DE69737562T2

DE69737562T2 - Behandlung einer ischämischen störung und zur verbesserung des infarktergebnis

Info

Publication number: DE69737562T2
Application number: DE69737562T
Authority: DE
Inventors: David J. Riverdale PINSKY; David Great Neck STERN; Ann Marie Franklin Lakes SCHMIDT; Eric A. Tenafly ROSE; E. Sander New York CONNOLY; Robert A. Palisades SOLOMON; Charles J. Teaneck PRESTIGIACOMO
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-25
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2017-09-26
Also published as: EP0951292A1; CA2266640A1; PT951292E; AU4594297A; DK0951292T3; EP1829550A2; CA2266640C; EP0951292A4; JP2001501612A; ES2285740T3; EP0951292B1; WO1998013058A1; ATE358492T1; DE69737562D1; EP1829550A3

Description

Die hierin offenbarte Erfindung wurde mit Regierungsunterstützung unter den National Institutes of Health, dem National Heart, Lung and Blood Institute-Preis HL55397 des Department of Health and Human Services gemacht. Dementsprechend hat die U.S.-Regierung bestimmte Rechte in dieser Erfindung.
Im Verlauf dieser Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen, um den Stand der Wissenschaft, wie er Fachleuten zum Zeitpunkt der hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindung bekannt ist, vollständiger zu beschreiben.
Hintergrund der Erfindung
Die Behandlung von ischämischen Störungen ist für viele Jahre der Fokus der Forschung gewesen. Die neue Verfügbarkeit von transgenen Mäusen hat zu einer aufkeimenden Zahl von Berichten geführt, die die Wirkungen von bestimmten Genprodukten auf die Pathophysiologie des Schlaganfalls beschreiben. Obwohl fokale cerebrale Ischämie-Modelle in Ratten gut beschrieben worden sind, sind Beschreibungen eines murinen Modells eines mittleren cerebralen Arterienverschlusses ungenügend, und die Quellen einer potenziellen experimentellen Variabilität bleiben undefiniert.
Eine akute Neutrophilen-Rekrutierung in einem postischämischen Herz- oder Lungengewebe hat schädliche Wirkungen in der frühen Reperfusionsperiode, aber die Mechanismen und Wirkungen des Neurophilen-Einströmens in der Pathogenese eines entstehenden Schlaganfalls bleiben umstritten.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Verwendung eines Gases, umfassend Kohlenmonoxid in einer ausreichenden Menge für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Vorbeugung einer ischämischen Erkrankung über einen ausreichenden Zeitraum in einem Individnum.
Weiterhin bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden hierin und in den Ansprüchen charakterisiert.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Neutrophilen-Akkumulierung, die einer fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion in der Maus folgt. Ein rechter mittlerer cerebraler Arterienverschluss wurde für 45 Minuten durchgeführt, gefolgt von 23 Stunden einer Reperfusion in männlichen C57BI/J6-Mäusen. Eine Stunde vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss wurden ≈3,3 × 10⁵ ¹¹¹In-markierte Neutrophile in die Schwanzvene injiziert. Ipsilaterale (rechte Hemisphäre) und kontralaterale (linke Hemisphäre) Zählungen wurden erhalten und auf g Gewebe normalisiert. (n = 7, ** = p < 0,01).
2A, 2B, 2C und 2D. Wirkung einer präoperativen Neutrophilen-Entleerung auf Anzeichen des Schlaganfallergebnisses. Männliche C57BI/J6-Mäuse wurden einem transitorischen mittleren cerebralen Arterienverschluss, wie oben beschrieben, unterzogen (Wildtyp, n = 16) und mit einer ähnliche Vorgehensweise verglichen, die in Mäusen durchgeführt wurde, die während der drei Tage vor dem Tag der Operation von Neutrophilen immun-entleert wurden (PMN-, n = 18). 2A. Infarktvolumina, berechnet basierend auf TTC-gefärbten cerebralen Reihenschnitten und ausgedrückt als die % des ipsilateralen Hemisphärenvolumens. 2B. Neurologischer Ausfallswert, bewertet vor der Anästhesie, 24 Stunden nach dem transitorischen mittleren cerebralen Arterienverschluss; 4 repräsentiert den schwersten neurologischen Ausfall. 2C. Cerebraler Blutfluss, gemessen durch Laser-Doppler-Flussmessungen 2 mm posterior des Bregmas, ausgedrückt als % des kontralateralen hemisphärischen Blutflusses. 2D. Mortalität 24 Stunden nach dem transitorischen mittleren cerebralen Arterienverschlusses. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001).
3. Expression von interzellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1)-Transkripten 24 Stunden nach dem mittleren cerebralen Arterienverschluss. RNA wurde von den ipsilateralen (Infarkt) und den kontralateralen (Nicht-Infarkt) Hemisphären von derselben Maus hergestellt, und ein Agarosegel wurde mit 20 μg Gesamt-RNA pro Reihe geladen. Nach einem Übernacht-Transfer auf eine Nylonmembran wurde der Northern-Blot mit einer murinen ³²P-markierten 1,90 kb ICAM-1-cDNA sondiert³³. Eine β-Actin-Sonde wurde als eine Kontrolle verwendet.
4A und 4B. Die Expression von interzellulärem Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1)-Antigen in den cerebralen Mikrogefäßen 24 Stunden nach dem mittleren cerebralen Arterienverschluss. Ein coronaler Schnitt des Gehirns wurde für eine ICAM-1-Immunfärbung erhalten, so dass die Nicht-Infarkt und die Infarkt-Hemisphären von demselben Gehirn unter identischen Färbebedingungen verglichen werden konnten. Die Färbung wurde unter Verwendung eines Ratte-anti-murinen ICAM-1-Antikörpers durchgeführt, wobei die Stellen der primären Antikörperbindung durch alkalische Phosphatase sichtbar gemacht wurden. 4A. Cerebrales Mikrogefäß im kontralateralen (Nicht-Infarkt) Schnitt eines Gehirns, erhalten 24 Stunden nach dem mittleren cerebralen Arterienverschluss. 4B. Cerebrales Mikrogefäß von der ipsilateralen (Infarkt) Hemisphäre von demselben Schnitt des Gehirns, wie in 4A gezeigt. Endotheliale Zellen der ipsilateralen cerebralen Mikrogefäße zeigen eine erhöhte Expression von ICAM-1 (hellrote Färbung). Vergrößerung 250X.
5A und 5B. Cerebrovaskuläre Anatomie in homozygoten ICAM-1-null-Mäusen (5B) und Wildtyp-Kontrollen (5A). Tusche-Färbung der cerebrovaskulären Anatomie mit einer Unter-Ansicht des Circulus arteriosus cerebri zeigt, dass es keine groben anatomischen Unterschiede im vaskulären Muster des cerebralen Kreislaufs mit intakten posterior kommunizierenden Arterien bei beiden gab.
6A und 6B. TTC-gefärbte Reihenschnitte nach 24 Stunden von repräsentativen Wildtyp- (6A) oder homozygoten ICAM-1-Null-Mäusen (6B), die einem transitorischen mittleren cerebralen Arterienverschluss unterzogen wurden. Der blasse weiße Bereich im mittleren cerebralen Arteriengebiet repräsentiert Infarkt-Gehirngewebe, wohingegen sich lebensfähiges Gewebe ziegelrot färbt. Eine Quantifizierung der Infarkt-Volumina durch Planimetrie von cerebralen Reihenschnitten in mehreren Experimenten ist in 7A gezeigt.
7A, 7B, 7C und 7D. Die Rolle von ICAM-1 im Schlaganfallergebnis. Ein transitorischer mittlerer cerebraler Arterienverschluss wurde, wie beschrieben, in ICAM-1 +/+ (Wildtyp, n = 16) oder ICAM-1 -/- (n = 13) Mäusen durchgeführt, und Anzeichen des Schlaganfallergebnisses wurden gemessen, wie in 2 beschrieben. 7A. Wirkung von ICAM-1 auf das Infarktvolumen, 7B. neurologischer Ausfallswert, 7C. cerebraler Blutfluss und 7D. Mortalität. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01).
8A und 8B. Wirkung einer Hypoxie auf die Weibel-Palade-Körper-Exocytose. 8A. Menschliche Nabelvenen wurden einer Hypoxie (pO₂ 15-20 Torr) oder Normoxie für die angezeigten Zeiträume ausgesetzt, und die von Willebrand-Faktor (vWF)-Sekretion wurde durch ELISA quantifiziert. *** = p < 0,001 für Hypoxie gegenüber Normoxie. 8B. Ähnliche Experimente wurden für 8 Stunden in der Anwesenheit von 2 mM Ca⁺⁺ (Ca⁺⁺ 2 mM), 0 mM Ca⁺⁺ (Ca⁺⁺-frei) oder 0 mM Ca⁺⁺ mit 2 mM EGTA, das zugefügt wurde, um mit dem extrazelluläre Rest-Ca⁺⁺ ein Chelat zu bilden (Ca⁺⁺-frei + EGTA), durchgeführt.
9A, 9B, 9C und 9D. Auswirkung einer endothelialen Hypoxie auf die P-Selectin-Expression und die Neutrophilen-Adhäsion. 9A. P-Selectin-Expression auf HUVECs, die einer Normoxie oder Hypoxie ausgesetzt wurden, bestimmt durch spezifische Bindung eines radioaktiv markierten monoclonalen anti-P-Selectin-IgG (WAPS12.2-Clon). Die Daten werden als relative Bindung im Vergleich zum normoxischen 4 h-Zeitpunkt ausgedrückt. 9B. Wirkung des Inhibierens der Proteinsynthese auf die Hypoxie-induzierte P-Selectin-Expression. In einem getrennten Experiment wird die Wirkung von Cycloheximid (10 μg/mL, + CHX), das zum Beginn des normoxischen oder hypoxischen 4 Stunden-Zeitraums zugefügt wurde, auf die P-Selectin-Expression gezeigt. Ein Vergleich wird mit gleichzeitigen Experimenten gemacht, die in der Abwesenheit von Cycloheximid (-CHX) durchgeführt wurden, wobei die Daten als relative Bindung im Vergleich zur normoxischen (-CHX) Bindung ausgedrückt werden. Mittelwerte ± SEM sind gezeigt; * = p < 0,05 gegenüber der Normoxie (-CHX);
= p < 0,05 gegenüber Normoxie (+CHX). Einsatz: Wirkung von Cycloheximid (10 μg/mL) auf die Proteinsynthese nach 4 Stunden, gemessen als Trichloressigsäure-präzipitierbare ³⁵S-markierte Proteine nach einer ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein-Verabreichung. 9C. ¹¹¹Indium-markierte Neutrophilen-Bindung an normoxische (N) oder hypoxische (H) menschliche, endotheliale Nabelvenen-Monolayer nach 4 h in der Anwesenheit eines blockierenden anti-P-Selectin-Antikörpers (WAPS 12.2-Clon) oder eines nicht-blockierenden anti-P-Selectin-Antikörpers (AC1.2-Clon). Mittelwerte ± SEM sind gezeigt; ** = p < 0,01.
10A, 10B und 10C. Rolle von Neutrophilen und endothelialem P-Selectin in der Nager-Herzkonservierung, gefolgt von heterotopischer Transplantation. 10A. Ratten-Herzkonservierung. Herzen wurden sofort nach dem Gewinnen transplantiert (frisch, n = 8) oder für 16 h in Ringer-Lactatlösung bei 4°C konserviert, gefolgt von einer Transplantation (Prsvd, n = 4). Die Wirkung des Verabreichens eines nicht-blockierenden anti-P-Selectin-Antikörpers (AC1.2, n = 3), der Immun-Ausschöpfung von Neutrophilen der Empfängern vor der Spenderherztransplantation (-PMN, n = 4) oder des Verabreichens von 250 μg blockierendem anti-P-Selectin-IgG (n = 4) 10 Minuten vor der Reperfusion auf das Herztransplantat-Überleben (schattierte Balken) und die Leukostase (Myeloperoxidase-Aktivität, dunkle Balken). Mittelwerte ± SEM sind gezeigt; Für das Transplantatüberleben, c gegenüber a, p < 0,0001; g gegenüber c, p < 0,05; i gegenüber e oder c, p < 0,05. Für die Transplantat-Neutrophilen-Infiltration, d gegenüber b, p < 0,01; h gegenüber d, p < 0,05; j gegenüber d oder f, p < 0,05. 10B. Rolle des coronaren endothelialen P-Selectin in der Herzkonservierung unter Verwendung von Spenderherzen von P-Selectin-Null (oder Wildtyp-Kontroll)-Mäusen, die vor der Konservierung frei von Blut gespült wurden. Das Transplantatüberleben wurde durch das Vorliegen/die Abwesenheit einer elektrischen/mechanischen Herzaktivität genau zehn Minuten nach der Re- Etablierung des Blutflusses bewertet. 10C: Quantifizierung der Neutrophilen-Infiltration durch Messen der Myeloperoxidase-Aktivität (dABs 460 nm/min), wie beschrieben^15,18. (Für die Balken, die von links nach rechts gezeigt sind, n = 14, 8, 13 beziehungsweise 7, mit den angezeigten p-Werten).
11A und 11B. Weibel-Palade-Körper-Freisetzung während der menschlichen Herzoperation in 32 Patienten. 11A. Coronares Sinusblut wurde am Beginn (CS₁) und Ende (CS₂) des ischämischen Zeitraums (Aorten-Abklemmung) gezogen. ELISAs wurden für Thrombomodulin (TM) und den vWF durchgeführt. 11B. vWF-Immunelektrophorese einer repräsentativen Probe von CS₁- und CS₂-Blut von demselben Patienten (die Verdünnungsfaktoren sind angezeigt). Es gibt einen Anstieg in den Multimeren mit hohem Molekulargewicht, die in den CS₂-Proben nachgewiesen werden.
12A, 12B, 12C und 12D. Überblick des operativen Aufbaus für das murine fokale, cerebrale Ischämie-Modell. 12A. Das Naht-basierende Rückzugssystem ist in dem Diagramm gezeigt. 12B. Ansicht durch das Operationsmikroskop. Der große Gefäßstumpf repräsentiert die externe Carotis-Arterie, die inferomedial im Operationsfeld gelegen ist. 12C. Fotographie einer hitzeabgestumpften verschließenden Naht von der angezeigten Dicke (5-0- [unten] oder 6-0-Nylon [oben]). 12D. Schematisches Diagramm der murinen cerebrovaskulären Anatomie mit einem Faden in der anterioren cerebralen Arterie, die die mittlere cerebrale Arterie an ihrem Ursprungspunkt verschließt.
13. Vergleich der cerebrovaskulären Anatomie zwischen Stämmen von Mäusen. Nach der Anästhesie wurde den Mäusen eine intracardiale Injektion von Tusche verabreicht, gefolgt von einer humanen Euthanasie. Ein intakter Circulus arteriosus cerebri, einschließlich der bilateralen posterior kommunizierenden Arterien, kann in allen Stämmen beobachtet werden, was darauf hinweist, dass es keine groben Stammes-bezogenen Unterschiede in der cerebrovaskulären Anatomie gibt.
14A, 14B und 14C. Wirkungen des Mausstamms auf das Schlaganfallergebnis. Mäuse (20-23 g Männchen) wurden 45 Minuten eines MCA-Verschlusses (unter Verwendung einer 12 mm 6.0 Verschluss-Naht), gefolgt von 24 Stunden einer Reperfusion ausgesetzt, und die Anzeichen eines Schlaganfallergebnisses wurden bestimmt. 14A. Wirkungen des Stammes auf das Infarktvolumen, bestimmt als ein Prozentsatz des ipsilateralen Hemisphären-Volumens, wie im Verfahren-Abschnitt beschrieben. 14B. Wirkungen des Stamms auf den neurologischen Ausfallswert, bewertet von kein neurologischer Ausfall (0) bis zu schwerer neurologischer Ausfall (4), wobei die Werte bestimmt werden, wie im Verfahren-Abschnitt beschrieben. 14C. Wirkungen des Stamms auf den cerebralen Blutfluss, gemessen durch Laser-Doppler-Flussmessung als relativer Fluss über das Infarkt-Gebiet im Vergleich zum Blutfluss über den kontralateralen (Nicht-Infarkt) Cortex. Die Stämme schlossen 129J- (n = 9), CD1-(n = 11) und C57/BI6-Mäuse (n = 11) ein; * = p < 0,05 gegenüber 129J-Mäusen.
15A, 15B und 15C. Wirkungen der Tiergröße und des Durchmessers der verschließenden Naht auf das Schlaganfallergebnis. Männliche CD-1-Mäuse der angezeigten Größen wurden einem mittleren cerebralen Arterienverschluss (45 Minuten), gefolgt von einer Reperfusion (24 Stunden) ausgesetzt, wie im Verfahren-Abschnitt beschrieben. Die Nahtgröße (Breite) wird in jedem Feld angezeigt. Kleine Tiere (n = 11) waren jene zwischen 20-25 g (Durchschnitt 23 g), und große Tiere waren zwischen 28-35 g (Durchschnitt 32 g, n = 14 für 6.0-Naht, n = 9 für 5.0-Naht). 15A. Wirkungen der Tier/Naht-Größe auf das Infarkt-Volumen, 15B. neurologischer Ausfallswert, und 15C. cerebraler Blutfluss, gemessen, wie in 14 beschrieben. Die P-Werte sind wie angezeigt.
16A, 16B und 16C. Wirkungen der Temperatur auf das Schlaganfallergebnis. Männliche C57/BI6-Mäuse wurden 45 Minuten eines MCA-Verschlusses (6.0-Naht), gefolgt von einer Reperfusion ausgesetzt. Die Kerntemperaturen wurden für 90 Minuten bei 37°C (Normothermie, n = 11) unter Verwendung einer intrarektalen Sonde mit einem Wärmekopplungs-kontrollierten Wärmeinstrument beibehalten. In der zweiten Gruppe (Hypothermie, n = 12) wurden die Tiere nach anfänglichen 10 Minuten der Normothermie in Käfigen platziert, die bei Zimmertemperatur gelassen wurden (mittlere Kerntemperatur 31°C nach 90 Minuten). In beiden Gruppen wurden die Tiere nach diesem 90 Minuten-Beobachtungszeitraum in ihre Käfige zurückgebracht, wobei die Raumtemperatur für die Dauer der Beobachtung bei 37°C beibehalten wurde. Vierundzwanzig Stunden nach dem MCA-Verschluss wurden Anzeichen des Schlaganfallergebnisses aufgezeichnet; 16A. Infarktvolumen, 16B. neurologischer Ausfallswert und 16C. cerebraler Blutfluss, gemessen, wie in 3 beschrieben. * = p < 0,05 Werte sind, wie gezeigt.
17A, 17B und 17C. Ergebnis-Vergleiche zwischen permanenter fokaler cerebraler Ischämie und transitorischer fokaler cerebraler Ischämie, gefolgt von einer Reperfusion. Die MCA wurde entweder permanent (n = 11) oder transitorisch (45 Minuten, n = 17) mit einer 6.0-Gauge-Naht in männlichen 22 g-C57/BI6-Mäusen verschlossen, wie im Verfahren-Abschnitt beschrieben. Vierundzwanzig Stunden nach dem MCA-Verschluss wurden Anzeichen des Schlaganfallergebnisses aufgezeichnet; 17A. Infarktvolumen, 17B. neurologischer Ausfallswert und 17C. cerebraler Blutfluss, gemessen, wie in 14 beschrieben.
18A und 18B. P-Selectin-Expression und Neutrophilen (PMN)-Akkumulation nach einem mittleren cerebralen Arterienverschluss (MCAO) in Mäusen. 18A. P-Selectin-Expression nach MCAO und Reperfusion. Die relative Expression des P-Selectin-Antigens in der ipsilateralen cerebralen Hemisphäre nach einem mittleren cerebralen Arterienverschluss wurde unter Verwendung entweder eines ¹²⁵I-markierten monoclonalen Ratten-anti-P-Selectin-IgG oder eines ¹²⁵I-markierten nicht-immunen Ratten-IgG gezeigt, um auf eine nichtspezifische Extravasation zu kontrollieren. Die Experimente wurden durchgeführt, wie in der Legende zur 18 beschrieben. Die Werte werden als ipsilaterale cpm/kontralaterale cpm ausgedrückt. n = 6 für jede Gruppe, außer für die Kontrolle 30 min (n = 4); ^⧧ = p < 0,001, 30 min Reperfusion gegenüber unmittelbarem Vor-Verschluss; * = p < 0,025, Änderung in der P-Selectin-Akkumulierung gegenüber der Änderung in der Kontroll-IgG-Akkumulierung. 18B. Zeitverlauf der PMN-Akkumulierung nach der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion in der Maus. Für diese Experimente wurden ≈3,3 × 10⁵ ¹¹¹In-markierte PANS 15 Minuten vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss (MCAO) intravenös in PS-Wildtyp (PS +/+)-Mäuse injiziert. Die ¹¹¹In-PMN-Akkumulierung wurde unmittelbar nach dem Töten als das Verhältnis ipsilaterale/kontralaterale cpm unter den folgenden Versuchsbedingungen gemessen: vor dem MCAO (Prä-O, n = 4), unmittelbar nach dem MCAO (Post-C, n = 6) und 10 Minuten nach dem MCAO, aber noch vor der Reperfusion (:10 Post-C, n = 6). Um die Wirkung der Reperfusion auf die PMN-Akkumulierung zu etablieren, wurde die Reperfusion nach 45 Minuten der Ischämie begonnen. Die PMN-Akkumulierung wurde nach 30 Minuten (n = 6), 300 Minuten (n = 3) und 22 Stunden (n = 8) der Reperfusion gemessen. Unter identischen Bedingungen wurde die PMN-Akkumulierung in P-Selectin-Null (PS -/-) Mäusen nach 45 Minuten der Ischämie und 22 Stunden der Reperfusion gemessen (n = 7, * = p < 0,05 gegenüber 45 min MCAO/22 h Reperfusion in PS +/+ Tieren).
19. Die Rolle von P-Selectin im cerebrovaskulären Nicht-Rückfluss. Der cerebrale Blutfluss wurde in PS +/+ (oberes Feld) und PS -/- (mittleres Feld) Mäusen unter Verwendung einer Laser-Dopplerflusssonde gemessen und als der Prozentsatz des kontralateralen (nicht ischämischen) Hemisphären-Blutflusses (± SEM) ausgedrückt. Der Blutfluss wurde zu den folgenden Zeitpunkten gemessen: a, vor dem MCAO (PS +/+, n = 16; PS -/-, n = 23); b, unmittelbar nach dem MCAO (PS +/+, n = 42; PS -/-, n = 40); c, 10 Minuten nach dem MCAO, aber noch vor der Reperfusion (PS +/+, n = 36; PS -/-, n = 34); d, unmittelbar nach der Reperfusion (PS +/+, n = 36, PS -/-, n = 34); e, 30 Minuten nach der Reperfusion (PS +/+, n = 8; PS -/-, n = 5); und f, 22 Stunden nach der Reperfusion (PS +/+, n = 15, PS -/-, n = 5). Das untere Feld repräsentiert eine Überlagerung der oberen zwei Felder, wobei die Fehlerbalken für die Klarheit ausgelassen wurden.
20. Cerebrovaskuläre Anatomie in homozygoten P-Selectin-Null-Mäusen, PS -/- (rechts) und Wildtyp-Kontrollen, PS +/+ (links). Eine Tusche/Kohlenschwarz-Färbung der cerebrovaskulären Anatomie mit einer Unter-Ansicht des Circulus arteriosus cerebri zeigt, dass es mit intakten posterior kommunizierenden Arterien bei beiden keine groben anatomischen Unterschiede im vaskulären Muster des cerebralen Kreislaufs gab.
21A, 21B und 21C. Wirkung des P-Selectin-Gens auf Schlaganfallergebnisse. Ein mittlerer cerebraler Arterienverschluss wurde in P-Selectin +/+ (n = 10) oder P-Selectin -/- (n = 7) Mäusen für 45 Minuten durchgeführt, gefolgt von 22 Stunden einer Reperfusion. Die Wirkung von P-Selectin auf: 21A. das Infarktvolumen, gezeigt durch 2% 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung und berechnet als Prozent der ipsilateralen Hemisphäre; 21B. den neurologischen Ausfallswert (1 = normale spontane Bewegungen; 2 = Kreisen im Uhrzeigersinn; 3 = Drehen im Uhrzeigersinn; 4 = keine Antwort auf schädliche Stimuli); 21C. den Überlebensanteil (%) zur Zeit der Tötung (* = p < 0,05).
22A, 22B, 22C und 22D. Wirkung einer P-Selectin-Blockade auf die Schlaganfallergebnisse. PS +/+ Mäusen wurde entweder ein blockierendes Ratte-anti-Maus-anti-P-Selectin-IgG (Clon RB 40.34, 30 μg/Maus) oder eine ähnliche Dosis eines nicht-immun-Ratten-IgG unmittelbar vor der Operation gegeben. 22A. Cerebraler Blutfluss 30 Minuten nach der Reperfusion; Nach 22 Stunden der Reperfusion sind die Infarktvolumina 22B., die neurologischen Ausfallswerte 22C. und die Mortalität 22D. gezeigt. (n = 7 für jede Gruppe, * = p < 0,05).
23A und 23B. 23A. Die Wirkung einer Kohlenmonoxid-Inhalation auf die cerebralen Infarktvolumina. Die Mäuse wurden in Glasglocken platziert, in denen sie 0,1% CO für 12 Stunden ausgesetzt wurden. Nach dieser Behandlung wurden sie aus den Glasglocken entfernt und einem intraluminalen Verschluss der mittleren cerebralen Arterie unterzogen. Nach 24 Stunden wurden die Tiere getötet und die Infarktvolumina durch Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung gemessen, wie in 25 gezeigt. Die Quantifizierung der Infarktvolumina (Mittelwert ± SEM) ist als Prozent des Infarkts der ipsilateralen Hemisphäre ausgedrückt. Diese Daten zeigen, dass eingeatmetes CO die Infarktvolumina nach einem Schlaganfall reduziert.
23B. Die Wirkung einer Kohlenmonoxid-Inhalation auf die Mortalität nach einem Schlaganfall. Die Experimente wurden durchgeführt, wie oben beschrieben. Die Mortalität nach 24 Stunden ist gezeigt. Diese Daten zeigen, dass eingeatmetes CO die Mortalität nach einem Schlaganfall reduziert.
24A, 24B und 24C. 24A. Dosis-Antwort des eingeatmeten Kohlenmonoxids auf das Schlaganfallergebnis. Die Experimente sind oben beschrieben. CO wurde in den angegebenen Dosen eingeatmet. Diese Daten zeigen, dass eingeatmetes CO das Infarktvolumen in einer Dosis-abhängigen Weise reduziert, wobei 0,1 % einen optimalen Schutz liefert. 24B und 24C. Die Rolle der Häm-Oxigenase, das Enzym, das CO produziert, im Schlaganfall. Den Tieren wurde entweder das Vehikel (DMSO) alleine als eine Kontrolle oder Zinkprotoporphyrin IX (ZnPP) oder Zinnprotoporphyrin IX (SnPP) gegeben. In einer Schlussgruppe wurde den Mäusen Biliverdin (Bili), eine Verbindung, die während des Vorgangs des Häm-Abbaus durch die Häm-Oxigenase zusammen mit CO gebildet wird, gegeben. Das Zinke Feld zeigt die Infarktvolumina. Das rechte Feld zeigt die Mortalität. Diese Experimente zeigen, dass, wenn die Häm-Oxigenase-Aktivität blockiert wird, die Schlaganfallergebnisse schlimmer sind (größere Infarkte und höhere Mortalitäten). Da die Biliverdin-Verabreichung nicht schützend ist, legen diese Daten nahe, dass das andere CO-Produkt der Häm-Oxigenase-Aktivität (CO) schützend ist.
25. TTC-Färbung von cerebralen Reihenschnitten für die Tiere von 23. Infarktgewebe erscheint weiß und lebensfähiges Gewebe erscheint ziegelrot.
26A-26F. Die Wirkung einer fokalen cerebralen Ischämie auf die Häm-Oxigenase I (HO-I)-Induktion. 26A-26C zeigen eine in situ-Hybridisierung von HO-I-mRNA im Schlaganfall (26B) und in Kontrollen (26A und 26C). 26D-26F zeigen eine Immunhistochemie des HO-I-Proteins. 26E zeigt, dass das Protein nach dem Schlaganfall in Blutgefäßen und Astrocyten exprimiert wird. 26D und 26F zeigen, dass das Protein in den Kontrollen nicht in Blutgefäßen und Astrocyten exprimiert wird.
27. Die Wirkung einer fokalen cerebralen Ischämie auf die Häm-Oxigenase-I (HO-I)-mRNA-Induktion. Kontralateral zeigt die Nicht-Schlaganfall-Seite des Gehirns an. Ipsilateral zeigt die Gehirnseite an, die dem Schlaganfall ausgesetzt war. In beiden Tieren zeigt die Seite des Gehirns, die dem Schlaganfall ausgesetzt war, erhöhte HO-I, aber die Nicht-Schlaganfall-Seite tut dies nicht.
28. Wirkung einer Hypoxie auf die Häm-Oxigenase-I (HO)-Induktion. Mäuse, die einer hypoxischen Umgebung für 12 Stunden ausgesetzt wurden (um eine Ischämie zu stimulieren), zeigen im Vergleich zu normoxischen Kontrollen eine erhöhte Häm-Oxigenase-I-mRNA. Diese Daten zeigen einen potenziellen Mechanismus, durch den ein hypoxisches Vor-Aussetzen auch einen Schutz gegen nachfolgende ischämische Vorgänge verleihen kann, was sich bei Mäusen, die einer Hypoxie, gefolgt von einem Schlaganfall, ausgesetzt wurden, bestätigt hat.
29. Wirkung einer Hypoxie auf die Häm-Oxigenase-I (HO-I)-Proteinexpression in endothelialen Mausgehirnzellen. Die Hypoxie bewirkt, dass die HO-I-Proteinspiegel in diesen Gehirn-abstammenden endothelialen Zellen steigen.
30. Wirkung einer Hypoxie auf die Häm-Oxigenase-I (HO-I)-mRNA-Induktion in endothelialen Mausgehirnzellen. Die Hypoxie bewirkt, dass die HO-I-mRNA-Spiegel in diesen Gehirn-abstammenden endothelialen Zellen ansteigen.
31A-31D. P-Selectin-Expression und Neutrophilen (PMN)-Akkumulierung nach einem mittleren cerebralen Arterienverschluss (MCAO) in Mäusen. 31A. P-Selectin-Expression nach MCAO und Reperfusion. Die relative Expression des P-Selectin-Antigens in der ipsilateralen cerebralen Hemisphäre nach einem mittleren cerebralen Arterienverschluss wurde unter Verwendung von entweder einem ¹²⁵I-markierten monoclonalen Ratten-anti-P-Selectin-IgG oder einem ¹²⁵I-markierten nicht-immun-Ratten-IgG gezeigt, um auf eine nichtspezifische Extravasation zu kontrollieren. Die Werte sind als ipsilaterale cpm/kontralaterale cpm ausgedrückt. n = 6 für jede Gruppe, außer für die Kontrolle 30 min (n = 4); ^⧧ = p < 0,001, 30 min Reperfusion gegenüber unmittelbarem Vorverschluss; * = p < 0,025, Änderung in der P-Selectin-Akkumulierung gegenüber der Änderung in der Kontroll-IgG-Akkumulierung. 31B und 31C. Immunhistochemische Lokalisation der P-Selectin-Expression in einem Abschnitt des Gehirns von einer Maus, die 45 Minuten MCAO, gefolgt von einer Stunde Reperfusion unterzogen wurde. Die ipsilateralen und kontralateralen cerebralen corticalen Schnitte sind von derselben Maus gezeigt. Die Pfeile zeigen auf ein cerebrales Mikrogefäß, wobei die dunkelbraune Farbe die P-Selectin-Expression auf der endothelialen Zelloberfläche repräsentiert. 31D.
Zeitverlauf der PMN-Akkumulierung nach der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion in der Maus. Für diese Experimente wurden ≈3,3 × 10⁵ ¹¹¹In-markierte PMNs 15 Minuten vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss (MCAO) intravenös in PS-Wildtyp (PS +/+) Mäuse injiziert. Die ¹¹¹In-PMN-Akkumulierung wurde unmittelbar nach der Tötung als das Verhältnis der ipsilateralen/kontralateralen cpm unter den folgenden Versuchsbedingungen gemessen: vor dem MCAO (Prä––O, n = 4), unmittelbar nach dem MCAO (Post-C, n = 6) und 10 Minuten nach dem MCAO, aber noch vor der Reperfusion (:10 Post-O, n = 6). Um die Wirkung der Reperfusion auf die PMN-Akkumulierung zu etablieren, wurde die Reperfusion nach 45 Minuten einer Ischämie begonnen. Die PMN-Akkumulierung wurde nach 30 Minuten (n = 6), 300 Minuten (n = 3) und 22 Stunden (n = 8) der Reperfusion gemessen. Unter identischen Bedingungen wurde die PMN-Akkumulierung in P-Selectin-Null (PS -/-) Mäusen nach 45 Minuten einer Ischämie und 22 Stunden Reperfusion gemessen (n = 7, * = p < 0,05 gegenüber 45 min MCAO/22 h Reperfusion in PS +/+ Tieren).
32A-32C. Die Rolle von P-Selectin im cerebrovaskulären Nicht-Rückfluss. Der cerebrale Blutfluss wurde in PS +/+ (oberes Feld) und PS -/- (mittleres Feld) Mäusen unter Verwendung einer Laser-Dopplerfluss-Sonde gemessen und als der Prozentsatz des kontralateralen (nicht ischämischen) hemisphärischen Blutflusses (± SEM) ausgedrückt. Der Blutfluss wurde zu den folgenden Zeitpunkten gemessen: a, vor dem MCAO (PS +/+, n = 16; PS -/-, n = 23); b, unmittelbar nach dem MCAO (PS +/+, n = 42; PS -/-, n = 40); c, 10 Minuten nach dem MCAO, aber noch vor der Reperfusion (PS +/+, n = 36; PS -/-, n = 34); d, unmittelbar nach der Reperfusion (PS +/+, n = 36, PS -/-, n = 34); e, 30 Minuten nach der Reperfusion (PS +/+, n = 8; PS -/-, n = 5); und f, 22 Stunden nach der Reperfusion (PS +/+, n = 15, PS -/-, n = 5). Das untere Feld repräsentiert eine Überlagerung der oberen zwei Felder, wobei die Fehlerbalken für die Klarheit ausgelassen wurden.
33A-33B. Wirkung des P-Selectin-Gens auf die Schlaganfallergebnisse. Ein mittlerer cerebraler Arterienverschluss wurde für 45 Minuten durchgeführt, gefolgt von 22 Stunden einer Reperfusion in P-Selectin +/+ (n = 10) oder P-Selectin -/- (n = 7) Mäusen. Die Wirkung von P-Selectin auf: 33A. das Infarktvolumen, gezeigt durch 2% 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung und berechnet als Prozent der ipsilateralen Hemisphäre; 33B. Prozentüberleben zum Zeitpunkt der Tötung. Mittelwerte ± SEM sind angezeigt, wobei die Zahlen der Tiere, von denen das Prozentüberleben berechnet wurde, über den Überlebensbalken angezeigt sind (* = p < 0,05).
34. Wirkung einer P-Selectin-Blockade auf die Schlaganfallergebnisse. PS +/+ Mäusen wurde entweder ein blockierendes Ratte-anti-Maus-anti-P-Selectin-IgG (Clon RB 40.34, 30 μg/Maus) oder eine ähnliche Dosis eines nicht-immun-Ratten-IgG unmittelbar vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss (Prä-MCAO; n = 7 für jede Gruppe) oder nach dem Verschluss der mittleren cerebralen Arterie (Post-MCAO; n = 9 für den Kontroll-Antikörper, n = 6 für den funktionell blockierenden anti-P-Selectin-Antikörper) gegeben. In beiden Fällen wurde die intraluminale verschließende Naht nach einem 45 Minuten-ischämischen Zeitraum entfernt, um eine klinische Reperfusion zu stimulieren. Nach 22 Stunden der Reperfusion sind die Infarktvolumina (dunkle Balken), der relative cerebrale Blutfluss 30 Minuten nach der Reperfusion (diagonal gestreifte Balken) und das Überleben (leicht schattierte Balken) gezeigt. Mittelwerte ± SEM sind angezeigt, wobei die Zahlen der Tiere, von denen das Prozentüberleben berechnet wurde, über den Überlebens-Balken angezeigt sind. * = p < 0,05 gegenüber dem Kontroll-Antikörper.
35A-35B. Bestätigung des quantitativen spektrophotometrischen intracerebralen Blutungstests in der Abwesenheit (35A) oder Anwesenheit (35B) von Gehirngewebe. 35A, Standardkurve, in der bekannte Konzentrationen von Hämoglobin zu Cyanomethämoglobin reduziert wurden, wonach die OD bei 550 nm gemessen wurde. N = 5 Bestimmungen an jedem Punkt, wobei Mittelwerte ± SEM gezeigt sind. Die Gleichung für die Ausgleichsgerade und der r-Wert sind gezeigt. 35B. Bekannte Konzentrationen von Hämoglobin (unter Verwendung von autologem Blut, verdünnt in Kochsalzlösung) wurden zu festgesetzten Volumen von frischem Gehirngewebe-Homogenat zugefügt, und der spektrophotometrische Hämoglobintest wurde durchgeführt. Die Gehirne wurden in Hemisphären geteilt; für jedes Tier wurde eine Hemisphäre für 20 Minuten in physiologische Kochsalzlösung eingetaucht (NS, durchgehende Linie), und die andere Hemisphäre wurde für 20 Minuten in Triphenyltetrazoliumchlorid platziert (TTC, gestrichelte Linie) (ähnlich zu der Vorgehensweise, die durchgeführt würde, um das cerebrale Infarktvolumen zu messen). Für jede Konzentration von zugefügtem Hämoglobin wurde der spektrophotometrischer Hämoglobintest an 6 Hemisphären durchgeführt. Mittelwerte ± SEM sind gezeigt.
36A-36B. Quantitativer spektrophotometrischer Hämoglobintest. 36A. Wirkungen einer Kollagenase-Infusion und von rt-PA auf die quantitative murine ICH. Mäuse wurden stereotaktisch mit ICH-induzierenden Mitteln in die rechten tiefen Cortex/Basalganglien infundiert. Die Gehirne wurden 24 Stunden später gewonnen, und der spektrophotometrische Hämoglobintest wurde durchgeführt, um die ICH zu quantifizieren. Die Mäuse wurden 1) keiner Behandlung (Kontrolle), 2) einer stereotaktischen Infusion von 1 μl normaler Kochsalzlösung (Schein), 3) einer stereotaktischen Infusion von 0,024 μg Kollagenase B in 1 μl normaler Kochsalzlösung (Kollagenase) oder 4) einer stereotaktischen Infusion von Kollagenase B (wie oben), gefolgt von einem intravenösen Gewebe-Plasminogen-Aktivator (1 mg/kg in 0,2 μl normaler Kochsalzlösung) durch dorsale Penisvenen-Injektion (Kollagenase + rt-PA) ausgesetzt. **p < 0,001 gegenüber Schein oder Kontrolle. 36B. Wirkung des rt-PA nach einem fokalen ischämischen Schlaganfall auf die quantitative murine ICH. Mäuse wurden einem 45 Minuten MCA-Verschluss, gefolgt von einer Reperfusion und dann 1) intravenös 0,2 μl normaler Kochsalzlösung (Schlaganfall + Kochsalz) oder 2) intravenösem Gewebe-Plasminogen-Aktivator (15 mg/kg in 0,2 μl normaler Kochsalzlösung) (Schlaganfall + rt-PA) ausgesetzt. Die Gehirne wurden 24 h später gewonnen, und der spektrophotometrische Hämoglobintest wurde durchgeführt, um die ICH zu quantifizieren. **p < 0,05.
37. Demonstration des Bewertungssystems, das für die visuelle Bestimmung einer ICH nach einem Schlaganfall verwendet wurde. Jeder Schnitt, der von verschiedenen Tieren genommen wurde, die einem Schlaganfall ausgesetzt waren, repräsentiert denen coronalen Schnitt eines Gehirn, der den maximalen hämorrhagischen Durchmesser zeigt. Die Zahlen korrespondieren mit dem visuell bestimmten Blutungs-Wert, wie im Verfahren-Abschnitt definiert.
38A-38B. Visueller ICH-Wert. 38A. Wirkungen einer Kollagenase-Infusion und von rt-PA auf den murinen visuellen ICH-Wert. Die Mäuse wurden stereotaktisch mit ICH-induzierenden Mitteln in die rechten tiefen Cortex/Basalganglien infundiert. Die Mäuse wurden 1) keiner Behandlung (Kontrolle), 2) einer stereotaktischen Infusion von 1 μl normaler Kochsalzlösung (Schein), 3) einer stereotaktischen Infusion von 0,024 μg Kollagenase B in 1 μl normaler Kochsalzlösung (Kollagenase) oder 4) einer stereotaktischen Infusion von Kollagenase B (wie oben), gefolgt von einem intravenösen Gewebe-Plasminogen-Aktivator (1 mg/kg in 0,2 μl normaler Kochsalzlösung) durch eine dorsale Penisvenen-Injektion (Kollagenase + rt-PA) ausgesetzt. Die Gehirne wurden 24 h später gewonnen, in 1 mm-coronale Schnitte geschnitten und durch einen objektiven Beobachter bewertet, wie im Verfahren-Abschnitt beschrieben. *p < 0,05 gegenüber Kollagenase, p<0,005 gegenüber Schein oder Kontrolle. 38B. Wirkung des rt-PA nach einem fokalen ischämischen Schlaganfall auf den murinen visuellen ICH-Wert. Die Mäuse wurden 45 Minuten eines MCA-Verschlusses, gefolgt von einer Reperfusion und dann 1) intravenös 0,2 μl normaler Kochsalzlösung (Schlaganfall + Kochsalz) oder 2) intravenösem Gewebe-Plasminogen-Aktivator (15 mg/kg in 0,2 μl normaler Kochsalzlösung) (Schlaganfall + rt-PA) ausgesetzt. Die Gehirne wurden 24 h später gewonnen, in 1mm coronale Schnitte geschnitten und durch einen objektiven Beobachter bewertet, wie im Verfahren-Abschnitt beschrieben *p > 0,01. Die individuellen Werte für die visuellen ICH-Werte sind gezeigt, wobei der Medianwert für jede Gruppe durch eine horizontale Linie angezeigt ist.
39. Korrelation zwischen der visuellen ICH und dem spektrophotometrischen Hämoglobintest. Die optische Dichte bei 550 nm (Ordinate) repräsentiert die Ergebnisse, die vom spektrophotometrischen Hämoglobintest erhalten wurden, in dem Gehirngewebe (von allen Experimenten) analysiert wurde. Die korrespondierenden visuellen ICH-Werte (wie in 38 gezeigt) sind entlang der Abszisse gezeichnet. Für jeden Punkt sind Mittelwerte ± SEM gezeigt. Eine lineare Korrelation wurde unter Verwendung der linearen Pearson-Korrelation durchgeführt, wobei die Gleichung der Linie und der r-Wert gezeigt sind.
40A-40F. 40A. Wirkung von Schlaganfall und einer Faktor IXai-Verabreichung im Schlaganfall auf die Akkumulierung von radioaktiv markierten Blutplättchen. ¹¹¹Indium-Blutplättchen wurden entweder in Kontrolltiere ohne Schlaganfall (n = 4) oder in Tiere unmittelbar vor dem Schlaganfall mit (n = 7) oder ohne präoperative Verabreichung des Faktor IXai (300 μg/kg, n = 7) verabreicht. Die Blutplättchen-Akkumulierung ist als die ipsilateralen cpm/kontralateralen cpm ausgedrückt. Mittelwerte ± SEM sind gezeigt. *p < 0,05 gegenüber kein Schlaganfall; **p < 0,05 gegenüber Schlaganfall + Vehikel. 40B. Akkumulierung von Fibrin in cerebralem Infarktgewebe. Zweiundzwanzig Stunden nach der fokalen cerebralen Ischämie und der Reperfusion wurde ein Gehirn von einer repräsentativen Maus gewonnen, die vor der Operation entweder mit Vehikel (zwei Reihen ganz links) oder Faktor IXai (300 μg/kg, zwei Reihen ganz rechts) vorbehandelt worden waren. Die Gehirne wurden in ipsilaterale (R) und kontralaterale (L) Hemisphären geteilt, und ein Plasminverdau wurde durchgeführt, um das akkumulierte Fibrin zu lösen. Immunblotten wurde unter Verwendung eines primären Antikörpers, der gegen ein Neo-Epitop gerichtet ist, das auf dem Gamma-Gamma-Ketten-Dimer des vernetzten Fibrin exprimiert wird, durchgeführt. 40C-40F. Immunhistochemische Identifizierung von Stellen der Fibrinbildung im Schlaganfall. Unter Verwendung desselben Antikörpers, wie in 2b beschrieben, um Fibrin nachzuweisen, wurden Gehirne von zwei Mäusen nach einem Schlaganfall gewonnen (die oberen und unteren Felder repräsentieren je eine Maus). Die Pfeile identifizieren cerebrale Mikrogefäße. Beachte, dass in beiden ipsilateralen Hemisphären (rechte Felder) intravaskuläres Fibrin deutlich durch die rote Färbung identifiziert werden kann, die nicht in den kontralateralen (linke Felder) nicht ischämischen Hemisphären gesehen wird.
41A-41C. 41A. Wirkung von Faktor IXai auf den relativen CBF in einem murinen Schlaganfall-Modell, gemessen durch Laser-Doppler. Der CBF in Faktor IXai-behandelten Tieren (300 μg/kg, n = 48, gestrichelte Linie) ist nach 24 Stunden signifikant höher als in Vehikel-behandelten Kontrollen (n = 62). Mittelwerte ± SEM sind gezeigt. *p < 0,05. 41B. Wirkung von Faktor IXai auf die Infarktvolumen in einem murinen Schlaganfall-Modell, gemessen durch TTC-Färbung von coronalen Reihenschnitten. Den Tieren wurden Vehikel (n = 62) oder Faktor IXai (300 μg/kg, n = 48) gegeben. Mittelwerte ± SEM sind gezeigt. *p < 0,05. 41C. Dosis-Antwort von Faktor IXai im Schlaganfall. Faktor IXai wurde unmittelbar vor dem Beginn des Schlaganfalls verabreicht, und die cerebralen Infarktvolumina wurden bestimmt, wie oben in 41B beschrieben. N = 62, 48, 6 und 6 für Vehikel, 300 μg/kg-, 600 μg/kg- beziehungsweise 1200 μg/kg-Dosen. Mittelwerte ± SEM sind gezeigt. *p < 0,05 gegenüber den Vehikel-behandelten Tieren.
42A-42B. Wirkung von Faktor IXai auf die intracerebrale Blutung. 42A. Ein spektrophotometrischer Hämoglobintest wurde durchgeführt, wie im Verfahren-Abschnitt beschrieben. Die O.D. bei 550 nm bezieht sich linear auf den Gehirn-Hämoglobingehalt^11,12. 42B. Visuell bestimmter ICH-Wert durch einen objektiven Beobachter, wie im Verfahren-Abschnitt beschrieben. Der ICH-Wert korreliert mit dem spektrophotometrisch bestimmten Gehirn-Hämoglobingehalt^11,12. Mittelwerte ± SEM sind gezeigt. *p < 0,05 gegenüber den Vehikel-behandelten Tieren.
43. Wirkung des Zeitpunkts der Faktor IXai-Verabreichung auf die cerebralen Infarktvolumina, wenn sie nach dem Beginn des Schlaganfalls gegeben wird. Die Mäuse wurden einer fokalen cerebralen Ischämie und einer Reperfusion ausgesetzt, wie im Verfahren-Abschnitt beschrieben. Die Vorverschluss-Verabreichung (2 Balken ganz links)-Daten sind jene, die in 42B gezeigt sind. In zusätzlichen Experimenten, um die Wirkungen von Faktor IXai, der nach dem Schlaganfall verabreicht wurde, zu bestimmen, wurde das Vehikel (normale Kochsalzlösung, n = 13) oder Faktor IXai (300 μg/kg, n = 7) unmittelbar nach dem Entfernen der intraluminalen Verschlussnaht intravenös verabreicht. Die cerebralen Infarktvolumen (basierend auf den TTC-gefärbten Reihenschnitten, die nach 22 h erhalten wurden) wurden bestimmt. Mittelwerte ± SEM sind gezeigt. *p < 0,05, **p < 0,05 gegenüber den Vehikel-behandelten Tieren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Hierin sind Verwendungen eines Verfahrens für das Behandeln einer ischämischen Störung in einem Patienten offenbart, was das Verabreichen einer pharmazeutisch verträglichen Form eines Selectin-Antagonisten in einer ausreichenden Menge über einen ausreichenden Zeitraum an einen Patienten einschließt, um die Akkumulierung von weißen Blutzellen zu verhindern, um die ischämische Störung in dem Patienten zu behandeln. Der Selectin-Antagonist kann ein Peptid-Mimetikum, ein Nucleinsäuremolekül, ein Ribozym, ein Polypeptid, ein kleines Molekül, ein Kohlenhydratmolekül, ein Monosaccharid, ein Oligosaccharid oder ein Antikörper sein. Das Selectin kann ein P-Selectin, ein E-Selectin oder ein L-Selectin sein. Der Antikörper kann ein P-Selectin-Antikörper sein. Der Antikörper kann weiterhin einen polyclonalen Antikörper oder einen monoclonalen Antikörper einschließen. Der P-Selectin-Antagonist kann einen Stickoxid (NO)-Vorläufer wie L-Arginin, einen NO-Spender wie Nitroglycerin oder Nitroprussid, ein cyclisches Nucleotidanalog wie ein cyclisches GMP oder ein cyclisches AMP-Analog oder einen Phosphodiesterase-Inhibitor einschließen.
Die pharmazeutisch verträgliche Form eines P-Selectin-Antagonisten kann einen P-Selectin-Antagonisten und einen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließen. Der Träger kann einen Aerosol-, intravenösen, oralen oder topischen Träger einschließen.
Die weiße Blutzelle kann ein Neutrophiler oder ein Monocyt sein. Der Patient kann ein Säuger sein. Der Säuger kann ein Mensch, eine Kuh, ein Schwein, ein Schaf, ein Hund, eine Katze, ein Affe, ein Geflügel oder jedes Tiermodell einer menschlichen Krankheit oder Störung sein.
Die ischämische Störung kann eine periphere Gefäßerkrankung, eine venöse Thrombose, eine Lungenembolie, einen Herzinfarkt, eine transitorische ischämische Attacke, instabile Angina, einen reversiblen ischämischen neurologischen Ausfall, Sichelzellanämie oder einen Schlaganfall einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Der Patient kann sich einer Herzoperation, Lungenoperation, Spinaloperation, Gehirnoperation, Gefäßoperation, Bauchoperation oder Organtransplantations-Operation unterziehen. Die Organtransplantationsoperation kann eine Herz-, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen- oder Leber-Transplantationsoperation einschließen.
Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung eine Verwendung eines Gases, umfassend Kohlenmonoxid in einer ausreichenden Menge für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Vorbeugung einer ischämischen Erkrankung über einen ausreichenden Zeitraum in einem Individuum.
Die Verabreichung von Kohlenmonoxid kann durch Inhalation durch ein Individuum oder durch extrakorporales Aussetzen von Blut oder Körperflüssigkeiten des Individuums erfolgen.
Die Menge von Kohlenmonoxid, die ausreichend sein kann, um den Individuum zu behandeln, schließt von etwa 0,0001% Kohlenmonoxid in einem inerten Gas bis etwa 2% Kohlenmonoxid in einem inerten Gas ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Das inerte Gas kann Sauerstoff, Stickstoff, Argon oder Luft sein. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Menge des verabreichten Kohlenmonoxids 0,1% Kohlenmonoxid in Luft sein.
Der Zeitraum, der ausreicht, um Kohlenmonoxid an einen Individuum zu verabreichen, um eine ischämische Störung zu behandeln, schließt von etwa 1 Tag vor der Operation bis etwa 1 Tag nach der Operation ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Der Zeitraum kann von etwa 12 Stunden vor der Operation bis etwa 12 Stunden nach der Operation sein. Der Zeitraum kann weiterhin von etwa 12 Stunden vor der Operation bis etwa 1 Stunde nach der Operation einschließen. Der Zeitraum kann weiterhin von etwa 1 Stunde vor der Operation bis etwa 1 Stunde nach der Operation einschließen. Der Zeitraum kann weiterhin von etwa 20 Minuten vor der Operation bis etwa 1 Stunde nach der Operation einschließen. Der Zeitraum, der ausreicht, um eine ischämische Störung in einem Individuum zu behandeln, der sich keiner Operation unterzieht, kann vor und während jeglicher physischen Manifestierung einer solchen Störung einschließen. Die Verabreichung von Kohlenmonoxid wird vor der Manifestierung bevorzugt, um eine solche Manifestierung einer ischämischen Störung zu verringern. Von der Kohlenmonoxid-Verabreichung ist, wie hierin unten beschrieben, gezeigt worden, dass sie vorbeugend gegen eine Ischämie in einem Individuum ist, wenn sie vor der Operation verabreicht wird.
Wie hierin verwendet, umspannt die „ischämische Erkrankung" eine periphere Gefäßerkrankung, eine venöse Thrombose, eine Lungenembolie, einen Herzinfarkt, eine transitorische ischämische Attacke, Lungenischämie, instabile Angina, einen reversiblen ischämischen neurologischen Ausfall, eine zusätzliche thrombolytische Aktivität, Zustände übermäßiger Gerinnung, Sichelzellanämie oder einen Schlaganfall, ist aber nicht darauf beschränkt.
Der Patient kann sich einer Herzoperation, Lungenoperation, Spinaloperation, Gehirnoperation, Gefäßoperation, Bauchoperation oder Organtransplantations-Operation unterziehen. Die Organtransplantationsoperation kann eine Herz-, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen- oder Leber-Transplantationsoperation einschließen.
Das Kohlenmonoxid kann auf eine indirekte Weise verabreicht werden. Dem Individuum können die Verbindungen eher gegeben werden, um die in vivo-Produktion von Kohlenmonoxid zu stimulieren, als dass der Patient das Kohlenmonoxidgas oder ein Gasgemisch direkt inhaliert oder erhält. Solche Verbindungen können Häm, Ferritin, Hämatin, endogene Vorläufer der Häm-Oxigenase oder Häm-Oxigenase-Stimulatoren einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Zusätzlich kann der Patient einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffspiegel im Vergleich zu der normalen Atmosphäre ausgesetzt werden.
Die Häm-Oxigenase ist ein endogenes Enzym, dass Kohlenmonoxid aus Vorläufer-Häm synthetisiert (es ist Teil des normalen Wegs, in dem Häm im Körper abgebaut und metabolisiert wird). Wenn Mäuse entweder einer Hypoxie oder einer Gewebeischämie ausgesetzt wurden, waren die Spiegel sowohl der Boten-RNA, die das Häm-Oxigenase-Protein codiert, als auch des Proteins selbst erhöht. Zusätzlich war die Aktivität des Enzyms erhöht, angezeigt durch Messungen von Kohlenmonoxid im Gewebe.
Weiterhin wird hierin eine Verwendung eines Verfahrens zum Behandeln einer ischämischen Erkrankung in einem Individuum offenbart, die das Verabreichen einer pharmazeutisch verträglichen Form des inaktivierten Faktors IX in einer ausreichenden Menge über einen ausreichenden Zeitraum an den Individuum umfasst, um eine Koagulierung zu inhibieren, um die ischämische Erkrankung im Individuum zu behandeln. Die ausreichende Menge kann von etwa 75 μg/kg bis etwa 550 μg/kg einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Menge kann 300 μg/kg sein. Die pharmazeutisch verträgliche Form des inaktivierten Faktors IX schließt den inaktivierten Faktor IX und einen pharmazeutisch verträglichen Träger ein.
Der Faktor IX kann durch die Standardverfahren, die einem Fachmann bekannt sind, wie Hitzeinaktivierung inaktiviert werden. Der Faktor IX kann inaktiviert werden, oder die Faktor IX-Aktivität kann durch einen Antagonisten inhibiert werden. Solch ein Antagonist kann ein Peptid-Mimetikum, ein Nucleinsäuremolekül, ein Ribozym, ein Polypeptid, ein kleines Molekül, ein Kohlenhydratmolekül, ein Monosaccharid, ein Oligosaccharid oder ein Antikörper sein.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die zum Verbessern einer ischämischen Erkrankung in einem Individuum in der Lage ist, was einschließt: a) Verabreichen der Verbindung an ein Tier, wobei das Tier ein Schlaganfall-Tiermodell ist; b) Messen des Schlaganfallergebnisses in dem Tier und c) Vergleichen des Schlaganfallergebnisses im Schritt (b) mit jenem des Schlaganfall-Tiermodells in der Abwesenheit der Verbindung, um eine Verbindung zu identifizieren, die zum Verbessern einer ischämischen Erkrankung in einem Individuum in der Lage ist. Das Schlaganfall-Tiermodell schließt ein murines Modell einer fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion ein. Das Schlaganfallergebnis kann durch physikalische Untersuchung, Magnetresonanz-Bildgebung, Laser-Doppler-Flussmessung, Triphenyltetrazoliumchlorid-Färbung, chemische Bewertung des neurologischen Ausfalls, Computertomographie oder cerebralen corticalen Blutfluss gemessen werden. Das Schlaganfallergebnis in einem Menschen kann auch durch klinische Messungen, Lebensqualität-Werte und neuropsychometrisches Testen gemessen werden. Die Verbindung kann einen P-Selectin-Antagonisten, einen E-Selectin-Antagonisten oder einen L-Selectin-Antagonisten einschließen.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die zum Vorbeugen der Akkumulierung von weißen Blutzellen in einem Individuum in der Lage ist, was einschließt: a) Verabreichen der Verbindung an ein Tier, wobei das Tier ein Schlaganfall-Tiermodell ist; b) Messen des Schlaganfallergebnisses in dem Tier und c) Vergleichen des Schlaganfallergebnisses im Schritt (b) mit jenem des Schlaganfall-Tiermodells in der Abwesenheit der Verbindung, um eine Verbindung zu identifizieren, die zum Vorbeugen der Akkumulierung von weißen Blutzellen in dem Individuum in der Lage ist.
Die weiße Blutzelle kann ein Neutrophiler, ein Blutplättchen oder ein Monocyt sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Verbindung kann ein Selectin-Inhibitor, ein Monocyten-Inhibitor, ein Blutplättchen-Inhibitor oder ein Neutrophilen-Inhibitor sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Der Selectin-Inhibitor kann ein P-Selectin-, E-Selectin- oder L-Selectin-Inhibitor sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Selectine werden auf der Oberfläche von Blutplättchen exprimiert, und solche Selectin-Inhibitoren oder -Antagonisten, wie hierin beschrieben, können die Expression von solchen Selectinen auf der Oberfläche der Zelle verhindern. Die Verhinderung der Expression kann auf den transkriptionellen, translationellen, post-translationellen Ebenen sein oder die Bewegung von solchen Selectinen durch das Cytosol verhindern und die Abgabe auf der Zelloberfläche verhindern.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt die Behandlung von ischämischen Erkrankungen durch Inhibieren der Fähigkeit eines Neutrophilen, eines Monocyten oder einer anderen weißen Blutzelle, richtig anzuhaften. Dies kann erreichtes Entfernen des Gegenliganden wie CD18 sein. Es ist gezeigt worden, wie hierin untenstehend diskutiert, dass „Knock-out"-CD18-Mäuse (Mäuse, die keine Expression des normalen CD18-Gens aufweisen) vor schädlichen ischämischen Zuständen geschützt sind. Die endothelialen Zellen auf der Oberfläche der Gefäße in dem Individuum können auch ein Ziel für die Behandlung sein. In einem Mausmodell des Schlaganfalls verursachte die Verabreichung von TPA als ein thrombolytisches Mittel eine gewisse sichtbare Blutung zusammen mit einer Verbesserung des Schlaganfallergebnisses. Die Verabreichung eines P-Selectin-Antagonisten verbesserte jedoch auch die Schlaganfall-Erkrankung in dem Tiermodell, aber ohne zusammentreffende Blutung. Die Offenbarung der vorliegenden Anwendung kann in Verbindung mit einer thrombolytischen Therapie verwendet werden, um die Wirksamkeit einer solchen Therapie zu erhöhen oder um niedrigere Dosen einer solchen Therapie, die an den Individuum verabreicht werden soll, zu ermöglichen, um Nebenwirkungen der thrombolytischen Therapie zu reduzieren.
Wie hierin verwendet, umspannt der Begriff „geeigneter pharmazeutisch verträglicher Träger" jeden der pharmazeutisch verträglichen Standardträger wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Wasser, Emulsionen wie eine Öl/Wasser-Emulsion oder eine Triglycerid-Emulsion, verschiedene Typen von Netzmitteln, Tabletten, beschichtete Tabletten und Kapseln. Ein Beispiel einer verträglichen Triglycerid-Emulsion, die für eine intravenöse und intraperitoneale Verabreichung der Verbindung nützlich ist, ist die Triglycerid-Emulsion, die kommerziell als Intralipid^® bekannt ist.
Typischerweise enthalten solche Träger Bindemittel wie Stärke, Milch, Zucker, bestimmte Typen von Lehm, Gelatine, Stearinsäure, Talk, Pflanzenfette oder Öle, Klebstoffe, Glykole oder andere bekannte Bindemittel. Solche Träger können auch Geschmacks- und Farb-Zusätze oder andere Bestandteile einschließen.
Die Anmeldung beschreibt auch Arzneimittel, einschließlich therapeutisch wirksame Mengen von Protein-Zusammensetzungen und Verbindungen, die zum Behandeln einer Schlaganfall-Erkrankung oder zum Verbessern des Schlaganfallergebnisses in dem Individuum der Erfindung in der Lage sind, zusammen mit geeigneten Verdünnern, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Emulgatoren, Hilfsmitteln und/oder Trägern, die in der Behandlung einer neuronalen Degradierung aufgrund von Alter, einer Lernschwierigkeit oder einer neurologischen Erkrankung nützlich sind. Solche Zusammensetzungen sind Flüssigkeiten oder lyophilisierte oder anderweitig getrocknete Präparate und schließen Verdünner mit verschiedenem/verschiedener Puffergehalt (z.B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH- Wert und ionischer Stärke, Zusätze wie Albumin oder Gelatine, um die Absorption auf Oberflächen zu verhindern, Detergenzien (z.B. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, Gallensäuresalze), Lösungsmittel (z.B. Glycerin, Polyethylenglycerin), Antioxidanzien (z.B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z.B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Quellungsmittel oder Tonizitäts-Modifizierer (z.B. Lactose, Mannit), kovalente Anheftung von Polymeren wie Polyethylenglycol an die Verbindung, Komplexbildung mit Metallionen oder Inkorporierung der Verbindung in oder auf bestimmte Präparate von polymeren Verbindungen wie Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Hydrogele, usw. oder auf Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, einlamellige oder viellamellige Vesikel, Erythrocyten-Geister oder Spheroblasten ein. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, Stabilität, Rate der in vivo-Freisetzung und die Rate der in vivo-Beseitigung der Verbindung oder Zusammensetzung beeinflussen. Die Wahl der Zusammensetzungen wird von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der Verbindung, die zum Lindern der Symptome des Schlaganfalls oder zum Verbessern des Schlaganfallergebnisses in dem Individuum in der Lage ist, abhängen.
Kontrollierte oder anhaltende Freisetzungsbedingungen schließen ein Präparat in lipophilen Depots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse, Öle). Durch die vorliegende Anmeldung werden auch bestimmte Zusammensetzungen, die mit Polymeren (z.B. Poloxameren oder Poloxaminen) beschichtet sind, und die Verbindung, die an Antikörper gekoppelt ist, die gegen Gewebe-spezifische Rezeptoren, Liganden oder Antigene gerichtet sind, oder an Liganden von Gewebespezifischen Rezeptoren gekoppelt sind, erfasst. Andere Aspekte der Zusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, schließen bestimmte Formen von schützenden Beschichtungen, Protease-Inhibitoren oder Permeationsverstärker für verschiedene Wege der Verabreichung, einschließlich parenteral, pulmonal, nasal und oral, ein.
Teile der Verbindung der vorliegenden Anmeldung können durch eine Assoziation mit einer nachweisbaren Markersubstanz (z.B. radioaktiv markiert mit ¹²⁵I oder biotinyliert) „markiert" sein, um Reagenzien bereitzustellen, die für den Nachweis und die Quantifizierung der Verbindung oder ihrer Rezeptor-tragenden Zellen oder ihrer Derivate in festem Gewebe und flüssigen Proben wie Blut, cerebrospinaler Flüssigkeit oder Urin nützlich sind.
Wenn sie verabreicht werden, werden die Verbindungen oft schnell aus dem Kreislauf entfernt und können daher eine relativ kurzlebige pharmakologische Aktivität hervorrufen. Folglich können häufige Injektionen von relativ großen Dosen der bioaktiven Verbindungen erforderlich sein, um eine therapeutische Wirksamkeit aufrecht zu erhalten. Von Verbindungen, die durch kovalentes Anheften von wasserlöslichen Polymeren wie Polyethylenglycol, Copolymeren von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Polyprolin modifiziert sind, ist bekannt, dass sie nach intravenöser Injektion wesentlich längere Halbwertszeiten im Blut zeigen als es die entsprechenden nicht modifizierten Verbindungen tun (Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982; und Katre et al., 1987). Solche Modifikationen können auch die Löslichkeit der Verbindung in einer wässrigen Lösung steigern, eine Aggregation eliminieren, die physikalische und chemische Stabilität der Verbindung verstärken und die Immunogenität und Reaktivität der Verbindung stark reduzieren. Als ein Ergebnis kann die erwünschte biologische in vivo-Aktivität durch die Verabreichung von solchen Polymer-Verbindungs-Addukten weniger häufig oder in niedrigeren Dosen als mit der nicht modifizierten Verbindung erreicht werden.
Das Anheften von Polyethylenglykol (PEG) an Verbindungen ist besonders nützlich, weil PEG eine sehr niedrige Toxizität in Säugern aufweist (Carpenter et al., 1971). Zum Beispiel wurde eine PEG-Konjugierung der Adenosin-Deaminase in den Vereinigten Staaten für die Verwendung in Menschen für die Behandlung des schweren kombinierten Immunschwäche-Syndroms bewilligt. Ein zweiter Vorteil, der durch die Konjugierung von PEG ermöglicht wird, ist jener des wirksamen Reduzierens der Immunogenität und Antigenität von heterologen Verbindungen. Zum Beispiel könnte eine PEG-Konjugierung eines menschlichen Proteins für die Behandlung einer Krankheit in anderen Säugerarten ohne das Risiko des Auslösens einer schweren Immunantwort nützlich sein. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung, die zum Lindern von Symptomen einer kognitiven Störung des Gedächtnisses oder des Lernens in der Lage ist, kann in einem Mikroverkapselungs- Instrument abgegeben werden, um eine Wirts-Immunantwort gegen die Verbindung oder gegen Zellen, die die Verbindung produzieren können, zu reduzieren oder zu verhindern. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann auch mikroverkapselt in einer Membran wie ein Liposom abgegeben werden.
Polymere wie PEG können einfach an einen oder mehrere reaktive(n) Aminosäurerest(e) in einem Protein wie die alpha-Aminogruppe der aminoterminalen Aminosäure, die Epsilon-Aminogruppen der Lysin-Seitenketten, die Sulfhydrylgruppen der Cystein-Seitenketten, die Carboxylgruppen der Aspartyl- und Glutamyl-Seitenketten, die alpha-Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure, Tyrosin-Seitenketten oder an aktivierte Derivate von Glycosylketten, die an bestimmte Aspargin-, Serin- oder Threonin-Reste angeheftet sind, angeheftet werden.
Zahlreiche aktivierte Formen von PEG, die für eine direkte Reaktion mit Proteinen geeignet sind, sind beschrieben worden. Nützliche PEG-Reagenzien für eine Reaktion mit Protein-Aminogruppen schließen aktive Ester der Carbonsäure oder Carbonat-Derivate, insbesondere jene, in denen die Austrittsgruppen N-Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenol, Imidazol oder 1-Hydroxy-2-nitrobenzen-4-sulfonat sind, ein. PEG-Derivate, die Maleimid- oder Haloacetyl-Gruppen enthalten, sind nützliche Reagenzien für die Modifizierung von proteinfreien Sulfhydrylgruppen. Gleichermaßen sind PEG-Reagenzien, die Aminohydrazin- oder Hydrazid-Gruppen enthalten, nützlich für die Reaktion mit Aldehyden, die durch Periodat-Oxidation von Kohlenhydrat-Gruppen in Proteinen erzeugt werden.
Durch wohlbekannte Techniken wie Titration und durch Inbetrachtziehen der beobachteten pharmakokinetischen Charakteristika des Mittels im individuellen Patienten kann ein Fachmann ein geeignetes Dosisregime bestimmen. Siehe zum Beispiel Benet et al., „Clinical Pharmacokinetics" in Kap. 1 (S. 20-32) von Goodman und Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. Auflage, A.G. Gilman et al. Hrsg. (Pergamon, New York 1990).
Die vorliegende Anmeldung beschreibt ein Arzneimittel, das ein Mittel, das zum Behandeln eines Schlaganfalls oder zum Verbessern des Schlaganfallergebnisses in der Lage ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Der Träger kann einen Verdünner, ein Aerosol, einen topischen Träger, eine wässrige Lösung, eine nichtwässrige Lösung oder einen festen Träger einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Diese Erfindung wird im Versuchsdetail-Abschnitt, der folgt, illustriert. Diese Abschnitte sind dargelegt, um einem Verstehen der Erfindung behilflich zu sein, aber sollen die Erfindung nicht in irgendeiner Weise limitieren, wie es in den Ansprüchen, die danach folgen, dargelegt ist, und sollen nicht so ausgelegt werden. Die folgenden Beispiele sind daher nicht notwendigerweise Beispiele der Erfindung.
VERSUCHSDETAILS
Abkürzungen:

EC, endotheliale Zelle; PMN, polymorphonuklärer Leukocyt; WP, Weibel-Palade-Körper; vWF, von Willebrand-Faktor; EGTA, Ethylenglycolbis(aminoethylether)tetraessigsäure; HBSS, gepufferte Hank-Kochsalzlösung; CS, coronarer Sinus; IL, Interleukin; PAF, Blutplättchenaktivierender Faktor; ICAM-1, interzelluläres Adhäsionsmolekül-1; HUVEC, menschliche Nabelvenen EC; LR, Ringer-Lactatlösung; MCAO, mittlerer cerebraler Arterienverschluss; rt-PA, rekombinanter Gewebe-Plasminogen-Aktivator; HO-I oder HOI oder HOI, Häm-Oxigenase I; ICH, intracerebrale Blutung; OD, optische Dichte; MCA, mittlere cerebrale Arterie; rt-PA, rekombinanter Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator; TIA, transitorische ischämische Attacke; TTC, Triphenyltetrazoliumchlorid.

BEISPIEL 1: Cerebraler Schutz in homozygoten ICAM-1-Null-Mäusen nach einem mittleren cerebralen Arterterienverschluss: Rolle der Neutrophilen-Adhäsion in der Pathogenese des Schlaganfalls
Um zu untersuchen, ob polymorphonucleäre Leukocyten (PMNs) zu einer schädlichen neurologischen Folgekrankheit und Mortalität nach einem Schlaganfall beitragen, und um die potenzielle Rolle des Leukocyten-Adhäsionsmoleküls interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) in der Pathogenese des Schlaganfalls zu untersuchen, wurde ein murines Modell der transitorischen fokalen cerebralen Ischämie angewendet, bestehend aus einem intraluminalen mittleren cerebralen Arterien (MCA)-Verschluss für 45 Minuten, gefolgt von 22 Stunden einer Reperfusion. Die PMN-Akkumulierung, überwacht durch die Ablagerung von ¹¹¹Indium-markierten PMNs im postischämischen cerebralen Gewebe, war in der ipsilateralen (Infarkt) Hemisphäre im Vergleich zu der kontralateralen (nicht Infarkt) Hemisphäre 2,5-fach erhöht (p < 0,01). Mäuse, die vor der Operation von Neutrophilen immun-entleert wurden, zeigten eine 3,0-fache Reduktion in den Infarktvolumina (p < 0,001), basierend auf einer Triphenyltetrazoliumchlorid-Färbung von cerebralen Reihenschnitten, einem verbesserten ipsilateralen corticalen cerebralen Blutfluss (gemessen durch Laser-Doppler) und einem reduzierten neurologischen Ausfall im Vergleich zu den Kontrollen. In Wildtyp-Mäusen, die 45 Minuten einer Ischämie, gefolgt von 22 Stunden einer Reperfusion ausgesetzt waren, war die ICAM-1-mRNA in der ipsilateralen Hemisphäre erhöht, wobei die Immunhistochemie eine erhöhte ICAM-1-Expression auf dem cerebralen Mikrogefäß-Endothelium lokalisierte. Die Rolle der ICAM-1-Expression im Schlaganfall wurde in homozygoten ICAM-1-Null-Mäusen (ICAM-1 -/-) im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen (ICAM-1 +/+) untersucht. ICAM -/- Mäuse zeigten eine 3,7-fache Reduktion im Infarktvolumen (p < 0,005), einen 35% Anstieg im Überleben (p < 0,05) und einen reduzierten neurologischen Ausfall im Vergleich zu ICAM-1 +/+ Kontrollen. Der cerebrale Blutfluss zu der Infarkt-Hemisphäre war 3,1-fach größer in ICAM-1 -/- Mäusen im Vergleich zu ICAM-1 +/+ Kontrollen (p < 0,01), was eine wichtige Rolle von ICAM-1 in der Entstehung des postischämischen cerebralen Nicht-Rückflusses nahe legt. Weil PMN-ausgeschöpfte und ICAM-1-defiziente Mäuse relativ resistent gegen eine cerebrale Ischämie-Reperfusions-Verletzung sind, legten diese Untersuchungen eine wichtige Rolle für die ICAM-1-vermittelte PMN-Adhäsion in der Pathophysiologie eines entstehenden Schlaganfalls nahe.
EINLEITUNG:
Neutrophile (PMNs) sind in den frühsten Stadien der Entzündung nach einer Gewebeischämie entscheidend involviert, wobei sie Phagocytosefunktionen einleiten, die später von Makrophagen fortgesetzt werden. Es gibt jedoch eine Schattenseite zum Neutrophilen-Einstrom, besonders in postischämischen Geweben^1-7, wo aktivierte PMNs die Schädigung von vaskulären und parenchymalen zellulären Elementen steigern können. Experimentelle Hinweise deuten auf eine entscheidende Rolle von endothelialen Zellen im Etablieren einer postischämischen PMN-Rekrutierung hin, da hypoxische/ischämische endotheliale Zellen das pro-inflammatorische Cytokin IL-1⁸ so wie das potente chemotaktische Neutrophilen-Lockmittel und den Aktivator IL-8⁹ synthetisieren. Eine feste Adhäsion von PMNs, an aktiviertes das Endothel in einem postischämischen vaskulären Milieu, wird durch die Translokation von P-Selectin zu der Zelloberfläche¹⁰ sowie eine verstärkte Produktion des Blutplättchen-aktivierenden Faktors und ICAM-1 gefördert¹¹.
Während Strategien, um jeden dieser Mechanismen der Neutrophilen-Rekrutierung zu blockieren, in verschiedenen Modellen der Ischämie und Reperfusionsverletzung schützend sind, bleibt ihre Wirksamkeit in der cerebralen Ischämie/Reperfusionsverletzung umstritten. Es gibt deutliche Hinweise, dass im Gehirn wie in anderen Geweben ein früher PMN-Einstrom einer ischämischen Episode folgt^12-17. Immunhistochemische Untersuchungen haben eine erhöhte Expression der PMN-Adhäsionsmoleküle P-Selectin und des interzellulären Adhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1) in der postischämischen cerebralen Gefäßversorgung beschrieben^12,18-20. Die pathogene Relevanz der Adhäsionsmolekül-Expression im Gehirn bleibt jedoch umstritten; Daten von einem Versuch eines monoclonalen anti-ICAM-1-Antikörpers im Schlaganfall in Menschen sind noch nicht verfügbar. In Tiermodellen gibt es widersprüchliche experimentelle Hinweise in Bezug auf die Wirksamkeit von anti-Adhäsionsmolekül-Strategien in der Behandlung eines experimentellen Schlaganfalls^21-23. Um festzustellen, ob ICAM-1 an der Pathogenese einer postischämischen cerebralen Verletzung teilnimmt, wurden die hier berichteten Experimente in einem murinen Modell einer fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion unternommen, sodass die Rolle eines einzelnen, kritischen Vermittlers der PMN-Adhäsion (ICAM-1) bestimmt werden konnte. Diese Untersuchungen zeigen, dass eine verstärkte ICAM-1-Expression und ein Einstrom von Neutrophilen einer Episode der fokalen cerebra7len Ischämie folgen. Darüber hinaus zeigen diese Untersuchungen, dass sowohl Neutrophile-defiziente als auch transgene ICAM-1-Null-Mäuse relativ resistent gegen einen cerebralen Infarkt nach einer Ischämie und Reperfusion sind, was einen starken Hinweis für eine erschwerende Rolle von ICAM-1 in der Pathophysiologie des Schlaganfalls liefert.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Mäuse: Die Experimente wurden mit transgenen ICAM-1-defizienten Mäusen durchgeführt, die, wie früher berichtet²⁴, durch Gene-Targeting in embryonalen J1-Stammzellen, die in C57BL/6-Blastocysten injiziert wurden, um eine Keimbahn-Transmission zu erhalten, gebildet und rückgekreuzt wurden, um homozygote ICAM-1-Null-Mäuse zu erhalten. Alle Experimente wurden mit ICAM-1 -/- oder Wildtyp (ICAM-1 +/+) Cousin-Mäusen aus der fünften Generation der Rückkreuzungen mit C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Experimente sieben bis neun Wochen alt und wogen zwischen 25-36 Gramm. Für bestimmte Experimente wurde eine Ausschöpfung von Neutrophilen der C57BI/6-Mäuse durch Verabreichen eines polyclonalen Kaninchen-anti-Maus-Neutrophilen-Antikörpers²⁵ (Accurate Scientific, Westbury NY) erzielt, der als eine tägliche intraperitoneale Injektion (0,3 ml einer 1:12-Lösung) für 3 Tage an rote Blutzellen voradsorbiert wurde. Die Experimente in diesen Mäusen wurden am vierten Tag nach Bestätigung einer Agranulocytose durch Wright-Giemsa-gefärbte periphäre Blutabstriche durchgeführt.
Transitorischer mittlerer cerebraler Arterienverschluss²⁶: Die Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion von 0,3 ml Ketamin (10 mg/ml) und Xylazin (0,5 mg/ml) anästhesiert. Die Tiere wurden in Rückenlage auf einer Rektaltemperaturkontrollierten Operationsoberfläche (Yellow Springs instruments, Inc., Yellow Springs, OH) positioniert. Die innere Temperatur der Tiere wurde intraoperativ und für 90 Minuten nach der Operation bei 36-38°C gehalten. Der mittlere cerebrale Arterienverschluss wurde wie folgt durchgeführt; Ein Nackeneinschnitt in der Mittellinie wurde gemacht, um die rechte Carotishülle unter dem Operationsmikroskop (16-25X Vergrößerung, Zeiss, Thornwood, NY) darzustellen. Die gemeinsame Carotis-Arterie wurde von ihrer Hülle befreit und mit einer 4-0 Seide isoliert, und die occipitalen und pterygopalatinalen Arterien wurden isoliert und geteilt. Eine distale Kontrolle der internen Carotis-Arterie wurde erhalten, und die externe Carotis wurde kauterisiert und nahe proximal von ihrer Bifurkation in die lingualen und maxillaren Abteilungen getrennt. Ein transitorischer Carotisverschluss wurde durch Vorführen einer 13 mm hitzeabgestupften 5-0 Nylonnaht durch den externen Carotisstumpf zum Ursprung der mittleren cerebralen Arterie erreicht. Nach dem Platzieren der verschließenden Naht wurde der externe Carotis-Arterienstumpf kauterisiert, um ein Bluten durch die Arteriotomie zu verhindern, und der arterielle Fluss wurde wieder etabliert. In allen Fällen war die Dauer des Carotisverschlusses weniger als zwei Minuten. Nach 45 Minuten wurde die verschließende Naht entfernt, um eine Reperfusion zu etablieren. Diese Vorgehensweisen sind kürzlich im Detail beschrieben worden²⁶.
Messung des cerebralen cortikalen Blutflusses: Transcraniale Messungen des cerebralen Blutflusses wurden unter Verwendung von Laser-Doppler- Flussmessungen (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) nach der Betrachtung der Haut, die die Kalotte überzieht, gemacht, wie früher beschrieben²⁷ (Transcraniale Ablesungen waren konsistent dieselben wie jene, die nach der Craniektomie in Pilotstudien gemacht wurden). Unter Verwendung einer geraden 0,7 mm-Laser-Dopplersonde (Modell #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) und früher veröffentlichen Charakteristika (2 mm posterior des Bregma, je 6 mm seitlich der Mittellinie) wurden relative cerebrale Blutfluss-Messungen gemacht, wie angezeigt; unmittelbar nach der Anästhesie, nach dem Verschluss der mittleren cerebralen Arterie, unmittelbar nach der Reperfusion und kurz vor der Euthanasie nach 24 Stunden. Die Daten werden als das Verhältnis der Dopplersignal-Intensität der ischämischen im Vergleich zu der nicht-ischämischen Hemisphäre ausgedrückt. Obwohl dieses Verfahren nicht den cerebralen Blutfluss pro Gramm Gewebe quantifiziert, dient die Verwendung von Laser-Doppler-Flussmessungen an genau definierten anatomischen Charakteristika als ein Mittel des seriellen Vergleichens von cerebralen Blutflüssen in demselben Tier über die Zeit. Das chirurgische Vorgehen/der intraluminale mittlere cerebrale Arterienverschluss und die Reperfusion wurden als technisch adäquat angesehen, wenn eine ≥ 50% Reduzierung im relativen cerebralen Blutfluss unmittelbar nach dem Platzieren der intraluminalen verschießenden Naht beobachtet wurde und ein ≥ 33% Anstieg im Fluss über den Grundlinien-Verschluss unmittelbar nach dem Entfernen der verschließenden Naht beobachtet wurde. Diese Verfahren sind in früheren Studien²⁶ verwendet worden.
Herstellung und Verabreichung von ¹¹¹In-markierten murinen Neutrophilen: Citrat-Blut von Wildtyp-Mäusen wurde 1:1 mit NaCl (0.9%) verdünnt, gefolgt von einer Gradienten-Ultrazentrifugation auf einem Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Nach einer hypotonischen Lyse der Rest-Erythrocyten (20 sec Aussatz gegenüber destilliertem H₂O, gefolgt von einer Wiederherstellung mit 1,8% NaCl) wurden die Neutrophilen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert. 5-7,5 × 10⁶ Neutrophile wurden in PBS mit 100 μCi ¹¹¹Indiumoxin (Amersham Mediphysics, Port Washington, NY) für 15 Minuten bei 37°C suspendiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Neutrophilen sanft pelletiert (450 g) und in PBS auf eine Endkonzentration von 1,0 × 10⁶ Zellen/mL resuspendiert. Unmittelbar vor der Operation wurden 100 μL der radioaktiv markierten PMNs, die mit physiologischer Kochsalzlösung auf ein Gesamtvolumen von 0,3 mL (≈3 × 10⁶ cpm) zusammengemischt wurden, durch Penisvenen-Injektion verabreicht. Nach einer humanen Euthanasie wurden die Gehirne, wie beschrieben, erhalten, und die Ablagerung von Neutrophilen wurde als cpm/g von jeder Hemisphäre quantifiziert.
Neurologische Untersuchung: Vierundzwanzig Stunden nach dem mittleren cerebralen Arterienverschluss und der Reperfusion, vor dem Verabreichen der Anästhesie wurden die Mäuse auf einen neurologischen Ausfall unter Verwendung eines vierstufigen Bewertungssystems²⁶ untersucht: Ein Wert von (1) wurde gegeben, wenn das Tier normale spontane Bewegungen zeigte; ein Wert von (2) wurde gegeben, wenn bemerkt wurde, dass sich das Tier nach rechts (Kreise im Uhrzeigersinn) dreht, wenn es von oben betrachtet wurde (d.h. zu der kontralateralen Seite); ein Wert von (3) wurde gegeben, wenn beobachtet wurde, dass sich das Tier der Länge nach dreht (im Uhrzeigersinn, wenn es vom Schwanz aus betrachtet wurde); ein Wert von (4) wurde gegeben, wenn das Tier reaktionslos auf schädliche Stimuli auf allen Vieren kauerte. Dieses Bewertungssystem ist kürzlich in Mäusen beschrieben worden²⁶ und basiert auf ähnlichen Bewertungssystemen, die in Ratten verwendet wurden^28,29, die auf der kontralateralen Bewegung von Tieren mit einem Schlaganfall basieren; nach einem cerebralen Infarkt ist die kontralaterale Seite „schwach", und daher tendiert das Tier dazu, sich zu der geschwächten Seite zu drehen. Eine frühere Arbeit in Ratten²⁸ und Mäusen²⁶ zeigte, dass größere cerebrale Infarkte mit einem größeren Grad an kontralateraler Bewegung zusammenhängen, bis zu dem Punkt, wo die Infarkte so groß sind, dass das Tier reaktionslos bleibt.
Berechnung des Infarktvolumens: Nach der neurologischen Untersuchung wurde den Mäusen 0,3 mL Ketamin (10 mg/ml) und Xylazin (0,5 mg/ml) gegeben, und endgültigen cerebralen Blutfluss-Messungen wurden erhalten. Eine humane Euthanasie wurde durch Enthaupten unter Anästhesie durchgeführt, und die Gehirne wurden entfernt und in eine Mausgehirn-Matrix (Activational Systems Inc., Warren, MI) für 1 mm-Schnitte platziert. Die Schnitte wurden in 2% 2,3,5,-,Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 0,9% phosphatgepufferter Kochsalzlösung getaucht, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und in 10% Formalin platziert^26,30-32. Das Infarkt-Gehirn wurde als ein Gebiet von ungefärbtem Gewebe gesehen, im Gegensatz zu lebensfähigem Gewebe, das sich ziegelrot färbt. Die Infarktvolumina wurden aus planimetrierten Reihenschnitten berechnet und als der Prozentsatz des Infarkts in der ipsilateralen Hemisphäre ausgedrückt.
RNA-Extraktion und Northern Blot-Analyse: 24 Stunden nach der fokalen Ischämie und Reperfusion wurden die Gehirne erhalten und in ipsilaterale (Infarkt) und kontralaterale (Nicht-Infarkt) Hemisphären geteilt. Um ICAM-1-Transkripte nachzuweisen, wurde die Gesamt-RNA von jeder Hemisphäre unter Verwendung eines RNA-Isolierungskits (Stratagene, La Jolla, CA) extrahiert. Gleiche Mengen an RNA (20 μg/Reihe) wurden auf ein 1,4% Agarose-Gel, enthaltend 2.2 M Formaldehyd, zur Größenfraktionierung geladen und dann über Nacht auf Nylon (Nytran)-Membranen mit 10 × SSC-Puffer durch Kapillardruck übertragen. Eine murine ICAM-1-cDNA-Sonde³³ (1,9 kb, ATCC, Rockville, MD) wurde mit ³²P-α-dCTP durch zufälliges Primermarkieren (Prime-A-Gene-Kit, Promega) markiert, bei 42°C an die Blots hybridisiert, gefolgt von 3 Waschschritten mit 1 × SSC/0,05% SDS. Die Blots wurden mit X-Omat AR-Film entwickelt, der mit Lichtblenden bei -70° für 7 Tage belichtet wurde. Eine β-Actin-Sonde (ATCC) wurde verwendet, um eine gleiche RNA-Ladung zu bestätigen.
Immunhistochemie: Die Gehirne wurden zu den angezeigten Zeitpunkten nach dem mittleren cerebralen Arterienverschluss entfernt, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und für die Immunhistochemie geschnitten. Die Schnitte wurden mit einem Ratte-anti-murinen-ICAM-1-Antikörper (1:50 Verdünnung, Genzyme, Cambridge MA) gefärbt, und die Stellen der primären Antikörperbindung wurden durch einen mit alkalischer Phosphatase konjugierten sekundären Antikörper, der mit FastRed (TR/Naphthol AS-MX, Sigma Chemical Co., St. Louis MO) nachgewiesen wird, sichtbar gemacht.
Datenanalyse: Der cerebrale Blutfluss, die Infarktvolumen und die neurologischen Ergebniswerte wurden unter Verwendung des Student-t-Tests für ungepaarte Variablen verglichen. Die Ablagerung von ¹¹¹Indium-Neutrophilen wurde als gepaarte Daten [Vergleichen von kontralateraler (Nicht-Infarkt) zu ipsilateraler (Infarkt) Hemisphäre] bewertet, um auf Veränderungen in den injizierten Anteilen oder der Volumenverteilung zu kontrollieren. Überlebens-Unterschiede zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung der Zufallsanalyse mit der Chi²-Statistik getestet. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt, wobei ein p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wird.
ERGEBNISSE:
Akkumulierung von Neutrophilen im Schlaganfall: Frühere pathologische Untersuchungen haben eine Akkumulierung von Neutrophilen nach einem cerebralen Infarkt gezeigt^15-17,34-36 Um zu bestimmen, ob Neutrophile in dem murinen Modell der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion akkumulieren, wurde die Akkumulierung von Neutrophilen nach einer transitorischen (45 min) Ischämie und Reperfusion (22 h) durch Messung der Ablagerung von ¹¹¹In-markierten Neutrophilen, die vor dem ischämischen Ereignis an Wildtyp-Mäuse gegeben wurden, quantifiziert. Diese Experimente zeigten eine signifikant größere Akkumulierung von Neutrophilen (2,5-facher Anstieg) in den ipsilateralen (Infarkt) im Vergleich zu den kontralateralen (Nicht-Infarkt) Hemisphären (n = 7, p < 0,01; 1). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn das Einströmen von Neutrophilen durch Myeloperoxidase-Tests überwacht wurde, obwohl niedrige Spiegel der Aktivität im letzteren Test aufgezeichnet wurden (Daten nicht gezeigt).
Auswirkung der Ausschöpfung von Neutrophilen auf das Schlaganfallergebnis: Um die Wirkung des Einströmens von Neutrophilen auf die Anzeichen des Schlaganfallergebnisses zu bestimmen, wurden Mäuse beginnend drei Tage vor der Operation von Neutrophilen immun-entleert. Wenn die Operation am vierten Tag durchgeführt wurde, war eine beinahe vollständige Agranulocytose auf den Abstrichen des periphären Bluts offensichtlich. Mäuse mit einer Neutropenie (n = 18) wurden 45 min einer cerebralen Ischämie und 22 Stunden einer Reperfusion unterzogen und die Anzeichen des Schlaganfallergebnisses bestimmt. Die Infarktvolumen waren 3-fach kleiner in Tieren mit einer Neutropenie im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen (11,1 ± 1,6% gegenüber 33,1 ± 6,4%, p < 0,001; 2A). Das Absinken in den Infarktvolumen in Mäusen mit Neutropenie entsprach den reduzierten neurologischen Ausfallswerten (2B), den erhöhten cerebralen, corticalen post-Reperfusions-Blutflüssen (2C) und einem Trend zu einer reduzierten über Nacht-Mortalität (22% Mortalität in den Mäusen mit Neutropenie gegenüber 50% Mortalität in den Kontrollen, 2D).
ICAM-1-Expression im murinen Schlaganfall: Um die Wirkung der cerebralen Ischämie/Reperfusion im murinen Modell zu etablieren, wurden die ICAM-1-mRNA-Spiegel nach der cerebralen Ischämie und Reperfusion in Wildtyp-Mäusen bewertet. Die ipsilaterale (Infarkt) cerebrale Hemisphäre zeigte durch Northern Blot-Analyse erhöhte ICAM-1-mRNA im Vergleich zu der RNA, die von der kontralateralen (nicht Infarkt) Hemisphäre von demselben Tier erhalten wurde (3). Um die ICAM-1-Antigen-Expression in diesem murinen Modell zu beurteilen, wurden Wildtyp-Mäuse 45 Minuten einer Ischämie, gefolgt von 23 Stunden einer Reperfusion unterzogen, und die cerebralen Mikrogefäße wurden durch Immunhistochemie untersucht. Die ICAM-1-Antigen-Expression war in den cerebralen Mikrogefäßen kontralateral zum Infarkt nicht nachweisbar (4A), aber war auf der ipsilateralen Seite mit einer deutlichen ICAM-1-Färbung der cerebralen endothelialen Zellen deutlich erhöht (4B).
Die Rolle von ICAM-1 im Schlaganfall: Um die Rolle von ICAM-1 im Schlaganfall zu untersuchen, wurden transgene Mäuse, die homozygot ICAM-1-defizient waren²⁴, in dem murinen Modell der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion untersucht. Da berichtet worden ist, dass Variationen in der cerebrovaskuären Anatomie in Unterschieden in der Empfänglichkeit für experimentellen Schlaganfall in Mäusen resultieren³⁷, wurde eine Tuschefärbung am Circulus arteriosus cerebri in homozygoten Null- (ICAM-1 -/-) und ICAM-1 +/+ Mäusen durchgeführt. Diese Experimente (5) zeigten, dass es keine groben anatomischen Unterschiede im vaskulären Muster des cerebralen Kreislaufs gab. Um die Rolle des interzellulären Adhäsionsmoleküls-1 im Einströmen von Neutrophilen nach fokaler cerebraler Ischämie und Reperfusion zu bestimmen, wurde die Akkumulierung von Neutrophilen in homozygoten ICAM-1-Null-Mäusen (ICAM-1 -/-) (n = 14) und Wildtyp-Kontrollen (n = 7), die mit ¹¹¹In-markierten Neutrophilen infundiert wurden, gemessen. Die relative Akkumulierung von Neutrophilen (ipsilaterale cpm/kontralaterale cpm) war in den ICAM-1 -/- Mäusen im Vergleich zu ICAM-1 +/+ Kontrollen vermindert (39% Reduzierung) (1,70 ± 0,26 gegenüber 2,9 ± 0,52, p < 0,05).
Dann wurden Experimente durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Expression von ICAM-1 eine pathophysiologische Rolle im Ergebnis nach einem Schlaganfall spielt. ICAM-1 -/- Mäuse (n = 13) waren basierend auf einer 3,7-fachen Reduzierung im Infarktvolumen (p < 0,01) im Vergleich zu ICAM-1 +/+ Kontrollen signifikant vor den Wirkungen der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion geschützt (6 und 7A). Diese Reduzierung im Infarktvolumen wurde von einem reduzierten neurologischen Ausfall (7B) und einem erhöhten cerebralen cortikalen post-Reperfusions-Blutfluss (7C) begleitet. In Anbetracht dieser Ergebnisse war es nicht überraschend, dass die Mortalität in den ICAM-1 -/- Mäusen im Vergleich zu den ICAM-1 +/+ Kontrollen auch signifikant erniedrigt war (15% gegenüber 50%, p < 0,05; 7D).
DISKUSSION:
Epidemiologische Hinweise in Menschen legen nahe, dass Neutrophile sowohl zum Beginn des Schlaganfalls³⁸ als auch zu der cerebralen Gewebeverletzung und einem schlechten klinischen Ergebnis³⁹ beitragen, mit einer potenziellen Rolle der Neutrophilen in der postischämischen Hypoperfusion, der neuronalen Dysfunktion und der Narbenbildung^40-44. Obwohl es beträchtliche experimentelle Hinweise gibt, die nahe legen, dass Neutrophile eine Gewebeschädigung nach einem Schlaganfall erschweren können^13,45-48, haben bestimmte Teile von experimentellen Daten durch das Versagen, eine Verbindung zwischen Mitteln, die eine Akkumulierung von Neutrophilen blockieren, und Anzeichen des Schlaganfallergebnisses zu finden, einen Streit ausgelöst. In einem Rattenmodell des Schlaganfalls senkte eine Antikörpervermittelte Ausschöpfung von Neutrophilen vor einem Schlaganfall signifikant den Gehirn-Wassergehalt und die Infarktgröße¹³. Eine Cyclophosphamidinduzierte Leukopenie in einem Wüstenrennmaus-Modell⁴⁹ oder eine anti-Neutrophile-Antikörper-Verabreichung an Hunde⁵⁰ zeigten jedoch keine günstigen Wirkungen in globalen Modellen einer cerebralen Ischämie. Eine experimentelle Therapie, die auf das Eingreifen bei Neutrophilen-endothelialen Interaktionen zielte, hat auch gemischte Ergebnisse produziert. In einem felinen Modell einer transitorischen fokalen cerebralen Ischämie veränderte die Behandlung mit einem Antikörper gegen CD18 (die allgemeine Untereinheit der β₂-Integrine, die an das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 binden⁵¹) nicht die Erholung des cerebralen Blutflusses, das Wiederkehren von hervorgerufenen Potenzialen oder das Infarktvolumen²³. Andere Experimente haben jedoch gefunden, dass die mikrovaskuläre Durchgängigkeit nach einer transitorischen fokalen Ischämie in Primaten durch Antikörper gegen CD18 verbessert ist¹⁴. In einem ähnlichen Rattenmodell ist auch gezeigt worden, dass ein anti-CD11b/CD18-Antikörper sowohl die Akkumulierung von Neutrophilen als auch die Ischämie-bezogene neuronale Schädigung reduziert⁵².
Die hier berichteten Experimente zeigen, dass in einem murinen Modell einer fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion die Neutrophilen im postischämischen cerebralen Gewebe akkumulieren, ein Ergebnis, das in anderen Modellen bestätigt wurde, die auf ähnliche Weise eine erhöhnte Granulocyten-Akkumulierung in Bereichen mit niedrigem cerebralen Blutfluss früh während der postischämischen Periode zeigen^15,16,36,45. Neutrophile akkumulieren nicht nur während der postischämischen Periode in Mäusen, sondern ihre Anwesenheit erschwert die Anzeichen des Schlaganfallergebnisses. Wenn die Tiere vor dem ischämischen Ereignis neutropenisch gemacht wurden, waren cerebrale Infarkte kleiner mit einer verbesserten cerebralen Perfusion nach dem ischämischen Ereignis. Diese Daten sind ziemlich ähnlich zu jenen, die in einem Kaninchen-Modell eines thromboembolischen Schlaganfalls berichtet wurden, in dem eine Immun-Ausschöpfung von Neutrophilen sowohl in einem reduzierten Infarktvolumen als auch einem verbesserten Blutfluss resultierte³⁵. Da die Neutrophilen zu der murinen postischämischen cerebralen Verletzung beitragen, wurde eine Strategie verfolgt, um die Rolle von ICAM-1 in der Pathophysiologie des Schlaganfalls unter Verwendung von deletionsmutanten ICAM-1 Mäusen zu erläutern²⁴. Die Experimente weisen darauf hin, dass homozygote ICAM-1-Null-Mäuse relativ resistent gegen die schädlichen Wirkungen einer cerebralen Ischämie und Reperfusion sind.
Um die Rolle von sowohl Neutrophilen als auch ICAM-1 in der Pathogenese der Gewebeverletzung beim Schlaganfall zu zeigen, verwendeten die hierin berichteten Untersuchungen einige Verfahren zum Bewerten des Schlaganfallergebnisses. Obwohl zahlreiche Forscher die TTC-Färbung verwendet haben, um cerebrale Infarktvolumina zu quantifizieren^{26,30-32,37,53}, hat es eine gewisse Kontroverse bezüglich der Genauigkeit dieses Verfahrens gegeben, besonders wenn früh nach dem ischämischen Ereignis beurteilt wurde. Beim TTC-Verfahren reagiert 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC) mit intakten oxidativen Enzymen auf den mitochondrialen Christae und wird dadurch zu einem gefärbten Formazan reduziert⁵⁴. Die TTC-Färbung ist unzuverlässig, bevor 2 Stunden der Ischämie verstrichen sind, nach 36 Stunden können sich Zellen, die in das Infarkt-Gewebe infiltrieren, positiv mit TTC färben, wodurch sie die klare Trennung zwischen Infarkt- und Nicht-Infarkt-Geweben, die mit früherer Färbung gesehen wird, verdecken³¹. Obwohl die Größe des Infarkts, der durch die TTC-Färbung abgegrenzt wird, gut mit der Infarktgröße, die durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung abgegrenzt wird, korreliert^30,32, tendieren direkte morphometrische Messungen die Infarktvolumen aufgrund eines cerebralen Odems besonders während der ersten 3 Tage nach dem ischämischen Ereignis zu überschätzen³². Sogar in Anbetracht dieser Einschränkungen inkorporieren die hier berichteten Untersuchungen dennoch drei zusätzliche Verfahren, um die Rolle der Neutrophilen und von ICAM-1 im Schlaganfallergebnis, einschließlich des neurologischen Ausfallswerts, dem relativen cerebralen Blutfluss zu dem betroffenen Gebiet und der Mortalität, zu definieren. Diese zusätzlichen Maße, die nicht von der Genauigkeit der TTC-Färbung abhängen, tragen stark zu der Identifizierung einer pathogenen Rolle sowohl der Neutrophilen als auch von ICAM-1 beim Schlaganfall bei.
Es hat einen kürzlichen Überfluss an wissenschaftlichen Untersuchungen gegeben, die die mechanistische Basis der Rekrutierung von Neutrophilen zu postischämischen Geweben untersuchen. Endotheliale Zellen scheinen die Hauptregulatoren des Neutrophilen-Verkehrs, der Regulierung der Vorgänge der chemotaktischen Neutrophilen-Anziehung, der Adhäsion und der Auswanderung aus den Gefäßen zu sein⁵⁵. Wenn sie einer hypoxischen Umgebung als ein Beispiel einer Gewebeischämie ausgesetzt werden, synthetisieren endotheliale Zellen das potente chemotaktischen Neutrophilen-Anziehungsmittel und den Aktivator Interleukin-8 (IL-8)⁹, dessen Blockierung in einem Lungenmodell der Ischämie und Reperfusion günstig zu sein scheint⁶. Zusätzlich synthetisieren hypoxische endotheliale Zellen das pro-inflammatorische Cytokin Interleukin-1⁸, das die endotheliale Expression der Neutrophilen-Adhäsionsmoleküle E-Selectin und ICAM-1 in einer autokrinen Weise hochregulieren kann^8,9,56. Andere Neutrophilen-Adhäsionsmechanismen können auch im Gehirn nach einer Ischämie aktiviert werden, wie die Freisetzung von P-Selectin aus vorgeformten Speicherpools in den Weibel-Palade-Körper-Membranen¹⁰. In einem Primatenmodell war die P-Selectin-Expression nach einer fokalen mittleren cerebralen Arterienischämie und Reperfusion schnell und dauerhaft verstärkt¹⁸. Obwohl die P-Selectin-abhängige Rekrutierung von Neutrophilen nach einer Herzischämie und Reperfusion schädlich zu sein scheint⁵⁷, ist ihre pathophysiologische Relevanz im Rahmen des Schlaganfalls noch nicht bestimmt worden. Während eine Hypoxie in einem Rückenmark-Ischämie-Reperfusionsmodell die de novo-Synthese des bioaktiven Lipid-Blutplättchen-aktivierenden Faktors (PAF) induziert¹¹, bot ein PAF-Antagonismus keinen zunehmenden Vorteil, wenn er simultan mit einem Antikörper gegen CD11/CD18 gegeben wurde⁴⁸.
Das Verstehen der Rolle von ICAM-1 in der Pathophysiologie des Schlaganfalls scheint aus einigen Gründen bei Menschen von besonderer Relevanz zu sein. In Primaten ist eine verstärkte cerebrovaskuläre ICAM-1-Expression durch 4 Stunden einer Ischämie und Reperfusion insbesondere in den lenticulostriaten Mikro-Gefäßen gezeigt worden¹⁸. Eine Autopsie-Untersuchung von frischen cerebralen Infarkten in Menschen zeigte auch eine erhöhte ICAM-1-Expression²⁰. Da Ratten innerhalb von 24 Stunden sowohl in einem photochemisch-induzierten Modell einer cerebralen Ratten-Ischämie¹⁹ als auch einem mittleren cerebralen Arterienverschluss-Modell¹² auch cerebrales vaskuläres ICAM-1 exprimieren, legten diese Daten die potenzielle Nützlichkeit von transgenen ICAM-1-defizienten Mäusen im Erläutern der pathophysiologischen Signifikanz einer erhöhten post-cerebralen ischämischen ICAM-1-Expression nahe. Insbesondere legt der Zeitraum der ICAM-1-Expression (erhöht von 4 bis 24 Stunden) in diesen Modellen nahe, dass ICAM-1-vermittelte Neutrophilen-endotheliale Interaktionen in zukünftigen pharmakologischen Strategien angezielt werden können, um das menschliche Schlaganfallergebnis zu verbessern, da dieser Zeitraum ein realistisches klinisches Fenster für eine therapeutische Intervention darstellt.
Obwohl Tiere mit einer Neutropenie einen erhöhten regionalen cerebralen Blutfluss im Vergleich zu den Kontrollen zeigten, tendierten ICAM-1-defiziente Mäuse im Vergleich zu Tieren mit einer Neutropenie dazu, einen noch höheren ipsilateralen cerebralen Blutfluss nach 24 Stunden zu haben. Diese Beobachtung kann sich auf das Nicht-Rückfluss-Phänomen beziehen, bei dem der Blutfluss nicht zu den Spiegeln vor der Blockade zurückzukehrt, sogar nach der Freigabe eines zeitweiligen Gefäßverschlusses. Ein signifikanter Teil einer früheren Arbeit hat ein Neutrophilen-Verstopfen von kapillären Mikro-Gefäß-Betten in diesem Vorgang mit sich gebracht⁵⁸, obwohl in einem Modell der globalen cerebralen Ischämie eine 85% Reduzierung in der zirkulierenden Leukocytenzahl nicht die Häufigkeit oder Schwere des Rückfluss-Versagens senkte⁴⁹. Die Daten legen nahe, dass nicht von Neutrophilen-abhängige Mechanismen, die nichtsdestotrotz ICAM-1 involvieren, zu dem cerebrovaskulären postischämischen Nicht-Rückfluss beitragen können. Da sowohl Makrophagen als auch Lymphocyten LFA-1, das eine adhäsive Interaktion mit dem endothelialen Zell-ICAM-1 vermittelt, exprimieren⁵¹, ist es möglich, dass ICAM-1-defiziente Mäuse eine verminderte Rekrutierung dieser mononukleären Zellen haben, eine Möglichkeit, die derzeit das Thema einer weiteren Untersuchung ist. Diese Hypothese wird durch mehrere pathologische Beobachtungen unterstützt, die eine Makrophagen- und Lymphocyten-Akkumulierung 1-3 Tage nach einem cerebralen Infarkt zeigen^{12,17,19,34,59}.
Zusammengefasst weisen die Untersuchungen darauf hin, dass in einem murinen Modell einer fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion Neutrophile in der Infarkt-Hemisphäre akkumulieren, und dass Tiere mit einer Neutropenie einen cerebralen Schutz zeigen. Eine erhöhte Expression von ICAM-1 auf cerebralen endothelialen Zellen scheint ein wichtiger Mechanismus zu sein, der diese Neutrophilen-Rekrutierung lenkt, und Mäuse, die nicht in der Lage sind, ICAM-1 zu exprimieren, zeigen verbesserte postischämische Blutflüsse, reduzierte Infarktvolumina und eine reduzierte Mortalität. Diese Daten legen nahe, dass pharmakologische Strategien, die auf das Eingreifen an Neutrophilen-endothelialen Interaktionen zielen, das Ergebnis nach einem Schlaganfall in Menschen verbessern können.
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BEISPIEL 2: Hypoxie-induzierte Exocytose von Weibel-Palade-Körpern der endothelialen Zellen: Ein Mechanismus für eine schnelle Rekrutierung von Neutrophilen nach einer Herz-Konservierung
Der Zeitraum der Hypoxie (H) ist ein wichtiges Grundereignis für die vaskuläre Dysfunktion, die eine Reperfusion begleitet, wobei endotheliale Zellen (ECs) und Neutrophile (PMNs) eine zentrale Rolle spielen. Es wurde angenommen, dass die Exocytose von EC-Weibel-Palade (WP)-Körpern während des hypoxischen/ischämischen Zeitraums während der Organ-Konservierung eine rasche PMN-Rekrutierung in postischämisches Gewebe erlaubt, ein Vorgang, der in einer Oxidationsmittel-reichen Umgebung weiter amplifiziert wird. Das Aussetzen von menschlichen Nabelvenen-ECs gegenüber einer hypoxischen Umgebung (pO₂ ≈20 Torr) stimulierte die Freisetzung des von Willebrand-Faktors (vWF), der in EC-WP-Körpern gelagert ist, sowie eine erhöhte Expression des WP-Körper-abstammenden PMN-Adhäsionsmoleküls P-Selectin auf der EC-Oberfläche. Eine erhöhte Bindung von ¹¹¹In-markierten PMNs an hypoxische EC-Monolayer (im Vergleich zu normoxischen Kontrollen) wurde mit einem blockierenden Antikörper gegen P-Selectin blockiert, aber wurde durch einen nicht-blockierenden Kontroll-Antikörper nicht bewirkt. Obwohl eine erhöhte P-Selectin-Expression und die vWF-Freisetzung auch während der Wiederanreicherung mit Sauerstoff bemerkt wurden, war H alleine (sogar in der Anwesenheit von Antioxidanzien) ausreichend, um die WP-Körper-Exocytose zu erhöhen. Um die Relevanz dieser Beobachtungen auf die hypothermische Herzkonservierung, während der der pO₂ innerhalb der Herzgefäße auf ähnlich niedrige Spiegel sinkt, zu bestimmen, wurden Experimente in einem Nager (Ratte und Maus) Herzkonservierungs/Transplantationsmodell durchgeführt. Eine Immunausschöpfung von Empfänger-PMNs oder die Verabreichung eines blockierenden anti-P-Selectin-Antikörpers vor der Transplantation resultierte in einer reduzierten Neutrophilen-Infiltration in das Transplantat und einem verbesserten Transplantat-Überleben im Vergleich zu identisch konservierten Herzen, die in Kontrollempfänger transplantiert wurden. Um die wichtige Rolle der endothelialen P-Selectin-Expression auf die Spendergefäße zu etablieren, wurden murine Herztransplantate unter Verwendung von homozygoten P-Selectin-defizienten und Wildtyp-Kontroll-Spenderherzen, die vor der Konservierung/Transplantation von Blut/Blutplättchen frei gewaschen wurden, durchgeführt. P-Selectin-Null-Herzen, die in Wildtyp-Empfänger transplantiert wurden, zeigten eine deutliche (13-fache) Reduzierung in der Neutrophilen-Infiltration in das Transplantat und ein erhöhtes Transplantat-Überleben im Vergleich zu Wildtyp-Herzen, die in Wildtyp-Empfänger transplantiert wurden. Um festzustellen, ob die coronare endotheliale Weibel-Palade-Körper-Exocytose während der Herzkonservierung in Menschen erfolgen kann, wurde die Freisetzung von vWF in den Coronarsinus in 32 Patienten während der offenen Herzchirurgie gemessen. Coronarsinus-Proben, die am Beginn und Ende der ischämischen Periode erhalten wurden, zeigten einen Anstieg im Coronarsinus-vWF-Antigen (durch ELISA), das vorwiegend aus Multimeren mit hohem Molekulargewicht besteht (durch Immunelektrophorese). Diese Daten legen nahe, dass die EC-Weibel-Palade-Körper-Exocytose während der hypothermischen Herzkonservierung erfolgt, was die Gefäße veranlasst, während der Reperfusion schnell PMNs zu rekrutieren.
Einleitung:
Endotheliale Zellen (EC) passen sich an eine Hypoxie mit einem charakteristischen Repertoire von Antworten an (1), die von einer erhöhten Expression von Endothelin (2) zu einer erhöhten Synthese des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (3) reichen. Kürzliche Untersuchungen haben darauf hingewiesen, dass viele Eigenschaften der EC-Antwort auf eine Hypoxie parallel zu Eigenschaften der entzündlichen Antwort laufen; eine Hypoxie reguliert selektiv die EC-Expression der Interleukine-1 (4), -6 (5) und -8 (6), des Blutplättchen-aktivierenden Faktors (PAF) (7,8) und von ICAM-1 (4) hinauf, die dazu dienen, die Rekrutierung von Neutrophilen (PMN), die Adhäsion und die Aktivierung an ischämischen Orten zu verstärken. Obwohl diese Mechanismen die späteren Phasen der Reperfusionsverletzung erklären können, legt die Schnelligkeit, mit der PMNs nach einer Periode der hypothermischen Konservierung zum reperfundierten Myokard rekrutiert werden, nahe, dass Mechanismen involviert sind, die keine de novo-Proteinsynthese erfordern. In dieser Hinsicht kann P-Selectin in den frühesten Phasen der PMN-Adhäsion an die reperfundierten Gefäße eine bedeutende Rolle spielen, da ECs schnell vorgebildetes P-Selectin aus den Subplasmalemma-Speicherstellen in den Weibel-Palade-Körper (9)-Membranen als Antwort auf die im Überfluss vorhandenen freien Sauerstoff-Radikale exprimieren können, die im Reperfusionsmilieu gebildet werden (10-12). Darüber hinaus haben neue Daten auf eine Rolle eines P-Selectin-vermittelten Leukocyten-Arrests in der Leukostase und einer Gewebeschädigung, die mit einer Lungenverletzung (13) und Herzischämie (14) assoziiert ist, hingewiesen. Zusammengefasst führten diese Ergebnisse zu der Hypothese, dass die hypoxische/ischämische Periode, die mit der hypothermischen Myocard-Konservierung assoziiert ist, die Gefäße zu ihrer charakteristischen Antwort während der Reperfusion durch deutliches Darlegen von P-Selectin auf der EC-Oberfläche vor der Reperfusion veranlasst, was als ein Funken dient, der die folgende entzündliche Antwort entfacht und amplifiziert.
Die Experimente wurden gestaltet, um zu ermitteln, ob die Hypoxie per se (oder die hypothermische Herzkonservierung, wie sie während der Herzoperation erfolgt, in der der pO₂ im coronaren Bett auf pO₂ < 20 Torr sinkt) (15) in einer WP-Körper-Exocytose resultieren würde. Darüber hinaus wurden Experimente unternommen, um die Rolle der P-Selectin-abhängigen PMN-Adhäsion im Herztransplantatversagen zu bestimmen, das charakteristischerweise einer Periode einer verlängerten hypothermischen Konservierung folgt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Hypoxie sogar in der Abwesenheit einer Wiederversorgung mit Sauerstoff (und der Anwesenheit von Antioxidanzien) ausreicht, um eine EC-WP-Körper-Exocytose zu induzieren, und dass die resultierende P-Selectin-Expression bewirkt, dass ECs PMNs in vitro binden. In Nagern können die schädlichen Folgen der P-Selectin-Expression nach der hypothermischen Herzkonservierung entweder durch Neutrophilen-Ausschöpfung, P-Selectin-Blockade oder durch Transplantieren von Herzen, deren endotheliale Zellen kein P-Selectin exprimieren können, vollständig aufgehoben werden. Da die WP-Körper-Exocytose auch während der Periode der hypothermischen Herzkonservierung in Patienten erfolgt, die sich einer offenen Herzoperation unterziehen, legen diese Daten nahe, dass eine P-Selectin-Blockade ein Ziel für eine pharmakologische Intervention darstellen kann, um die Herzkonservierung bei Menschen zu verbessern.
Verfahren:
Endotheliale Zellkultur und Aussetzen von Zellen gegenüber H oder H/R. Menschliche Nabelvenen-ECs wurden aus Nabelschnüren präpariert und in Kultur durch das Verfahren von Jaffe (16), wie es durch Thornton (17) modifiziert wurde, gezüchtet. Die Experimente verwendeten konfluente ECs (Passagen 1-4), die in Medium 199, angereichert mit fötalem bovinen Serum (15%; Gemini, Calabasas, CA), menschlichem Serum (5%, Gemini), endothelialer Wachstumsergänzung (Sigma, St. Louis, MO), Heparin (90 μg/ml; Sigma) und Antibiotika, wie beschrieben (17), gezüchtet wurden. Wenn ECs die Konfluenz erreichten, wurden die Experimente durch Platzieren der Kulturen in eine Umweltkammer (Coy Laborstory Products, Ann Arbor, MI) durchgeführt, die eine kontrollierte Temperatur (37°C) und Atmosphäre mit der angezeigten Menge an Sauerstoff, Kohlendioxid (5%) und dem Rest, der mit Stickstoff ausgeglichen wurde, bereitstellte. Die Verwendung dieser Kammer für Zellkultur-Experimente ist früher beschrieben worden (15,18). Während des Aussetzens der ECs gegenüber einer Hypoxie (für ein Maximum von 16 Stunden) war die Sauerstoffspannung im Kulturmedium 14-18 Torr und es gab keine Änderung im pH-Wert des Mediums. Die Wiederversorgung mit Sauerstoff wurde durch Platzieren der ECs in eine Umgebungsatmosphäre, die Kohlendioxid (5%) bei 37°C enthält, durchgeführt.
Messung der Weibel-Palade-Körper-Exocytose: Die ECs wurden in Schalen mit 24 Vertiefungen plattiert, dreimal mit gepufferter Hank-Salzlösung gespült und dann einer Hypoxie oder einer Normoxie für die angezeigten Zeiträume ausgesetzt. Für die Experimente, in denen der vWF gemessen wurde, wurden die Zellen in einem serumfreien Medium gehalten. Alle anderen EC-Experimente wurden im EC-Wachstumsmedium durchgeführt, das oben beschrieben wurde. Für Messungen des vWF wurden 200 μL-Aliquots des Kulturüberstands zu den angezeigten Zeitpunkten entfernt, und ein kommerziell erhältlicher ELISA (American Diagnostica, Greenwich, CT), der auf einem polyclonalen Ziege-anti-Mensch-vWF-Antikörper basiert, wurde an doppelten Proben durchgeführt, wobei eine Standardkurve unter Verwendung von gereinigtem menschlichen vWF-Antigen, das von demselben Vertreiber geliefert wurde, hergestellt wurde. Die EC-P-Selectin-Expression wurde durch Messen der spezifischen Bindung eines murinen monoclonalen anti-Mensch-P-Selectin-Antikörpers (WAPS 12.2-Clon, Endogen, Cambridge, MA; dies ist ein IgG1, das ein Calcium-sensitives Epitop erkennt und eine P-Selectin-abhängige Neutrophilen-Adhäsion blockiert) bestimmt. Der Antikörper wurde mit ¹²⁵I durch das Lactoperoxidase-Verfahren (19) unter Verwendung von Enzymobeads (Bio-Rad, Hercules, CA) radioaktiv markiert, bei 4°C gelagert und innerhalb einer Woche nach dem Markieren verwendet. Die Bindungstests wurden an HUVECs durchgeführt, die auf Schalen mit 96 Vertiefungen plattiert wurden, in die frisches M199 mit 0,1% bovinem Serumalbumin (Sigma, St. Louis, MO) unmittelbar vor jedem Experiment zugefügt wurde. Die Zellen wurden in eine befeuchtete Umgebung bei 37°C platziert und einer Normoxie oder H (in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 50 μM Probucol, wie angezeigt, Sigma) für die angezeigten Zeiträume ausgesetzt. Die Zellmonolayer wurden für 15 min mit 1% Paraformaldehyd fixiert¹⁰ (die Zellen, die H ausgesetzt wurden, wurden fixiert, während sie noch in der hypoxischen Umgebung waren), visuell untersucht, um abzusichern, dass die Monolager intakt blieben, und zweimal mit HBSS, enthaltend 0,5% bovines Serumalbumin (HBSS/A), gewaschen. Die Monolager wurden dann 10⁵ cpm des ¹²⁵I-markierten anti-P-Selectin-Antikörpers (WAPS 12.2) in der Anwesenheit von 200 μg/mL entweder des unmarkierten blockierenden Antikörpers (WAPS 12.2) oder des nicht-blockierenden anti-P-Selectin-IgG desselben Isotyps (anti-GMP-140, AC1.2-Clon, Becton-Dickinson, San Jose, CA) ausgesetzt (20,21). Nach der Bindung für 1 Stunde bei 37°C wurden die Monolager 4-mal mit HBSS/A gewaschen, und gebundener Antikörper wurde mit 1% Triton X-100 in PBS (200 μL/Vertiefung) eluiert und gezählt. Für bestimmte Experimente wurde Cycloheximid (10 μg/mL, Sigma) am Beginn der normoxischen oder hypoxischen 4 Stunden-Periode, wie angezeigt, zugefügt. In separaten Experimenten, die gestaltet wurden, um den Grad der Inhibition der Proteinsynthese durch die Cycloheximid-Behandlung zu bestimmen, wurden die ECs mit einem Methionin- und Cystein-armen minimal-essentiellen Medium (Gibco, Grand Island, NY) in der Anwesenheit von ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein (entweder in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Cycloheximid, 10 μg/mL) inkubiert (3). Nach 4 Stunden eines normoxischen Aussetzens wurde Trichloressigsäure-präzipitierbares Material gewonnen und gezählt.
Darstellung von menschlichen PMNs und Messung der Bindung: Kurz, Citrat-Blut von gesunden Spendern wurde 1:1 mit NaCl (0,9%) verdünnt, gefolgt von einer Gradienten-Ultrazentrifugation auf Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Nach einer hypotonen Lyse der Rest-Erythrocyten (20 sec Aussetzen gegenüber destilliertem H₂O, gefolgt von Wiederherstellung mit 1,8% NaCl) wurden die PMNs in HBSS mit 5 mg/mL menschlichem Serumalbumin (HBSS/HSA) suspendiert. 50-200 × 10⁶ PMNs wurden in HBSS/HSA in der Anwesenheit von 0,2-0,5 μCi ¹¹¹Indium-Oxin (Amersham Mediphysics, Port Washington, NY) für 15 Minuten bei 37°C suspendiert. Nach dem Waschen mit HBSS/HSA wurden die PMNs sanft pelletiert (450 g) und in HBSS/HSA auf eine Endkonzentration von 5,5 × 10⁶ PMNs/mL resuspendiert. Nach einer sanften Bewegung wurden 100 μL der radioaktiv markierten PMN-Suspension zu jeder Vertiefung zum angezeigten Zeitpunkt zugefügt, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und dann 4-mal mit HBSS/HSA gewaschen. Die Monolager wurden dann mit 1 N NaOH behandelt und die Inhalte von jeder Vertiefung entfernt und gezählt.
Heterotopisches Ratten- und Maus-Herztransplantat-Modell. Herztransplantate wurden im heterotopischen Ono-Lindsey Isotransplantat-Modell der Herztransplantation durchgeführt (15,18,22). Kurz, männliche Lewis-Ratten (250-300 Gramm, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) wurden anästhesiert, heparinisiert, und das Spenderherz wurde schnell nach einem hypothermischen hohes Kalium-cardioplegischen Arrest geerntet. Die Herzen wurden durch Spülen der Coronararterien mit 4°C Ringerlactat (LR)-Lösung (Baxtrer, Edison, NJ), sechzehn Stunden Eintauchen in derselben Lösung bei 4°C konserviert, gefolgt von einer heterotopischen Transplantation in Geschlechts/Stamm-passende Empfänger, wobei sequenzielle Spender- und Empfänger-Aorten- und Spender-Pulmonalarterien/Empfänger-Vena cava inferior-Anastomosen durchgeführt wurden. Das Transplantat-Überleben wurde durch die Anwesenheit/Abwesenheit einer elektrischen/mechanischen Herzaktivität genau 10 Minuten nach der Re-Etablierung des Blutflusses bewertet, wonach das Transplantat ausgeschnitten wurde und die Neutrophilen-Infiltration durch Myeloperoxidase-Aktivität quantifiziert wurde, gemessen, wie früher beschrieben (15,18). Für bestimmte Experimente wurde die Ausschöpfung von Neutrophilen der Empfängerratten durch Verabreichen eines polyclonalen Kaninchen-anti-Ratte-Neutrophilen-Antikörpers (23-25) (Accurate Scientific, Westbury NY) als eine einzelne intravenöse Injektion 24 Stunden vor dem Transplantationsvorgang erreicht. Die Ausschöpfung der Neutrophilen in diesen Tieren wurde durch Zählen der verbleibenden Neutrophilen, die auf Wright-Giemsagefärbten Abstrichen von peripherem Blut identifiziert wurden, bestätigt und quantifiziert. In anderen Experimenten wurde ein blockierendes anti-P-Selectin-IgG (250 μg/Ratte, Cytel, San Diego, CA) (13,14,26) 10 Minuten vor dem Beginn der Reperfusion intravenös verabreicht. Murine Herztransplantate wurden auf eine identische Weise unter Verwendung von männlichen homozygoten P-Selectin-Null- oder Wildtyp-Kontrollmäusen mit einem C57BL/6J-Hintergrund (27) durchgeführt, wobei die geernteten Herzen sofort mit 1,0 ml 4°C LR, das durch eine abgeklemmten Aortenwurzel verabreicht wurde, frei von nativem Blut gespült wurden, gefolgt von einer Periode der hypothermischen Konservierung, bestehend aus drei Stunden Eintauchen in Ringer-Lactatlösung bei 4°C.
Messung von vWF im Herzabfluss von hypothermisch konservierten Ratten- und menschlichen Herzen:
Menschliche Coronarsinus-Proben. Nach dem Erhalten einer Einverständniserklärung wurde zum Beginn und Ende einer Routine-Herzoperation in einer nicht-selektierten Reihe von 32 Patienten Coronarsinusblut mit gleichzeitigem Probenziehen von peripherem (arteriellem) Blut bei sechs erhalten. Die Coronarsinus-Proben wurden von einem retrograden Perfusionskatheter erhalten, der routinemäßig in Patienten platziert wurde, die sich einem cardiopulmonalen Bypass unterzogen. Die Plasmaproben wurden für 5 min bei 1500 × g zentrifugiert, um zelluläre Elemente zu sedimentieren, und das Plasma wurde aliquotiert und bei -70°C bis zum Zeitpunkt des Tests gefroren. ELISAs wurden für vWF (wie oben beschrieben) und Thrombomodulin (Asserchron Thrombomodulin, Diagnostica Stago) durchgeführt.
vWF-Immunelektrophorese: Eine multimerische Zusammensetzung des vWFs in Coronarsinus-Plasmaproben und endothelialen Zellüberständen wurde durch Durchführen einer Agarosegel-Immunelektrophorese bewertet. Die Proben wurden 1:10, 1:20 und 1:30 (wie angezeigt) verdünnt und für 30 Minuten bei 37°C in Native Sample Buffer (Bio-Rad) inkubiert. Die Proben (20 μL) wurden dann in einem 1,5% Agarosegel (0,675 g Low M^r-Agarose, Bio-Rad; 0,045 g SDS; 45 mL Tris-Tricin SDS-Puffer [Bio-Rad]) einer Elektrophorese unterzogen. Molekulargewichtsmarker, die gleichzeitig auf den Agarosegelen gelaufen wurden, wurden durch Markieren und Teilen des Gels sichtbar gemacht, wobei die Molekulargewichtsmarker-Lokalisationen durch Coomasieblau-Färbung zugeordnet wurden. Die verbleibende Hälfte des Gels wurde in Natriumborat (0,01 M) für 30 Minuten gewaschen, gefolgt von einem elektrophoretischen über Nacht-Transfer auf eine Nitrocellulosemembran. Die Membran wurde mit Waschpuffer, bestehend aus Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,5) mit 0,05% Tween-20, gewaschen und dann für 1 Stunde mit 50 mL Waschpuffer, enthaltend 2,5 g Carnation-Instantmilch blockiert. Nach einem Spülen mit physiologischer Kochsalzlösung wurde die Membran über Nacht in Waschpuffer, enthaltend 1 g/dL Gelatine und eine 1:500-Verdünnung von Kaninchen-anti-Mensch-vWF-Serum (American Bioproducts, Parsippany, NJ), eingetaucht. Nach einem fünfmaligen Waschen mit Waschpuffer wurde die Membran für 3 Stunden mit sanftem Schwenken in Waschpuffer, enthaltend 1 g/dL Gelatine und 16,6 μL Ziege-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase-konjugiertes IgG (Bio-Rad) eingetaucht und mit 60 mL HRP-Entwickler (30 mg HRP Developer-Pulver, Bio-Rad; 10 mL Methanol; 50 mL Tris-gepufferte Kochsalzlösung; 50 μL 30% Wasserstoffperoxid, das unmittelbar vor der Verwendung zugefügt wurde) entwickelt.
Statistik. Eine Varianzanalyse wurde verwendet, um 3 oder mehr Zustände zu vergleichen, wobei logische Vergleiche unter Verwendung der Tukey Vorgehensweise getestet wurden. Die Transplantat-Überlebensdaten wurden unter Verwendung der Zufallsanalyse mit der Chi²-Statistik analysiert. Ein gepaarter Vergleich von Reihenmessungen (menschliche CS- und periphere Blutproben zum Start und Ende der Herzoperation) wurde unter Verwendung des Student-t-Tests für gepaarte Variablen vergleichen. Die Werte werden als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt, wobei ein p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wird.
Ergebnisse:
Aussetzen von gezüchteten ECs gegenüber einer Hypoxie resultiert in der Freisetzung des vWF und einer Translozierung von P-Selectin auf die Zelloberfläche. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass das Aussetzen von endothelialen Zellen gegenüber einer Hypoxie in einer Erhöhung des intrazellulären Calcium resultiert (28). Angesichts der Assoziation des erhöhten cytosolischen Calciums mit der EC-Weibel-Palade-Körper-Exocytose als Antwort auf Thrombin oder Histamin (29,30) wurde erwogen, ob das Aussetzen von ECs gegenüber einer Hypoxie diesen Vorgang iniziieren könnte. ECs, die in eine hypoxische Umgebung (pO₂ 20 Torr) platziert wurden, setzten mehr vWF in die Kulturüberstände frei als ihre normoxischen Gegenstücke (8A, ELISA; bestätigt durch Immunelektrophorese, Daten nicht gezeigt). Obwohl ein Trend zu verstärkten Spiegeln von vWF zuerst nach 1 Stunde der Hypoxie bemerkt wurde, wurden die Unterschiede zwischen den normoxischen und hypoxischen vWF-Spiegeln bis nach 4 Stunden des Aussetzens nicht statistisch signifikant, wonach sie stetig für bis zu 12 Stunden der Beobachtung anstiegen. Um festzustellen, ob die erhöhte vWF-Freisetzung, die nach 4 Stunden der Hypoxie gesehen wurde, aufgrund der Freisetzung von vorgeformtem vWF erfolgte, wurden ähnliche Experimente in der Anwesenheit von 10 μg/ml Cycloheximid durchgeführt, um die Proteinsynthese zu inhibieren. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Zugabe von Cycloheximid zum Beginn der hypoxischen Periode die Hypoxie-induzierte vWF-Freisetzung um 12,5% senkte, was nahe legt, dass die Mehrheit des vWF, der durch das hypoxischen Aussetzen freigegeben wurde, vorgeformt war.
Obwohl diese Experimente in ihrer Gänze in der hypoxischen Umgebung durchgeführt wurden (d.h. es gab keine Wiederversorgung mit Sauerstoff), wurde, um weiter zu zeigen, dass diese H-vermittelte Exocytose der Weibel-Palade-Körper unabhängig von der Bildung von reaktiven Sauerstoff-Zwischenprodukten war, das Antioxidans Probucol (50 μM) zum Beginn der H zu den ECs zugefügt, und es wurde gefunden, dass es keine Wirkung hat (vWF 4,7 ± 0,31 × 10^-3 E/ml nach 6 Stunden der H). Die Anwesenheit von Probucol stumpfte den weiteren Anstieg der vWF-Spiegel, die nach der Wiederversorgung mit Sauerstoff der hypoxischen ECs gesehen wurde, ab. Die Calcium-Abhängigkeit der Hypoxie-induzierten Weibel-Palade-Körper-Exocytose wurde durch Experimente gezeigt, in denen die ECs zum Beginn des hypoxischen Aussetzens in ein Calcium-freies Medium platziert wurden. Die Abwesenheit von extrazellulärem Calcium schwächte die H-induzierte EC-Freisetzung von vWF ab, und die Zugabe von EGTA hatte eine noch unterdrückendere Wirkung (die basale endotheliale Freisetzung von vWF wurde auch durch die Reduktion von extrazellulärem Calcium vermindert) (8B).
Um festzustellen, ob die Hypoxie auch die Translozierung von P-Selectin auf die EC-Plasmalemma-Oberfläche induzierte, wurde die spezifische Bindung von ¹²⁵I-markiertem anti-P-Selectin-IgG an normoxische oder hypoxische EC-Monolayer untersucht. Bindungsuntersuchungen wurden auf EC-Monolayern, die mit Paraformaldehyd fixiert wurden, während sie noch in der hypoxischen Umgebung waren, um die Sauerstofffreie Radikal-induzierte P-Selectin-Expression während der Wiederversorgung mit Sauerstoff zu verhindern, durchgeführt. Diese Untersuchungen zeigten eine verstärkte Bindung von ¹²⁵I-anti-P-Selectin-IgG durch die hypoxischen im Vergleich zu den normoxischen ECs (9A). Diese Bindung wurde durch unmarkiertes blockierendes anti-P-Selectin-IgG aber nicht durch ein nicht-blockierendes Kontroll-anti-P-Selectin-IgG desselben Isotyps blockiert. Die Oberflächenexpression von P-Selectin wurde zu den frühesten Zeitpunkten, die beobachtet wurden (60 min der H), bemerkt und wurde in ähnlichen Spiegeln während der Periode des hypoxischen Ausgesetztseins (bis zu 4 Stunden der Beobachtung) beobachtet. Es ist möglich, dass die Hypoxie-induzierte endotheliale P-Selectin-Expression zu Zeitpunkten nachgewiesen wurde, die einem statistisch signifikanten Anstieg der vWF-Freisetzung in ähnlich behandelten Zellen vorangehen, da ein Teil des anfänglich sezernierten vWF fest an die subendometriale Matrix bindet (31).
Um zu bestimmen, ob die Proteinsynthese für eine Hypoxie-induzierte P-Selectin-Expression benötigt wurde, wurde ein separates Experiment durchgeführt, in dem Cycloheximid zum Beginn der Normoxie oder H gegeben, und die Bindung von radioaktiv markiertem anti-P-Selectin-IgG zum 4 Stunden-Zeitpunkt bestimmt wurde. Dieses Experiment zeigte, dass die Hypoxie sogar bei einer > 85% Inhibition der Proteinsynthese (9B, Einsatz) noch die endotheliale P-Selectin-Expression erhöhte, wenngleich zu reduzierten Spiegeln (9B). Um zu etablieren, dass das Hypoxie-induzierte Zelloberflächen-P-Selectin an der Neutrophilen-Bindung teilnehmen kann, wurden menschliche Neutrophile, die mit ¹¹¹Indium-Oxin radioaktiv markiert wurden, mit hypoxischen ECs inkubiert; eine verstärkte Bindung an die hypoxischen Monolager wurde beobachtet. Die Hypoxie-induzierte ¹¹¹In-PMN-Bindung wurde durch die Zugabe eines blockierenden anti-P-Selectin-IgG aber nicht durch ein nicht-blockierendes anti-P-Selectin-IgG blockiert (9C).
Die Rolle der P-Selectin-abhängigen Neutrophilen-Adhäsion in der hypothermischen/ischämischen Myokard-Konservierung. Um die Relevanz dieser Beobachtungen zur hypothermischen Myokard-Konservierung (in der der pO₂ der Konservierungslösung in den Coronargefäßen unter 20 Torr sinkt (15)) zu begründen, wurden Herzen von männlichen Lewis-Ratten gewonnen und einer hypothermischen Konservierung, wie im Verfahren-Abschnitt beschrieben, ausgesetzt. Da die Neutrophilen-vermittelte Schädigung nach einer Herzischämie gut etabliert ist (32-38), wurde die potenzielle pathophysiologische Rolle der endothelialen P-Selectin-Expression in einem orthotopischen Ratten-Herztransplantations-Modell untersucht, in dem die Reperfusion nach einer Periode der hypothermischen Konservierung erfolgte. Diese Experimente zeigten ein ausgezeichnetes Transplantat-Überleben und eine geringe Neutrophilen-Infiltration, wenn die Herztransplantation unmittelbar nach dem Ernten durchgeführt wurde (10A, Frisch). Wenn jedoch ähnliche Experimente mit einer Zwischenzeit (16 Stunden) einer hypothermischen Konservierung zwischen den Ernte- und Transplantationsvorgehensweisen durchgeführt wurden, gab es ein hohes Auftreten (90%) von Transplantatversagen und eine deutliche Leukostase, die histologisch und durch Bestimmen der Myeloperoxidase-Aktivität bestätigt wurde (10A, Konserv.). Um zu zeigen, dass die Neutrophilen-Adhäsion für ein Transplantatversagen nach einer verlängerten Konservierung zumindest zum Teil verantwortlich war, wurden die Transplantate nach einer Neutrophilen-Ausschöpfung der Empfängerratten durchgeführt. Der verwendete polyclonale Kaninchen-anti-Ratte-PMN-Antikörper (23-25) eliminierte nahezu alle zirkulierenden PMNs in den Empfängern (PMN-Zahl 1471 ± 56 gegenüber 67 ± 11 PMNs/mm³ für Kontroll- beziehungsweise immun-ausgeschöpfte Tiere, p < 0,001), mit einer geringen Wirkung auf andere Zelltypen. Wenn 16 Stunden-konservierte Herzen in Neutrophilenausgeschöpfte Empfänger transplantiert wurden, um ein Neutrophilen-freies Reperfusionsmilieu zu liefern, gab es eine signifikante Reduktion in der Transplantat-Myeloperoxidase-Aktivität und einen Anstieg im Transplantat-Überleben (10A, Konserv. (-) PMN). Normale Empfängerratten, die 10 Minuten vor der Re-Etablierung des Blutflusses mit einem blockierenden anti-P-Selectin-IgG infundiert wurden, zeigten eine Reduzierung sowohl der Myeloperoxidase-Aktivität als auch eine Verbesserung im Transplantat-Überleben (10A, α-PS, Blockierend) in einer ähnlichen Größenordnung wie die Neutrophilen-ausgeschöpften Empfänger. Diese reduzierte PMN-Infiltration und das verbesserte Transplantat-Überleben wurden trotz 16 Stunden der hypothermischen Konservierung des Spenderherzens beobachtet. In starkem Gegensatz dazu hatte die Verabreichung eines nicht-blockierenden Kontroll-Antikörpers (AC1.2) keine positive Wirkung auf die Transplantat-Leukostase oder das Transplantatüberleben (10A, α-PS, Nicht-Blockierend).
Da zusätzlich zu den Interaktionen zwischen ECs und PMNs auch Blutplättchen durch einen P-Selectin-abhängigen Mechanismus mit PMNs interagieren können (39), wurde ein Experiment gestaltet, um den Beitrag des endothelialen P-Selectins zu der Leukostase und einem Transplantatversagen, die nach einer verlängerten hypothermischen Herzkonservierung erfolgen, zu isolieren. Für diese Experimente konnten Spenderherzen von homozygoten P-Selectin-defizienten Mäusen frei von Blut gespült werden, so dass coronare endotheliale P-Selectin-Null-Zellen in Wildtyp-Empfänger mit P-Selectin-enthaltenden Blutplättchen transplantiert werden konnten. Unter Verwendung eines murinen heterotopischen Herztransplantatmodells, das identisch zu der Ratten-Operation durchgeführt wurde, wurden Spenderherzen von entweder homozygoten P-Selectin-Null-Mäusen (27) oder Wildtyp-Kontrollen erhalten; alle Herzen wurden in Wildtyp-Empfänger transplantiert. Diese Experimente zeigten eine signifikant höhere Transplantat-Überlebensrate in den P-Selectin-Null – Wildtyp-Transplantaten im Vergleich zu den Wildtyp – Wildtyp-Transplantaten (10B). Dieses verbesserte Transplantat-Überleben in der ersteren Gruppe lief zu einer deutlichen (13-fachen) Reduktion der Transplantat-Leukostase parallel (10C). Da diese Herzen zu Beginn der Konservierung frei von Blut gespült worden waren, bringen diese Untersuchungen endotheliales Herz-(eher als Blutplättchenabstammendes) P-Selectin mit der schwachen Konservierung und einem Leukocytenarrest, der nach einer hypothermischen Myocard-Konservierung bemerkt wird, in Verbindung.
Weibel-Palade-Körper-Exocytose während der menschlichen Herzoperation. Um die Relevanz dieser Ergebnisse für Menschen zu etablieren, wurde der nächste Satz von Experimenten gestaltet, um zu zeigen, dass coronare ECs die Inhalte der Weibel-Palade-Körper während der hypothermischen Herzkonservierung, wie sie während einer Routine-Herzoperation erfolgt, freisetzen. Messungen der vWF-Freisetzung aus den Coronargefäßen während einer gut definierten Periode der Herzischämie wurden gemacht, die während der Periode der Aorten-Abklemmung auftritt. Coronarsinusblut (Entleerung des Herzens) wurde zum Beginn (CS₁) und Ende (CS₂) der Aorten-Abklemmung in 32 Patienten gezogen (dieses Intervall repräsentiert die ischämische Periode). Diese Patienten (23 männliche, 9 weibliche) hatten eine klinische Vorgeschichte einer Herzklappenkrankheit (n = 11) oder einer ischämischen Herzerkrankung (n = 21) und unterzogen sich entweder einer/einem Klappenreparatur/Ersatz beziehungsweise einer Coronararterien-Bypass-Transplantation. Einfang-ELISAs, die für das integrale Membranprotein Thrombomodulin durchgeführt wurden (40), zeigten keine Änderung in den Spiegeln zwischen den CS₁- und den CS₂-Proben (4,35 ± 1,2 ng/mL gegenüber 3,48 ± 0,8 ng/mL, p = NS), was darauf hinweist, dass die ECs sich nicht ablösten und die Zellmembran-Integrität während der Herzkonservierung erhalten blieb. Ähnliche Messungen, die für den vWF durchgeführt wurden, zeigten, dass es einen konsistenten und signifikanten Anstieg des vWF gab, der während des Verlaufs der Herzkonservierung sezerniert wird (0,68 ± 0,06 E/ml gegenüber 0,90 ± 0,05 E/ml, CS₁ gegenüber CS₂, p < 0,01) (11A).
Um zu zeigen, dass dieser vWF wahrscheinlich eher von coronarem endothelialem als von Blutplättchen-Ursprung und daher nicht einfach eine Folge des Herzlungen-Bypasses war, wurden periphere Blutproben gleichzeitig mit den CS₁- und CS₂-Proben erhalten und zeigten, dass die Spiegel des vWF unverändert waren (0,831 ± 0,52 E/mL gegenüber 0,900 ± 0,41 E/mL, p = NS), was nahe legt, dass die mechanische Störung der Blutplättchen während des Herzlungen-Bypasses nicht verursachend war. Da der vWF im Plasma als Multimere mit einem Bereich von M_r's (41-44) vorhanden ist, wobei jene vWF-Multimere aus dem stimulierbaren Pool (im Gegensatz zu jenen, die konstitutiv sezerniert werden) vom höchsten Molekulargewicht sind (45), wurde eine Immunelektrophorese an den CS-Proben durchgeführt. Diese Gele zeigten, dass es zusätzlich zu einem Gesamtanstieg des vWF in den CS₂-Proben einen Anstieg in den Hochmolekulargewichts-Multimeren zu geben schien, was eine Freisetzung aus einem stimulierbaren Pool, wie er in endothelialen Zellen gefunden wird, nahe legt (11B).
Diskussion:
Die Gefäße spielen eine kritische Rolle im Beibehalten des extrazellulären Milieus von Organen, die einer Ischämie und Reperfusion ausgesetzt sind, eine Rolle, die hauptsächlich durch die ECs, die das endovaskuläre Lumpen auskleiden, instrumentiert wird. Die EC antwortet auf eine Periode des Sauerstoffmangels mit wirkungsvoller phänotypischer Modulation, wodurch sie pro-thrombotisch (46) und pro-inflammatorisch (1, 4, 6) wird. ECs, die einer Hypoxie ausgesetzt werden, sezernieren die pro-inflammatorischen Cytokine IL-1 (4) und IL-8 (6), was dazu dienen kann, den Leukocytenverkehr zu Bereichen der Ischämie zu lenken. Da diese Vorgänge eine de novo-Proteinsynthese erfordern, erklären sie nicht die unmittelbaren Ereignisse, die nach einer Periode der hypothermischen Konservierung erfolgen. Während eine verstärkte Expression von ICAM-1 und die Induzierung von E-Selectin zu späteren Zeitpunkten zu einem Leukocytenarrest in Herztransplantaten beitragen können, erklärt dies nicht die schnelle Leukostase, die nach einer kalten Konservierung beobachtet wird, in der die Proteinsynthese wahrscheinlich deutlich verlangsamt ist. In diesem Zusammenhang ändert die Cycloheximid-Vorbehandlung nicht die frühe (90-120 Minuten) PMN-Adhäsion, die nach einem hypoxischen Aussetzen von ECs gesehen wird (7), was nahe legt, dass eine de novo-Proteinsynthese nicht in Hypoxie-vermittelte Anstiege in der PMN-Bindung involviert sein muss. Obwohl der Blutplättchen-aktivierende Faktor (PAF) an der Hypoxie-vermittelten PMN-Adhäsion (7,47) und Aktivierung (48,49) teilnehmen kann, wird PAF nicht gelagert und muss synthetisiert werden, was seine Wichtigkeit während der hypothermischen Periode während der Myocard-Konservierung verringern kann. Aus diesem Grund kann die schnelle EC-Expression von vorgeformtem P-Selectin aus Subplasmalemma-Speicherstellen in Weibel-Palade-Körpern (9,50,51) den wichtigsten Mechanismus für die frühe PMN-Rekrutierung nach einer hypothermischen Konservierung darstellen. Weibel-Palade-Körper werden im Überfluss in den coronaren Mikrogefäßen gefunden (52), was ihre besondere Wichtigkeit in der Herzkonservierung nahe legt.
Die Daten zeigen, dass die Weibel-Palade-Exocytose sowohl als Antwort auf die Hypoxie per se als auch in menschlichen Herzen während der hypothermischen Konservierung erfolgt. Während es schwer ist, einen endothelialen Ursprung für den vWF, der in den menschlichen Coronarsinus-Proben beobachtet wird, genau zu identifizieren, zeigen Untersuchungen von Blutplättchen nach einem Herzlungen-Bypass keinen Anstieg in der Oberflächen-P-Selectin-Expression oder der α-Granula-Sekretion (53,54). Dies legt nahe, dass der beobachtete Anstieg im Coronarsinus-vWF nach einer Aorten-Abklemmung nicht von Blutplättchen-Ursprung ist. Zwei Aspekte der Daten legen auch nahe, dass der nach der Ischämie freigesetzte vWF von endothelialem Ursprung ist; (1) Periphere vWF-Spiegel blieben unverändert, während die Coronarsinus-Spiegel nach der Myocard-Ischämie erhöht sind, was nahe legt, dass der erhöhte vWF vom Herzen entspringt, nicht vom Herzlungen-Bypass-Apparat; (2) Die transgenen P-Selectin-Null-Spenderherzen wurden zum Beginn der Konservierung von Spenderblut frei gespült, sodass coronares endotheliales (nicht Blutplättchen-) P-Selectin vermutlich fehlt, wenn sie in Wildtyp-Empfänger transplantiert werden. Diese Experimente zeigen den wichtigen Beitrag von endothelialem P-Selectin zu der Rekrutierung von Neutrophilen, die die Reperfusion begleitet.
Es ist nicht überraschend, dass P-Selectin nach der hypothermischen Myokard-Konservierung wichtig sein sollte; neue Untersuchungen haben gezeigt, dass P-Selectin ein wichtiger Vermittler der durch Neutrophile induzierten Reperfusionsschädigung nach einer normothermischen Ischämie ist, wie es im Kaninchenohr (26) und in felinen Herzischämie (14)-Modellen gezeigt worden ist. Da Oxidationsmittel eine Expression von P-Selectin auf der EC-Oberfläche bewirken (10), war es in diesen Untersuchungen wichtig, die Rolle der hypoxischen Periode alleine zu beurteilen, da sie die ECs veranlassen kann, die erste Welle von PMNs zu rekrutieren, wobei eine weitere PMN-Rekrutierung mit dem Ansturm von reaktiven Sauerstoff-Zwischenprodukten, die in der Reperfusions-Mikroumgebung produziert werden, amplifiziert wird. Obwohl ein Bericht nahe gelegt hat, dass eine Hypoxie die EC-P-Selectin-Expression induzieren könnte, wurden diese Experimente (7) tatsächlich nach der Wiederversorgung mit Sauerstoff durchgeführt, einem Zustand, von dem bekannt ist, dass er sowohl Superoxid (18,55) als auch eine Neutrophilen-Anhaftung an gezüchtete ECs induziert (56). Im Gegensatz dazu wurden die hierin beschriebenen Experimente gänzlich in einer hypoxischen Umgebung durchgeführt, um die Möglichkeit der Wiederversorgung mit Sauerstoff vollständig zu verhindern, und Antioxidanzien versagten, die Hypoxie-induzierte P-Selectin-Expression zu blockieren, was nahe legt, dass die hierin beschriebenen Beobachtungen eher die Hypoxie per se als eine Wiederversorgung mit Sauerstoff reflektieren. Darüber hinaus zeigte der hierin gezeigte Herzschutz unter Verwendung einer Strategie, bei der blutfreie konservierte Herzen von transgenen P-Selectin-Null-Mäusen in Empfänger mit Wildtyp-Blutplättchen transplantiert werden, dass die endotheliale P-Selectin-Expression nach der hypothermischen Herzkonservierung schädlich sein kann. Weil die Weibel-Palade-Körper-Exocytose während der hypothermischen Herzkonservierung in Menschen erfolgt, legen diese Untersuchungen nahe, dass die Myocard-Konservierung durch therapeutische Strategien verbessert werden kann, die gestaltet sind, um die Aktivität von P-Selectin zu blockieren, das auf der endothelialen Oberflächen exprimiert wird.
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BEISPIEL 3: Verfahrenstechnische- und Stamm-bezogene Variablen beeinflussen signifikant das Ergebnis in einem murinen Modell der fokalen cerebralen Ischämie
Die neue Verfügbarkeit von transgenen Mäusen hat zu einer aufkeimenden Zahl von Berichten geführt, die die Wirkungen von spezifischen Genprodukten auf die Pathophysiologie des Schlaganfalls beschreiben. Obwohl fokale cerebrale Ischämiemodelle in Ratten gut beschrieben worden sind, sind Beschreibungen eines murinen Modells des mittleren cerebralen Arterienverschlusses ungenügend, und Quellen einer potenziellen experimentalen Variabilität bleiben undefiniert. Die Hypothese wurde aufgestellt, dass geringe technische Modifizierungen in stark diskrepanten Ergebnissen in einem murinen Modell des Schlaganfalls resultieren würden, und dass das Kontrollieren von operativen und verahrenstechnischen Bedingungen zu reproduzierbaren physiologischen und anatomischen Schlaganfallergebnissen führen könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurde ein murines Modell etabliert, das entweder eine permanente oder eine transitorische fokale cerebrale Ischämie durch intraluminalen Verschluss der mittleren cerebralen Arterie (MCA) erlauben würde. Diese Untersuchung liefert eine detaillierte Beschreibung der Operationstechnik und offenbart wichtige Unterschiede zwischen Stämmen, die häufig für die Produktion von transgenen Mäusen verwendet werden. Zusätzlich zu den Stammbezogenen Unterschieden scheinen das Infarktvolumen, das neurologische Ergebnis und der cerebrale Blutfluss wesentlich durch die Temperatur während der ischämischen und postischämischen Perioden, die Mausgröße und die Größe der Naht, die das Gefäßvolumen verschießt, beeinflusst zu werden. Wenn diese Variablen konstant gehalten wurden, gab es eine bemerkenswerte Gleichmäßigkeit des Schlaganfallergebnisses. Diese Daten betonen die schützenden Wirkungen der Hypothermie im Schlaganfall und sollten helfen, Techniken unter verschiedenen Laboratorien zu standardisieren, um ein zusammenhängendes Gerüst für das Beurteilen der Ergebnisse von zukünftigen Untersuchungen in transgenen Mäusen zu liefern.
Einleitung:
Das neue Aufkommen von genetisch veränderten Mäusen liefert eine einmalige Möglichkeit, die Rolle von einzelnen Genprodukten in der Pathophysiologie des Schlaganfalls zu bewerten. Obwohl es eine steigende Zahl an Berichten über die Wirkung einer cerebralen Ischämie in transgenen Mäusen gibt, gibt es bis jetzt keine detaillierte Beschreibung der involvierten murinen Modelle, noch gibt es eine detaillierte Analyse von potenziell wichtigen verfahrenstechnischen Variablen, die das Schlaganfallergebnis beeinflussen können. Die meisten Beschreibungen eines murinen Modells (1,4,8,9,14,17-19,23,24) sind übertragene Beschreibungen der weitverbreitet verwendeten Rattenmodelle der fokalen cerebralen Ischämie (22,26). Obwohl den Stammbezogenen Unterschieden in der Empfindlichkeit von Mäusen gegenüber einer cerebralen Ischämie eine gewisse Aufmerksamkeit entgegengebracht worden ist (4), sind wenige technische Betrachtungen in den veröffentlichten Untersuchungen behandelt worden. Da Pilot-Daten zeigten, dass sich geringe Unterschiede in dem operativen Vorgehen oder der postoperativen Nachsorge auf wesentliche Unterschiede im Schlaganfallergebnis übertragen, wurde die derzeitige Untersuchung unternommen, um wichtige chirurgische, technische und anatomische Betrachtungen, die benötigt werden, um konsistente Ergebnisse in einem murinen Modell der fokalen cerebralen Ischämie zu erhalten, systematisch zu identifizieren. Wenn Schlaganfälle auf eine streng kontrollierte Weise erzeugt werden, sollten die Unterschiede aufgrund der Abwesenheit (oder Überexpression) eines einzelnen Genprodukts leicht wahrnehmbar sein.
Diese Untersuchung präsentiert basierend auf Modifikationen des ursprünglichen Rattenmodells (26) eine detaillierte Darstellung eines reproduzierbaren murinen Modells eines fokalen cerebralen Infarkts. Diese Untersuchung identifiziert verfahrenstechnishce Variablen, die einen großen Einfluss auf das Schlaganfallergebnis haben, die früher in technischen Beschreibungen von murinen Schlaganfallmodellen nicht berichtet worden sind. Diese Variablen schließen die Nahtlänge und -breite, die Verfahren der vaskulären Kontrolle, die Temperaturregulierung in Mäusen und Unterschiede zwischen Stämmen, die häufig für das Züchten von transgenen Tieren verwendet werden, ein. Da sich das beschriebene Modell für die Untersuchung entweder der permanenten oder transitorischen fokalen cerebralen Ischämie eignet, werden Beweise dargelegt, die mit sorgfältig gewählten Ischämiezeitpunkten, Infarktvolumen und Mortalität in reperfundierten Tieren so gemacht werden können, um jenen, die mit einem permanenten Verschluss gesehen werden, zu entsprechen. Das Verstehen von potenziellen Modell-abhängigen Quellen der Variablilität im Schlaganfallergebnis kann helfen, die zwischen verschiedenen Laboratorien divergierenden Ergebnisse aufzuklären. Die Aneignung eines standardisierten Modells, das konsistente Ergebnisse liefert, ist ein wichtiger erster Schritt in Richtung der Verwendung von transgenen Mäusen in der Untersuchung der Pathophysiologie des Schlaganfalls.
Materialen und Verfahren:
Tierkauf und Anästhesie: Männliche Mäuse von drei verschiedenen Stämmen (C57 BlackJ6, CD-1 und 129J) wurden von den Jackson Laborstories (Bar Harbor, ME) gekauft. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Experimente acht bis zehn Wochen alt und wogen zwischen 18-37 Gramm (wie angezeigt). Die Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion von 0,3 ml Ketamin (10 mg/ml) und Xylazin (0,5 mg/ml) anästhesiert. Eine zusätzliche Dosis von 0,1 ml wurde vor dem Entfernen des Katheders bei Tieren gegeben, die einer transitorischen Ischämie unterzogen wurden. Am Tag nach der Operation wurde die Anästhesie unmittelbar vor der Laser-Doppler-Flussmessung und humanen Euthanasie wiederholt. Diese Vorgehensweisen sind durch das Institutional Animal Care and Use Committee an der Columbia University genehmigt worden und sind in Übereinstimmung mit den AALAC-Richtlinien für die humane Versorgung und Verwendung von Labortieren.
Chirurgischer Aufbau: Das Tier wurde in Rückenlage auf einer Gaze-Unterlage positioniert, die auf einer Temperaturkontrollierten Operationsoberfläche (Yellow Springs Instruments, Inc. [YSI], Yellow Springs, OH) liegt. Eine Rektaltemperatursonde (YSI) wurde inseriert, um die Temperatur der Operationsoberfläche zu regulieren, um eine konstante innere Tiertemperatur von 36-38°C beizubehalten. Um die Darstellung zu erleichtern, wurden die rechte Hinterpfote und die linke Vorderpfote auf die Operationsoberfläche geklebt, die rechte Vorderpfote wurde an die Brust des Tiers geklebt, und der Schwanz wurde an die rektale Sonde geklebt (12A). Eine Nackeninszision in der Mittellinie wurde durch sanftes Anheben der losen Haut zwischen dem Manubrium und dem Kiefer und Ausschneiden eines 1 cm 2 Kreises der Haut gemacht. Die gepaarten submandibularen Mittellinien-Drüsen, die direkt unter diesem Bereich liegen, wurden stumpf getrennt, wobei die linke Drüse in situ belassen wurde. Die rechte Drüse wurde mit einer kleinen geraden Sugita-Aneurismen-Klammer (Mizutto America, Inc., Beverly, MA), die durch eine 4.0-Seide und Klebeband an den Tisch befestigt wurde, nach cranial retrahiert. Der sternocleidomastoide Muskel wurde dann identifiziert und eine 4.0-Seidenligatur um seinen Bauch platziert. Diese Ligatur wurde nach inferolateral gezogen und an den Tisch geklebt, um den omohyoiden Muskel freizulegen, der die Carotishülle bedeckt. Die Darstellung ist in 12B gezeigt.
Operativer Ansatz: Sobald die Carotishülle freigelegt war, wurden die Maus und die Temperatur-kontrollierte Oberfläche unter ein Operationsmikroskop (16-25X Vergrößerung, Zeiss, Thornwood, NY) platziert, wobei eine coaxiale Lichtquelle verwendet wurde, um das Feld zu beleuchten. Der omohyoide Muskel wurde vorsichtig unter der Vergrößerung mit Pinzetten geteilt. Die gemeinsame Carotis-Arterie (CCA) wurde vorsichtig von ihrer Hülle befreit, wobei darauf geachtet wurde, dass keine Spannung auf den Vagus-Nerv (der lateral der CCA verläuft) angebracht wurde. Sobald sie befreit war, wurde die CCA mit einer 4.0-Seide isoliert, lose an den Operationstisch geklebt. Sobald die proximale Kontrolle der CCA erhalten wurde, wurde die Carotis-Bifurkation ins Gesichtsfeld gebracht. Die okzipitale Arterie, die aus der proximalen externen Carotis-Arterie hervorgeht und posterolateral über die proximale interne Carotis-Arterie (ICA) läuft, um in den digastrischen Muskel einzutreten, wurde an ihrem Ursprung isoliert und unter Verwendung eines bipolaren Malis-Mikrokoagulans (Codman-Schurtleff, Randolph, MA) geteilt. Dies ermöglichte eine bessere Betrachtung der ICA, da sie posterior und cephalad unter dem stylohyoiden Muskel in Richtung Schädelbasis verläuft. Kurz bevor die ICA in den Schädel eintritt, gibt sie einen pterygopalatinen Zweig ab, der lateral und cranial verläuft. Dieser Zweig wurde identifiziert, isoliert und an seinem Ursprung getrennt, währenddessen sich die CCA-ICA-Achse streckt. Eine 4.0-Seidennaht wurde dann um die interne Carotis-Arterie zur distalen Kontrolle platziert, wobei das Ende davon lose an die Operationsoberfläche geklebt wurde.
Als Nächstes wurde die externe Carotis-Arterie ins Gesichtsfeld gebracht. Ihr craniomedialer Verlauf wurde skelettiert, und ihr erster Zweig, die superiore thyroide Arterie, wurde kauterisiert und geteilt. Das Skelettieren wurde danach distal durch Anheben des Hyoids durchgeführt, um die Bifurkation der Arterie in die lingualen und maxillaren Arterien freizulegen. Nahe proximal dieser Bifurkation wurde die externe Carotis kauterisiert und geteilt. Eine ausreichende Spannung wurde dann auf die Seidennähte, die die proximalen gemeinsamen und distalen internen Carotis-Arterien umgeben, angesetzt, um den Blutfluss zu verschießen, wobei darauf geachtet wurde, nicht die Arterienwand zu verletzen. Das Klebeband auf den verschießenden Nähten wurde neu angepasst, um den Verschluss zu beizubehalten.
Einbringen und Einfädeln der verschießenden intraluminalen Naht: Unmittelbar nach dem Carotis-Verschluss wurde eine Arteriotomie in der distalen externen Carotiswand kurz proximal des kauterisierten Bereichs hergestellt. Durch diese Arteriotomie wurde eine hitzeabgestumpfte 5,0- oder 6,0-Nylonnaht (wie im Ergebnisabschnitt angegeben) eingebracht (12C und 12D). Während die Naht zum Bereich der Carotis-Bifurkation vorgeführt wurde, wurde der externe Stumpf sanft nach caudal zurückgezogen, was die Spitze der Naht in die proximale ICA leitete. Sobald die verschießende Naht in die ICA eintrat, wurde die Spannung auf die proximalen und distalen Kontrollnähte entspannt, und die verschließende Naht wurde langsam unter direkter Betrachtung (nach der Höhe der Schädelbasis geht die Sicht auf die verschließende Naht verloren) entlang der ICA in Richtung der Schädelbasis vorgeführt. Die Lokalisierung der distalen Spitze der verschließenden Naht über den Ursprung der mittleren cerebralen Arterie (MCA) (proximal des Ursprungs der anterioren cerebralen Arterie) wurde durch die Länge der gewählten Naht (12 mm oder 13 mm, wie im Ergebnisabschnitt angezeigt, gezeigt in 12C), durch Laser-Doppler-Flussmessung (siehe Abschnitt über ergänzende physiologische Vorgehensweisen) und durch Färben der cerebralen Gefäße nach dem Töten (siehe unten) bestimmt. Nachdem das Platzieren der verschießenden Naht vollständig war, wurde der externe Carotis-Arterienstumpf kauterisiert, um ein Bluten durch die Arteriotomie zu verhindern, sobald der arterielle Fluss re-etabliert war.
Komplettierung des Operationsverfahrens: Für alle gezeigten Experimente war die Dauer des Carotisverschlusses weniger als zwei Minuten. Um die Inzision zu verschließen, wurden die Nähte, die die proximale und distale CCA sowie den sternocleidomastoiden Muskel umgeben, geschnitten und gezogen. Die Aneurismenklammer wurden von der submandibularen Drüse entfernt, und die Drüse wurde über das Operationsfeld gelegt. Die Hautenden wurden dann mit einer chirurgischen Klammer angenähert, und das Tier wurde vom Tisch entfernt.
Entfernen der verschließenden Naht, um eine transitorische cerebrale Ischämie zu etablieren: Transitorische cerebrale Ischämie-Experimente erforderten die erneute Untersuchung der Wunde, um die verschließende Naht zu entfernen. Für diese Experimente wurde der anfängliche Wundverschluss mit einer temporären Aneurismenklammer anstatt einer chirurgischen Klammer durchgeführt, um einen schnellen Zugang zu der Carotis bereitzustellen. Die proximale Kontrolle mit einer 4-0-Seidennaht wurde vor dem Entfernen der verschießenden Naht wieder etabliert, um die Blutung aus dem externen Carotisstumpf zu minimieren. Während des Entfernens der verschließenden Naht wurde das Kauterisieren des externen Carotis-Arterienstumpfes früh begonnen, bevor die distale Naht den Stumpf vollständig freigegeben hat. Sobald die Naht vollständig entfernt war, wird der Stumpf ausgedehnter kauterisiert. Die Re-Etablierung des Flusses in der extracranialen internen Carotis-Arterie wurde visuell bestätigt, und die Wunde wurde verschlossen wie für die permanente fokale Ischämie, die oben beschrieben wurde. Die Bestätigung der intracranialen Reperfusion wurde mit einer Laser-Doppler-Flussmessung erzielt (siehe den Abschnitt über ergänzende physiologische Vorgehensweisen).
Berechnung des Schlaganfallvolumens: 24 Stunden nach dem mittleren cerebralen Arterienverschluss, wurden die überlebenden Mäuse wieder mit 0,3 ml Ketamin (10 mg/ml) und Xylazin (0,5 mg/ml) anästhesiert. Nachdem die endgültigen Gewichts-, Temperatur- und cerebrale Blutfluss-Ablesungen genommen wurden (wie unten beschrieben), wurden die Tiere mit 5 ml einer 0,15% Lösung von Methylenblau und Kochsalzlösung perfundiert, um die Betrachtung der cerebralen Arterien zu verstärken. Die Tiere wurden dann enthauptet, und die Gehirne wurden entfernt. Die Gehirne wurden dann auf Hinweise für eine korrekte Katheterplatzierung überprüft, die durch negative Färbung des vaskulären Gebiets, das der MCA gegenüberliegt, bewiesen wurde, und für das Durchführen von 1 mm-Schnitten in eine Mausgehirn-Matrix platziert (Activational Systems Inc., Warren, MI). Die Schnitte wurden in 2% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) in 0,9% phosphatgepufferte Kochsalzlösung eingetaucht, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und in 10% Formalin platziert (5). Nach der TTC-Färbung wurde das Infarkt-betroffene Gehirn als ein Gebiet von ungefärbtem (weißem) Gewebe in einem umgebenden Hintergrund von lebensfähigem (ziegelrotem) Gewebe gesehen. Reihenschnitte wurden fotografiert und bei einer einheitlichen Vergrößerung auf Transparentpapier projeziert; alle Reihenschnitte wurden nachgezeichnet, ausgeschnitten und das Papier wurde durch einen Techniker gewogen, der nicht über die Versuchsbedingungen informiert war. Unter diesen Bedingungen sind die Infarktvolumen proportional zu den addierten Gewichten der Papiere, die die Infarktregion umschreiben, und wurden als ein Prozentsatz des rechten Hemisphären-Volumens ausgedrückt. Diese Verfahren sind in früheren Untersuchungen bestätigt worden (3,12,15,16).
Ergänzende physiologische Untersuchungen:
Ergänzende physiologische Untersuchungen wurden an jedem der drei verschiedenen, in den gegenwärtigen Experimenten verwendeten Stämmen unmittelbar vor und nach der operativen Vorgehensweise durchgeführt. Systemische Blutdrücke wurden durch Katheterisierung der infrarenalen abdominalen Aorta erhalten und unter Verwendung eines Grass Modell 7-Polygraphen (Grass Instrument Co., Quincy, MA) gemessen. Eine arterielle Blutprobe wurde von diesem infrarenalen Aorten-Katheter erhalten; arterieller pH, pCO₂ (mm Hg), pO₂ (mmHg) und Hämoglobin-Sauerstoffsättigung (%) wurden unter Verwendung eines Blutgas-Analysegeräts und eines Hämoglobinometers (Grass Instrument Co., Quincy, MA) gemessen. Aufgrund der Notwendigkeit der arteriellen Punktierung und abdominalen Manipulation, um diese physiologischen Parameter zu messen, wurden Tiere lediglich für diese Messungen bestimmt (Schlaganfallvolumen, neurologisches Ergebnis und cerebrale Blutflüsse wurden in diesen selben Tieren nicht gemessen).
Transcraniale Messungen des cerebralen Blutflusses wurden unter Verwendung der Laser-Doppler-Flussmessung (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) nach Betrachtung der Haut, die das Schädeldach überzieht, gemacht, wie früher beschrieben (10) (die transcranialen Ablesungen waren konsistent dieselben wie jene, die in Pilotstudien nach einer Craniectomie gemacht wurden). Um diese Messungen auszuführen, wurden die Tiere in einen stereotaktischen Kopfrahmen platziert, wonach sie einer medianen Hautinzision von der Nasenwurzel zu der superioren Nackenlinie unterzogen wurden. Die Haut wurde nach lateral geschoben, und eine gerade 0,7 mm Laser-Doppler-Sonde (Modell #PF2B) wurde auf die corticale Oberfläche, die mit einer kleinen Menge physiologischer Kochsalzlösung benetzt wurde, abgesenkt. Die Ablesungen wurden 2 mm posterior des Bregma je 3 mm und 6 mm auf jeder Seite der Mittellinie unter Verwendung eines stereotaktischen Mikromanipulators, der den Winkel der Sonde senkrecht zur corticalen Oberfläche hielt, erhalten. Die relativen cerebralen Blutfluss-Messungen wurden unmittelbar nach der Anästhesie, nach dem Verschluss der MCA und unmittelbar vor der Euthanasie gemacht und sind als das Verhältnis der Dopplersignal-Intensität der ischämischen im Vergleich zu der nicht-ischämischen Hemisphäre ausgedrückt. Für Tiere, die einer transitorischen cerebralen Ischämie ausgesetzt waren, wurden kurz vor und kurz nach dem Entfernen der Naht, das eine Reperfusion iniziierte, zusätzliche Messungen gemacht.
Das chirurgische Vorgehen/der intraluminale MCA-Verschluss wurde als technisch adäquat angesehen, wenn eine ≥ 50% Reduktion im relativen cerebralen Blutfluss unmittelbar nach dem Platzieren des intraluminalen Verschlusskatheters beobachtet wurde (15 der 142 in dieser Untersuchung verwendeten Tiere [10,6%] wurden aufgrund eines inadäquaten Abfalls des Blutflusses zum Zeitpunkt des Verschlusses ausgeschlossen). Von diesen Ausschlusskriterien wurde in Voruntersuchungen durch die TTC-Färbung gezeigt, dass sie Spiegel der Ischämie ergeben, die ausreichend sind, um konsistente Infarktvolumen zu erbringen. Die Reperfusion wurde als technisch adäquat angesehen, wenn der cerebrale Blutfluss beim Katheterentfernen mindestens zweimal der cerebrale Blutfluss des Verschlusses war (13/17 Tiere in dieser Untersuchung [76%]).
Temperatur: Die innere Temperatur während der peri-Infarktperiode wurde während der Versuchsperiode sorgfältig kontrolliert. Vor der Operation wurde eine Grundlinien-Rektaltemperatur aufgezeichnet (YSI Modell 74 Thermistemp-Rektalsonde, Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH). Intraoperativ wurde die Temperatur unter Verwendung einer Thermoelement-kontrollierten Operationsoberfläche kontrolliert. Nach dem MCA-Verschluss wurden die Tieren für 90 Minuten in einen Brutschrank platziert, wobei die Tiertemperatur unter Verwendung der Rektalsonde, die durch eine Thermokupplung mit der Wärmequelle im Brutschrank verbunden war, bei 37°C gehalten. Die Temperatur wurde auf ähnliche Weise in jenen Tieren kontrolliert, die einer transitorischen Ischämie, die eine 45 Minuten (ischämische)-Periode sowie eine 90 Minuten postischämische Periode einschließt, im Brutschrank ausgesetzt waren. Nach dem Platzieren in den Kerntemperatur-Brutschrank wurden die Tiere für die restliche Dauer der Beobachtung vor der Tötung in ihre Käfige zurückgegeben.
Neurologische Untersuchung: Vor dem Verabreichen der Anästhesie zum Zeitpunkt der Euthanasie wurden die Mäuse unter Verwendung eines vierstufigen Bewertungssystems auf einen offensichtlichen neurologischen Ausfall untersucht: (1) normale spontane Bewegungen, (2) das Tier kreist nach rechts, (3) das Tier dreht sich nach rechts, (4) das Tier kauerte auf allen Vieren, reagierte nicht auf schädliche Stimuli. Von diesem System wurde in Voruntersuchungen gezeigt, dass es die Infarktgröße genau vorhersagt, und es basiert auf Systemen, die für die Verwendung in Ratten entwickelt wurden (6).
Datenanalyse: Die Schlaganfallvolumen, die neurologischen Ergebniswerte, die cerebralen Blutflüsse und die arteriellen Blutgasdaten wurden unter Verwendung eines ungepaarten Student-t-Tests verglichen. Die Werte werden als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt, wobei ein p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wird. Mortalitätsdaten, wo sie dargelegt wurden, wurden unter Verwendung der Chi²-Analyse bewertet.
Ergebnisse:
Auswirkungen des Stamms: Drei verschiedene, allgemein verwendete Mausstämme (CD1, C57/BI6 und 129J) wurden verwendet, um die Variabilität im Schlaganfallergebnis nach einer permanenten fokalen cerebralen Ischämie zu vergleichen. Um zu etablieren, dass es keine groben anatomischen Unterschiede in der Collateralisierung des cerebralen Kreislaufs gab, wurde der Circulus arteriosus cerebri unter Verwendung von Tusche in allen drei Stämmen sichtbar gemacht (13). Diese Untersuchungen konnten keine groben anatomischen Unterschiede offenlegen. Mäuse von ähnlichen Größen (20 ± 0,8 g, 23 ± 0,4 g und 23 ± 0,5 g für 129J-, CD1- beziehungsweise C57BI-Mäuse) wurden dann einer permanenten fokalen Ischämie unter normothermischen Bedingungen, unter Verwendung einer 12 mm Länge einer verschießenden 6-0 Nylonnaht, unterzogen. Signifikante Stamm-bezogene Unterschiede im Infarktvolumen wurden bemerkt, wobei die Infarkte in den 129J-Mäusen trotz identischer Versuchsbedingungen signifikant kleiner waren als jene, die in CD1- und C57/BI6-Mäusen beobachtet wurden (14A). Die Unterschiede in der Infarktgröße wurden zur neurologischen Untersuchung parallel gestellt, wobei die höchsten Werte (d.h. die schwerste neurologische Schädigung) in den C57/BI6- und CD1-Mäusen gesehen wurde (14B).
Um das Verhältnis zwischen Infarktvolumen und cerebralem Blutfluss zu der Kernregion zu bestimmen, wurde eine Laser-Doppler-Flussmessung durch das dünne murine Schädeldach durchgeführt. Es wurden keine präoperativen Stammesbezogenen Unterschiede im cerebralen Blutfluss beobachtet, was dem Fehlen von groben anatomischen Unterschieden in der vaskulären Anatomie entspricht (13). Eine Messung des cerebralen Blutflusses unmittelbar nach der Insertion des verschließenden Katheters offenbarte, dass ähnliche Grade der Flussreduktion durch das Vorgehen gebildet wurden (der Prozentsatz von ipsilateralem/kontralateralem Fluss unmittelbar nach der Insertion des verschließenden Katheters war 23 ± 2%, 19 ± 2%, 17 ± 3% für 129J-, CD1- beziehungsweise C57/BI6-Mäuse). Nicht überraschend zeigte der Blutfluss zu der Kernregion, der nach 24 Stunden kurz vor der Euthanasie gemessen wurde, die niedrigsten Blutflüsse in jenen Tieren mit der schwersten neurologischen Verletzung (14C).
Anatomische und physiologische Charakteristika von Mäusen: Die arteriellen Grundlinien-Blütdrucke sowie die arteriellen Blütdrucke nach einem mittleren cerebralen Arterienverschluss waren für alle untersuchten Tiere beinahe identisch und wurden nicht durch den Mausstamm oder die Größe beeinflusst (Tabelle I). Die Analyse des arteriellen Bluts auf pH-Wert, CO₂ und die Hämoglobin-Sauerstoffsättigung (%) ergab ähnlich keine signifikanten Unterschiede (Tabelle I).
Auswirkung der Tiergröße und Weite der verschießenden Naht: Um die Auswirkungen der Mausgröße auf das Schlaganfallergebnis zu untersuchen, wurden Mäuse von zwei verschiedenen Größen (23 ± 0,4 g und 31 ± 0,7 g) einer permanenten fokalen cerebralen Ischämie unterzogen. Um andere potenzielle Quellen einer Variabilität in diesen Experimenten zu eliminieren, wurden die Experimente unter normothermischen Bedingungen in Mäusen desselben Stamms (CD1) unter Verwendung von verschließenden Nähten von identischer Länge und Weite (12 mm 6-0 Nylon) durchgeführt. Unter diesen Bedingungen erlitten kleine Mäuse (23 ± 0,4 g) konsistent große Infarktvolumen (28 ± 9% der ipsilateralen Hemisphäre). Unter identischen Versuchsbedingungen zeigten große Mäuse (31 ± 0,7 g) viel kleinere Infarkte (3,2 ± 3%, p = 0,02, 15A), eine geringere Morbidität bei der neurologischen Untersuchung (15B) und eine Tendenz, einen höheren ipsilateralen cerebralen Blutfluss nach dem Infarkt beizubehalten als kleinere Tiere (15C).
Da die Hypothese aufgestellt wurde, dass die Reduzierung in der Infarktgrößen-Infarkte in diesen großen Tieren in Beziehung zu einer Fehlanpassung im Durchmesser/der Länge zwischen der verschießenden Naht und den cerebralen Blutgefäßen stand, wurden längere/dickere verschließende Nähte (13 mm, 5-0-Nylon) für die Verwendung in diesen größeren Mäusen gestaltet. Große CD1-Mäuse (34 ± 0,8 g), die einem permanenten Verschluss mit diesen größeren verschließenden Nähten unterzogen wurden, erlitten einen deutlichen Anstieg in den Infarktvolumen (50 ± 10% der ipsilateralen Hemisphäre, p < 0,0001 im Vergleich zu großen Mäusen, bei denen der Infarkt mit einer kleineren verschließenden Naht ausgelöst wurde, 15A). Diese größeren Mäuse, bei denen der Infarkt mit größeren verschließenden Nähten ausgelöst wurde, zeigten höhere neurologische Ausfallswerte (15B) und niedrigere ipsilaterale cerebrale Blutflüsse (15C) im Vergleich zu ähnlich großen Mäusen, bei denen ein Infarkt mit kleineren verschließenden Nähten ausgelöst wurde.
Auswirkungen der Temperatur: Um die Rolle der perioperativen Hypothermie auf die Schlaganfallvolumen und die neurologischen Ergebnisse nach einem MCA-Verschluss zu etablieren, wurden kleine C57/BI6-Mäuse (22 ± 0,4g) einem permanenten MCA-Verschluss mit einer 12 mm 6-0 Gauge-Naht ausgesetzt, wobei die Normothermie für zwei verschiedene Zeiträume beibehalten wurde; Gruppe 1 („Normothermie") wurde, wie oben beschrieben, durchgeführt, wobei die Temperatur bei 37°C von der präoperativen Periode bis 90 Minuten nach dem Verschluss beibehalten wurde. Gruppe 2-Tiere („Hypothermie") wurden von präop bis nur 10 Minuten nach dem Verschluss bei 37°C gehalten, wie es früher beschrieben worden ist (14). Innerhalb von 45 Minuten nach dem Entfernen aus dem Wärmekupplungskontrollierten wärmenden Brutschrank sank die innere Temperatur in dieser zweiten Gruppe von Tieren auf 33,1 ± 0,4°C (und sank weiter auf 31,3 ± 0,2°C nach 90 Minuten). Die Tiere, die unter Bedingungen einer verlängerten Normothermie (Gruppe 1) operiert wurden, zeigten größere Infarkt-Volumen (32 ± 9%) als die hypothermischen (Gruppe 2) Tiere (9,2 ± 5%, p = 0,03, 16A). Unterschiede im Infarktvolumen wurden durch Unterschiede im neurologischen Ausfall widergespiegelt (3,2 ± 0,4 gegenüber 2,0 ± 0,8, p = 0,02, 16B), aber waren zum Großteil unabhängig vom cerebralen Blutfluss (52 ± 5 gegenüber 52 ± 7, p = NS, 16C).
Auswirkungen eines transitorischen MCA-Verschlusses: Da die Reperfusionsverletzung als eine wichtige Ursache einer neuronalen Schädigung nach dem cerebrovaskulären Verschluss in Verbindung gebracht worden ist (25), wurde eine Untergruppe von Tieren einer transitorischen (45 Minuten) Periode der Ischämie, gefolgt von einer Reperfusion, wie oben beschrieben, unterzogen, und Vergleiche wurden mit jenen Tieren angestellt, die einem permanenten MCA-Verschluss unterzogen wurden. Der Zeitpunkt des Verschlusses wurde auf der Basis von Voruntersuchungen (nicht gezeigt) gewählt, die nicht akzeptabel hohe Mortalitätsraten (> 85%) mit 180 Minuten der Ischämie und einen seltenen Infarkt (<15%) mit 15 Minuten der Ischämie zeigten. Um den störenden Einfluss von anderen Variablen zu minimieren, wurden die anderen Versuchsbedingungen konstant gehalten (kleine (22,5 ± 0,3 g) C57/BI6-Mäuse wurden verwendet, die verschließende Naht bestand aus 12 mm 6-0 Nylon, und die Experimente wurden unter normothermischen Bedingungen durchgeführt). Der anfängliche Abfall im CBF unmittelbar nach dem Verschluss war in beiden Gruppen ähnlich (16 ± 2% gegenüber 17 ± 3% für transitorische beziehungsweise permanente Verschluss-Gruppen, p = NS). Die Reperfusion wurde sowohl durch Laser-Doppler (2,3-facher Anstieg im Blutfluss nach dem Entfernen der verschließenden Naht auf 66 ± 13%) als auch visuell durch intracardiale Methylenblau-Farbinjektion in repräsentativen Tieren bestätigt. Infarktgrößen (29 ± 10% gegenüber 32 ± 9%), neurologische Ausfallswerte (2,5 ± 0,5 gegenüber 3,2 ± 0,4) und der cerebrale Verlust-Blutfluss (46 ± 18% gegenüber 53 ± 5%) waren ziemlich ähnlich zwischen Tieren, die einer transitorischen cerebralen Ischämie und Reperfusion ausgesetzt wurden, und jenen, die einer permanenten fokalen cerebralen Ischämie ausgesetzt wurden (p = NS, für alle Gruppen) (17A-17C).
Diskussion:
Die wachsende Verfügbarkeit von genetisch modifizierten Mäusen hat zu einer steigenden Verwendung von murinen Modellen der fokalen cerebralen Ischämie geführt, um spezifische Genprodukte in der Pathogenese des Schlaganfalls einzusetzen. Obwohl neue Veröffentlichungen die Verwendung einer intraluminalen Naht beschreiben, um die mittlere cerebrale Arterie zu verschließen, um eine permanente und/oder transitorische cerebrale Ischämie in Mäusen zu bilden, hat es nur eine knappe Beschreibung der nötigen Modifizierungen des ursprünglichen technischen Berichts in Ratten (8,14,17-19,24,26) gegeben. Die hierin beschriebenen Experimente liefern nicht nur eine detaillierte technische Erklärung eines murinen Modells, das sowohl für eine permanente als auch eine transitorische fokale mittlere cerebrale Arterienischämie geeignet ist, sondern adressieren auch potenzielle Quellen der Variabilität in dem Modell.
Wichtigkeit des Stammes:
Eine der wichtigsten potenziellen Quellen der Variabilität im hierin beschriebenen murinen cerebralen Ischämie-Modell bezieht sich auf den Stamm des verwendeten Tieres. Die Daten der drei getesteten Stämme legen nahe, dass 129J-Mäuse besonders resistent gegen eine neurologische Verletzung nach dem MCA-Verschluss sind. Obwohl Barone ähnlich Unterschiede in den Schlaganfallvolumen zwischen 3 Stämmen von Mäusen (BDF, CFW und BALB/C) fand, wurden diese Unterschiede Variationen in den posterioren kommunizierenden Arterien in diesen Stämmen zugeschrieben (4). Da anatomische Unterschiede in der cerebrovaskulären Anatomie in dieser Untersuchung nicht grob ersichtlich waren (13), legen die Daten nahe, dass nicht-anatomische Stammes-bezogene Unterschiede auch für das Ergebnis nach einem MCA-Verschluss wichtig sind.
Das sich das Schlaganfallergebnis signifikant zwischen 2 Stämmen von Mäusen (129J und C57/BI6), die häufig verwendeten werden, um transgene Mäuse durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen zu produzieren (11), unterscheidet, legen die Daten einen wichtigen Einspruch gegen Experimente nahe, die mit transgenen Mäusen durchgeführt werden. Da frühe Gründernachkommen von der Bildung von transgenen Tieren mit diesen Stämmen einen gemischten 129J/C57/BI6-Hintergrund haben, sollten die Experimente idealerweise entweder mit Geschwisterkontrollen oder nach einer ausreichen Zahl von Rückkreuzungen durchgeführt werden, um die Stammesreinheit zu versichern.
Wichtigkeit der Größe:
Größere Tiere erfordern eine längere und dickere intraluminale Naht, um die Infarktvolumen zu erhalten, die mit jenen konsistent sind, die in kleineren Tieren mit kleineren verschließenden Nähten erhalten wurden. Die Größen-Anpassung von Tier und Naht erscheint wichtig zu sein, nicht nur, um konsistent einen cerebralen Infarkt zu produzieren, sondern wohingegen eine zu kleine Naht zu einer unzureichenden Ischämie führt, führt eine zu große Naht zu häufiger intracerebraler Blutung und vaskulärem Trauma (nicht veröffentlichte Beobachtung).
Die Verwendung von Tieren von ähnlicher Größe ist nicht nur wichtig, um eine potenzielle altersbezogene Variabilität in der neuronalen Empfänglichkeit auf den Ischämie-Insult zu minimieren, sondern auch um zu versichern, dass nicht kleine Unterschiede in der Tiergröße einen bedeutenden Datenvergleich vernebeln. In diesem Beispiel wird gezeigt, dass Größenunterschiede von so wenig wie 9 Gramm eine wesentliche Auswirkung auf das Infarktvolumen und das neurologische Ergebnis nach einer cerebralen Ischämie haben können. Weitere Experimente unter Verwendung einer verschließenden Naht mit größerer Weite in größeren Tieren legen nahe, dass die erhöhte Neigung von kleineren Tieren, größere Schlaganfälle zu haben, nicht aufgrund einer relativen Resistenz von größeren Tieren gegenüber einer ischämischen neuronalen Schädigung erfolgte, sondern eher aufgrund der kleinen Größe der Naht war, die verwendet wurde, um die MCA in großen Tieren zu verschließen. Obwohl diese Daten unter Verwendung von CD1-Mäusen erhalten wurden, sind ähnliche Untersuchungen durchgeführt worden, und es wurde gefunden, dass diese Ergebnisse auch bei anderen Mausstämmen wie C57/BI6 zutreffen (nicht veröffentlichte Daten). Neue veröffentlichte Berichte verwenden Mäuse von vielen verschiedenen Größen (von 21 g bis 35 g) sowie verschiedene Naht-Durchmesser und -Längen, die oft nicht berichtet werden (14,17). Die Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Tier- und Nahtgröße wichtige methodische Themen sind, die in wissenschaftlichen Berichten adressiert werden müssen.
Wichtigkeit der Temperatur:
Es ist lange erkannt, dass eine Hypothermie eine Reihe von Organen, einschließlich des Gehirns, vor ischämischer Verletzung schützt. Untersuchungen, die in Ratten durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass eine intraischämische Hypothermie von bis zu 1 Stunde nach dem MCA-Verschluss schützend ist (2,15), wobei sie mit Temperaturen von 34,5 Grad sowohl die Mortalität als auch die Infarktvolumen reduziert. Obwohl diese Ergebnisse auf murine Modelle der cerebralen Ischämie extrapoliert worden sind, indem die Untersuchungen oft das Beibehalten der Normothermie in Tieren beschreiben, sind die post-MCA-Verschluss-Temperatur-Überwachungszeiträume extrem kurz gewesen („unmittelbar nach der Operation" oder „10 Minuten nach der Operation") (4,14). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Tiere versagen, ihre Temperatur über diese kurzen Zeiträume hinaus zu autoregulieren, wobei sie während der postoperativen Periode schwer hypothermisch werden, und dass Temperaturunterschiede bis zu 90 Minuten nach dem MCA-Verschluss eine schwere Wirkung auf die Anzeichen des Schlaganfallergebnisses nach einem MCA-Verschluss können haben (längere Zeiträume der Normothermie wurden nicht untersucht). Während andere eine Normothermie unter Verwendung eines Feedback-Systems basierend auf der Rektaltemperatur ähnlich zu dem einen, das hierin beschrieben wird, versichert haben, wird die Dauer der Normothermie oft nicht angegeben (17). Die Ergebnisse argumentieren für eine klare Identifizierung der Verfahren zum Überwachen und Beibehalten der Temperatur sowie der involvierten Zeiträume, sodass experimentelle Ergebnisse sowohl innerhalb von als auch zwischen Zentren, die die Pathophysiologie des Schlaganfalls untersuchen, verglichen werden können.
Transitorischer versus permanenter Verschluss:
Die Pathophysiologie von bestimmten Aspekten der permanenten cerebralen Ischämie kann gut von jener der cerebralen Ischämie, gefolgt von einer Reperfusion, verschieden sein, daher war es wichtig, dass ein Modell beschrieben wird, das die Analyse von jedem Zustand erlaubt. Obwohl die Unterschiede zwischen diesen zwei Modellen nicht ausführlich in der gegenwärtigen Reihe von Experimenten getestet wurden, wurden unter den getesteten Bedingungen (45 Minuten der Ischämie, gefolgt von 23 Stunden der Reperfusion) keine signifikanten Unterschiede in irgendeinem Anzeichen des Schlaganfallergebnisses gefunden. Variable Zeiträume der Ischämie und Reperfusion sind in anderen murinen Modellen der transitorischen cerebralen Ischämie berichtet worden, wobei die Ischämie-Zeiträume von 10 Minuten zu 3 Stunden reichten und die Reperfusions-Zeiträume von 3 bis 24 Stunden reichten (17,24). Untersuchungen in Ratten haben gezeigt, dass kurze Perioden der Ischämie, gefolgt von einer Reperfusion, mit kleineren Infarkten assoziiert sind als ein permanenter Verschluss (21,25). Wenn jedoch die Dauer der Ischämie über einen kritischen Grenzwert hinaus ansteigt (zwischen 120 und 180 Minuten), ist die Reperfusion mit größeren Infarkten assoziiert (7,21,26). Für die laufende Reihe von Experimenten wurden die Zeiträume der Ischämie und Reperfusion so gewählt, um Infarkte zu erhalten, die zu jenen vergleichbar waren, die nach einem permanenten MCA-Verschluss beobachtet wurden, was wahrscheinlich erklärt, warum die Daten keine Unterschiede zwischen der permanenten und transitorischen Ischämie zeigen konnten. Diese Zeiträume im transitorischen Modell wurden nach Pilot-Experimenten gewählt, die offenlegten, dass kürzere ischämische Zeiträume (15 Minuten) selten zu einem Infarkt führten, wohingegen 180 Minuten des Verschlusses, gefolgt von einer Reperfusion, zu einem massiven Infarkt und beinahe 100% Mortalität innerhalb von 4-6 Stunden in normothermischen Tieren führten (nicht veröffentlichte Beobachtung). Obwohl die Anzeichen des Schlaganfallergebnisses früher als 24 Stunden gemessen werden können, wurde die 24 Stunden-Beobachtungszeitdauer gewählt, weil die Beobachtung zu dieser Zeit die Untersuchung eines verzögerten unklaren Todes erlaubt, was wahrscheinlich klinisch relevant für die Pathophysiologie des Schlaganfalls in Menschen ist. Darüber hinaus ist in einem Rattenmodell gezeigt worden, dass 24 Stunden für eine vollständige Infarktreifung ausreichend sind (3,12,15,16).
Technische Aspekte des murinen Modells:
Die technischen Aspekte der Operation, die benötigt wird, um eine fokale cerebrale Ischämie in Mäusen zu bilden, unterscheiden sich in bestimmten wichtigen Punkten von jenen in Ratten. Selbsthaltende Retraktoren, die in früheren Berichten in Ratten empfohlen worden sind (26), sind in Mäusen unhandlich. Naht-basierendes Zurückziehen, das mit einem Klebeband gesichert wird, liefert eine bessere Alternative. In Ratten ist ein Klammer-Verschluss der proximalen und distalen Carotis-Arterie nach Mobilisierung der externen Carotis-Arterie berichtet worden (26), erzeugt aber ein(e) größere(s) Carotis-Trauma und Blutung in Mäusen. Ohne eine distale, interne Carotiskontrolle, die früher in Mäusen nicht beschrieben worden ist, ist ein Rückbluten aus der externen Carotis-Arterie durchweg unkontrollierbar. Unter Verwendung der in diesem Dokument beschrieben Techniken kann die Operation nahezu ohne Blutverlust beendet werden, was angesichts des kleinen Blutvolumens in Mäusen besonders wichtig ist.
Im Gegensatz zu dem Rattenmodell wird der Verschluss und die Durchtrennung der externen Carotis-Arterien-Zweige und der pterygopalatinen Arterie im murinen Modell alleine durch Elektrokauterisieren erreicht. In frühere Berichten einer murinen Operation ist unklar gewesen, ob die pterygopalatine Arterie genommen wurde oder nicht (17,24). Andere haben ein Verfahren mit einem permanenten Verschluss der gemeinsamen Carotis-Arterie und eine trans-Carotis-Insertion der Naht ohne Beachtung des externen Carotis-Systems oder der pterygopalatinen Arterie beschrieben. Während dieses letztere Verfahren für einen permanenten Verschluss wirksam ist, macht es eine Reperfusions-Untersuchung unmöglich.
Das Verfahren der Reperfusion, das ursprünglich in der Ratte beschrieben wurde, erfordert ein blindes Katheterentfernen ohne Anästhesie (26). Wenn dies in Pilot-Untersuchungen in Mäusen versucht wurde, bluteten einige Tiere. Daher wurde ein Verfahren zur Nahtentfernung unter direkter Betrachtung im anästhesierten Tier entwickelt, das nicht nur eine visuelle Bestätigung der Reperfusion der extracranialen Carotis-Arterie ermöglicht sondern auch eine äußerst genaue Hämostase gestattet.
Weiterhin erlaubt das Verfahren unmittelbare prä- und post-Reperfusions-Laser-Doppler-Flussmessungs-Ablesungen im anästhesierten Tier.
Diese Laser-Doppler-Flussmessungs-Ablesungen sind ähnlich zu jenen, die durch Kamii et al. und Yang et al. beschrieben wurden, da die Ablesungen periodisch und mit der Verwendung eines stereotaktischen Mikromanipulators gemacht werden (17,24). Die Ablesungen unterscheiden sich allerdings dadurch, dass die verwendeten Koordinaten (2 mm posterior und 3 und 6 mm lateral des Bregma) ein bisschen mehr lateral und posterior sind als die früher veröffentlichten Kern- und Halbschatten-Koordinaten (1 mm posterior und 2 mm und 4,5 mm lateral des Bregma). Diese Koordinaten, die basierend auf Pilot-Untersuchungen angepasst wurden, sind dieselben wie jene, die von Huang et al. (14) verwendet wurden.
Schlussfolgerung:
Diese Untersuchungen zeigen spezifische technische Aspekte eines murinen Modells für eine fokale cerebrale Ischämie und Reperfusion, das eine Reproduzierbarkeit der Messungen zwischen verschiedenen Laboratorien erlaubt. Zusätzlich liefern diese Untersuchungen einen Rahmen zum Verstehen von wichtigen verfahrenstechnischen Variablen, die das Schlaganfallergebnis stark beeinflussen können, was zu einem klaren Verstehen von Unterschieden, die untersucht werden und nicht mit der Vorgehensweise in Beziehung stehen, führen sollte. Am wichtigsten ist, dass diese Untersuchung den Bedarf einer sorgfältigen Kontrolle des Mausstamms, der Tier- und Nahtgröße und der Temperatur in den Versuchs- als auch den Kontrolltieren aufzeigt. Bedingungen können etabliert werden, so dass das Schlaganfallergebnis zwischen Modellen einer permanenten fokalen cerebralen Ischämie und einer transitorischen fokalen cerebralen Ischämie ähnlich ist, was einen direkten Vergleich ermöglichen und die Untersuchung einer Reperfusionsverletzung erlauben sollte. Das in dieser Untersuchung beschriebene Modell sollte einen geschlossenen Rahmen für das Bewerten der Ergebnisse von zukünftigen Untersuchungen in transgenen Tieren bereit stellen, um ein Verstehen des Beitrags von spezifischen Genprodukten in der Pathophysiologie des Schlaganfalls zu ermöglichen.
Tabelle I. Prä- und postoperative physiologische Parameter. MAP, mittlerer arterieller Druck; pCO₂, teilweiser Druck des arteriellen CO₂ (mm Hg); O₂ Sat, O₂-Sättigung (%); Hb, Hämoglobinkonzentration (g/dl); Präoperativ, anästhesierte Tiere vor der Carotis-Präparierung; Schein, anästhesierte Tiere, die der im Text beschriebenen Operation unterzogen werden, unmittelbar vor dem Einbringen der verschließenden Naht; Schlaganfall, anästhesierte Tiere, die der im Text beschriebenen Operation unterzogen werden, unmittelbar nach dem Einbringen der verschließenden Naht. p = NS für alle Vergleiche zwischen den Gruppen (gezeigte Daten sind für kleine 22 Gramm-C57/BI6-Mäuse).
Bezugnahmen:

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BEISPIEL 4: Verschlimmerung der cerebralen Verletzung in Mäusen, die das P-Selectin-Gen exprimieren: Identifizierung der P-Selectin-Blockade als ein neues Ziel für die Behandlung eines Schlaganfalls
Derzeit gibt es eine starre therapeutische Leere für die Behandlung eines entstehenden Schlaganfalls. Obwohl P-Selectin durch hypoxische endotheliale Zellen in vitro schnell exprimiert wird, bleibt die funktionelle Signifikanz der P-Selectin-Expression im Schlaganfall unerforscht. Um die pathophysiologischen Folgen der P-Selectin-Expression zu identifizieren und um eine P-Selectin-Blockade als einen potenziellen neuen Ansatz für die Behandlung des Schlaganfalls zu identifizieren, wurden Experimente unter Verwendung eines murinen Modells der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion durchgeführt. Eine frühe P-Selectin-Expression im postischämischen cerebralen Cortex wurde durch die spezifische Akkumulierung von radioaktiv markiertem anti-murines P-Selectin-IgG gezeigt. In parallelen Experimenten war die neutrophile Akkumulierung im ischämischen Cortex von Mäusen, die das P-Selectin-Gen exprimieren (PS +/+) signifikant größer als jene, die in homozygoten P-Selectin-Null-Mäusen (PS -/-) gezeigt wurde. Ein reduzierter Neutrophilen-Einstrom wurde in den PS -/- Mäusen von einem größeren postischämischen cerebralen Rückfluss begleitet (gemessen durch Laser-Doppler). Zusätzlich zeigten PS -/- Mäuse kleinere Infarktvolumen (fünffache Reduktion, p < 0,05) und ein verbessertes Überleben im Vergleich zu PS +/+ Mäusen (88% gegenüber 44%, p < 0,05). Eine funktionelle Blockade von P-Selectin in PS +/+ Mäusen unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der gegen murines P-Selectin gerichtet ist, verbesserte auch den frühen Rückfluss und das Schlaganfallergebnis im Vergleich zu Kontrollen. Diese Daten sind die ersten, die eine pathophysiologische Rolle von P-Selectin im Schlaganfall zeigen, und legen nahe, dass eine P-Selectin-Blockade ein neues therapeutisches Ziel für die Behandlung des Schlaganfalls darstellen kann.
EINLEITUNG
Der ischämische Schlaganfall macht heute die dritte führende Todesursache in den Vereinigten Staaten aus¹. Bis vor sehr kurzer Zeit hat es keine direkte Behandlung gegeben, um die cerebrale Gewebeschädigung in einem entstehenden Schlaganfall zu reduzieren. Obwohl die NINDS² und ECASS³ rt-PA-akuter Schlaganfall-Untersuchungen nahe gelegt haben, dass es potenzielle therapeutische Vorteile einer frühen Reperfusion gibt⁴, unterstreicht die erhöhte Mortalität, die nach einer Streptokinase-Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls beobachte wird⁵, die ernüchternde Tatsache, dass es zur Zeit keine klar wirksame Behandlung eines entstehenden Schlaganfalls gibt. Diese Lücke im gegenwärtigen medizinischen Rüstzeug für die Behandlung des Schlaganfalls hat zu einer Reihe von neuen Ansätzen geführt⁶, jedoch haben außer rt-PA keine den klinischen Bereich erreicht. Um eine potenziell sichere und wirksame Behandlung für einen entstehenden Schlaganfall zu identifizieren, ist die Aufmerksamkeit auf die schädliche Rolle der rekrutierten Neutrophilen konzentriert worden. Eine neue Arbeit in einem murinen Modell eines reperfundierten Schlaganfalls hat gezeigt, dass die Ausschöpfung von Neutrophilen (PMNs) vor dem Schlaganfall die cerebrale Gewebeverletzung minimiert und das funktionelle Ergebnis verbessert⁷; Mäuse, denen das spezifische Zelladhäsionsmolekül ICAM-1 fehlt, sind ähnlich geschützt⁷. P-Selectin, ein Molekül, das schnell aus vorgeformten Speicherstellen zu der hypoxischen endothelialen Oberfläche transloziert werden kann⁸, ist ein wichtiger früher Mediator des Neutrophilen-Rollens⁹, das einen ICAM-1-vermittelten Neutrophilen-Arrest ermöglicht. Obwohl P-Selectin im Primaten-Schlaganfall exprimiert wird¹⁰, gibt es keine veröffentlichten Daten, die die funktionelle Signifikanz der P-Selectin-Expression in irgendeinem Modell von entweder reperfundiertem oder nicht-reperfundiertem Schlaganfall adressieren.
Um die pathophysiologische Rolle von P-Selectin im Schlaganfall zu untersuchen, wurde ein murines Modell der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion¹¹ unter Verwendung von sowohl Wildtyp-Mäusen und Mäusen, die homozygot-Null für das P-Selectin-Gen waren⁹, und einer Strategie des Verabreichens eines funktionell blockierenden P-Selectin-Antikörpers angewendet. Diese Untersuchung bestätigt nicht nur, dass die P-Selectin-Expression nach einem mittleren cerebralen Arterienverschluss mit einem reduzierten cerebralen Rückfluss nach der Reperfusion und einem schlechteren Ergebnis nach dem Schlaganfall assoziiert ist, sondern dass eine P-Selectin-Blockade einen signifikanten Grad eines postischämischen cerebralen Schutzes verleiht. Diese Untersuchungen repräsentieren das erste Aufzeigen der pathophysiologischen Rolle der P-Selectin-Expression im Schlaganfall und legen die aufregende Möglichkeit nahe, dass anti-P-Selectin-Strategien sich als nützlich für die Behandlung eines reperfundierten Schlaganfalls erweisen können.
VERFAHREN
Mäuse: Die Experimente wurden mit transgenen P-Selectin-defizienten Mäusen durchgeführt, die, wie früher berichtet⁹, durch Gene-Targeting in embryonalen J1-Stammzellen, die in C57BL/6-Blastocysten injiziert, um eine Keimbahnübertragung zu erhalten, und rückgekreuzt wurden, um homozygote P-Selectin-Null-Mäuse (PS -/-) zu erhalten, hergestellt wurden. Die Experimente wurden mit PS -/- oder Wildtyp (PS +/+) Cousin-Mäusen aus der dritten Generation von Rückkreuzungen mit C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Experimente sieben bis zwölf Wochen alt und wogen zwischen 25-36 Gramm.
Transitorischer mittlerer cerebraler Arterienverschluss: Die Mäuse wurden anästhesiert (0,3 ml von 10 mg/ml Ketamin und 0,5 mg/ml Xylazin, i.p.) und in Rückenlage auf einer Rektaltemperatur-kontrollierten Operationsoberfläche (Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH) positioniert. Die innere Temperatur der Tiere wurde intraoperativ und für 90 Minuten nach der Operation bei 37 ± 1°C gehalten. Eine Nackeninzision in der Mittellinie wurde gemacht, um die rechte Carotishülle unter dem Operationsmikroskop (16-25X Vergrößerung, Zeiss, Thornwood, NY) freizulegen. Die gemeinsame Carotis-Arterie wurde mit einer 4-0 Seide isoliert und die okzipitalen, pterygopalatinalen und externen Carotis-Arterien wurden isoliert und geteilt. Der mittlere cerebrale Arterienverschluss (MCAO) wurde durch Vorführen einer 13 mm hitzeabgestumpften 5-0 Nylon-Naht durch den externen Carotisstumpf erreicht. Nach dem Platzieren der verschließenden Naht wurde der externe Carotis-Arterienstumpf kauterisiert, und die Wunde wurde verschlossen. Nach 45 Minuten wurde die verschließende Naht entfernt, um eine Reperfusion zu etablieren. Diese Vorgehensweisen sind früher im Detail beschrieben worden⁹.
Messung des cerebralen corticalen Blutflusses: Transcraniale Messungen des cerebralen Blutflusses wurden unter Verwendung eines Laser-Doppler (Perimed, Inc., Piscataway, NJ), wie früher beschrieben¹², durchgeführt. Unter Verwendung einer geraden 0,7 mm Laser-Doppler-Sonde (Modell #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) und früher veröffentlichen Charakteristika (2 mm posterior des Bregma, je 6 mm seitlich der Mittellinie)^11,13 wurden relative cerebrale Blutfluss-Messungen gemacht, wie angezeigt; unmittelbar nach der Anästhesie, 1 und 10 Minuten nach dem Verschluss der mittleren cerebralen Arterie sowie nach 30 Minuten, 300 Minuten und 22 Stunden der Reperfusion. Die Daten sind als das Verhältnis der Doppler-Signalintensität der ischämischen im Vergleich zur nicht-ischämischen Hemisphäre ausgedrückt. Obwohl dieses Verfahren den cerebralen Blutfluss nicht pro Gramm Gewebe quantifiziert, dient die Verwendung von Laser-Doppler-Flussmessungen an genau definierten anatomischen Charakteristika als ein Mittel zum fortlaufenden Vergleichen der cerebralen Blutflüsse im Zeitablauf im selben Tier. Das chirurgische Vorgehen wurde als technisch adäquat angesehen, wenn eine ≥ 50% Reduktion im relativen cerebralen Blutfluss unmittelbar nach dem Platzieren der intraluminalen verschließenden Naht beobachtet wurde. Diese Verfahren sind in früheren Untersuchungen verwendet worden^7,11.
Die cerebrovaskuläre Anatomie wurde in repräsentativen Tieren auf die folgende Weise bestimmt. Die Mäuse wurden anästhesiert, und eine ante-mortem Injektion (0,1 ml) von Tusche: Kohlenschwarz: Methanol: physiologischer Kochsalzlösung (1:1:1:1, V:V:V:V) wurde durch linke ventrikuläre Punktion verabreicht. Die Gehirne wurden durch schnelle Enthauptung, gefolgt von einer Immersion in 10% Formalin bei 4°C für 2 Tage präpariert, wonach die inferioren Oberflächen fotografiert wurden, um das vaskuläre Muster des Circulus arteriosus cerebri zu zeigen.
Präparation und Verabreichung von ¹²⁵I-markierten Proteinen und ¹¹¹In-markierten murinen Neutrophilen: Radioaktiv iodierte Antikörper wurden wie folgt hergestellt. Monoclonales Ratte-anti-murines P-Selectin-IgG (Clon RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA)¹⁴ und nicht immunes Ratten-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden mit ¹²⁵I durch das Lactoperoxidase-Verfahren¹⁵ unter Verwendung von Enzymobeads (Bio-Rad, Hercules, CA) radioaktiv markiert. Radioaktiv markierte PMNs wurden auf folgende Weise hergestellt. Citratblut von Wildtyp-Mäusen wurde 1:1 mit NaCl (0,9%) verdünnt, gefolgt von einer Gradienten-Ultrazentrifugation auf Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Nach einer hypotonischen Lyse der Rest-Erythrocyten (20 sec Aussetzen gegenüber destilliertem H₂O, gefolgt von Rekonstitution mit 1,8% NaCl) wurden die PMNs in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert. Die Neutrophilen (5 – 7,5 × 10⁶) wurden in PBS mit 100 μCi ¹¹¹Indiumoxin (Amersham Mediphysics, Port Washington, NY) suspendiert und für 15 Minuten bei 37°C einer sanften Bewegung ausgesetzt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die PMNs sanft pelletiert (450 × g) und in PBS auf eine Endkonzentration von 1,0 × 10⁶ Zellen/mL resuspendiert.
Neurologische Untersuchung: Vor dem Verabreichen der Anästhesie wurden die Mäuse 22 h nach der Reperfusion unter Verwendung eines vierstufigen Bewertungssystems¹¹ auf einen neurologischen Ausfall untersucht: ein Wert von 1 wurde gegeben, wenn das Tier normale spontane Bewegungen zeigte; ein Wert von 2 wurde gegeben, wenn bemerkt wurde, dass sich das Tier zu der ipsilateralen Seite dreht; ein Wert von 3 wurde gegeben, wenn beobachtet wurde, dass sich das Tier longitudinal (im Uhrzeigersinn, wenn vom Schwanz aus betrachtet) dreht; ein Wert von 4 wurde gegeben, wenn das Tier keine Reaktion auf schädigende Stimuli zeigte. Dieses Bewertungssystem ist früher in Mäusen beschrieben worden^7,11 und basiert auf ähnlichen Bewertungssystemen, die in Ratten verwendet werden^16,17.
Berechnung der Infarktvolumen: Nach der neurologischen Untersuchung wurden die Mäuse anästhesiert und die endgültigen cerebralen Blutfluss-Messungen erhalten. Eine humane Euthanasie wurde durch Enthaupten durchgeführt, und die Gehirne wurden entfernt und für 1 mm-Schnitte in eine Mausgehirn-Matrix (Activational Systems Inc., Warren, MI) platziert. Die Schnitte wurden in 2% 2,3,5-Triphenyl-2H- tetrazoliumchlorid (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 0,9% phosphatgepufferter Kochsalzlösung eingetaucht, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und in 10% Formalin platziert¹⁸. Infarkt-Gehirn wurde als ein Bereich von nicht gefärbtem Gewebe gesehen. Die Infarktvolumen wurden aus planimetrischen Reihenschnitten berechnet und als der Prozentsatz des Infarkts in der ipsilateralen Hemisphäre ausgedrückt. Dieses Verfahren des Berechnens von Infarktvolumen ist früher verwendet worden^7,11,13,18 und ist mit den anderen funktionellen Anzeichen des Schlaganfallergebnisses, die oben beschrieben sind, korreliert worden.
Verabreichung von unmarkierten Antikörpern, radioaktiv markierten PMNs und radioaktiv markierten Antikörpern: Für Experimente, in denen unmarkierte Antikörper verabreicht wurden, wurden ein oder zwei verschiedenen Antikörpertypen verwendet; entweder ein blockierendes monoclonales Ratte-anti-murines P-Selectin-IgG (Clon RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA)^14,19,20 oder ein nicht-immunes Ratten-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Die Antikörper wurden als 30 μg in 0,2 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,1% bovines Serumalbumin, hergestellt, was dann 10 Minuten vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss in die Penisvene verabreicht wurde. In separaten Experimenten wurden radioaktiv markierte Antikörper (0,15 mL, ≈2,6 × 10⁵ cpm/μL) 10 Minuten vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss intravenös injiziert. In einer dritten Gruppe von Experimenten wurden radioaktiv markierte PMNs 10 Minuten vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss als eine 100 μL Injektion (radioaktiv markierte PMNs wurden mit physiologischer Kochsalzlösung auf ein Gesamtvolumen von 0,15 mL zusammengemischt; ≈3 × 10⁶ cpm/μL) intravenös verabreicht. Für Experimente, in denen unmarkierte Antikörper verabreicht wurden, ist die Zeit, zu der die Messungen unter Verwendung der Verfahren, die oben beschrieben wurden, um den cerebralen Blutfluss, die Infarktvolumen und die Mortalität zu bestimmen, gemacht wurden, im Text angezeigt. Für jene Experimente, in denen entweder radioaktiv markierte Antikörper oder radioaktiv markierte nPMNs verabreicht wurden, wurden die Mäuse zu den angezeigten Zeitpunkten getötet, und die Gehirne wurden sofort entfernt und in ipsilaterale (postischämische) und kontralaterale Hemisphären geteilt. Die Ablagerung von radioaktiv markierten Antikörpern oder Neutrophilen wurde gemessen und als ipsilaterale/kontralaterale cpm ausgedrückt.
Datenanalyse: Der cerebrale Blutfluss, das Infarktvolumen und die ¹¹¹InPMN-Ablagerung wurden unter Verwendung des Student-t-Tests für ungepaarte Variablen verglichen. Die neurologischen Ausfallswerte wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests verglichen. Eine Zweiweg-ANOVA wurde durchgeführt, und auf signifikante Unterschiede zwischen der Grundlinien- und der endgültigen (30 min) Antikörperablagerung zwischen den zwei Gruppen (Versuch gegenüber Schein) zu testen. Der Student-t-Test für ungepaarte Variablen wurde durchgeführt, um Unterschiede (Grundlinie gegenüber dem 30 min-Zeitpunkt) innerhalb einer Gruppe zu bewerten. Die Überlebens-Unterschiede zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung einer Zufalls-Analyse mit der Chi²-Statistk getestet. Die Werte werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt, wobei ein p-Wert von < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wird.
ERGEBNISSE
P-Selectin-Expression im murinen Schlaganfall: Weil P-Selectin die Anfangsphase der Leukocyten-Adhäsion an aktivierte endotheliale Zellen vermittelt²¹, wurde die frühe cerebrale P-Selectin-Expression in einem murinen Modell eines reperfundierten Schlaganfalls untersucht. Mäusen, denen vor der Operation ein ¹²⁵I-markiertes monoclonales Ratte-anti-murines P-Selectin-IgG gegeben wurde, zeigten nach 30 Minuten der Reperfusion einen 216% Anstieg in der Akkumulierung des Antikörpers im Vergleich zu den Schein-behandelten Tieren (p < 0,001, 18A). Um zu zeigen, dass dieser Grad der Antikörperablagerung in der reperfundierten Hemisphäre aufgrund der P-Selectin-Expression und nicht einer nicht-spezifischen Akkumulierung erfolgte, wurde ein Vergleich mit identisch behandelten Tieren, denen ein ¹²⁵I-markiertes Ratte-nicht-immun-IgG gegeben wurde, angestellt. Diese Experimente zeigten, dass es eine signifikant größere Akkumulierung des anti-P-Selectin-IgG gab als vom nicht-immun-IgG (p < 0,025, 18A), was nahe legt, dass P-Selectin im Gehirn innerhalb von 30 Minuten der Reperfusion exprimiert wird).
Neutrophilen-Akkumulierung im murinen Schlaganfall: Um den Zeitverlauf zu beschreiben, in dem das PMN-Einströmen nach dem Schlaganfall erfolgt, wurden die ¹¹¹In-markierte PMN-Akkumulierung in Wildtyp (PS +/+) Mäusen vor dem MCAO, unmittelbar nach und 10 Minuten nach dem MCAO und nach 30 min, 300 min und 22 h der Reperfusion gemessen. In PS +/+ Mäusen beginnt die Akkumulierung der PMNs früh nach dem Iniziieren der fokalen Ischämie und setzt sich durch die Periode der Reperfusion fort (18B). Um die Rolle von P-Selectin in dieser postischämischen Neutrophilen-Akkumulierung zu etablieren, wurden Experimente unter Verwendung von Mäusen durchgeführt, die homozygot-Null für das P-Selectin-Gen (PS -/-) waren. PS -/- Mäuse zeigten eine signifikant reduzierte PMN-Akkumulierung nach dem mittleren cerebralen Arterienverschluss und der Reperfusion (18B).
Die Rolle von PS im cerebrovaskulären Nicht-Rückfluss: Um zu bestimmen, ob die Reduktion in der PMN-Akkumulierung in PS -/- Mäusen in einem verbesserten cerebralen Blutfluss nach der Re-Etablierung des Flusses resultierte, wurden Reihenmessungen des relativen CBF durch Laser-Doppler in sowohl PS +/+ als auch PS -/- Mäusen erhalten. Vor dem Beginn der Ischämie (19, Punkt a) waren die relativen cerebralen Blutflüsse beinahe identisch zwischen den Gruppen. Der mittlere cerebrale Arterienverschluss (19, Punkt b) war mit einem beinahe identischen Abfall im cerebralen Blutfluss in beiden Gruppen assoziiert. Unmittelbar vor dem Entfernen der intraluminalen verschließenden Naht nach 45 Minuten der Ischämie (19, Punkt c) waren die cerebralen Blutflüsse leicht angestiegen, obwohl sie im Vergleich zu den Grundlinien-Flüssen signifikant niedrig blieben. Unmittelbar nach dem Entfernen der verschließenden Naht, um die Reperfusion zu iniziieren (19, Punkt d), stiegen die cerebralen Blutflüsse in beiden Gruppen auf einen vergleichbaren Wert (≈60% der Grundlinie in den PS -/- und PS +/+ Mäusen). Das unmittelbare Versagen der cerebralen Blutflüsse nach der Reperfusion, die Spiegel vor dem Verschluss zu erreichen, ist charakteristisch für den cerebrovaskulären Nicht-Rückfluss²², wobei der folgende Abfall in den cerebralen Blutflüssen nach der Reperfusion eine verzögerte postischämische cerebrale Hypoperfusion repräsentiert ²³. Nach 30 Minuten der Reperfusion (19, Punkt e) waren die cerebralen Blutflüsse zwischen den zwei Gruppen von Tieren auseinander gelaufen, wobei die PS -/- Tiere signifikant größere relative cerebrale Blutflüsse zeigten als die PS +/+ Kontrollen (p < 0,05). (19, Punkt f). Dieses Auseinanderweichen reflektierte signifikante Unterschiede in der verzögerten postischämischen cerebralen Hypoperfusion und hielt für den 22 Stunden-Beobachtungszeitraum an.
Da berichtet worden ist, dass Variationen in der cerebrovaskulären Anatomie in Unterschieden in der Empfindlichkeit gegenüber einem experimentellen Schlaganfall in Mäusen resultieren²⁴, wurde eine Tusche/Kohlenschwarz-Färbung durchgeführt, um das vaskuläre Muster des Circulus arteriosus cerebri sowohl in PS -/- als auch PS +/+ Mäusen zu visualisieren. Diese Experimente zeigten, dass es keine groben anatomischen Unterschiede im vaskulären Muster des cerebralen Kreislaufs gab (20).
Schlaganfallergebnis: Die funktionelle Signifikanz der P-Selectin-Expression wurde durch Vergleichen der Anzeichen des Schlaganfallergebnisses in PS -/- Mäusen mit jenen in PS +/+ Kontrollen getestet. PS -/- Mäusen waren vor den Wirkungen der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion basierend auf einer 77% Reduktion im Infarktvolumen (p < 0,01) im Vergleich zu den P-Selectin +/+ Kontrollen signifikant geschützt (21A). Diese Reduktion im Infarktvolumen wurde von einem Trend zu einem reduzierten neurologischen Ausfall (p = 0,06, 21B) und einem erhöhten Überleben (p < 0,05; 21C) in den PS -/- Tieren begleitet.
Auswirkung einer P-Selectin-Blockade: Nachdem die funktionelle Rolle der P-Selectin-Expression im Schlaganfall unter Verwendung von deletionsmutanten Mäusen beobachtet worden ist, wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine pathophysiologisch Blockade von P-Selectin das Schlaganfallergebnis in PS +/+ Mäusen verbessern könnte. Unter Verwendung einer Strategie des Verabreichens eines monoclonalen blockierenden Ratte-anti-Maus-P-Selectin-Antikörpers Clon RB 40.34,^14,19,20 )oder eines nicht-immun-Kontrollratten-IgGs unmittelbar vor der Operation wurde beobachtet, dass Mäuse, die den blockierenden Antikörper erhielten, nach 30 Minuten verbesserte cerebrale Blutflüsse nach der Reperfusion (22A) sowie reduzierte neurologische Ausfälle (22B), reduzierte cerebrale Infarktvolumen (22C) und einen Trend in Richtung reduzierter Mortalität im Vergleich zu den Kontrollen (22D) aufweisen.
DISKUSSION
Trotz eines wesentlichen Fortschritts in den letzten Jahren in der primären Verhinderung des Schlaganfalls¹ bleiben die therapeutischen Optionen, einen entstehenden Schlaganfall zu behandeln, äußerst limitiert⁶. Obwohl von der Veröffentlichung von zwei Grundsatz-Versuchen im letzten Herbst, die eine reduzierte Morbidität nach der Behandlung eines ischämischen Schlaganfalls mit rt-PA gezeigt haben^2,3 angenommen wurde, dass sie eine neue Ära der thrombolytischen Therapie in der Behandlung des Schlaganfalls einleitet⁴, ist der Enthusiasmus durch die hämorrhagische Transformierung und eine erhöhte Mortalität, die in Patienten mit einem ischämischen Schlaganfall, die mit Streptokinase behandelt wurden, bemerkt wurden⁵, etwas gemäßigt worden. Diese divergierenden Versuche machen es kritischer als je zuvor, dass neue, sichere Therapien entwickelt werden, um einen entstehenden Schlaganfall zu behandeln. Obwohl die Wiederherstellung des Blutflusses zum postischämischen Gehirn neue Möglichkeiten für eine frühe therapeutischen Intervention gestattet, ist die Reperfusion ein doppelschneidiges Schwert. Angesichts des cytotoxischen Potenzials der Neutrophilen²⁵ ist es nicht überraschend, dass der Neutrophilen-Einstrom in das postischämische Gehirngewebe zu einer weiteren Schädigung und einem verschlechterten Ergebnis nach einem experimentellen Schlaganfall führen kann^7,26-29. Unter Verwendung eines murinen Modells der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion wurde vor kurzem eine wichtige beitragende Rolle für das Zelladhäsionsmolekül ICAM-1 in der Neutrophilen-Akkumulierung 22 Stunden nach dem Schlaganfall identifiziert⁷. Eine vermehrte cerebrovaskuläre endotheliale ICAM-1-Expression erfordert jedoch transkriptionelle und translationelle de novo-Ereignisse, was Zeit benötigt. Im Gegensatz dazu kann P-Selectin, ein Membranumspannendes Glycoprotein, das die frühsten Phasen der Neutrophilen-Adhäsion vermittelt, aus vorgebildeten Speicher-Pools mobilisiert werden, um schnell auf der ischämischen endothelialen Zelloberfläche exprimiert zu werden^8,30. Da die klinischen Versuche einer thrombolytischen Therapie für den Schlaganfall ein enges Zeitfenster für einen potenziellen Vorteil (innerhalb der ersten paar Stunden des Schlaganfallbeginns) zeigen^2,3,5, legt dies nahe, dass Strategien, die gestaltet sind, um mit den frühesten Phasen der PMN-Adhäsion zu interferieren, von theoretischem Vorteil im menschlichen Schlaganfall sein könnten. Diese Versuche sollten in größeren Zahlen von Patienten resultieren, die für eine frühere therapeutischen Intervention präsentiert werden, was den Bedarf erhöht, das Thema der Reperfusionsverletzung in medizinisch revaskularisierten Gebieten zu behandeln. Zusätzlich unterstreichen diese Versuche den dringenden Bedarf, die Beiträge von individuellen Adhäsionsmolekülen an der Pathogenese des Schlaganfalls zu verstehen.
Angesichts der beträchtlichen Masse an Literatur, die die Rolle von P-Selectin in anderen Modellen der Ischämie und Reperfusion beschreibt^8,31-34, ist überraschend wenig über die Rolle von P-Selectin im Schlaganfall bekannt. Die Kenntnis der spezifischen Rolle von P-Selectin in den cerebralen Gefäßen ist wichtig, da Adhäsionsmolekül-Anforderungen zwischen den vaskulären Betten und den Zuständen, die untersucht werden, variieren. Zum Beispiel reduzierten in einem Modell der intestinalen Transplantation³⁵ anti-P-Selectin-Antikörper nicht die Reperfusionsverletzung, wohingegen anti-CD11/CD18-Antikörper dies taten. Obwohl eine P-Selectin-Blockade unwirksam im Reduzieren der PMN-Adhäsion und des Albumin-Ausströmens in einem mesenteralen Ischämie- und Reperfusions-Rattenmodell war, war eine ICAM-1-Blockade wirksam³⁶. In einem Hinterextremitäts-Ischämie/Reperfusions-Rattenmodell unterschieden sich die Selectin-Anforderungen für eine PMN-Adhäsion zwischen den pulmonalen und Beinmuskel-Gefäßbetten³³.
Die einzige veröffentlichte Untersuchung, die sich mit P-Selectin im ischämischen Gehirn beschäftigt, ist eine histopathologische Beschreibung des Primaten-Schlaganfalls, in dem die P-Selectin-Expression in den lenticulostriaten Mikrogefäßen erhöht war¹⁰. Darüber hinaus gibt es keine Daten, die die funktionelle Signifikanz dieser P-Selectin-Expression behandeln. Die gegenwärtigen Untersuchungen wurden unternommen, um zu untersuchen, ob die P-Selectin-Expression zu der postischämischen cerebralen Neutrophilen-Akkumulierung, dem Nicht-Rückfluss und der Gewebeschädigung in einem murinen Modell des reperfundierten Schlaganfalls beiträgt. Unter Verwendung eines kürzlich etablierten Modells der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion in Mäusen¹¹ wurde die P-Selectin-Expression durch eine erhöhte Ablagerung eines radioaktiv markierten Antikörpers in das ischämische Gebiet gezeigt. In dieser Technik wurde die Antikörper-Ablagerung in die ischämische Hemisphäre zu jener in der nicht-ischämischen Hemisphäre in jedem Tier normalisiert, nicht nur um potenzielle Variationen im Injektionsvolumen oder im Volumen der Verteilung zu minimieren, sondern um einen Vergleich zwischen Tieren, denen verschiedene Antikörper gegeben wurden, zu ermöglichen. Weil die Zerstörung der endothelialen Abgrenzungsfunktion im ischämischen Cortex eine nichtselektive Antikörper-Ablagerung steigern kann, wurden ähnliche Experimente mit einem Kontroll-Ratten-IgG durchgeführt. Diese Daten zeigen, dass der Antikörper, der an P-Selectin bindet, in einer verstärkten Rate im Vergleich zum Kontroll-Antikörper abgelagert wird, was nahe legt, dass eine lokale P-Selectin-Expression im reperfundierten Gewebe erhöht ist. Diese Daten im murinen Modell laufen parallel zu jenen, die in einem Pavian-Modell des Schlaganfalls berichtet wurden¹⁰, in dem die P-Selectin-Expression innerhalb von 1 Stunde nach dem ischämischen Ereignis erhöht war.
Die Rolle der P-Selectin-Expression in den zu der postischämischen Zone rekrutierten PMNs wurde unter Verwendung einer Strategie gezeigt, in der die Akkumulierung von ¹¹¹In-markierten PMNs gemessen wurde. Obwohl es früher berichtet wurde, dass nach 22 Stunden die PMN-Akkumulierung in der ischämischen Hemisphäre erhöht ist⁷, zeigen die gegenwärtigen Zeitverlaufs-Daten, dass die PMN-Akkumulierung kurz nach dem Beginn der Ischämie beginnt. Ein Versagen, das P-Selectin-Gen zu exprimieren, war mit einer reduzierten PMN-Akkumulierung assoziiert, was die Teilnahme von P-Selectin in der postischämischen cerebralen PMN-Rekrutierung nahe legt. Die P-Selectin-Null-Tiere zeigten jedoch eine gemäßigte (wenngleich weniger als die Kontrolle) Neutrophilen-Akkumulierung nach 22 Stunden. Diese Daten weisen darauf hin, dass P-Selectin nicht der ausschließliche Auslösungsmechanismus ist, der für die postischämische cerebrale PMN-Rekrutierung verantwortlich ist, und sind konsistent mit den früheren Daten, dass ICAM-1 auch an der postischämischen PMN-Adhäsion teilnimmt⁷. Darüber hinaus sind diese Daten nicht ungleich zu jenen, in denen eine intraabdominale Einflößung von Thioglycollat in P-Selectin-defizienten Mäusen eine verzögerte (aber nicht fehlende) PMN-Rekrutierung verursachte⁹.
Aufgrund des kritischen Bedarfs, die Ursachen für eine verfehlte Reperfusion zu identifizieren, untersuchten die gegenwärtigen Untersuchungen die Rolle von P-Selectin in der verzögerten postischämischen cerebralen Hypoperfusion^22,23, dem Phänomen, in dem der Blutfluss während der Reperfusion trotz der Wiederherstellung von adäquaten Perfusions-Drucken absinkt. In Herzmodellen der Ischämie verschlechtert sich der Nicht-Rückfluss wenn die Zeit nach der Reperfusion vergeht³⁷, was eine wichtige Rolle für rekrutierte Auslösemechanismen wie progressive mikrozirkulierende Thrombose, vasomotorische Dysfunktion und PMN-Rekrutierung nahe legt. In anderen Modellen ist gezeigt worden, dass sowohl P-Selectin- und ICAM-1-abhängige Anhaftungsreaktionen³⁸ als auch kapilläre PMN-Verstopfung³⁹ am postischämischen Nicht-Rückfluss teilnehmen. Im Gehirn sind PMNs mit dem postischämischen cerebralen Nicht-Rückfluss in Zusammenhang gebracht worden^40,41, aber die Rolle von P-Selectin in diesem Vorgang ist nicht erläutert worden. Die gegenwärtige Untersuchung verwendet eine relativ nicht-invasive Technik (Laser-Doppler), um Reihenmessungen des relativen cerebralen Blutflusses zu erhalten, um die Existenz, den Zeitverlauf und die P-Selectin-Abhängigkeit des postischämischen cerebrovaskulären Nicht-Rückflusses zu etablieren. In diesen Experimenten wurden P-Selectin-Null- und Kontrolltiere nahezu identischen Graden der Ischämie ausgesetzt, und die sofortige Erholung des Blutflusses nach dem Entfernen der intraluminalen verschließenden Naht war dieselbe in den zwei Gruppen. Der cerebrale Blutfluss sank jedoch im Zeitraum nach der Reperfusion in P-Selectin +/+ Tieren. Im starken Gegensatz dazu zeigten die PS -/- Tiere nur eine leicht verzögerte postischämische cerebrale Hypoperfusion. Dieses späte (wenngleich limitierte) Absinken im cerebralen Blutfluss nach 22 Stunden ist konsistent mit der gemäßigten PMN-Rekrutierung, die in den PS -/- Tieren über denselben Zeitraum beobachtet wurde. Dies legt wieder nahe, dass andere Auslösemechanismen (wie ICAM-1) für das späte Absinken im cerebralen Blutfluss in PS -/- Tieren verantwortlich sein können.
Die funktionellen Auswirkungen der P-Selectin-Expression werden aus der gegenwärtigen Gruppe von Untersuchungen klar: Tiere, die das P-Selectin-Gen nicht exprimieren können (oder PS +/+ Tiere, die mit einem funktionell-blockierenden anti-P-Selectin-Antikörper behandelt wurden), zeigen kleinere Infarkte, ein verbessertes Überleben, und die Überlebenden zeigen verbesserte neurologische Ergebnisse im Vergleich zu den Kontrollen. Wenn diese Daten zusammen mit früher veröffentlichten Daten, die eine schädliche Rolle der ICAM-1-Expression im Schlaganfall zeigen⁷, überlegt werden, wird es zunehmend offensichtlich, dass es mehrere Mittel zum Rekrutieren von PMNs in den postischämischen cerebralen Cortex gibt und dass eine Blockade von jedem eine potenzielle Strategie darstellt, um das Schlaganfallergebnis in Menschen zu verbessern. Angesichts der derzeitigen Anerkennung der Wichtigkeit einer zeitgerechten Reperfusion im Anhalten der voranschreitenden Wellenfront des neuronalen Tods nach einem Schlaganfall erscheint das Interferieren mit der PMN-Adhäsion zu ihren frühesten Stadien eine attraktive Möglichkeit zum Reduzieren der Morbidität und Mortalität zu sein. Tatsächlich können anti-Adhäsionsmolekül-Strategien nicht nur selber günstig sein (d.h. einschließlich von Patienten, die nicht für eine Thrombolyse tauglich sind), sondern können den Spielraum für eine thrombolytische Intervention ausdehnen⁴². Die gegenwärtige Gruppe von Untersuchungen trägt zum Verstehen der pathophysiologischen Mechanismen bei, die im reperfundierten Schlaganfall wirksam sind. Diese Untersuchungen legen den Bedarf von klinischen Versuchen von Therapien für einen entstehenden Schlaganfall nahe, die das Reperfusionsmilieu optimieren, um eine PMN-Akkumulierung zu reduzieren.
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BEISPIEL 5: Homozygote P-Selectin-Null-Mäuse sind resistent gegen eine fokale cerebrale Ischämie und Reperfusionsverletzung
Die Rolle von Neutrophilen (PMNs) im Potenzieren einer fokalen Ischämie-Reperfusions-Verletzung im zentralen Nervensystem bleibt widersprüchlich. Ein wichtiger früher Schritt im Auffangen von zirkulierenden PMNs durch die Gefäße wird durch P-Selectin vermittelt, das auf dem postischämischen Endothel exprimiert wird. Obwohl eine frühe und andauernde endotheliale P-Selectin-Expression in den Gehirn-Mikrogefäßen nach einem mittleren cerebralen Arterienverschluss in Pavianen beschrieben worden ist, sind die Folgen einer endothelialen P-Selectin-Expression im Schlaganfall nicht bestimmt worden. Um die Rolle von P-Selectin im Schlaganfall zu definieren, wurde ein murines Modell einer fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion, bestehend aus einem intraluminalen mittleren cerebralen Arterien (MCA)-Verschluss für 45 Minuten, gefolgt von 22 Stunden einer Reperfusion, in zwei Gruppen von Mäusen verwendet; transgene Mäuse, die homozygot Null für P-Selectin waren (PS -/-), und Wildtyp-Cousin-Kontrollen (PS +/+). Die cerebralen Infarktvolumen wurden aus planimetrierten Reihenschnitten, die mit Triphenyltetrazoliumchlorid gefärbt wurden, berechnet und als der Prozentsatz des Infarktgewebes in der ipsilateralen Hemisphäre ausgedrückt. Das neurologische Ergebnis basierte auf dem Tierverhalten, das durch einen unabhängigen Forscher beobachtet wurde (1: kein Ausfall; 2: Kreisen; 3: Drehen; 4: immobil). Der ipsilaterale corticale cerebrale Blutfluss (CBF) wurde durch Laser-Doppler-Flussmessung bestimmt und als Prozent des kontralateralen corticalen CBF ausgedrückt. PS -/- Mäuse zeigten eine 3,8-fache Reduktion in den Infarktvolumen im Vergleich zu PS +/+ Kontrollen (7,6 ± 4,4% gegenüber 29,2 ± 10,1%, p<0,05). Diese Reduktion in den Infarktvolumen in Mäusen, denen P-Selectin fehlt, wurde durch ein verbessertes Überleben (87% gegenüber 42%, p<0,05) und einen Trend in Richtung eines reduzierten neurologischen Ausfalls (1,9 ± 0,4 gegenüber 2,5 ± 0,3, p = NS) in den Überlebenden widergespiegelt. Da es eine Tendenz zu einem erhöhten cerebralen Blutfluss nach einer cerebralen Ischämie und Reperfusion in der PS -/- Gruppe gab (65 ± 11% gegenüber 46 ± 18% für Kontrollen, p = NS), legen diese Untersuchungen nahe, dass eine P-Selectin-abhängige Adhäsion zum cerebralen Nicht-Rückfluss beitragen kann. Zusammengefasst implizieren diese Daten eine wichtige Rolle der P- Selectin-Expression in der Pathophysiologie des Schlaganfalls und legen neue pharmakologische Strategien nahe, um das Schlaganfallergebnis zu verbessern.
BEISPIEL 6: Das Fehlen des P-Selectin-Gens reduziert die postischämische cerebrale Neutrophilen-Akkumulierung, den Nicht-Rückfluss und die Gewebeverletzung in einem murinen Modell des reperfundierten Schlaganfalls
Neue Untersuchungen in Menschen weisen darauf hin, dass die Re-Etablierung des cerebralen Blutflusses (CBF) während der frühen Periode nach dem Beginn des Schlaganfalls die neurologische Folgekrankheit reduziert. Die Hypothese wurde aufgestellt, dass P-Selectin (PS), ein früh wirkendes Neutrophilen (PMN)-Adhäsionsmolekül, das durch hypoxisches Endothel exprimiert wird, eine wichtige pathophysiologische Rolle im entstehenden, reperfundierten Schlaganfall haben kann. Vorläufige Untersuchungen wurden in einem murinen Modell der transitorischen fokalen cerebralen Ischämie durchgeführt, bestehend aus einem intraluminalen mittleren cerebralen Arterienverschluss für 45 Minuten, gefolgt von 22 Stunden der Reperfusion. In diesem Modell haben Mäuse, die nicht das PS-Gen exprimieren (PS -/-), kleinere Infarktvolumen, reduzierte neurologische Ausfallswerte und ein verbessertes Überleben im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen (PS +/+). Die gegenwärtigen Untersuchungen wurden durchgeführt, um (einen) PS-induzierte(n) Mechanismus/Mechanismen der cerebralen Verletzung weiter zu definieren. PS +/+ Mäuse (n = 6), denen vor der Operation ein ¹²⁵I-markiertes anti-PS-IgG gegeben wurde, zeigten nach 30 min der Reperfusion eine 216% größere Akkumulierung des Antikörpers in der ipsilateralen Hemisphäre im Vergleich zu den Schein-behandelten Tieren (n = 6, p < 0,001) oder zu Tieren, denen nicht-immunes IgG gegeben wurde und die einer transitorischen fokalen cerebralen Ischämie und 30 min der Reperfusion ausgesetzt wurden (n = 4, p < 0,03). In PS +/+ Mäusen beginnt die Akkumulierung von PMNs früh nach dem Iniziieren der fokalen Ischämie und setzt sich durch die Periode der Reperfusion fort (2-facher Anstieg in der ipsilateralen/kontralateralen ¹¹¹In-PMN-Akkumulierung nach 22 Stunden, n = 8, p < 0,05). PS -/- Mäuse zeigten nach 22 Stunden eine 25% Reduktion in der PMN-Akkumulierung in die ipsilaterale Hemisphäre (n = 7, p < 0,05). Die Wirkung der PS-Expression auf den postischämischen cerebralen Nicht-Rückfluss wurde durch serienmäßiges Messen des ipsilateralen CBF während der Schlaganfallentstehung untersucht. Obwohl die Grundlinien-, nach dem Verschluss- und die anfänglichen Reperfusions-CBFs identisch waren, waren die CBFs nach 30 Minuten der Reperfusion signifikant größer in PS -/- Mäusen (n = 5) im Vergleich zu den PS +/+ Mäusen (n = 8, 2,4-fach größer, p < 0,05). Dieser Unterschied wurde während des Rests der 22 h-Reperfusionsperiode aufrechterhalten. Diese Daten unterstützen eine wichtige frühe Rolle von PS in der PMN-Rekrutierung, dem postischämischen Nicht-Rückfluss und der Gewebeschädigung im entstehenden Schlaganfall. Dies ist die erste Darlegung einer pathophysiologischen Rolle von PS in der cerebralen Reperfusionsverletzung, die nahe legt, dass eine PS-Blockade ein therapeutischen Ziel für die Behandlung des reperfundierten Schlaganfalls repräsentieren kann.
BEISPIEL 7: Kohlenmonoxid und ein entstehender Schlaganfall.
Kohlenmonoxid-Gas, ein toxisches Nebenprodukt des Häm-Katabolismus, ist in die Langzeit-Potenzierung und das Gedächtnis im zentralen Nervensystem involviert. Andere physiologische Rollen der CO-Produktion im Gehirn sind jedoch unbekannt. Da die Häm-Oxigenase während entzündlichen Zuständen induziert wird, wurde untersucht, ob eine endogene CO-Produktion eine cerebral-schützende Rolle im Schlaganfall verleihen kann. In einem murinen Modell der fokalen cerebralen Ischämie wurde Häm-Oxigenase-Typ I auf den mRNA- (durch Northern Blot) und Proteinbereichen (durch Western Blot) induziert, durch in situ-Hybridisierung und Immunhistochemie am cerebralen vaskulären Endothel in der ischämischen Hemisphäre lokalisiert. Eine lokale Produktion von CO durch direkte Messung wurde in der ischämischen Zone beobachtet. In Parallelexperimenten zeigten murine Gehirn-Endothelzellen, die einer hypoxischen Umgebung ausgesetzt waren, eine ähnliche Induktion von Häm-Oxigenase-mRNA, -Protein und der CO-Erzeugung. Um zu bestimmen, ob die CO-Produktion zufällig zur Pathophysiologie des Schlaganfalls erfolgte, wurde die CO-Produktion durch Zinn-Protoporphyrin-Verabreichung blockiert (bestätigt durch direkte Messung von reduzierten lokalen CO-Spiegeln). Diese Tiere zeigten signifikant größere Infarktvolumen, schlechtere neurologische Ergebnisse und eine erhöhte Mortalität im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Darüber hinaus verlieh die Verabreichung von CO vor dem Schlaganfall einen signifikanten cerebralen Schutz. Da dieser Schutz nicht in Tieren beobachtet wurde, die mit Biliverdin, dem zufälligen Nebenprodukt des Häm-Katabolismus, behandelt wurden, legen diese Daten nahe, dass die endogene CO-Produktion per se eine schützende Rolle im entstehenden Schlaganfall hat.
Einleitung
Es gibt eine beträchtliche Masse an Literatur und eine allgemeine Anerkennung der toxischen Wirkungen von exogenem Kohlenmonoxid (CO), das eifrig and Häm-Zentren bindet, was den Sauerstoff-Transport inhibiert und die zelluläre Atmung vergiftet. Für viele Jahre wurde CO als ein zufälliges Nebenprodukt des Häm-Katabolismus angesehen, aber neue Daten im Gehirn legen nahe, dass CO, das durch Häm-Oxigenase II in abgesonderten Neuronen produziert wird, eine Langzeit-Potenzierung modulieren kann. In Ratten ist das Aussetzen gegenüber einem Hitzeschock mit der Expression eines 32 kDa-Hitzeschock-Proteins (Häm-Oxigenase I) in einigen Organen, einschließlich des Gehirns, korreliert worden. Die physiologische Signifikanz dieser HSP32-Induktion ist teleologisch der stoichiometrischen Freisetzung von CO durch die Häm-Oxigenase I (HOI) zugeschrieben worden. In den meisten experimentellen Untersuchungen dient die HOI-Induktion nur als ein zufälliger Marker des zellulären Oxidationsmittel-Stresses. Die kürzliche Identifizierung einer anti-inflammatorischen Rolle von HOI in einem Modell der peritonealen Entzündung ist der Produktion des natürlichen Antioxidans Biliverdin während des Vorgangs des Häm-Katabolismus zugeschrieben worden.
Die gegenwärtige Untersuchung berichtet zum ersten Mal, dass das postischämische Gehirn enorme Mengen an CO herstellt. Unter Verwendung eines murinen Modells der fokalen cerebralen Ischämie, in dem die mittlere cerebrale Arterie durch eine intraluminale Naht verschlossen wird, wurde die HOI-Produktion in der ischämischen Hemisphäre im Vergleich zu der nicht-ischämischen Hemisphäre signifikant erhöht. Da die Immunhistochemie und in situ-Hybridisierung die Quelle der HOI bei endothelialen Zellen innerhalb der ischämischen Hemisphäre lokalisierte, wurde ein in vitro-Modell der zellulären Hypoxie verwendet, um die Induktion von HOI-Botschaft, -Protein und -Aktivität in murinen cerebralen endothelialen Mikrogefäß-Zellen zu bestätigen. Eine Blockade der CO-Produktion unter Verwendung von Zinn- oder Zink-Protoporphyrin IX war mit einem Anstieg im cerebralen Infarktvolumen und der Mortalität assoziiert, wohingegen das Aussetzen der Tiere gegenüber CO unmittelbar vor der Ischämie einen signifikanten dosisabhängigen cerebralen Schutz innerhalb eines engen therapeutischen Fensters verlieh. Die Biliverdin-Verabreichung war in diesem Modell ohne Wirkung. Zusammengefasst weisen diese Daten darauf hin, dass ischämisches Gehirngewebe große Mengen von CO produziert, wobei dessen Produktion einen cerebralen Schutz verleiht, der die Menge des Gewebes limitiert, das während des Schlaganfalls zerstört wird.
Verfahren
Protoporphyrin-Herstellung und -Verabreichung. Zinn-Protoporphyrin IX-Dichlorid (20 mg, Porphyrin Products, Logan, UT), Zink-Protoporphyrin IX (17 mg, Porphyrin Products, Logan, UT) oder Biliverdin (18 mg, Porphyrin Products, Logan, UT) wurde anfänglich in Dimethylsulfoxid (2 mL) gelöst. Ein Aliquot dieser Lösung (200 μL) wurde zu normaler Kochsalzlösung (9,8 mL) zugefügt, und dieses Gemisch wurde stark gevortext, um eine 2,7 × 10^-4 M-Lösung des Protoporphyrins zu ergeben. Der Lösungsbehälter wurde in Alufolie gewickelt, um eine Photolyse des Protoporphyrins zu verhindern, und bei 4°C gelagert, bis es verwendet wurde.
Mikro-osmotische Pumpen (#1003D, Alza Corp., Palo Alto, CA) wurden mit dieser Protoporphyrin-Lösung (91 μL/Pumpe) geladen und 24 Stunden vor dem Beginn der Operation subcutan über einen 1 cm-Schnitt in der dorsalen Mittellinie in die anästhesierte Maus implantiert. Diese Pumpen verabreichen die Arzneistofflösung in einer Rate von 0,95 ± 0,02 μL/h. Zum Zeitpunkt der Operation wurde vor dem Inserieren des intraluminalen verschließenden Katheters eine zusätzliche Dosis der Protoporphyrin-Lösung verabreicht (0,3 mL, i.v.). Jedes Tier erhielt die folgenden Gesamt (Injektion + Pumpe)-Arzneistoffmengen über den Verlauf der Untersuchung: Zinn-Protoporphyrin (0,070 mg), Zink-Protoporphyrin (0,059 mg) oder Biliverdin (0,061 mg).
BEISPIEL 8:
Hypoxie- oder durch freie Radikale induzierte P-Selectin (PS)-Translozierung zu der endothelialen Zell (EC)-Oberfläche, wo es an der Neutrophilen (PMN)-Adhäsion während der Reperfusion teilnimmt. Um einen Mechanismus zu untersuchen, durch den Nitrovasodilatoren eine postischämische Leukosequestrierung abschwächen können, testeten wir, ob das Stimulieren des NO/cGMP-Signalwegs die Oberflächen-PS-Expression in hypoxischen menschlichen Nabelvenen-ECs abschwächen könnte. ECs, die einer Hypoxie (pO2 < 20 Torr für 4 Stunden) ausgesetzt waren, zeigten einen 50% Anstieg in der vWF-Freisetzung (p < 0,005) (vWF ist mit PS verpackt), was parallel zu einem 80% Anstieg in der Oberflächen-PS-Expression lief (p < 0,0001), gemessen durch die spezifische Bindung eines radioaktiv markierten anti-PS-Antikörpers. Unter ähnlichen Bedingungen verursachte die Zugabe des NO-Donors 3-Morpholinosydnonimin (SIN-1, 0,1 mM) oder des cGMP-Analogs 8-Brom-cGMP (cGMP, 10 nM) eine Reduzierung in der vWF-Freisetzung; Kontroll-vWF, 11 ± 0,4 mE/mL; SIN-1, 9,1 ± 0,3 mE/mL; cGMP, 9,7 ± 0,2 mE/mL; p < 0,005 sowohl für SIN-1 als auch cGMP gegenüber der Kontrolle. Im Vergleich mit den Kontrollen reduzierten SIN-1 oder cGMP auch die Oberflächen-PS-Expression (40% beziehungsweise 48% Absinken, p<0,005 für beide). Unter Verwendung eines Immunfluoreszenz-Adhärenz-Tests reduzierten sowohl SIN-1 als auch cGMP die HL60-Bindung an hypoxische HUVECs (53% und 86% Absinken gegenüber den Kontrollen, p < 0,05 für beide). Die Messung der Fura-2-Fluoreszenz zeigte, dass die Hypoxie die intrazelluläre Calciumkonzentration [Cal] erhöhte und dass erhöhtes [Cai] durch cGMP blockiert werden konnte. Weder SIN-1 noch cGMP konnten die PS-Expression weiter reduzieren, wenn die ECs in ein calciumfreies Medium platziert wurden. Diese Daten legen nahe, dass die Stimulierung des NO/cGMP-Signalwegs die PS-Expression durch Inhibieren des Calcium-Einstroms in ECs inhibiert, und diese Inhibition als einen wichtigen Mechanismus identifiziert, durch den Nitro-Vasodilatoren die PMN-Bindung in postischämischen Geweben erniedrigen können.
BEISPIEL 9: Faktor IXai
Faktor IX ist ein Gerinnungsfaktor, der in Menschen und anderen Säugern existiert, und ist ein wichtiger Teil des Gerinnungs-Signalwegs. Im normalen Schema der Gerinnung wird der Faktor IX durch entweder Faktor IXa oder einen Gewebefaktor/VIIa-Komplex zu seiner aktivierten Form, Faktor IXa, aktiviert. Faktor IXa kann dann Faktor X aktivieren, der den Endteil der Gerinnungskaskade auslöst, was zur Thrombose führt. Da der Faktor X durch einen der zwei Signalwege, entweder die extrinsischen (durch VIIa/Gewebefaktor) oder die intrinsischen Signalwege (über Faktor IXa), aktiviert werden kann, stellten wir die Hypothese auf, dass der inhibierenden Faktor IXa zu einer Beeinträchtigung von manchen Formen der Hämostase führen, aber die Hämostase als Antwort auf eine Gewebeschädigung intakt lassen könnte. In anderen Worten, er könnte zu einer Blockade von manchen Typen der Gerinnung führen, aber müsste nicht zu einer überschüssigen oder unerwünschten Blutung führen. Faktor IXai ist Faktor IX, der chemisch modifiziert worden ist, so dass er noch dem Faktor IXa gleicht (und daher mit dem natürlichen Faktor IXa konkurrieren kann), aber dem seine Aktivität fehlt. Dies kann eine kompetitive Inhibition des normalen Faktors IXa-abhängigen Signalwegs der Gerinnung „überwältigen" oder bewirken. Da der Faktor IXa an das Endothel und Blutplättchen und vielleicht andere Stellen bindet, kann das Blockieren der Aktivität von Faktor IXa auch durch das Verabreichen von Mitteln möglich sein, die mit der Bindung des Faktors IXa interferieren (oder durch Interferieren mit der Aktivierung von Faktor IX).
Beim Schlaganfall und anderen ischämischen Störungen kann es einen klinischen Vorteil geben, der durch Lysieren eines existierenden Thrombus abgeleitet ist, aber es gibt auch die potenziell verheerende Komplikation der Blutung. In den gegenwärtigen Experimenten wurde das Maus-Modell der cerebralen Ischämie und Reperfusion (Schlaganfall) verwendet. Die Mäuse erhielten kurz vor der Operation einen intravenösen Bolus von 300 μg/kg Faktor IXai. Die Schlaganfälle wurden durch intraluminalen Verschluss der rechten mittleren cerebralen Arterie erzeugt. Wenn die Schlaganfallergebnisse 24 Stunden später gemessen wurden, hatten die Tiere, die den Faktor IXai erhalten hatten, kleinere Infarktvolumen, eine verbesserte cerebrale Perfusion, weniger neurologische Ausfälle und eine reduzierte Mortalität im Vergleich zu den Kontrollen, die derselben Operation unterzogen wurden aber die den Faktor IXai nicht erhielten. Es wurde auch bemerkt, dass die Faktor IXai-Tiere frei von einer offensichtlichen intracerebralen Blutung waren. Im Gegensatz dazu wurde in den Kontrolltieren, die den Faktor IXai nicht erhielten, gelegentlich eine intracerebrale Blutung bemerkt.
Tabelle II.
Beispiel 10: Verschlimmerung der cerebralen Verletzung in Mäusen, die das P-Selectin-Gen exprimieren: Identifizierung der P-Selectin-Blockade als ein neues Ziel für die Behandlung des Schlaganfalls
Kurzfassung:
Gegenwärtig gibt es eine starke therapeutische Lücke für die Behandlung eines entstehenden Schlaganfalls. Obwohl P-Selectin durch hypoxische endotheliale Zellen in vitro schnell exprimiert wird, bleibt die funktionelle Signifikanz der P-Selectin-Expression im Schlaganfall unerforscht. Um die pathophysiologischen Folgen der P-Selectin-Expression zu identifizieren und um eine P-Selectin-Blockade als einen potenziellen neuen Ansatz für die Behandlung eines Schlaganfalls zu identifizieren, wurden Experimente unter Verwendung eines murinen Modells der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion durchgeführt. Eine frühe P-Selectin-Expression im postischämischen cerebralen Cortex wurde durch die spezifische Akkumulierung von radioaktiv markiertem anti-murines P-Selectin-IgG gezeigt, wobei durch Immunhistochemie die erhöhte P-Selectin-Expression in den ipsilateralen cerebralen endothelialen Mikrogefäß-Zellen lokalisiert wurde. In Experimenten, die gestaltet wurden, um die funktionelle Signifikanz einer erhöhten P-Selectin-Expression im Schlaganfall zu testen, wurde gezeigt, dass die Neutrophilen-Akkumulierung im ischämischen Cortex von Mäusen, die das P-Selectin-Gen exprimieren (PS +/+) signifikant größer war als jene in homozygoten P-Selectin-Null-Mäusen (PS -/-). Ein reduzierter Neutrophilen-Einstrom war von einem größeren postischämischen cerebralen Rückfluss (gemessen durch Laser-Doppler) in den PS -/- Mäusen begleitet. Zusätzlich zeigten PS -/- Mäuse kleinere Infarktvolumen (fünffache Reduktion, p < 0,05) und ein verbessertes Überleben im Vergleich zu PS +/+ Mäusen (88% gegenüber 44%, p < 0,05). Eine funktionelle Blockade von P-Selectin in PS +/+ Mäusen unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der gegen murines P-Selectin gerichtet ist, verbesserte auch den frühen Rückfluss und das Schlaganfallergebnis im Vergleich zu den Kontrollen, wobei reduzierte cerebrale Infarktvolumen bemerkt wurden, sogar wenn der blockierende Antikörper nach dem Verschluss der mittleren cerebralen Arterie verabreicht wurde. Diese Daten sind die ersten, die eine pathophysiologische Rolle von P-Selectin im Schlaganfall zeigen, und legen nahe, dass eine P-Selectin-Blockade ein neues therapeutisches Ziel für die Behandlung des Schlaganfalls darstellen kann.
EINLEITUNG:
Ein ischämischer Schlaganfall ist heute die dritthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten¹. Bis vor sehr kurzer Zeit hat es keine direkte Behandlung gegeben, um die cerebrale Gewebeschädigung in einem entstehenden Schlaganfall zu reduzieren. Obwohl die NINDS² und ECASS³
Schlaganfall-Untersuchungen nahe gelegt haben, dass es potenzielle therapeutische Vorteile einer frühen Reperfusion gibt⁴, unterstreicht die erhöhte Mortalität, die nach der Streptokinase-Behandlung eines akuten ischämischen Schlaganfalls beobachtet wird⁵, die ernüchternde Tatsache, dass es derzeit keine deutlich wirksame Behandlung für einen entstehenden Schlaganfall gibt. Diese Lücke im derzeitigen medizinischen Rüstzeug für die Behandlung des Schlaganfalls hat zu einer Reihe von neuen Ansätzen geführt⁶, jedoch haben außer rt-PA keine den klinischen Bereich erreicht. Um eine potenziell sichere und wirksame Behandlung für einen entstehenden Schlaganfall zu identifizieren, haben wird uns auf die schädliche Rolle von rekrutierten Neutrophilen konzentriert. Neue Arbeit in einem murinen Modell des reperfundierten Schlaganfalls hat gezeigt, dass das Ausschöpfen von Neutrophilen (PMNs) vor dem Schlaganfall die cerebrale Gewebeschädigung minimiert und das funktionelle Ergebnis verbessert⁷; Mäuse, denen das spezifische Zelladäsionsmolekül ICAM-1 fehlt, sind ähnlich geschützt⁷. P-Selectin, ein Molekül, das schnell aus vorgebildeten Speicherstellen zu der hypoxischen endothelialen Oberfläche transloziert werden kann, ist ein wichtiger früher Vermittler des Neutrophilen-Rollens⁹, das den ICAM-1-vermittelten Neutrophilen-Arrest ermöglicht. Obwohl P-Selectin im Primaten-Schlaganfall exprimiert wird¹⁰, bleibt die funktionelle Signifikanz der P-Selectin-Expression im Schlaganfall unbekannt.
Um die pathophysiologische Rolle von P-Selectin im Schlaganfall zu untersuchen, wendeten wir ein murines Modell der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion¹¹ unter Verwendung von sowohl Wildtyp-Mäusen als auch Mäusen, die homozygot Null für das P-Selectin-Gen waren⁹, und eine Strategie des Verabreichens eines funktionell blockierenden P-Selectin-Antikörpers an. In diesen Untersuchungen bestätigen wir nicht nur, dass die P-Selectin-Expression nach einem mittleren cerebralen Arterienverschluss mit einem reduzierten cerebralen Rückfluss nach der Reperfusion und einem schlechteren Ergebnis nach dem Schlaganfall assoziiert ist, sondern dass eine P-Selectin-Blockade einen signifikanten Grad eines postischämischen cerebralen Schutzes verleiht. Diese Untersuchungen repräsentieren das erste Aufzeigen der pathophysiologischen Rolle der P-Selectin-Expression im Schlaganfall und legen die aufregende Möglichkeit nahe, dass anti-P-Selectin-Strategien sich für die Behandlung eines reperfundierten Schlaganfalls als nützlich erweisen können.
VERFAHREN:
Mäuse: Die Experimente wurden mit transgenen P-Selectin-defizienten Mäusen durchgeführt, die, wie früher berichtet⁹, durch Gene-Targeting in embryonalen J1-Stammzellen, die in C57BL/6-Blastocysten injiziert, um eine Keimbahntransmission zu erhalten, und rückgekreuzt wurden, um homozygote P-Selectin-Null-Mäuse (PS -/-) zu erhalten, gebildet wurden. Die Experimente wurden mit PS -/- oder Wildtyp (PS +/+)-Cousin-Mäusen aus der dritten Generation von Rückkreuzungen mit C57BL/6J-Mäusen durchgeführt. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Experimente sieben bis zwölf Wochen alt und wogen zwischen 25-36 Gramm. Da berichtet worden ist, dass Variationen in der cerebrovaskulären Anatomie in Unterschieden in der Empfindlichkeit gegenüber einem experimentellen Schlaganfall in Mäusen resultieren¹², wurde eine Tusche/Kohlenschwarz-Färbung durchgeführt, um das vaskuläre Muster des Circulus arteriosus cerebri sowohl in PS -/- als auch PS +/+ Mäusen sichtbar zu machen. Diese Experimente zeigten, dass es keine groben anatomischen Unterschiede im vaskulären Muster der cerebralen Zirkulation gab.
Transitorischer mittlerer cerebraler Arterienverschluss: Die Mäuse wurden anästhesiert (0,3 ml 10 mg/ml Ketamin und 0,5 mg/ml Xylazin, i.p.) und in Rückenlage auf einer Rektaltemperatur-kontrollierten Operationsoberfläche (Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH) positioniert. Die innere Temperatur der Tiere wurde intraoperativ und für 90 Minuten nach der Operation bei 37 ± 1°C gehalten. Eine Nackeninzision in der Mittellinie wurde durchgeführt, um die rechte Carotishülle unter dem Operationsmikroskop (16-25X Vergrößerung, Zeiss, Thornwood, NY) freizulegen. Die gemeinsame Carotis-Arterie wurde mit einer 4-0 Seide isoliert, und die okzipitalen, pterygopalatinen und externen Carotis-Arterien wurden isoliert und getrennt. Der mittlere cerebrale Arterienverschluss (MCAO) wurde durch Vorführen einer 13 mm hitzeabgestumpften 5-0 Nylonnaht durch den externen Carotisstumpf erreicht. Nach dem Platzieren der verschließenden Naht wurde der externe Carotis-Arterienstumpf kauterisiert, und die Wunde wurde verschlossen. Nach 45 Minuten wurde die verschließende Naht entfernt, um die Reperfusion zu etablieren. Diese Vorgehensweisen sind früher im Detail beschrieben worden¹¹.
Messung des cerebralen corticalen Blutflusses: Transcraniale Messungen des cerebralen Blutflusses wurden unter Verwendung eines Laser-Dopplers (Perimed Inc., Piscataway, NJ), wie früher beschrieben¹³, durchgeführt. Unter Verwendung einer gerade 0,7 mm-Laser-Dopplersonde (Modell #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) und von früher veröffentlichen Charakteristika (2 mm posterior des Bregma, 6 mm auf jeder Seite der Mittellinie)¹¹ wurden relative cerebrale Blutfluss-Messungen gemacht, wie angezeigt; unmittelbar nach der Anästhesie, 1 und 10 Minuten nach dem Verschluss der mittleren cerebralen Arterie sowie nach 30 Minuten, 300 Minuten und 22 Stunden der Reperfusion. Die Daten werden als das Verhältnis der Doppler-Signalintensität der ischämischen im Vergleich zur nicht-ischämischen Hemisphäre ausgedrückt. Obwohl dieses Verfahren den cerebralen Blutfluss nicht pro Gramm Gewebe quantifiziert, dient die Verwendung von Laser-Doppler-Flussmessungen an genau definierten anatomischen Charakteristika als ein Mittel zum serienmäßigen Vergleichen der cerebralen Blutflüsse in demselben Tier im Zeitverlauf. Das chirurgische Vorgehen wurde als technisch adäquat angesehen, wenn eine ≥ 50% Reduzierung im relativen cerebralen Blutfluss unmittelbar nach dem Platzieren der intraluminalen verschließenden Naht beobachtet wurde. Diese Verfahren sind in früheren Untersuchungen verwendet worden^7,11.
Herstellung und Verabreichung von ¹²⁵I-markierten Proteinen und ¹¹¹In-markierten murinen Neutrophilen: Radioaktiv iodierte Antikörper wurden wie folgt hergestellt. Monoclonales Ratte-anti-murines P-Selectin-IgG (Clon RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA)¹⁴ und nicht immunes Ratten-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden mit ¹²⁵I durch das Lactoperoxidase-Verfahren¹⁵ unter Verwendung von Enzymobeads (Bio-Rad, Hercules, CA) radioaktiv markiert. Radioaktiv markierte PMNs wurde auf folgende Weise hergestellt. Citratblut von Wildtyp-Mäusen wurde 1:1 mit NaCl (0,9%) verdünnt, gefolgt von einer Gradienten-Ultrazentrifugation auf Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Nach einer hypotonen Lyse der Rest-Erythrocyten (20 sec-Aussetzen gegenüber destilliertem H₂O, gefolgt von Wiederherstellung mit 1,8% NaCl) wurden die PMNs in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert. Die Neutrophilen (5-7,5 × 10⁶) wurden in PBS mit 100 μCi ¹¹¹Indiumoxin (Amersham Mediphysics, Port Washington, NY) suspendiert und einer sanften Bewegung für 15 Minuten bei 37°C ausgesetzt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die PMNs sanft pelletiert (450 × g) und in PBS auf eine Endkonzentration von 1,0 × 10⁶ Zellen/mL resuspendiert.
Berechnung der Infarktvolumen: Nach einer neurologischen Untersuchung wurden die Mäuse anästhesiert und die endgültigen cerebralen Blutfluss-Messungen erhalten. Eine humane Euthanasie wurde durch Enthaupten durchgeführt, und die Gehirne wurden entfernt und für 1 mm-Schnitte in eine Mausgehirn-Matrix (Activational Systems Inc., Warren, MI) platziert. Die Schnitte wurden in 2% 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 0,9% phosphatgepufferter Kochsalzlösung eingetaucht, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und in 10% Formalin platziert¹⁶. Infarktgehirn wurde als ein Gebiet von ungefärbtem Gewebe gesehen. Die Infarktvolumen wurden aus den planimetrierten Reihenschnitten berechnet und als der Prozentsatz des Infarkts in der ipsilateralen Hemisphäre ausgedrückt. Dieses Verfahren des Berechnens von Infarkt-Volumen ist früher von unserer Gruppe^7,11 und anderen^16,17 verwendet worden und ist mit den anderen funktionellen Anzeichen des Schlaganfallergebnisses, die oben beschrieben sind, korreliert worden.
Verabreichung von unmarkierten Antikörpern, radioaktiv markierten PMNs und radioaktiv markierten Antikörpern: Für Experimente, in denen unmarkierte Antikörper verabreicht wurden, wurden ein oder zwei verschiedene Antikörpertyp(en) verwendet; entweder ein blockierendes monoclonales Ratte-anti-murines P-Selectin-IgG (Clon RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA)^14,18,19 oder nicht-immunes Ratten-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Die Antikörper wurden als 30 μg in 0,2 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,1% bovines Serumalbumin, hergestellt, was dann 10 Minuten vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss in die Penisvene verabreicht wurde. In getrennten Experimenten wurden radioaktiv markierte Antikörper (0,15 mL, ≈2,6 × 10⁵ cpm/μL) 10 Minuten vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss intravenös injiziert. In einer dritten Gruppe von Experimenten wurden radioaktive markierte PMNs 10 Minuten vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss als eine 100 μL-Injektion (die radioaktiv markierten PMNs wurden mit physiologischer Kochsalzlösung auf ein Gesamtvolumen von 0,15 mL gemischt; ≈3 × 10⁶ cpm/μL) intravenös verabreicht. Für Experimente, in denen unmarkierte Antikörper verabreicht wurden, wurden die Zeitpunkte, zu denen Messungen unter Verwendung der Verfahren, die oben beschrieben sind, vorgenommen wurden, um den cerebralen Blutfluss, die Infarktvolumen und die Mortalität zu bestimmen, im Text angezeigt. Für jene Experimente, in denen entweder radioaktiv markierte Antikörper oder radioaktiv markierte PMNs verabreicht wurden, wurden die Mäuse zu den angezeigten Zeitpunkten getötet, und die Gehirne wurde sofort entfernt und in ipsilaterale (postischämische) und kontralaterale Hemisphären geteilt. Die Ablagerung von radioaktiv markierten Antikörpern oder Neutrophilen wurde gemessen und als ipsilaterale/kontralaterale cpm ausgedrückt.
Immunhistochemie: Gehirne wurden eine Stunde nach dem mittleren cerebralen Arterienverschluss entfernt, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und für die Immunhistochemie geschnitten. Die Schnitte wurden mit einem Affinitätsaufgereinigten polyclonalen Kaninchen-anti-menschlichen P-Selectin-Antikörper (1:25-Verdünnung, Pharmingen, San Diego, CA) gefärbt, und die Stellen der primären Antikörper-Bindung wurden unter Verwendung eines Biotin-konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG (1:20), das mit ExtrAvidin-Peroxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) nachgewiesen wurde, sichtbar gemacht.
Datenanalyse: Der cerebrale Blutfluss, das Infarktvolumen und die ¹¹¹In-PMN-Ablagerung wurden unter Verwendung des Student-t-Tests für ungepaarte Variablen verglichen. Eine Zweiweg-ANOVA wurde durchgeführt, um auf signifikante Unterschiede zwischen der Grundlinien- und endgültigen (30 min) Antikörper-Ablagerung zwischen den zwei Gruppen (experimentell gegenüber Schein) zu testen. Der Student-t-Test für ungepaarte Variablen wurde durchgeführt, um Unterschiede innerhalb einer Gruppe (Grundlinie gegenüber dem 30 min-Zeitpunkt) zu bewerten. Überlebensunterschiede zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung einer Zufallsanalyse mit der Chi²-Statistik getestet. Die Werte werden als Durchschnitt ± SEM ausgedrückt, wobei ein p-Wert von < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wird.
ERGEBNISSE:
P-Selectin-Expression im murinen Schlaganfall: Da P-Selectin die anfängliche Phase der Leukocyten-Adhäsion an aktivierte endotheliale Zellen vermittelt²⁰, untersuchten wir die frühe cerebralen P-Selectin-Expression in einem murinen Modell des reperfundierten Schlaganfalls. Mäuse, denen ein ¹²⁵I-markiertes monoclonales Ratte-anti-murines P-Selectin-IgG vor der Operation gegeben wurde, zeigten nach 30 Minuten der Reperfusion einen 216% Anstieg in der Akkumulierung des Antikörpers im Vergleich zu den Schein-behandelten Tieren (p < 0,001, 31A). Um zu zeigen, dass dieser Grad der Antikörper-Ablagerung in der reperfundierten Hemisphäre aufgrund der P-Selectin-Expression und nicht einer nichtspezifischen Akkumulierung erfolgte, wurde ein Vergleich mit identisch behandelten Mäusen angestellt, denen ein ¹²⁵I-markiertes Ratte-nicht-immun-IgG gegeben wurde. Diese Experimente zeigten, dass es eine signifikant größere Akkumulierung des anti-P-Selectin-IgG als des nicht-immunen IgG gab (p < 0,025, 31A), was nahe legt, dass P-Selectin innerhalb von 30 Minuten der Reperfusion im Gehirn exprimiert wird. Eine Untersuchung der Schnitte des Gehirngewebes, dass auf P-Selectin immungefärbt wurde, offenbart, dass die P-Selectin-Expression vorwiegend in den endothelialen Mikrogefäß-Zellen im ipsilateralen cerebralen Cortex lokalisiert ist (31B).
Neutrophilen-Akkumulierung im murinen Schlaganfall: Um den Zeitablauf zu skizzieren, über den der PMN-Einstrom nach dem Schlaganfall erfolgt, wurde die Akkumulierung der ¹¹¹In-markierten PMNs in Wildtyp (PS +/+) Mäusen vor dem MCAO, unmittelbar nach und 10 Minuten nach dem MCAO und nach 30 min, 300 min und 22 h der Reperfusion gemessen. In PS +/+ Mäusen beginnt die Akkumulierung von PMNs früh nach dem Beginn der fokalen Ischämie und setzt sich über den Zeitraum der Reperfusion fort (31C). Um die Rolle von P-Selectin in dieser postischämischen Neutrophilen-Akkumulierung zu etablieren, wurden Experimente unter Verwendung von Mäusen durchgeführt, die homozygot-Null für das P-Selectin-Gen waren (PS -/-). PS -/- Mäuse zeigten eine signifikant reduzierte PMN-Akkumulierung nach einem mittleren cerebralen Arterienverschluss und einer Reperfusion (31B).
Die Rolle von P-Selectin im cerebrovaskulären Nicht-Rückfluss: Um zu bestimmen, ob die Reduktion in der PMN-Akkumulierung in PS -/- Mäusen in einem verbesserten cerebralen Blutfluss nach der Wiederherstellung des Flusses resultierte, wurden Reihenmessungen des relativen CBF durch Laser-Doppler sowohl in PS +/+ als auch PS -/- Mäusen erhalten. Vor dem Beginn der Ischämie (32, Punkt a), waren die relativen cerebralen Blutflüsse beinahe identisch zwischen den Gruppen. Der mittlere cerebrale Arterienverschluss (32, Punkt b) war mit einem beinahe identischen Abfall im cerebralen Blutfluss in beiden Gruppen assoziiert. Unmittelbar vor dem Entfernen der intraluminalen verschließenden Naht nach 45 Minuten der Ischämie (32, Punkt c) waren die cerebralen Blutflüsse leicht angestiegen, obwohl sie im Vergleich zu den Grundlinien-Flüssen signifikant vermindert blieben. Unmittelbar nach dem Entfernen der verschließenden Naht, um die Reperfusion zu iniziieren (32, Punkt d), stiegen die cerebralen Blutflüsse in beiden Gruppen auf einen vergleichbaren Grad (≈60% der Grundlinie in den PS -/- und PS +/+ Mäusen). Das unmittelbare Versagen des cerebralen Post-Reperfusions-Blutflusses, die Spiegel vor dem Verschluss zu erreichen, ist charakteristisch für den cerebrovaskulären Nicht-Rückfluss²¹, wobei der folgende Abfall in den cerebralen post-Reperfusions-Blutflüssen eine verzögerte postischämische cerebralen Hypoperfusion darstellt²². Nach 30 Minuten der Reperfusion (32, Punkt e) waren die cerebralen Blutflüsse zwischen den zwei Gruppen von Tieren auseinandergewichen, wobei die PS -/- Tiere signifikant größere relative cerebrale Blutflüsse als die PS +/+ Kontrollen zeigten (p < 0,05). (32, Punkt f). Dieses Auseinanderweichen reflektierte die signifikanten Unterschiede in der verzögerten postischämischen cerebralen Hypoperfusion und hielt für den 22 Stunden-Beobachtungszeitraum an.
Schlaganfallergebnis: Die funktionelle Signifikanz der P-Selectin-Expression wurde durch Vergleichen der Anzeichen des Schlaganfallergebnisses in PS -/- Mäusen mit jenen in PS +/+ Kontrollen getestet. PS -/- Mäuse waren basierend auf einer 77% Reduzierung im Infarktvolumen (p < 0,01) im Vergleich zu P-Selectin +/+ Kontrollen signifikant vor den Wirkungen der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion geschätzt (33A). Diese Reduzierung im Infarktvolumen war von einem erhöhten Überleben in den PS -/- Tieren begleitet (p < 0,05; 33B).
Wirkung einer P-Selectin-Blockade: Nachdem die funktionelle Rolle der P-Selectin-Expression im Schlaganfall unter Verwendung von deletionsmutanten Mäusen beobachtet wurde, wurden Experimente durchgeführt, um festzustellen, ob eine pharmakologische Blockade von P-Selectin das Schlaganfallergebnis in PS +/+ Mäusen verbessern könnte. Unter Verwendung einer Strategie des Verabreichens eines funktionell blockierenden monoclonalen Ratte-anti-Maus-P-Selectin-Antikörpers (Clon RB 40.34^14,18,19) oder eines nicht-immunen Kontroll-Ratten-IgG unmittelbar vor der Operation wurde beobachtet, dass Mäuse, die den blockierenden Antikörper unmittelbar vor dem mittleren cerebralen Arterienverschluss erhielten, nach 30 Minuten verbesserte cerebrale post-Reperfusions-Blutflüsse sowie reduzierte cerebrale Infarktvolumen und einen Trend zu einer reduzierten Mortalität im Vergleich zu den Kontrollen aufwiesen (34, die 6 äußerst linken Säulen). Um die potenzielle klinische Relevanz einer Strategie der P-Selectin-Blockade als eine neue Behandlung des Schlaganfalls zu erhöhen, wurden zusätzliche Experimente durchgeführt, in denen nach dem intraluminalen Verschluss der mittleren cerebralen Arterie entweder der Kontroll- oder der blockierende Antikörper gegeben wurden (weil die meisten Patienten nach dem Beginn eines Schlaganfalls vorgestellt werden). In diesen Untersuchungen wurden eine signifikante Reduzierung in den Infarktvolumen sowie ein Trend zu einem verbesserten cerebralen Blutfluss beobachtet (34, die 6 äußerst rechten Säulen).
DISKUSSION:
Trotz des wesentlichen Fortschritts in den vergangenen Jahren in der primären Verhinderung des Schlaganfalls¹ bleiben therapeutischen Möglichkeiten, einen entstehenden Schlaganfall zu behandeln, äußerst beschränkt. Obwohl von der Veröffentlichung von zwei herausragenden Versuchen im letzten Herbst, die eine reduzierte Morbidität nach der Behandlung eines ischämischen Schlaganfalls mit rt-PA zeigten^2,3, angenommen wurde, dass sie eine neue Ära der thrombolytischen Therapie in der Behandlung des Schlaganfalls einleiten⁴, ist der Enthusiasmus durch die hämorrhagische Transformierung und eine erhöhte Mortalität, die in Patienten mit einem ischämischen Schlaganfall, der mit Streptokinase behandelt wurde, bemerkt wurden, etwas gemäßigt worden. Diese auseinanderweichenden Versuche machen es kritischer denn je, dass neue sichere Therapien entwickelt werden, um einen entstehenden Schlaganfall zu behandeln. Obwohl die Wiederherstellung des Blutflusses zum postischämischen Gehirn neue Möglichkeiten für eine frühe therapeutische Intervention bietet, ist die Reperfusion ein doppelschneidiges Schwert. In Anbetracht des cytotoxischen Potenzials von Neutrophilen²³ ist es nicht überraschend, dass der Neutrophilen-Einstrom in das postischämische Gehirngewebe zu einer weiteren Schädigung führen und das Ergebnis nach einem experimentellen Schlaganfall verschlechtern kann^7,24,27. Unter Verwendung eines murinen Modells der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion haben wir vor kurzem eine wichtige beitragende Rolle des Zelladhäsionsmoleküls ICAM-1 in der Neutrophilen-Akkumulierung 22 Stunden nach einem Schlaganfall identifiziert⁷. Die gesteigerte endotheliale cerebrovaskuläre ICAM-1-Expression benötigt jedoch transkriptionelle und translationelle de novo-Vorgänge, was Zeit benötigt. Im Gegensatz dazu kann P-Selectin, ein Membran-umspannendes Glycoprotein, das die frühsten Phasen der Neutrophilen-Adhäsion vermittelt, aus vorgeformten Speicherpools mobilisiert werden, um schnell auf der ischämischen endothelialen Zelloberfläche exprimiert zu werden^8,28. Da die klinischen Versuche einer thrombolytischen Therapie für den Schlaganfall ein enges Zeitfenster für einen potenziellen Nutzen zeigen (innerhalb der ersten paar Stunden des Schlaganfall-Beginns)^2,3,5, legt dies nahe, dass Strategien, die gestaltet werden, um mit den frühsten Phasen des PMN-Adhäsion zu interferieren, von theoretischem Nutzen im menschlichen Schlaganfall sein könnten. Diese Versuche sollten in größeren Zahlen von Patienten resultieren, die für eine frühere therapeutische Intervention vorgestellt werden, was den Bedarf erhöht, das Thema der Reperfusionsverletzung in medizinisch revaskulierten Gebieten zu adressieren. Zusätzlich unterstreichen sie den dringenden Bedarf, die Beiträge von individuellen Adhäsionsmolekülen an der Pathogenese des Schlaganfalls zu verstehen.
Angesichts der beträchtlichen Menge an Literatur, die die Rolle von P-Selectin in anderen Modellen der Ischämie und Reperfusion beschreibt^8,29,32, ist überraschend wenig über die Rolle von P-Selectin im Schlaganfall bekannt. Die Kenntnis der spezifischen Rolle von P-Selectin in den cerebralen Gefäßen ist wichtig, weil Adhäsionsmolekül-Anforderungen zwischen den Gefäßbetten und den Bedingungen, die untersucht werden, variieren. Zum Beispiel reduzierten in einem Modell der intestinalen Transplantation³³ anti-P-Selectin-Antikörper nicht die Reperfusionsverletzung, wohingegen anti-CD11/CD18-Antikörper dies taten. Obwohl eine P-Selectin-Blockade im Reduzieren der PMN-Adhäsion und des Albumin-Ausfließens in einem mesenterisalem Ratten-Ischämie und Reperfusionsmodell unwirksam war, war eine ICAM-1-Blockade wirksam³⁴. In einem Ratten-Hinterextremitäts-Ischämie/Reperfusions-Modell unterschieden sich die Selectin-Anforderungen für die PMN-Adhäsion zwischen den pulmonalen und Beinmuskel-Gefäßbetten³¹.
Nach unserem Wissen ist die einzige veröffentlichte Untersuchung, die eine erhöhte P-Selectin-Expression im ischämischen Gehirn beschreibt, eine histopathologische Beschreibung des Primaten-Schlaganfalls, in dem die P-Selectin-Expression in den lenticulostriaten Mikrogefäßen erhöht war¹⁰. Die gegenwärtigen Untersuchungen wurden unternommen, um zu untersuchen, ob die P-Selectin-Expression zu der postischämischen cerebralen Neutrophilen-Akkumulierung, dem Nicht-Rückfluss und der Gewebeverletzung in einem murinen Modell des reperfundierten Schlaganfalls beiträgt. Unter Verwendung eines kürzlich etablierten Modells der fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion in Mäusen¹¹ wurde durch erhöhte endotheliale Immunfärbung und eine erhöhte Ablagerung von radioaktiv markiertem Antikörper eine P-Selectin-Expression im ischämischen Gebiet gezeigt. In der letzteren Technik wurde die Antikörper-Ablagerung in die ischämische Hemisphäre zu jener in der nicht-ischämischen Hemisphäre in jedem Tier normalisiert, nicht nur, um potenzielle Variationen im Injektionsvolumen oder dem Volumen der Verteilung zu minimieren, sondern um einen Vergleich zwischen Tieren, denen verschiedene Antikörper gegeben wurden, zu ermöglichen. Da eine Zerstörung der endothelialen Grenzfunktion im ischämischen Cortex eine nicht-selektive Antikörper-Ablagerung erhöhen kann, wurden ähnliche Experimente mit einem Kontroll-Ratten-IgG durchgeführt. Diese Daten zeigen, dass der Antikörper, der an P-Selectin bindet, in einer beschleunigten Rate im Vergleich zum Kontroll-Antikörper abgelagert wird, was nahe legt, dass eine lokale P-Selectin-Expression im reperfundierten Gewebe gesteigert ist. Diese Daten im murinen Modell laufen parallel zu jenen, die in einem Pavian-Modell des Schlaganfalls berichtet wurden¹⁰, in dem die P-Selectin-Expression innerhalb von 1 Stunde nach dem ischämischen Ereignis erhöht war.
Die Rolle der P-Selectin-Expression in zu der postischämischen Zone rekrutierten PMNs wurde unter Verwendung einer Strategie gezeigt, in der die Akkumulierung von ¹¹¹In-markierten PMNs gemessen wurde. Obwohl wir früher berichtet haben, dass nach 22 Stunden die PMN-Akkumulierung in der ischämischen Hemisphäre erhöht ist⁷, zeigen die gegenwärtigen Zeitablaufs-Daten, dass die PMN-Akkumulierung kurz nach dem Beginn der Ischämie beginnt. Das Versagen, das P-Selectin-Gen zu exprimieren, war mit einer reduzierten PMN-Akkumulierung assoziiert, was die Teilnahme von P-Selectin an der postischämischen cerebralen PMN-Rekrutierung nahe legt. Die P-Selectin-Null-Tiere zeigten jedoch nach 22 Stunden eine milde (wenngleich weniger als die Kontrolle) Neutrophilen-Akkumulierung. Diese Daten weisen darauf hin, dass P-Selectin nicht der ausschließliche Wirkungsmechanismus ist, der für die postischämische cerebrale PMN-Rekrutierung verantwortlich ist, und sind konsistent mit unseren früheren Daten, dass ICAM-1 auch an der postischämischen PMN-Adhäsion teilnimmt⁷. Darüber hinaus sind diese Daten nicht verschieden zu jenen, in denen die intraabdominale Instillation von Thioglycollat in P-Selectin-defizienten Mäusen eine verzögerte (aber nicht fehlende) PMN-Rekrutierung verursachte⁹.
Aufgrund des kritischen Bedarfs, Gründe für die verfehlte Reperfusion zu identifizieren, untersuchten die gegenwärtigen Untersuchungen die Rolle von P-Selectin in der verzögerten postischämischen cerebralen Hypoperfusion^21,22, dem Phänomen, in dem der Blutfluss trotz der Wiederherstellung von adäquaten Perfusions-Drucken während der Reperfusion absinkt. In Herzmodellen der Ischämie verschlechtert sich der Nicht-Rückfluss mit dem Verstreichen der Zeit nach der Reperfusion³⁵, was eine wichtige Rolle für rekrutierte Wirkungsmechanismen wie fortschreitende mikrozirkulatorische Thrombose, vasomotorische Dysfunktion und PMN-Rekrutierung nahe legt. Sowohl von den P-Selectin- als auch ICAM-1-abhängige Anhaftungs-Reaktionen³⁶ und kapillärem PMN-Verstopfen³⁷ ist in anderen Modellen gezeigt worden, dass sie am postischämischen Nicht-Rückfluss teilnehmen. Im Gehirn sind PMNs mit dem postischämischen cerebralen Nicht-Rückfluss in Zusammenhang gebracht worden^38,39, aber die Rolle von P-Selectin war früher nicht erläutert worden.
Die gegenwärtige Untersuchung verwendet eine relativ nicht-invasive Technik (Laser-Doppler), um Reihenmessungen des relativen cerebralen Blutflusses zu erhalten, um das Vorliegen, den Zeitablauf und die P-Selectin-Abhängigkeit des postischämischen cerebrovaskulären Nicht-Rückflusses zu etablieren. Um zu zeigen, dass das einfädelnde Vorgehen selbst nicht die Ursache der vaskulären Schädigung und des folgenden cerebralen Infarkts war, wurden Ischämie-Scheinexperimente durchgeführt (n = 10), in denen eine Nylonnaht für eine nicht-verschließende 45 Minuten-Periode in die interne Carotis-Arterie eingefädelt wurde. In diesen Experimenten wurde durch Laser-Doppler gezeigt, dass das Einfädeln basierend auf dem Nichtabfall der Perfusion während der 45 Minuten-Periode nicht verschließend war. Wenn die Gehirne dann nach 24 Stunden gewonnen und mit TTC gefärbt wurden, zeigte keines einen Hinweis auf einen cerebralen Infarkt. Daher können wir schließen, dass das einfädelnde Vorgehen per se keine ausreichende Schädigung provoziert, um unsere Haupt-Ergebnisvariablen zu beeinflussen. Wenn der relative cerebrale Blutfluss nach einem offenen mittleren cerebralen Arterienverschluss in Versuchstieren untersucht wurde, beobachteten wir, dass P-Selectin-Null- und Kontrolltiere nahezu identischen Graden der Ischämie ausgesetzt waren (es gab in beiden einen anfänglichen ≈4,5-fachen Abfall im relativen cerebralen Blutfluss nach dem mittleren cerebralen Arterienverschluss). Dennoch gab es einen leichten Anstieg im relativen cerebralen Blutfluss in den ersten 10 Minuten nach dem Verschluss, obwohl die verschließende Naht an ihrer Stelle blieb. Dies ist eine empirische Beobachtung, die wir immer wieder gemacht haben, für die es wahrscheinlich einige mögliche Erklärungen gibt. Wahrscheinlich gibt es einen gewissen Grad eines kollateralen Flusses, der sich im ischämischen Gebiet eröffnet. Eine andere haltbare Erklärung ist, dass es ein Element des anfänglichen Vasospasmus in der Region der verschließenden Katheterspitze geben kann, der sich innerhalb von einigen Minuten gemäßigt auflöst. Obwohl beide dieser Erklärungen möglich sind, können wir aufgrund der kleinen Größe der murinen Gefäße den Mechanismus in unserem Modell nicht mit Sicherheit identifizieren. Nichtsdestotrotz, da wir sowohl in Kontroll- als auch in Versuchstieren denselben Grad der Fluss-Rekrutierung beobachten, verändern diese Daten nicht unsere Hauptschlussfolgerungen, dass P-Selectin ein wichtiger Vermittler der cerebralen Gewebeverletzung im reperfundierten Schlaganfall ist.
Nach dem Entfernen der intraluminalen verschließenden Naht war die sofortige Erholung des Blutflusses dieselbe sowohl in den P-Selectin +/+ als auch den -/- Tieren. Die Tatsache, dass die Fluss-Spiegel nie zu der Grundlinie zurückkehrten (noch gab es eine Überreaktion, wie es mit einer reaktiven Hyperämie gesehen werden könnte), kann aufgrund der Schwere und Dauer der ischämischen Periode sein, was wahrscheinlich andere Mechanismen des postischämischen cerebrovaskulären Nicht-Rückflusses wie Thrombose oder Neutrophilen-Rekrutierung, die durch nicht-Selectin-abhängige Mechanismen verursacht werden, rekrutiert. Sogar wenn spätere Zeitpunkte untersucht werden (wie 30 Minuten bis 22 Stunden nach dem Entfernen der verschließenden Naht), ist es interessant zu bemerken, dass es einen leichten Abfall im cerebralen Blutfluss in den P-Selectin -/- Tieren gibt. Dieser späte (wenngleich limitierte) Abfall im cerebralen Blutfluss nach 22 Stunden ist konsistent mit der mäßigen PMN-Rekrutierung, die in den PS -/- Tieren über denselben Zeitraum beobachtet wurde, was wieder die Rekrutierung von anderen Fluss-limitierenden Wirkungsmechanismen (wie ICAM-1) in den PS -/- Tieren nahe legt.
Die funktionellen Wirkungen der P-Selectin-Expression sind aus der gegenwärtigen Gruppe von Untersuchungen klar: Tiere, die das P-Selectin-Gen nicht exprimieren können (oder PS +/+ Tiere, die mit einem funktionell blockierenden anti-P-Selectin-Antikörper behandelt werden), zeigen kleinere Infarkte und ein verbessertes Überleben im Vergleich zu den Kontrollen. Wenn diese Daten zusammen mit früher veröffentlichten Daten, die eine schädliche Rolle der ICAM-1-Expression im Schlaganfall zeigen⁷, in Betracht gezogen werden, wird es vermehrt offensichtlich, dass es mehrere Mittel für das Rekrutieren von PMNs zum postischämischen cerebralen Cortex gibt und dass eine Blockade von jedem eine potenzielle Strategie darstellt, um das Schlaganfallergebnis bei Menschen zu verbessern. Angesichts unserer gegenwärtigen Anerkennung der Wichtigkeit einer zeitgerechten Reperfusion im Anhalten der fortschreitenden Wellenfront des neuronalen Todes nach dem Schlaganfall scheint das Interferieren mit der PMN-Adhäsion in ihren frühesten Stadien eine attraktive Möglichkeit für die Reduzierung der Morbidität und Mortalität zu sein. Tatsächlich können anti-Adhäsionsmolekül-Strategien nicht nur selber günstig sein (d.h. einschließlich der Patienten, die nicht für eine Thrombolyse geeignet sind), sondern können den Spielraum für eine thrombolytische Intervention ausdehnen⁴⁰. Die gegenwärtige Gruppe von Untersuchungen trägt zu unserem Verständnis der pathophysiologischen Mechanismen bei, die im reperfundierten Schlaganfall wirksam sind. Diese Untersuchungen legen den Bedarf für klinische Studien von Therapien für einen entstehenden Schlaganfall nahe, die das Reperfusionsmilieu optimieren, um die PMN-Akkumulierung zu reduzieren.
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Beispiel 11: Verwendung von Kohlenmonoxid, um eine ischämische Störung zu behandeln – Beispiel der schützenden Wirkungen von Kohlenmonoxid in der Lungenischämie
In der anfänglichen Patentanmeldung legten wir Daten offen, die darauf hinweisen, dass eine endogene Produktion von Kohlenmonoxid oder die Verabreichung von exogenem Kohlenmonoxid günstig für das Schützen des Gehirns gegen eine folgende ischämische Verletzungen ist. Als ein anderes Beispiel der Verwendung von Kohlenmonoxid im Behandeln einer ischämischen Störung haben wir Kohlenmonoxid an Ratten verabreicht, um seine Wirkungen auf das Verbessern der Lungenkonservierung für die Transplantation zu testen (dies ist ähnlich zu einer ischämischen Störung, da die Spenderlungen von einem Empfänger entfernt werden; während der Periode, in der die Lungen konserviert und vom Spender zum Empfänger transferiert werden, gibt es eine Unterbrechung im Blutfluss).
Verfahren zum Testen der Wirkung von Kohlenmonoxid auf die Lungenkonservierung:
Materialien, die verwendet werden, um die Konservierungslösung herzustellen:
Für alle Experimente bestand die Basis-Konservierungslösung aus modifizierter Euro-Collins (EC)-Lösung (Na⁺ 10 mEq/L, K⁺ 115 mEq/L, Cl^- 15 mEq/L, HPO₄ ^2- 85 mEq/L, H₂PO₄ ^- 15 mEq/L, HCO₃ ^- 10 mEq/L).
Lungengewinnung, Konservierung und Transplantation:
Durch Inzucht erzeugte männliche Lewis-Ratten (250-300 Gramm) wurden für alle Experimente gemäß einem Protokoll verwendet, das durch das institutionelle Animal Care and Use Committee an der Columbia University gemäß den Richtlinien genehmigt wurde, die durch die American Academy for Accreditation of Laborstory Animal Care (AAALAC) festgesetzt wurden. Lungentransplantations-Experimente wurden auf die folgende Weise durchgeführt. Den Spenderratten wurden 500 Einheiten Heparin intravenöse verabreicht, und die Pulmonal-Arterie (PA) wurde mit einem 30 mL-Volumen der 4°C-Konservierungslösung bei einem konstanten Druck von 20 mm Hg gespült. Wenn die Lungen auf diese Weise konserviert werden, kommt der Großteil der infundierten Spüllösung bei einer linken Vorhof-Öffnung heraus, die im Lungenspender gebildet wird, sowie nach der Durchtrennung aus den Pulmonal-Venen.
Die linke Lunge wurde dann gewonnen, eine Manschette wurde auf jeden Gefäßstumpf platziert, ein Zylinder wurde in die Bronchie inseriert und die Lunge wurde für 6 Stunden in 4°C Konservierungslösung eingetaucht, die identisch zu der PA-Spüllösung war. Geschlechts/Stammes/Größen-angepasste Ratten wurden anästhesiert, intubiert und mit 100% O₂ unter Verwendung eines Nager-Beatmungsgeräts (Harvard Apparatus, South Natick, MA) beatmet. Eine orthotopische linke Lungentransplantation wurde durch eine linke Thoracotomie unter Verwendung einer schnellen Manschettentechnik für alle Anastomosen durchgeführt, wobei die warmen ischämischen Zeiten unter 5 Minuten blieben. Die Hilus-Kreuzklammer wurde entfernt, was den Blutfluss und die Atmung zu der transplantierten Lunge wiederherstellte. Dann wurde eine Schlinge um die rechte PA geführt, und Millar-Katheter (2F; Millar instruments, Houston, TX) wurden in die Haupt-PA und das linke Atrium (LA) eingebracht. Eine Doppler-Fluss-Sonde (Transonics, Ithaca, NY) wurde um die Haupt-PA platziert.
Messung der Lungentransplantat-Funktion:
Ein hämodynamisches Online-Überwachen wurde unter Verwendung von MacLab und einem Macintosh Ilci-Computer erreicht. Gemessene hämodynamische Parameter schlossen die LA- und PA-Drucke (mm Hg) und den PA-Fluss (mL/min) ein. Die arterielle Sauerstoffspannung (pO₂, mm Hg) wurde während des Einatmens von 100% O₂ unter Verwendung eines Modell ABL-2-Gasanalysegeräts (Radiometer, Kopenhagen, Dänemark) gemessen. PVRs wurden als (mittlerer PA-Druck – LA-Druck)/mittlerer PA-Fluss berechnet und als mm Hg/mL/min ausgedrückt. Nach Grundlinien-Messungen wurde die natürliche rechte PA ligiert, und Reihenmessungen wurden alle fünf Minuten bis zum Zeitpunkt der Euthanasie nach 30 Minuten (oder bis zum Tod des Empfängers) vorgenommen.
Verabreichung von Kohlenmonoxid:
Zu der angezeigten Zeit vor der Chirurgie (4, 8 oder 12 Stunden) wurden die Ratten in eine Vacuumglocke platziert und Kohlenmonoxid wurde in verschiedenen Konzentrationen (0,01%, 0,03% oder 0,1%) verabreicht, wobei der Rest des Gasgemisches als Raumluft bestand. (Das Gas wurde vor den Verabreichungen durch ein Glas mit Wasser geleitet, um es für das Wohlbefinden der Tiere anzufeuchten). Zu den angezeigten Zeiten nach dem Beginn des Ausgesetztseins wurden die Ratten anästhesiert und die Lungen, wie oben beschrieben, gewonnen. Diese Spenderlungen wurden in den folgenden Lungentransplantations-Experimenten verwendet.
Ergebnisse und Diskussion:
Die Ergebnisse dieser Experimente weisen darauf hin, dass die Inhalation von Kohlenmonoxid vor der Lungengewinnung im Gegensatz zu unbehandelten Kontrollen einen signifikanten Schutz für die Lungen nach der Transplantation verleiht. Dieser Schutz wird bewiesen durch; (1) eine verbesserte arterielle Sauerstoffversorgung der Empfänger der Kohlenmonoxid-vorbehandelten Spenderlungen; (2) einen verstärkten pulmonalen arteriellen Blutfluss (und einen reduzierten pulmonalen Gefäßwiderstand) bei der Verwendung von Kohlenmonoxid-vorbehandelten Spenderlungen; und (3) ein verbessertes Überleben der Empfänger von Kohlenmonoxid-vorbehandelten Spenderlungen im Vergleich zu den Kontrollen. Die positiven Wirkungen von Kohlenmonoxid waren dosisabhängig, d.h. der beste Schutz wurde bei der 0,1%-Dosis gesehen, wobei ein dazwischenliegender Grad des Schutzes bei der 0,03%-Dosis gesehen wurde und der geringste Schutz bei der 0,01%-Dosis gesehen wurde. Die günstigen Wirkungen von Kohlenmonoxid waren auch zeitabhängig, indem längere Aussetzungszeiten den größten Schutz zu liefern schienen. Zusammen weisen diese Daten darauf hin, dass Kohlenmonoxid in einer anderen ischämische Störung (Lungenischämie) schützen kann, und legen nahe, dass die Ergebnisse auch auf andern ischämische Störungen übertragen werden können.
Beispiel 12: Die Verwendung eines spektrophotometrischen Hämoglobin-Tests, um eine intracerebrale Blutung in Mäusen objektiv zu quantifizieren
Kurzfassung
Hintergrund und Ziel
Es gibt ein großes Interesse am Entwickeln von neuen antikoagulierenden oder thrombolytischen Strategien, um einen ischämischen Schlaganfall zu behandeln. Derzeit gibt es jedoch limitierte Mittel, um das Blutungspotenzial von diesen Agenzien genau bewerten. Die gegenwärtigen Untersuchungen wurden gestaltet, um ein Verfahren für ein genaues Quantifizieren des Grads einer intracerebralen Blutung in murinen Modellen zu entwickeln und zu bestätigen.
Verfahren
In einem murinen Modell wurde eine intracerebrale Blutung (ICH) durch stereotaktische intraparenchymale Infusion von Kollagenase B alleine (6 × 10^-6 Einheiten, n = 5) oder Kollagenase B, gefolgt von einem intravenösem Gewebe-Plasminogen-Aktivator (rt-PA, 0,1 mg/kg, n = 6) induziert. Die Kontrollen bestanden entweder aus einer Schein-Operation mit einer stereotaktischen Infusion einer Kochsalzlösung (n = 5) oder aus unbehandelten Tieren (n = 5). Die ICH wurde (1) durch eine Skala, die auf dem maximalen Blutungsdurchmesser auf coronalen Schnitten basierte, bewertet und (2) durch einen spektrophotometrischen Test quantifiziert, der Cyanomethämoglobin in chemisch reduzierten Extrakten eines homogenisierten murinen Gehirns misst. Dieser spektrophotometrische Test wurde unter Verwendung von bekannten Mengen von Hämoglobin oder autologem Blut, das zu einer getrennten Gruppe von homogenisierten Gehirnen zugefügt wurde, validiert. Unter Verwendung dieses Tests wurde der Grad der Blutung nach einem/einer fokalen mittleren cerebralen Arterienverschluss/Reperfusion in Mäusen, die mit einer hohen Dosis IV rt-PA (10 mg/kg, n = 11) nach dem Verschluss behandelt wurden, und Kontrollmäusen, die einem Schlaganfall ausgesetzt waren aber mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurden (n = 9), quantifiziert.
Ergebnisse:
Bekannte Mengen von Hämoglobin oder autologem Blut, das zu frischem Gesamtgehirngewebe-Homogenaten zugefügt wurde, zeigten ein lineares Verhältnis zwischen der zugefügten Menge und der OD beim Absorptionspeak von Cyanomethämoglobin (r = 1,00 beziehungsweise 0,98). Wenn in vitro-Untersuchungen durchgeführt wurden, um die experimentell induzierte ICH zu quantifizieren, hatten die Tiere, die eine intracerebrale Infusion von Kollagenase B erhielten, signifikant höhere ODs als Kochsalzlösung-infundierte Kontrollen (2,1-facher Anstieg, p = 0,05). In einem mittleren cerebralen Arterienverschluss- und Reperfusionsmodell des Schlaganfalls erhöhte die Verabreichung von rt-PA nach der Reperfusion die OD 1,8-fach im Vergleich zu Tieren, die physiologische Kochsalzlösung erhielten (p < 0,001). Wenn die zwei Verfahren des Messens der ICH (visueller Wert und OD) verglichen wurden, gab es eine lineare Korrelation (r = 0,88). Zusätzliche Experimente zeigten, dass die Triphenyltetrazolium-Färbung, die im Allgemeinen verwendet wird, um lebendes Gehirngewebe zu färben, nicht mit der spektrophotometrischen Quantifizierung der ICH interferiert.
Schlussfolgerungen
Diese Daten zeigen, dass der spektrophotometrische Test eine murine ICH genau und verlässlich quantifiziert. Dieses neue Verfahren sollte die objektive Bewertung der hämorrhagischen Risiken von neuen antikoagulatorischen oder thrombolytischen Strategien, um einen Schlaganfall zu behandeln, fördern und kann die Quantifizierung von anderen Formen einer intracerebralen Blutung erleichtern.
Einleitung
Der ischämische Schlaganfall macht die größte Mehrheit des Vorkommens von akutem Schlaganfall aus. Es hat daher ein enormes Interesse am Gestalten von Strategien gegeben, die den Blutfluss zu der ischämischen Region des Gehirns prompt und wirksam wiederherstellen können. Obwohl Heparin im beginnenden Schlaganfall wirksam sein kann (TIAs)³, kann seine Verwendung während der akuten Phasen des Schlaganfalls mit einem hohen Grad der Morbidität und intracerebralen Blutung assoziiert sein^1-4. Auf ähnliche Weise führten die bedrückenden Ergebnisse in den Streptokinase-Versuchen für den akuten Schlaganfall in den frühen 1960ern zu der Zurückhaltung von Krankenhausärzten, für die folgenden drei Jahrzehnte den akuten Schlaganfall zu thrombolysieren^5,6. Diese Zurückhaltung ist durch kürzliche Versuche bestätigt worden, in denen die Verwendung von Streptokinase mit einem erhöhten Risiko der Mortalität und intracerebralen Blutung assoziiert worden ist⁷. Auf der anderen Seite hat sich die Verwendung eines rekombinanten Gewebetyp-Plasminogen-Aktivators (rt-PA), um einen fortschreitenden Schlaganfall zu behandeln, vielversprechender gezeigt⁸, wobei eine Untergruppe von Patienten mit akutem Schlaganfall, die mit rt-PA behandelt wird, eine reduzierte Langzeit-Morbidität zeigt, wenn sie innerhalb der ersten 3 Stunden des Beginns der Symptome gehandelt wird^9-11. Trotzdem haben andere Versuche unter Verwendung desselben Mittels (rt-PA) versagt, einen Vorteil zu zeigen, oder zeigten überschießend hohe Raten einer ICH^9,12,15.
Dieser verwirrende Morast von klinischen Daten unterstreicht den dringenden Bedarf, verbesserte Strategien zu identifizieren, um eine schnelle Reperfusion zu erzielen. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es zwingend, ein experimentelles Modell zu identifizieren, in dem die potenziellen Vorteile einer zeitgerechten Reperfusion im Schlaganfall objektiv gegen die Risiken einer erhöhten intracerebralen Blutung abgewogen werden können. In den meisten Tierstudien einer thrombolytischen Therapie für den klinischen Schlaganfall sind die Risiken einer intracerebralen Blutung eher geschätzt als quantitativ gemessen worden^16-24. Die gegenwärtigen Untersuchungen wurden gestaltet, um ein Verfahren zum genauen Quantifizieren des Grads der intracerebralen Blutung in murinen Modellen zu entwickeln und zu bestätigen, um potenzielle Risiken von neuen antikoagulatorischen oder thrombolytischen Behandlungen für den akuten Schlaganfall zu bewerten.
Materialen und Verfahren
Versuchstiere
In der vorliegenden Untersuchung wurden männliche C57BL/6J-Mäuse von den Jackson Laborstories (Bar Harbor, ME) gekauft und wurden zwischen 8 und 10 Wochen alt (22-32 g) verwendet. Alle Vorgänge wurden gemäß einem institutionell genehmigten Protokoll durchgeführt und sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien, die durch die American Academy of Accreditation of Laborstory Animal Care (AAALAC) bereitgestellt werden.
Spektrophotometrischer Test für eine intracerebrale Blutung
Der Hämoglobingehalt der Gehirne, die den untenstehenden experimentellen Vorgehensweisen unterzogen wurden, wurde unter Verwendung eines spektrophotometrischen Tests wie folgt quantifiziert. Gesamtgehirn-Gewebe wurde von frisch euthanasierten Kontroll- oder Versuchstieren erhalten, und jedes Gehirn wurde individuell wie folgt behandelt. Destilliertes Wasser (250 μl) wurde zu jedem Gehirn zugefügt, gefolgt von einer Homogenisierung für 30 sec (Brinkman Instruments, Inc., Westbury, NY), einer Bestrahlung auf Eis mit einem Puls-Ultrasonicator für eine Minute (SmithKline Corporation, Collegeville, PA) und einer Zentrifugation bei 13000 Upm für 30 Minuten (Baxter Scientific Products, Deerfield, IL). Nach dem Sammeln des Hämoglobin-enthaltenden Überstands wurden 80 μl Drabkin-Reagenz (gekauft von Sigma Diagnostics, St. Louis, MO; K₃Fe(CN)₆ 200 mg/L, KCN 50 mg/L, NaHCO₃ 1 g/L, pH 8,6²⁵) zu einem 20 μl-Aliquot zugefügt und für 15 Minuten stehen gelassen. Diese Reaktion konvertiert Hämoglobin zu Cyanomethämoglobin, das einen Absorptionspeak bei 540 nm hat und dessen Konzentration dann durch die optische Dichte der Lösung bei einer Wellenlänge von ≈550 nm bewertet werden kann²⁶. Um zu bestätigen, dass die gemessene Absorption nach diesen Vorgängen die Menge Hämoglobin reflektiert, wurden bekannte Mengen von bovinem Erythrocyten-Hämoglobin (Sigma, St. Louis, MO) unter Verwendung von ähnlichen Vorgehensweisen neben jedem Gehirngewebe-Test analysiert. Als ein zusätzliches Maß wurde Blut von Kontrollmäusen durch Herzpunktion nach einer Anästhesie erhalten. Schrittweise Aliquots dieses Bluts wurden dann zu frisch homogenisiertem Gehirngewebe zugefügt, das von unbehandelten Mäusen erhalten wurde, um eine Absorptions-Standardkurve herzustellen.
Kollagenase-induzierte intracerebrale Blutung
Die allgemeinen Vorgehensweisen zum Induzieren einer intracerebralen Blutung in der Maus wurden von einem Verfahren adaptiert, das früher in Ratten beschrieben worden ist²⁷. Nach der Anästhesie mit einer intraperitonealen Injektion von 0,35 ml Ketamin (10 mg/ml) und Xylazin (0,5 mg/ml) wurden die Mäuse in Rückenlage in einen stereotaktischen Kopfrahmen positioniert. Das Schädeldach wurde durch eine Kopfhautinzision in der Mittellinie von der Nasenwurzel zu der superioren Nackenlinie freigelegt, und dann wurde die Haut nach lateral zurückgezogen. Unter Verwendung eines Bohrers mit variabler Geschwindigkeit (Dremel, Racine, WI) wurde in 1,0 mm-Gratloch 2,0 mm posterior des Bregma und 2,0 mm rechts der Mittellinie gemacht. Eine einzelne 22 Gauge-Angiokatheternadel wurde unter Verwendung der stereotaktischen Führung in den/die rechten tiefen Cortex/Basalganglien inseriert (Koordinaten: 2,0 mm posterior, 2,0 mm lateral). Die Nadel war durch einen Plastikschlauch mit einer Mikroinfusionsspritze verbunden, und die Lösungen wurden in das Gehirn in einer Rate von 0,25 μl pro Minute für 4 Minuten mit einer Infusionspumpe (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) infundiert. Die Tiere erhielten entweder: (1) 0,024 μg Kollagenase B (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) in 1 μl normaler Kochsalzlösung (Kollagenase); (2) 1 μl normale Kochsalzlösung alleine (Schein); (3) keine Behandlung (Kontrolle); oder (4) eine stereotaktisch-gelenkte Infusion von Kollagenase B wie oben, aber unmittelbar gefolgt von einem intravenösen rekombinanten menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Genentech Inc., South San Francisco, CA, 1 mg/kg in 0,2 ml normaler Kochsalzlösung), verabreicht durch eine dorsale Penisvenen-Injektion (Kollagenase + rt-PA). In den Kollagenase-, Schein- und Kollagenase + rt-PA-Gruppen wurde die stereotaktische Nadel unmittelbar nach der Infusion entfernt, und die Inzision wurde mit chirurgischen Klammern verschlossen. Gehirngewebe wurde unmittelbar nach dem schnellen anästhesierten Enthaupten gewonnen.
Hämorrhagische Konversion in einem murinen fokalen cerebralen Ischämie-Modell
Eine fokale cerebrale Ischämie wurde in den Tieren durch einen transitorischen rechten mittleren cerebralen Arterienverschluss unter Verwendung eines Verfahrens, das früher im Detail beschrieben wurde^28,29, produziert. Kurz, eine hitzeabgestumpfte 12 oder 13 mm 5-0 oder 6-0 Gauge-Nylonnaht wurde in die rechte interne Carotis-Arterie auf die Ebene der mittleren cerebralen Arterie geleitet. Nach 45 Minuten wurde die verschließende Naht entfernt, um eine Reperfusion zu reetablieren. Sofort nach dem Entfernen der verschließenden Naht erhielten die Tiere entweder intravenös den Gewebe-Plasminogen-Aktivator (10 mg/kg in 0,2 ml normaler Kochsalzlösung, Schlaganfall + rt-PA) oder normale Kochsalzlösung (Schlaganfall + Kochsalzlösung), verabreicht durch dorsale Penisvenen-Injektion. Nach 24 Stunden wurde das Gehirngewebe sofort nach einer schnellen anästhesierten Enthauptung gewonnen. Um die Wirkung von 2,3,5-Triphenyltretrazoliumchlorid (TTC) zu bewerten, das allgemein verwendet wird, um cerebrales Infarkt- und Nicht-Infarkt-Gewebe zu unterscheiden^28,30, wurden nicht manipulierte (Kontroll-) Gehirne halbiert, in 2% TTC (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) in 0,9% phosphatgepufferter Kochsalzlösung eingetaucht, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und dann präpariert, wie oben für den spektrophotometrischen Hämoglobin-Test beschrieben. Die andere Hälfte von jedem Gehirn wurde für eine identische Dauer in Kochsalzlösung eingetaucht und dann den Vorgehensweisen unterzogen, die oben für den spektrophotometrischen Hämoglobin-Test beschrieben sind.
Bestätigung des quantitativen intracerebralen Blutungstests
Der Grad der ICH wurde zuerst durch einen objektiven Beobachter visuell beurteilt. Für die visuelle Bewertung der intracerebralen Blutung in Mäusen wurden Gehirne, die von Mäusen erhalten wurden, die bis zum 24 Stunden-Zeitpunkt nach der Vorgehensweise (Kollagen-induzierte Blutung oder MCA-Verschluss) überlebt hatten, in eine Mausgehirn-Matrix (Activational Systems Inc., Warren, MI) platziert, um coronale 1 mm-Reihenschnitte zu erhalten. Die Schnitte wurden durch einen objektiven Beobachter inspiziert, und den Gehirnen wurde ein ICH-Wert von einer abgestuften Skala gegeben, die auf dem maximalen Blutungsdurchmesser basiert, der auf irgendeinem der Schnitte gesehen wird, gegeben [ICH-Wert 0, keine Blutung; 1, < 1 mm; 2, 1-2 mm; 3, > 2-3 mm; 4, > 3 mm]. Die Schnitte von jedem Gehirn wurden dann gepoolt, homogenisiert und dann gemäß den Vorgehensweisen behandelt, die oben für den spektrophotometrischen Hämoglobin-Test beschrieben sind.
Statistik
Korrelationen zwischen den visuell bestimmten ICH-Werten und den spektrophotometrischen Feststellungen der ICH wurden unter Verwendung der linearen Pearson-Korrelation mit den angezeigten Korrelations-Koeffizienten durchgeführt. Um zu etablieren, ob eine Behandlung (Kollagenase, Schein, Schlaganfall, usw.) eine signifikante Wirkung entweder auf die spektrophotometrisch oder visuell bewertete ICH hatte, wurden Vergleiche unter Verwendung eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests gemacht. Für nicht-parametrische Daten (visuelle ICH-Werte) wurde eine nicht-parametrische Analyse unter Verwendung des Mann- Whitney-Tests durchgeführt. Die Werte werden als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt, wobei ein p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wird.
Ergebnisse
Spektrophotometrischer Hämoglobin-Test
Anfängliche Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Verlässlichkeit und Wiederholbarkeit des spektrophotometrischen Hämoglobin-Tests zu bestimmen. Im ersten Satz der Experimente wurden bekannte Mengen von Hämoglobin gemäß früher veröffentlichten Vorgehensweisen zu Cyanomethämoglobin umgesetzt, und die OD wurde gemessen [35A]²⁶. In einem zweiten Satz von Experimenten wurden bekannte Mengen von autologem Blut zu fixen Volumen von frischem Gehirngewebe-Homogenat zugefügt, mit einer weiteren Behandlung der Proben, wie oben beschrieben. Diese Daten zeigen, dass die optische Dichte von Cyanomethämoglobin-enthaltenden Überständen bei 550 nm linear mit der Menge des zugefügten Blutes korrelierte [35B]. Diese Daten zeigen eng lineare Korrelationen (r = 1,00 und 0,98 für die 35A beziehungsweise 35B) sowie eine ausgezeichnete Wiederholbarkeit, beurteilt durch relativ kleine Standardfehler des Mittelwerts. Um zu etablieren, dass TTC (allgemein verwendet, um cerebrales Infarkt- von Nicht-Infarkt-Gewebe zu unterscheiden^28,30) nicht den spektrophotometrischen Hämoglobin-Test beeinflusst, wurden nicht-manipulierte (Kontroll-) Gehirne halbiert, wobei eine Hälfte der TTC-Färbe-Standardvorgehensweise ausgesetzt wurde und eine Hälfte mit Kochsalzlösung als eine Kontrolle behandelt wurde. Diese Daten (vergleiche 35B, durchgehende und gestrichelte Linien) weisen darauf hin, dass eine Vorbehandlung von Gehirngewebe mit TTC den spektrophotometrischen Hämoglobin-Test nicht beeinflusst.
Um zu bestimmen, ob dieses Verfahren in der Lage ist, eine ICH nachzuweisen, wurde der Test an einer murinen intracerebralen Blutung durchgeführt, die durch zwei unterschiedliche Vorgehensweisen verursacht wurde, intraparenchymale Kollagenase-Infusion oder mittlerer cerebraler Arterienverschluss/Reperfusion. Im ersten Vorgehen wurde Kollagenase B als eine lokale Infusion durch ein Gratloch angewendet, um die Gefäßwand zu schwächen, um eine ICH zu fördern (Koliagenase-Gruppe). Um die Neigung zu einer und den Grad der ICH weiterhin zu erhöhen, wurde ein ähnliches Vorgehen mit einer sofortigen Verabreichung von rt-PA nach dem Vorgehen durchgeführt (Kollagenase + rt-PA-Gruppe). Zwei Kontroll-Zustände wurden auch eingeschlossen, eine Schein-Operation, die Bohren des Gratlochs einschloss, aber mit einer Instillation von physiologischer Kochsalzlösung (Schein), und eine unbehandelte Gruppe (Kontrolle). Diese Versuche zeigten, dass die Kollagenase-Infusion die Menge des intracerebralen Blutes, das durch den spektrophotometrischen Test nachgewiesen wurde (insbesondere mit Kollagenase + rt-PA) im Vergleich zu den Schein-behandelten Tieren oder den normalen Kontrollen erhöht [36A].
Im zweiten und vielleicht klinisch relevanteren Verfahren zum Induzieren einer ICH wurde ein Schlaganfall durch einen transitorischen intraluminalen Verschluss der mittleren cerebralen Arterie, gefolgt von einer Reperfusion gebildet. Zusätzlich versuchten wir, die Neigung zur hämorrhagischen Konversion durch Verabreichung eines thrombolytischen Mittels zu erhöhen. Zwei Gruppen wurden untersucht, jene, die normale Kochsalzlösung erhalten hatten, oder jene, die intravenösen rt-PA sofort nach Entfernen der intraluminalen verschließenden Naht erhielten. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Zugabe eines fibrinolytischen Agens nach dem Schlaganfall die Menge der ICH erhöht, die durch den spektrophotometrischen Hämoglobin-Test nachgewiesen wird [36B]. Es ist interessant zu bemerken, dass die Grundlinien-Absorptionsfähigkeit in Tieren, die einem Schlaganfall ausgesetzt werden, niedriger ist als in Kontroll-/unbehandelten Tieren [36A und 36B]. Um weiter zu untersuchen, wie das intravaskuläre Restblut den spektrophotometrischen Hämoglobin-Test beeinflussen könnte, wurden Experimente durchgeführt, in welchen unmittelbar vor dem Enthaupten des Tiers zum Gewinnen des Gehirns eine Schädel-Perfusion von physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt wurde (verabreicht durch den linken Herzventrikel). In Kontrolltieren (n = 5), die die Kochsalzlösungs-Herzperfusion vor der Gehirngewinnung erhielten, war die mittlere optische Dichte nach der Gewebepräparation und dem spektrophotometrischen Hämoglobin-Test 0,25 ± 0,3 (dies ist niedriger als die optische Dichte, die in nicht-herzperfundierten Tieren gesehen wird, die entweder keiner oder einer Schein-Operation unterzogen wurden (n = 10, OD 0,34 ± 0,05, p = 0,05 gegenüber den herzperfundierten Kontrollen). Auf der andern Seite gab es nach dem Schlaganfall keinen Unterschied in der O.D., ob eine Kochsalzlösungs-Herzperfusion durchgeführt wurde oder nicht (0,15 ± 0,04 für Schlaganfall ohne Kochsalzlösungs-Herzperfusion, n = 5; 0,15 ± 0,03 für Schlaganfall mit Kochsalzlösungs-Herzperfusion, P = NS). Wenn Kochsalzlösungs-perfundierte Tiere mit Schlaganfall mit Kochsalzlösungs-perfundierten Tieren ohne Schlaganfall verglichen wurden, gibt es eine offensichtliche Reduktion in der OD nach dem spektrophotometrischen Hämoglobin-Test. Diese Daten würden nahe legen, dass die Tiere mit einem Schlaganfall weniger intracerebrales Blut nachgewiesen haben, vielleicht als das Ergebnis einer Reduktion der Gesamtmenge von Blut in der ipsilateralen MCA-Region nach der Ischämie.
Visueller ICH-Wert
Um den spektrophotometrischen Hämoglobin-Test weiter zu bestätigen, verglichen wir ihn mit der morphometrischen Bewertung der Blutungsgröße, die traditionell in der Literatur verwendet worden ist^31-35. Wir entwickelten ein visuelles Bewertungssystem (0-4), in dem ein objektiver Beobachter den Grad der ICH in cerebralen Reihenschnitten basierend auf dem maximalen Blutungsdurchmesser bewertete. Diese visuelle Bewertung wurde auf einer Fotographie des Gehirns durchgeführt, die unmittelbar vor der Durchführung des spektrophotometrischen Hämoglobin-Tests genommen wurde [37], sodass die zwei Techniken an denselben Proben korreliert werden konnten. Im Vergleich zu den Kontrollen, die keiner Intervention unterzogen wurden, zeigen die Tiere, die eine lokale Schein-Infusion erhielten (d.h. Gratloch + Kochsalzlösung) nur einen leichten Anstieg im visuellen ICH-Wert [38A]. Wenn jedoch entweder Kollagenase alleine oder Kollagenase + rt-PA zu der Infusion zugefügt wurde, waren die visuellen ICH-Werte signifikant erhöht [38A]. Im Schlaganfallmodell resultierte rt-PA auf ähnliche Weise in einem Anstieg im visuellen ICH-Wert [38B]. Wenn die Daten gezeichnet werden, um das Verhältnis zwischen dem visuellen ICH-Wert und der spektrophotometrischen Technik zum Quantifizieren der ICH zu zeigen, wurde eine lineare Beziehung vorgeschlagen (r = 0,88), mit kleineren Graden der Blutung (visuelle ICH-Werte von 0 oder 1) hielt diese Beziehung jedoch nicht stand [39].
Diskussion
In letzter Zeit ist es offensichtlich geworden, dass eine frühe Intervention mit bestimmten intravenösen thrombolytischen Mitteln (rt-PA) im Schlaganfall günstig sein kann, wenn sie innerhalb von 3 Stunden des Beginns der Symptome eingeleitet wird^9,10. Die Verabreichung von thrombolytischen Mitteln außerhalb dieses engen therapeutischen Fensters kann jedoch eine unannehmbar hohe Häufigkeit einer verheerenden ICH bewirken (Streptokinase gegenüber Placebo, 10 Tage-Mortalität 34% gegenüber 18,2%, p = 0,002, 6 Monate-Mortalität 73% gegenüber 59%, p = 0,06)⁷. Es bleibt daher ein klinisches Muss, optimalere Mittel zum Wiederherstellen der Perfusion zu identifizieren, die mit einem geringeren Risiko einer hämorrhagischen Konversion assoziiert sind. Um neue Mittel, die mit der Gerinnung oder fibrinolytischen Mechanismen interferieren, adäquat zu untersuchen, ist es nötig, ein objektives Mittel zum Quantifizieren des Kehrseiten-Risikos der ICH zu haben. In der experimentellen Literatur ist eine Quantifizierung der ICH entweder durch radiologische Bildgebungs-Vorgehensweisen^32-37 oder durch eine visuelle Schätzung der Menge der Blutung im post-mortem-Gehirngewebe durchgeführt worden^31-35. Diese Vorgehensweisen sind in Abhängigkeit der Zustände, die untersucht werden, von limitierter Nützlichkeit. Zum Beispiel sind die meisten radiologischen Bildgebungs-Techniken zusätzlich zu den logistischen Einschränkungen, die durch den Bedarf an hochentwickelten Instrumenten auferlegt werden, in murinen Modellen von limitierter Verwendbarkeit, was ihre Verwendung in der Bewertung von transgenen Mäusen, einem potenziell starken Instrument für die Untersuchung der Gerinnung oder von fibrinolytischen Systemen, unmöglich machen kann. Die visuelle Schätzung der ICH ist von subjektiver Natur, und wie unsere Daten zeigen, kann sie für das Nachweisen von kleinen Graden der ICH relativ ungenau sein. Darüber hinaus erlauben weder die radiologischen noch die visuellen Techniken eine genaue Quantifizierung einer ICH, wenn die hämorrhagische Region fleckig oder multifokal ist.
Die gegenwärtigen Untersuchungen wurden durchgeführt, um ein objektives Verfahren zum Quantifizieren einer ICH in Versuchstieren zu entwickeln und zu bestätigen. Die Verwendung eines spektrophotometrischen Tests für die Quantifizierung von Hämoglobin, basierend auf der Konversion von Hämoglobin zu Cyanomethämoglobin, ist früher berichtet worden^26-31. Im Gehirn ist er jedoch nach unserem besten Wissen nur in Ratten verwendet worden, um die Größe eines freien Blutgerinnsels nach seiner Entfernung von benachbartem Gehirngewebe zu messen³¹. Der spektrophotometrische Test, den wir beschreiben und bestätigen, kann in Tieren verwendet werden, die so klein wie Mäuse sind, was die Verwendung der vielen transgenen Mausstämmen erlaubt, die jetzt verfügbar sind (insbesondere jene mit Veränderungen in den thrombotischen oder fibrinolytischen Kaskaden). Darüber hinaus erlaubt dieser spektrophotometrische Test die Quantifizierung einer ICH, sogar wenn es fleckige oder multifokale Blutungen gibt, die andernfalls schwierig zu identifizieren oder isolieren sein würden. Schließlich haben wir unsere Untersuchung im Gegensatz zu der Untersuchung von Lee unter Verwendung von bekannten Mengen von Hämoglobin und autologem Blut, das mit dem Gehirngewebe gemischt wird, auf Wiederholbarkeit und Verlässlichkeit bestätigt³¹. Da das chirurgische Vorgehen, das in den Schlaganfall-Experimenten verwendet wird, die Blut-Hämoglobin-Konzentrationen nicht signifikant veränderte (Daten nicht gezeigt), kann der spektrophotometrische Hämoglobin-Test verwendet werden, um das Volumen einer intracerebralen Blutung hochzurechnen, wenn die Hämoglobin-Konzentration zur Zeit der Blutung bekannt ist.
Um den spektrophotometrischen Hämoglobin-Test für Situation zu entwickeln und zu bestätigen, die für eine klinische ICH relevant sein könnten, bildeten wir intracerebrale Blutungen durch zwei unterschiedliche Verfahren: (1) intracerebrale Injektion von Kollagenase (um die Gefäßwand zu schwächen, wie es mit einem Aneurysma oder mit einem Trauma erfolgen könnte) und (2) in einem Modell des Schlaganfalls. In beiden Fällen erhielt eine Gruppe von Tieren auch rt-PA, um das Modell am hohen Ende des Spektrums der ICH zu bestätigen. Weil es keine etablierte anerkannte Referenz-Messung der ICH in Mäusen gegeben hat, wurden unsere spektrophotometrischen Messungen mit der ICH-Größe, die unabhängig durch visuelle Bewertung bewertet wurde, verglichen. Schließlich, um den Test noch nützlicher für experimentelle Modelle des Schlaganfalls zu bestätigen, in denen die Gehirne mit Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) gefärbt sind, um das cerebrale Infarktvolumen zu quantifizieren, wurden die Gehirne der Tiere, die einem/einer MCA-Verschluss/Reperfusion unterzogen wurden, vor dem Vereinigen und Homogenisieren mit TTC gefärbt, um zu etablieren, dass das TTC-Färbungsvorgehen selbst nicht mit der Fähigkeit interferiert, die ICH durch den spektrophotometrischen Hämoglobin-Test zu quantifizieren. Diese Daten (1B) weisen darauf hin, dass es keine nachweisbare Kreuz-Interferenz zwischen den zwei Vorgehensweisen gibt, wenn sie sequenziell (zuerst TTC-Färbung, gefolgt von Homogenisierung und dem spektrophotometrischen Hämoglobin-Test) verwendet werden.
Zusätzlich zu ihrer Fähigkeit, eine ICH nachzuweisen, weisen die gegenwärtigen Untersuchungen darauf hin, dass diese Technik auch einen Hinweis auf die Menge des intravaskulären Restbluts nach der Gehirn-Gewinnung geben kann. Das Vorgehen der Schädel-Kochsalzlösungs-Perfusion verändert nicht die optische Dichte von Cyanomethämoglobin in Gehirnen, die einem Schlaganfall ausgesetzt werden, was nahe legt, dass die Menge des intravaskulären Blutes relativ gleich ist und nicht durch das Vorgehen ausgewaschen wird. In Kontrolltieren, die anderweitig unbehandelt gewesen sind, scheint die Kochsalzlösungs-Perfusionsbehandlung jedoch die optische Dichte von Cyanomethämoglobin um etwa 30% zu senken. Unsere Experimente liefern nicht den Grund für diesen Unterschied, aber man kann spekulieren, dass es nach einem Schlaganfall ein Element der/des Gefäßkonstriktion/Gefäßverschlusses im Gebiet des Infarkts gibt, das die Kochsalzlösungs-Perfusionstechnik weniger wirksam im Auswaschen des zusätzlichen intravaskulären Restbluts macht. Wenn es wirklich ein Element der Gefäßkonstriktion nach dem Schlaganfall oder einer experimentell induzierten intracerebralen Blutung gibt, kann dies auch den intravaskulären Blutpool reduzieren und so eine Gesamtsenkung der optischen Dichte erklären, wenn Kontroll- und Schlaganfall/ICH-Gehirne verglichen werden (sogar wenn ein gewisses extravaskuläres Blut in der letzteren Gruppe vorhanden ist).
Einige technische Aspekte der spektrophotometrischen Technik zum Messen einer intracerebralen Blutung verdienen es auch, erwähnt zu werden. Für die gegenwärtigen Experimente, obwohl es einen breiten Absorptionsgipfel für Cyanomethämoglobin gibt, der um 540 nm gelegen ist, maßen wir die Absorptionsfähigkeit von Cyanomethämoglobin bei 550 nm. Der Grund, warum wir dies taten, ist, dass viele Spektrophotometer fixierte Wellenlängen-Möglichkeiten in Abhängigkeit von den vorgegebenen Filtern haben, und 550 nm ist eine häufig verwendete Wellenlänge (insbesondere bei ELISA-Plattenlesegeräten). Obwohl Messungen der Absorptionsfähigkeit bei 540 nm vielleicht geringfügig höhere optische Dichte-Messungen ergeben hätten, ist der Absorptionspeak von Cyanomethämoglobin in diesem Bereich weit, und daher kann 550 nm ohne die Notwendigkeit verwendet werden, auf die Absorption von Eisen(III)- oder Eisencyanid zu korrigieren (die Extinktionskoeffizienten für Cyanomethämoglobin bei 551 nm und 540 nm sind 11,5 beziehungsweise 11,1 im Vergleich zu dem 41-fach niedrigeren Extinktionskoeffizient von Eisen(III)- oder Eisencyanid³⁸). Untersuchungen unter Verwendung eines kontinuierlichen Wellenlängen-Spektrometers (das verwendet wurde, um die OD bei 540 nm zu messen) und eines getrennten Spektrum-ELISA-Plattenlesegeräts (verwendet, um die OD bei 550 nm zu messen) gaben ähnliche Ergebnisse. Da die letztere Technik einfacher war, den Durchsatz der Vorgehensweise erhöhte und uns erlaubte, das Probenvolumen zu minimieren, wählten wir, die letztere Technik für die Untersuchungen zu verwenden, die im Ergebnis-Abschnitt gezeigt sind.
Es gibt einige potenzielle andere technische Überlegungen, die in Betracht gezogen werden sollten, wenn der spektrophotometrische Test verwendet wird. Obwohl wir gezeigt haben, dass das spektrophotometrische Verfahren im Zusammenhang mit der TTC-Färbung von cerebralen Reihenschnitten für die Infarktvolumen-Analyse verwendet werden kann, muss das Gewebe danach homogenisiert und extrahiert werden, was den Gewebeaufbau zerstört und eine weitere histologische Charakterisierung unmöglich macht. Es ist möglich, dass diese Technik den Grad der ICH überschätzen kann, wenn extracerebrales Blut unbeabsichtigt während der Gehirn-Gewinnung eingeschlossen wird, oder die Technik kann den Grad der ICH unterschätzen, wenn epidurales, subdurales oder subarachnoidales Restblut am Schädeldach anhaften bleibt, das während des Vorgangs der Gehirnentfernung verworfen wird.
Aufgrund des Wesens der Messtechnik, in der das Licht bei einer bestimmten Wellenlänge entlang eines festgesetzten Längenpfads absorbiert wird, kann alles, was eine Trübung des homogenisierten Gehirnüberstands bewirkt, die OD-Ablesung erhöhen. Dies kann Lipide, abnormale Plasmaproteine und Erythrocyten-Stroma einschließen. In der Tat haben wir in Vor-Experimenten gefunden, dass die ODs fehlerhaft erhöht waren, wenn die Zentrifugation unzureichend war und etwas der Lipidschicht in den Test eingeschlossen war. Freie Pyridine können das Absorptionsspektrum von Cyanomethämoglobin verändern, und es gibt das Potenzial für andere Hämochromogene, auch mit dem Drabkin-Reagenz zu reagieren³⁹. Diese Reaktionen sollten jedoch nach unserem Wissen nicht in einem signifikanten Ausmaß mit der Bestimmung des/der intracerebralen Bluts/Blutung interferieren.
Zusammengefasst illustrieren die gegenwärtigen Daten, wie ein einfacher und kostengünstiger spektrophotometrischer Test für Hämoglobin ein nützliches Verfahren zum Quantifizieren einer ICH liefern kann. Diese Technik sollte sich als besonders nützlich erweisen, um das hämorrhagische Potenzial von neu entwickelten thrombolytischen oder antikoagulatorischen Therapien für die Behandlung des Schlaganfalls zu bewerten.
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Beispiel 13: Der an der aktiven Stelle blockierte Faktor IXa limitiert eine mikrovaskuläre Thrombose und cerebrale Verletzung im murinen Schlaganfall ohne Erhöhen der intracerebralen Blutung
Zusammenfassung
Das klinische Dilemma in der Schlaganfall-Behandlung ist, dass Mittel, die die vaskuläre Durchgängigkeit wiederherstellen, das Risiko einer intracerebralen Blutung erhöhen. Der an der aktiven Stelle blockierte Faktor IXa (IXai), der aus gereinigtem Faktor IXa durch Dansylierung seiner aktiven Stelle gebildet wird, konkurriert mit dem natürlichen Faktor IXa, um die Anordnung des Faktor IXa in den Aktivierungskomplex des intrinsischen Faktors X zu inhibieren. Wenn sie mit Faktor IXai vorbehandelt wurden, zeigten Mäuse, die einer fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion ausgesetzt waren, reduziertes mikrovaskuläres Fibrin und eine reduzierte Blutplättchen-Ablagerung, eine erhöhte cerebrale Perfusion und signifikant kleinere cerebrale Infarkte als Vehikel-behandelte Kontrollen. Der Faktor IXai-vermittelte Gehirn-Schutz war dosisabhängig, bei therapeutisch wirksamen Dosen nicht mit einer intracerebralen Blutung assoziiert und wurde sogar gesehen, wenn der Faktor IXai nach dem Beginn der cerebralen Ischämie verabreicht wurde. Die Verabreichung von Faktor IXai repräsentiert eine neue Strategie, um einen Schlaganfall in Entwicklung zu behandeln, ohne das Risiko einer intracerebralen Blutung zu erhöhen.
Einleitung
Die zeitgerechte Re-Etablierung des Blutflusses in das ischämische Gehirn stellt das gegenwärtige Behandlungs-Muster für einen akuten Schlaganfall dar^1-3. Die Verabreichung eines thrombolytischen Mittels, sogar wenn es unter optimalen Bedingungen gegeben wird, muss nicht dieses erwünschte klinische Ergebnis erzielen. Die Perfusion versagt oft, zu denen präischämischen Spiegeln zurückzukehren (postischämische Hypoperfusion), was nahe legt, dass eine ischämische Verletzung nicht nur durch den ursprünglichen Verschluss produziert wird, sondern dass es auch ein Element des mikrozirkulatorischen Versagens gibt. Zusätzlich ist die Thrombolyse des akuten Schlaganfalls mit einem erhöhten Risiko einer intracerebralen Blutung (ICH) assoziiert^1-4, was darauf hinweist, dass ein deutlicher Bedarf bleibt, neue Mittel zu identifizieren, die eine Reperfusion fördern können, ohne das Risiko einer ICH zu erhöhen.
Nach einem ischämischen Ereignis ist die Gefäßwand von ihrem ruhenden, anti-adhäsiven, antithrombotischen Status zu einem umgewandelt, der die Leukocyten-Adhäsion und Thrombose fördert. Im akuten Schlaganfall potenziert die aktive Rekrutierung von Leukocyten durch Adhäsionsrezeptoren, die in den ipsilateralen Mikrogefäßen exprimiert werden, wie ICAM-1⁵ und P-Selectin⁶ die postischämische Hypoperfusion. Experimente mit Mäusen, die für jedes dieser Gene deletionsmutant waren, zeigten jedoch, dass der postischämische cerebrale Blutfluss (CBF) sogar in ihrer Abwesenheit nur teilweise zur Grundlinie zurückkehrt, was das Vorliegen von zusätzlichen Mechanismen nahe legt, die für einen postischämischen cerebrovaskulären Nicht-Rückfluss verantwortlich sind. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde die erste Gruppe von Experimenten gestaltet, um die Hypothese zu testen, dass eine lokale Thrombose im Bereich der Mikrogefäße (distal der Stelle des primären Verschlusses) im Schlaganfall erfolgt.
Um die schädlichen Konsequenzen einer mikrovaskulären Thrombose im Schlaganfall zu bewerten, testete die zweite Gruppe von Experimenten die Hypothese, dass eine selektive Blockade des intrinsischen Signalswegs der Gerinnung die mikrovaskuläre Thrombose limitieren könnte und dadurch das Gehirn im Schlaganfall schützt. Die Strategie der selektiven Inhibition des intrinsischen Signalwegs der Gerinnung wurde gewählt, da sie primär für die intravaskuläre Thrombose verantwortlich ist. Heparin, Hirudin und fibrinolytische Mittel interferieren mit dem endgültigen gemeinsamen Signalweg der Gerinnung, um die Bildung von Fibrin zu inhibieren oder dessen Lyse zu beschleunigen, und erhöhen daher die Neigung zur ICH. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine selektive Blockade der IXa/VIIIa/X-Aktivierungskomplex-Anordung einen neuen Mechanismus liefern könnte, um die intravaskuläre Thrombose zu limitieren, während die Mechanismen der extravaskulären Hämostase durch den extrinsischen/Gewebefaktor-Signalweg der Gerinnung, der im Infarkt-Gehirngewebe oder den benachbarten Regionen, wo kleine Gefäße brüchig sind und zu einer Ruptur neigen, kritisch sein kann, bewahrt werden. Wir verwendeten eine neue Strategie, in der ein kompetitiver Inhibitor von Faktor IXa (an der aktiven Stelle blockierter IXa, oder IXai) an Mäuse gegeben wurde, die einem Schlaganfall ausgesetzt waren, um die Hypothese zu testen, dass er das Schlaganfallergebnis verbessern würde, ohne die ICH zu erhöhen.
Verfahren
Murines Schlaganfall-Modell: Eine transitorische fokale cerebrale Ischämie wurde in Mäusen durch intraluminalen Verschluss der mittleren cerebralen Arterie (45 Minuten) und Reperfusion (22 h) induziert, wie früher berichtet⁷. Reihenmessungen des relativen cerebralen Blutflusses (CBF) wurden durch Laser-Doppler-Flussmessungen aufgezeichnet⁷, und die Infarktvolumen (% ipsilaterale Hemisphäre) durch planimetische/volumetrische Analyse von Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-gefärbten cerebralen Reihenschnitten bestimmt⁷.
¹¹¹Indium-Blutplättchen-Untersuchungen: Die Blutplättchen-Akkumulierung wurde unter Verwendung von ¹¹¹Indium-markierten Blutplättchen bestimmt, die gewonnen und präpariert wurden, wie früher beschrieben⁸. Unmittelbar vor der Operation wurden den Mäusen intravenös 5 × 10⁶ ¹¹¹In-markierte Blutplättchen gegeben; die Ablagerung wurde nach 24 Stunden als ipsilaterale cpm/kontralaterale cpm quantifiziert.
Fibrin-Immunblotten/Immunfärbung: Die Akkumulierung von Fibrin wurde nach der Tötung (von vollständig heparinisierten Tieren) unter Verwendung der Immunblot/Immunfärbe-Vorgehensweisen gemessen, die früher beschrieben und bestätigt worden sind⁹. Da Fibrin äußerst unlöslich ist, wurden die Gehirngewebeextrakte durch Plasmin-Verdau hergestellt, dann für die Elektrophorese auf ein SDS-Polyacrylamid-Standardgel aufgetragen, gefolgt von einem Immunblotten unter Verwendung eines polyclonalen Kaninchen-anti-Mensch-Antikörpers, der gegen die Gamma-Gamma-Kettendimere, die in vernetztem Fibrin vorhanden sind, hergestellt wurde und der murines Fibrin mit einer relativ geringen Kreuzreaktivität mit Fibrinogen nachweisen kann¹⁰. Die Fibrin-Akkumulierung wurde als ein ipsilateral zu kontralateral-Verhältnis angegeben. In zusätzlichen Experimenten wurden Gehirne in Paraffin eingebettet, geschnitten und unter Verwendung desselben anti-Fibrin-Antikörpers immungefärbt.
Spektrophotometrischer Hämoglobin-Test und visueller ICH-Wert: Die ICH wurde durch einen spektrophotometrisch-basierenden Test quantifiziert, den wir entwickelt und bestätigt haben^11,12. Kurz, Maus-Gehirne wurden homogenisiert, mit Ultraschall behandelt, zentrifugiert und das Methämoglobin in den Überständen wurde zu Cyanomethämoglobin umgewandelt (unter Verwendung des Drabkin-Reagenz), dessen Konzentration durch Messen der O.D. bei 550 nm gegen eine Standardkurve bewertet wurde, die mit bekannten Mengen an Hämoglobin erzeugt wurde. Das visuelle Bewerten der ICH wurde auf coronalen 1 mm-Reihenschnitten basierend auf dem maximalen Blutungsdurchmesser, der auf irgendeinem der Schnitte gesehen wurde, durch einen objektiven Beobachter durchgeführt [ICH-Wert 0, keine Blutung; 1, < 1 mm; 2, 1-2 mm; 3, > 2-3 mm; 4, > 3 mm].
Herstellung von Faktor IXai 13: Faktor IXai wurde durch selektives Modifizieren der aktiven Stelle des Histidinrests auf dem Faktor IXa unter Verwendung von Dansylglu-gly-arg-chlormethylketon hergestellt. Proplex wurde auf eine präparative Säule aufgetragen, die einen immobilisierten Calcium-abhängigen monoclonalen Antikörper gegen Faktor IX enthält. Die Säule wurde gewaschen, mit EDTA-enthaltendem Puffer eluiert, und der Faktor IX im Eluat (bestätigt als eine einzelne Bande auf SDS-PAGE) wurde dann durch Auftragen von Faktor XIa aktiviert (Inkubieren in der Anwesenheit von CaCl₂). Man ließ den gereinigten Faktor IXa mit einem 110-fach molaren Überschuss von Dansyl-glu-gly-arg-chlormethylketon reagieren und das Gemisch wurde dann dialysiert. Das Endprodukt (IXai), dem die prokoagulierende Aktivität fehlt, wandert auf SDS-PAGE identisch zu IXa. Dieses Material (Faktor IXai) wurde dann nach einer Filtration (0,2 μm) und Chromatographie auf DeToxi-Gelsäulen, um jegliche Endotoxin-Spurenkontamination zu entfernen, für Experimente verwendet (in Proben-Aliquots gab es kein nachweisbares Lipopolysaccharid). IXai wurde anschließend bis zur Zeit der Verwendung bei -80°C in Aliquots eingefroren. Für jene Experimente, in denen IXai verwendet wurde, wurde es als ein einzelner intravenöser Bolus zu den angezeigten Zeiten und in den angegebenen Dosen gegeben.
Ergebnisse
Um in einem murinen Modell einen Schlaganfall zu bilden, wird eine Naht in die cerebralen Gefäße eingebracht, so dass sie die Öffnung der rechten mittleren cerebralen Arterie verschließt, was das entgegengesetzte Gebiet ischämisch macht. Durch Entfernen der Naht nach einem 45 Minuten-Zeitraum des Verschlusses wird ein reperfundiertes Modell des Schlaganfalls gebildet; Mäuse, die so behandelt werden, zeigen fokale neurologische Ausfälle sowie scharf umrissene Gebiete eines cerebralen Infarkts. Da die verschließende Naht nicht über den Hauptgefäß-Zufluss (die mittlere cerebrale Arterie) hinaus fortschreitet, liefert dieses Modell eine ausgezeichnete Möglichkeit, „stromabwärts liegende" Vorgänge zu untersuchen, die in Antwort auf den Zeitraum des unterbrochenen Blutflusses innerhalb der cerebralen Mikrogefäße erfolgen. Unter Verwendung dieses Modells wurde die Rolle der Mikrogefäß-Thrombose wie folgt untersucht. Um zu zeigen, dass innerhalb der ischämischen cerebralen Hemisphäre Blutplättchen-reiche thrombotische Foci auftreten, wurden ¹¹¹In-markierte Blutplättchen unmittelbar vor dem Einbringen der intraluminalen verschließenden Naht an Mäuse verabreicht, um ihre Ablagerung während der darauf folgenden Periode der cerebralen Ischämie und Reperfusion zu verfolgen. In Tieren, die keiner chirurgischen Vorgehensweise ausgesetzt wurden, um einen Schlaganfall zu bilden, war die Anwesenheit der Blutplättchen ungefähr gleich zwischen den rechten und linken Hemisphären, wie es erwartet werden würde [40A, linke Säule]. Wenn die Tiere jedoch einem Schlaganfall ausgesetzt wurden (und nur Vehikel erhielten, um nachfolgende Experimente zu überprüfen), akkumulierten die radioaktiv markierten Blutplättchen vorzugsweise in der ischämischen (ipsilateralen) Hemisphäre im Vergleich zu einer signifikant geringeren Ablagerung in der kontralateralen (nicht-ischämischen) Hemisphäre [40A, mittlere Säule]. Diese Daten unterstützen das Auftreten von Blutplättchen-reichen Thromben im ischämischen Gebiet. Wenn der Faktor IXai vor dem Einbringen der intraluminalen verschließenden Naht an Tiere verabreicht wird, gibt es eine signifikante Reduktion in der Akkumulierung von radioaktiv markierten Blutplättchen in der ipsilateralen Hemisphäre [40A, rechte Säule].
Ein anderer Weg des Nachweises unterstützt auch das Auftreten einer Mikrogefäß-Thrombose im Schlaganfall. Diese Daten kommen von dem Immunnachweis von Fibrin unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen ein Neo-Epitop auf dem Gamma-Gamma-Ketten-Dimer von vernetztem Fibrin gerichtet ist. Immunblots zeigen eine Bande von erhöhter Intensität in der ipsilateralen (rechten) Hemisphäre von Vehikel-behandelten Tieren, die einer fokalen cerebralen Ischämie und Reperfusion ausgesetzt waren [40B, „Vehikel"]. In Tieren, die vor dem Schlaganfall mit dem Faktor IXai (300 μg/kg) behandelt wurden, gibt es keinen offensichtlichen Anstieg in der ipsilateralen Akkumulierung von Fibrin [40B, „Faktor IXai"]. Um zu zeigen, dass die Fibrin-Akkumulierung aufgrund der Ablagerung von intravaskulärem Fibrin erfolgte (statt durch nicht-spezifische Permeabilitätsänderungen und Ausgesetztsein gegenüber der subendothelialen Matrix), lokalisierte eine Fibrin-Immunfärbung das erhöhte Fibrin deutlich in den Lumen der ipsilateralen intracerebralen Mikrogefäße [40C].
Um zu untersuchen, ob der Faktor IXai die intracerebrale Thrombose limitieren und die Perfusion wiederherstellen kann, wurde IXai unmittelbar vor dem Schlaganfall an Mäuse gegeben (300 μg/kg). Diese Experimente zeigen durch Immunfärbung sowohl eine Reduktion in der ¹¹¹In-Blutplättchen-Akkumulierung in der ipsilateralen Hemisphäre [41A] als auch ein vermindertes Auftreten von intravaskulärem Fibrin. Darüber hinaus gibt es einen signifikanten Anstieg im CBF nach 24 Stunden, was die Wiederherstellung der mikrovaskulären Durchgängigkeit durch Faktor IXai nahe legt [41A]. Die klinische Relevanz dieser Beobachtung wird durch die Fähigkeit von Faktor IXai unterstrichen, die cerebralen Infarktvolumen zu reduzieren [41B]. Diese günstigen Wirkungen von Faktor IXai waren dosisabhängig, wobei 600 μg/kg die optimale Dosis ist [41C]. Da die Entwicklung einer ICH ein Hauptbedenken mit jeder antikoagulierenden Strategie im Rahmen eines Schlaganfalls ist, wurde die Wirkung von IXai auf die ICH unter Verwendung unseres kürzlich bestätigten spektrophotometrischen Verfahrens zum Quantifizieren einer ICH^11,12 gemessen. Diese Daten weisen darauf hin, dass es bei den niedrigsten Dosen (und den wirksamsten) keinen signifikanten Anstieg in der ICH gibt [42A]. Bei der höchsten getesteten Dosis (1200 μg/kg) gibt es einen Anstieg in der ICH, was durch ein semiquantitatives visuelles Bewertungsverfahren, das wir auch kürzlich berichtet haben^11,12, bekräftigt wurde [42B].
Da die Therapien, die auf das Verbessern des Ergebnisses von einem akuten Schlaganfall gerichtet sind, nach der klinischen Vorstellung gegeben werden müssen, und da Fibrin fortfährt, sich nach dem anfänglichen ischämischen Ereignis im Schlaganfall zu bilden, testen wir, ob IXai wirksam sein könnte, wenn es nach dem Beginn der cerebralen Ischämie gegeben wird. IXai, das nach dem mittleren cerebralen Arterienverschluss (nach dem Entfernen der verschließenden Naht) gegeben wurde, lieferte einen signifikanten cerebralen Schutz, bewertet durch seine Fähigkeit, die cerebralen Infarktvolumen im Vergleich zu Vehikel-behandelten Kontrollen signifikant zu reduzieren [43].
Diskussion
Die Daten in diesen Untersuchungen zeigen einen klaren Hinweis auf eine intravaskuläre Thrombus-Bildung (sowohl Blutplättchen als auch Fibrin) innerhalb der postischämischen cerebralen Mikrogefäße. Die pathophysiologische Relevanz der Mikrogefäß-Thrombose im Schlaganfall wird durch die Fähigkeit des Faktor IXai unterstrichen, die Mikrogefäß-Thrombose zu reduzieren (sowohl die Blutplättchen- als auch die Fibrin-Akkumulierung sind reduziert, mit einem begleitenden Anstieg im postischämischen CBF) und das Schlaganfallergebnis zu verbessern. Diese starken antithrombotischen Wirkungen von Faktor IXai sind wahrscheinlich im Rahmen des Schlaganfalls klinisch signifikant, weil der Faktor IXai nicht nur die Infarktvolumen in einer dosisabhängigen Weise reduziert, sondern er tut dies sogar, wenn er nach dem Beginn des Schlaganfalls gegeben wird. Zusätzlich bewirkt die Behandlung mit Faktor IXai in klinisch relevanten Dosen keinen Anstieg in der ICH, was eine selektive Inhibierung der Faktor IXa/VIIIa/X-Aktivierungskomplex-Anordnung mit dem Faktor IXai ein attraktives Ziel für die Schlaganfall-Therapie in Menschen macht.
Es gibt eine Reihe von Gründen, warum gezielte antikoagulatorische Strategien aufgrund ihres kontroversen Erfolges in klinischen Versuchen eine attraktive Alternative zu der gegenwärtigen Verwendung von thrombolytischen Mitteln in der Handhabung des akuten Schlaganfalls sein könnte. Theoretisch würde eine ideale Behandlung für einen akuten Schlaganfall die Bildung des Fibrin-Blutplättchen-Netzes, das die mikrovaskuläre Thrombose in der ischämischen Zone verursacht, verhindern oder dessen Auflösung induzieren, ohne das Risiko einer intracerebralen Blutung zu erhöhen. Die thrombolytischen Mittel, die in klinischen Versuchen des akuten Schlaganfalls untersucht worden sind, haben jedoch konsistent das Risiko einer intracerebralen Blutung erhöht^1-4. Streptokinase, die in den ersten paar (<6) Stunden nach dem Beginn des Schlaganfalls gegeben wurde, war mit einer erhöhten Rate einer hämorrhagischen Transformierung (bis zu 67%) assoziiert; obwohl es eine erhöhte frühe Mortalität gab, litten die überlebenden Patienten weniger an einer Rest-Behinderung. Die Verabreichung von Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator (tPA) innerhalb von 7 Stunden (besonders innerhalb von 3 Stunden) des Schlaganfall-Beginns resultierte in einer erhöhten frühen Mortalität und erhöhten Raten einer hämorrhagischen Konversion (zwischen 7-20%), obwohl die Überlebenden eine geringere Rest-Behinderung zeigten. Um verbesserte antikoagulatorische oder thrombolytische Therapien zu entwickeln, sind einige Tiermodelle des Schlaganfalls untersucht worden. Diese Modelle bestehen im Allgemeinen aus der Verabreichung von geronnenem Blut in die interne Carotis-Arterie, gefolgt von der Verabreichung eines thrombolytischen Mittels. In Ratten verbesserte eine tPA-Verabreichung innerhalb von 2 Stunden des Schlaganfalls den cerebralen Blutfluss und reduzierte die Infarktgröße um bis zu 77%^14,15. In einem ähnlichen Kaninchenmodell des embolischen Schlaganfalls war tPA wirksam im Wiederherstellen des Blutflusses und Reduzieren der Infarktgröße, mit einem gelegentlichen Auftreten einer intracerebralen Blutung^16,17. Obwohl es Vorteile einer sofortigen Gerinnsel-Auflösung gibt, weisen diese Untersuchungen (so wie die klinischen Versuche von thrombolytischen Mitteln) dennoch darauf hin, dass es ein begleitendes erhöhtes Risiko einer intracerebralen Blutung mit diesem therapeutischen Ansatz gibt.
Aufgrund des gewöhnlich steilen Beginns des ischämischen Schlaganfalls ist eine Therapie vorwiegend in Richtung Lysieren der wesentlichen fibrinösen/atheroembolischen Ablagerung, der einen wesentlichen vaskulären Zufluss zum Gehirn verschließt, angezielt worden. Wie jedoch die gegenwärtige Arbeit zeigt, gibt es eine wichtige Komponente der mikrovaskulären Thrombose, die stromabwärts der Stelle des ursprünglichen Verschlusses erfolgt und die wahrscheinlich von beträchtlicher pathophysiologischer Signifikanz für die postischämische Hypoperfusion (den Nicht-Rückfluss) und die cerebrale Verletzung im entstehenden Schlaganfall ist. Diese Daten sind in ausgezeichneter Übereinstimmung mit jenen, die früher berichtet worden sind, in denen Mikrothromben topographisch zu der ischämischen Region in frischen Gehirninfarkten lokalisiert worden sind¹⁸. Die Verwendung eines Mittels, das die Anordnung des Faktor IXa/VIIIa/X-Aktivierungskomplex inhibiert, repräsentiert einen neuen Ansatz, die Thrombose, die in den mikrovaskulären Lumen erfolgt, zu limitieren ohne die extravaskuläre Hämostase zu beeinträchtigen, deren Beibehalten kritisch für das Verhindern einer ICH sein kann. In den gegenwärtigen Untersuchungen reduziert die Behandlung mit Faktor IXai die mikrovaskuläre Blutplättchen- und Fibrin-Akkumulierung, verbessert den postischämischen cerebralen Blutfluss und reduziert die cerebralen Infarktvolumen im Rahmen des Schlaganfalls, ohne die ICH zu erhöhen.
Die Potenz von Faktor IXai als ein antikoagulierendes Agens stammt von der integralen Rolle des aktivierten Faktor IX in der Gerinnungskaskade. Eine Strategie der Faktor IXa-Blockade scheint nicht nur im Rahmen des Schlaganfalls wirksam zu sein, sondern sie scheint auch beim Verhindern eines progressiven Coronar- Arterienverschlusses, der nach der anfänglichen Anwendung eines elektrischen Stroms auf die linke gekrümmte Coronar-Arterie in Hunden induziert wurde¹³, wirksam zu sein. Wie in jenen Untersuchungen, in denen der Faktor IXai nicht die aktivierte teilweise Thromboplastin-Zeit (APTT) verlängerte (224), veränderte im murinen Modell die Verabreichung von Faktor IXai in der therapeutisch wirksamen Dosis von 300 μg/kg in ähnlicher Weise weder die Vorzeit noch die APTT signifikant [13,4 ± 0,7 und 79,9 ± 8,9 gegenüber 12,1 ± 0,7 und 70,6 ± 8,9 für PT und APTT von IXai-behandelten (n = 7) beziehungsweise Vehikel-behandelten (n = 4) Mäusen, P = NS)].
Die Daten, die zeigen, dass IXai, das nach dem Beginn des Schlaganfalls gegeben wurde, wirksam ist, führen zu einer anderen interessanten Hypothese, dass die Bildung eines Thrombus ein dynamisches Gleichgewicht zwischen den Vorgängen der anhaltenden Thrombose und anhaltenden Fibrinolyse darstellt. Sogar unter normalen (nicht-ischämischen) Bedingungen ist von diesem dynamischen Gleichgewicht gezeigt worden, dass es beim Menschen vorkommt¹⁹. Die Daten in den gegenwärtigen Untersuchungen, die zeigen, dass der Faktor IXai wirksam ist, sogar wenn er nach dem Beginn des Schlaganfalls verabreicht wird, legen nahe, dass diese Strategie das dynamische Gleichgewicht, das nach der cerebralen Ischämie auf die Seite der Thrombose verschoben ist, wieder zurück zu einem mehr ruhenden (antithrombotischen) Gefäßwand-Phänotyp herstellt.
Als ein letzter Gesichtspunkt, sogar wenn die Thrombolyse erfolgreich den verschließenden Hauptthrombus entfernt und/oder antikoagulierende Strategien wirksam sind, um eine fortschreitende mikrozirkulatorische Thrombose einzuschränken, versagt der Blutfluss normalerweise, zu den Spiegeln vor der Ischämie zurückzukehren. Dies wird durch die Daten in der gegenwärtigen Untersuchung beispielhaft dargelegt, in der, obwohl der CBF deutlich durch den Faktor IXai (der die Fibrin/Blutplättchen-Akkumulierung einschränkt) verbessert wird, der CBF trotzdem nicht zu den Spiegeln vor der Ischämie zurückkehrt. Diese Daten unterstützen die Existenz von mehreren Effektor-Mechanismen für die postischämische cerebrale Hypoperfusion, einschließlich der postischämischen Neutrophilen-Akkumulierung und der folgenden mikrovaskulären Verstopfung, wobei die P-Selectin- und ICAM-1-Expression durch die cerebralen mikrovaskulären endothelialen Zellen in dieser Hinsicht besonders relevant sind^5,6. Wenn sie vom Gesichtspunkt der Leukocyten-Adhäsionsrezeptor-Expression betrachtet werden, sogar wenn diese Adhäsionsrezeptoren fehlen, sind die CBF-Spiegel nach dem Schlaganfall im Vergleich zu den Kontrollen verbessert, kehren jedoch nicht zu den Spiegeln vor der Ischämie zurück. Zusammengefasst legen diese Daten nahe, dass eine mikrovaskuläre Thrombose und die Leukocyten-Adhäsion zusammen zu der postischämischen cerebralen Hypoperfusion beitragen.
Zusammengefasst stellt die Verabreichung eines kompetitiven Inhibitors von Faktor IXai, dem an der aktiven Stelle blockierten Faktor IXa, eine neue Therapie für die Behandlung des Schlaganfalls dar. Diese Therapie reduziert nicht nur die mikrozirkulatorische Thrombose, verbessert den postischämischen cerebralen Blutfluss und reduziert die cerebrale Gewebeverletzung nach dem Schlaganfall, sondern sie kann dies tun, sogar wenn sie nach dem Beginn der cerebralen Ischämie gegeben wird und ohne das Risiko einer ICH zu erhöhen. Diese Kombination von günstigen Eigenschaften und das relativ geringe Schattenseiten-Risiko der hämorrhagischen Transformierung macht dies einen äußerst attraktiven Ansatz für weiteres Testen und potenzielle klinische Versuche im menschlichen Schlaganfall.
Bezugnahmen

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Claims

Verwendung eines Gases, umfassend Kohlenmonoxid in einer ausreichenden Menge für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung einer ischämischen Erkrankung über einen ausreichenden Zeitraum in einem Individuum.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Menge an Kohlenmonoxid 0,0001% Kohlenmonoxid bis 2% Kohlenmonoxid in einem inerten Gas umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das inerte Gas Luft, Sauerstoff, Argon oder Stickstoff umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Arzneimittel für die Inhalation angepasst ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Arzneimittel angepasst ist, um es außerhalb des Körpers Blut oder Körperflüssigkeiten auszusetzen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die ischämische Erkrankung eine periphere Gefäßerkrankung, venöse Thrombose, Lungenembolie, einen Herzinfarkt, eine transitorische ischämische Attacke, Lungenischämie, instabile Angina, einen reversiblen ischämischen neurologischen Ausfall, eine zusätzliche thrombolytische Aktivität, einen Zustand übermäßiger Gerinnung, Sichelzellanämie oder einen Schlaganfall umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei sich das Individuum einer Operation unterzieht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Herzoperation, Lungenoperation, Spinaloperation, Gehirnoperation, Gefäßoperation, Bauchoperation oder Organtransplantationsoperation.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Organtransplantationsoperation eine Herz-, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen- oder Lebertransplantationsoperation umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Zeitraum etwa einen Tag vor der Operation bis etwa einen Tag nach der Operation umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Zeitraum etwa 12 Stunden vor der Operation bis etwa 12 Stunden nach der Operation umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Zeitraum etwa 12 Stunden vor der Operation bis etwa 1 Stunde nach der Operation umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Zeitraum etwa 1 Stunde vor der Operation bis etwa 1 Stunde nach der Operation umfasst.