチンの薬学的封鎖が行わ れ、PS+/+マウスにおける卒中発作の結果を改善できるかどうかを確定した。モ ノクローナルラット抗マウスＰセクレチン封鎖抗体（クローン40.34，^14,19,20 ）または非免疫コントロールラットIgGを、手術直前に投与する戦法を使用して 、封鎖抗体を投与されたマウスにおいては、再灌流後の大脳血流を30分までに改 善した事が観察され(図22A)、のみならず神経学的欠損の減少(図22B)、大脳閉塞 体積（図22C）の減少、およびコントロールと比較して死亡率が減少する傾向に ある事（図22D）が観察された。 考察 近年の卒中発作¹の主要な防御における実質的な進展にも拘わらず、卒中発作 発症を治療する治療学的選択は、はなはだしく限定されたままである⁶。昨秋、r t−PA^2,3による虚血性卒中発作の治療の後に罹患率が減少したことを実証した二 つの画期的試みが公表され、それが、卒中発作⁴の治療における血栓崩壊治療の 新時代への案内役となることが想定されるにも拘わらず、出血性トランスフォー メ ーションおよびストレプトキナーゼ⁵によって虚血性卒中発作が治療された患者 の死亡率が増加したことによって、熱狂が幾分和らいできた。このような多岐に わたる試みによって、卒中発作の発生を治療するための新しい安全な治療方法が 開発されることが、今まで以上により重要になる。虚血後脳に対する血流の回復 することで、治療的介入を初期に行なうという新しい機会が与えられるけれども 、再灌流は両刃の剣である。好中球²⁵の細胞毒性を考えると、虚血後脳組織中へ の好中球が流入する事は、更に損傷を導びき、実験的卒中発作後の結果が悪くな る^7、26-29事は驚きではない。限局性大脳虚血および再灌流のネズミモデルを使 用して、卒中発作後22時間目に好中球の蓄積において細胞接着分子ＩＣＡＭ−１ が重要な貢献的役割を果たす事が、最近特定された⁷。しかしながら、大脳血管 系上皮細胞ＩＣＡＭ−１発現の増大は、時間を必要とする新生転写および翻訳事 件を必要とする。これに対して、Ｐ−セクレチン、即ち好中球付着の初期段階を 媒介する膜介在糖蛋白は、先に形成された貯蔵所から移動し、虚血性上皮細胞表 面^8、30で急速に発現するのかもしれない。卒中発作に対する血栓治療の臨床的試 みは恩恵を与える可能性のある時間的機会は狭い事（卒中発作の発症の最初数時 間以内）であるので、この事によって、ＰＭＮ付着の一番早い段階を妨害するよ うに戦略を設計すれば、ヒト卒中発作においては理論的には恩恵となるかもしれ ない。これらの試みは、結果的により初期の治療的介在を呈する患者数を増やし 、医学的に再血管形成された領域における灌流損傷問題に向ける必要性を増大さ せる。加えて、これらの試みによって、卒中発作の病因に対する個々の付着分子 の貢献を理解する事が急務となることが強調される。 虚血および再灌流^8、31-34の別のモデルにおけるp-セクレチンの役割を記載する 文献はかなりの分量あるが、驚いたことに卒中発作におけるＰ−セクレチンの役 割については少しも知られていない。大脳血管形におけるＰ−セクレチンの役割 について知る事は重要である。というのは、付着分子の要求が血管床間と研究下 にある条件とで相違するからである。例えば、腸移植³⁵のモデルでは、抗Ｐ−セ クレチン抗体は、再灌流損傷を減らす事はないが、抗CD11/CD18抗体は減らす。 Ｐ−セクレチン封鎖は、ラットの腸管膜虚血および再灌流モデルにおいてＰＭＮ 付着およびア ルブミン漏洩を減らすには効果がなかったけれども、ＩＣＡＭ−１封鎖は効果的 であった³⁶。ラットの後肢虚血／再灌流モデルにおいて、ＰＭＮ付着に対するセ クレチンの要求は肺および脚の筋肉血管床の間で相違していた³³。 虚血性脳においてＰセクレチンを扱っている唯一の研究は、霊長類の卒中発作を 組織病理学的に記載されているものである。そこではＰ−セクレチン発現はレン ズ核綿状体微細血管系で増加した¹⁰。更に、このＰ−セクレチン発現の機能的重 要性に向けたデータはなにもない。現在の研究は、Ｐ−セクレチンの発現が、再 灌流卒中発作のネズミモデルにおける虚血後大脳好中球の蓄積、無再流、組織損 傷に貢献するかどうかに付いて研究するために行われた。最近確立された、ネズ ミ¹¹における限局性大脳虚血および再灌流モデルを使用して、Ｐセクレチンの発 現が、放射活性標識された抗体の虚血領域への堆積が増加することで実証された 。この技法では、注入体積または分配体積における変異を最小化するためのみな らず、異なる抗体を与えた動物間での比較を可能とさせるためにも、各動物にお いて虚血性半球への抗体堆積を、非虚血性半球における蓄積に対して正規化した 。虚血性皮質における上皮バリア機能が破壊されると非選択性抗体の堆積が増大 するかもしれないので、コントロールのラットＩｇＧで同様の実験が行われた。 これらのデータによって、コントロールの抗体と比較して、Ｐセクレチンを結合 する抗体が、加速度的比率で堆積される事が示され、これによって局所的Ｐセク レチンの発現が再灌流組織において増大することが示唆されることになる。ネズ ミモデルにおけるこのデータは、虚血事象の後1時間以内にＰセクレチンの発現 が増大するというヒヒの卒中発作モデル¹⁰においての報告と平行している。 後虚血ゾーンに対するＰＭＮｓを補充する際のセクレチンの発現の役割は、^{11 1} Ｉｎで標識されたＰＭＮｓの蓄積を測定する戦略を利用して実証された。22時 間までは、ＰＭＮ蓄積は虚血性半球⁷で上昇したと先般報告されているが、現存 の経時データでによると、ＰＭＮの蓄積が虚血発症の僅か後に開始された事がわ かる。Ｐセクレチン遺伝子が発現しなかったことに伴ってＰＭＮ蓄積は減少する 。この事によって、虚血後の大脳ＰＭＮ補充におけるＰセクレチンが関与するこ とが示唆される。しかしな がら、Ｐセクレチンのない動物は、22時間までに控え目ながら（コントロールよ り低めではあるが）好中球の蓄積を示した。このデータによって、Ｐセクレチン が、虚血後の大脳ＰＭＮ補充に関与する排他的エフェクター機構ではないことを がわかるし、またＩＣＡＭ−１虚血後ＰＭＮ付着⁷に関与するという先のデータ とも一致する。更に、このデータは、Ｐセクレチン欠損マウスにおいてチオグリ コレートを腸内点滴すると、ＰＭＮ補充遅延⁹（しかし補充なしではない）を引 き起こすというデータとは異なることはない。 再灌流失敗の理由を特定する事が決定的に必要であるので、現研究では、遅延 虚血後大脳灌流減少、即ち適切なる灌流圧力の回復にも拘わらず再灌流の間、血 流が低下する現象、におけるＰセクレチンの役割を調査した^22、23。心臓虚血性 のモデルにおいては、再灌流³⁷後時間の経過と共に無再流はいっそう悪くなり、 この事によって、進行性微細循環性血栓、血管運動機能障害、およびPMN補充等 のエフェクター機構に対して重要な役割が示唆される。Ｐセクレチン依存性およ びＩＣＡＭ−１依存性の両付着反応³⁸およびＰＭＮ毛細血管血栓³⁹が他のモデル 中にもみられ、虚血後再流に関与する。脳においては、ＰＭＮｓは、虚血後大脳 無再流^40、41に関与していたが、この過程におけるＰセクレチンの働きについて は解明されていない。現研究では、相対的な無侵襲技法（レーザー・ドップラー ）を使用し、その存在、時間経過、および虚血後大脳血管無再流のＰセクレチン 依存性を確立するために、相対的大脳血流の連続測定値を得た。これらの実験で は、Ｐセクレチンのないの動物およびコントロール動物は実質的に同程度の虚血 に供され、管内閉塞縫合の除去後、二つのグループは同様の血流の瞬時回復を示 した。しかしながら、大脳血流は、Ｐセクレチン+/+動物において、再灌流後は 低下した。これと全く対照的に、PS-/-動物は、わずかに遅延した虚血後大脳潅 流減少のみを示した。22時間までのこの大脳血流の後期低下（限られてはいるが ）は、同し期間にわたってPS-/-動物で観察された控えめなＰＭＮ補充と一致し ている。これによってPS-/-動物における大脳血流における後期低下に他のエフ ェクター機構（ＩＣＡＭ−１等）が関与するかもしれない事が再び示唆される。 Ｐセクレチン発現の機能的効果は、現一組の研究から明らかである。Ｐセクレチ ン遺伝子の発現ができない動物(または抗Ｐセクレチン抗体を機能的にブロック して処置したPS+/+動物)は、閉塞が小さく、生存率の改善がみられ、また生存者 は、コントロールと比較して神経学的結果の改良を示した。これらのデータが、 卒中発作⁷におけるＩＣＡＭ−１発現に対する有毒な役割を明示している先に公 表されたデータに沿うものとみなされると、虚血後の大脳皮質に対してＰＭＮｓ を補充することに対して多数の手段がある事、また各々を封鎖することはヒトに おける卒中発作の結果を改善する可能性のある戦略である事がもっと明白となる 。卒中発作の後のニューロンの死滅の波面の進行を停止させるにおいて、タイム リーに再灌流を行なう事の重要性を現在認識したならば、その初期段階でPMN付 着を阻害する事ば、罹患率および死亡率を減らすための魅力的なオプションであ るようだ。実際、抗付着分子戦法は、それ自身の正当性（即ち、血栓崩壊につい ての不適格患者を含む）の点で有益のみならず、血栓崩壊介在⁴²に対する機会と いう手段をも差し伸べてもいる。現一組研究は、再灌流卒中発作に効力のある病 態生理学機構を理解することに貢献する。これらの研究によって、ＰＭＮ蓄積を 減らす灌流環境を至適化する卒中発作発生に対する治療法の臨床的試みを必要と している事が示唆される。 実施例５：Ｐ−セレクチン無しの同型接合体マウスは、病巣の脳虚血および再流 障害に耐性である 中枢神経系での局所虚血再灌流障害を強化する上での好中球（ＰＭＮｓ）の役 割は、問題が残る。血管系によってＰＭＮｓを循環させる捕捉での重要な初期段 階は、後虚血内皮に発現したＰ−セレクチンに向けられる。初期および継続的内 皮Ｐ−セレクチン発現は、ヒヒでは中大脳動脈閉塞を伴う脳微小血管系で記述さ れてきたが、脳卒中における内皮Ｐ−セレクチン発現の発生は、測定されていな い。脳卒中におけるＰ−セレクチンの役割を明確にするために、45分間、中大脳 動脈（ＭＣＡ）閉塞、続いて２２時間の再灌流から構成される局所脳虚血および 再灌流のネズミ・モデルを、Ｐ−セレクチンの無い同型接合体（ＰＳ−／−）と 、野生型従兄弟関係の対照（ＰＳ＋／＋）である２つのグループのマウスに使用 した。トリフェニルテトラゾリウムクロリドで染色し、そして同側半球での梗塞 組織の含有率として発現された面積計測した一連の薄片から脳梗塞容積を計算し た。神経学的成行きは、目隠しされた調査員によって観察される動物行動に基づ いた（１：欠陥なし;２：旋回;３：回転;４：静止）。同側性大脳皮質血流（Ｃ ＢＦ）を、レーザードップラー流量計によって測定し、そして対側性皮質ＣＢＦ の含有率として発現された。ＰＳ−／−マウスは、ＰＳ＋／＋対照と比較して梗 塞容積で３．８倍の減少を示した（７．６±４．４％対２９．２±１０．１％、 ｐ＜０．０５）。Ｐ−セレクチンを欠くマウスでの梗塞容積についてのこの減少 は、生存者が改善したことおよび生存者での神経学上の欠損を減少させる方向へ の傾向によって反映される。ＰＳ−／−コホートでの脳虚血症および再灌流を伴 う脳血流を増大させる傾向があった（６５±１１％対、対照の４６±１８％、ｐ ＝ＮＳ）ので、これらの研究は、Ｐ−セレクチン依存性接着が、大脳の逆流がな いことに寄与しうることを示唆する。一緒にして、これらのデータは、脳卒中の 病理学でＰ−セレクチン発現についての重要な役割に影響を与え、そして新規の 製薬学的攻略法が脳卒中の転帰を改善することを示唆する。実施例６： Ｐ−セレクチン遺伝子の不在が、再灌流された脳卒中のネズミのモデ ルでの後虚血性脳の好中球蓄積、逆流のないこと、および組織傷害を減少させる ヒトでの最近の研究は、初期の発症を伴う初期期間中の脳血流（ＣＢＦ）の再 樹立が神経学上の続発症を減少させることを示す。低酸素の内皮によって発現さ れる初期作用好中球（ＰＭＮ）接着分子であるＰ−セレクチン（ＰＳ）が、再灌 流された脳卒中に関与する上で重要な病態生理学上の役割を示す可能性があるこ とが仮定された。４５分間の内腔内中大脳動脈閉塞、続いて２２時間の再灌流か ら構成される一過性の局所脳虚血のネズミ・モデルで、一次の研究が行われた。 このモデルでは、ＰＳ遺伝子（ＰＳ−／−）を発現しないマウスは、野生型対照 （ＰＳ＋／＋）に比較して梗塞容積が小さくなり、神経学上の欠損スコアーが減 少し、そして生存率が改善したことを示す。最近の研究は、さらに、脳傷害のＰ Ｓ−誘導機構（類）を明確にするために行われた。手術前に¹²⁵Ｉ標識抗−ＰＳ ＩｇＧを付与されたＰＳ＋／＋マウスは、擬手術動物（ｎ＝６、ｐ＜０．００１ ）と、または非免疫ＩｇＧを示し、そして一過性の局所脳虚血そして３０分間の 再灌流にかけられた動物と比較によって、そして３０分の再灌流（ｎ＝４、ｐ＜ ０．０３）によって、同側半球で抗体の蓄積が２１６％多くなることを例示した 。ＰＳ＋／＋マウスでは、ＰＭＮｓの蓄積は、局所虚血症の開始を伴って初期に 始まり、そして再灌流の期間を通して持続する（２２時間までの同側／反対側半 球の¹¹¹Ｉｎ−ＰＭＮ蓄積で２倍の増加、Ｎ＝８、ｐ＜０．０５）。ＰＳ−／− マウスは、２２時間までの同側半球へのＰＭＮ蓄積で２５％減少を示した（ｎ＝ ７、ｐ＜０．０５）。後虚血性脳逆流なしでのＰＳ発現の影響を、脳卒中の進行 の間中同側のＣＢＦを連続して測定することによって調べた。基線、後期閉塞、 および初期再灌流ＣＢＦｓが同一であるが、３０分の再灌流でのＣＢＦｓは、Ｐ Ｓ＋／＋マウス（ｎ＝８、２．４倍大きい、ｐ＜０．０５）に比較して明らかに 大きいＰＳ−／−マウス（ｎ＝５）であった。この差異は、２２時間の再灌流期 間の残りの間維持された。これらのデータは、ＰＭＮ補充、後虚血性の逆流なし 、および進行性脳卒中での組織損傷でのＰＳの重要な初期の役割を支持する。こ れは、脳の再灌流傷害でのＰＳの病態生理学上の役割の最初の例示であり、それ は、ＰＳ遮断薬が、再灌流脳卒中の治療のための治療上の標的を表すかもしれな いことを示唆する。実施例７： 一酸化炭素および進行性脳卒中 ヘム異化の毒性副産物である一酸化炭素ガスは、中枢神経系での長期強化およ び記憶に関与される。しかし、脳でのＣＯ生成についての他の生理学上の役割は 、知られていない。ヘムオキシゲナーゼが、炎症症状中に誘導されるので、内因 性ＣＯ生成が、脳卒中での脳の保護的役割に供しうるかどうかが調べられた。局 所脳虚皿のネズミ・モデルでは、ヘムオキシゲナーゼＩ型は、ｍＲＮＡ（ノーザ ンブロットにより）およびタンパク質レベル（ウエスタンブロットにより）で導 入され、インスティ・ハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学によって虚血 性半球での脳血管内皮に局在化された。直接測定法によるＣＯの局所生成が、虚 血性領域で観察された。平行した実験では、低酸素環境にさらされたネズミの脳 の内皮細胞は、ヘムオキシゲナーゼｍＲＮＡ、タンパク質およびＣＯ生成の同様 の導入を例示した。ＣＯ生成が、脳卒中の病態生理学に起こりがちかどうかを測 定するために、スズ・プロトプルフィリン投与によってＣＯ生成を遮断した（減 少した局所ＣＯレベルの直接測定法によって確認される）。これらの動物は、未 処置対照と比較して、梗塞容積が明らかに大きく、神経学上の転帰が悪く、およ び死亡率が上昇することを示した。さらに、脳卒中の前のＣＯの投与は、目立っ た脳保護を洪した。ヘム異化の同時副産物であるビリベルジンで処置した動物に は、この保護は観察されなかったので、これらのデータは、内因性ＣＯ生成が本 質的に進行性脳卒中で保護的役割を示すことを示唆する。導入 文献の考慮すべき本文および、酸素移送を阻害し、細胞の呼吸を毒性にする、 ヘム中心に食欲に結合する内因性一酸化炭素（ＣＯ）の毒性効果の一般的認識が ある。長年の間、ＣＯは、ヘム異化の偶発的副産物であると考えられたが、脳に おける最近のデータは、ヘムオキシゲナーゼＩＩによって別個の神経単位で生成 されたＣＯは、長期的増強作用を増強しうることを示唆する。ラットでは、熱シ ョックにさらすことは、脳を含めた数種の臓器で３２ｋＤａの熱ショックタンパ ク質（ヘゲナーゼＩ）の発現との相互関係が証明された。このＨＳＰ３２導入の 生理学的有為性は、目的論的に、ヘムオキシゲナーゼＩ（ＨＯＩ）によってＣＯ の化学量論的遊離の結果だとされてきた。ほとんどの実験的研究では、ＨＯＩ導 入は、細胞酸素圧の偶発的標識としてのみ働く。腹膜炎症のモデルでのＨＯＩの 抗炎症の役割の最近の確認は、ヘム異化の過程の間の自然の抗酸化剤ビ リベルジンの生成の結果だとされた。 最近の研究は、後虚血性の脳は多量のＣＯを発生することを初めて報告してい る。中大脳動脈が、内腔内縫合によって閉塞された、局所脳虚血症のネズミ・モ デルを使用して、虚血半球でのＨＯＩ生成は、非虚血半球に比較して、際立って 増加した。免疫組織化学およびインスティ・ハイブリダイゼーションが、ＨＯＩ の源を虚血半球内の内皮細胞に局在化させるので、細胞低酸素症のインビトロ・ モデルを使用して、ネズミの脳微小血管の内皮細胞でのＨＯＩメッセージの誘導 、タンパク質および活性を確認した。スズまたは亜鉛プロトポルフィリンＩＸを 使用したＣＯ生成の遮断薬は、脳梗塞容積および死亡率での増加に関連するのに 対して、虚血症の直前に動物をＣＯに曝させることは、狭い治療窓内で際立った 用量依存性の脳保護を供された。ビリベルジン投与が、このモデルで効果がない 。一緒にして、これらのデータは、虚血性脳組織が、大量のＣＯを生成し、その 生成が、脳卒中の間に破壊される組織の量を制限する脳保護を供することを示す 。方法 プロトポルフィリン製造および投与。スズ・プロトポルフィリンＩＸジクロリ ド（２０ｍｇ、ユダ州、ローガン（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）のポルフィリン・プロダ クツ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））、亜鉛プロトポルフィリンＩ Ｘ（１７ｍｇ、ユダ州、ローガン（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）のポルフィリン・プロダ クツ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））、またはビリベルベルジン（ １８ｍｇ、ユダ州、ローガン（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）のポルフィリン・プロダクツ （Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））を、最初に、スルホン酸ジメチル （２ｍＬ）に溶解させた。アリコート量のこの溶液（２００μＬ）を、正常な生 理食塩水（９．８ｍＬ）に添加し、そしてこの混合液を、激しく旋回させて、プ ロトポルフィリンの２．７×１０^-4Ｍ溶液を得た。その溶液の容器を、アルミホ イルで覆って、プロトポルフィリンの光分解を予防し、そして使用されるまで４ ℃で保存した。 微細浸透性ポンプ（番号１００３Ｄ、カリフォルニア州パロアルト（Palo Alt o,CA）のアルザ・コープ（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．））を、このプロトポルフィリ ン溶液（９１μＬ／ポンプ）にかけ、そして手術の開始の２４時間前に、１ｃｍ の 背正中線切開を介して麻酔したマウスに皮下に移植した。これらのポンプは、０ ．９５±０．０２μＬ／時間の比率で薬剤溶液を投与する。手術の時に、内腔内 咬合カテーテルの挿入前に、追加の用量のプロトポルフィリン溶液を投与した（ ０．３ｍＬ、静脈内）。各動物は、その研究のコースを通して、以下の総（注射 ＋ポンプ）薬剤量：スズ・プロトポルフィリン（０．０７０ｍｇ）、亜鉛プロト ポルフィリン（０．０５９ｍｇ）、またはビリベルジン（０．０６１ｍｇ）を受 けた。実施例８： 低酸素症または遊離ラジカルは、それが再灌流中の好中球（ＰＭＮ）接着に関 与する場所である、内皮細胞（ＥＣ）表面へのＰ−セレクチン（ＰＳ）転位を誘 導する。それによりニトロ血管拡張剤が、後虚血性白血球腐骨形成を弱める機構 を探すために、我々は、ＮＯ／ｃＧＭＰ経路を刺激することが、低酸素性ヒト臍 帯静脈ＥＣｓでの表面ＰＳ発現を弱めうるかどうかを試験した。低酸素症にさら されたＥＣｓ（４時間ｐ０２＜２０トル）は、放射性標識抗−ＰＳ抗体の特異的 結合によって測定され、表面ＰＳ発現（Ｐ＜０．０００１）で８０％増加するの に平行して、νＷＦ放出（ｐ＜０．００５）（νＷＦは、ＰＳで包装される）に おいて５０％増加を示した。同様の条件下で、ＮＯ供与体３−モルフォリノシド ノニミン（ＳＩＮ−１、０．１ｍＭ）またはｃＧＭＰ類似８−ブロモ−ｃＧＭＰ （ｃＧＭＰ、１０ｎＭ）を添加して、νＷＦ放出に減少を起させた；対照νＷＦ 、１１±０．４ｍＵ／ｍＬ；ＳＩＮ−１、９．１±０．３ｍＵ／ｍＬ；ｃＧＭＰ 、９．７±０．２ｍＵ／ｍＬ；ＳＩＮ−１またはｃＧＭＰ対対照の両方について ｐ＜０．００５。対照と比較して、ＳＩＮ−１またはｃＧＭＰも、表面ＰＳ発現 を減少させた（それぞれ４０％および４８％減少、各々についてｐ＜０．００５ ）。免疫蛍光接着アッセイを用いて、ＳＩＮ−１およびｃＧＭＰの両方が、低酸 素症ＨＵＶＥＣｓに結合するＨＬ６０を減少させた（対照に対して５３％および ８６％減少、各々についてｐ＜０．０５）。フラ−２蛍光の測定は、低酸素症が 、細胞内カルシウム濃度[Ｃａｌ]を増加させること、そして増加[Ｃａｌ]が、ｃ ＧＭＰによって遮断されうることを示した。ＳＩＮ−１またはｃＧＭＰのいずれ もが、さらに、ＥＣｓがカルシウム不含の培地に載せられた場合にＰＳ発現を減 少させ得ない。これらのデータは、ＮＯ／ｃＧＭＰ経路の刺激が、ＥＣｓ中のカ ル シウム還流を阻害することによってＰＳ発現を阻害し、そして重要な機構として この阻害を確認し、それによってニトロ血管拡張剤が、後虚血性組織でＰＭＮ結 合を減少させる可能性があることを示唆する。実施例９：因子ＩＸａｉ 因子ＩＸは、ヒトおよび他の哺乳類に存在する凝集因子であり、そして凝集経 路の重要な部分である。凝集の正常な反応図式では、因子ＩＸは、因子ＸＩａま たは組織因子／ＶＩＩ複合体のいずれかによってその活性形態である因子ＩＸａ に活性化される。その後、因子ＩＸａは、凝集カスケードの最終部分を引起こし て、血栓を導く因子Ｘを活性化できる。因子Ｘが、２つの経路、外因性（ＶＩＩ ａ／組織因子を介して）または内因性経路（因子ＩＸａを介して）のいずれかの 内の１つによって活性化されうるので、我々は、因子ＩＸａを阻害することで、 止血のある種の形態を欠陥を引起こす可能性があるが、組織傷害の無損傷に対応 して止血したままにするという仮説を立てた。言換えれば、ある種の型の凝集の 遮断薬を引起こしうるが、しかし、過剰のまたは歓迎されない出血を引起こす可 能性はない。因子ＩＸａｉは、化学的に修飾されてさらに因子ＩＸａ（したがっ て、生来の因子ＩＸａと競合できる）に類似するが、その活性を欠く因子ＩＸで ある。これは、凝集の正常な因子ＩＸａ−依存性経路の競合阻害を「壊滅」また は引起こしうる。因子ＩＸａは、内皮および血小板、そしておそらく他の部位に 結合して、それにより因子ＩＸａの活性を遮断することは、因子ＩＸａの結合に 干渉する薬剤を投与することによって（または因子ＩＸの活性化に干渉すること によって）も可能でありうる。 脳卒中および他の虚血性疾患では、存在する血栓を溶かすことによって誘導さ れる臨床的利益がありえるが、出血を潜在的に圧倒する合併症もある。本実験で は、脳虚血症および再灌流（脳卒中）のマウスモデルを使用した。マウスは、手 術直前に３００μｇ／ｋｇの因子ＩＸａｉの静脈内・ボラスを受けた。脳卒中は 、右中大脳動脈の内膜内閉塞によって創り出された。脳卒中の結果が２４時間後 に測定された時に、因子ＩＸａｉを受けた動物は、同じ手術を行ったが、因子Ｉ Ｘａｉを受けなかった対照と比較して梗塞容積が小さくなり、脳灌流が改善され 、神経学上の欠損は少なくなり、そして死亡率が減少した。因子ＩＸａｉ動物は 、 見掛けの脳内出血から開放されていることも記述された。対称的に、脳内出血は 、因子ＩＸａｉを受けていない対照動物で時折記述された。 実施例１０：Ｐ−セレクチン遺伝子を発現するマウスでの脳傷害の悪化：脳卒中 を治療するための新たな標的としてのＰ−セレクチン遮断薬の確認 要約： 最近、進行性脳卒中の治療に効果のないスターク治療がある。Ｐ−セレクチン は、インビトロで低酸素症の内皮細胞によって迅速に発現されるが、脳卒中での Ｐ−セレクチン発現の機能上の意義は、未捜査のままである。Ｐ−セレクチン発 現の病態生理学上の結果を確認し、そして脳卒中を治療するための強力な新規ア プローチ法としてＰ−セレクチン遮断薬を確認するために、局所脳虚血症および 再灌流のネズミモデルを使用して、実験を行った。後虚血性大脳脂質での初期Ｐ −セレクチン発現は、免疫組織化学によって同側の脳微細血管内皮細胞に局在化 されたＰ−セレクチン発現を増加させながら、放射性標識の抗−ネズミＰ−セレ クチンＩｇＧの特異的蓄積によって示される。脳卒中でＰ−セレクチン発現が増 加することの機能上の意義を試験するために計画された実験で、Ｐ−セレクチン 遺伝子（ＰＳ＋／＋）を発現するマウスの虚血性皮質での好中球蓄積は、同型接 合体のＰ−セレクチン無しのマウス（ＰＳ−／−）でのものより際立って大きい ことが示された。ＰＳ−／−マウスでの大きな後期虚血性大脳逆流（レーザード ップラーによって測定した）によって好中球流入の減少を伴った。さらに、ＰＳ −／−マウスは、ＰＳ＋／＋マウス（８８％対４４％、ｐ＜０．０５）と比較し て梗塞容積がより小さいこと（5倍減少、ｐ＜０．０５）そして生存率が改善さ れることを示した。ネズミＰ−セレクチンに指向されたモノクローナル抗体を用 いたＰＳ＋／＋マウスでのＰ−レクチンの機能的遮断薬は、中大脳動脈の閉塞後 に、遮断抗体が投与された時でさえ表された脳梗塞容積を減少させながら、対照 と比較して初期逆流および脳卒中の結果も改善した。これらのデータは、脳卒中 でのＰ−セレクチンの病態生理学的役割を示す最初のもので、そしてＰ−セレク チン遮断薬が、脳卒中を治療するための新規な治療標的を表しうることを示唆す る。 導入： 虚血性脳卒中は、今日、米国での第三の死因を構成する¹。ごく最近まで、進 行性脳卒中での脳組織損傷を減少させる直接的治療はなかった。ＮＩＮＤＳ²お よびＥＣＡＳＳ³ｒｔ−ＰＡ³⁺急性脳卒中研究は、初期再灌流⁴の潜在的な治療利 益があることを示唆したが、急性虚血性脳卒中⁵のストレプトキナーゼ処置に続 いて観察される死亡率が増加することは、進行性脳卒中に現時点で明かに効果的 な治療法はないというありのままの事実を強調する。脳卒中の治療のための最近 の医療施設に効果のないこのことは、多数の革新的なアプローチ法⁶を導いたが 、ｒｔ−ＰＡ以外、医療領域に達したものはない。進行性脳卒中の潜在的安全性 および効き目のある治療を確認するために、我々は、補充された好中球の心身に 有害な役割に焦点を当てた。再灌流脳卒中のネズミモデルでの最近の研究は、脳 卒中前の好中球（ＰＭＮｓ）の消耗は、脳組織傷害を最小限にし、そして機能上 の転帰を改善することを示した⁷。特異的細胞接着分子、ＩＣＡＭ−１を欠くマ ウスは、同様に保護される⁷。前形成された保存部位⁸から低酸素性内皮表面に迅 速に転移できた分子Ｐ−セレクチンは、ＩＣＡＭ−１−指向性好中球停止状態を 促進する好中球ローリング⁹の重要な初期メディエーターである。Ｐ−セレクチ ンは、霊長類の脳卒中¹⁰で発現されるが、脳卒中でのＰ−セレクチン発現の機能 上の意義は知られていないままである。 脳卒中でのＰ−セレクチンの病態生理学上の役割を捜すために、我々は、野生 型マウスおよびＰ−セレクチン遺伝子⁹の無い同型接合体であるマウスの両方、 そして機能的に遮断するＰ−セレクチン抗体を投与する攻略法を利用して、局所 脳虚血症および再灌流¹¹のネズミモデルを使用した。これらの研究で、我々は、 中大脳動脈閉塞を伴うＰ−セレクチン発現が、再灌流を伴う脳の逆流が減少する こと、および脳卒中を伴う結果が悪くなることに関連しているのみならず、Ｐ− セレクチン遮断薬が、後虚血性大脳保護の目立った程度を供することを確認する 。これらの研究は、脳卒中でのＰ−セレクチン発現の病態生理学上の役割の最初 の例示を表し、そして抗−Ｐ−セレクチン攻略法が、再灌流脳卒中を治療するの に有用であることを立証しうる刺激的な可能性を示唆する。方法 ： マウス：Ｊ１胚幹細胞中で標的を追う遺伝子によって先に報告⁹されたとおり 造られ、Ｃ５７ＢＬ／６芽細胞に注入して生殖細胞系の伝達を得、そして戻し交 雑させてＰ−セレクチン無しの同型接合体マウス（ＰＳ−／−）を得たトランス ジェニックＰ−セレクチン欠損マウスで、実験を行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウ スとの戻し交雑の第三世代から得たＰＳ−／−または野生型（ＰＳ＋／＋）の従 兄弟関係のマウスを用いて実験を行った。動物は、７から１２週の年齢であり、 実験期間中２５−３６グラムの間の重量であった。脳血管の解剖学での変種は、 マウスでの実験的脳卒中に対する罹病率に差異を生じることが報告されている¹² ので、墨／カーボンブラック染色を行って、ＰＳ−／−およびＰＳ＋／＋マウス の両方でのウイリス（Ｗｉｌｌｉｓ）の循環の血管パターンを可視化させた。こ れらの実験は、脳循環の血管パターンに総体的な解剖学上の差異がないことを示 した。一過性中大脳動脈閉塞 ：マウスを麻酔（１０ｍｇ／ｃｃケタミンおよび０．５ｍ ｇ／ｃｃキシラジンの０．３ｃｃ、腹腔内）し、そして直腸の温度制御操作表面 （イエロー・スプリングス・インストルメンツ，インク．（Yellow Springs Ins truments，Inc.）、オハイオ州、イエロー・スプリングス（Yellow Springs,OH ））上の仰臥で位置決めした。動物核温度は、手術中にそして手術後に９０分間 は３７±１℃に維持した。正中線の首の閉塞は、手術中の顕微鏡（１６−２５× ズーム、ニューヨーク州ソルンウッド(Thornwood，NY)のツェズ（Zeiss））下 で右の頚動脈鞘を露出するように造られた。共通の頚動脈鞘動脈は、４−０シル クで単離し、そして後頭部の、翼突口蓋の、そして外部の頚動脈をそれぞれ分離 して、分割した。外部頚動脈断端を介して１３ｍｍの加熱平滑化５−０ナイロン 縫合を前進させることによって、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を完了した。閉塞 縫合を行った後、外部の頚動脈断端を焼灼し、そして傷を塞いだ。４５分後、閉 塞している縫合を解いて、再灌流を確保した。これらの手段は、先に詳細に記載 されている¹¹。大脳脂質の血流の測定 ：先に記述されるとおり¹³、レーザードップラー（ニュー ジャージー州ピスケイタウエイ（Piscataway,NJ）のペリメド・インク（Perimed Inc.））を使用して脳血流のＸ線像測定を行った。０．７ｍｍの直線レーザー ドップラープローブ（モデル番号PF303、ニュージャージー州ピスケイタウエイ （Piscataway,NJ）のペリメド・インク．（Perimed Inc.））および先に公表さ れた標識点（プレグマに後方２ｍｍ、正中線の各側面に６ｍｍ）を用いて、示さ れるとおり、麻酔直後に、中大脳動脈の閉塞の１分後と１０分後、並びに再灌流 の３０分、３００分、および２２時間後、関連の脳血流測定を行った。データは 、非虚血半球と比較した虚血のドップラー信号強度の比として表される。この方 法は、組織１グラム当たりの脳血流を定量しないが、正確に明確にされた解剖学 的境界線でのレーザードップラー・流測定法を使用することは、時間中に連続し て同一動物での脳血流を構成する手段として働く。手術手段は、相対的な脳血流 での５０％以上の減少が内腔内閉塞縫合の配置を伴って直ちに観察される場合、 技術的に適切であると考えられた。これらの方法は、先の研究で使用された^7,11 。１２５Ｉ−標識タンパク質および¹¹¹In−標識ネズミの好中球の製造および投与 放射性ヨウ化抗体を、以下のとおり製造した。モノクローナルのラット抗−ネ ズミＰ-セレクチンＩｇＧ（クローン（Ｃｌｏｎｅ）ＲＢ４０．３４、カリフォ ルニア州サンディエゴのファルミンゲン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｃｏ．））^{1 4} および非−免疫ラットＩｇＧ（ミズーリー州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ，ＭＯ）のシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．））を、 エンチモビーズ（カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のバ イ オーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用いてラクトペルオキシダーゼ法¹⁵によって¹²⁵ Ｉで放射性標識した。放射性標識ＰＭＮｓを、以下の方法で製造した。野生 型マウスから得たクエン酸化血液を、ＮａＣｌ（０．９％）で１：１に希釈し、 続いてフィコール−ハイパック（Ficoll−Hypaque）(ニュージャージー州ピスケ イタウエイ(Piscataway，NJ)のファルマシア（Pharmacia）)で勾配超遠心分離を 行った。残りの赤血球の低張性溶解（蒸留Ｈ₂Ｏに２０秒露出し、続いて１．８ ％ＮａＣｌで再構成させた）に続いて、ＰＭＮｓを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS )に懸濁させた。好中球（５−７．５×１０⁶）を、１００μＣｉの¹¹¹インジウ ムオキシン（ニューヨーク州ポルトワシントン(Port Washington)のアマシャム ・メジフィジックス（Amersham Mediphysics））でＰＢＳに懸濁させ、そして１ ５分間、３７℃で穏やかに曝気させた。ＰＢＳで洗浄した後、PMNsを、穏やかに ペレット化し（４５０×ｇ）、そして１．０×１０⁶細胞／ｍＬの最終濃度まで ＰＢＳに再懸濁した。梗塞容積の計算 ：神経学上の実験後、マウスを麻酔し、そして最終の脳血流測定 を得た。断頭によってヒューマン（Humane）の安楽死が行われ、そして脳を取除 き、そして１ｍｍ薄片に切るためにマウス脳マトリックス（ミシガン州ワレン( Ｗａｒｒｅｎ，ＭＩ)のアクチベイショナル・システムズ社(Ａｃｔｉｖａｔｉｏ ｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ)）に載せた。薄片を、０．９％リン酸緩衝生理 食塩水中の２％の２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロリド（ ＴＴＣ、ミズーリー州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ・ケミ カル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．））に浸し、３０分間、３７℃で インキュベートし、そして１０％ホルマリン¹⁶の中に置いた。梗塞した脳を、未 染色組織の領域として可視化させた。梗塞容積を、面積計で測定した一連の画分 から計算し、そして同側の半球での梗塞の含有率として表された。梗塞容積を計 算するこの方法は、我々のグループ^7、11および他者^16、17によって先に使用され 、そして上に記載される脳卒中の転帰の他の関数の指数と相互に関連した。未標識抗体、放射性標識ＰＭＮｓ、および放射性標識抗体の投与 ：未標識抗体が 投与された実験については、２つの異なる抗体型の内の１つを使用した；遮断モ ノクローナルラット抗−ネズミＰ−セレクチンＩｇＧ（クローン（Ｃｌｏｎｅ） ＲＢ４０．３４、カリフォルニア州サンディエゴのファルミンゲン社（Ｐｈａｒ ｍｉｎｇｅｎ Ｃｏ．））^14、18、19または非−免疫ラットＩｇＧ（ミズーリー州 セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．））のいずれか。０．１％ウシ血清アルブミンを含有 する０．２ｍＬリン酸緩衝生理食塩水中３０μｇとして抗体を製造し、その後、 中大脳動脈閉塞の１０分前に陰茎静脈に投与した。別個の実験で、放射性標識抗 体(０．１５ｍＬ、２．６×１０⁵ｃｐｍ／μＬ)を、中大脳動脈閉塞の１０分前 に静脈に注射した。第三組の実験では、１００μＬ注射（放射性標識ＰＭＮｓを 、０１５ｍＬの総量まで生理学的食塩水と混合した；３×１０⁶ｃｐｍ／μＬ） 時に、放射性標識ＰＭＮｓを、中大脳動脈閉塞の１０分前に静脈に注射した。未 標識抗体を投与した実験では、測定が行われた時は、脳血流、梗塞容積および死 亡率を決定するために上に記載された方法を用いて、テキストに示される。放射 性標識抗体または放射性標識ＰＭＮｓのいずれかを投与したそれらの実験につい ては、マウスを指定の時点で犠牲にし、そして脳を直ちに取出し、そして同側（ 後部虚血性）および対側半球に分割した。放射性標識抗体または好中球の沈澱が 測定され、そして同側／対側のｃｐｍとして表現される。免疫組織化学 ：脳を、中大脳動脈閉塞を伴う１時間で取出し、１０％ホルマリン で固定し、パラフィン埋設し、そして免疫組織化学のために薄片に切り分けた。 切片をアフィニティー精製ポリクローナルラビット抗−ヒトＰ−セレクチン抗体 （１：２５希釈、カリフォルニア州サンディエゴのファルミンケン社（Ｐｈａｒ ｍｉｎｇｅｎ Ｃｏ．））で染色し、そして一次抗体結合の部位を、エキストラ アビジンペルオキシダーゼ（ExtrAvidin peroxidase）（ミズーリー州セントル イス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ Ｃｏ．））で検出したビオチン−接合ヒツジ抗−ウサギＩｇＧ（１： ２０）を用いて可視化した。データ解析: 脳血流、梗塞容積、および¹¹¹Ｉｎ−ＰＭＮ沈澱を、対になっていな い変化量についてスチューデンツｔ−試験を用いて比較した。２つのグループ（ 実験対擬）の間の基線および最終（３０分）抗体沈澱の間の目立った差異につい て試験する２つの方法のANOVAを行った。グループ内の差異（基線対３０分の 時点）を評価するために、対になっていない変化量についてのスチューデンツｔ −試験を行った。グループ間の数種の差異を、Ｃｈｉ−平方統計学で付随の解析 を使用して試験した。量は、統計学的に意義のあると考えられるｐ値＜０．０５ と一緒に、平均±SEMとして表される。 結果：ネズミの脳卒中でのP−セレクチン発現 ：Ｐ−セレクチンが、活性化内皮細胞²⁰ への白血球接着の初期を指向するので、我々は、再灌流脳卒中のネズミのモデル での初期脳Ｐ−セレクチン発現を試験した。手術前に¹²⁵Ｉ−標識ラットモノク ローナル抗−ネズミＰ−セレクチンＩｇＧを示したマウスは、擬手術動物（ｐ＜ ０．００１、図３１Ａ）と比較した３０分の再灌流で、抗体の蓄積において２１ ６％増加を示した。再灌流された半球でのこの程度の抗体沈澱が、非特異的蓄積 よりむしろＰ−セレクチン発現に依ったことを示すために、¹²⁵Ｉ−標識ラット 非免疫ＩｇＧを示した同一に処理した動物で比較を行った。これらの実験は、非 免疫ＩｇＧ（ｐ＜０．０２５、図３１Ａ）より明かに大きな蓄積の抗−Ｐ−セレ クチンＩｇＧがあることを示し、それによりＰ−セレクチンが３０分の再灌流内 に脳で発現されることを示唆する。Ｐ−セレクチンについて免疫染色された脳組 織の薄片の試験は、Ｐ−セレクチン発現が、同側の大脳脂質での微小血管内皮細 胞に一次的に局在化していることを示す（図３１Ｂ）。ネズミの脳卒中における好中球蓄積 ：ＰＭＮ流入が脳卒中を伴って起こる間の時 間コースを詳細に描写するために、¹¹¹Ｉｎ−標識ＰＭＮ蓄積を、ＭＣＡＯの前 、ＭＣＡＯの直後、および１０分後に、そして再灌流の３０分、３００分および ２２時間目に野生型（ＰＳ＋／＋）マウスで測定した。ＰＳ＋／＋マウスでは、 ＰＭＮｓの蓄積は、局所虚血症の開始を伴って初期に始まり、そして再灌流の期 間中継続する（図３１Ｃ）。この後虚血性好中球蓄積におけるＰ−セレクチンの 役割を確認するために、Ｐ−セレクチン遺伝子（ＰＳ−／−）無しの同型接合体 であるマウスを使用して、実験を行った。ＰＳ−／−マウスは、中大脳動脈閉塞 および再灌流を伴うＰＭＮ蓄積が明かに減少することを示した（図３１Ｂ）。脳血管逆流なしのＰ−セレクチンの役割 ：ＰＳ−／−マウスでＰＭＮ蓄積での減 少が、流れの再樹立を伴う脳血流が改善される結果になるかどうかを決定するた めに、相対的ＣＢＦの一連の測定が、ＰＳ＋／＋およびＰＳ−／−マウスの両方 でレーザードップラーによって得られた。虚血症の開始前（図３２、点ａ）に、 相対的脳血流は、グループ間でほどんど同一であった。中大脳動脈閉塞（図３２ 、点ｂ）は、両方のグループでの脳血流中でほとんど同一の１滴に関連した。４ ５分の虚血症での内腔内閉塞縫合（図３２、点ｃ）を中止する直前に、それらが 、基線流と比較して明らかに抑制が残るが、脳血流は、わずかに上昇した。再灌 流を開始する閉塞縫合（図３２、点ｄ）を中止する直前に、両グループでの脳血 流は、比較しうる程度（ＰＳ−／−およびＰＳ＋／＋マウスでの基線の６０％） に増加した。前閉塞レベルに達する後期再灌流の脳血流の即座の不全は、遅延後 期虚血性脳低再灌流²²を表す後期再灌流の脳血流における連続減少を伴う、脳血 管逆流なし²¹の特徴である。３０分の再灌流（図３２、点ｅ）までに、２つのグ ループの動物の間の脳血流は、ＰＳ＋／＋対照（ｐ＜０．０５）（図３２、点ｆ ）より明かに大きな相対的脳血流を示すＰＳ−／−動物と異なる。この相違は、 遅延後虚血性脳低灌流での目立った差異に反映し、そして２２時間観察期間持続 した。脳卒中転帰 ：Ｐ−セレクチン発現の機能上の意義は、ＰＳ−／−マウスでの脳卒 中転帰の指数をＰＳ＋／＋マウスでのものと比較することによって試験した。Ｐ −セレクチン＋／＋対照（図３３Ａ）と比較した梗塞容積（ｐ＜０．０１）での ７７％減少に基づいて、ＰＳ−／−マウスは、局所脳虚血症および再灌流の効果 から明らかに保護された。梗塞容積でのこの減少は、ＰＳ−／−動物での生存者 が増加したことを伴った（ｐ＜０．０５、図３３Ｂ）。Ｐ−セレクチン遮断薬の効果 ：欠失で突然変異したマウスを使用して、脳卒中に おけるＰ−セレクチン発現の機能上の役割を観察した後、Ｐ−セレクチンの製薬 学上の遮断薬が、ＰＳ＋／＋マウスでの脳卒中の転帰を改善できるかどうかを測 定するために実験を行った。手術直前に機能的に遮断するモノクローナルラット 抗−マウスＰ−セレクチン抗体（クローンＲＢ４０．３４^14、18、19）または非免 疫対照ラットＩｇＧを投与する攻略法を用いて、中大脳動脈閉塞の直前に遮断抗 体を受けたマウスは、脳梗塞容積を減少させ、そして対照に比較して死亡率が減 少する方向への傾向と同様に、３０分までに後期再灌流血流を改善させたこと が観察された（図３４、最も左の６つの棒線）。脳卒中の新しい治療法としてＰ −セレクチン遮断薬の攻略法の潜在的な臨床関連を増すために、対照または遮断 抗体のいずれが、中大脳動脈の内腔内閉塞後に示されるかの追試を行った（ほと んどの患者が、脳卒中の発症を伴って存在するので）。これらの研究では、梗塞 容積での明らかな減少が、脳血流が改善される方向への傾向と同様に観察された （図３４、最も右の６つの棒線）。 検討： 脳卒中の一次的予防での近年での維持された進行の代わりに¹、進行性脳卒中 を治療する治療的別法は、極端に制限されたままである。ｒｔ−ＰＡでの虚血性 脳卒中の治療に伴う死亡率が減少することを示している昨秋の２つの際立った治 験の出版物^2、3は、脳卒中の治療での血栓治療の新時代の先駆者と考えられた⁴が 、その熱意は、出血性形質転換、そしてストレプトキナーゼで治療した虚血性脳 卒中を示す患者に示される死亡率が上昇したことによって幾分減退した⁵。これ らの相違する治験は、新規で安全な療法が、進行性脳卒中を治療するために開発 されることをいままでよりいっそう重大にする。後虚血脳への血流の回復は、初 期治療介入の新たな機会を供するが、再灌流は、両刃の剣である。細胞毒潜在性 の好中球²³が示されると、後虚血性脳組織への好中球流入が、実験的脳卒中に伴 ってさらなる損傷および悪化の転帰を導きうる^7、24-27ということには驚かされ ない。局所脳虚血症および再灌流のネズミ・モデルを用いて、我々は、最近、脳 卒中に続く２２時間に、好中球蓄積における細胞接着分子ＩＣＡＭ−１の重要な 貢献的役割を確認した⁷。しかし、増大する脳血管内皮ＩＣＡＭ−１発現は、時 間を要するデノボ（新規）の転写および翻訳事象を必要とする。対称的に、最も 初期の好中球接着を指向する膜伸縮糖タンパクであるＰ−セレクチンは、虚血性 内皮細胞表面に迅速に発現されるべき前形成保存プールから移動できる^8、28。脳 卒中の血栓治療の臨床治験が、潜在的利益について狭い時間枠（脳卒中の発症の 最初の数時間以内）を示す^2、3、5とき、これは、ＰＭＮ接着の最も早期に干渉す るように設計された攻略法が、ヒトの脳卒中で理論的な利益のあるものである可 能性がある。これらの治験は、初期治療の介入を表す多数の患者を生じるにちが いなく、それにより医療的に血管を移植された領域での再灌流傷害の問題と取 組む必要が増す。さらに、それらは、脳卒中の病原論に対する個々の接着分子の 貢献を理解するのに緊急の必要を強調する。 虚血症および再灌流の他のモデルでのＰ−セレクチンの役割を記述する文献の 考慮しうる本文^8、29-32を示して、脳卒中のでＰ−セレクチンの役割については 驚くほどほとんど知られていない。接着分子の必要性が、研究中の血管床と症状 の間で変化するので、脳血管でのＰ−セレクチンの特定の役割についての知識は 重要である。例えば、腸移植のモデル³³で、抗−Ｐ−セレクチン抗体は、再灌流 傷害を減少させなかった一方で、抗−ＣＤ１１／ＣＤ１８抗体は減少した。Ｐ− セレクチン遮断薬は、ラットの腸間膜の虚血症および再灌流モデルでのＰＭＮ接 着およびアルブミン漏れを減少させるのに効果的でなかったが、ＩＣＡＭ−１の 遮断薬は有効であった³⁴。ラットの後足の虚血症／再灌流モデルでは、ＰＭＮ接 着についてのセレクチン要求は、肺および脚の筋肉血管床の間で異なった³¹。 我々の知識に関して、虚血性脳でのＰ−セレクチン発現が増加されることを記 述する唯一の公表された研究は、Ｐ−セレクチン発現が、レンズ核線状体の微小 血管系で増大されたという霊長類の脳卒中の組織病理学上の説明である¹⁰。最近 の研究は、Ｐ−セレクチン発現が、再灌流脳卒中のネズミ・モデルでの後期虚血 性脳の好中球蓄積、逆流なし、および組織損傷に寄与するかどうかを研究するこ とを企てた。マウスでの局所脳虚血症および再灌流の最近確立されたモデルを用 いて、Ｐ−セレクチン発現は、虚血性領域での内皮免疫染色が増加し、そして放 射性標識抗体の沈澱が増加することによって示された。後者の技術では、虚血性 牛球への抗体沈澱は、各動物での非虚血性半球でのものに正常化されて、注射容 量または分配の量での潜在的変量を最小限にするためのみならず、様々な抗体を 与えられた動物の間の比較を可能にした。虚血性皮質での内皮バリヤー機能の崩 壊は、非選択的抗体の沈澱を増大させるので、類似の実験が、対照ラットＩｇＧ で行われた。これらのデータは、Ｐ−セレクチンに結合する抗体が、対照抗体と 比較して加速した速度で沈澱することを示し、それにより局所Ｐ−セレクチン発 現が、再灌流組織で増大されたことを示唆する。ネズミモデルでのこのデータは 、Ｐ−セレクチン発現が、虚血性事象を伴って１時間以内に増加される、脳卒中 のヒヒ・モデルで報告されたことと並行する。後期虚血性ゾーンにＰＭＮｓを補 充 する上でのＰ−セレクチン発現の役割は、¹¹¹Ｉｎ−標識ＰＭＮｓの蓄積が測定 された攻略法を用いて明かにされた。我々は、２２時間までに、虚血半球でＰＭ Ｎ蓄積を上昇することを先に報告した⁷が、最近の時間コースデータは、ＰＭＮ 蓄積が、虚血症の発症直後に開始することを示す。Ｐ−セレクチン遺伝子を発現 するのに失敗することは、ＰＭＮ蓄積が減少されたことに関連し、それにより後 期虚血性脳ＰＭＮ補充でのＰ−セレクチンの関与を示唆する。しかし、Ｐ−セレ クチン無しの動物は、２２時間までに並みの（対照より少なくはあるが）好中球 蓄積を示した。このデータは、Ｐ−セレクチンが後期虚血性脳ＰＭＮ補充に原因 のある唯一のエフェクター機構ではなく、そしてＩＣＡＭ−１も後期虚血性ＰＭ Ｎ接着に関与するという我々の先のデータ⁷と一致することを示す。さらに、こ のデータは、Ｐ−セレクチン欠乏マウスでのチオグリコレートの腹腔内点滴注入 が、ＰＭＮ補充の（不在でなく）遅延を引起こした⁹。 再灌流が失敗した理由を確認する重大な必要性のために、最近の研究では、適 切な灌流圧が回復するにもかかわらず、血流が再灌流の間に減少する現象である 遅延後期虚血性脳低灌流でのＰ−セレクチンの役割が試験された^21、22。虚血症 の心臓のモデルでは、逆流なしは、再灌流後時が経過したときに悪化し³⁵、それ により、進行性微小循環血栓症、血管運動の機能不全、およびＰＭＮ補充のよう な、補充されたエフェクター機構の重要な役割を示唆する。Ｐ−セレクチンおよ びＩＣＡＭ−１−依存性接着反応³⁶とＰＭＮキャピラリー栓子³⁷との両方が、後 期虚血性非逆流で関与する他のモデルで示された。脳では、ＰＭＮｓは、結果と して後期虚血性脳の非逆流^38、39に影響を及ぼされるが、Ｐ−セレクチンの役割 は、先に解明されていなかった。 最近の研究は、後期虚血性脳血管の非逆流の存在、時間コースおよびＰ−セレ クチン依存性を立証するために、比較的非侵襲性の技術（レーザードップラー） を使用して、相対的脳血流の一連の測定法を得る。糸通し手段それ自身が、血管 損傷および連続の脳梗塞の原因でないことを示すために、ナイロン縫合が４５分 間の非閉塞期間に内部頚動脈に糸が通される擬虚血症実験を行った（ｎ＝１０） 。これらの実験で、糸通しは、４５分の期間中レーザードップラーによって灌流 で減少がないことに基づいた非閉塞性があることが示された。その後、脳を収集 し、 そして２４時間でＴＴＣで染色したとき、脳梗塞の証拠を示すものはなかった。 したがって、我々は、糸通し手段それ自身が、我々の主要な結果の変量に影響を 及ぼすのに十分な損傷を誘発しないと結論づけることができる。相対的脳血流が 、実験動物で明らかな中大脳動脈閉塞を伴って行われたとき、我々は、Ｐ−セレ クチン無しおよび対照の動物が、実際に同じ程度の虚血症にかかったこと（両方 で中大脳動脈閉塞を伴う相対的脳血流においてインティアル（ｉｎｔｉａｌ）の ４５倍滴だった）を観察した。しかし、閉塞縫合がその場に残ってはいるが、閉 塞に続く最初の１０分で、相対的脳血流に僅かな増加があった。このことは、幾 つかの可能な説明がありそうな、我々が一致で成した実験的観察である。虚血性 領域で開口するある程度の側軸索流でありそうである。別の筋道の通った説明は 、数分以内に控え目に解消する、閉塞カテーテル先端の領域にある当初の血管痙 攣の要素がありうることである。マウスの血管系が小さなサイズであるために、 これらの説明の両方が可能であるが、我々は、我々のモデルに確信をもってその 機構を同定できない。我々が、対照および実験動物の両方に同じ程度の流れの補 充を観察する限り、これらのデータは、P-セレクチンが、再灌流脳卒中での脳組 織傷害の重要なメディエーターであるという我々の主要な結論を変えさせない。 内膜内閉塞縫合の除去に続いて、血流の即時の回復は、P-セレクチン＋／＋お よび−／−動物の両方で同じであった。流れのレベルが基線に決して戻らなかっ た（反応性充血と共に見られうるとおり、行き過ぎもなかった）という事実は、 虚血時期の重篤度および期間による可能性があり、それは、非セレクチン依存性 機構によって起された血栓症または好中球補充のような後期虚血性脳血管の非逆 流の他の機構を補充するように思われる。後者の時点でさえ試験されるとき（閉 塞縫合を解いた後３０分から２２時間までのような）、Ｐ−セレクチン−／−動 物での脳血流に僅かな減少があることを示すことは興味深い。２２時間までの脳 血流におけるこの後期の（限定されるが）減少は、同じ期間をかけたＰＳ−／− 動物で観察された控え目なＰＭＮ充填と一致し、再度これにより、ＰＳ−／−動 物での（ＩＣＡＭ−１のような）他の流れを制限するエフェクター機構の補充を 示唆する。 Ｐ−セレクチン発現の機能上の効果は、最近の一連の研究から明らかである。 Ｐ−セレクチン遺伝子を発現するのに失敗する動物（または機能的に遮断する抗 −Ｐ−セレクチン抗体で処置したＰＳ＋／＋動物）は、対照と比較して梗塞は小 さくそして生存者は改善されていることを示す。これらのデータが、脳卒中での ＩＣＡＭ−１発現のための破壊的な役割を示す先に公表されたデータと一緒に考 慮されると⁷、後期虚血性大脳脂質にＰＭＮｓを補充する複数の手段があること 、および各々の遮断薬が、ヒトでの脳卒中転帰を改善する強力な攻略法を表すこ とが徐々に明かになる。脳卒中に続く神経の死の前進する波先を停止させる上で 時期的に適切な再灌流の重要さの我々の最近の認識が示されると、その初期段階 でのＰＭＮ接着に干渉することは、病的状態および死亡率を減少させる魅力的な 別法であるように見える。事実、抗−接着分子の攻略法は、彼ら自身の正確さ（ すなわち、血栓崩壊に不適当な患者を含め）に有益であるのみならず、血栓崩壊 介入⁴⁰の機会の窓を広げうる。最近の一連の研究は、再灌流された脳卒中に効果 をもたらす組織生理学上の機構を我々が理解するのに貢献する。これらの研究は 、ＰＭＮ蓄積を減少する再灌流環境を最適にする進行性脳卒中のための治療法の 臨床治験の必要性を示唆する。 資料：参照文献 実施例１１：虚血性疾患を治療するための一酸化炭素の使用−肺虚血症での一酸 化炭素の保護的効果の例 当初の本出願で、我々は、一酸化炭素の内因性の生成または外因性の一酸化炭 素の投与が、連続虚血傷害に対して脳を保護する上で有益であることを示すデー タを明らかにした。虚血性疾患を治療する上で一酸化炭素を使用する別の例とし て、我々は、ラットに一酸化炭素を投与して、移植のために肺保存を改善するそ れの効果を試験した（このことは、肺が享受者から取出されるので、虚血性疾患 に類似する；肺が提供者から享受者に移される期間中、血流での干渉がある。） 。肺保存における一酸化炭素の影響を試験する方法： 保存溶液を作るために使用した材料 全ての実施例について、塩基保存溶液は、改質ユーロ−コリンズ（Euro−Coll ins）（EC）溶液（Ｎａ⁺１０ｍＥｑ／Ｌ、Ｋ⁺１１５ｍＥｑ／Ｌ、Ｃｌ^-１５ｍＥ ｑ／Ｌ、ＨＰＯ₄ ^2-８５ｍＥｑ／Ｌ、Ｈ２ＰＯ₄ ^-１５ｍＥｑ／Ｌ、ＨＣＯ₃ ^-１０ ｍＥｑ／Ｌ）から構成された。 肺回収、保存および移植 同系交配の雄のルイスラット（２５０−３００グラム）を、ジ・アメリカン・ アカデミー・フォー・アクレディテイション・オブ・ラボラトリー・アニマル・ ケアー(AAALAC)によって規定された指針にしたがって、コロンビア大学(Columbi a University)でのインスティテューショナル・アニマル・ケアー・アンド・ユ ーズ、コミッティー(the Institutional Animal Care and Use Committee)によ って承認されたプロトコルにしたがって全実験に使用した。肺移植実験を、以下 の方法で行った。提供ラットに５００単位のヘパリンを静脈内に投与し、そして 肺動脈（PA）を、２０ｍｍHgの一定圧で、３０ｍＬ容量の４℃保存溶液で洗い流 した。肺がこの方法で保存されるとき、注入された洗浄溶液のほとんどは、横断 面に続く肺静脈の外と同様に肺提供者に形成された左の動脈孔から外に出る。 その後、左肺を回収し、カフを各血管断端に載せ、シリンダーを気管支に挿入 し、肺を、ＰＡ洗浄溶液と一致した４℃の保存溶液中で６時間浸水させた。性別 ／株／サイズの適合したラットを、麻酔し、挿管し、そしてげっ歯類用換気装置 （マサチューセッツ州サウスナチック（South Natick）のハーバード・アパレイ タス（Harvard Apparatus））を用いて１００％Ｏ₂で換気した。正常位の左の肺 の移植を、全ての吻口のための迅速なカフ技術を用い、５分未満に維持された温 和な虚血回数で、左開胸を通して行った。移植肺に血流および通気を再確立させ ながら、臍帯の交雑集塊を放出した。その後、係蹄を、右ＰＡの周りに通し、そ してミラーのカテーテル（２Ｆ；テキサス州ヒューストン（Houston，TX）のミ ラー・インストルメンツ（Millar Instruments））を、主要なＰＡおよび左房（ ＬＡ）に導入した。ドップラー流プローブ（ニューヨーク州イサカ（Ithaca，NY ）のトランソニックス（Transonics））を、主要なＰＡの周りに置いた。 肺移植片機能の測定 マックラボ（MacLab）およびマッキントッシュ（Macintosh）IIｃｉコンピュ ーターを使用して、オンラインの血流力学上の監視を達成した。測定した血流力 学上のパラメーターとしては、ＬＡおよびＰＡ圧力（ｍｍHg）、およびＰＡ流（ ｍＬ／分）が挙げられる。モデルＡＢＬ−２気体分析機（デンマーク国コペンハ ーゲン（Copenhagen，Denmark）のラジオメーター（Radiometer））を用いて、 １００％Ｏ₂の吸息の間中、動脈内の酸素圧（ｐＯ₂、ｍｍＨｇ）を測定した。（ 平均値ＰＡ圧力−ＬＡ圧力）／平均血ＰＡ流としてＰＶＲｓを計算し、そしてｍ ｍＨｇ／ｍＬ／分として表された。基線測定の後、生来の右ＰＡを繋げ、そして ３０分での安楽死の時まで（または享受者の死まで）５分毎に一連の測定をした 。 一酸化炭素の投与 手術前の規定時間（４、８または１２時間）に、ラットを、釣鐘型のジャーに 入れ、そして一酸化炭素を、様々の濃度（０．０１％、０．０３％または０．１ ％）で投与し、残りの気体混合物は、室内の空気から構成される。（それを動物 の快適な湿度にするために、投与前に気体を水のジャーを通過させた。）露出の 開始に続く規定の時間に、ラットを麻酔し、そして肺を上述のとおり回収した。 これらの提供者の肺を、連続肺移植試験に使用した。 結果および検討： これらの実験の結果は、未処理の対照と比較して、肺回収前の一酸化炭素の吸 入は、移植に続く肺の際立った保護を供する。この保護は、（１）一酸化炭素− 前処理提供者の肺の享受者の動脈の酸素付加が改善されること、（２）一酸化炭 素−前処理提供者の肺を使用することで、肺動脈の血流が増加される（肺の血管 の抵抗が減らされる）こと、および（３）対照と比較して一酸化炭素−前処理提 供者の肺の享受者の生存が改善されることによって立証される。一酸化炭素の有 益な効果は、用量依存性であり、すなわち、最善の保護は、０．１％の用量で見 られ、中程度の保護は、０．０３％用量で見られ、そして最小限の保護は、０． ０１％用量で見られた。より長い暴露は、より大きな保護を供するように見える 点で、一酸化炭素の利益的効果はまた時間的依存である。一緒に、これらのデー タは、一酸化炭素は、別の虚血性疾患（肺虚血症）で保護できることを示し、そ してその結果が、同様に他の虚血性疾患に一般化しうることを示唆する。 実施例１２：マウスでの脳内出血を客観的に定量するための分光光度ヘモグロビ ンアッセイの使用 要約 背景および目的 虚血性脳卒中を治療する新規抗凝固剤または血栓溶解法を開 発する上で非常に興味深い。しかし、現時点で、これらの剤の出血潜在力を正確 に評価する限られた手段がある。最近の研究は、ネズミモデルでの脳内出血の程 度を正確に定量する方法を開発および確認するために計画された。方法 ネズミ モデルでは、脳内出血（ＩＣＨ）を、コラーゲナーゼＢのみ(６×１０^-6単位、 ｎ＝５)またはコラーゲナーゼＢと続いて静脈組織プラスミノーゲン活性化剤(ｒ ｔ−ＰＡ、０．１ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６)の定位的に実質内注入によって導入した 。対照は、生理食塩水（ｎ＝５）の定位的注入を伴う擬手術または未処理動物（ ｎ＝５）のいずれかから構成される。ＩＣＨは、（１）皮質薄片での最大の出血 半径に基づいたスケールによって格付けされ、そして（２）均質化ネズミ脳の化 学的に還元した抽出物中のシアノメテモグロビンを測定する分光光度アッセイに よって定量した。この分光光度アッセイは、別々のコホートの均質化脳に加えた 既知量のヘモグロビンまたは自己の血液を使用して確認された。このアッセイを 使用して、局所中大脳動脈閉塞／再灌流を伴う出血の程度を、後期閉塞高用量Ｉ Ｖｒｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１１）で処理したマウスおよび脳卒中には かけられたが、生理学的食塩水で処理されたマウス（ｎ＝９）で定量した。結果 新鮮な全脳組織均質物に添加された既知量のヘモグロビンまたは自己の血液は、 シアノメテモグロブリン（それぞれｒ＝１．００および０．９８）の吸収ピーク で添加された量およびＯＤの間に線状関係を示した。実験的に誘導されたＩＣＨ を定量するために、インビボでの研究を行ったとき、コラゲナーゼＢの脳内注入 を受ける動物は、生理食塩水注入対照より明かに高いＯＤｓ（２．１倍増加、ｐ ＝０．０５）を示した。脳卒中（卒中）の中大脳動脈閉塞および再灌流では、再 灌流後のｒｔ−ＰＡの投与は、生理学的食塩水溶液を受けた動物（ｐ＜０．００ １）と比較して１．８倍までＯＤを増大させた。ＩＣＨ（視覚的スコアーおよび ＯＤ）を測定する２つの方法を比較した場合、線状的な相互関連があった（ｒ＝ ０．８８）。追加の実験は、生存能力のある脳組織を染色するのに一般的に使用 されるトリフェニルテトラゾリウムが、ＩＣＨの分光光度計定量に干渉しないこ とを示した。結論 これらのデータは、分光光度計アッセイが、ネズミＩＣＨを 正確にそして信頼性のあるように定量することを示す。この新規な方法は、脳卒 中を治療する新規抗凝固剤または血栓崩壊攻略法の出血の危険を客観的に評価す る助けをし、そして他の形態の脳内出血の定量化を促進できる。 導入 虚血性脳卒中は、急性脳卒中の先進部の最大限の大半の原因である。したがっ て、血流を脳の虚血領域に迅速にそして効果的に再保存できる攻略法を計画する 上で膨大な利益がある。ヘパリンは、初期脳卒中（ＴＩＡｓ）³に有効でありう るが、脳卒中の急性期の間のそれの使用は、高度の病的状態および脳内出血に関 連しうる^1-4。同様に、１９６０年代当初は、急性脳卒中についてのストレプト キナーゼ治験でのつまらない結果のために、ここ３０年間、急性脳卒中を血栓崩 壊するのに臨床医を嫌がらせた^5、6。この嫌気は、ストレプトキナーゼが、死亡 率および脳内出血の危険を増大させることに関連した最近の治験によって確認さ れた⁷。他方では、ｒｔ−ＰＡで処置される急性脳卒中を示す患者の部分集合が 、症状発症の最初の３時間以内に処置される場合に長期病的状態を減少させるこ とを示しながら^9-11、進行中の脳卒中を治療するのに組換え体組織型プラスミノ ーゲン活性化剤（ｒｔ−ＰＡ）を使用することは、さらなる信頼を示した⁸。そ うであっても、同じ剤（ｒｔ−ＰＡ）を使用する他の治験は、利益を示すのに失 敗するか、または過剰に高い比率のICHを有した^9、12-15。 臨床データのこの混乱する難局は、迅速な再灌流に達する改善された攻略法を 確認する緊急の必要性を強調する。この終わりに向けて、脳卒中での適時の再灌 流の潜在的利益が、脳内出血が増加する危険に対して客観的に評価されうる実験 モデルを確認するのは避けられない。臨床的脳卒中のための血栓崩壊療法のほと んどの動物研究で、脳内出血の危険は、定量的に測定されるよりむしろ概算され てきた^16-24。最近の研究は、急性脳卒中のための新たな抗凝固剤または血栓崩 壊治療の潜在的な危険を評価するために、ネズミのモデルでの脳内出血の程度を 正確に定量する方法を開発および確認することが計画された。 材料および方法 実験動物 本研究で、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ジャクソン・ラボラトリーズ（Ja ckson Laboratories）（メイン州バー・ハーバー（Bar Harbor，ME））から購入 し、そして８から１０週齢（２２−３２ｇ）の間で使用した。研究所で公認され たプロトコールにしたがって、全方法を行い、そしてジ・アメリカン・アカデニ ー・フォー・アクレディティション・オブ・ラボラトリー・アニマル・ケアー（ AAALAC）によって提供された指針に従った。 脳内出血についての分光光度アッセイ 以下の実験方法にかけられた脳のヘモグロビン含有率を、以下のとおり分光光 度アッセイを使用して定量した。全脳組織を、新たに安楽死された対照または実 験動物から得、そして各脳を以下のとおり個々に処理した。蒸留水（２５０μｌ ）を、各脳に添加し、つづいて３０秒間均質化し（ニューヨーク州ウエストバリ ー（Westbury，NY）のブリンクマン・インストルメンツ社（Brinkman Instrumen ts，Inc.））、１分間プラスの超音波発生装置（ペンシルベニア州カレッジビル （Collegeville，PA）のスミスクライン・コーポレーション（SmithKline Corpo ration））で氷上で超音波処理し、そして３０分間１３，０００ｒｐｍで遠心分 離した（イリノイ州ディアーフィールド（Deerfield，IL）のバクスター・サイ エンティフィック・プロダクツ（Baxter Scientific Products））。ヘモグロビ ン含有上清を収集した後、８０μｌのドラッキンの試薬（Drabkin's reagent） （ミズーリー州セントルイス（St．Louis，MO）のシグマ・ダイアグノスチック ス （Sigma Diagnostics）から購入；Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆２００ｍｇ／Ｌ、ＫＣＮ５ ０ｍｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ₃１ｇ／Ｌ、ｐＨ８．６²⁵）を、２０μｌのアリコート 量に添加し、そして１５分間静置させた。この反応は、ヘモグロビンを、５４０ ｎｍに吸収ピークを示し、そしてその後、その濃度は、５５０ｎｍ波長での溶液 の光学的密度によって評価することができる²⁶、シアノメテモグロビンに変換す る。こえらの手段に続く測定吸収が、ヘモグロビンの量に影響を及ぼすことを確 認するために、既知量のウシの赤血球ヘモグロビン（ミズーリー州セントルイス （St．Louis，MO）のシグマ（Sigma））を、各脳組織アッセイと一緒に類似の方 法を使用して分析した。追加の測定法として、血液を、安楽死に続く心臓穿刺に よって対照マウスから得た。その後、この血液の増加アリコート量を、未処理マ ウスから得た新たに均質化した脳組織に添加して、標準吸収曲線を作成した。 コラゲナーゼ誘導脳内出血 マウスの脳内出血を導入する一般的手段は、ラットで先に記述された方法²⁷か ら適合させた。ケタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン（０．５ｍｇ／ｍ ｌ）０．３５ｍｌの腹膜内注射で安楽死させた後、マウスを、定位の頭部枠にう つむいて位置決めした。頭蓋冠を、ナジオンから上部うなじの線まで正中線の頭 皮切開によって露出させ、そしてその後、皮膚を、横に収縮した。可変の高速ド リル（ウィスコンシン州ラシーン(Racine，WI)のドレメル（Dremel））を用いて 、１．０−ｍｍバール穴をブレグマの後方２．０ｍｍ、そして正中線の右２．０ ｍｍに造った。単独の２２ゲージの血管カテーテルの針を、定常位の誘導装置を 用いて、右副皮質／脳幹神経節（座標：２．０ｍｍ後方、２．０ｍｍ横）に挿入 した。針を、プラスチック製管によって、微小注入シリンジに密着させ、そして 溶液を、４分間、１分当たり０．２５μｌの速度で注入ポンプ（インディアナ州 ウエスト・ラファイエット（West Lafayette，IN）のバイオアナリティカル・シ ステムズ（Bioanalytlcal Systems））を用いて脳に注入した。動物は、（１） １μｌの正常な生理食塩溶液中の０．０２４μｇコラゲナーゼＢ（ドイツ国マン ハイム(Mannheim,Germanv)のベルリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim) ）（コラーゲナーゼ）；（２）１μｌの正常な生理食塩溶液のみ（擬）；（３） 未処理（対照）；または（４）上述のとおり、しかしすぐに続いて、陰茎背静脈 注入に よって投与される組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化剤（カリフォルニア州 サウス・サンフランシスコ（South San Francisco）のジェネンティック社（Gen entech Inc.）、０．２ｍｌの正常な生理食塩溶液中１ｍｇ／ｋｇ）を投与して 定常位に誘導されたコラーゲナーゼＢの注入（コラケナーゼ＋ｒｔ−ＰＡ）のい ずれかを受けた。コラーゲナーゼ、擬性、およびコラゲナーゼ＋ｒｔ−ＰＡのグ ループで、定常位の針を、注入に続いて直に取除き、そして切開を手術用ステイ プルで閉じた。脳組織を、迅速な麻酔下の断頭の直後に回収した。 ネズミの局所脳虚血症モデルでの止血変換 先に詳細に記述された方法^28、29を用いて、一過性の右中大脳動脈閉塞によっ て、局所脳虚血症を、動物に起させた。簡潔に、加熱平滑１２または１３ｍｍ５ −０または６−０ゲージのナイロン縫合を、中大脳動脈のレベルまで右内部頚動 脈に通した。４５分後、閉塞縫合を、取除いて、灌流を再樹立した。閉塞縫合を 除去してすぐに続けて、動物は、静脈の組織プラスミノーゲン活性化剤（０．２ ｍｌの正常な生理食塩溶液中１０ｍｇ／ｋｇ、脳卒中＋ｒｔ−ＰＡ）または陰茎 背静脈注射によって与えられた正常な生理食塩溶液（脳卒中＋生理食塩水）のい ずれかを受けた。２４時間で、脳組織を、迅速な麻酔下の断頭直後に回収した。 非梗塞脳組織^28、30から得た梗塞物を区別するのに共通に使用される、２，３， ５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）の効果を評価するために、 非操作（対照）脳を、半分に分割し、０．９％リン酸緩衝生理食塩水中の２％Ｔ ＴＣ（ミズーリー州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ・ケミカ ル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ））に浸漬して漬け、３ ７℃で３０分間インキュベートし、そしてその後、分光光度ヘモグロビンアッセ イについて上で記述されたとおりに製造した。各脳の他の半分を、同じ期間、生 理食塩水に浸漬し、そしてその後、分光光度ヘモグロビンアッセイについて上で 記述された手段にかけられた。 定量的脳内出血アッセイの確認 ＩＣＨの程度を、盲検観察者によって最初に視覚的に格付けした。マウスでの 脳内出血の視覚的格付けのために、その手段（コラーゲナーゼ誘導止血またはＭ ＣＡ閉塞）に続いて２４時間の時点まで生存したマウスから得た脳を、マウスの 脳マトリックス（ミシガン州ワーレン（Warren，MI）のアクティベイショナル・ システムズ社（Activational Systems Inc.））に載せて、１ｍｍの一連の皮質 薄片を得た。薄片を、盲検観察者によって検査し、そして脳に、薄片のいずれに も見られる最大限の出血半径に基づいた等級スケールからICHスコアーを付与し た［ＩＣＨスコアー０、出血なし；１、＜１ｍｍ；２、１−２ｍｍ；３、＞２− ３ｍｍ；４、＞３ｍｍ］。その後、各脳から得た切片を保存し、均質化し、そし てその後分光光度ヘモグロビンアッセイについて上で記述された手段に従って処 理した。 統計学 示された対比係数と共にパーソンズの線状対比を用いて、視覚的に測定したＩ ＣＨスコアーおよびＩＣＨの分光光度測定の間の対比を行った。所定の処置（コ ラーゲナーゼ、擬、脳卒中など）が、分光光度または視覚的格付けしたＩＣＨの いずれかで際立った効果を示したかを確認するために、不対の２つの尾部ｔ−試 験を用いて、比較を行った。非パラメーター性データ（視覚的ＩＣＨスコアー） については、マン−ホイットニー試験を使用して、非パラメーター分析を行った 。値は、統計学的に有為である考えられるｐ＜０．０５で、平均値±ＳＥＭとし て示される。 結果 分光光度ヘモグロビンアッセイ 分光光度ヘモグロビンアッセイの信頼性および再現性を測定するために、当 初の研究を行った。最初の組の実験で、先に公表された手段にしたがって、既知 量のヘモグロビンをジアノメテモグロビンに変換し、そしてＯＤを測定した［図 ３５Ａ］²⁶。第二の組の実験では、既知量の自己の血液を、上述のとおりの試験 片をさらなる処理と一緒に、固定量の新たな脳組織均質化物に添加した。これら のデータは、５５０ｎｍでのシアノメテモグロビン含有上清の光学密度が、添加 血液の量と線状に相関関係のあったことを示した［図３５Ｂ］。これらのデータ は、平均値の比較的小さな標準誤差によって測定されるとおり、素晴らしい再現 性とともに、厳密な線状相互関係（図３５Ａおよび３５Ｂについて、それそれｒ ＝１．００および０．９８）を示す。ＴＴＣ（非梗塞脳細胞から梗塞物を区別す るのに一般，に便用される^28、30）が、分光光度ヘモグロビンアッセイに影響を 及ぼさないことを確認するために、非操作（対照）脳を半分に分割し、その半分 が標準ＴＴＣ染色手段にかけられ、そして半分が対照として生理食塩水で処理さ れた。これらのデータ（図３５Ｂ、実線と破線を比較）は、ＴＴＣでの脳組織の 前処理は、分光光度ヘモグロビンアッセイに影響を及ぼさないことを示す。 この方法が、ＩＣＨを検出できるかどうかを決めるために、実質内のコラーゲ ナーゼ注入または中大脳動脈閉塞／再灌流の２つの別々の手段によって起される ネズミの脳内出血でアッセイを行った。最初の手段では、血管壁を弱めてＩＣＨ を促進する（コラーゲナーゼグルーブ）ために、コラーゲナーゼＢを、バール穴 を通して局所注入として使用した。ＩＣＨの性質および程度をさらに増大させる ために、その手段に続いてｒｔ−ＰＡの迅速な投与を行って、類似の手段を行っ た（コラーゲナーゼ＋ｒｔ−ＰＡグループ）。バール穴を開けるが、生理学的食 塩水の点滴注入を共に含む擬操作（擬）、および未処理グループ（対照）の２つ の対照症状も含まれる。これらの実験は、擬処理動物または正常対照と比較して コラーゲナーゼ注入が、分光光度アッセイ（特に、コラーゲナーゼ＋ｒｔ−ＰＡ で）によって検出された脳内血液の量を増加させることを示した［図３６Ａ］。 第二そしておそらくそれ以上のＩＣＨを誘導する臨床的に同類の方法では、脳 卒中は、中大脳動脈の一過性内膜内閉塞、続いて再灌流によって作り出される。 さらに、我々は、血栓崩壊剤の投与によって、出血変換の性質を増大させること を試みた。正常な生理的食塩溶液を受けたもの、または内腔内の閉塞縫合を取除 くことにすぐ続いた静脈内のｒｔ−ＰＡを受けたものの２つのグループを研究し た。これらのデータは、脳卒中に続いて繊維素溶解剤を添加すると、分光光度ヘ モグロビンアッセイによって検出されるＩＣＨの量が増加することを示す［図３ ６Ｂ］。基線吸収が、対照／未処理動物より脳卒中にかけた動物でのほうが低い ことに注目するのは興味深い［図３６Ａおよび３６Ｂ］。どのように残りの血管 内血液が、分光光度ヘモグロビンアッセイに影響を及ぼしうるかをさらに調べる ために、脳回収のための動物の断頭の直前に、生理学的食塩水の頭部灌流を行っ た（左心室を介して投与された）実験を行った。脳回収の前に心臓の生理食塩水 の灌流を受けた対照動物（ｎ＝５）で、組織標品および分光光度ヘモグロビンア ッセイに続く平均値の光学密度は、０．２５±０．３だった（これは、手術なし または擬似手術（ｎ＝１０、ＯＤ０．３４±０．０５、ｐ＝０．０５対心臓灌流 対照）のいずれかにかけた非心臓灌流動物に見られる光学密度より低い。）。一 方では、脳卒中に続いて、心臓の生理食塩水の灌流が行われるかどうかをＯ．Ｄ ．での差異がなかった（心臓の生理食塩水の灌流なしの脳卒中については０．１ ５±０．０４、ｎ＝５；心臓の生理食塩水の灌流を伴う脳卒中については０．１ ５±０．０３、Ｐ＝ＮＳ）。生理食塩水を灌流し、脳卒中に罹っている動物を、 生理食塩水を灌流し、脳卒中に罹っていない動物と比較したとき、分光光度ヘモ グロビンアッセイに伴われてＯＤで明らかな減少があった。これらのデータは、 脳卒中に罹っている動物が、虚血症に伴う同側のＭＣＡ領域での血液の総量を減 少させる結果として、検出された脳内血液が少ないことを示すことを示唆する。 視覚的ＩＣＨスコアー 分光光度ヘモグロビンアッセイをさらに確認するために、我々は、文献^31-35 で伝統的に使用されてきた出血サイズの形状評価についてそれを比較した。我々 は、盲検観察者が、最大出血半径に基づいて、一連の脳薄片でのＩＣＨの程度を 格付けする、視覚的格付けシステム（０−４）を開発した。分光光度ヘモグロビ ンアッセイの実行直前に撮られた脳の写真でこの視覚的評価を行い［図３７］、 その結果、２つの技術は、同じ試験片で相互に関係させうる。いかなる介入もか けてられていない対照と比較すると、擬局所注入を受ける動物（すなわち、バー ル穴＋生理食塩水）は、視覚的ＩＣＨスコアーにわずかな増加のみを示す［図３ ８Ａ］。しかし、コラーゲナーゼのみまたはコラーゲナーゼ＋ｒｔ−ＰＡのいず れかを、注入物に添加したとき、視覚的ＩＣＨスコアーを、明かに増加させた［ 図３８Ａ］。脳卒中モデルで、ｒｔ−ＰＡは、同様に、視覚的ＩＣＨスコアーに ついて増加を生じた［図３８Ｂ］。データをプロットして、ＩＣＨを定量するの に視覚的ＩＣＨスコアーと分光光度技術の間の関係を示したとき、線状の関係は 、示唆されたが（ｒ＝０．８８）、しかし、出血の程度が小さくて（０または１ の視覚的ＩＣＨスコアー）、この関係は、維持しなかった［図３９］。 検討 最近、ある種の静脈内血栓崩壊剤（ｒｔ−ＰＡ）を用いた、脳卒中の初期介入 は、徴候発症の３時間以内に始められる場合に、有益でありうることが明かにな ってきた^9、10。しかし、この狭い治療窓の外側に血栓崩壊剤を投与すると、痛烈 なＩＣＨの受入れがたく高い発生率を生じうる（ストレプトキナーゼ対プラセボ 、１０日目の死亡率３４．０％対１８．２％、ｐ＝０．００２、６ヶ月の死亡率 ７３％対５９％、ｐ＝０．０６）⁷。したがって、出血変換の危険が低いことと 関連する再保存灌流のためのいっそう最適な剤を確認することの臨床的緊急性を 残す。凝固または繊維素溶解機構に干渉する新たな剤を適切に研究するために、 ＩＣＨの下降危険を定量する客観的平均を示すことが必要である。実験の文献で は、放射線学上の造影手段^32-37によるか、または死後の脳組織における出血の 量の視覚的概算^31-35によってＩＣＨの定量を行った。これらの手段は、研究下 での条件によって、有用さが制限されたものである。例えば、洗練された装置の 必要性によって強いられた論理的拘束に加えて、ほとんどの放射線学上の造影技 術は、ネズミのモデルでの限定された有用さのものであり、それは、凝固または 繊維素溶解系を研究するための潜在的に強力な道具であるトランスジェニックマ ウスの評価でのそれらの使用を排除しうる。ＩＣＨの視覚的概算は、事実上主観 的であり、そして我々自身のデータが示すとおり、少ない程度のＩＣＨを検出す るのに比較的感受性が低い可能性がある。さらに、出血範囲が、疎らであるかま たは多重巣状である場合、放射線学上あるいは視覚的技術のいずれも、ＩＣＨの 正確な定量を可能にしない。実験動物でのＩＣＨを定量する客観的方法を開発お よび確認する最近の研究を行った。ヘモグロビンをシアノメテモグロビンに変換 することに基づいたヘモグロビンの定量のための分光光度アッセイを利用するこ とは、先に報告された^26、31。しかし、最善の我々の知識のために、脳に、隣接 の脳組織からそれを取除くことに続いておおよその血餅のサイズを測定するのは 、ラットで使用されるのみであった³¹。我々が記述しそして確認する分光光度ア ッセイは、マウスと同じくらい小さな動物に使用することができ、それは、現在 入手可能な多くのトランスジェニックマウス株（特に、血栓または繊維素崩壊カ スケードで改変を伴うもの）の使用を促進する。さらに、この分光光度アッセイ は、疎らなまたは多重の局所出血がある場合でさえＩＣＨの定量を可能にし、そ れは、さもなければ同定または単離が困難である。最終的に、リー（Ｌｅｅ）の 研究と 対称的に、我々は、既知量のヘモグロビンおよび脳組織と混合された自己の血液 を使用して、再現性および信頼性についての我々の研究を確認した³¹。脳卒中試 験に使用される手術手段が、血液ヘモグロビン濃度を明かに変化させなかった（ データは示されず）ので、分光光度ヘモグロビンアッセイは、ヘモグロビン濃度 が、出血の時に知られている場合、脳内出血の容積を推定するのに使用されうる 。 臨床的ＩＣＨに関連がある可能性がある状況についてその分光光度ヘモグロビ ンアッセイを開発および確認するために、我々は、２つの異なる方法：（１）コ ラーゲナーゼの脳内注射（血管壁を弱め、動脈瘤と共に、あるいは外傷を伴って 生じうるとき）、および（２）脳卒中のモデルで脳内出血を作り出した。両方の 例で、コホートの動物も、ＩＣＨのスペクトルの上限でそのモデルを確認するた めに、ｒｔ−ＰＡを受けた。マウスでのＩＣＨについての確立された金−標準測 定法はないので、我々の分光光度測定法を、視覚的格付けによって独立に評価さ れるとおりＩＣＨサイズについて比較した。最終的に、そのアッセイは、脳が、 脳の梗塞容積を定量するためにトリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ） で染色された、脳卒中の実験的モデルとしてさらにいっそう有用であることを立 証するために、ＭＣＡ閉塞／再濯流にかけられた動物の脳を、保存および均質化 の前にＴＴＣで染色して、ＴＴＣ染色手段それ自身が、分光光度ヘモグロビンア ッセイによってＩＣＨを定量する能力に干渉しないことを立証した。これらのデ ータ（図１Ｂ）は、連続的に使用される（最初にＴＴＣ染色、続いて均質化、そ して分光光度ヘモグロビンアッセイ）場合、その２つの手段の間に何も検出可能 な交差干渉はないことを示す。 ＩＣＨを検出するそれの能力に加えて、最近の研究は、この技術も、脳の回収 に続いて残りの血管内血液の量の指標を示しうることを示す。頭部の生理食塩水 灌流の手段は、脳卒中にかけられた脳の中のシアノメテモグロビンの光学密度を 変化させず、それにより血管内の血液の量が比較的固定され、そしてその手段に よって洗い流せないことが示唆される。しかし、別な方法で未処理であった対照 動物では、生理食塩水濯流処理は、約３０％までシアノメテモグロビンの光学密 度を低下させるようである。我々の実験は、この差異の理由を供しないが、閉塞 の領域に血管収縮／血管閉塞の要素がある以下の脳卒中は、生理食塩水灌流技術 がさらなる残りの血管内の血液を洗い流すのに効果を低めることを推測するもの もいる。さらに、脳卒中を伴う血管収縮または実験的に誘導された脳内出血の要 素が本当にあれば、これは、血管内の血液保存を減少させ、そしてこのため、対 照および脳卒中／ＩＣＨ脳が比較される場合（ある種の血管外血液が、後者のグ ループに存在する場合さえ）、光学密度の総体的低下に原因がある。 脳内出血を測定するための分光光学的技術の数種の技術的態様も、記述に値す る。現在の実験として、５４０ｎｍ付近を中心とするシアノメテモグロビンにつ いての広範な吸収ピークがあるが、我々は、５５０ｎｍでのシアノメテモグロビ ンの吸収を測定した。これを行う理由は、多くの光学光度計が、前設定フィルタ ーによって波長性能を固定したことであり、そして５５０ｎｍは、一般に使用さ れる波長（特に、ＥＬＩＳＡプレート読取り機で）である。おそらく５４０ｎｍ での吸収の測定は、わずかに高い光学密度測定を生じたが、シアノメテモルグロ ビンの吸収ピークは、この領域で広がっており、そしてそのために、５５０ｎｍ は、フェリーまたはフェロシアニド（５５１ｎｍおよび５４０ｎｍでのシアノメ テモグロビンの吸光度係数は、フェリーまたはフェロシアニドの４１倍低い吸光 度係数と比較して、それぞれ１１．５および１１．１である³⁸）の吸収を直す必 要なく使用しうる。連続波長の分光光度計を使用する研究（５４０ｎｍでＯＤを 測定するのに使用された）および別々のスペクトルのＥＬＩＳＡプレート読取り 機（５５０ｎｍでのＯＤを測定するのに使用される）は、同様の結果を示した。 後者の技術は、簡便であり、手段の処理量を増加させ、そして我々にサンプル量 を最小限にさせるので、我々は、「結果」のセクションで示された研究として後 者の技術を使用することを選択した。 分光光度アッセイを用いるときに考慮されるべきある種の潜在力のある他の技 術的考慮がある。我々は、分光光度手段が、梗塞容積分析のための一連の脳薄片 をＴＴＣ染色と連結して使用できることを示した場合でさえ、その組織は、組織 構築物を破壊し、そしてさらなる組織学上の特性を不可能にしながら、連続的に 均質化され、そして抽出されるにちがいない。脳外の血液が、脳回収のあいだ故 意でなく関与する場合、この技術が、ＩＣＨの程度を過大評価しうることが可能 であるか、または残余の硬膜外、硬膜下、またはくも膜下の血液が、頭蓋冠に接 着したままになる場合、その技術は、ＩＣＨの程度を過少評価し得て、それは、 脳取出しの過程を通して廃棄する。 測定技術の性質のために、所定の波長での光が、固定長の経路にそって吸収さ れ、均質化の脳上清の混乱を生じるめらゆるものは、ＯＤ読取りを増加する可能 性がある。これは、脂質、異常なプラズマタンパク質、および赤血球ストローマ を含みうる。実際に、一次的実験では、我々は、遠心分離が不十分であり、そし てある種の脂質層が、このアッセイに関与したときＯＤｓが偽って上昇されるこ とが分かった。遊離ピリジンは、シアノメテモグロビンの吸収スペクトルを変え させることができ、そしてドラッキンの試薬³⁹とも反応する他のヘモクロモゲン の能力がある。しかし、我々の知識で、これらの反応は、脳内血液／出血の測定 と明らかな範囲に干渉しない。 要するに、最近のデータは、どのくらい簡便で、そして安価なヘモグロビンの 分光光度アッセイが、ＩＣＨを定量する有用な方法を提供できるかを例示する。 この技術は、脳卒中の治療のために新たに開発された血栓崩壊または抗凝固剤治 療の出血潜在性を評価するのに特に有用であることを証明する。 資料：参照文献 実施例１３：活性部位遮断因子ＩＸａは、脳内出血を増大させることなく、ネズ ミの脳卒中で微小血管血栓および脳傷害を制限する 要約 脳卒中治療における臨床上の迷いは、血管開通性を戻す薬剤が、脳内出血の危 険を増大させることである。その活性部位をダンジル化することによって精製因 子ＩＸａから形成される活性部位遮断因子ＩＸａ（ＩＸａｉ）は、因子Ｘ活性複 合体への因子ＩＸａの集合を阻害する生来の因子ＩＸａと競合する。因子ＩＸａ ｉと前処理するとき、局所脳虚血症および再灌流にかけられたマウスは、微小血 管フィブリンおよび血小板沈澱が減少し、脳灌流が増大し、そして伝播体処理対 照より脳梗塞がかなり小さいことを示した。因子ＩＸａｉ指向性脳保護は、用量 依存性であって、治療的に有効な用量で脳内出血と関連せず、そして因子ＩＸａ ｉが脳虚血症の発症後に投与されたときでさえ見られた。因子ＩＸａｉの投与は 、脳内出血の危険を増すことなしに進行中の脳卒中を治療する新たな攻略法を表 す。 導入 虚血性脳への血流の時間的に都合のよい再樹立は、急性脳卒中ための最近の治 療凡例を表す^1-3。最適条件下で付与されたときでさえ血栓崩壊剤の投与は、そ れらの望ましい臨床結果に達しえない。灌流は、しばしば前虚血レベル（後虚血 低灌流）に戻ることに失敗し、それにより虚血性傷害は、元の閉塞によって唯一 生成されないが、微小循環の不全の要素もあることが示唆される。さらに、急性 脳卒中の血栓崩壊は、脳内出血（ICH）の危険が増加していることに関連し^1-4、 それによりICHの危険を増大させることなく、再灌流を促進できる新たな薬剤を 同定する明らかな必要性があるままであることが示される。 虚血事象に続いて、血管壁は、その静止性、抗接着性、、抗血栓状態から、白 血球接着および血栓形成を促進するものまで改質される。急性脳卒中では、ＩＣ ＡＭ−１⁵およびＰ−セレクチン⁶のような同側の微小血管系で発現された接着レ セプターによって白血球の活性補充は、後虚血性低灌流を強化する。しかし、こ れらの遺伝子の各々のマウスの欠失的な突然変異体との実験は、それらの不在で さえ、後虚血性脳血流（ＣＢＦ）は、基線に部分的にのみ戻ることを示し、それ により、後虚血性脳血管逆流なしの原因である付加機構の存在が示唆される。 この可能性を捜査するために、第一組の実験は、局所血栓が、脳卒中での微小血 管系（一次閉塞の部位に遠位な）のレベルで生じるという仮説を試験するために 計画された。 脳卒中での微小血栓の酷い結果を評価するために、第二の組の実験は、凝固の 固有な経路の選択的遮断薬が、微小血管の血栓を制限でき、それにより脳卒中の 脳を保護するという仮説を試験した。凝固の固有な経路の選択的阻害の攻略法は 、それが、血管内血栓の第一の原因であるので選択された。ヘパリン、ヒルジン 、および繊維素溶解剤が、フィブリンの形成を阻害するか、または溶解を促進す ることで凝固の最終共通経路を干渉し、そしてしたがって、ＩＣＨの性質を増大 させる。我々は、小さな血管が脆く、そして破壊にかけられる脳組織または隣接 領域で重大でありうる凝固の外因性／組織因子経路によって細胞外止血の機構を 保存しながら、ＩＸａ／ＶＩＩＩａ／Ｘ活性化複合体集合の選択的遮断薬が、血 管内 血栓を制限する新規な機構を提供することを仮説した。 方法ネズミの脳卒中モデル： 先に報告されるとおり⁷、一過性の局所脳虚血症を、中 大動脈の内膜内閉塞（４５分）および再灌流（２２時間）によってマウスに誘導 した。相対的脳血流（ＣＢＦ）の一連の測定を、レーザードップラー流量計⁷を 介して、そしてトリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色連続脳薄片 の面積計の／容積分析⁷によって測定される閉塞量（同側の半球の含有率（％） ）を記録した。 ¹¹¹ インジウム血小板研究 ：血小板蓄積を、¹¹¹インジウム標識血小板を使用して 測定し、回収し、そして先に記述したとおり製造した⁸。手術直前に、静脈でマ ウスに５×１０⁶の¹¹¹インジウム標識血小板を付与した。沈澱を、同側のｃｐｍ ／対側のｃｐｍとすることによって２４時間後に定量した。フィブリン免疫ブロッティング／免疫染色： フィブリンの蓄積を、最近記述され そして確認された免疫ブロッティング／免疫染色手段⁹を使用して、（十分にヘ パリン付けした動物を）犠牲にすることに続いて測定した。フィブリンは、厳密 に不溶性であるので、プラスミン消化によって脳組織抽出を製造し、その後電気 泳動のための標準ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけ、続いてポリクローナ ル・ウサギの抗−ヒト抗体を使用する免疫ブロッティングにかけて、フィブリノ ーゲンとの比較的少ない交差反応性を有する¹⁰ネズミのフィブリンを検出できる 架橋フィブリンに存在するガンマ−ガンマ鎖二量体を製造した。フィブリン蓄積 を、同側対対側比として報告した。追加の実験で、脳を、パラフィンに埋設させ 、薄片に切り、そして同じ抗−フィブリン抗体を使用して免疫染色した。分光光度ヘモグロビンアッセイおよび可視化ＩＣＨスコアー： ＩＣＨを、我々が 開発しそして確認した分光光度計基礎のアッセイ^11、12によって定量した。簡潔 には、マウスの脳を、均質化し、超音波処理し、遠心分離し、そして上清中のメ テモグロビンを（ドラッキンの試薬（Drabkin's reagent）を用いて）シアノメ テモグロビンに変換し、その濃度は、既知量のヘモグロビンで生じた標準曲線に 対して５５０ｎｍでのＯ．Ｄ．を測定することによって評価した。薄片のうちの いずれかに見られる最大出血半径に基づいた盲検観察員によって１ｍｍの連続皮 質薄片でＩＣＨの視覚的格付けを行った［ＩＣＨ格付け、０、出血なし；１、＜ １ｍｍ；２、１−２ｍｍ；３、＞２−３；４、＞３ｍｍ］。因子ＩＸａｉの製造¹³ ：因子ＩＸａｉを、ダンシル−ｇｌｕ−ｇｌｙ−ａｒｇ− クロロメチルケトンを用いて、因子ＩＸａ上の活性部位ヒスチジン残基を選択的 に修飾することによって製造した。プロプレックスを、因子ＩＸに対する固定化 カルシウム依存性モノクローナル抗体を含む分取カラムにかけた。カラムを洗浄 し、ＥＤＴＡ−含有緩衝液で溶出し、そしてその後、（ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの単 独バンドとして確認される）溶出物中の因子ＩＸを、（ＣａＣｌ₂の存在下でイ ンキュベートする）因子ＸＩａをかけることによって活性化した。精製因子ＩＸ ａを、１００倍モル過剰のダンシル−ｇｌｕ−ｇｌｙ−ａｒｇ−クロロメチルケ トンと反応させ、そして混合物を塩析させた。前凝固剤活性を欠いている最終産 物（ＩＸａｉ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのＩＸａに一致して移行する。その後、 この材料（因子ＩＸａｉ）を、濾過（０．２μｍ）およびＤｅＴｏｘｉ−ゲルカ ラム上でのクロマトグラフィーを伴った試験に使用して、（サンプルアリコート 量中の、検出可能なリポポリサッカライドなし）めらゆる痕跡の内毒素混入物を 取除いた。続いて、ＩＸａｉを、使用の時間まで、−８０℃でアリコート量に凍 結した。ＩＸａｉを使用したそれらの実験について、例示時間に、そして例示用 量で単独の静脈ボーラスとして付与した。 結果 ネズミ・モデルでの脳卒中を作るために、縫合を、脳血管系に導入し、その結 果、それが右中大脳動脈のオリフィスを閉塞し、それにより、範囲を定められた 領域を虚血にさせた。４５分の期間の閉塞後、縫合を解くことによって、脳卒中 の再灌流モデルを造り出す。そのように処理されたマウスは、脳梗塞の局所神経 学上の欠損および明らかに切断した領域を示す。閉塞縫合が、主要な血管試験（ 中大脳動脈）によって促進しないので、このモデルは、中断した血流の時期に応 答して脳の微小血管系内に起こる「下流」事象を調査する素晴らしい機会を提供 する。このモデルを使用して、微小血管血栓の役割を以下のとおり調査した。血 小板富血栓芯が、虚血脳半球内に生じることを示すために、内膜内閉塞縫合の導 入直前に¹¹¹インジウム標識血小板を、マウスに投与して、脳虚血症および再灌 流の確認時期の間それらの沈澱を追跡した。脳卒中を造る手術手段にかけられて いない動物で、予測されるとおり、血小板の存在は、右および左の半球の間でお よそ等しかった［図４０Ａ、左の棒線］。しかし、動物を、脳卒中にかけた（そ して、連続実験の対照へのベヒクルのみを受けた）とき、放射性標識血小板を、 反対側（非虚血）半球での沈澱が非常に少ないのと比較して、虚血性（同側の） 半球で優先的に蓄積させた［図４０Ａ、中央の捧線］。これらのデータは、虚血 性領域での血小板富血栓の発生を支持する。因子ＩＸａｉを、動物に投与すると き、内膜内閉塞縫合の導入前に同側の半球での放射性標識血小板の蓄積に著しい 減少があった［図４０Ａ、右の捧線］。 別のラインの証拠も、脳卒中での微小血清の発生を支持する。このデータは、 架橋フィブリンのガンマ−ガンマ鎖二量体上のネオエピトープに対して向けられ た抗体を使用して、フィブリンの免疫検定から生じる。イムノブロットは、局所 脳虚血症および再灌流にかけられた、ベヒクル処理動物の同側（右）半球での増 加強度のバンドを示す［図４０Ｂ、「ベヒクル」］。脳卒中の前に因子ＩＸａｉ （３００μｇ／ｋｇ）で処理した動物で、フィブリンの同側の蓄積に明らかな増 加はない［図４０Ｂ、「因子ＩＸａｉ」]。フィブリン蓄積が、（非特異的透過 性変化のためよりむしろ、そして副内皮マトリックスにさらす）血管内フィブリ ンの沈澱に依存したことを示すために、フィブリン免疫染色は、同側の脳内微小 血管の内膜に増加したフィブリンを局在化させた［図４０Ｃ］。 因子ＩＸａｉが、脳内血栓を制限しそして灌流を戻すことができるかどうかを 調査するために、ＩＸａｉを、脳卒中直前にマウスに付与した（３００μｇ／ｋ ｇ）。これらの実験は、同側の半球で¹¹¹Ｉｎ−血小板蓄積での減少［図４１Ａ ］並びに免疫染色による血管内フィブリンの証拠減少の両方を示す。さらに、２ ４時間までＣＢＦでの著しい増加があり、それにより因子ＩＸａｉによる微小血 管の疎らさの回復が示唆される［図４１Ａ］。この観察の臨床的関連を、因子Ｉ Ｘａｉの能力によって過少格付けして、脳の梗塞容積を減少させる［図４１Ｂ］ 。因子ＩＸａｉのこれらの有益な効果は、用量依存性であり、６００μｇ／ｌｇ は、至適用量であった［図４１Ｃ］。ＩＣＨの開発が、脳卒中の環境で抗凝固法 との主要な関係であるので、ＩＣＨを定量する我々の最近確認された分光光度法^11、12 を用いて、ＩＣＨでのＩＸａｉの効果を測定した。これらのデータは、最 低用量（最も効果的なもの）で、ＩＣＨでの著しい増加はないことを示す［図４ ２Ａ］。試験された最大用量（１２００ｐｇ／ｋｇ）で、ＩＣＨに増加があり、 それは、我々が最近報告もした半定量的な視覚的格付け法によって確認された［ 図４２Ｂ］^11、12 急性脳卒中から改善する転帰で指示された治療は、医療上の定位の後に付与さ れるので、そしてフィブリンは、脳卒中での当初の虚血事象を伴って形成をつづ けるので、我々は、ＩＸａｉが、脳虚血症の開始に続いて付与される場合に効果 的でありうるかどうかを試験した。中大脳動脈閉塞（閉塞縫合を除去することに 続いて）後に付与されたＩＸａｉは、ベヒクル処理対照と比較して脳梗塞容積を 非常に減少させるその能力によって判断された顕著な脳保護を提供した[図４３] 。 検討 この研究でのデータは、後虚血性脳微小血管系内の血管内の血栓形成（血小板 およびフィブリンの両方）の明らかな証拠を示す。脳卒中での微小血管の血栓の 病態生理学上の適切さは、微小血管の血栓（後虚血ＣＢＦでの付随の増加を伴っ て、血小板およびフィブリン蓄積の両方を減少させる）を減少させ、そして脳卒 中の転帰を改善する因子ＩＸａｉの能力によって強調される。因子ＩＸａｉは、 用量依存性手段で梗塞容積を減少させるのみならず、脳卒中の発症後に付与され るときでさえそうなるので、因子ＩＸａｉのこれらの潜在抗血栓作用は、脳卒中 の環境で臨床的に意義のあるようである。さらに、医療的に関連のある用量で、 因子ＸＩａｉでの治療は、ＩＣＨでの増加を起こさせず、それにより因子ＩＸａ ｉとの因子ＩＸａ／ＶＩＩＩａ／Ｘ活性化複合体集合の選択的阻害をヒトでの脳 卒中治療の魅力的な標的にする。 臨床治験でのそれらの変化を与える成功のために、標的になった抗凝固剤法が 、急性脳卒中を管理する上で、凝固崩壊剤の最近の使用に対する魅力的な代替法 でありうる多数の理由がある。論理的に、急性脳卒中のための理想的な治療は、 脳内出血の危険を増加させることなく、虚血性ゾーンでの微小血管血栓を起こす フィブリン−血小板メッシュの形成または導入溶解を防止する。しかし、急性脳 卒中の臨床治験で研究されてきた血栓崩壊剤は、脳内出血の危険を一貫して増加 してきた^1-4。脳卒中の発症に続く最初の数時間（＜６）に示されるストレプト キナーゼは、出血形質転換の速度を増加（６７％まで）させることに関連した。 初期死亡率が増加したけれども、生存する患者は、残余の不自由さが減る。生存 者は、残余の不自由さが下がることを示すが、脳卒中発症の７時間以内（特に３ 時間以内）の組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）の投与は、初期死亡率 を増加させ、そして出血変換の速度を増加（７−２０％）させた。改善された抗 凝固または血栓崩壊療法を開発するために、脳卒中の幾つかの動物モデルを試験 した。これらのモデルは、一般に、凝固血を内部頚動脈へ投与し、続いて血栓崩 壊剤を投与することから構成される。ラットでは、脳卒中の２時間以内のｔＰＡ 投与は、脳血流を改善し、梗塞サイズを７７％まで減少させた^14、15。同様のウ サギ胚の塞栓脳卒中モデルでは、ｔＰＡは、血流を戻し、そして脳内出血の偶発 的出現を伴う梗塞サイズを減少させる上で有効であった^16、17。しかし、即座の 血餅溶解に利点があるが、これらの研究（並びに血栓崩壊剤の臨床治験）は、こ の治療法での脳内出血の付随の危険が増加することを示す。 虚血性脳卒中の通常に出抜けの発症のために、治療法は、脳の主要な血管支援 を閉塞する主要なフィブリンの／アテローム血栓症の壊死組織片を溶解すること に向けられる一次的に標的を攻撃する。しかし、最近の研究が例示するとおり、 当初の閉塞の部位から下流に生じる微小血管閉塞の重要な成分があり、それは、 進行性脳卒中での後虚血性低灌流（非逆流）および脳傷害についての考慮すべき 病態生理学上の意義のものであるようである。このデータは、微小血栓が、新た な脳梗塞での虚血性領域に形態的に局在された、先に報告されたものに素晴らし く一致している¹⁸。因子ＩＸａ／ＶＩＩＩａ／Ｘ活性化複合体の集合を阻害する 剤を使用することは、血管外止血を害することなく、微小血管内膜に起こる血栓 を制限するための新規アプローチ法を現し、その維持法は、ＩＣＨを避けるのに 重大である可能性がある。最近の研究では、因子ＩＸａｉでの治療は、ＩＣＨを 増加することなしに、脳卒中の環境で、微小血管の血小板およびフィブリン沈澱 を減少させ、後虚血性脳血流を改善し、そして脳梗塞容積を減少させる。 抗凝固剤としての因子ＩＸａｉの性質は、凝固カスケードでの活性化因子ＩＸ の絶対必要な役割から由来する。因子ＩＸａ遮断薬の攻略法が、脳卒中の環境で 有効あるように思われるのみならず、イヌでの左回旋冠状動脈への電流の初期使 用に続いて誘導される進行性冠状閉塞を避けるのに有効であるようにも思われる¹³ 。ネズミモデルで、因子ＩＸａｉが、活性化された部分的スロンボプラスチン 時間（ＡＰＴＴ）（２２４）を長引かせないそれらの研究でのとおり、３００μ ｇ／ｋｇの治療的に有効な用量で因子ＩＸａｉを投与することは、後半時間また はＡＰＴＴのいずれかを同様に著しく変えない［それぞれ、ＩＸａｉ−処理（ｎ ＝７）のＰＴおよびＡＰＴＴ並びにベヒクル処理（ｎ＝４）マウスについて１３ ．４±０．７および７９．９±８９対１２．１±０．７および７０．６±８．９ 、Ｐ＝ＮＳ］。 脳卒中の発症後付与されるＩＸａｉが、効果的であることを示すデータは、血 栓の形成が、進行中の血栓症および進行中の繊維素溶解の過程の間の動的平衡を 表す別の興味深い仮説を導く。正常の（非虚血）環境下でさえ、この動的平衡は 、ヒトで生じることが示された¹⁹。因子ＩＸａｉが脳卒中の発症後に投与される 時でさえ有効であることを示す最近の研究でのデータは、この攻略法が、血栓症 を好む脳虚血症後に移行される、いっそう静止した（抗血栓性）血管壁フェノタ イプに向かって戻る動的平衡を戻すことを示唆する。 最終的考慮として、血栓溶解が、主要な閉塞血栓を首尾よく取除く、および／ または抗凝因剤法が、進行性微小循環血栓を制限するのに効果的である場合でさ え、血流は、通常前虚血レベルに戻ることに失敗する。これは、ＣＢＦが因子Ｉ Ｘａｉ（フィブリン／血小板蓄積を限定する）によって考慮すべく改善されるが 、ＣＢＦは、前虚血性レベルにいまだ戻らないという最近の研究でのデータによ って証明されている。このデータは、脳微小血管内皮細胞によるＰ−セレクチン およびＩＣＡＭ−１発現が、この考慮で特に密接な関係がありながら、後虚血性 好中球蓄積および連続微小血管プラギングを含めた、後虚血性脳低濯流の多重エ フェクター機構の存在を支持する^5、6。白血球接着レセプター発現の展望から見 るとき、これらの接着レセプターが不在である場合でさえ、ＣＢＦレベルは、前 虚血レベルに戻らない以外は対照と比較して脳卒中に続いて改善される。一緒に して、これらのデータは、微小血管血栓症および白血球接着が、後虚血性脳低灌 流に一緒に貢献することを示唆する。 要約すると、因子ＩＸａ、活性部位遮断因子ＩＸａの競合阻害剤の投与は、脳 卒中の治療のための新規療法を表す。この療法は、微小循環血栓を減じ、後虚血 性脳血流を改善し、脳卒中に伴う脳組織傷害を減じるのみならず、ＩＣＨの危険 を増やすことなしに、脳虚血症の発症後に付与される場合でさえそうできる。有 益な特性および出血形質転換の相対的に低い下降線の危険のこの組合せは、これ を正確に魅力的な、さらに試験するアプローチ法およびヒトの脳卒中での潜在的 な臨床治験にする。 参照文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 7/02 7/06 7/06 9/10 9/10 11/00 11/00 Ｃ０７Ｋ 14/645 Ｃ０７Ｋ 14/645 16/26 16/26 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 スタン、デビット アメリカ合衆国、ニューヨーク州 11020、 グレート・ネック、タナース・ロード 63 (72)発明者 シュミット、アン・マリー アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07417、フランクリン・レイクス、ヘイブ ン・ロード 242 (72)発明者 ローズ、エリック・エー アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07670、テナフライ オックスフォード・ ドライブ 96 (72)発明者 コノリー、イー・サンダー アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10014、 ニューヨーク、アパートメント ３―アー ル、ウエスト・イレブンス・ストリート 325 (72)発明者 ソロモン、ロバート・エー アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10964、 パリサデス、ジャスティン・コート １ (72)発明者 プレスチジャコモ、チャールズ・ジェイ アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07666、ティーネック、ヒルクレスト・ス トリート 557

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者の虚血性疾患を治療する方法であって、患者の虚血性疾患を治療する ために、十分な期間、十分な量の薬学的に許容される型のセレクチンアンタゴニ ストを患者に投与して白血球細胞の蓄積を妨げることを具備する方法。 ２．請求項１の方法であって、セレクチンアンタゴニストに、ペプチド類似物 、核酸分子、リボザイム、ポリペプチド、小分子、炭水化物分子、単糖、オリゴ 糖、又は抗体が含まれる方法。 ３．抗体がセレクチン抗体である請求項２の方法。 ４．抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である請求項３の方法 。 ５．セレクチンアンタゴニストに、ニトログリセリン又は一酸化窒素をアデノ シン3',5'-環状モノホスフェート、サイクリックAMP又はサイクリックGMP経路刺 激する物質が含まれる請求項１の方法。 ６．請求項１の方法であって、薬学的に許容される型が、セレクチンアンタゴ ニスト及び薬学的に許容される担体を具備する方法。 ７．請求項６の方法であって、担体に、エアロゾル、静脈内、経口、又は局所 担体が含まれる方法 ８．請求項１の方法であって、白血球細胞が好中球、単球、又は血小板である 方法。 ９．患者が哺乳動物である請求項１の方法。 １０．哺乳類がヒトである請求項９の方法。 １１．請求項１の方法であって、虚血性疾患が末梢血管疾患、肺塞栓、静脈血 栓、心筋梗塞、一過性虚血発作、不安定狭心症、可逆性虚血性神経欠損、鎌形赤 血球貧血症、又は発作性疾患である方法。 １２．患者が、心臓手術、肺手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、腹部手術、 又は臓器移植手術中である請求項１の方法。 １３．臓器移植手術に心臓、肺、膵臓、又は肝臓移植手術が含まれる請求項１ ２の方法。 １４．セレクチンが、P-セレクチン、E-セレクチン、又はL-セレクチンである 請求項１の方法。 １５．患者の虚血性疾患を治療する方法であって、十分な期間、十分な量の一 酸化炭素ガスを患者に投与することによって患者の虚血性疾患を治療することを 具備する方法。 １６．吸入又は体外暴露を介して投与される請求項１５の方法。 １７．量が空気中の約0.001％一酸化炭素から不活性ガス中の約2％一酸化炭素 をである請求項15の方法。 １８．不活性ガスに空気、酸素、アルゴン又は窒素が含まれる請求項１７の方 法。 １９．量が空気中の0.1％一酸化炭素である請求項１５の方法。 ２０．期間が、手術前の約１日前から約１日後である請求項１５の方法。 ２１．期間が、手術約12時間前から手術約12時間後である請求項１５の方法。 ２２．期間が、手術約12時間前から手術約１時間後である請求項１５の方法。 ２３．期間が、手術約１時間前から手術約１時間後である請求項１５の方法。 ２４．患者が哺乳動物である請求項１５の方法。 ２５．哺乳動物がヒトである請求項１５の方法。 ２６．虚血性疾患が、末梢血管疾患、肺塞栓、静脈血栓、心筋梗塞、一過性虚 血発作、不安定狭心症、可逆性虚血性神経欠損、鎌形赤血球貧血症、又は発作性 疾患である請求項１５の方法。 ２７．患者が、心臓手術、肺手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、腹部手術、 又は臓器移植手術中である請求項１５の方法。 ２８．臓器移植手術に心臓、肺、膵臓、又は肝臓移植手術が含まれる請求項２ ７の方法。 ２９．患者の虚血性疾患を治療する方法であって、患者の虚血性疾患を治療す るために、十分な期間、十分な量の薬学的に許容される型の不活化された第IX因 子を患者に投与しで凝固を阻害することを具備する方法。 ３０．量が約75〜550μｇ/kgである請求項２９の方法。 ３１．量が300μｇ/kgである請求項２９の方法。 ３２．薬学的に許容される型が、不活化された第IX因子には、不活化された第 IX因子及び薬学的に許容される担体を具備する請求項２９の方法。 ３３．担体が、エアロゾル、静脈内、経口、又は局所担体を具備する請求項３ ２の方法。 ３４．患者が哺乳動物である請求項２９の方法。 ３５．哺乳動物がヒトである請求項３４の方法。 ３６．虚血性疾患が、末梢血管疾患、肺塞栓、静脈血栓、心筋梗塞、一過性虚 血発作、不安定狭心症、可逆性虚血性神経欠損、鎌形赤血球貧血症、又は発作性 疾患である請求項２９の方法。 ３７．患者が、心臓手術、肺手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、腹部手術、 又は臓器移植手術中である請求項２９の方法。 ３８．臓器移植手術に心臓、肺、膵臓、又は肝臓移植手術が含まれる請求項２ ９の方法。 ３９．患者の虚血性疾患を改善し得る化合物を同定する方法であって、 ａ）発作動物モデルである動物に化合物を投与することと、 ｂ）該動物の発作後の症状を測定することと、 ｃ）ステップ(b)の発作後の症状を該化合物非存在下の発作動物モデルの発作 後の症状と比較して患者の虚血性疾患を改善し得る化合物を同定すること と、 を含む方法。 ４０．発作動物モデルが、局所大脳虚血及び再潅流のマウスモデルである請求 項３９の方法。 ４１．発作後の症状が、身体の調査、MRI、レーザードップラーフローメトリ ー、トリフェニルテトラゾリウムクロライド染色、神経欠損の化学的評価、ＣＴ スキャン、又は大脳皮質血流量によって測定される請求項３９の方法。 ４２．化合物がＰ−セレクチンアンタゴニストである請求項３９の方法。 ４３．患者の白血球の蓄積を防ぎ得る化合物を同定する方法であって、 ａ）発作動物モデルである動物に化合物を投与することと、 ｂ）該動物の発作後の症状を測定することと、 ｃ）ステップ(b)の発作後の症状を該化合物非存在下の発作動物モデルの発作 後の症状と比較して患者に白血球細胞が蓄積するのを防ぎ得る化合物を同 定することと、 を含む方法。 ４４．白血球細胞が好中球、単球、又は血小板である請求項４３の方法。 ４５．化合物が、Ｐ−セレクチン阻害剤、単球阻害剤、血小板阻害剤、又は好 中球阻害剤である請求項４３の方法。