PT951292E

PT951292E - Métodos de tratamento de uma perturbação isquémica e de melhoria das consequências de acidente vascular cerebral.

Info

Publication number: PT951292E
Application number: PT97944453T
Authority: PT
Inventors: David Stern; Ann Marie Schmidt; David J Pinsky; Eric A Rose; E Sander Connoly; Robert A Solomon; Charles J Prestigiacomo
Original assignee: Univ Columbia
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-25
Publication date: 2007-06-18
Also published as: EP1829550A3; CA2266640A1; DE69737562D1; CA2266640C; JP2001501612A; ES2285740T3; DK0951292T3; EP0951292B1; ATE358492T1; WO1998013058A1; EP0951292A1; DE69737562T2; EP1829550A2; AU4594297A; EP0951292A4

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODOS DE TRATAMENTO DE UMA PERTURBAÇÃO ISQUÉMICA E DE MELHORIA DAS CONSEQUÊNCIAS DE ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL" A invenção aqui revelada teve o apoio governamental ao abrigo do projecto HL55397 dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue do Departamento de Saúde e Serviços Humanos. Em conformidade, o Governo dos E.U.A. tem certos direitos nesta invenção.

Ao longo desta candidatura referem-se várias publicações para descrever de forma mais completa a técnica actual tal como é conhecida dos experimentados na área até à data da invenção aqui descrita e reivindicada.

Contexto da Invenção 0 tratamento de perturbações isquémicas tem sido assunto de investigação desde há muito anos. A disponibilidade recente de ratinhos transgénicos conduziu a um número crescente de relatos que descrevem os efeitos de produtos de genes específicos na patofisiologia do acidente vascular cerebral. Apesar de modelos de isquemia cerebral focal em ratos terem sido extensamente descritos, são escassas as descrições de um modelo murino de oclusão da artéria cerebral média e continuam indefinidas fontes de potencial variabilidade experimental. 0 recrutamento agudo de neutrófilos para tecido cardíaco ou pulmonar pós-isquémico tem efeitos prejudiciais no periodo inicial de reperfusão, mas os mecanismos e efeitos do influxo de neutrófilos na patogénese do acidente vascular cerebral em progressão permanecem controversos. 2

Resumo da Invenção A presente invenção proporciona a utilização de um gás que compreende monóxido de carbono numa quantidade suficiente para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento ou prevenção de uma perturbação isquémica durante um período de tempo suficiente num sujeito.

Outras especificações preferidas da presente invenção são caracterizadas aqui e nas reivindicações.

Descrição Breve das Figuras

Figura 1. Acumulação de neutrófilos após isquemia cerebral focal e reperfusão no ratinho. Efectuou-se oclusão da artéria cerebral média direita durante 45 minutos, seguida de 23 horas de reperfusão em ratinhos C57B1/J6 machos. Uma hora antes da oclusão da artéria cerebral média, inj ectaram-se na veia da cauda ~ 3,3 x 105 neutrófilos etiquetados com 111In. Obtiveram-se as contagens ipsilateral (hemisférica direita) e contralateral (hemisférica esquerda), tendo sido normalizadas por grama de tecido. (n=7, **=p < 0,01).

Figuras 2A, 2B, 2C e 2D. Efeito da depleção pré-operatória de neutrófilos nos índices das consequências de acidente vascular cerebral. Ratinhos machos C57B1/J6 foram submetidos a oclusão transitória da artéria cerebral média como descrito acima (Tipo Selvagem, n=16), tendo sido comparada com um procedimento semelhante realizado em ratinhos submetidos a depleção imunológica de neutrófilos durante os três dias antes do dia da cirurgia (PMN -, n=18). Fig. 2A. Volumes de enfarte, calculados com base em secções cerebrais em série coradas com TTC e expressos como % do volume hemisférico ipsilateral. Fig. 2B. Pontuação de 3 deficiências neurológicas, avaliadas antes da anestesia 24 horas após a oclusão transitória da artéria cerebral média; 4 representa as deficiências neurológicas mais graves. Fig. 2C. Fluxo de sangue cerebral, medido por medições de fluxo por Doppler de laser 2 mm posterior ao bregma, expresso como % do fluxo de sangue hemisférico contralateral. Fig. 2D. Mortalidade às 24 horas após oclusão transitória da artéria cerebral média (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001).

Figura 3. Expressão de transcritos da Molécula de Adesão Intercelular-1 (ICAM-1) 24 horas após oclusão da artéria cerebral média. Preparou-se RNA dos hemisférios ipsilateral (com enfarte) e contralateral (sem enfarte) do mesmo ratinho e carregou-se um gel de agarose com 20 μg de RNA total por via. Após transferência durante a noite para uma membrana de nylon, a coloração "Northern" foi avaliada com um cDNA de ICAM-1 murino de 1,90 kb etiquetado com 32P 33. Para controlo utilizou-se uma sonda de β-actina.

Figuras 4A e 4B. Expressão do antigene da Molécula de Adesão Intercelular-1 (ICAM-1) na rede microvascular cerebral 24 horas após oclusão da artéria cerebral média. Obteve-se uma secção coronal do cérebro para imunocoloração de ICAM-1, de modo a ser possível comparar os hemisférios sem enfarte e com enfarte do mesmo cérebro em condições idênticas de coloração. A coloração foi efectuada utilizando um anticorpo anti-ICAM-1 murina de rato, em que os sítios de ligação do anticorpo primário foram visualizados por fosfatase alcalina. Fig. 4A. Micro-vaso cerebral na secção contralateral (sem enfarte) de um cérebro obtido 24 horas após oclusão da artéria cerebral média. Fig. 4B. Micro-vaso cerebral do hemisfério 4 ipsilateral (com enfarte) da mesma secção do cérebro apresentada na Fig. 4A. Células endoteliais de micro-vasos cerebrais ipsilaterais exibem expressão aumentada de ICAM-1 (coloração vermelho brilhante). Ampliação 250X.

Figuras 5A e 5B. Anatomia cerebrovascular em ratinhos homozigóticos nulos para ICAM-1 (Fig. 5B) e controlos de tipo selvagem (Fig. 5A). A coloração com tinta da índia da anatomia cerebrovascular com uma perspectiva inferior do Círculo de Willis mostra não haverem grandes diferenças anatómicas no padrão vascular da circulação cerebral, existindo em ambos artérias comunicantes posteriores intactas.

Figuras 6A e 6B. Secções em série coradas com TTC às 24 horas de ratinhos representativos de tipo selvagem (Fig. 6A) ou homozigóticos nulos para ICAM-1 (Fig. 6B) sujeitos a oclusão transitória da artéria cerebral média. A área branca no território da artéria cerebral média representa tecido cerebral com enfarte, ao passo que o tecido viável é corado de vermelho tijolo. A quantificação dos volumes de enfarte por planimetria de secções cerebrais em série em múltiplas experiências está apresentada na Figura 7A.

Figuras 7A, 7B, 7C e 7D. Papel da ICAM-1 nas consequências de acidente vascular cerebral. Procedeu-se à oclusão transitória da artéria cerebral média como descrito em ratinhos ICAM-1 +/+ (Tipo Selvagem, n=16) ou ICAM-1 -/-(n=13) e mediram-se os índices de consequências de acidente vascular cerebral como descrito na Figura 2. Fig. 7A. Efeito da ICAM-1 no volume de enfarte. Fig. 7B. Pontuação de deficiências neurológicas. Fig. 7C. Fluxo de sangue 5 cerebral. Fig. 7D. Mortalidade. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01.)

Figuras 8A e 8B. Efeito de hipoxia na exocitose de corpos de Weibel-Palade. Fig. 8A. Veias umbilicais humanas foram expostas a hipoxia (pC>2 15-20 Torr) ou normoxia durante os períodos indicados e quantificou-se a secreção de factor de von Willebrand (vWF) por ELISA. ***=p < 0,001 para hipoxia versus normoxia. Fig. 8B. Realizaram-se experiências semelhantes durante 8 horas na presença de Ca++ 2 mM (Ca++ 2 mM) , Ca++ 0 mM (sem Ca++) ou Ca++ 0 mM com EGTA 2 mM adicionado para quelar o Ca++ extracelular residual (sem Ca++ + EGTA) .

Figuras 9A, 9B, 9C e 9D. Efeito de hipoxia endotelial na expressão de P-selectina e adesão de neutrófilos. Fig. 9A. Expressão de P-selectina em HUVECs expostas a normoxia ou hipoxia, determinada por ligação específica de IgG anti-P-selectina monoclonal etiquetada de forma radioactiva (clone WAPS12.2). Os dados estão expressos como ligação relativa comparada com o instante normóxico às 4 horas. Fig. 9B. Efeito da inibição da síntese de proteínas na expressão de P-selectina induzida por hipoxia. Numa experiência separada, mostra-se o efeito da adição de ciclo-heximida (10 μς/πιΐ, + CHX), no início do período normóxico ou hipóxico de 4 horas, na expressão de P-selectina. A comparação é feita com experiências simultâneas realizadas na ausência de ciclo-heximida (-CHX), em que os dados estão expressos como ligação relativa em comparação com ligação normóxica (-CHX). Apresentam-se médias ± EPM; *=p < 0,05 versus normoxia (-CHX); t=p < 0,05 versus normoxia (+CHX). Inserção: Efeito de ciclo-heximida (10 μρ/ΓηΙ) na síntese de proteínas às 4 horas, medido na forma de proteínas 6 etiquetadas com 35S aptas a serem precipitadas com ácido tricloroacético após administração de 35S-metionina e 35S-cisteína. Fig. 9C. Ligação de neutrófilos etiquetados com 111índio a monocamadas endoteliais da veia umbilical humana normóxicas (N) ou hipóxicas (H) às 4 horas na presença de um anticorpo anti-P-selectina bloqueador (clone WAPS 12.2) ou de um anticorpo anti-P-selectina não bloqueador (clone AC1.2). Apresentam-se médias ± EPM; **=p < 0,01.

Figuras 10A, 10B e 10C. Papel de neutrófilos e de P-selectina endotelial na conservação cardiaca de roedores seguida de transplantação heterotópica. Fig. 10A. Conservação cardiaca de ratos. Os corações foram transplantados imediatamente após a remoção (Frescos, n=8) ou foram conservados durante 16 horas em solução de Ringer lactada a 4°C, seguido de transplantação (Prsvd, n=4). Efeito da administração de anticorpo anti-P-selectina não bloqueador (AC1.2, n=3), da depleção imunológica de receptores de neutrófilos antes da implantação do coração dador (-PMN, n=4) ou da administração de 250 μg de IgG anti-P-selectina bloqueador (n=4) 10 minutos antes da reperfusão na sobrevivência de enxertos cardíacos (barras sombreadas) e leucostasia (actividade de mieloperoxidase, barras escuras). Apresentam-se médias ± EPM. Para a sobrevivência de enxertos, c versus a, p < 0,0001; g versus c, p < 0,05; i versus e ou c, p < 0,05. Para infiltração de neutrófilos nos enxertos, d versus b, p < 0,01; h versus d, p < 0,05; j versus d ou f, p < 0,05. Fig. 10B. Papel da P-selectina endotelial coronária na conservação cardíaca, utilizando corações dadores de ratinhos nulos para P-selectina (ou controlos de tipo selvagem) que foram limpos de sangue antes da conservação. Avaliou-se a sobrevivência dos enxertos pela presença/ausência de actividade cardíaca 7 eléctrica/mecânica dez minutos após o restabelecimento do fluxo de sangue. Fig. 10C. Quantificação da infiltração de neutrófilos por medição da actividade de mieloperoxidase (dABs 460 nm/minuto) como descrito 15,18. (Para as barras apresentadas da esquerda para a direita, n=14, 8, 13 e 7, respectivamente, com valores P indicados.)

Figuras 11A e 11B. Libertação de corpos de Weibel-Palade durante cirurgia cardíaca humana em 32 pacientes. Fig. 11A. Procedeu-se à amostragem de sangue do seio coronário no início (CSi) e conclusão (CS2) do período isquémico (fixação aórtica cruzada). Realizaram-se ELISAs para trombomodulina (TM) e vWF. Fig. 11B. Imunoelectroforese de vWF de uma amostra representativa de sangue CSi e CS2 do mesmo paciente (os factores de diluição estão indicados). Há um aumento dos multímeros de elevado peso molecular detectado nas amostras CS2.

Figuras 12A, 12B, 12C e 12D. Perspectiva global do cenário operatório para o modelo de isquemia cerebral focal murina. Fig. 12A. Mostra-se no diagrama o sistema de retracção à base de suturas. Fig. 12B. Visualização pelo microscópio operatório. O tronco vascular grande representa a artéria carótida externa, que está situada na área operatória de modo inferomedial. Fig. 12C. Fotografia da sutura de oclusão com a ponta tratada a quente com o calibre indicado (nylon 5-0 [base] ou 6-0 [topo]). Fig. 12D. Diagrama esquemático da anatomia cerebrovascular murina, com fio na artéria cerebral anterior que provoca a oclusão da artéria cerebral média na sua origem.

Figura 13. Comparação da anatomia cerebrovascular entre estirpes de ratinhos. Após a anestesia, os ratinhos 8 receberam uma injecção intra-cardíaca de tinta da índia seguida de eutanásia compassiva. Pode observar-se um Circulo de Willis intacto em todas as estirpes, incluindo artérias comunicantes posteriores bilaterais, o que indica não existirem grandes diferenças da anatomia cerebrovascular relacionadas com a estirpe.

Figuras 14A, 14B e 14C. Efeitos da estirpe do ratinho nas consequências de acidente vascular cerebral. Ratinhos (machos com 20-23 gramas) foram submetidos a 45 minutos de oclusão da MCA (utilizando sutura de oclusão 6.0 de 12 mm), seguida de 24 horas de reperfusão, tendo-se determinado os índices das consequências de acidente vascular cerebral. Fig. 14A. Efeitos da estirpe no volume de enfarte, determinados como percentagem do volume hemisférico ipsilateral, como descrito na secção Métodos. Fig. 14B. Efeitos da estirpe na pontuação de deficiências neurológicas, classificada desde sem deficiências neurológicas (0) até deficiências neurológicas graves (4), em que as pontuações foram determinadas como descrito na secção Métodos. Fig. 14C. Efeitos da estirpe no fluxo de sangue cerebral, medidos por fluxometria por Doppler de laser na forma do fluxo relativo no território com enfarte em comparação com o fluxo de sangue no córtex contralateral (sem enfarte). As estirpes incluíram ratinhos 129J (n=9), CD1 (n=ll) e C57/B16 (n=ll); * = p < 0,05 versus ratinhos 129 J.

Figuras 15A, 15B e 15C. Efeitos da estatura dos animais e diâmetro da sutura de oclusão nas consequências de acidente vascular cerebral. Ratinhos CD-I machos com as estaturas indicadas foram submetidos a oclusão da artéria cerebral média (45 minutos) seguida de reperfusão (24 horas), como 9 descrito na secção Métodos. A dimensão da sutura (calibre) está indicada em cada painel. Os animais pequenos (n=ll) tinham entre 20-25 gramas (média 23 gramas) e os animais grandes tinham entre 28-35 gramas (média 32 gramas; n=14 para sutura 6.0, n=9 para sutura 5.0). Fig. 15A. Efeitos da estatura do animal/dimensão da sutura no volume de enfarte. Fig. 15B. Pontuação de deficiências neurológicas. Fig. 15C. Fluxo de sangue cerebral, medido como descrito na Figura 14. Mostram-se os valores P.

Figuras 16A, 16B e 16C. Efeitos da temperatura nas consequências de acidente vascular cerebral. Ratinhos C57/B16 machos foram submetidos a 45 minutos de oclusão da MCA (sutura 6.0) seguida de reperfusão. As temperaturas centrais foram mantidas durante 90 minutos a 37°C (normotermia, n=ll) utilizando uma sonda intra-rectal com um dispositivo de aquecimento controlado por termopar. No segundo grupo (hipotermia, n=12), os animais foram colocados em gaiolas deixadas à temperatura ambiente após 10 minutos iniciais de normotermia (temperatura média central 31°C aos 90 minutos). Em ambos os grupos, após este período de observação de 90 minutos, os animais regressaram às suas gaiolas com temperatura ambiente mantida a 37°C durante a observação. Vinte e quatro horas após a oclusão da MCA registaram-se os índices das consequências de acidente vascular cerebral. Fig. 16A. Volume de enfarte. Fig. 16B. Pontuação de deficiências neurológicas. Fig. 16C. Fluxo de sangue cerebral, medido como descrito na Figura 3. Mostram-se os valores * = p < 0,05.

Figuras 17A, 17B e 17C. Comparações de consequências entre isquemia cerebral focal permanente e isquemia cerebral focal transitória seguidas de reperfusão. A MCA foi 10 submetida a oclusão permanente (n=ll) ou transitória (45 minutos, n=17) com sutura de calibre 6.0 em ratinhos C57/B16 machos de 22 gramas, como descrito na secção Métodos. Vinte e quatro horas após a oclusão da MCA registaram-se os índices das consequências de acidente vascular cerebral. Fig. 17A. Volume de enfarte. Fig. 17B. Pontuação de deficiências neurológicas. Fig. 17C. Fluxo de sangue cerebral, medido como descrito na Figura 14.

Figuras 18A e 18B. Expressão de P-selectina e acumulação de neutrófilos (PMNs) após oclusão da artéria cerebral média (MCAO) em ratinhos. Fig. 18A. Expressão de P-selectina após MCAO e reperfusão. Demonstrou-se a expressão relativa do antigene da P-selectina no hemisfério cerebral ipsilateral após oclusão da artéria cerebral média utilizando uma IgG anti-P-selectina monoclonal de rato etiquetada com 125I ou uma IgG de rato não imunológica etiquetada com 125I para controlar o extravasamento inespecífico. As experiências foram realizadas como descrito na legenda da figura 18. Os valores estão expressos na forma de cpm ipsilateral/cpm contralateral. n=6 para cada grupo, excepto para 30 minutos de controlo (n=4); Φ = p < 0, 001, 30 minutos de reperfusão versus pré-oclusão imediata; * = p < 0,025, alteração da acumulação de P-selectina versus alteração da acumulação de IgG de controlo. Fig. 18B. Decurso temporal da acumulação de PMNs após isquemia cerebral focal e reperfusão no ratinho. Para estas experiências injectaram-se intravenosamente «3,3 x 105 PANS etiquetados com inIn em ratinhos PS de tipo selvagem (PS +/+) 15 minutos antes da oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Mediu-se a acumulação de 111In-PMNs imediatamente após o sacrifício na forma da razão de cpm ipsilateral/contralateral nas seguintes condições experimentais: antes de MCAO (Pré-O, 11 n=4), imediatamente após MCAO (Pós-O, n=6) e 10 minutos após MCAO mas ainda antes da reperfusão (: 10 Pós-O, n=6) . Para determinar o efeito da reperfusão na acumulação de PMNs iniciou-se a reperfusão após 45 minutos de isquemia. Mediu-se a acumulação de PMNs após 30 minutos (n=6), 300 minutos (n=3) e 22 horas (n=8) da reperfusão. Em condições idênticas mediu-se a acumulação de PMNs em ratinhos nulos para P-selectina (PS -/-) após 45 minutos de isquemia e 22 horas de reperfusão (n=7, * = p < 0,05 versus 45 minutos MCAO/22 horas de reperfusão em animais PS +/+).

Figura 19. Papel da P-selectina na ausência de refluxo cerebrovascular. Mediu-se o fluxo de sangue cerebral em ratinhos PS +/+ (painel superior) e PS -/- (painel do meio) utilizando uma sonda de fluxo por Doppler de laser, tendo sido expresso como percentagem do fluxo de sangue hemisférico contralateral (não isquémico) (± EPM). Mediu-se o fluxo de sangue nos seguintes instantes: a, antes da MCAO (PS +/ + , n=16; PS -/-, n=23) ; b, imediatamente após MCAO (PS +/ + , n=42; PS -/-, n=40); c, 10 minutos após MCAO mas ainda antes da reperfusão (PS +/ + , n=36; PS -/-, n=34); d, imediatamente após a reperfusão (PS +/+, n=36; PS -/-, n=34); e, 30 minutos após a reperfusão (PS +/+, n=8; PS -/-, n=5), e f, 22 horas após a reperfusão (PS +/+, n=15; PS -/-, n=5). O painel inferior representa uma sobreposição dos dois painéis superiores, tendo-se omitido as barras de erro por motivos de clareza.

Figura 20. Anatomia cerebrovascular em ratinhos homozigóticos nulos para P-selectina, PS -/- (direita), e controlos de tipo selvagem, PS +/+ (esquerda). A coloração com tinta da índia/negro de fumo da anatomia cerebrovascular com uma perspectiva inferior do Circulo de 12

Willis mostra não existirem grandes diferenças anatómicas no padrão vascular da circulação cerebral, com artérias comunicantes posteriores intactas em ambos.

Figuras 21A, 21B e 21C. Efeito do gene da P-selectina nas consequências de acidente vascular cerebral. Procedeu-se à oclusão da artéria cerebral média durante 45 minutos, seguida de 22 horas de reperfusão em ratinhos P-selectina +/+ (n=10) ou P-selectina -/- (n=7). Efeito da P-selectina nos seguintes parâmetros. Fig. 21A. Volume de enfarte, evidenciado por coloração com cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio (TTC) 2% e calculado como percentagem do hemisfério ipsilateral. Fig. 21B. Pontuação de deficiências neurológicas (1 = movimentos espontâneos normais; 2 = movimento em círculos na orientação dos ponteiros do relógio; 3 = rotação na orientação dos ponteiros do relógio; 4 = sem resposta a estímulos nocivos). Fig. 21C. Percentagem da sobrevivência na altura do sacrifício. (* = p < 0,05.)

Figuras 22A, 22B, 22C e 22D. Efeito do bloqueio de P-selectina nas consequências de acidente vascular cerebral. Ratinhos PS +/+ receberam uma IgG de rato anti-P-selectina anti-ratinho bloqueadora (clone RB 40.34, 30 μg/ratinho) ou uma dose semelhante de IgG de rato não imunológica imediatamente antes da cirurgia. Fig. 22A. Fluxo de sangue cerebral aos trinta minutos após a reperfusão. Após 22 horas de reperfusão, mostram-se os volumes de enfarte Fig. 22B, pontuações de deficiências neurológicas Fig. 22C e mortalidade Fig. 22D. (n=7 para cada grupo, * = p < 0,05.)

Figuras 23A e 23B. Fig. 23A. Efeito da inalação de monóxido de carbono nos volumes de enfarte cerebral. Os ratinhos 13 foram colocados em campânulas de vidro onde foram expostos a CO 0,1% durante 12 horas. Após este tratamento, foram removidos das campânulas de vidro e sujeitos a oclusão intraluminal da artéria cerebral média. Às 24 horas, os animais foram sacrificados, tendo-se medido os volumes de enfarte por coloração com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) como mostrado na Figura 25. A quantificação dos volumes de enfarte (média ± EPM) está expressa como percentagem de enfarte do hemisfério ipsilateral. Estes dados mostram que o CO inalado reduz os volumes de enfarte após acidente vascular cerebral. Fig. 23B. Efeito da inalação de monóxido de carbono na mortalidade após acidente vascular cerebral. Realizaram-se experiências como descrito acima. Apresenta-se a mortalidade às 24 horas. Estes dados mostram que o CO inalado reduz a mortalidade após acidente vascular cerebral.

Figuras 24A, 24B e 24C. Fig. 24A. Resposta à dose de monóxido de carbono inalado nas consequências de acidente vascular cerebral. As experiências estão descritas acima. O CO foi inalado nas doses indicadas. Estes dados mostram que o CO inalado reduz o volume de enfarte de uma forma dependente da dose, em que 0,1% confere protecção óptima. Fig. 24B e Fig. 24C. Papel da heme oxigenase, a enzima que produz CO, em acidente vascular cerebral. Os animais receberam veiculo (DMSO) isoladamente como controlo ou protoporfirina IX de zinco (ZnPP) ou protoporfirina IX de estanho (SnPP). Num grupo final, os ratinhos receberam biliverdina (Bili) , um composto que se forma juntamente com CO durante o processo de degradação do heme pela heme oxigenase. O painel da esquerda mostra volumes de enfarte. O painel da direita mostra mortalidade. Estas experiências demonstram que, quando a actividade da heme oxigenase é 14 bloqueada, as consequências de acidente vascular cerebral são piores (enfartes mais extensos e mortalidades mais elevadas). Uma vez que a administração de biliverdina não é protectora, estes dados sugerem que o outro co-produto da actividade da heme oxigenase (CO) é protector.

Figura 25. Coloração com TTC de secções cerebrais em série para os animais da Figura 23. 0 tecido com enfarte aparece a branco e o tecido viável aparece a vermelho tijolo.

Figuras 2 6A-2 6F. Efeito de isquemia cerebral focal na indução da heme oxigenase I (HO-I). As Figs. 26A-26C mostram hibridização in situ de mRNA de HO-I em acidente vascular cerebral (Fig. 26B) e em controlos (Figs. 26A e 26C) . As Figs. 26D-26F mostram a imuno-histoquimica da proteina HO-I. A Fig. 26E mostra que a proteína é expressa em vasos sanguíneos e astrócitos após acidente vascular cerebral. As Figs. 26D e 26F mostram que a proteína não é expressa em vasos sanguíneos nem em astrócitos em controlos.

Figura 27. Efeito de isquemia cerebral focal na indução de mRNA de heme oxigenase I (HO-I). Contralateral indica o lado do cérebro sem acidente vascular cerebral. Ipsilateral indica o lado do cérebro sujeito a acidente vascular cerebral. Em ambos os animais, o lado do cérebro sujeito a acidente vascular cerebral exibe HO-I aumentada, mas o lado sem acidente vascular cerebral não exibe HO-I aumentada.

Figura 28. Efeito de hipoxia na indução de heme oxigenase I (HO-I). Ratinhos expostos a um ambiente hipóxico durante 12 horas (para simular isquemia) exibem um aumento de mRNA de heme oxigenase I em comparação com controlos normóxicos. 15

Estes dados mostram um mecanismo potencial pelo qual a pré-exposição hipóxica também pode conferir protecção contra acontecimentos isquémicos subsequentes, o que se verificou acontecer em ratinhos sujeitos a hipoxia seguida de acidente vascular cerebral.

Figura 29. Efeito de hipoxia na expressão da proteina heme oxigenase I (HO-I) em células endoteliais de cérebro de ratinho. A hipoxia aumenta os niveis da proteina HO-I nestas células endoteliais derivadas do cérebro.

Figura 30. Efeito de hipoxia na na indução de mRNA de heme oxigenase I (HO-I) em células endoteliais de cérebro de ratinho. A hipoxia aumenta os niveis de mRNA de HO-I nestas células endoteliais derivadas do cérebro.

Figuras 31A-31D. Expressão de P-selectina e acumulação de neutrófilos (PMNs) após oclusão da artéria cerebral média (MCAO) em ratinhos. Fig. 31A. Expressão de P-selectina após MCAO e reperfusão. Demonstrou-se a expressão relativa do antigene da P-selectina no hemisfério cerebral ipsilateral após oclusão da artéria cerebral média utilizando uma IgG anti-P-selectina monoclonal de rato etiquetada com 125I ou uma IgG de rato não imunológica etiquetada com 125I para controlar o extravasamento inespecifico. Os valores estão expressos em cpm ipsilateral/cpm contralateral. n=6 para cada grupo, excepto para 30 minutos de controlo (n=4); Φ = p < 0,001, reperfusão durante 30 minutos versus pré-oclusão imediata; * = p < 0,025, alteração da acumulação de P-selectina versus alteração da acumulação da IgG de controlo. Figs. 31B e 31C. Localização imuno-histoquimica da expressão de P-selectina numa secção do cérebro de um ratinho sujeito a 45 minutos de MCAO seguido de 1 hora de 16 reperfusão. Apresentam-se secções corticais cerebrais ipsilateral e contralateral do mesmo ratinho. As setas apontam para um micro-vaso cerebral, em que a cor castanho-escuro representa expressão de P-selectina na superfície de células endoteliais. Fig. 31D. Decurso temporal da acumulação de PMNs após isquemia cerebral focal e reperfusão no ratinho. Para estas experiências, injectaram-se intravenosamente »=3,3 χ 105 PMNs etiquetados com li;Lln em ratinhos PS de tipo selvagem (PS +/+) 15 minutos antes da oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Mediu-se a acumulação de inIn-PMNs imediatamente após o sacrifício na forma da razão de cpm ipsilateral/contralateral nas seguintes condições experimentais: antes de MCAO (Pré-O, n=4), imediatamente após MCAO (Pós-O, n=6) e 10 minutos após MCAO mas ainda antes da reperfusão (: 10 Pós-O, n=6) . Para determinar o efeito da reperfusão na acumulação de PMNs iniciou-se a reperfusão após 45 minutos de isquemia. Mediu-se a acumulação de PMNs após 30 minutos (n=6), 300 minutos (n=3) e 22 horas (n=8) de reperfusão. Em condições idênticas, mediu-se a acumulação de PMNs em ratinhos nulos para P-selectina (PS -/-) após 45 minutos de isquemia e 22 horas de reperfusão (n=7, * = p < 0,05 versus 45 minutos de MCAO/22 horas de reperfusão em animais PS +/+).

Figuras 32A-32C. Papel da P-selectina na ausência de refluxo cerebrovascular. Mediu-se o fluxo de sangue cerebral em ratinhos PS +/+ (painel superior) e PS -/-(painel do meio) utilizando uma sonda de fluxo por Doppler de laser, tendo sido expresso como percentagem do fluxo de sangue hemisférico contralateral (não isquémico) (± EPM). Mediu-se o fluxo de sangue nos seguintes instantes: a, antes de MCAO (PS +/+, n=16; PS -/-, n=23); b, imediatamente após MCAO (PS +/+, n=42; PS -/-, n=40); c, 10 17 minutos após MCAO mas ainda antes da reperfusão (PS +/+, n=36; PS -/-, n=34); d, imediatamente após a reperfusão (PS +/+, n=36; PS -/-, n=34); e, 30 minutos após a reperfusão (PS +/+, n=8; PS -/-, n=5), e f, 22 horas após a reperfusão (PS +/ + , n=15; PS -/-, n=5) . O painel inferior representa uma sobreposição dos dois painéis superiores, tendo-se omitido as barras de erro por motivos de clareza.

Figuras 33A-33B. Efeito do gene da P-selectina nas consequências de acidente vascular cerebral. Procedeu-se à oclusão da artéria cerebral média durante 45 minutos, seguida de 22 horas de reperfusão em ratinhos P-selectina +/+ (n=10) ou P-selectina -/- (n=7). Efeito da P-selectina nos parâmetros seguintes. Fig. 33A. Volume de enfarte, evidenciado por coloração com cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio (TTC) 2% e calculado como percentagem do hemisfério ipsilateral. Fig. 33B. Percentagem da sobrevivência na altura do sacrifício. Apresentam-se médias ± EPM, com os números dos animais a partir dos quais se calculou a percentagem de sobrevivência indicados acima das barras de sobrevivência (* = p < 0,05).

Figura 34. Efeito do bloqueio de P-selectina nas consequências de acidente vascular cerebral. Ratinhos PS +/+ receberam uma IgG de rato anti-P-selectina anti-ratinho bloqueadora (clone RB 40.34, 30 μg/ratinho) ou uma dose semelhante de IgG de rato não imunológica imediatamente antes da oclusão da artéria cerebral média (Pré-MCAO; n=7 para cada grupo) ou após oclusão da artéria cerebral média (Pós-MCAO; n=9 para o anticorpo de controlo, n=6 para o anticorpo anti-P-selectina funcionalmente bloqueador). Em ambos os casos, a sutura de oclusão intraluminal foi removida após um período isquémico de 45 minutos, para 18 simular reperfusão clínica. Após 22 horas de reperfusão, apresentam-se os volumes de enfarte (barras escuras), fluxo relativo de sangue cerebral aos trinta minutos após a reperfusão (barras com riscos diagonais) e sobrevivência (barras claras) . Apresentam-se médias ± EPM, com os números dos animais a partir dos quais se calculou a percentagem de sobrevivência indicados acima das barras de sobrevivência. * = p < 0,05 versus anticorpo de controlo.

Figuras 35A-35B. Validação do ensaio espectrofotométrico quantitativo de hemorragia intracerebral na ausência (Fig. 35A) ou presença (Fig. 35B) de tecido do cérebro. Fig. 35A. Curva-padrão em que concentrações conhecidas de hemoglobina foram reduzidas para cianometa-hemoglobina, após o que se mediu a OD a 550 nm. N=5 determinações em cada ponto, apresentando-se médias ± EPM. Apresenta-se a equação para a linha de melhor ajustamento e o valor r. Fig. 35B. Adicionaram-se concentrações conhecidas de hemoglobina (utilizando sangue autólogo diluído em solução salina) a volumes fixos de homogenato de tecido de cérebro fresco e efectuou-se o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina. Os cérebros foram divididos em hemisférios; para cada animal, um hemisfério foi imerso em soro fisiológico durante 20 minutos (NS, linha contínua) e o outro hemisfério foi colocado em cloreto de trifeniltetrazólio (TTC, linha tracejada) durante 20 minutos (semelhante ao procedimento que seria seguido para medir o volume de enfarte cerebral). Para cada concentração de hemoglobina adicionada, o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina foi realizado em 6 hemisférios. Apresentam-se médias ± EPM.

Figuras 36A-36B. Ensaio espectrofotométrico quantitativo de hemoglobina. Fig. 36A. Efeitos da infusão de colagenase e 19 rt-PA em ICH murina quantitativa. Os ratinhos foram infundidos de forma estereotáctica com agentes indutores de ICH no córtex direito profundo/gânglios basais. Removeram-se os cérebros 24 horas depois e conduziu-se o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina para quantificar a ICH. Os ratinhos foram sujeitos a 1) nenhum tratamento (Controlo), 2) infusão estereotáctica de 1 μΐ de solução salina normal (Simulado), 3) infusão estereotáctica de 0,024 μρ de colagenase B em 1 μΐ de solução salina normal (Colagenase) ou 4) infusão estereotáctica de colagenase B (como acima) seguida de activador do plasminogénio em tecidos intravenoso (1 mg/kg em 0,2 μΐ de solução salina normal) por injecção na veia dorsal peniana (Colagenase + rt-PA). ** p < 0,001 versus Simulado ou Controlo. Fig. 36B. Efeito de rt-PA após acidente vascular cerebral isquémico focal em ICH murina quantitativa. Os ratinhos foram sujeitos a 45 minutos de oclusão da MCA seguida de reperfusão e depois 1) 0,2 μΐ intravenosos de solução salina normal (Acidente Vascular Cerebral + Solução Salina) ou 2) activador do plasminogénio em tecidos intravenoso (15 mg/kg em 0,2 μΐ de solução salina normal) (Acidente Vascular Cerebral + rt-PA). Removeram-se os cérebros 24 horas depois e conduziu-se o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina para quantificar a ICH. ** p < 0,05.

Figura 37. Demonstração do sistema de pontuação utilizado para a determinação visual de ICH após acidente vascular cerebral. Cada tira, recolhida de animais diferentes sujeitos a acidente vascular cerebral, representa a tira coronal de cérebro que exibe o diâmetro hemorrágico máximo. Os números correspondem à pontuação de hemorragia determinada visualmente, como definido na secção Métodos. 20

Figuras 38A-38B. Pontuação visual de ICH. Fig. 38A. Efeitos da infusão de colagenase e rt-PA na pontuação visual de ICH murina. Os ratinhos foram infundidos de forma estereotáctica com agentes indutores de ICH no córtex direito profundo/gânglios basais Os ratinhos foram suj eitos a 1) nenhum tratamento (Controlo), 2) infusão estereotáctica de 1 μΐ de solução salina normal (Simulado), 3) infusão estereotáctica de 0,024 μς de colagenase B em 1 μΐ de solução salina normal (Colagenase) ou 4) infusão estereotáctica de colagenase B (como acima) seguida de activador do plasminogénio em tecidos intravenoso (1 mg/kg em 0,2 μΐ de solução salina normal) por injecção na veia dorsal peniana (Colagenase + rt-PA). Os cérebros foram removidos 24 horas depois, foram seccionados em tiras coronais de 1 mm e classificados por um observador cego como descrito na secção Métodos. * p < 0,05 versus

Colagenase, p < 0,005 versus Simulado ou Controlo. Fig. 38B. Efeito de rt-PA após acidente vascular cerebral isquémico focal na pontuação visual de ICH murina. Os ratinhos foram sujeitos a 45 minutos de oclusão da MCA seguida de reperfusão e depois 1) 0,2 μΐ intravenosos de solução salina normal (Acidente Vascular Cerebral + Solução Salina) ou 2) activador do plasminogénio em tecidos intravenoso (15 mg/kg em 0,2 μΐ de solução salina normal) (Acidente Vascular Cerebral + rt-PA). Os cérebros foram removidos 24 horas depois, foram seccionados em tiras coronais de 1 mm e classificados por um observador cego como descrito na secção Métodos. * p < 0,01. Apresentam-se os valores individuais das pontuações visuais de ICH, com o valor da mediana para cada grupo indicada por uma linha horizontal. 21

Figura 39. Correlação entre ICH visual e ensaio espectrofotométrico de hemoglobina. A densidade óptica a 550 nm (ordenadas) representa os resultados obtidos do ensaio espectrofotométrico de hemoglobina onde se analisou tecido do cérebro (de todas as experiências). As pontuações visuais de ICH correspondentes (apresentadas na Figura 38) estão representadas nas abcissas. Para cada ponto apresentam-se médias ± EPM. Efectuou-se uma correlação linear utilizando a correlação linear de Pearson, apresentando-se a equação da linha e o valor r.

Figuras 40A-40F. Fig. 40A. Efeito de acidente vascular cerebral e de administração de Factor IXai em acidente vascular cerebral na acumulação de plaquetas etiquetadas de forma radioactiva. Administraram-se iníndio-plaquetas a animais de controlo sem acidente vascular cerebral (n=4) ou a animais imediatamente antes de acidente vascular cerebral com (n=7) ou sem administração pré-operatória de Factor IXai (300 μρ/]<:ρ, n=7) . A acumulação de plaquetas está expressa na forma de cpm ipsilateral/cpm contralateral. Apresentam-se médias ± EPM. * p < 0,05 Sem Acidente Vascular Cerebral; ** p < 0,05 versus Acidente Vascular Cerebral + Veiculo. Fig. 40B. Acumulação de fibrina em tecido cerebral com enfarte. Vinte e duas horas após isquemia cerebral focal e reperfusão, removeu-se um cérebro de um ratinho representativo que tinha sido pré-tratado antes da cirurgia com veiculo (duas vias mais à esquerda) ou Factor IXai (300 \xq/kq, duas vias mais à direita) . Os cérebros foram divididos nos hemisférios ipsilateral (R) e contralateral (L) e procedeu-se à digestão com plasmina para solubilizar a fibrina acumulada. Efectuou-se imunocoloração utilizando um anticorpo primário dirigido contra um neoepitopo expresso no dimero da cadeia gama-gama 22 de fibrina com ligações cruzadas. Fig. 40C-40F. Identificação imuno-histoquímica de sitios de formação de fibrina em acidente vascular cerebral. Utilizando o mesmo anticorpo descrito na Figura 2b para detectar fibrina, os cérebros foram removidos de dois ratinhos após acidente vascular cerebral (cada um dos painéis superior e inferior representa um ratinho). As setas identificam micro-vasos cerebrais. De notar que, em ambos os hemisférios ipsilaterais (painéis da direita), a fibrina intravascular pode ser claramente identificada pela coloração vermelha, que não se observa nos hemisférios contralaterais (painéis da esquerda) não isquémicos.

Figuras 41A-41C. Fig. 41A. Efeito do Factor IXai no CBF relativo num modelo murino de acidente vascular cerebral, medido por Doppler de laser. 0 CBF em animais tratados com Factor IXai (300 μρ/kg, n=48, linha tracejada) é significativamente mais elevado às 24 horas do que nos controlos tratados com veiculo (n=62). Apresentam-se médias ± EPM. * p < 0,05. Fig. 41B. Efeito do Factor IXai em volumes de enfarte num modelo de acidente vascular cerebral murino, medido por coloração com TTC de secções coronais em série. Os animais receberam veiculo (n=62) ou Factor IXai (300 μς/ΐίς, n=48) . Apresentam-se médias ± EPM. * p < 0,05. Fig. 41C. Resposta à dose do Factor IXai em acidente vascular cerebral. O Factor IXai foi administrado imediatamente antes do inicio do acidente vascular cerebral, tendo-se determinado os volumes de enfarte como descrito na Figura 41B acima. N=62, 48, 6 e 6 para Veículo, doses de 300 μq/'k.qr 600 μρ/1<:ς e 1200 μς/kg, respectivamente. Apresentam-se médias ± EPM. * p < 0,05 versus animais tratados com veículo. 23

Figuras 42A-42B. Efeito do Factor IXai em Hemorragia intracerebral. Fig. 42A. 0 ensaio espectrofotométrico de hemoglobina foi realizado como descrito na secção Métodos. A O.D. a 550 nm está linearmente relacionada com o teor de hemoglobina no cérebro 11,12. Fig. 42B. Pontuação de ICH determinada visualmente por um observador cego, como descrito na secção Métodos. A pontuação de ICH está correlacionada com o teor de hemoglobina no cérebro determinado espectrofotometricamente 11,12. Apresentam-se médias ± EPM. * p < 0,05 versus animais tratados com veiculo.

Figura 43. Efeito da calendarização da administração do Factor IXai nos volumes de enfarte cerebral quando administrado após o inicio de acidente vascular cerebral. Os ratinhos foram submetidos a isquemia cerebral focal e reperfusão como descrito na secção Métodos. Os dados da administração pré-oclusão (2 barras mais à esquerda) estão apresentados na Figura 42B. Em experiências adicionais para determinar os efeitos do Factor IXai administrado após o acidente vascular cerebral, administrou-se intravenosamente veiculo (solução salina normal, n=13) ou Factor IXai (300 μρ/kg, n=7) imediatamente após a remoção da sutura de oclusão intraluminal. Determinaram-se os volumes de enfarte cerebral (com base em secções em série coradas com TTC obtidas às 22 horas) . Apresentam-se médias ± EPM. * p < 0,05, ** p < 0,05 versus animais tratados com veiculo.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Revelam-se aqui utilizações de um método para tratar uma perturbação isquémica num sujeito que inclui administrar ao sujeito uma forma farmaceuticamente aceitável de um antagonista da selectina numa quantidade suficiente e 24 durante um período de tempo suficiente para prevenir a acumulação de glóbulos brancos, de modo a tratar a perturbação isquémica no sujeito. 0 antagonista da selectina pode ser um péptido-mimético, uma molécula de ácido nucleico, uma ribozima, um polipéptido, uma molécula pequena, uma molécula de hidrato de carbono, um monossacárido, um oligossacárido ou um anticorpo. A selectina pode ser uma P-selectina, uma E-selectina ou uma L-selectina. 0 anticorpo pode ser um anticorpo para P-selectina. 0 anticorpo também pode incluir um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. 0 antagonista da P-selectina pode incluir um precursor do óxido nítrico (NO), como L-arginina, um dador de NO, como nitroglicerina ou nitroprussiato, um análogo nucleotídico cíclico, como um análogo de GMP cíclico ou de AMP cíclico, ou um inibidor da fosfodiesterase. A forma farmaceuticamente aceitável do antagonista da P-selectina pode incluir um antagonista da P-selectina e um transportador farmaceuticamente aceitável. 0 transportador pode incluir um transportador em aerossol, intravenoso, oral ou tópico. 0 glóbulo branco pode ser um neutrófilo ou um monócito. 0 sujeito pode ser um mamífero. 0 mamífero pode ser um humano, uma vaca, um porco, uma ovelha, um cão, um gato, um macaco, um pássaro ou qualquer modelo animal de uma doença ou perturbação humana. A perturbação isquémica pode incluir, mas não se limita a uma perturbação vascular periférica, uma trombose venosa, um êmbolo pulmonar, um enfarte do miocárdio, um ataque isquémico transitório, angina instável, uma deficiência 25 neurológica isquémica reversível, anemia de células falciformes ou uma perturbação de acidente vascular cerebral. 0 sujeito pode estar a ser submetido a cirurgia cardíaca, cirurgia pulmonar, cirurgia da espinal-medula, cirurgia cerebral, cirurgia vascular, cirurgia abdominal ou cirurgia de transplantação de órgãos. A cirurgia de transplantação de órgãos pode incluir cirurgia de transplantação do coração, pulmão, pâncreas ou fígado.

Em particular, a presente invenção proporciona a utilização de um gás que compreende monóxido de carbono numa quantidade suficiente para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento ou prevenção de uma perturbação isquémica num sujeito durante um período de tempo suficiente. A administração de monóxido de carbono pode ser feita via inalação pelo sujeito ou via exposição extra-corporal a sangue ou fluidos corporais do sujeito. A quantidade de monóxido de carbono que pode ser suficiente para tratar o sujeito inclui, mas não se limita a um valor desde cerca de 0,0001% de monóxido de carbono num gás inerte até cerca de 2% de monóxido de carbono num gás inerte. O gás inerte pode ser oxigénio, azoto, árgon ou ar. Numa especificação da presente invenção, a quantidade de monóxido de carbono administrada pode ser 0,1% de monóxido de carbono em ar. O período de tempo suficiente para administrar monóxido de carbono a um sujeito com a finalidade de tratar uma 26 perturbação isquémica inclui, mas não se limita a um valor desde cerca de 1 dia antes da cirurgia até cerca de 1 dia após a cirurgia. 0 periodo de tempo pode ir desde cerca de 12 horas antes da cirurgia até cerca de 12 horas após a cirurgia. 0 periodo de tempo pode suplementarmente incluir desde cerca de 12 horas antes da cirurgia até cerca de 1 hora após a cirurgia. 0 periodo de tempo também pode incluir desde cerca de 1 hora antes da cirurgia até cerca de 1 hora após a cirurgia. 0 periodo de tempo também pode incluir desde cerca de 20 minutos antes da cirurgia até cerca de 1 hora após a cirurgia. O periodo de tempo suficiente para tratar uma perturbação isquémica num sujeito não submetido a cirurgia pode incluir antes e durante qualquer manifestação fisica dessa perturbação. A administração de monóxido de carbono é preferível antes da manifestação de modo a atenuar essa manifestação de uma perturbação isquémica. Foi mostrado, como aqui descrito abaixo, que a administração de monóxido de carbono protege um sujeito de isquemia se for administrado antes da cirurgia.

Tal como é aqui utilizado, a "perturbação isquémica" abrange e não se limita a uma perturbação vascular periférica, uma trombose venosa, um êmbolo pulmonar, um enfarte do miocárdio, um ataque isquémico transitório, isquemia do pulmão, angina instável, uma deficiência neurológica isquémica reversível, actividade trombolítica adjunta, condições de coagulação excessiva, anemia de células falciformes ou uma perturbação de acidente vascular cerebral. O sujeito pode estar a ser submetido a cirurgia cardíaca, cirurgia pulmonar, cirurgia da espinal-medula, cirurgia 27 cerebral, cirurgia vascular, cirurgia abdominal ou cirurgia de transplantação de órgãos. A cirurgia de transplantação de órgãos pode incluir cirurgia de transplantação do coração, pulmão, pâncreas ou fígado. 0 monóxido de carbono pode ser administrado de forma indirecta. Em vez do sujeito inalar ou receber directamente monóxido de carbono gasoso ou uma mistura de gases, podem administrar-se ao sujeito compostos para estimular a produção in vivo de monóxido de carbono. Esses compostos podem incluir, mas não se limitam ao heme, ferritina, hematina, precursores endógenos da heme oxigenase ou estimuladores da heme oxigenase. Adicionalmente, o sujeito pode ser exposto a um ambiente com um nível baixo de oxigénio em comparação com a atmosfera normal. A heme oxigenase é uma enzima endógena que sintetiza monóxido de carbono a partir do heme precursor (faz parte da via normal na qual o heme é degradado e metabolizado no corpo). Quando se expuseram ratinhos a hipoxia ou isquemia de tecido, os níveis do RNA mensageiro que codifica para a proteína heme oxigenase e da própria proteína aumentaram. Adicionalmente, a actividade da enzima aumentou, como indicado por medições de monóxido de carbono no tecido. É suplementarmente revelado aqui um método de tratamento de uma perturbação isquémica num sujeito, que compreende administrar ao sujeito uma forma farmaceuticamente aceitável de Factor IX inactivado numa quantidade suficiente e durante um período de tempo suficiente para inibir a coagulação, de modo a tratar a perturbação isquémica no sujeito. A quantidade suficiente pode incluir, mas não se limita a um valor desde cerca de 75 \iq/k.q até 28 cerca de 550 μς/kg. A quantidade pode ser 300 μς/kg. A forma farmaceuticamente aceitável do Factor IX inactivado inclui Factor IX inactivado e um transportador farmaceuticamente aceitável. O Factor IX pode ser inactivado pelos métodos comuns conhecidos do experimentado na área, como inactivação pelo calor. O Factor IX pode ser inactivado ou a actividade do Factor IX pode ser inibida por um antagonista. Esse antagonista pode ser um péptido-mimético, uma molécula de ácido nucleico, uma ribozima, um polipéptido, uma molécula pequena, uma molécula de hidrato de carbono, um monossacárido, um oligossacárido ou um anticorpo. A presente candidatura descreve um método para identificar um composto capaz de melhorar uma perturbação isquémica num sujeito, que inclui: a) administrar o composto a um animal, cujo animal é um modelo animal de acidente vascular cerebral; b) medir as consequências de acidente vascular cerebral no animal e c) comparar as consequências de acidente vascular cerebral do passo (b) com as do modelo animal de acidente vascular cerebral na ausência do composto, de modo a identificar um composto capaz de melhorar uma perturbação isquémica num sujeito. O modelo animal de acidente vascular cerebral inclui um modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão. As consequências de acidente vascular cerebral podem ser medidas por exame físico, imagiologia de ressonância magnética, fluxometria por Doppler de laser, coloração com cloreto de trifeniltetrazólio, avaliação química de deficiências neurológicas, varrimento de tomografia computorizada ou fluxo de sangue cortical cerebral. As consequências de acidente vascular cerebral num humano 29 também podem ser medidas por medições clinicas, classificações de qualidade de vida e realização de testes neuropsicométricos. 0 composto pode incluir um antagonista da P-selectina, um antagonista da E-selectina ou um antagonista da L-selectina. A presente candidatura também descreve um método para identificar um composto capaz de prevenir a acumulação de glóbulos brancos num sujeito, que inclui: a) administrar o composto a um animal, cujo animal é um modelo animal de acidente vascular cerebral; b) medir as consequências de acidente vascular cerebral no animal e c) comparar as consequências de acidente vascular cerebral do passo (b) com as do modelo animal de acidente vascular cerebral na ausência do composto, de modo a identificar um composto capaz de prevenir a acumulação de glóbulos brancos no suj eito. 0 glóbulo branco pode ser, mas não se limita a um neutrófilo, uma plaqueta ou um monócito. 0 composto pode ser, mas não se limita a um inibidor da selectina, um inibidor de monócitos, um inibidor de plaquetas ou um inibidor de neutrófilos. 0 inibidor da selectina pode ser, mas não se limita a um inibidor da P-selectina, E-selectina ou L-selectina. As selectinas são expressas na superfície de plaquetas, e esses inibidores ou antagonistas da selectina, como descritos aqui, podem prevenir a expressão dessas selectinas na superfície da célula. A prevenção da expressão pode dar-se ao nível da transcrição, tradução, pós-tradução ou prevenção do movimento dessas selectinas através do citosol e prevenção da distribuição na superfície celular. 30 A presente candidatura descreve o tratamento de perturbações isquémicas por inibição da capacidade do neutrófilo, monócito ou outro glóbulo branco para aderir apropriadamente. Isto pode ser conseguido removendo o contra-ligando, como CD18. Foi demonstrado, como aqui discutido abaixo, que ratinhos " knock-out" CD18 (ratinhos onde não ocorre expressão do gene CD18 normal) estão protegidos de estados isquémicos adversos. As células endoteliais na superfície dos vasos do sujeito também podem ser um alvo do tratamento. Num modelo de ratinho de acidente vascular cerebral, a administração do agente trombolítico TPA causou alguma hemorragia visível juntamente com melhoria da perturbação de acidente vascular cerebral. No entanto, a administração de um antagonista da P-selectina também melhorou a perturbação de acidente vascular cerebral no modelo animal mas sem a hemorragia concomitante. A revelação da presente candidatura pode ser utilizada em conjunção com uma terapia trombolítica, para aumentar a eficácia dessa terapia ou para permitir a administração ao sujeito de doses menores dessa terapia, de modo a reduzir efeitos secundários da terapia trombolítica.

Tal como é aqui utilizado, o termo "transportador adequado farmaceuticamente aceitável" abrange qualquer um dos transportadores comuns farmaceuticamente aceites, como solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões, como uma emulsão óleo/água ou uma emulsão de triglicéridos, vários tipos de agentes humedecedores, pastilhas, pastilhas revestidas e cápsulas. Um exemplo de uma emulsão aceitável de triglicéridos útil na administração intravenosa e intraperitoneal dos compostos é a emulsão de triglicéridos comercialmente conhecida como Intralipid®. 31

Tipicamente, esses transportadores contêm excipientes tais como amido, leite, açúcar, certos tipos de argila, gelatina, ácido esteárico, talco, gorduras ou óleos vegetais, gomas, glicóis ou outros excipientes conhecidos. Esses transportadores também podem incluir aditivos aromatizantes e corantes ou outros ingredientes. A candidatura também descreve composições farmacêuticas que incluem quantidades terapeuticamente eficazes de composições e compostos proteicos capazes de tratar perturbação de acidente vascular cerebral ou de melhorar as consequências de acidente vascular cerebral no sujeito da invenção juntamente com diluentes, conservantes, solubilizadores, emulsionantes, adjuvantes e/ou transportadores adequados úteis no tratamento de degradação neuronal devido a envelhecimento, uma incapacidade de aprendizagem ou uma perturbação neurológica. Essas composições são líquidos ou formulações liofilizadas ou secas de qualquer outra forma e incluem diluentes com vários tampões (por exemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH e força iónica, aditivos como albumina ou gelatina, para evitar a absorção em superfícies, detergentes (por exemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácidos biliares), agentes solubilizadores (por exemplo, glicerol, polietilenoglicerol), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (por exemplo, Timerosal, álcool benzílico, parabenos), substâncias de volume ou modificadores da tonicidade (por exemplo, lactose, manitol), ligação covalente de polímeros, como polietilenoglicol, ao composto, complexação com iões metálicos, ou incorporação do composto em ou sobre preparações em partículas de compostos poliméricos, como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogéis, etc., ou 32 sobre lipossomas, micro-emulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, fantasmas de eritrócitos ou esferoplastos. Essas composições influenciarão o estado físico, solubilidade, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de eliminação in vivo do composto ou composição. A escolha das composições dependerá das propriedades físicas e químicas do composto capaz de atenuar os sintomas da perturbação de acidente vascular cerebral ou de melhorar as consequências de acidente vascular cerebral no sujeito.

Composições de libertação controlada ou prolongada incluem formulação em sistemas de depósito lipófilos (por exemplo, ácidos gordos, ceras, óleos). Também são abrangidas pela presente candidatura composições em partículas revestidas com polímeros (por exemplo, poloxâmeros ou poloxaminas) e o composto acoplado a anticorpos dirigidos contra receptores, ligandos ou antigenes específicos de tecidos ou acoplado a ligandos de receptores específicos de tecidos. Outros aspectos das composições descritas aqui incorporam formas em partículas, revestimentos protectores, inibidores de proteases ou intensificadores da permeação para várias vias de administração, incluindo parentérica, pulmonar, nasal e oral.

Porções do composto da presente candidatura podem ser "etiquetadas" por associação a uma substância marcadora detectável (por exemplo, etiquetadas de forma radioactiva com 125I ou biotiniladas), para proporcionar reagentes úteis na detecção e quantificação do composto, ou de células que contêm o seu receptor, ou seus derivados em tecido sólido e amostras fluidas, como sangue, fluido da espinal-medula ou urina. 33

Quando administrados, os compostos são muitas vezes eliminados rapidamente da circulação e, assim, podem induzir actividade farmacológica de duração relativamente curta. Em consequência, podem ser necessárias injecções frequentes de doses relativamente grandes de compostos bioactivos para sustentar a eficácia terapêutica. Sabe-se que compostos modificados pela ligação covalente de polímeros solúveis em água, como polietilenoglicol, copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona ou poliprolina, exibem tempos de semi-vida substancialmente maiores no sangue após injecção intravenosa do que os correspondentes compostos não modificados (Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982, e Katre et al., 1987). Essas modificações também podem aumentar a solubilidade do composto em solução aquosa, eliminar a agregação, aumentar a estabilidade física e química do composto e reduzir grandemente a imunogenicidade e reactividade do composto. Em resultado, pode obter-se a actividade biológica desejada in vivo pela administração desses adutos polímero-composto menos frequentemente ou em doses mais baixas do que com o composto não modificado. A ligação de polietilenoglicol (PEG) a compostos é particularmente útil porque o PEG tem toxicidade muito baixa em mamíferos (Carpenter et al., 1971). Por exemplo, um aduto de PEG de adenosina desaminase foi aprovado nos Estados Unidos para utilização em humanos para o tratamento da síndroma de imunodeficiência combinada grave. Uma segunda vantagem conferida pela conjugação de PEG consiste em reduzir eficazmente a imunogenicidade e antigenicidade de compostos heterólogos. Por exemplo, um aduto de PEG de uma proteína humana poderá ser útil para o tratamento de 34 doenças noutras espécies de mamíferos sem o risco de desencadear uma resposta imunológica grave. 0 composto da presente invenção capaz de atenuar sintomas de uma perturbação cognitiva da memória ou aprendizagem pode ser distribuído num dispositivo de microencapsulação, de modo a reduzir ou prevenir uma resposta imunológica do hospedeiro contra o composto ou contra células que possam produzir o composto. 0 composto da presente invenção também pode ser distribuído microencapsulado numa membrana, como um lipossoma.

Polímeros como PEG podem ser convenientemente ligados a um ou mais resíduos de aminoácidos reactivos numa proteína, como o grupo alfa- -amino do aminoácido amino- -terminal, os grupos épsilon-amino de cadeias laterais de lisina, os grupos sulfidrilo de cadeias laterais de cisteína, os grupos carboxilo de cadeias laterais de aspartilo e glutamilo, o grupo alfa-carboxilo do aminoácido carboxi-terminal, cadeias laterais de tirosina, ou a derivados activados de cadeias de glicosilo ligadas a certos resíduos asparagina, serina ou treonina.

Foram descritas numerosas formas activadas de PEG adequadas para reacção directa com proteínas. Reagentes de PEG úteis para reacção com grupos amino de proteínas incluem ésteres activos de derivados de ácidos carboxílicos ou carbonatos, particularmente aqueles em que os grupos abandonantes são N-hidroxissuccinimida, p-nitrofenol, imidazolo ou 1-hidroxi-2-nitrobenzeno-4-sulfonato. Derivados de PEG que contenham grupos maleimido ou haloacetilo são reagentes úteis para a modificação de grupos sulfidrilo sem proteínas. Da mesma forma, reagentes de PEG que contenham grupos amino hidrazina ou hidrazida são úteis para reacção 35 com aldeídos gerados por oxidação com periodato de grupos hidratos de carbono em proteínas.

Empregando técnicas bem conhecidas, como titulação, e tomando em consideração as características farmacocinéticas observadas do agente no sujeito individual, o experimentado na área pode determinar um regime de dosagem apropriado. Ver, por exemplo, Benet et al., "Clinicai Pharmacokinetics" no capítulo 1 (páginas 20-32) da publicação de Good e Gilman "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8a edição, A. G. Gilman et al., editores (Pergamon, Nova Iorque, 1990) . A presente candidatura descreve uma composição farmacêutica que compreende um agente capaz de tratar uma perturbação de acidente vascular cerebral ou de melhorar as consequências de acidente vascular cerebral e um transportador farmaceuticamente aceitável. O transportador pode incluir, mas não se limita a um diluente, um aerossol, um transportador tópico, uma solução aquosa, uma solução não aquosa ou um transportador sólido.

Esta invenção é ilustrada na secção Pormenores Experimentais que se segue. Apresentam-se estas secções para ajudar a compreender a invenção, mas não se pretende que limitem, nem devem ser consideradas limitadoras, de modo nenhum, da invenção tal como apresentada nas reivindicações que depois se seguem. Em consequência, os exemplos seguintes não são necessariamente exemplos da invenção.

PORMENORES EXPERIMENTAIS 36

Abreviaturas: EC, célula endotelial; PMN, leucócito polimorfonucleado; WP, corpo de Weibel-Palade; vWF, factor de von Willebrand; EGTA, ácido etilenoglicol-bis-(amino-etiléter)tetracético; HBSS, solução de sal equilibrada de Hank; CS, seio coronário; IL, interleuquina; PAF, factor activador de plaquetas; ICAM-1, molécula de adesão intercelular-1; HUVEC, EC da veia umbilical humana; LR, solução de Ringer lactada; MCAO, oclusão da artéria cerebral média; rt-PA, activador do plasminogénio em tecidos recombinante; HO-I ou HOI ou HO I, heme oxigenase I; ICH, hemorragia intracerebral; OD, densidade óptica; MCA, artéria cerebral média; rt-PA, activador do plasminogénio em tipos de tecidos recombinante; TIA, ataque isquémico transitório; TTC, cloreto de trifeniltetrazólio. EXEMPLO 1: Protecção Cerebral em Ratinhos Homozigóticos Nulos para ICAM-1 Após Oclusão da Artéria Cerebral Média: Papel da Adesão de Neutrófilos na Patoqénese de Acidente Vascular Cerebral

Para investigar se leucócitos polimorfonucleados (PMNs) contribuem para sequelas neurológicas adversas e mortalidade após acidente vascular cerebral, e para estudar o papel potencial da molécula de adesão de leucócitos Molécula de Adesão Intercelular-1 (ICAM-1) na patogénese de acidente vascular cerebral, empregou-se um modelo murino de isquemia cerebral focal transitória que consiste em oclusão intraluminal da artéria cerebral média (MCA) durante 45 minutos seguida de 22 horas de reperfusão. A acumulação de PMNs, monitorizada por deposição de PMNs etiquetados com 111índio em tecido cerebral pós-isquémico, aumentou 2,5 vezes no hemisfério ipsilateral (com enfarte) em comparação com o hemisfério contralateral (sem enfarte) (p < 0,01). Os 37 ratinhos submetidos a depleção imunológica de neutrófilos antes da cirurgia exibiram uma redução de 3,0 vezes dos volumes de enfarte (p < 0,001), com base na coloração com cloreto de trifeniltetrazólio de secções cerebrais em série, fluxo de sangue cerebral cortical ipsilateral melhorado (medido por Doppler de laser) e deficiências neurológicas reduzidas em comparação com controlos. Em ratinhos de tipo selvagem submetidos a 45 minutos de isquemia seguida de 22 horas de reperfusão, mRNA de ICAM-1 aumentou no hemisfério ipsilateral, tendo-se localizado, por imuno-histoquimica, expressão acrescida de ICAM-1 em endotélio microvascular cerebral. Investigou-se o papel da expressão de ICAM-1 em acidente vascular cerebral em ratinhos homozigóticos nulos para ICAM-1 (ICAM-1 -/-) em comparação com controlos de tipo selvagem (ICAM-1 +/+). Os ratinhos ICAM-1 -/- exibiram uma redução de 3,7 vezes do volume de enfarte (p < 0,005), um aumento de 35% da sobrevivência (p < 0,05) e deficiências neurológicas reduzidas em comparação com controlos ICAM-1 +/+. O fluxo de sangue cerebral para o hemisfério com enfarte foi 3,1 vezes mais elevado em ratinhos ICAM-1 -/- em comparação com controlos ICAM-1 +/+ (p < 0,01), sugerindo um papel importante da ICAM-1 na génese de ausência de refluxo cerebral pós-isquémico. Uma vez que ratinhos com depleção de PMNs e deficientes em ICAM-1 são relativamente resistentes a isquemia cerebral-lesão de reperfusão, estes estudos sugerem um papel importante da adesão de PMNs mediada por ICAM-1 na patofisiologia de acidente vascular cerebral em progressão.

INTRODUÇÃO

Os neutrófilos (PMNs) estão criticamente envolvidos nas primeiras fases de inflamação após isquemia em tecidos, 38 iniciando funções de remoção que posteriormente também são assumidas por macrófagos. No entanto, há uma faceta mais adversa do influxo de neutrófilos, especialmente em tecidos pós-isquémicos 1-7, em que PMNs activados podem aumentar os danos em elementos celulares vasculares e do parênquima. Evidências experimentais apontam para um papel crucial de células endoteliais no estabelecimento de recrutamento pós-isquémico de PMNs, pois células endoteliais hipóxicas/ isquémicas sintetizam a citoquina pró-inflamatória IL-1 8 bem como o potente quimioatractor e activador de neutrófilos IL-8 9. A adesão firme de PMNs a endotélio activado num meio vascular pós-isquémico é promovida por relocalização de P-selectina para a superfície celular 10, bem como produção acrescida de factor activador de plaquetas e ICAM-1 11.

Se bem que estratégias para bloquear cada um destes mecanismos do recrutamento de neutrófilos sejam protectoras em vários modelos de isquemia e lesão de reperfusão, a sua eficácia em isquemia cerebral/lesão de reperfusão permanece controversa. Há evidências consideráveis de que, no cérebro, tal como noutros tecidos, um influxo inicial de PMNs se segue a um episódio isquémico 12-17. Estudos imuno-histoquímicos descreveram expressão acrescida das moléculas de adesão de PMNs P-selectina e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) na rede vascular cerebral pós-isquémica 12,18-20. contudo, a relevância patogénica da expressão de moléculas de adesão no cérebro permanece controversa; ainda não estão disponíveis dados de um ensaio de um anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 em acidente vascular cerebral em humanos. Em modelos animais há evidências experimentais que entram em conflito no que se refere à eficácia de estratégias anti-moléculas de adesão no 39 tratamento de acidente vascular cerebral experimental 21-23. Para determinar se a ICAM-1 participa na patogénese de lesão cerebral pós-isquémica conduziram-se as experiências relatadas aqui num modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão, para determinar o papel de um único mediador critico da adesão de PMNs (ICAM-1). Estes estudos demonstram que a expressão de ICAM-1 e influxo de neutrófilos aumentados se seguem a um episódio de isquemia cerebral focal. Além disso, estes estudos mostram que ratinhos deficientes em neutrófilos e nulos para ICAM-1 transgénicos são relativamente resistentes a enfarte cerebral após isquemia e reperfusão, oferecendo evidências fortes de um papel de exacerbação da ICAM-1 na patofisiologia de acidente vascular cerebral.

MATERIAIS E MÉTODOS

Ratinhos. Realizaram-se experiências com ratinhos transgénicos deficientes em ICAM-1, criados como previamente relatado por abordagem selectiva de genes em células estaminais embrionárias Jl, injecção em blastócitos C57BL/6 para obter transmissão da linha germinativa e retrocruzamento para obter ratinhos homozigóticos nulos para ICAM-1. Todas as experiências foram realizadas com ratinhos primos ICAM-1 -/- ou de tipo selvagem (ICAM-1 +/+) da quinta geração de retrocruzamentos com ratinhos C57BL/6. Os animais tinham sete até nove semanas de idade e pesavam entre 25-36 gramas na altura das experiências. Para certas experiências, obteve-se depleção de neutrófilos de ratinhos C57BL/6 por administração de anticorpo policlonal de coelho anti-neutrófilos de ratinho 25 (Accurate Scientific, Westbury, NI) pré-adsorvido em glóbulos vermelhos na forma de uma injecção intraperitoneal diária (0,3 ml de solução 1:12) durante 3 dias. As experiências nestes ratinhos foram 40 conduzidas no quarto dia após confirmação de agranulocitose por esfregaços de sangue periférico corado com Wright-Giemsa.

Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média 26. Os ratinhos foram anestesiados com uma injecção intraperitoneal de 0,3 ml de cetamina (10 mg/cm3) e xilazina (0,5 mg/cm3). Os animais foram posicionados em supinação numa superfície operatória com temperatura rectal controlada (Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH). A temperatura central dos animais foi mantida a 36-38°C intra-operatoriamente e durante 90 minutos pós-operatoriamente. Efectuou-se do modo seguinte a oclusão da artéria cerebral média. Fez-se uma incisão na linha média do pescoço para expor a bainha da carótida direita ao microscópio operatório (ampliação 16-25X, Zeiss, Thornwood, NI). A artéria carótida comum foi libertada da sua bainha e isolada com uma linha de seda 4-0, e cada uma das artérias ocipital e pterigopalatina foi isolada e dividida. Obteve-se controlo distai da artéria carótida interna e a carótida externa foi cauterizada e dividida, próximo da sua bifurcação, nas divisões lingual e maxilar. Efectuou-se a oclusão transitória da carótida fazendo avançar uma sutura de nylon 5-0 com a ponta tratada a quente de 13 mm via o tronco da carótida externa até à origem da artéria cerebral média. Após a colocação da sutura de oclusão, o tronco da artéria carótida externa foi cauterizado para prevenir hemorragia através da arteriotomia, tendo-se restabelecido o fluxo arterial. Em todos os casos, a duração da oclusão da carótida foi inferior a 2 minutos. Passados 45 minutos, removeu-se a sutura de oclusão para estabelecer a reperfusão. Estes procedimentos foram previamente descritos em pormenor 26. 41

Medição do fluxo de sangue cerebral cortical. Fizeram-se medições transcranianas do fluxo de sangue cerebral utilizando medições de fluxo por Doppler de laser (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) após reflexão da pele que recobre o calvarium, como previamente descrito (as leituras transcranianas foram consistentemente iguais às feitas após craniectomia em estudos-piloto) . Utilizando uma sonda de Doppler de laser linear de 0,7 mm (modelo #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) e pontos de referência previamente publicados (2 mm posterior ao bregma, 6 mm para cada lado da linha média), fizeram-se medições do fluxo relativo de sangue cerebral como indicado: imediatamente após a anestesia, após oclusão da artéria cerebral média, imediatamente após a reperfusão e às 24 horas imediatamente antes da eutanásia. Os dados estão expressos como razão da intensidade do sinal de Doppler no hemisfério isquémico em comparação com o hemisfério não isquémico. Apesar deste método não quantificar o fluxo de sangue cerebral por grama de tecido, a utilização de medições de fluxo por Doppler de laser em pontos de referência anatómicos definidos de forma precisa é um meio para comparar fluxos de sangue cerebral no mesmo animal em série ao longo do tempo. Considerou-se que o procedimento cirúrgico de oclusão intraluminal da artéria cerebral média e reperfusão era tecnicamente adequado se se observasse á 50% de redução do fluxo relativo de sangue cerebral imediatamente após a colocação da sutura de oclusão intraluminal e se se observasse um aumento á 33% do fluxo durante a oclusão de referência imediatamente após a remoção da sutura de oclusão. Estes métodos foram utilizados em estudos anteriores 26.

Preparação e administração de neutrófilos murinos etiquetados com 111In. Sangue citrado de ratinhos de tipo 42 selvagem foi diluído 1:1 com NaCl (0,9%), seguido de ultracentrifugação com gradiente em Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Após lise hipotónica de eritrócitos residuais (exposição durante 20 segundos a H20 destilada, seguida de reconstituição com NaCl 1,8%), os neutrófilos foram suspensos em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Suspenderam-se 5-7,5 x 106 neutrófilos em PBS com 100 μΟί de míndio-oxina (Amersham Mediphysics, Port Washington, NI) durante 15 minutos a 37°C. Após lavagem com PBS, os neutrófilos foram suavemente transformados em grânulos (450 g) e foram novamente suspensos em PBS para uma concentração final de 1,0 x 106 células/ml. Imediatamente antes da cirurgia administraram-se 100 μΐ de PMNs etiquetados de forma radioactiva misturados com soro fisiológico para um volume total de 0,3 ml (»3 x 106 cpm) por injecção na veia peniana. Após eutanásia compassiva obtiveram-se os cérebros como descrito, tendo-se quantificado a deposição de neutrófilos na forma de cpm/grama de cada hemisfério.

Exame Neurológico. Vinte e quatro horas após a oclusão da artéria cerebral média e reperfusão e antes de proceder à anestesia, os ratinhos foram examinados quanto a deficiências neurológicas utilizando um sistema de classificação de um até quatro 26. Atribuiu-se a pontuação (1) quando o animal exibiu movimentos espontâneos normais; atribuiu-se a pontuação (2) quando se notou que o animal se voltava para a direita (círculos na orientação dos ponteiros do relógio) quando visto de cima (isto é, na direcção do lado contralateral); atribuiu-se a pontuação (3) quando se observou que o animal rodava longitudinalmente (na orientação dos ponteiros do relógio quando visto da cauda); atribuiu-se a pontuação (4) quando 43 o animal se inclinou nas quatro patas, não respondendo a estímulos nocivos. Este sistema de pontuação tinha sido previamente descrito em ratinhos 26 e baseia-se em sistemas de pontuação semelhantes utilizados em ratos 28'29, que se baseiam no movimento contralateral de animais com acidente vascular cerebral; após enfarte cerebral, o lado contralateral está "fraco" e, assim, o animal tende a voltar-se para o lado enfraquecido. Trabalho prévio realizado em ratos e ratinhos demonstra que enfartes cerebrais de maior extensão estão associados a um grau mais elevado de movimento contralateral, até os enfartes serem tão grandes que o animal deixa de responder. Cálculo do Volume de Enfarte. Após o exame neurológico, os ratinhos receberam 0,3 ml de cetamina (10 mg/ml) e xilazina (0,5 mg/ml) e obtiveram-se medições finais do fluxo de sangue cerebral. Realizou-se eutanásia compassiva por decapitação sob anestesia; removeram-se os cérebros, que foram colocados numa matriz de cérebro de ratinho (Activational Systems Inc., Warren, MI) para se fazerem seccionamentos de 1 mm. As secções foram imersas em cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio 2% (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em solução salina tamponada com fosfato 0,9%, foram incubadas durante 30 minutos a 37°C e colocadas em formalina 10% 26, 30-32. o cérebro com enfarte foi visualizado como uma área de tecido não corado em contraste com tecido viável, que fica corado de vermelho tijolo. Calcularam-se os volumes de enfarte a partir de secções em série de planimetria, tendo sido expressos como percentagem de enfarte no hemisfério ipsilateral.

Extracção de RNA e análise de coloração "Northern". Vinte e quatro horas após isquemia focal e reperfusão, os cérebros 44 foram obtidos e divididos nos hemisférios ipsilateral (com enfarte) e contralateral (sem enfarte). Para detectar transcritos de ICAM-1 extraiu-se RNA total de cada hemisfério, utilizando um estojo de isolamento de RNA (Stratagene, La Jolla, CA). Colocaram-se quantidades iguais de RNA (20 \iq/v±a) num gel de agarose 1,4% que continha formaldeido 2,2 M para fraccionamento por tamanhos, que depois foram transferidas durante a noite para membranas de nylon (Nytran) com tampão 10X SSC por pressão capilar. Uma sonda de cDNA de ICAM-1 murina 33 (1, 90 kb, ATCC, Rockville, MD) foi etiquetada com 32P-a-dCTP por etiquetagem com "primers" aleatórios (estojo Prime-A-Gene, Promega) e hibridizada para colorações a 42°C, seguido de 3 lavagens de IX SSC/SDS 0,05%. As colorações foram desenvolvidas com filme X-Omat AR exposto com telas de luz a -70° durante 7 dias. Utilizou-se uma sonda de β-actina (ATCC) para confirmar a carga igual de RNA.

Imuno-histoquímica. Os cérebros foram removidos nas alturas indicadas após oclusão da artéria cerebral média, foram fixados em formalina 10%, embutidos em parafina e seccionados para imuno-histoquimica. As secções foram coradas com um anticorpo anti-ICAM-1 murina de rato (diluição 1:50, Genzyme, Cambridge MA) e os sítios de ligação do anticorpo primário foram visualizados com um anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina detectado com FastRed (TR/naftol AS-MX, Sigma Chemical Co., St. Louis MO).

Análise dos Dados. O fluxo de sangue cerebral, volumes de enfarte e pontuações de consequências neurológicas foram comparados utilizando o teste t de Student para variáveis 45 não emparelhadas. Avaliou-se a deposição de míndio-neutrófilos na forma de dados emparelhados [comparando o hemisfério contralateral (sem enfarte) com o hemisfério ipsilateral (com enfarte)], para controlar variações em contagens injectadas ou volume de distribuição. Testaram-se diferenças de sobrevivência entre grupos utilizando análise de contingência com a estatística de Qui-quadrado. Os valores estão expressos como médias ± EPM, em que um valor p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

Acumulação de Neutrófilos em Acidente Vascular Cerebral. Estudos patológicos prévios demonstraram ocorrer acumulação de neutrófilos após enfarte cerebral 15-17,34-36 _ para determinar se os neutrófilos se acumulam no modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão, quantificou-se a acumulação de neutrófilos após isquemia transitória (45 minutos) e reperfusão (22 horas) por medição da deposição de neutrófilos etiquetados com 1λ1Ιη administrados a ratinhos de tipo selvagem antes do acontecimento isquémico. Estas experiências demonstraram ocorrer acumulação de neutrófilos significativamente maior (aumento de 2,5 vezes) no hemisfério ipsilateral (com enfarte) em comparação com o hemisfério contralateral (sem enfarte) (n=7, p < 0,01; Figura 1) . Obtiveram-se resultados semelhantes quando o influxo de neutrófilos foi monitorizado por ensaios de mieloperoxidase, apesar de se terem registado níveis baixos de actividade no último ensaio (dados não mostrados).

Efeito da Depleção de Neutrófilos nas Consequências de Acidente Vascular Cerebral. Para determinar o efeito do influxo de neutrófilos nos índices das consequências de acidente vascular cerebral, os ratinhos foram submetidos a 46 depleção imunológica de neutrófilos iniciada três dias antes da cirurgia. Quando a cirurgia foi efectuada no quarto dia, foi evidente a ocorrência de agranulocitose quase completa em esfregaços de sangue periférico. Submeteram-se ratinhos neutropénicos (n=18) a 45 minutos de isquemia cerebral e 22 horas de reperfusão, tendo-se determinado os indices das consequências de acidente vascular cerebral. Os volumes de enfarte foram 3 vezes menores em animais neutropénicos em comparação com controlos de tipo selvagem (11,1 ± 1,6% versus 33,1 ± 6,4%, p < 0,001; Figura 2A). O decréscimo dos volumes de enfarte em ratinhos neutropénicos foi acompanhado de modo paralelo por pontuações reduzidas de deficiências neurológicas (Figura 2B) , fluxos aumentados de sangue cortical cerebral pós-reperfusão (Figura 2C) e uma tendência para mortalidade reduzida durante a noite (22% de mortalidade em ratinhos neutropénicos versus 50% de mortalidade em controlos, Figura 2D).

Expressão de ICAM-1 em Acidente Vascular Cerebral Murino. Para determinar o efeito de isquemia cerebral/reperfusão no modelo murino avaliaram-se os níveis de mRNA de ICAM-1 após isquemia cerebral e reperfusão em ratinhos de tipo selvagem. O hemisfério cerebral ipsilateral (com enfarte) exibiu mRNA de ICAM-1 aumentado por análise de coloração "Northern" em comparação com RNA obtido do hemisfério contralateral (sem enfarte) do mesmo animal (Figura 3) . Para avaliar a expressão de antigenes de ICAM-1 neste modelo murino, ratinhos de tipo selvagem foram sujeitos a 45 minutos de isquemia seguida de 23 horas de reperfusão e a rede microvascular cerebral foi examinada por imuno-histoquímica. A expressão de antigenes de ICAM-1 não foi detectável na rede microvascular cerebral contralateral ao 47 enfarte (Figura 4A) , mas aumentou acentuadamente no lado ipsilateral, com coloração de ICAM-1 proeminente de células endoteliais cerebrais (Figura 4B).

Papel da ICAM-1 em Acidente Vascular Cerebral. Para explorar o papel da ICAM-1 em acidente vascular cerebral estudaram-se ratinhos transgénicos homozigóticos deficientes em ICAM-1 no modelo munno de isquemia cerebral focal e reperfusão. Uma vez que foi relatado que variações na anatomia cerebrovascular resultam em diferenças de susceptibilidade a acidente vascular cerebral experimental em ratinhos 37, efectuou-se coloração com tinta da índia no Circulo de Willis em ratinhos homozigóticos nulos (ICAM-1 -/-) e ICAM-1 +/+. Estas experiências (Figura 5) revelaram não existirem grandes diferenças anatómicas no padrão vascular da circulação cerebral. Para determinar o papel da molécula de adesão intercelular-1 no influxo de neutrófilos após isquemia cerebral focal e reperfusão, mediu-se a acumulação de neutrófilos em ratinhos homozigóticos nulos para ICAM-1 (ICAM-1 -/-) (n=14) e controlos de tipo selvagem (n=7) infundidos com neutrófilos etiquetados com mIn. A acumulação relativa de neutrófilos (cpm ipsilateral/cpm contralateral) diminuiu (redução de 39%) nos ratinhos ICAM-1 -/- em comparação com controlos ICAM-1 +/+ (1,70 ± 0,26 versus 2,9 ± 0,52, p < 0,05).

Em seguida, realizaram-se experiências para investigar se a expressão de ICAM-1 exerce um efeito patofisiológico nas consequências de acidente vascular cerebral. Ratinhos ICAM-1 -/- (n=13) foram significativamente protegidos dos efeitos de isquemia cerebral focal e reperfusão, com base numa redução de 3,7 vezes do volume de enfarte (p < 0,01) 48 em comparação com controlos ICAM-1 +/+ (Figuras 6 e 7A) . Esta redução do volume de enfarte foi acompanhada de deficiências neurológicas reduzidas (Figura 7B) e fluxo aumentado de sangue cortical cerebral pós-reperfusão (Figura 7C) . Dados estes resultados, não foi surpreendente que a mortalidade também tivesse diminuído significativamente nos ratinhos ICAM-1 -/- em comparação com controlos ICAM-1 +/+ (15% versus 50%, p < 0,05; Figura 7D) .

DISCUSSÃO

Evidências epidemiológicas em humanos sugerem que neutrófilos contribuem para a iniciação de acidente vascular cerebral 38 e para lesões em tecido cerebral e fracas melhorias clinicas 39, com um papel potencial de neutrófilos em hipoperfusão pós-isquémica, disfunção neuronal e formação de escaras 40-44 . Apesar de existirem evidências experimentais consideráveis sugerindo que neutrófilos podem exacerbar danos em tecidos após acidente vascular cerebral 13-45-48^ alguns dados experimentais alimentaram controvérsias ao não conseguirem encontrar uma associação entre agentes que bloqueiam a acumulação de neutrófilos e índices de consequências de acidente vascular cerebral. Num modelo de rato de acidente vascular cerebral, a depleção de neutrófilos mediada por anticorpos antes do acidente vascular cerebral diminuiu significativamente o teor de água no cérebro e dimensão do enfarte 13. No entanto, leucocitopenia induzida por ciclofosfamida num modelo de gerbilo 49 ou administração de anticorpos anti-neutrófilos a cães 50 não deram origem a efeitos benéficos em modelos globais de isquemia cerebral. Uma terapia experimental com a finalidade de interferir em interacções neutrófilos-endoteliais também deu origem a resultados 49 misturados. Num modelo felino de isquemia cerebral focal transitória, o tratamento com um anticorpo para CD18 (a subunidade comum de β2 integrinas, que se liga à molécula de adesão intercelular-1 51) não alterou a recuperação do fluxo de sangue cerebral, retorno de potenciais evocados nem volume de enfarte 23. Todavia, noutras experiências verificou-se que a abertura microvascular após isquemia focal transitória em primatas é melhorada por anticorpos para CD18 14. Num modelo de rato semelhante, também foi mostrado que anticorpos anti-CDllb/CD18 reduzem a acumulação de neutrófilos e danos neuronais relacionados 52 com isquemia

As experiências relatadas aqui mostram que, num modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusâo, os neutrófilos se acumulam em tecido cerebral pós-isquémico, uma descoberta corroborada noutros modelos que demonstram, de modo semelhante, acumulação aumentada de granulócitos em áreas de baixo fluxo de sangue cerebral inicialmente durante o período pós-isquémico 15,16,36,45^ pão só os neutrófilos se acumulam durante o período pós-isquémico em ratinhos, mas também a sua presença exacerba os índices das consequências de acidente vascular cerebral. Quando os animais foram manipulados para se tornarem neutropénicos antes do acontecimento isquémico, os enfartes cerebrais foram menores, com perfusão cerebral melhorada após o acontecimento isquémico. Estes dados são bastante semelhantes aos relatados num modelo de coelho de acidente vascular cerebral tromboembólico, no qual a depleção imunológica de neutrófilos resultou em volume de enfarte reduzido e fluxo de sangue melhorado 35. Uma vez que os neutrófilos contribuem para lesão cerebral pós-isquémica murina, seguiu-se uma estratégia para elucidar o papel da 50 ICAM-1 na patofisiologia de acidente vascular cerebral utilizando ratinhos mutantes para ICAM-1 devido a deleção 24. As experiências indicam que ratinhos homozigóticos nulos para ICAM-1 são relativamente resistentes aos efeitos prejudiciais de isquemia cerebral e reperfusão.

Para demonstrar o papel de neutrófilos e da ICAM-1 na patogénese de lesão de tecidos em acidente vascular cerebral, os estudos relatados aqui fizeram uso de vários métodos para avaliar as consequências de acidente vascular cerebral. Não obstante numerosos investigadores terem utilizado coloração com TTC para quantificar volumes de enfarte cerebral 26'30"32'37'53^ tem havido alguma controvérsia quanto ao rigor deste método, especialmente quando avaliado na fase inicial após o acontecimento isquémico. No método de TTC, cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio (TTC) reage com enzimas oxidativas intactas em cristãs mitocondriais e, assim, é reduzido para um formazano corado 54. A coloração com TTC não é fiável antes de terem decorrido 2 horas de isquemia; para além das 36 horas, as células que se infiltram no tecido com enfarte podem ser coradas positivamente com TTC, desse modo obscurecendo a demarcação clara entre tecidos com enfarte e sem enfarte observada com coloração inicial 31. Apesar da extensão do enfarte delineada por coloração com TTC estar bem correlacionada com a extensão do enfarte delineada por coloração com hematoxilina e eosina ' , medições morfométricas directas tendem a sobrestimar os volumes de enfarte devido a edema cerebral, especialmente durante os 3 primeiros dias após o acontecimento isquémico 32. No entanto, mesmo dadas estas limitações, os estudos relatados aqui incorporam três métodos adicionais para definir o papel de neutrófilos e ICAM-1 nas consequências de acidente vascular cerebral, 51 incluindo pontuação de deficiências neurológicas, fluxo relativo de sangue cerebral para a área afectada e mortalidade. Estas medidas adicionais, que não dependem do rigor da coloração com TTC, contribuem fortemente para a identificação de um papel patogénico de neutrófilos e ICAM-1 em acidente vascular cerebral.

Houve uma profusão recente de estudos científicos que exploraram a base do mecanismo do recrutamento de neutrófilos para tecidos pós-isquémicos. As células endoteliais aparentam ser os grandes reguladores do tráfego de neutrófilos, regulando os processos de quimioatracção, adesão e emigração de neutrófilos a partir da rede vascular 55. Quando expostas a um ambiente hipóxico como paradigma de isquemia de tecidos, as células endoteliais sintetizam o potente quimioatractor e activador de neutrófilos Interleuquina-8 (IL-8) 9, cujo bloqueio parece ser benéfico num modelo de pulmão de isquemia e reperfusão 6. Adicionalmente, células endoteliais hipóxicas sintetizam a citoquina pró-inflamatória Interleuquina-1 8, que consegue regular positivamente a expressão endotelial das moléculas de adesão de neutrófilos E-selectina e ICAM-1 de uma forma autocrina 8,9,56. Outros mecanismos de adesão de neutrófilos também podem ser activados no cérebro após isquemia, como a libertação de P-selectina a partir de reuniões de armazenamento pré-formadas em membranas de corpos de Weibel-Palade 10. Num modelo de primata, a expressão da P-selectina foi rápida e persistentemente aumentada após isquemia da artéria cerebral média focal e reperfusão 18. Apesar do recrutamento de neutrófilos dependente da P-selectina parecer ser prejudicial após isquemia cardíaca e reperfusão 57, a sua relevância patofisiológica no cenário de acidente vascular cerebral ainda não foi determinada. Se 52 bem que hipoxia induza a síntese de novo do factor activador de plaquetas (PAF) lipídico bioactivo n, num modelo de isquemia-reperfusão da espinal-medula o antagonismo do PAF não ofereceu benefícios adicionais quando administrado simultaneamente com anticorpos para CD11/CD18 48 . A compreensão do papel da ICAM-1 na patofisiologia de acidente vascular cerebral parece ser particularmente relevante em humanos por vários motivos. A expressão aumentada de ICAM-1 cerebrovascular foi demonstrada em primatas às 4 horas de isquemia e reperfusão, particularmente na rede microvascular lenticuloestriada 18. Um estudo de autópsias de enfartes cerebrais recentes em humanos também demonstrou ter ocorrido expressão aumentada de ICAM-1 . Uma vez que ratos também expressam ICAM-1 vascular cerebral num período de 24 horas num modelo induzido fotoquimicamente de isquemia cerebral no rato 19 e num modelo de oclusão da artéria cerebral média 12, estes dados sugeriram a utilidade potencial de ratinhos transgénicos deficientes em ICAM-1 na elucidação da importância patofisiológica de expressão acrescida de ICAM-1 pós-isquemia cerebral. Em particular, a janela temporal da expressão de ICAM-1 (aumentada em 4 até 24 horas) nestes modelos sugere que interacções neutrófilos-endoteliais mediadas por ICAM-1 podem ser abordadas selectivamente em futuras estratégias farmacológicas para melhorar as consequências de acidente vascular cerebral humano, pois esta janela de tempo representa uma janela clínica realista para intervenção terapêutica.

Apesar de animais neutropénicos terem exibido fluxo acrescido de sangue cerebral regional em comparação com 53 controlos, em comparação com animais neutropénicos os ratinhos deficientes em ICAM-1 exibiram propensão para fluxos de sangue cerebral ipsilateral ainda mais elevados às 24 horas. Esta observação pode estar relacionada com o fenómeno de ausência de refluxo, no qual o fluxo de sangue não consegue regressar aos níveis pré-obstrução mesmo após libertação de uma oclusão vascular temporária. Uma quantidade significativa de estudos prévios implicou a obstrução por neutrófilos de leitos da rede microvascular capilar neste processo 58, apesar de, num modelo de isquemia cerebral global, uma redução de 85% da contagem de leucócitos em circulação não ter diminuído a incidência ou gravidade de falha de refluxo 49. Os dados sugerem que mecanismos não dependentes de neutrófilos, que ainda assim envolvem a ICAM-1, poderão contribuir para a ausência de refluxo pós-isquémico cerebrovascular. Tendo em vista que macrófagos e linfócitos expressam LFA-1, que medeia uma interacção adesiva com ICAM-1 de células endoteliais 51, é possível que em ratinhos deficientes em ICAM-1 ocorra recrutamento decrescido destas células mononucleares, uma possibilidade que presentemente está a ser suplementarmente investigada. Esta hipótese é suportada por múltiplas observações patológicas que demonstram acumulação de macrófagos e linfócitos aos 1-3 dias após enfarte cerebral 12,17,19,34,59

Considerados em conjunto, os estudos indicam que, num modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão, os neutrófilos se acumulam no hemisfério com enfarte e que animais neutropénicos exibem protecção cerebral. A expressão aumentada de ICAM-1 em células endoteliais cerebrais parece ser um mecanismo importante que conduz a este recrutamento de neutrófilos, e ratinhos que não 54 conseguem expressar a ICAM-1 exibem fluxos de sangue pós-isquémicos melhorados, volumes de enfarte reduzidos e mortalidade reduzida. Estes dados sugerem que estratégias farmacológicas destinadas a interferir nas interacções neutrófilos-endoteliais podem melhorar as consequências de acidente vascular cerebral em humanos.

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EXEMPLO 2: Exocitose Induzida por Hipoxia de Corpos de Weibel-Palade de Células Endoteliais: Um Mecanismo de Recrutamento Rápido de Neutrófilos Após Conservação Cardíaca O período de hipoxia (H) é um acontecimento iniciador importante para a disfunção vascular que acompanha a reperfusão, no qual células endoteliais (ECs) e neutrófilos (PMNs) desempenham um papel central. Pôs-se a hipótese da exocitose de corpos de Weibel-Palade (EP) de ECs durante o período hipóxico/isquémico durante a conservação de órgãos permitir o recrutamento vivo de PMNs para tecido pós-isquémico, um processo suplementarmente amplificado num meio rico em oxidantes. A exposição de ECs da veia umbilical humana a um ambiente hipóxico (pC>2 * 20 torr) estimulou a libertação de factor de von Willebrand (vWF), armazenado em corpos WP de ECs, bem como expressão aumentada da molécula de adesão de PMNs P-selectina derivada de corpos WP na superfície de ECs. A ligação acrescida de PMNs etiquetados com niIn a monocamadas de ECs hipóxicas (em comparação com controlos normóxicos) foi bloqueada com um anticorpo bloqueador para P-selectina, o que não aconteceu com um anticorpo de controlo não bloqueador. Apesar de também se terem notado expressão de 61 P-selectina e libertação de vWF aumentadas durante a reoxigenação, H isoladamente (mesmo na presença de antioxidantes) foi suficiente para aumentar a exocitose de corpos WP. Para determinar a relevância destas observações para a conservação cardíaca hipotérmica, durante a qual a pC>2 na rede vascular cardíaca diminui para níveis semelhantemente baixos, realizaram-se experiências num modelo de conservação/transplantação cardíaca de roedores (rato e ratinho). A depleção imunológica de PMNs receptores ou administração de um anticorpo anti-P-selectina bloqueador antes da transplantação resultou em infiltração reduzida de neutrófilos nos enxertos e sobrevivência melhorada dos enxertos, em comparação com corações identicamente conservados transplantados para receptores de controlo. Para determinar o importante papel da expressão de P-selectina endotelial na rede vascular do dador, realizaram-se transplantes murinos cardíacos utilizando corações dadores homozigóticos deficientes em P-selectina e de controlo de tipo selvagem que tinham sido limpos de sangue/plaquetas antes da conservação/transplantação. Os corações nulos para P-selectina transplantados para receptores de tipo selvagem exibiram uma redução acentuada (13 vezes) da infiltração de neutrófilos nos enxertos e sobrevivência aumentada dos enxertos em comparação com corações de tipo selvagem transplantados para receptores de tipo selvagem. Para determinar se pode ocorrer exocitose de corpos de Weibel-Palade endoteliais coronários durante a conservação cardíaca em humanos, mediu-se a libertação de vWF no seio coronário em 32 pacientes durante cirurgia aberto ao coração. As amostras do seio coronário obtidas no início e na conclusão do período isquémico exibiram um aumento do antigene de vWF do seio coronário (por ELISA) que consistiu predominantemente em multímeros de elevado 62 peso molecular (por imunoelectroforese). Estes dados sugerem que ocorre exocitose de corpos de Weibel-Palade de ECs durante a conservação cardíaca hipotérmica, fazendo com que a rede vascular inicie o recrutamento rápido de PMNs durante a reperfusão.

Introdução Células endoteliais (ECs) adaptam-se à hipoxia com um repertório característico de respostas (1), que variam desde expressão aumentada de endotelina (2) até síntese acrescida do factor de crescimento de fibroblastos básico (3) . Estudos recentes indicaram que muitas características da resposta de ECs a hipoxia são paralelas às características da resposta inflamatória; a hipoxia regula positiva e selectivamente a expressão em ECs das Interleuquinas 1 (4), 6 (5) e 8 (6), factor activador de plaquetas (PAF) (7,8) e ICAM-1 (4), que alimentam o recrutamento, adesão e activação de neutrófilos (PMNs) em loci isquémicos. Não obstante estes mecanismos poderem explicar as fases tardias da lesão de reperfusão, a rapidez do recrutamento de PMNs para miocárdio submetido a reperfusão após um período de conservação hipotérmica sugere estarem envolvidos mecanismos que não requerem a síntese de proteínas de novo. A este respeito, a P-selectina pode desempenhar um papel predominante nas primeiras fases da adesão de PMNs à rede vascular submetida a reperfusão, uma vez que as ECs podem expressar rapidamente P-selectina pré-formada a partir de sítios de armazenamento do subplasmalema em membranas de corpos de Weibel-Palade (9) em resposta aos abundantes radicais livres de oxigénio gerados no meio de reperfusão (10-12) . Suplementarmente, dados recentes indicaram um papel para o arresto de leucócitos mediado por P-selectina na 63 leucostasia e danos em tecidos associados a lesão do pulmão (13) e isquemia cardíaca (14) . Consideradas em conjunto, estas descobertas conduziram à hipótese do período hipóxico/isquémico associado à conservação hipotérmica do miocárdio fazer com que a rede vascular inicie a sua resposta característica durante a reperfusão ao exibir P-selectina predominantemente na superfície de ECs antes da reperfusão, servindo como faísca que desencadeia e amplifica a resposta inflamatória subsequente.

Conceberam-se experiências para determinar se hipoxia per se (ou conservação cardíaca hipotérmica, tal como ocorre durante cirurgia cardíaca, em que a pC>2 no leito coronário diminui para pC>2 < 20 Torr) (15) resultaria em exocitose de corpos WP. Suplementarmente, realizaram-se experiências para determinar o papel da adesão de PMNs dependente de P-selectina na falha de enxerto cardíaco que se segue, de forma característica, a um período de conservação hipotérmica prolongada. Os resultados mostram que a hipoxia é suficiente para induzir exocitose de corpos WP de ECs, mesmo na ausência de reoxigenação (e presença de antioxidantes), e que a expressão resultante de P-selectina provoca a ligação de ECs a PMNs in vitro.

Em roedores, as consequências adversas da expressão de P-selectina após conservação cardíaca hipotérmica podem ser completamente anuladas por depleção de neutrófilos, bloqueio de P-selectina ou por transplantação de corações cujas células endoteliais não conseguem expressar a P-selectina. Uma vez que a exocitose de corpos WP também ocorre em pacientes submetidos a cirurgia aberta ao coração durante o período de conservação cardíaca hipotérmica, estes dados sugerem que o bloqueio de P-selectina pode 64 representar um alvo para intervenção farmacológica com a finalidade de melhorar a conservação cardíaca em humanos. Métodos

Cultura de células endoteliais e exposição de células a H ou H/R. Prepararam-se ECs da veia umbilical humana a partir de cordões umbilicais, que cresceram em cultura pelo método de Jaffe (16) modificado por Thornton (17). Nas experiências utilizaram-se ECs confluentes (passagens 1-4) que cresceram em Meio 199 suplementado com soro fetal de bovino (15%; Gemini, Calabasas, CA), soro humano (5%; Gemini), suplemento de crescimento endotelial (Sigma, St. Louis, MO), heparina (90 \\,q/m±; Sigma) e antibióticos, como descrito (17) . Quando as ECs atingiram a confluência, conduziram-se experiências colocando culturas numa câmara ambiental (Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI) que proporcionou uma temperatura controlada (37 °C) e atmosfera com a quantidade indicada de oxigénio e dióxido de carbono (5%) e equilibrada com azoto. A utilização desta câmara para experiências de cultura de células foi previamente descrita (15,18). Durante a exposição de ECs a hipoxia (durante um período máximo de 16 horas), a tensão de oxigénio no meio de cultura foi 14-18 torr e não houve alterações do pH do meio. Efectuou-se a reoxigenação colocando ECs numa atmosfera ambiente que continha dióxido de carbono (5%) a 37 °C.

Medição da exocitose de corpos de Weibel-Palade. Plaquearam-se ECs em placas de 24 cavidades, tendo sido enxaguadas 3 vezes com solução de sal equilibrada de Hank e depois expostas a hipoxia ou normoxia durante os períodos indicados. Para experiências em que se mediu o vWF, as células foram mantidas em meio sem soro. Todas as outras 65

experiências com ECs foram realizadas no meio de crescimento de ECs descrito acima. Para a medição de vWF, removeram-se aliquotas de 200 μΐ do sobrenadante de cultura nas alturas indicadas e realizou-se em espécimes duplicados um ensaio ELISA comercialmente disponível (American Diagnostica, Greenwich, CT) , com base num anticorpo policlonal anti-vWF humano de cabra, tendo-se gerado uma curva padrão utilizando antigene de vWF humano purificado fornecido pelo mesmo vendedor. Determinou-se a expressão de P-selectina em ECs medindo a ligação específica de um anticorpo monoclonal murino anti-P-selectina humana (clone WAPS 12.2, Endogen, Cambridge, MA; é uma IgGl que reconhece um epítopo sensível ao cálcio e bloqueia a adesão de neutrófilos dependente de P-selectina). O anticorpo foi etiquetado de forma radioactiva com 125I pelo método da lactoperoxidase (19) utilizando Enzymobeads (Bio-Rad, Hercules, CA) , foi armazenado a 4 °C e utilizado num período de uma semana após a etiquetagem. Efectuaram-se ensaios de ligação em HUVECs plaqueadas em placas de 96 cavidades, tendo-se adicionado M199 fresco com albumina de soro bovino 0,1% (Sigma, St. Louis, MO) imediatamente antes de cada experiência. As células foram colocadas num ambiente humidificado a 37 °C e foram expostas a normoxia ou H (na presença ou ausência de probucol 50 μΜ, como indicado, Sigma) durante os períodos de tempo indicados. As monocamadas celulares foram fixadas durante 15 minutos com paraformaldeído 1% 10 (as células expostas a H foram fixadas enquanto ainda estavam no ambiente hipóxico), foram inspeccionadas visualmente para assegurar que as monocamadas permaneceram intactas e foram lavadas duas vezes com HBSS que continha albumina de soro bovino 0,5% (HBSS/A). Em seguida, as monocamadas foram expostas a 105 cpm de anticorpo anti-P-selectina etiquetado com 125I (WAPS 66 12.2) na presença de 200 μς/ΓηΙ de anticorpo bloqueador não etiquetado (WAPS 12.2) ou de IgG anti-P-selectina não bloqueadora do mesmo isotipo (anti-GMP-140, clone AC1.2, Becton-Dickinson, San Jose, CA) (20,21). Após ligação durante 1 hora a 37 °C, as monocamadas foram lavadas 4 vezes com HBSS/A, o anticorpo ligado foi eluido com Triton X-100 1% em PBS (200 μΐ/cavidade) e foi contado. Para certas experiências adicionou-se ciclo-heximida (10 μρ/πιΐ, Sigma) no inicio do período normóxico ou hipóxico de 4 horas, como indicado. Em experiências separadas, concebidas para determinar o grau de inibição da síntese de proteínas por tratamento com ciclo-heximida, incubaram-se ECs com meio essencial mínimo com baixo teor de metionina e cisteína (Gibco, Grand Island, NI) na presença de 35S-metionina e 35S-cisteína (na presença ou ausência de ciclo-heximida, 10 μς/ιηΐ) (3) . Após 4 horas de exposição normóxica, recolheu-se e contou-se o material apto a ser precipitado com ácido tricloroacético.

Preparação de PMNs Humanos e Medição da Ligação. Em resumo, sangue citrado de dadores saudáveis foi diluído 1:1 com NaCl (0,9%), seguido de ultracentrifugação com gradiente em Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Após lise hipotónica de eritrócitos residuais (exposição durante 20 segundos a H20 destilada seguida de reconstituição com NaCl 1,8%), os PMNs foram suspensos em HBSS com 5 mg/ml de albumina de soro humano (HBSS/HSA). Suspenderam-se 50-200 x 106 PMNs em HBSS/HSA na presença de 0,2-0,5 μΟί de ulíndio-oxina (Amersham Mediphysics, Port Washington, NI) durante 15 minutos a 37 °C. Após lavagem com HBSS/HSA, os PMNs foram suavemente transformados em grânulos (450 g) e foram novamente suspensos em HBSS/HSA para uma concentração final 67 de 5,5 x 106 PMNs/ml. Após agitação suave, adicionaram-se a cada cavidade, na altura indicada, 100 μΐ da suspensão de PMNs etiquetados de forma radioactiva, o sistema foi incubado durante 30 minutos a 37 °C e depois foi lavado 4 vezes com HBSS/HSA. Em seguida, trataram-se as monocamadas com NaOH 1 N e removeu-se e contou-se o conteúdo de cada cavidade.

Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico de Rato e Ratinho. Efectuaram-se transplantes cardíacos no modelo de isoenxerto heterotópico de Ono-Lindsey de transplantação cardíaca (15,18,22). Em resumo, ratos machos Lewis (250-300 gramas, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) foram anestesiados, heparinizados e o coração dador foi rapidamente removido após paragem cardioplégica hipotérmica com grande quantidade de potássio. Os corações foram conservados lavando as artérias coronárias com solução de Ringer (LR) lactada a 4 °C (Baxter, Edison, NJ) e dezasseis horas de imersão na mesma solução a 4 °C, seguida de transplantação heterotópica para receptores de género/estirpe correspondentes, tendo-se realizado anastomoses sequenciais aórticas no dador e receptor e da artéria pulmonar do dador/veia cava inferior do receptor. Avaliou-se a sobrevivência dos enxertos pela presença/ausência de actividade eléctrica/mecânica cardíaca exactamente dez minutos após o restabelecimento do fluxo de sangue; em seguida, o enxerto foi excisado e quantificou-se a infiltração de neutrófilos pela actividade de mieloperoxidase, medida como previamente descrito (15,18). Para certas experiências, obteve-se depleção de neutrófilos de ratos receptores por administração de um anticorpo policlonal de coelho anti-neutrófilos de rato (23-25) (Accurate Scientific, Westbury, NI) na forma de uma única 68 injecção intravenosa 24 horas antes do procedimento de transplantação. A depleção de neutrófilos nestes animais foi confirmada e quantificada contando os neutrófilos remanescentes, identificados em esfregaços corados com Wright-Giemsa de sangue periférico. Noutras experiências, administrou-se intravenosamente uma IgG anti-P-selectina bloqueadora (250 μg/rato, Cytel, San Diego, CA) (13,14,26) 10 minutos antes do inicio da reperfusão. Os transplantes de coração murino foram efectuados de forma idêntica, utilizando ratinhos machos homozigóticos nulos para P-selectina ou de controlo de tipo selvagem com um fundo C57BL/6J (27), em que os corações removidos foram imediatamente lavados para eliminar sangue nativo com 1,0 ml de LR a 4°C administrados ao longo de uma raiz aórtica fechada de forma cruzada, seguido de um período de conservação hipotérmica que consistiu em três horas de imersão em solução de Ringer lactada a 4 °C.

Medição de vWF em Efluente Coronário de Corações de Rato e Humano Conservados de Forma Hipotérmica.

Amostras de seio coronário humano. Após consentimento informado, obteve-se sangue do seio coronário no início e conclusão de cirurgia cardíaca de rotina numa série não seleccionada de 32 pacientes, com amostragem simultânea de sangue periférico (arterial) em seis. Obtiveram-se amostras do seio coronário com um cateter de perfusão retrógrada, que foi rotineiramente colocado em pacientes submetidos a derivação cardiopulmonar. As amostras de plasma foram centrifugadas durante 5 minutos a 1500 x g, para sedimentar elementos celulares, e o plasma foi separado em alíquotas e congelado a -70 °C até à altura do ensaio. Efectuaram-se ELISAs para o vWF (como descrito acima) e trombomodulina (Asserchron Thrombomodulin, Diagnostica Stago) . 69

Imunoelectroforese de vWF. Avaliou-se a composição multimérica do vWF em amostras de plasma do seio coronário e sobrenadantes de células endoteliais realizando imunoelectroforese em gel de agarose. As amostras foram diluídas 1:10, 1:20 e 1:30 (como indicado) e foram incubadas durante 30 minutos a 37 °C em Tampão de Amostras Nativo (Bio-Rad) . Em seguida, as amostras (20 μΐ) foram submetidas a electroforese num gel de agarose 1,5% (0,675 g de agarose Low Mr, Bio-Rad; 0,045 g de SDS; 45 ml de Tampão Tris-Tricine SDS [Bio-Rad]). Os marcadores de pesos moleculares processados simultaneamente em géis de agarose foram visualizados por marcação e divisão do gel, em que as localizações dos marcadores de pesos moleculares foram atribuídas por coloração com azul de Coomasie. A outra metade do gel foi lavada em borato de sódio (0,01 M) durante 30 minutos, seguida de transferência electroforética durante a noite para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi lavada com tampão de lavagem que consistiu em solução salina tamponada com Tris (pH 7,5) com Tween-20 0,05%, e depois foi bloqueada durante 1 hora com 50 ml de tampão de lavagem que continha 2,5 g de leite instantâneo Carnation. Após enxaguamento com soro fisiológico, a membrana foi imersa durante a noite em tampão de lavagem que continha 1 g/dl de gelatina e uma diluição 1:500 de soro de coelho anti-vWF humano (American Bioproducts, Parsippany, NJ) . Depois de ser lavada 5 vezes com tampão de lavagem, a membrana foi imersa durante 3 horas, com agitação suave, em tampão de lavagem que continha 1 g/dl de gelatina e 16,6 μΐ de IgG de cabra anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano bravo (Bio-Rad) e foi desenvolvida com 60 ml de HRP Developer (30 mg de pó HRP Developer, Bio-Rad; 10 ml de metanol; 50 ml de solução 70 salina tamponada com Tris; 50 μΐ de peróxido de hidrogénio 30% adicionado imediatamente antes da utilização).

Estatística. Utilizou-se análise da variância para comparar 3 ou mais condições, em que as comparações pós-hoc foram testadas utilizando o procedimento de Tukey. Analisaram-se os dados de sobrevivência dos enxertos utilizando análise de contingência com a estatística de Qui-quadrado. As comparações emparelhadas de medições em série (amostras de CS e sangue periférico humanos no início e conclusão da cirurgia cardíaca) foram feitas utilizando o teste t de Student para variáveis emparelhadas. Os valores estão expressos na forma de médias ± EPM, em que um valor p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Exposição de ECs cultivadas a hipoxia resulta na libertação de vWF e relocalização de P-selectina para a superfície celular. Estudos prévios mostraram que a exposição de células endoteliais a hipoxia resulta num aumento do cálcio intracelular (28) . Tendo em vista a associação de cálcio citosólico aumentado a exocitose de corpos de Weibel-Palade de ECs em resposta a trombina ou histamina (29,30), considerou-se se a exposição de ECs a hipoxia poderia iniciar este processo. ECs colocadas num ambiente hipóxico (p02 20 torr) libertaram mais vWF para os sobrenadantes de cultura do que os seus correspondentes normóxicos (Fig. 8A, ELISA; confirmado por imunoelectroforese, dados não mostrados). Apesar de se ter notado primeiramente uma tendência para níveis aumentados de vWF à 1 hora de hipoxia, as diferenças entre os níveis de vWF normóxicos e hipóxicos só se tornaram estatisticamente significativas após 4 horas de exposição, aumentando depois de modo 71 consistente até às 12 horas de observação. Para determinar se a libertação aumentada de vWF observada às 4 horas de hipoxia se devia à libertação de vWF pré-formado conduziram-se experiências semelhantes na presença de 10 μρ/πιΐ de ciclo-heximida, para inibir a sintese de proteínas. Estas experiências mostraram que a adição de ciclo-heximida no início do período hipóxico diminuiu a libertação de vWF induzida por hipoxia em 12,5%, sugerindo que a maior parte do vWF libertado por exposição hipóxica era pré-formado. Não obstante estas experiências terem sido totalmente realizadas no ambiente hipóxico (isto é, sem reoxigenação), para demonstrar suplementarmente que esta exocitose mediada por H de corpos de Weibel-Palade era independente da formação de intermediários de oxigénio reactivos, adicionou-se o antioxidante probucol (50 μΜ) às ECs no início de H, tendo-se verificado não exercer nenhum efeito (vWF 4,7 + 0,31 x 10’3 U/ml às 6 horas de H). A presença de probucol mitigou o aumento suplementar dos níveis de vWF observados após reoxigenação das ECs hipóxicas. Demonstrou-se a dependência de cálcio da exocitose de corpos de Weibel-Palade induzida por hipoxia por experiências nas quais ECs foram colocadas num meio sem cálcio no início da exposição hipóxica. A ausência de cálcio extracelular atenuou a libertação de vWF por ECs induzida por H e a adição de EGTA teve um efeito ainda mais supressor (a libertação endotelial basal de vWF também diminuiu em resultado da redução de cálcio extracelular) (Fig. 8B).

Para determinar se a hipoxia também induzia relocalização de P-selectina para a superfície do plasmalema de ECs, examinou-se a ligação específica de IgG anti-P-selectina 72 etiquetada com 125I a monocamadas de ECs normóxicas ou hipóxicas. Os estudos de ligação foram efectuados em monocamadas de ECs fixadas com paraformaldeido enquanto ainda estavam no ambiente hipóxico, para obviar a expressão de P-selectina induzida por radicais livres de oxigénio durante a reoxigenação. Estes estudos demonstraram ligação acrescida de IgG I-anti-P-selectma por ECs hipóxicas em comparação com ECs normóxicas (Fig. 9A) . Esta ligação foi bloqueada por IgG anti-P-selectina bloqueadora não etiquetada, mas não por uma IgG anti-P-selectina de controlo não bloqueadora do mesmo isotipo. Notou-se expressão de superfície de P-selectina nos primeiros instantes de observação (60 minutos de H) e foi observada, em níveis semelhantes, ao longo do período da exposição hipóxica (até 4 horas de observação) . É possível que a expressão de P-selectina endotelial induzida por hipoxia tenha sido detectada em instantes anteriores a um aumento estatisticamente significativo de libertação de vWF em células tratadas de forma semelhante, uma vez que uma porção do vWF inicialmente segregado se liga fortemente à matriz subendotelial (31).

Para determinar se a síntese de proteínas era necessária para a expressão de P-selectina induzida por hipoxia realizou-se uma experiência separada na qual se administrou ciclo-heximida no início da normoxia ou H, tendo-se determinado a ligação de IgG anti-P-selectina etiquetada de forma radioactiva às 4 horas. Esta experiência demonstrou que, mesmo com inibição > 85% da síntese de proteínas (Fig. 9B, Inserção), a hipoxia ainda aumentou a expressão de P-selectina endotelial, apesar de o ter feito em níveis reduzidos (Fig. 9B) . Para determinar se a P-selectina da superfície celular induzida por hipoxia poderia participar 73 na ligação de neutrófilos, neutrófilos humanos etiquetados de forma radioactiva com 111índio-oxina foram incubados com ECs hipóxicas; observou-se ligação aumentada às monocamadas hipóxicas. A ligação de 111ln-PMNs induzida por hipoxia foi bloqueada pela adição de uma IgG anti-P-selectina bloqueadora, mas não por uma IgG anti-P-selectina não bloqueadora (Fig. 9C).

Papel da adesão de neutrófilos dependente de P-selectina na conservação miocárdica hipotérmica/isquémica. Com a finalidade de determinar a relevância destas observações na conservação miocárdica hipotérmica (em que a pCU da solução de conservação na rede vascular coronária diminui para menos de 20 Torr (15)), removeram-se corações de ratos machos Lewis, tendo sido sujeitos a conservação hipotérmica como descrito na secção Métodos. Uma vez que os danos mediados por neutrófilos após isquemia cardíaca estão bem determinados (32-38), investigou-se o potencial papel patofisiológico da expressão de P-selectina endotelial num modelo de transplante de coração ortotópico de rato no qual se efectuou reperfusão após um período de conservação hipotérmica. Estas experiências revelaram excelente sobrevivência dos enxertos e pouca infiltração de neutrófilos quando a transplantação do coração foi realizada imediatamente após a recolha (Fig. 10A, Fresco). No entanto, quando se realizaram experiências semelhantes com um período intermediário (16 horas) de conservação hipotérmica entre os procedimentos de remoção e transplantação, observou-se elevada incidência (90%) de falha dos enxertos e leucostasia acentuada, confirmada histologicamente e determinando a actividade de mieloperoxidase (Fig. 10A, Prsvd). Para demonstrar que a adesão de neutrófilos era responsável, pelo menos em parte, 74 por falha dos enxertos após conservação prolongada, realizaram-se transplantações após depleção de neutrófilos de ratos receptores. 0 anticorpo policlonal de coelho anti-PMNs de rato utilizado (23-25) eliminou virtualmente todos os PMNs em circulação nos receptores (contagem de PMNs 1471 ± 56 versus 67 ± 11 PMNs/mm3 para animais de controlo e submetidos a depleção imunológica, respectivamente, p < 0,001), com poucos efeitos noutros tipos de células. Quando corações conservados durante 16 horas foram transplantados para receptores submetidos a depleção de neutrófilos, para proporcionar um meio de reperfusão sem neutrófilos, observou-se uma redução significativa da actividade de mieloperoxidase nos enxertos e um aumento da sobrevivência dos enxertos (Fig. 10A, Prsvd (-) PMN). Ratos receptores normais infundidos com IgG anti-P-selectina bloqueadora 10 minutos antes do restabelecimento do fluxo de sangue exibiram uma redução da actividade de mieloperoxidase e uma melhoria da sobrevivência dos enxertos (Fig. 10A, a-PS, Bloqueador) de magnitude semelhante aos receptores submetidos a depleção de neutrófilos. Esta infiltração reduzida de PMNs e sobrevivência melhorada dos enxertos foi observada apesar de 16 horas de conservação hipotérmica do coração dador. Em contraste abrupto, a administração de um anticorpo de controlo não bloqueador (AC1.2) não exerceu nenhum efeito benéfico na leucostasia dos enxertos nem na sobrevivência dos enxertos (Fig. 10A, α-PS, Não-bloqueador).

Uma vez que, para além das interacções entre Ecs e PMNs, as plaquetas também podem interagir com PMNs via um mecanismo dependente da P-selectina (39), concebeu-se uma experiência para isolar a contribuição de P-selectina endotelial para a leucostasia e falha de enxertos que ocorrem após 75 conservação cardíaca hipotérmica prolongada. Para estas experiências, corações dadores de ratinhos homozigóticos deficientes em P-selectina foram lavados para eliminar o sangue, de modo que células endoteliais coronárias nulas para P-selectina pudessem ser transplantadas em receptores de tipo selvagem com plaquetas que continham P-selectina. Utilizando um modelo murino de transplante de coração heterotópico realizado de forma idêntica à operação em ratos, obtiveram-se corações dadores de ratinhos homozigóticos nulos para P-selectina (27) ou de controlos de tipo selvagem; todos os corações foram transplantados para receptores de tipo selvagem. Estas experiências demonstraram uma taxa significativamente mais elevada de sobrevivência dos enxertos nos transplantes nulo para P-selectina - tipo selvagem em comparação com os transplantes tipo selvagem - tipo selvagem (Fig. 10B). Esta sobrevivência melhorada dos enxertos no primeiro grupo foi acompanhada de uma redução acentuada (13 vezes) de leucostasia dos enxertos (Fig. 10C) . Uma vez que estes corações tinham sido lavados para eliminar o sangue no início da conservação, estes estudos implicam P-selectina endotelial coronária (em vez de derivada de plaquetas) na má conservação e arresto de leucócitos notados após conservação miocárdica hipotérmica.

Exocitose de corpos de Weibel-Palade durante cirurgia cardíaca humana. Com a finalidade de determinar a relevância destas descobertas em humanos, concebeu-se o seguinte conjunto de experiências para demonstrar que ECs coronárias libertam o conteúdo de corpos de Weibel-Palade durante conservação cardíaca hipotérmica tal como ocorre durante cirurgia cardíaca de rotina. Mediu-se a libertação de vWF a partir da rede vascular coronária durante um 76 período bem definido de isquemia cardíaca, aquele que ocorre durante o período de fecho aórtico cruzado. Procedeu-se à amostragem de sangue do seio coronário (por drenagem do coração) no início (CSi) e conclusão (CS2) do fecho aórtico cruzado em 32 pacientes (este intervalo representa o período isquémico). Estes pacientes (23 indivíduos do sexo masculino, 9 indivíduos do sexo feminino) tinham um historial clínico de doença valvular cardíaca (n=ll) ou doença cardíaca isquémica (n=21) e foram submetidos a reparação/substituição da válvula ou a enxerto de derivação da artéria coronária, respectivamente. ELISAs de captura realizadas para a proteína membranar integral trombomodulina (40) não revelaram alterações nos níveis entre as amostras CSi e CS2 (4,35 ± 1,2 ng/ml versus 3,48 ± 0,8 ng/ml, p=NS), sugerindo que as ECs não foram desagregadas e que a integridade das membranas celulares foi mantida durante a conservação cardíaca. Medições semelhantes realizadas para o vWF mostraram ter havido um aumento consistente e significativo do vWF que é segregado durante a conservação cardíaca (0,68 ± 0,06 U/ml versus 0,90 ± 0,05 U/ml, CSi versus CS2, p < 0,01) (Fig. 11A) .

Para demonstrar ser provável que este vWF fosse de origem endotelial coronária em vez de ser originário de plaquetas e, assim, não simplesmente uma consequência da derivação cardiopulmonar, obtiveram-se amostras de sangue periférico simultaneamente com as amostras CSi e CS2, tendo revelado que os níveis de vWF permaneceram inalterados (0,813 ± 0,52 U/ml versus 0,900 ± 0,41 U/ml, p=NS), sugerindo que a perturbação mecânica de plaquetas durante a derivação cardiopulmonar não foi causadora. Uma vez que o vWF está presente no plasma na forma de multímeros com uma gama de Mr's (41-44), em que os multímeros do vWF da reunião apta a 77 ser estimulada (em oposição aos segregados de forma constitutiva) tinham os pesos moleculares mais elevados (45), efectuou-se imunoelectroforese nas amostras de CS. Estes géis mostraram que, para além de um aumento global do vWF nas amostras CS2, pareceu haver um aumento dos multimeros de elevado peso molecular, o que sugere libertação de uma reunião apta a ser estimulada, tal como se encontra em células endoteliais (Fig. 11B).

Discussão A rede vascular desempenha um papel crítico na manutenção do meio extracelular de órgãos sujeitos a isquemia e reperfusão, um papel que é maioritariamente dirigido pelas ECs que revestem o lúmen endovascular. A EC responde a um período de privação de oxigénio por modulação fenotípica acentuada, tornando-se pró-trombótica (46) e pró-inflamatória (1,4,6). As ECs expostas a hipoxia segregam as citoquinas pró-inflamatórias IL-1 (4) e IL-8 (6), que podem dirigir o tráfego de leucócitos para áreas de isquemia. Uma vez que estes processos requerem a síntese de proteínas de novo, não explicam os acontecimentos imediatos que se dão após um período de conservação hipotérmica. Se bem que a expressão acrescida de ICAM-1 e indução de E-selectina possam contribuir, em instantes posteriores, para o arresto de leucócitos em enxertos cardíacos, isto não explica a rápida leucostasia observada após conservação a frio, em que é provável que a síntese de proteínas seja consideravelmente abrandada. Neste contexto, o pré-tratamento com ciclo-heximida não altera a adesão inicial (90-120 minutos) de PMNs observada após exposição hipóxica de ECs (7) , o que sugere não ser necessário que a síntese de proteínas de novo esteja envolvida em aumentos mediados por hipoxia da ligação de PMNs. Apesar do factor activador 78 de plaquetas (PAF) poder participar na adesão (7,47) e activação (48,49) de PMNs mediadas por hipoxia, o PAF não é armazenado e tem que ser sintetizado, o que poderá atenuar a sua importância durante o período hipotérmico da conservação miocárdica. É por este motivo que a expressão rápida em ECs de P-selectina pré-formada a partir de sítios de armazenamento do subplasmalema em corpos de Weibel-Palade (9,50,51) poderá ser o mecanismo mais importante do recrutamento inicial de PMNs após conservação hipotérmica. Os corpos de Weibel-Palade estão presentes em abundância na rede microvascular coronária (52), sugerindo a sua importância particular na conservação cardíaca.

Os dados mostram que ocorre exocitose de Weibel-Palade em resposta a hipoxia per se e em corações humanos durante conservação hipotérmica. Não obstante ser difícil identificar de forma precisa uma origem endotelial para o vWF observado nas amostras do seio coronário humano, estudos de plaquetas após derivação cardiopulmonar não demonstram um aumento da expressão de P-selectina na superfície nem secreção de grânulos α (53,54). Isto sugere que o aumento observado do vWF do seio coronário após fecho aórtico cruzado não tem origem nas plaquetas. Dois aspectos dos dados também sugerem que o vWF libertado após isquemia tem origem endotelial; (1) os níveis periféricos de vWF permaneceram inalterados, ao passo que os níveis no seio coronário estão aumentados após isquemia do miocárdio, sugerindo que o vWF acrescido proveio do coração, não do aparato da derivação cardiopulmonar; (2) os corações dadores transgénicos nulos para P-selectina foram lavados para eliminar o sangue dador no início da conservação, de modo que, quando transplantados para receptores de tipo selvagem, é presumível que P-selectina endotelial coronária 79 (não de plaquetas) esteja ausente. Estas experiências demonstram a importante contribuição de P-selectina endotelial para o recrutamento de neutrófilos que acompanha a reperfusão. Não é surpreendente que a P-selectina deva ser importante após conservação miocárdica hipotérmica; estudos recentes demonstraram que a P-selectina é um mediador importante dos danos de reperfusão induzidos por neutrófilos após isquemia normotérmica, como foi mostrado em modelos de isquemia de ouvido de coelho (26) e cardíaca felina (14) . Uma vez que oxidantes provocam a expressão de P-selectina na superfície de ECs (10), foi importante avaliar nestes estudos o papel do período hipóxico isoladamente, pois pode activar ECs para recrutarem a primeira onda de PMNs, em que o recrutamento suplementar de PMNs é amplificado com a investida de intermediários de oxigénio reactivos produzidos no microambiente de reperfusão. Apesar de um relato ter sugerido que a hipoxia poderia induzir expressão de P-selectina em ECs, estas experiências (7) foram, de facto, realizadas após reoxigenação, uma condição que se sabe induzir aderência de superóxido (18,55) e neutrófilos a ECs cultivadas (56). Em contraste, as experiências descritas aqui foram inteiramente realizadas num ambiente hipóxico para prevenir totalmente a possibilidade de reoxigenação, e antioxidantes não conseguiram bloquear a expressão de P-selectina induzida por hipoxia, sugerindo que as observações descritas aqui reflectem hipoxia per se em vez de reoxigenação.

Suplementarmente, a protecção cardíaca demonstrada aqui, utilizando uma estratégia pela qual corações conservados sem sangue de ratinhos transgénicos nulos para P-selectina 80 são transplantados para receptores com plaquetas de tipo selvagem, demonstra que a expressão de P-selectina endotelial pode ser prejudicial após conservação cardíaca hipotérmica. Uma vez que ocorre exocitose de corpos de Weibel-Palade durante a conservação cardíaca hipotérmica em humanos, estes estudos sugerem que a conservação miocárdica pode ser intensificada por estratégias terapêuticas concebidas para bloquear a actividade de P-selectina expressa na superfície endotelial.

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Apesar de terem sido descritos pormenorizadamente modelos de isquemia cerebral focal em ratos, são escassas as descrições de um modelo murino de oclusão da artéria cerebral média e permanecem indefinidas fontes de potencial variabilidade experimental. Pôs-se a hipótese de ligeiras modificações técnicas resultarem em resultados com muitas discrepâncias num modelo murino de acidente vascular cerebral e do controlo de condições cirúrgicas e de procedimento poderem conduzir a consequências de acidente vascular cerebral fisiológicas e anatómicas reprodutíveis. Para testar esta hipótese estabeleceu-se um modelo murino que permitirá induzir 87 isquemia cerebral focal permanente ou transitória por oclusão intraluminal da artéria cerebral média (MCA). Este estudo proporciona uma descrição pormenorizada da técnica cirúrgica e revela diferenças importantes entre estirpes habitualmente utilizadas na produção de ratinhos transgénicos. Para além de diferenças relacionadas com a estirpe, também o volume de enfarte, consequências neurológicas e fluxo de sangue cerebral aparentam ser afectados de modo importante pela temperatura durante os períodos isquémico e pós-isquémico, estatura do ratinho e dimensão da sutura que obstrui o lúmen vascular. Quando se mantiveram constantes estas variáveis obteve-se uniformidade notável das consequências de acidente vascular cerebral. Estes dados salientam os efeitos protectores de hipotermia em acidente vascular cerebral e devem ajudar a padronizar técnicas entre diferentes laboratórios para proporcionar uma estrutura coesiva de avaliação de resultados de estudos futuros em animais transgénicos.

Introdução 0 advento recente de ratinhos geneticamente alterados proporciona uma oportunidade única para avaliar o papel de produtos de um único gene na patofisiologia de acidente vascular cerebral. Apesar de haver um número crescente de relatos sobre o efeito de isquemia cerebral em ratinhos transgénicos, não existem, até à data, descrições pormenorizadas dos modelos murinos envolvidos, nem está disponível nenhuma análise pormenorizada de variáveis de procedimento potencialmente importantes que possam afectar as consequências de acidente vascular cerebral. A maior parte das descrições de um modelo murino (1,4,8,9,14,17-19,23,24) são descrições dos modelos de rato amplamente utilizados de isquemia cerebral focal (22,26). Não obstante 88 ter sido prestada alguma atenção às diferenças relacionadas com a estirpe na susceptibilidade de ratinhos a isquemia cerebral (4), poucas considerações técnicas foram abordadas nos estudos publicados. Uma vez que dados-piloto demonstraram que diferenças muito pequenas no procedimento operatório ou cuidados pós-operatórios se traduziram em diferenças muito grandes nas consequências de acidente vascular cerebral, conduziu-se o presente estudo para identificar sistematicamente importantes considerações cirúrgicas, técnicas e anatómicas necessárias para obter resultados consistentes num modelo murino de isquemia cerebral focal. Quando os acidentes vasculares cerebrais são criados de uma forma rigidamente controlada, diferenças devido à ausência (ou super-expressão) de um produto de um único gene deverão ser facilmente discerniveis.

Este estudo apresenta pormenorizadamente um modelo murino reprodutível de enfarte cerebral focal com base em modificações do modelo de rato original (26) . Este estudo identifica variáveis de procedimento que têm grande impacto nas consequências de acidente vascular cerebral e que não foram previamente relatadas em descrições técnicas de modelos murinos de acidente vascular cerebral. Estas variáveis incluem comprimento e calibre da sutura, métodos de controlo vascular, regulação da temperatura em ratinhos e diferenças entre estirpes habitualmente utilizadas na criação de animais transgénicos. Uma vez que o próprio modelo descrito é propenso ao estudo de isquemia cerebral focal permanente ou transitória, apresentam-se evidências de que, com tempos de isquemia cuidadosamente escolhidos, o volume de enfarte e mortalidade em animais submetidos a reperfusão podem ser aproximadamente os observados na oclusão permanente. 0 entendimento de potenciais fontes de 89 variabilidade dependentes do modelo nas consequências de acidente vascular cerebral pode ajudar a clarificar resultados divergentes entre diferentes laboratórios. A adopção de um modelo padronizado que dê origem a resultados consistentes é um primeiro passo importante para a utilização de ratinhos transgénicos no estudo da patofisiologia de acidente vascular cerebral.

Materiais e métodos

Compra de Animais e Anestesia. Ratinhos transgénicos de três estirpes diferentes (C57 BlackJ6, CD-I e 129J) foram adquiridas à Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) . Os animais tinham oito até dez semanas de idade e pesavam entre 18-37 gramas (como indicado) na altura das experiências. Os ratinhos foram anestesiados com uma injecção intraperitoneal de 0,3 ml de cetamina (10 mg/cm3) e xilazina (0,5 mg/cm3). Administrou-se uma dose adicional de 0,1 cm3 antes da remoção do cateter em animais submetidos a isquemia transitória. Um dia após a cirurgia repetiu-se a anestesia imediatamente antes da medição de fluxo por Doppler de laser e eutanásia compassiva. Estes procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade de Columbia e estão de acordo com as orientações da AALAC para o cuidado e utilização compassivos de animais de laboratório.

Cenário Cirúrgico. O animal foi posicionado em supinação nuam almofada de gaze colocada sobre uma superfície operatória de temperatura controlada (Yellow Springs Instruments, Inc. [YSI], Yellow Springs, OH). Inseriu-se uma sonda rectal de temperatura (YSI) com a finalidade de regular a temperatura da superfície operatória, para manter uma temperatura constante central do animal de 36-38°C. 90

Para facilitar a exposição, a pata traseira direita e pata dianteira esquerda foram presas com fita adesiva à superfície operatória, a pata dianteira direita foi presa com fita adesiva ao peito do animal e a cauda foi presa com fita adesiva à sonda rectal (Figura 12A). Fez-se uma incisão na linha média do pescoço levantando suavemente a pele solta entre o manúbrio e o maxilar e excisando um círculo de pele de 1 cm2. As glândulas sub-mandibulares da linha média emparelhadas directamente por baixo desta área foram divididas sem cuidados especiais, deixando a glândula esquerda in situ. A glândula direita foi retraída cranialmente com um pequeno grampo de aneurisma Sugito recto (Mizutto America, Inc., Beverly, MA) preso à mesa com um fio de seda 4.0 e fita adesiva. Em seguida identificou-se o músculo esternocleidomastoideu e colocou-se uma ligadura de seda 4.0 em redor da sua barriga. Esta ligadura foi puxada na direcção inferolateral e foi presa à mesa com fita adesiva, para expor o músculo omo-hióideo que recobre a bainha da carótida. A exposição está apresentada na Figura 12B.

Abordagem Operatória. Depois de exposta a bainha da carótida, o ratinho e a superfície de controlo da temperatura foram colocados num microscópio operatório (ampliação 16-25X, Zeiss, Thornwood, NI), utilizando uma fonte de luz coaxial para iluminar o campo. Com ampliação, dividiu-se cuidadosamente o músculo omo-hióideo com pinças longas. A artéria carótida comum (CCA) foi cuidadosamente libertada da sua bainha, tendo o cuidado de não exercer tensão no nervo vago (que prossegue lateralmente à CCA) . Depois de libertada, a CCA foi isolada com um fio de seda 4.0 e foi presa com fita adesiva de modo folgado à mesa de operações. Depois de se ter controlado proximamente a CCA, 91 expôs-se a bifurcação da carótida. A artéria occipital, que surge da artéria carótida externa próxima e prossegue de forma posterolateral através da artéria carótida interna próxima (ICA) para entrar no músculo digástrico, foi isolada na sua origem e foi dividida utilizando um microcoagulador bipolar Malis (Codman-Schurtleff, Randolph, MA) . Este procedimento permitiu visualizar melhor a ICA à medida que prossegue posteriormente e para montante por baixo do músculo estilo-hióideo até à base do crânio. Imediatamente antes da ICA entrar no crânio liberta uma ramificação pterigopalatina, que prossegue lateralmente e na direcção do crânio. Esta ramificação foi identificada, isolada e dividida na sua origem e, durante esse período de tempo, o eixo CCA-ICA é endireitado. Depois colocou-se uma sutura de seda 4.0 em redor da artéria carótida interna para controlo distai, cuja extremidade foi presa com fita adesiva de forma folgada à superfície operatória.

Em seguida expôs-se a artéria carótida externa. A sua progressão crânio-medial foi submetida a esqueletonização e a sua primeira ramificação, a artéria superior da tiróide, foi cauterizada e dividida. Subsequentemente efectuou-se esqueletonização distai elevando o osso hióide, para expor a bifurcação da artéria nas artérias lingual e maxilar. De forma imediatamente próxima a esta bifurcação, a carótida externa foi cauterizada e dividida. Depois aplicou-se tensão suficiente nas suturas de seda que envolvem as artérias carótidas comum próxima e interna distai para obstruir o fluxo de sangue, tendo o cuidado de não causar traumatismos na parede arterial. Reajustou-se a fita adesiva das suturas de oclusão para manter a oclusão. 92

Introdução e Costura da Sutura de Oclusão Intraluminal. Imediatamente após a oclusão da carótida procedeu-se a uma arteriotomia na parede da carótida externa distai imediatamente próximo da área cauterizada. Com esta arteriotomia introduziu-se uma sutura de nylon 5.0 ou 6.0 (como indicado na secção Resultados) com ponta tratada a quente (Figuras 12C e 12D). A medida que a sutura progredia para o nivel da bifurcação da carótida, retraia-se suavemente o tronco externo de forma caudal, dirigindo a ponta da sutura para a ICA próxima. Depois da sutura de oclusão ter entrado na ICA relaxou-se a tensão nas suturas de controlo próxima e distai e fez-se avançar lentamente a sutura de oclusão ao longo da ICA para a base do crânio sob visualização directa (para além do nivel da base do crânio deixa de se ver a sutura de oclusão) . Determinou-se a localização da ponta distai da sutura de oclusão através da origem da artéria cerebral média (MCA) (próximo da origem da artéria cerebral anterior) pelo comprimento escolhido da sutura (12 mm ou 13 mm, como indicado na secção Resultados, mostrado na Figura 12C), por fluxometria por Doppler de laser (ver secção Procedimentos fisiológicos auxiliares) e por coloração pós-sacrificio da rede vascular cerebral (ver abaixo). Depois de completada a colocação da sutura de oclusão, o tronco da artéria carótida externa foi cauterizado para evitar hemorragia através da arteriotomia depois de restabelecido o fluxo arterial.

Acabamento do Procedimento Cirúrgico. Para todas as experiências mostradas, a duração da oclusão da carótida foi inferior a dois minutos. Para fechar a incisão, cortaram-se e removeram-se as suturas envolvendo a CCA próxima e distai, bem como o músculo esternocleidomastoideu. Removeu-se o grampo de aneurisma da 93 glândula submandibular e estendeu-se a glândula no campo operatório. Em seguida, as extremidades da pele foram aproximadas com um grampo cirúrgico e o animal foi removido da mesa.

Remoção da Sutura de Oclusão para Estabelecer Isquemia Cerebral Transitória. As experiências de isquemia cerebral transitória requereram nova exploração da ferida para remover a sutura de oclusão. Para estas experiências, o fecho inicial da ferida foi efectuado com um grampo de aneurisma temporário em vez de um grampo cirúrgico, para proporcionar acesso rápido à carótida. Restabeleceu-se o controlo próximo com uma sutura de seda 4-0 antes da remoção da sutura de oclusão, para minimizar hemorragias pelo tronco da carótida externa. Durante a remoção da sutura de oclusão, iniciou-se precocemente a cauterização do tronco da artéria carótida externa antes da sutura distai ter limpo completamente o tronco. Depois da sutura ter sido completamente removida, o tronco é cauterizado mais extensamente. Confirmou-se visualmente o restabelecimento do fluxo na artéria carótida interna extracraniana e fechou-se a ferida tal como para isquemia focal permanente, descrito acima. Confirmou-se a reperfusão intracraniana com fluxometria por Doppler a laser (ver secção Procedimentos fisiológicos auxiliares). Cálculo do Volume de Enfarte. Vinte e quatro horas após a oclusão da artéria cerebral média, os ratinhos sobreviventes foram novamente anestesiados com 0,3 cm3 de cetamina (10 mg/ml) e xilazina (0,5 mg/ml). Depois de se terem feito as leituras finais de pesos, temperaturas e fluxo de sangue cerebral (como descrito abaixo), os animais foram submetidos a perfusão com 5 ml de uma solução 0,15% 94 de azul-de-metileno e solução salina, para intensificar a visualização das artérias cerebrais. Em seguida, decapitaram-se os animais e removeram-se os cérebros. Os cérebros foram inspeccionados para verificar a colocação correcta do cateter, evidenciada por coloração negativa do território vascular subtendido pela MCA, e foram colocados numa matriz de cérebro de ratinho (Activational Systems Inc., Warren, MI) para efectuar seccionamentos de 1 mm. As secções foram imersas em cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (TTC) 2% em solução salina tamponada com fosfato 0,9%, foram incubadas durante 30 minutos a 37°C e colocadas em formalina 10% (5). Após coloração com TTC, visualizou-se o cérebro com enfarte na forma de uma área de tecido não corado (branco) num fundo envolvente de tecido viável (vermelho tijolo) . As secções em série foram fotografadas e projectadas em papel vegetal com ampliação uniforme; todas as secções em série foram desenhadas e cortadas e o papel foi pesado por um técnico cego para as condições experimentais. Nestas condições, os volumes de enfarte são proporcionais aos pesos somados dos papéis que circunscrevem a região com enfarte, tendo sido expressos como percentagem do volume hemisférico direito. Estes métodos foram validados em estudos prévios (3,12,15,16).

Estudos Fisiológicos Auxiliares

Realizaram-se estudos fisiológicos auxiliares em cada uma das três estirpes diferentes utilizadas nas presentes experiências imediatamente antes e após o procedimento operatório. Obtiveram-se pressões de sangue sistémico por cateterização da aorta abdominal infra-renal, tendo sido medidas utilizando um polígrafo Grass Modelo 7 (Grass Instrument Co., Quincy, MA). Obteve-se uma amostra de sangue arterial deste cateter aórtico infra-renal; mediu-se 95 ο ρΗ, pC02 (mm Hg), ρθ2 (mm Hg) e saturação de oxigénio na hemoglobina (%) arteriais utilizando um Analisador de Gás no Sangue e Hemoglobinómetro (Grass Instrument Co., Quincy, MA) . Devido à necessidade de efectuar punção arterial e manipulação abdominal para medir estes parâmetros fisiológicos, os animais foram destinados apenas para estas medições (os volumes de enfarte, consequências neurológicas e fluxos de sangue cerebral não foram medidos nestes mesmos animais).

Fizeram-se medições transcranianas do fluxo de sangue cerebral utilizando fluxometria por Doppler de laser (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) após reflexão da pele que recobre o calvarium, como previamente descrito (10) (as leituras transcranianas foram consistentemente iguais às feitas após craniectomia em estudos-piloto) . Para efectuar estas medições, os animais foram colocados num suporte estereotáctico para a cabeça, após o que foram submetidos a incisão na pele na linha média desde o ponto Nasion até à linha superior da nuca. A pele foi varrida lateralmente e uma sonda de Doppler de laser recta de 0,7 mm (modelo #PF2B) foi baixada até à superfície cortical, humedecida com uma pequena quantidade de soro fisiológico. Obtiveram-se leituras 2 mm posterior ao bregma, a 3 mm e 6 mm para cada lado da linha média utilizando um micromanipulador estereotáctico, mantendo a sonda perpendicular à superfície cortical. Fizeram-se medições do fluxo relativo de sangue cerebral imediatamente após a anestesia, após oclusão da MCA e imediatamente antes da eutanásia, tendo sido expressas como a razão da intensidade do sinal de Doppler do hemisfério isquémico comparado com o hemisfério não isquémico. Para animais submetidos a isquemia cerebral transitória, fizeram-se medições adicionais imediatamente 96 antes e imediatamente após a remoção da sutura, que iniciou a reperfusão. 0 procedimento cirúrgico/oclusão intraluminal da MCA foi considerado tecnicamente adequado se fosse observada uma redução ^ 50% do fluxo relativo de sangue cerebral imediatamente após a colocação do cateter de oclusão intraluminal (excluíram-se 15 dos 142 animais utilizados neste estudo [10,6%] devido a queda inadequada do fluxo de sangue na altura da oclusão). Em estudos preliminares, foi mostrado que estes critérios de exclusão dão origem a níveis de isquemia suficientes para tornar consistentes os volumes de enfarte por coloração com TTC. A reperfusão foi considerada tecnicamente adequada se o fluxo de sangue cerebral na altura da remoção do cateter fosse pelo menos o dobro do fluxo de sangue cerebral durante a oclusão (13/17 animais neste estudo [76%]).

Temperatura. A temperatura central durante o período peri-enfarte foi cuidadosamente controlada durante o período experimental. Antes da cirurgia registou-se uma temperatura rectal de referência (sonda rectal YSI Modelo 74 Thermistemp, Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH). Intra-operatoriamente, a temperatura foi controlada utilizando uma superfície operatória controlada com termopar. Após oclusão da MCA, os animais foram colocados durante 90 minutos numa incubadora, em que a temperatura do animal foi mantida a 37°C utilizando a sonda rectal ligada, via um termopar, a uma fonte de aquecimento da incubadora. A temperatura foi semelhantemente controlada nos animais sujeitos a isquemia transitória, incluindo um período de 45 minutos (isquémico) bem como um período pós-isquémico de 90 minutos na incubadora. Depois de terem sido 97 colocados na incubadora de temperatura central, os animais regressaram às suas gaiolas durante o período restante da observação pré-sacrifício.

Exame Neurológico. Antes da administração da anestesia na altura da eutanásia, os ratinhos foram examinados quanto a deficiências neurológicas óbvias utilizando um sistema de classificação de quatro pontuações: (1) movimentos espontâneos normais, (2) animal em círculos para a direita, (3) animal rodando para a direita, (4) animal inclinado nas quatro patas, não respondendo a estímulos nocivos. Em estudos preliminares mostrou-se que este sistema prevê a dimensão do enfarte de forma precisa e baseia-se em sistemas desenvolvidos para utilização em ratos (6).

Análise de Dados. Compararam-se os volumes de enfarte, pontuações de consequências neurológicas, fluxos de sangue cerebral e dados de gás de sangue arterial utilizando um teste t de Student não emparelhado. Os valores estão expressos como médias ± EPM, em que um valor p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo. Avaliaram-se os dados de mortalidade, quando apresentados, utilizando análise de qui-quadrado.

Resultados

Efeitos da Estirpe. Utilizaram-se três estirpes diferentes de ratinho habitualmente usadas (CDl, C57/B16 e 129J) para comparar a variabilidade das consequências de acidente vascular cerebral após isquemia cerebral focal permanente. Para determinar que não havia grandes diferenças anatómicas na colateralização da circulação cerebral, visualizou-se o Círculo de Willis utilizando tinta da índia nas três estirpes (Figura 13). Estes estudos não conseguiram revelar 98 grandes diferenças anatómicas. Em seguida, ratinhos de estatura semelhante (20 ± 0,8 g, 23 í 0,4 g e 23 í 0,5 g para ratinhos 129J, CD1 e C57B1, respectivamente) foram submetidos a isquemia focal permanente em condições normotérmicas utilizando um comprimento de 12 mm de uma sutura de oclusão de nylon 6-0. Notaram-se diferenças significativas relacionadas com a estirpe no volume de enfarte, em que os enfartes em ratinhos 129J foram significativamente menores do que os observados em ratinhos CD1 e C57/B16, apesar das condições experimentais idênticas (Figura 14A). As diferenças da extensão do enfarte foram acompanhadas de diferenças paralelas por exame neurológico, em que as pontuações mais elevadas (isto é, danos neurológicos mais graves) foram observadas nos ratinhos C57/B16 e CD1 (Figura 14B).

Para determinar a relação entre o volume de enfarte e fluxo de sangue cerebral para a região central efectuou-se fluxometria por Doppler de laser através do calvarium murino fino. Não se observaram diferenças pré-operatórias relacionadas com a estirpe no fluxo de sangue cerebral, correspondente à ausência de grandes diferenças anatómicas na anatomia vascular (Figura 13) . A medição do fluxo de sangue cerebral imediatamente após a inserção do cateter de oclusão revelou que o procedimento tinha criado graus semelhantes de redução do fluxo (a percentagem do fluxo ipsilateral/contralateral imediatamente após a inserção do cateter de obstrução foi 23 ± 2%, 19 ± 2%, 17 ± 3% para ratinhos 129J, CD1 e C57/B16, respectivamente) . Não surpreendeu que o fluxo de sangue para a região central medido às 24 horas imediatamente antes da eutanásia tivesse exibido os níveis mais baixos nos animais com lesões neurológicas mais graves (Figura 14C). 99

Características Anatómicas e Fisiológicas de Ratinhos. As pressões de sangue arterial de referência, bem como as pressões de sangue arterial após oclusão da artéria cerebral média, foram quase idênticas para todos os animais estudados e não foram afectadas pela estirpe ou estatura dos ratinhos (Tabela I) . De modo semelhante, a análise do sangue arterial quanto ao pH, pC02 e saturação de oxigénio na hemoglobina (%) não revelou diferenças significativas (Tabela I).

Efeito da Estatura dos Animais e Calibre da Sutura de Oclusão. Para investigar os efeitos da estatura dos ratinhos nas consequências de acidente vascular cerebral, ratinhos com duas estaturas diferentes (23 í 0,4 g e 31 í 0,7 g) foram sujeitos a isquemia cerebral focal permanente. Com a finalidade de eliminar outras fontes potenciais de variabilidade nestas experiências, as experiências foram efectuadas em condições normotérmicas em ratinhos da mesma estirpe (CD1) utilizando suturas de oclusão de comprimento e calibre idênticos (nylon 6-0 12 mm) . Nestas condições, ratinhos pequenos (23 + 0,4 g) exibiram consistentemente grandes volumes de enfarte (28 ± 9% do hemisfério ipsilateral). Em condições experimentais idênticas, ratinhos grandes (31 ± 0,7 g) exibiram enfartes muito menores (3,2 ± 3%, p = 0,02, Figura 15A), menos morbidez por exame neurológico (Figura 15B) e uma tendência para manter fluxo mais elevado de sangue cerebral ipsilateral após enfarte do que animais mais pequenos (Figura 15C).

Uma vez que se pôs a hipótese da redução da extensão do enfarte nestes animais grandes estar relacionada com falta de correspondência do diâmetro/comprimento entre a sutura 100 de oclusão e os vasos de sangue cerebral, conceberam-se suturas de oclusão mais longas/mais grossas (13 mm, nylon 5-0) para utilização nestes ratinhos maiores. Ratinhos CD1 grandes (34 ± 0,8 g) submetidos a oclusão permanente com estas suturas de oclusão maiores exibiram um aumento acentuado dos volumes de enfarte (50 ± 10% do hemisfério ipsilateral, p < 0,0001 em comparação com ratinhos grandes submetidos a enfarte com a sutura de oclusão menor, Figura 15A) . Estes ratinhos maiores submetidos a enfarte com suturas de oclusão maiores exibiram pontuações mais elevadas de deficiências neurológicas (Figura 15B) e fluxos de sangue cerebral ipsilateral menores (Figura 15C) em comparação com ratinhos semelhantemente grandes submetidos a enfarte com suturas de oclusão menores.

Efeitos da Temperatura. Para determinar o papel de hipotermia peri-operatória nos volumes de acidente vascular cerebral e consequências neurológicas após oclusão da MCA, ratinhos C57/B16 pequenos (22 ± 0,4 g) foram sujeitos a oclusão permanente da MCA com uma sutura de 12 mm de calibre 6-0, tendo-se mantido a normotermia durante dois períodos diferentes. O Grupo 1 ("Normotermia") foi operado como descrito acima, mantendo a temperatura a 37°C desde o período pré-operatório até aos 90 minutos pós-oclusão. Os animais do Grupo 2 ("Hipotermia") foram mantidos a 37°C desde o período pré-operatório apenas até aos 10 minutos pós-oclusão, como foi descrito previamente (14). Num período de 45 minutos após remoção da incubadora de aquecimento controlado com termopar, a temperatura central neste segundo grupo de animais diminuiu para 33,1 ± 0,4°C (e diminuiu suplementarmente para 31,3 ± 0,2°C aos 90 minutos). Os animais operados em condições de normotermia prolongada (Grupo 1) exibiram maiores volumes de enfarte 101 (32 + 9%) do que os animais hipotérmicos (Grupo 2) (9,2 ± 5%, p = 0,03, Figura 16A) . As diferenças do volume de enfarte foram semelhantes às diferenças de deficiências neurológicas (3,2 ± 0,4 versus 2,0 ± 0,8, p = 0,02, Figura 16B), mas foram amplamente independentes do fluxo de sangue cerebral (52 ± 5 versus 52+7, p = NS, Figura 16C).

Efeitos da Oclusão Transitória da MCA. Uma vez que a lesão de reperfusão foi implicada como causa importante de danos neuronais após oclusão cerebrovascular (25), um subconjunto de animais foi sujeito a um periodo transitório (45 minutos) de isquemia seguida de reperfusão, como descrito acima, tendo-se feito comparações com os animais submetidos a oclusão permanente da MCA. Escolheu-se o instante da oclusão com base em estudos preliminares (não mostrado), que revelaram taxas de mortalidade inaceitavelmente elevadas (> 85%) num periodo de 180 minutos de isquemia e enfarte raro (< 15%) num periodo de 15 minutos de isquemia. Para minimizar a influência de outras variáveis, que poderia induzir confusão, mantiveram-se constantes outras condições experimentais (utilizaram-se ratinhos C57/B16 pequenos (22,5 ± 0,3 g), a sutura de oclusão consistiu em nylon 6-0 de 12 mm e as experiências foram realizadas em condições normotérmicas) . Os declínios iniciais do CBF imediatamente pós-oclusão foram semelhantes em ambos os grupos (16 ± 2% versus 17 ± 3%, para os grupos de oclusão transitória versus permanente, respectivamente, p = NS). A reperfusão foi confirmada por Doppler de laser (aumento de 2,3 vezes do fluxo de sangue após remoção da sutura de oclusão para 66 ± 13%) e visualmente por injecção intracardíaca de corante azul-de-metileno em animais representativos. As dimensões de enfarte (29 ± 10% versus 32 ± 9%), pontuações de deficiências neurológicas (2,5 ± 102 0,5 versus 3,2 ± 0,4) e fluxo de sangue cerebral no sacrifício (46 ± 18% versus 53 ± 5%) foram bastante semelhantes entre animais sujeitos a isquemia cerebral transitória e reperfusão e os sujeitos a isquemia cerebral focal permanente (p=NS para todos os grupos) (Figuras 17A-17C) .

Discussão A disponibilidade crescente de ratinhos alterados geneticamente conduziu a uma utilização acrescida de modelos murinos de isquemia cerebral focal para implicar produtos de genes específicos na patogénese de acidente vascular cerebral. Não obstante publicações recentes descreverem a utilização de uma sutura intraluminal para efectuar a oclusão da artéria cerebral média com a finalidade de criar isquemia cerebral permanente e/ou transitória em ratinhos, só têm aparecido descrições escassas das modificações necessárias do relato técnico original em ratos (8,14,17-19,24,26). As experiências descritas aqui proporcionam não só uma explicação técnica pormenorizada de um modelo murino adequado para estudar isquemia da artéria cerebral média focal permanente ou transitória mas também abordam potenciais fontes de variabilidade no modelo.

Importância da Estirpe

Uma das mais importantes fontes potenciais de variabilidade no modelo de isquemia cerebral murina descrito aqui está relacionada com a estirpe do animal utilizada. Os dados sugerem que, das três estirpes testadas, os ratinhos 129J são particularmente resistentes a lesões neurológicas após oclusão da MCA. Apesar de Barone ter encontrado, de forma semelhante, diferenças nos volumes de acidente vascular 103 cerebral entre 3 estirpes de ratinhos (BDF, CFW e BALB/C) , estas diferenças foram atribuídas a variações nas artérias comunicantes posteriores destas estirpes (4). Uma vez que o estudo não revelou grandes diferenças anatómicas da anatomia cerebrovascular (Figura 13), os dados sugerem que diferenças não anatómicas relacionadas com a estirpe também são importantes nas consequências de oclusão da MCA.

Uma vez que as consequências de acidente vascular cerebral diferem significativamente entre 2 estirpes de ratinhos (129J e C57/B16) habitualmente utilizadas para produzir ratinhos transgénicos via recombinação homóloga em células estaminais embrionárias (11), os dados sugerem um embargo importante a experiências realizadas com ratinhos transgénicos. Devido ao facto da progenitura fundadora inicial da criação de animais transgénicos com estas estirpes terem um fundo 129J / C57/B16 misturado, idealmente as experiências devem ser realizadas com controlos irmãos ou após um número suficiente de retrocruzamentos, para assegurar a pureza da estirpe.

Importância da Estatura

Os animais maiores requerem uma sutura intraluminal mais longa e mais grossa para sustentar volumes de enfarte consistentes com os obtidos em animais mais pequenos com suturas de oclusão mais pequenas. A correspondência de dimensões entre animal e sutura parece ser importante não só para produzir enfarte cerebral consistente; enquanto uma sutura demasiado pequena conduz a isquemia insuficiente, uma sutura demasiado grande conduz a frequentes hemorragias cerebrais e traumatismos vasculares (observação não publicada). 104 A utilização de animais de estatura semelhante é importante não só para minimizar variabilidade potencial relacionada com a idade da susceptibilidade neuronal a insulto isquémico mas também para assegurar que pequenas diferenças da estatura dos animais não ofuscam uma comparação significativa dos dados. Neste exemplo demonstra-se que diferenças de estatura tão pequenas quanto 9 gramas podem exercer grande impacto no volume de enfarte e consequências neurológicas após isquemia cerebral. Experiências suplementares utilizando suturas de oclusão de maior calibre em animais maiores sugerem que a propensão acrescida de animais mais pequenos para sofrerem acidentes vasculares cerebrais de maior extensão não se deveu a uma resistência relativa de animais maiores a danos neuronais isquémicos; ao invés, deveu-se à pequena dimensão da sutura utilizada para a oclusão da MCA em animais grandes. Apesar destes dados terem sido obtidos utilizando ratinhos CD1, realizaram-se estudos semelhantes, tendo-se verificado que estes resultados também se aplicam a outras estirpes de ratinhos, como C57/B16 (dados não publicados). Os relatos previamente publicados utilizaram ratinhos de muitas estaturas diferentes (desde 21 g até 35 g) , bem como diferentes diâmetros e comprimentos das suturas, que muitas vezes não são relatados (14,17). Os estudos indicam que a dimensão do animal e da sutura são questões de metodologia importantes que devem ser abordadas em relatos científicos.

Importância da Temperatura É reconhecido desde há muito tempo que a hipotermia protege alguns órgãos de lesão isquémica, incluindo o cérebro. Estudos realizados em ratos demonstraram que hipotermia intra-isquémica até 1 hora pós-oclusão da MCA é protectora (2,15), reduzindo a mortalidade e volumes de enfarte com 105 temperaturas de 34,5 graus. Apesar destes resultados terem sido extrapolados para modelos murinos de isquemia cerebral, pois estudos descrevem frequentemente a manutenção da normotermia em animais, os períodos de monitorização da temperatura pós-oclusão da MCA foram extremamente breves ("imediatamente após a cirurgia" ou "10 minutos após a cirurgia") (4,14). Os resultados indicam que os animais não conseguem auto-regular a sua temperatura para além destas durações breves, tornando-se gravemente hipotérmicos durante o período pós-operatório, e que diferenças de temperatura até 90 minutos após oclusão da MCA podem exercer um efeito profundo nos índices das consequências de acidente vascular cerebral após oclusão da MCA (não foram estudadas durações mais longas de normotermia). Se bem que outros investigadores tenham assegurado a normotermia utilizando um sistema de realimentação com base na temperatura rectal semelhante ao descrito aqui, muitas vezes a duração da normotermia não é especificada (17) . Os resultados requerem a identificação clara dos métodos de monitorização e manutenção da temperatura, bem como das durações envolvidas, de modo que os resultados experimentais possam ser comparados dentro e entre Centros que estudem a patofisiologia de acidente vascular cerebral.

Oclusão Transitória versus Permanente A patofisiologia de certos aspectos de isquemia cerebral permanente pode ser bem diferente da de isquemia cerebral seguida de reperfusão, de modo que foi importante descrever um modelo que permitisse analisar cada um dos estados. Não obstante diferenças entre estes dois modelos não terem sido extensamente testadas na presente série de experiências, nas condições testadas (45 minutos de isquemia seguida de 106 23 horas de reperfusão) não se observaram diferenças significativas em nenhum índice de consequências de acidente vascular cerebral. Foram relatadas durações variáveis de isquemia e reperfusão noutros modelos murinos de isquemia cerebral transitória, com tempos isquémicos variando desde 10 minutos até 3 horas e tempos de reperfusão variando desde 3 até 24 horas (17,24). Estudos em ratos mostraram que períodos curtos de isquemia seguidos de reperfusão estão associados a enfartes de menor extensão do que a oclusão permanente (21,25). No entanto, à medida que aumenta a duração da isquemia para além de um limite crítico (entre 120 e 180 minutos), a reperfusão fica associada a enfartes de maior extensão (7,21,26). Para a presente série de experiências, escolheram-se as durações de isquemia e reperfusão de modo a obter enfartes comparáveis aos observados após oclusão permanente da MCA, o que provavelmente explicará o motivo por que os dados não conseguiram revelar diferenças entre isquemia permanente e transitória. Escolheram-se estas durações para o modelo transitório depois de experiências-piloto terem revelado que durações isquémicas mais curtas (15 minutos) raramente conduziram a enfarte, ao passo que 180 minutos de oclusão seguida de reperfusão conduziram a enfarte extenso e quase 100% de mortalidade num período de 4-6 horas em animais normotérmicos (observação não publicada). Apesar dos índices de acidente vascular cerebral poderem ser medidos antes das 24 horas, elegeu-se o instante de observação às 24 horas por que a observação nesta altura permite estudar morte penumbral retardada, que provavelmente será clinicamente relevante para a patofisiologia de acidente vascular cerebral em humanos. Suplementarmente, foi mostrado num modelo de rato que as 24 horas são suficientes para maturação completa do enfarte (3,12,15,16). 107

Aspectos Técnicos do Modelo Murino

Os aspectos técnicos da cirurgia necessários para criar isquemia cerebral focal em ratinhos diferem, em certas questões importantes, dos mesmos em ratos. Retractores de auto-fixação, que foram defendidos em relatos prévios em ratos (26), não são apropriados em ratinhos. Uma retracção à base de suturas fixa com fita adesiva proporciona uma alternativa superior. Em ratos, foi relatada a oclusão com grampo da artéria carótida próxima e distai após mobilização da artéria carótida externa (26), mas cria mais traumatismos na carótida e hemorragias em ratinhos. Sem controlo da carótida interna distai, que não foi previamente descrito em ratinhos, retro-hemorragias a partir da artéria carótida externa são consistentemente incontroláveis. Utilizando as técnicas descritas neste artigo, a cirurgia pode ser completada virtualmente sem perda de sangue, o que é especialmente importante dado o pequeno volume de sangue dos ratinhos.

Ao contrário do modelo do rato, procede-se à oclusão e corte transversal das ramificações da artéria carótida externa e da artéria pterigopalatina no modelo murino apenas com electrocauterização. Relatos anteriores de cirurgias murinas não esclareceram se a artéria pterigopalatina foi ou não isolada (17,24). Outros investigadores descreveram um método com oclusão permanente da artéria carótida comum e inserção trans-carótida da sutura sem prestar atenção ao sistema da carótida externa nem à artéria pterigopalatina. Se bem que seja eficaz para oclusão permanente, este último método impossibilita estudos de reperfusão. 108 O método de reperfusão originalmente descrito no rato requer remoção cega do cateter sem anestesia (26) . Quando foi tentado em estudos-piloto em ratinhos, vários animais sofreram hemorragias. Em consequência, desenvolveu-se um método de remoção de suturas com visualização directa no animal anestesiado que não só permite confirmar visualmente a reperfusão da artéria carótida extracraniana mas também proporciona hemostasia meticulosa. Além disso, o método permite fazer leituras de fluxometria por Doppler de laser imediatas pré- e pós-reperfusão no animal anestesiado.

Estas leituras de fluxometria por Doppler de laser são semelhantes às descritas por Kamii et al. e Yang et al.r pois as leituras são feitas intermitentemente e utilizando um micromanipulador estereotáctico (17,24). No entanto, as leituras diferem no facto das coordenadas utilizadas (2 mm posterior e 3 e 6 mm lateral ao bregma) serem ligeiramente mais laterais e posteriores do que as coordenadas centrais e penumbrais previamente publicadas (1 mm posterior e 2 mm e 4,5 mm lateral ao bregma). Estas coordenadas, que foram adoptadas com base em estudos-piloto, são as utilizadas por Huang et al. (14) .

Conclusão

Estes estudos revelam aspectos técnicos específicos de um modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão que permite obter reprodutibilidade de medições entre diferentes laboratórios. Adicionalmente, estes estudos proporcionam um enquadramento para compreender variáveis de procedimento importantes que podem ter grande impacto nas consequências de acidente vascular cerebral, que deverão conduzir a uma compreensão clara de diferenças não relacionadas com o procedimento a serem investigadas. De 109 modo muito importante, este estudo aponta para a necessidade de controlar cuidadosamente a estirpe dos ratinhos, dimensão dos animais e suturas e temperatura em animais experimentais e de controlo. As condições podem ser fixadas de modo que as consequências de acidente vascular cerebral sejam semelhantes entre modelos de isquemia cerebral focal permanente e isquemia cerebral focal transitória, que facilitarão a comparação directa e permitirão estudar lesão de reperfusão. O modelo descrito neste estudo deverá proporcionar uma estrutura coesiva para avaliar os resultados de estudos futuros em animais transgénicos, com a finalidade de facilitar um entendimento da contribuição de produtos de genes específicos na patofisiologia de acidente vascular cerebral.

Tabela I. Parâmetros fisiológicos pré- e pós-operatórios. MAP, pressão arterial média; pC02, pressão parcial de CO2 arterial (mm Hg); Sat. 02, saturação de O2 (%) ; Hb, concentração de hemoglobina (g/dl); Pré-operatório, animais anestesiados antes da dissecção da carótida; Simulado, animais anestesiados submetidos ao procedimento cirúrgico descrito no texto imediatamente antes da introdução da sutura de oclusão; Acidente vascular cerebral, animais anestesiados submetidos ao procedimento cirúrgico descrito no texto imediatamente após a introdução da sutura de oclusão. p=NS para todas as comparações entre grupos (dados apresentados para ratinhos C57/B16 pequenos de 22 gramas). 110 PARÂMETRO PRÉ-OPERATÓRIO SIMULADO ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL MAP 102 +5,5 94 + 1,9 88 + 4,9 pH 7,27 + 0,02 7,23 + 0,04 7,28 + 0,01 pC02 46 + 1,3 44+1,3 47 + 3,5 Sat. 02 89 + 1,6 91+1,8 85 + 2,2 Hb 14,6 + 0,42 14,3 + .12 14,2 + 0,12

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Presentemente há um grande vazio terapêutico no que se refere ao tratamento de acidente vascular cerebral em progressão. Apesar da P-selectina ser rapidamente expressa por células endoteliais hipóxicas in vitro, a importância funcional da expressão de P-selectina em acidente vascular cerebral ainda não foi explorada. Para identificar as consequências patofisiológicas da expressão de P-selectina e para identificar o bloqueio de P-selectina como nova abordagem potencial para o tratamento de acidente vascular cerebral, conduziram-se experiências que utilizam um modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão. A expressão inicial de P-selectina no córtex cerebral pós-isquémico foi demonstrada pela acumulação especifica de IgG anti-P-selectina murina etiquetada de forma radioactiva. Em experiências paralelas, a acumulação de neutrófilos no córtex isquémico de ratinhos que expressam o gene da P-selectina (PS +/+) foi significativamente mais elevada do que a exibida em ratinhos homozigóticos nulos para P-selectina (PS -/-) . 0 influxo reduzido de neutrófilos foi acompanhado de maior refluxo cerebral pós-isquémico (medido por Doppler de laser) nos ratinhos PS -/-. Adicionalmente, ratinhos PS -/- exibiram menores volumes de enfarte (redução de cinco vezes, p < 0,05) e sobrevivência melhorada em comparação com ratinhos PS +/+ (88% versus 44%, p < 0,05). O bloqueio funcional de P-selectina em ratinhos PS +/+ utilizando um anticorpo monoclonal dirigido contra a P-selectina murina também melhorou o refluxo inicial e consequências de acidente vascular cerebral em comparação com controlos. Estes dados são os primeiros a demonstrar um papel patofisiológico da P-selectina em acidente vascular cerebral e sugerem que o bloqueio de P- 114 selectina poderá representar um novo alvo terapêutico para o tratamento de acidente vascular cerebral.

INTRODUÇÃO

Hoje em dia, o acidente vascular cerebral isquémico é a terceira principal causa de morte nos Estados Unidos 7. Até muito recentemente não havia nenhum tratamento directo para reduzir danos ocorridos em tecido cerebral em acidente vascular cerebral em progressão. Apesar dos estudos de acidente vascular cerebral agudo com rt-PA de NINDS 2 e ECASS 3 terem sugerido existirem potenciais benefícios terapêuticos de reperfusão inicial 4, a mortalidade acrescida observada após tratamento com estreptoquinase de acidente vascular cerebral isquémico agudo 5 salienta o facto de, presentemente, não haver nenhum tratamento claramente eficaz para acidente vascular cerebral em progressão. Este vazio nos presentes recursos médicos para o tratamento de acidente vascular cerebral conduziu a algumas abordagens inovadoras 6, mas, para além de rt-PA, nenhuma atingiu a esfera clínica. Para identificar um tratamento potencial seguro e eficaz para acidente vascular cerebral em progressão centrou-se a atenção no papel prejudicial de neutrófilos recrutados. Um trabalho recente num modelo murino de acidente vascular cerebral com reperfusão demonstrou que a depleção de neutrófilos (PMNs) antes do acidente vascular cerebral minimiza lesões em tecidos cerebrais e melhora as consequências funcionais 7; ratinhos sem a molécula de adesão celular específica, ICAM-1, ficam protegidos de modo semelhante 7. A P-selectina, uma molécula que pode ser rapidamente relocalizada para a superfície endotelial hipóxica a partir de sítios de armazenamento pré-formados 8, é um mediador inicial importante da rotação de neutrófilos 9, que facilita o 115 arresto de neutrófilos mediado pela ICAM-1. Apesar da P-selectina ser expressa em acidente vascular cerebral em primatas 10, não há dados publicados que abordem a importância funcional da expressão de P-selectina em qualquer modelo de acidente vascular cerebral com reperfusão ou sem reperfusão.

Para explorar o papel patofisiológico da P-selectina em acidente vascular cerebral empregou-se um modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão 11 que utiliza ratinhos de tipo selvagem e ratinhos homozigóticos nulos para o gene da P-selectina 9 e uma estratégia de administração de um anticorpo para a P-selectina funcionalmente bloqueador. Este estudo confirma não só que a expressão de P-selectina após oclusão da artéria cerebral média está associada a refluxo cerebral reduzido após reperfusão e consequências piores após acidente vascular cerebral mas também que o bloqueio de P-selectina confere um grau significativo de protecção cerebral pós-isquémica. Estes estudos são a primeira demonstração do papel patofisiológico da expressão de P-selectina em acidente vascular cerebral e sugerem a possibilidade excitante de estratégias anti-P-selectina poderem ser úteis para o tratamento de acidente vascular cerebral com reperfusão.

MÉTODOS

Ratinhos. Realizaram-se experiências com ratinhos transgénicos deficientes em P-selectina, criados como previamente relatado 9 por abordagem selectiva de genes em células estaminais embrionárias Jl, injecção em blastocistos C57BL/6 para obter transmissão da linha germinativa e retrocruzamento para obter ratinhos homozigóticos nulos para P-selectina (PS -/-). As 116 experiências foram realizadas com ratinhos primos PS -/- ou de tipo selvagem (PS +/+) da terceira geração de retrocruzamentos com ratinhos C57BL/6J. Os animais tinham sete até doze semanas de idade e pesavam entre 25-36 gramas na altura das experiências.

Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média. Os ratinhos foram anestesiados (0,3 cm3 de cetamina 10 mg/cm3 e xilazina 0,5 mg/cm3, i.p.) e foram posicionados em supinação numa superfície operatória com temperatura rectal controlada (Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH). A temperatura central dos animais foi mantida a 37 ± 1°C intra-operatoriamente e durante 90 minutos pós-operatoriamente. Criou-se uma incisão na linha média do pescoço para expor a bainha da carótida direita ao microscópio operatório (ampliação 16-25X, Zeiss, Thornwood, NI). A artéria carótida comum foi isolada com uma linha de seda 4-0 e cada uma das artérias occipital, pterigopalatina e carótida externa foi isolada e dividida. Efectuou-se a oclusão da artéria cerebral média (MCAO) fazendo avançar uma sutura de nylon 5-0 com a ponta tratada a quente de 13 mm via o tronco da carótida externa. Após a colocação da sutura de oclusão, o tronco da artéria carótida externa foi cauterizado e a ferida foi fechada. Passados 45 minutos removeu-se a sutura de oclusão, para estabelecer a reperfusão. Estes procedimentos foram previamente descritos em pormenor 9.

Medição do fluxo de sangue cortical cerebral. Fizeram-se medições transcranianas do fluxo de sangue cerebral utilizando Doppler de laser (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) como previamente descrito 12. Utilizando uma sonda de Doppler de laser linear de 0,7 mm (modelo #PF303, Perimed, 117

Piscataway, NJ) e pontos de referência previamente publicados (2 mm posterior ao bregma, 6 mm para cada lado da linha média) n'13, fizeram-se medições do fluxo relativo de sangue cerebral como indicado; imediatamente após a anestesia, 1 e 10 minutos após oclusão da artéria cerebral média, bem como após 30 minutos, 300 minutos e 22 horas de reperfusão. Os dados estão expressos como razão da intensidade do sinal de Doppler no hemisfério isquémico em comparação com o hemisfério não isquémico. Apesar deste método não quantificar o fluxo de sangue cerebral por grama de tecido, a utilização de medições de fluxo por Doppler de laser em pontos de referência anatómicos definidos de forma precisa é um meio para comparar fluxos de sangue cerebral no mesmo animal em série ao longo do tempo. Considerou-se que o procedimento cirúrgico era tecnicamente adequado se se observasse ^ 50% de redução do fluxo relativo de sangue cerebral imediatamente após a colocação da sutura de oclusão intraluminal. Estes métodos foram utilizados em estudos anteriores 7,11.

Determinou-se a anatomia cerebrovascular em animais representativos do modo seguinte. Anestesiaram-se os ratinhos e administrou-se uma injecção antemortem (0,1 ml) de tinta da índia:negro de fumo:metanol:soro fisiológico (1:1:1:1, v:v:v:v) por punção ventricular esquerda. Prepararam-se os cérebros por decapitação rápida, seguida de imersão em formalina 10% a 4°C durante 2 dias, após o que se fotografaram as superfícies inferiores para revelar o padrão vascular do Círculo de Willis.

Preparação e administração de proteínas etiquetadas com l25I e neutrófilos murinos etiquetados com 111In. Prepararam-se do modo seguinte anticorpos iodados de forma radioactiva. 118

IgG monoclonal de rato anti-P-selectina murina (Clone RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA) 14 e IgG de rato não imunológica (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) foram etiquetadas de forma radioactiva com 125l pelo método de lactoperoxidase 15 utilizando Enzymobeads (Bio-Rad, Hercules, CA) . Prepararam-se do modo seguinte PMNs etiquetados de forma radioactiva. Sangue citrado de ratinhos de tipo selvagem foi diluido 1:1 com NaCl (0,9%), seguido de ultracentrifugação com gradiente em Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Após lise hipotónica de eritrócitos residuais (exposição durante 20 segundos a H20 destilada seguida de reconstituição com NaCl 1,8%), os PMNs foram suspensos em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Suspenderam-se neutrófilos (5-7,5 x 106) em PBS com 100 μCi de 111índio-oxina (Amersham Mediphysics, Port Washington, NI), tendo sido sujeitos a agitação suave durante 15 minutos a 37°C. Após lavagem com PBS, os PMNs foram suavemente transformados em grânulos (450 x g) e novamente suspensos em PBS para uma concentração final de 1,0 x 106 células/ml.

Exame Neurológico: Antes de receberam a anestesia, os ratinhos foram examinados quanto a deficiências neurológicas 22 horas após a reperfusão utilizando um sistema de classificação de um até quatro 11: atribuiu-se a pontuação 1 quando o animal exibiu movimentos espontâneos normais; atribuiu-se a pontuação 2 quando se notou que o animal se voltava para o lado ipsilateral; atribuiu-se a pontuação 3 quando se observou que o animal rodava longitudinalmente (na orientação dos ponteiros do relógio quando visto da cauda); atribuiu-se a pontuação 4 quando o animal não respondeu a estímulos nocivos. Este sistema de pontuação tinha sido previamente descrito em ratinhos 7,11 e 119 baseia-se em sistemas de pontuação semelhantes utilizados em ratos 16,17. Cálculo dos Volumes de Enfarte: Após o exame neurológico, os ratinhos foram anestesiados e obtiveram-se medições finais do fluxo de sangue cerebral. Realizou-se eutanásia compassiva por decapitação e removeram-se os cérebros, que foram colocados numa matriz de cérebro de ratinho (Activational Systems Inc., Warren, MI) para efectuar seccionamentos de 1 mm. As secções foram imersas em cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio 2% (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em solução salina tamponada com fosfato 0,9%, foram incubadas durante 30 minutos a 37°C e colocadas em formalina 10% 18. O cérebro com enfarte foi visualizado como uma área de tecido não corado. Calcularam-se os volumes de enfarte a partir de secções em série de planimetria, tendo sido expressos como percentagem de enfarte no hemisfério ipsilateral. Este método de cálculo de volumes de enfarte foi previamente utilizado ' ' ' e foi correlacionado com os outros índices funcionais de consequências de acidente vascular cerebral que estão descritos acima.

Administração de Anticorpos Não Etiquetados, PMNs Etiquetados de Forma Radioactiva e Anticorpos Etiquetados de Forma Radioactiva. Para experiências em que se administraram anticorpos não etiquetados utilizou-se um de dois tipos diferentes de anticorpos; uma IgG monoclonal de rato anti-P-selectina murina bloqueadora (Clone RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA) 14,19,20 qu jgç ra-t-0 ng0 imunológica (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Prepararam-se os anticorpos na forma de 30 μς em 0,2 ml de solução salina tamponada com fosfato que continha albumina 120 de soro bovino 0,1%, que depois foi administrado na veia peniana 10 minutos antes da oclusão da artéria cerebral média. Em experiências separadas, anticorpos etiquetados de forma radioactiva (0,15 ml, *2,6 x 105 cpm/μΐ) foram injectados intravenosamente 10 minutos antes da oclusão da artéria cerebral média. Num terceiro conjunto de experiências, PMNs etiquetados de forma radioactiva foram administrados intravenosamente 10 minutos antes da oclusão da artéria cerebral média na forma de uma injecção de 100 μΐ (os PMNs etiquetados de forma radioactiva foram misturados com soro fisiológico para um volume total de 0,15 ml; *3 x 106 cpm/μΐ) . Para experiências em que se administraram anticorpos não etiquetados, a altura em que as medições foram feitas está indicada no texto, utilizando os métodos descritos acima para determinar o fluxo de sangue cerebral, volumes de enfarte e mortalidade. Para as experiências em que se administraram anticorpos etiquetados de forma radioactiva ou nPMNs etiquetados de forma radioactiva, os ratinhos foram sacrificados nos instantes indicados e os cérebros foram imediatamente removidos e divididos nos hemisférios ipsilateral (pós-isquémico) e contralateral. A deposição de anticorpos ou neutrófilos etiquetados de forma radioactiva foi medida e expressa como cpm ipsilateral/contralateral.

Análise dos Dados. O fluxo de sangue cerebral, volume de enfarte e deposição de mInPMNs foram comparados utilizando o teste t de Student para variáveis desemparelhadas. Compararam-se as pontuações de deficiências neurológicas utilizando o teste U de Mann-Whitney. Efectuou-se ANOVA de duas vias para testar quanto a diferenças significativas entre deposição de anticorpos de referência e final (30 121 minutos) nos dois grupos (experimental versus simulado). Utilizou-se o teste t de Student para variáveis desemparelhadas para avaliar diferenças dentro dos grupos (referência versus o instante de 30 minutos). Testaram-se diferenças de sobrevivência entre grupos utilizando análise de contingência com a estatística de Qui-quadrado. Os valores estão expressos como média ± EPM, em que um valor p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

Expressão de P-selectina em Acidente Vascular Cerebral Murino. Uma vez que a P-selectina medeia a fase inicial de adesão de leucócitos a células endoteliais activadas 21, examinou-se a expressão inicial de P-selectina cerebral num modelo murino de acidente vascular cerebral com reperfusão. Os ratinhos que receberam uma IgG monoclonal de rato anti-P-selectina murina etiquetada com I antes da cirurgia exibiram um aumento de 216% da acumulação de anticorpo aos 30 minutos de reperfusão em comparação com animais operados de forma simulada (p < 0,001, Figura 18A). Para demonstrar que este grau de deposição de anticorpos no hemisfério submetido a reperfusão se deveu a expressão de P-selectina e não a acumulação inespecífica, compararam-se com animais identicamente tratados que receberam uma IgG não imunológica de rato etiquetada com 125I. Estas experiências demonstraram ter ocorrido acumulação significativamente mais elevada da IgG anti-P-selectina do que da IgG não imunológica (p < 0,025, Figura 18A), sugerindo que a P-selectina é expressa no cérebro num período de 30 minutos após a reperfusão.

Acumulação de Neutrófilos em Acidente Vascular Cerebral Murino. Para delinear o período de tempo durante o qual 122 ocorre influxo de PMNs após acidente vascular cerebral, mediu-se a acumulação de PMNs etiquetados com mIn em ratinhos de tipo selvagem (PS +/+) antes da MCAO, imediatamente após e 10 minutos depois da MCAO e aos 30 minutos, 300 minutos e 22 horas de reperfusão. Em ratinhos PS +/+, a acumulação de PMNs começa logo após a iniciação de isquemia focal e continua durante o período de reperfusão (Figura 18B) . Para determinar o papel da P-selectina nesta acumulação de neutrófilos pós-isquémica realizaram-se experiências utilizando ratinhos homozigóticos nulos para o gene da P-selectina (PS -/-) . Os ratinhos PS -/- exibiram acumulação de PMNs significativamente reduzida após oclusão da artéria cerebral média e reperfusão (Figura 18B).

Papel da PS em Ausência de Refluxo Cerebrovascular. Para determinar se a redução da acumulação de PMNs em ratinhos PS -/- resultava em fluxo de sangue cerebral melhorado após o restabelecimento do fluxo obtiveram-se medições em série do CBF relativo por Doppler de laser em ratinhos PS +/+ e PS -/-. Antes da iniciação da isquemia (Figura 19, ponto a), os fluxos relativos de sangue cerebral eram quase idênticos entre grupos. A oclusão da artéria cerebral média (Figura 19, ponto b) esteve associada a uma queda quase idêntica do fluxo de sangue cerebral em ambos os grupos. Imediatamente antes da remoção da sutura de oclusão intraluminal aos 45 minutos de isquemia (Figura 19, ponto c), os fluxos de sangue cerebral tinham aumentado ligeiramente, apesar de terem permanecido significativamente decrescidos em comparação com os fluxos de referência. Imediatamente após da remoção da sutura de oclusão para iniciar a reperfusão (Figura 19, ponto d), os fluxos de sangue cerebral em ambos os grupos aumentaram 123 para um grau comparável (* 60% da referência nos ratinhos PS -/- e PS +/+) . A falha imediata dos fluxos de sangue cerebral pós-reperfusão em atingir níveis pré-oclusão é característica de ausência de refluxo cerebrovascular , em que o decréscimo subsequente dos fluxos de sangue cerebral pós-reperfusão representa hipoperfusão cerebral pós-isquémica retardada 23. Aos 30 minutos de reperfusão (Figura 19, ponto e), os fluxos de sangue cerebral entre os dois grupos de animais divergiram, em que os animais PS -/-exibiram fluxos relativos de sangue cerebral significativamente mais elevados do que os controlos PS +/+ (p < 0,05) (Figura 19, ponto f). Esta divergência reflectiu diferenças significativas na hipoperfusão cerebral pós-isquémica retardada e persistiu durante o período de observação de 22 horas.

Uma vez que foi relatado que variações da anatomia cerebrovascular resultam em diferenças de susceptibilidade a acidente vascular cerebral experimental em ratinhos , efectuou-se coloração com tinta da índia/negro de fumo para visualizar o padrão vascular do Círculo de Willis nos ratinhos PS -/- e PS +/+. Estas experiências demonstraram não existirem grandes diferenças anatómicas no padrão vascular da circulação cerebral (Figura 20).

Consequências de Acidente Vascular Cerebral. Testou-se a importância funcional da expressão de P-selectina comparando índices de consequências de acidente vascular cerebral em ratinhos PS -/- com os de controlos PS +/+. Os ratinhos PS -/- foram significativamente protegidos dos efeitos de isquemia cerebral focal e reperfusão, com base numa redução de 77% do volume de enfarte (p < 0,01) em comparação com controlos P-selectina +/+ (Figura 21A). Esta 124

redução do volume de enfarte foi acompanhada de uma tendência para deficiências neurológicas reduzidas (p = 0,06, Figura 21B) e sobrevivência acrescida (p < 0,05; Figura 21C) nos animais PS

Efeito do Bloqueio de P-selectina. Depois de se ter observado o papel funcional da expressão de P-selectina em acidente vascular cerebral utilizando ratinhos mutantes por deleção, conduziram-se experiências para determinar se o bloqueio farmacológico de P-selectina poderia melhorar as consequências de acidente vascular cerebral em ratinhos PS +/+. Utilizando uma estratégia que consistiu em administrar um anticorpo monoclonal de rato bloqueador anti-P-selectina de ratinho (clone RB 40.34, 14,19,2°) ou jgç rato de controlo não imunológica imediatamente antes da cirurgia, observou-se que os ratinhos que receberam o anticorpo bloqueador exibiram fluxos de sangue cerebral pós-reperfusão melhorados aos trinta minutos (Figura 22A), bem como deficiências neurológicas reduzidas (Figura 22B), volumes reduzidos de enfarte cerebral (Figura 22C) e uma tendência para mortalidade reduzida em comparação com controlos (Figura 22D).

DISCUSSÃO

Apesar dos progressos substanciais em anos recentes na prevenção primária de acidente vascular cerebral 1, as opções terapêuticas para tratar acidente vascular cerebral em progressão continuam a ser extremamente limitadas 6. Não obstante ter-se pensado que a publicação de dois ensaios de referência no Outono passado, demonstrando morbidez reduzida após tratamento de acidente vascular cerebral isquémico com rt-PA 2,3, faria surgir uma nova era de terapia trombolítica no tratamento de acidente vascular 125 cerebral 4, o entusiasmo diminuiu um pouco quando se notou transformação hemorrágica e mortalidade acrescida em pacientes com acidente vascular cerebral isquémico tratados com estreptoquinase 5. Estes ensaios divergentes tornaram mais critico do que nunca o desenvolvimento de novas terapias seguras para tratar acidente vascular cerebral em progressão. Se bem que o restabelecimento do fluxo de sangue em cérebro pós-isquémico confira novas oportunidades para intervenção terapêutica precoce, a reperfusão é uma espada de dois gumes. Dado o potencial citotóxico dos neutrófilos 25, não é surpreendente que o influxo de neutrófilos para tecido cerebral pós-isquémico possa conduzir a danos suplementares e piore as consequências após acidente vascular cerebral experimental 7,26-29 ^ Utilizando um modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão, foi recentemente identificado um papel contributivo importante para a molécula de adesão celular ICAM-1 na acumulação de neutrófilos às 22 horas após acidente vascular cerebral 7. No entanto, a expressão aumentada de ICAM-1 endotelial cerebrovascular requer acontecimentos de transcrição e tradução de novo, o que requer tempo. Em contraste, a P-selectina, uma glicoproteina que abrange membranas e que medeia as fases iniciais da adesão de neutrófilos, pode ser mobilizada de reuniões de armazenamento pré-formadas para ser rapidamente expressa na superfície de células endoteliais isquémicas 8,30. Uma vez que os ensaios clínicos de terapia trombolítica para acidente vascular cerebral revelam uma janela temporal estreita para benefícios potenciais (nas primeiras várias horas do início do acidente vascular cerebral) 2'3'5, isto sugere que estratégias concebidas para interferir nas fases iniciais da adesão de PMNs poderão ser teoricamente benéficas em acidente vascular cerebral 126 humano. Estes ensaios deverão conduzir a um maior número de pacientes para intervenção terapêutica precoce, aumentando a necessidade de abordar a questão de lesão de reperfusão em territórios medicamente vascularizados. Adicionalmente, estes ensaios sublinham a necessidade premente de compreender as contribuições de moléculas de adesão individuais para a patogénese de acidente vascular cerebral.

Dada a quantidade considerável de literatura que descreve o papel da P-selectina noutros modelos de isquemia e reperfusão 8,31“34, sabe-se surpreendentemente pouco acerca do papel da P-selectina em acidente vascular cerebral. 0 conhecimento do papel especifico da P-selectina na rede vascular cerebral é importante porque os requisitos de moléculas de adesão podem variar entre leitos vasculares e condições em estudo. Por exemplo, num modelo de transplantação intestinal 35 r anticorpos anti- •P-selectina não reduziram a lesão de reperfusão, ao passo que anticorpos anti-CDll/CD18 conseguiram reduzi-la. Apesar do bloqueio da P-selectina ter sido ineficaz na redução da adesão de PMNs e fugas de albumina num modelo de isquemia mesentérica e reperfusão no rato, o bloqueio de ICAM-1 foi eficaz 36. Num modelo de isquemia/reperfusão da pata traseira de rato, os requisitos da selectina quanto à adesão de PMNs diferiram entre os leitos vasculares pulmonar e do músculo crural 33. 0 único estudo publicado que aborda a P-selectina no cérebro isquémico é uma descrição histopatológica de acidente vascular cerebral em primatas, no qual a expressão da P-selectina foi aumentada na rede microvascular lenticuloestriada 10. Além disso, não há dados que abordem 127 a importância funcional desta expressão de P-selectina. Realizaram-se os presentes estudos para estudar se a expressão de P-selectina contribui para a acumulação de neutrófilos, ausência de refluxo e lesão em tecidos cerebral pós-isquémico num modelo murino de acidente vascular cerebral com reperfusão. Utilizando um modelo recentemente estabelecido de isquemia cerebral focal e reperfusão em ratinhos n, a expressão de P-selectina foi demonstrada por deposição acrescida de anticorpo etiquetado de forma radioactiva no território isquémico. Nesta técnica, a deposição de anticorpos no hemisfério isquémico foi normalizada para a do hemisfério não isquémico em cada animal, não só para minimizar variações potenciais do volume de injecção ou volume de distribuição, mas para permitir comparar animais que receberam anticorpos diferentes. Uma vez que a destruição da função da barreira endotelial no córtex isquémico pode aumentar a deposição de anticorpos sem selectividade, realizaram-se experiências semelhantes com uma IgG de rato de controlo. Estes dados mostram que o anticorpo que se liga à P-selectina é depositado a uma taxa acelerada em comparação com o anticorpo de controlo, sugerindo que a expressão local de P-selectina está aumentada no tecido sujeito a reperfusão. Estes dados do modelo murino são paralelos aos relatados num modelo de babuíno de acidente vascular cerebral 10, no qual a expressão de P-selectina aumentou no período de 1 hora após o acontecimento isquémico.

Demonstrou-se o papel da expressão da P-selectina no recrutamento de PMNs para a zona pós-isquémica utilizando uma estratégia na qual se mediu a acumulação de PMNs etiquetados com inIn. Não obstante ter sido previamente relatado que, às 22 horas, a acumulação de PMNs está 128 aumentada no hemisfério isquémico 7, os presentes dados temporais demonstram que a acumulação de PMNs começa pouco tempo depois do inicio da isquemia. A falha em expressar o gene da P-selectina foi associada a acumulação reduzida de PMNs, sugerindo a participação da P-selectina no recrutamento cerebral pós-isquémico de PMNs. No entanto, os animais nulos para P-selectina exibiram uma acumualção de neutrófilos modesta (se bem que inferior aos controlos) às 22 horas. Este dado indica que a P-selectina não é o mecanismo efector exclusivo responsável pelo recrutamento cerebral pós-isquémico de PMNs e é consistente com dados anteriores segundo os quais a ICAM-1 também participa na adesão pós-isquémica de PMNs 7. Além disso, este dado não diverge daquele em que instilação intra-abdominal de tioglicolato em ratinhos deficientes em P-selectina causou recrutamento retardado (mas não ausente) de PMNs 9.

Devido à necessidade critica de identificar motivos para reperfusão falhada, nos presentes estudos examinou-se o papel da P-selectina em hipoperfusão cerebral pós-isquémica retardada 22'23, o fenómeno em que o fluxo de sangue diminui durante a reperfusão apesar do restabelecimento de pressões de perfusão adequadas. Em modelos cardíacos de isquemia, a ausência de refluxo piora à medida que o tempo decorre após a reperfusão 37, sugerindo um papel importante de mecanismos efectores recrutados, como trombose microcirculatória progressiva, disfunção vasomotora e recrutamento de PMNs. Foi mostrado noutros modelos que reacções de aderência dependentes de P-selectina e de ICAM-1 e obstrução capilar por PMNs participam na ausência de refluxo pós-isquémico. No cérebro, os PMNs foram implicados em ausência de refluxo cerebral pós-isquémico 40'41, mas o papel da P-selectina neste processo não foi 129 elucidado. 0 presente estudo emprega uma técnica relativamente não invasiva (Doppler de laser) para obter medições em série do fluxo relativo de sangue cerebral com a finalidade de determinar a existência, decurso temporal e dependência de P-selectina da ausência de refluxo cerebrovascular pós-isquémico. Nestas experiências, animais nulos para P-selectina e de controlo foram sujeitos a graus virtualmente idênticos de isquemia, e a recuperação instantânea do fluxo de sangue após a remoção da sutura de oclusão intraluminal foi igual nos dois grupos. No entanto, o fluxo de sangue cerebral diminuiu no período de tempo após a reperfusão em animais P-selectina +/+. Em contraste abrupto, os animais PS -/- exibiram apenas ligeira hipoperfusão cerebral pós-isquémica retardada. Este último decréscimo (se bem que limitado) do fluxo de sangue cerebral às 22 horas é consistente com o recrutamento modesto de PMNs observado nos animais PS -/- ao longo do mesmo período. Mais uma vez, isto sugere que outros mecanismos efectores (como ICAM-1) poderão ser responsáveis pela diminuição tardia do fluxo de sangue cerebral em animais PS -/-.

Os efeitos funcionais da expressão de P-selectina são claros a partir do presente conjunto de estudos: animais que não conseguem expressar o gene da P-selectina (ou animais PS +/+ tratados com um anticorpo anti-P-selectina funcionalmente bloqueador) exibem enfartes menores e sobrevivência melhorada e os sobreviventes exibem consequências neurológicas melhoradas em comparação com os controlos. Quando estes dados são considerados juntamente com dados previamente publicados que demonstram um efeito prejudicial da expressão de ICAM-1 em acidente vascular cerebral 7, torna-se cada vez mais clara a existência de 130 múltiplos meios de recrutamento de PMNs para o córtex cerebral pós-isquémico e que o bloqueio de cada um representa uma estratégia potencial para melhorar as consequências de acidente vascular cerebral em humanos. Dado o presente reconhecimento da importância de reperfusão calendarizada na travagem da onda em progressão de morte neuronal após acidente vascular cerebral, interferir na adesão de PMNs nas suas fases iniciais parece ser uma opção atractiva para reduzir a morbidez e a mortalidade. De facto, estratégias anti-moléculas de adesão poderão não só ser benéficas por si próprias (isto é, incluindo pacientes não elegíveis para trombólise), mas poderão estender a janela de oportunidade de intervenção trombolítica 42. O presente conjunto de estudos contribui para a compreensão dos mecanismos patofisiológicos que operam em acidente vascular cerebral com reperfusão. Estes estudos sugerem a necessidade de ensaios clínicos de terapias para acidente vascular cerebral em progressão que optimizem o meio de reperfusão para reduzir a acumulação de PMNs.

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Para definir o papel da P-selectina em acidente vascular cerebral utilizou-se um modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão que consistiu em oclusão intraluminal da artéria cerebral média (MCA) durante 45 minutos seguida de 22 horas de reperfusão em dois grupos de ratinhos: ratinhos transgénicos homozigóticos nulos para P-selectina (PS -/-) e primos de controlo de tipo selvagem (PS +/+). Calcularam-se os volumes de enfarte cerebral a partir de secções em série de planimetria coradas com cloreto de trifeniltetrazólio e foram expressos como percentagem de tecido com enfarte no hemisfério ipsilateral. As consequências neurológicas basearam-se no comportamento do animal observado por um investigador cego (1: sem deficiências; 2: em círculos; 3: rotação; 4: imóvel). Determinou-se o fluxo de sangue cerebral (CBF) cortical ipsilateral por fluxometria por Doppler de laser, tendo sido expresso como percentagem do CBF cortical contralateral. Os ratinhos PS -/- exibiram uma redução de 3,8 vezes dos volumes de enfarte em comparação com controlos PS +/+ (7,6 ± 4,4% versus 29,2 ± 10,1%, p < 0,05). Esta redução dos volumes de enfarte em ratinhos sem P-selectina foi acompanhada de efeitos semelhantes de sobrevivência melhorada (87% versus 42%, p < 0,05) e uma tendência para deficiências neurológicas decrescidas (1,9 ± 0,4 versus 2,5 ± 0,3, p=NS) nos sobreviventes. Uma vez que se observou uma tendência para fluxo aumentado de sangue cerebral após isquemia cerebral e reperfusão no coorte PS -/- (65 ± 11% versus 46 ± 18% para controlos, p=NS) , estes estudos sugerem que a adesão dependente de P-selectina pode contribuir para ausência de refluxo cerebral. Considerados em conjunto, estes dados implicam um papel importante da expressão de P-selectina na patofisiologia de acidente 136 vascular cerebral e sugerem novas estratégias farmacológicas para melhorar as consequências de acidente vascular cerebral. EXEMPLO 6: Ausência do Gene da P-selectina Reduz a Acumulação Pós-Isquémica de Neutrófilos Cerebrais, Ausência de Refluxo e Lesões em Tecidos num Modelo Murino de Acidente Vascular Cerebral com Reperfusão

Estudos recentes em humanos indicam que o restabelecimento do fluxo de sangue cerebral (CBF) durante o período inicial que se segue ao aparecimento de acidente vascular cerebral reduz as sequelas neurológicas. Pôs-se a hipótese da P-selectina (PS), uma molécula de adesão de neutrófilos (PMNs) de actuação precoce expressa por endotélio hipóxico, poder exercer um papel patofisiológico importante em acidente vascular cerebral em progressão com reperfusão. Realizaram-se estudos preliminares num modelo murino de isquemia cerebral focal transitória que consistiu em oclusão intraluminal da artéria cerebral média durante 45 minutos seguida de 22 horas de reperfusão. Neste modelo, ratinhos que não expressam o gene da PS (PS -/-) exibiram menores volumes de enfarte, pontuações reduzidas de deficiências neurológicas e sobrevivência melhorada em comparação com controlos de tipo selvagem (PS +/+) . Realizaram-se os presentes estudos para definir suplementarmente mecanismo(s) induzido(s) por PS de lesão cerebral. Os ratinhos PS +/+ (n=6) que receberam uma IgG anti-PS etiquetada com 125I antes da cirurgia exibiram uma acumulação 216% maior do anticorpo no hemisfério ipsilateral aos 30 minutos de reperfusão em comparação com animais operados de forma simulada (n=6, p < 0,001) ou com animais que receberam IgG não imunológica e sujeitos a isquemia cerebral focal transitória e 30 minutos de 137 reperfusão (n=4, p < 0,03). Em ratinhos PS +/+, a acumulação de PMNs começa precocemente após a iniciação da isquemia focal e continua durante o período de reperfusão (aumento de 2 vezes da acumulação de 111ln-PMNs ipsilateral/contralateral às 22 horas, n=8, p < 0,05). Os ratinhos PS -/- exibiram uma redução de 25% da acumulação de PMNs no hemisfério ipsilateral às 22 horas (n=7, p < 0,05). Investigou-se o efeito da expressão de PS na ausência de refluxo cerebral pós-isquémico medindo o CBF ipsilateral em série durante a evolução de acidente vascular cerebral. Apesar dos CBFs de referência, pós-oclusão e na reperfusão inicial terem sido idênticos, os CBFs aos 30 minutos da reperfusão foram significativamente mais elevados em ratinhos PS -/- (n=5) em comparação com ratinhos PS +/+ (n=8, 2,4 vezes mais elevado, p < 0,05). Esta diferença manteve-se durante o restante do período de 22 horas de reperfusão. Estes dados corroboram um papel inicial importante da PS no recrutamento de PMNs, ausência de refluxo pós-isquémico e danos em tecidos em acidente vascular cerebral em progressão. Esta é a primeira demonstração de um papel patofisiológico da PS em lesão de reperfusão cerebral, sugerindo que o bloqueio de PS poderá representar um alvo terapêutico para o tratamento de acidente vascular cerebral com reperfusão. EXEMPLO 7: Monóxido de Carbono e Acidente Vascular Cerebral em Progressão

O monóxido de carbono gasoso, um produto secundário tóxico do catabolismo do heme, está envolvido na potenciação e memória de longo prazo do sistema nervoso central. Todavia, desconhecem-se outros papéis fisiológicos da produção de CO no cérebro. Uma vez que a heme oxigenase é induzida durante estados inflamatórios, investigou-se se a produção de CO 138 endógeno poderia conferir um papel protector cerebral em acidente vascular cerebral. Num modelo murino de isquemia cerebral focal, a heme oxigenase de tipo I foi induzida ao nivel do mRNA (por coloração "Northern") e de proteínas (por coloração "Western") com localização no endotélio vascular cerebral no hemisfério isquémico por hibridização in situ e imuno-histoquimica. Observou-se produção local de CO por medição directa na zona isquémica. Em experiências paralelas, células endoteliais de cérebro murino expostas a um ambiente hipóxico exibiram indução semelhante de mRNA de heme oxigenase, proteínas e geração de CO. Para determinar se a produção de CO era inerente à patofisiologia de acidente vascular cerebral, bloqueou-se a produção de CO por administração de protoporfirina de estanho (confirmada por medição directa de níveis reduzidos de CO local). Estes animais exibiram volumes de enfarte significativamente mais elevados, piores consequências neurológicas e mortalidade acrescida em comparação com controlos não tratados. Suplementarmente, a administração de CO antes de acidente vascular cerebral conferiu protecção cerebral significativa. Uma vez que esta protecção não foi observada em animais tratados com biliverdina, o produto secundário coincidente do catabolismo do heme, estes dados sugerem que a produção de CO endógeno per se tem um papel protector em acidente vascular cerebral em progressão.

Introdução Há uma quantidade considerável de literatura e um reconhecimento comum dos efeitos tóxicos de monóxido de carbono (CO) exógeno, que se liga avidamente a centros de heme, inibindo o transporte de oxigénio e envenenando a respiração celular. Durante muitos anos, o CO foi considerado um produto secundário acidental do catabolismo 139 do heme, mas dados recentes no cérebro sugerem que o CO produzido em neurónios discretos pela heme oxigenase II poderá modular a potenciação de longo prazo. Em ratos, a exposição a choque térmico foi correlacionada com a expressão de uma proteína de choque térmico de 32 kDa (heme oxigenase I) em vários órgãos, incluindo o cérebro. A importância fisiológica desta indução de HSP32 foi teleologicamente atribuída à libertação estequiométrica de CO pela heme oxigenase I (HOI). Na maior parte dos estudos experimentais, a indução de HOI é apenas um marcador acidental de "stress" oxidativo celular. A identificação recente de um papel anti-inflamatório da HOI num modelo de inflamação peritoneal foi atribuída à produção do antioxidante natural biliverdina durante o processo do catabolismo do heme. 0 presente estudo relata, pela primeira vez, que o cérebro pós-isquémico gera enormes quantidades de CO. Utilizando um modelo murino de isquemia cerebral focal no qual a artéria cerebral média é submetida a oclusão com uma sutura intraluminal, a produção de HOI no hemisfério isquémico aumentou significativamente em comparação com o hemisfério não isquémico. Uma vez que, em estudos de imuno-histoquímica e hibridização in situ, a fonte de HOI foi localizada em células endoteliais no hemisfério isquémico, utilizou-se um modelo in vitro de hipoxia celular para confirmar a indução de mensagem, proteína e actividade de HOI em células endoteliais microvasculares cerebrais murinas. 0 bloqueio da produção de CO utilizando protoporfirina IX de estanho ou zinco foi associado a um aumento do volume de enfarte cerebral e mortalidade, ao passo que a exposição de animais a CO imediatamente antes da isquemia conferiu protecção cerebral significativa 140 dependente da dose numa janela terapêutica estreita. A administração de biliverdina não teve efeito neste modelo. Considerados em conjunto, estes dados indicam que o tecido cerebral isquémico produz grandes quantidades de CO, cuja produção confere protecção cerebral que limita a quantidade de tecido destruido durante acidente vascular cerebral. Métodos

Preparação e administração de protoporfirina. Dicloreto de protoporfirina IX de estanho (20 mg, Porphyrin Products, Logan, UT) , protoporfirina IX de zinco (17 mg, Porphyrin Products, Logan, UT) ou biliverdina (18 mg, Porphyrin Products, Logan, UT) foi inicialmente dissolvido em dimetilsulfóxido (2 ml). Adicionou-se uma aliquota desta solução (200 μΐ) a solução salina normal (9,8 ml) e submeteu-se esta mistura a vórtice vigoroso para dar origem a uma solução 2,7 x 10~4 M da protoporfirina. O recipiente que continha a solução foi envolvido em papel de alumínio, para prevenir a fotólise da protoporfirina, e foi armazenado a 4°C até à utilização.

Carregaram-se bombas micro-osmóticas (#1003D, Alza Corp., Paio Alto, CA) com esta solução de protoporfirina (91 μΐ/bomba), tendo sido implantadas subcutaneamente no ratinho anestesiado via uma incisão de 1 cm na linha média dorsal 24 horas antes do início da cirurgia. Estas bombas administram solução de fármaco a uma taxa de 0,95 ± 0,02 μΐ/hora. Na altura da cirurgia administrou-se uma dose adicional da solução de protoporfirina (0,3 ml, i.v.) antes da inserção do cateter de oclusão intraluminal. Cada animal recebeu as seguintes quantidades totais (injecção + bomba) de fármaco durante o estudo: protoporfirina de estanho 141 (0,070 mg), protoporfirina de zinco (0,059 mg) ou biliverdina (0,061 mg). EXEMPLO 8

Hipoxia ou radicais livres induzem relocalização de P-selectina (PS) para a superfície de células endoteliais (ECs), onde participa na adesão de neutrófilos (PMNs) durante a reperfusão. Para explorar um mecanismo pelo qual nitrovasodilatadores poderão atenuar o sequestro de leucócitos pós-isquémico, testámos se a estimulação da via NO/cGMP poderia atenuar a expressão de PS na superfície em ECs hipóxicas da veia umbilical humana. As ECs expostas a hipoxia (p02 < 20 Torr durante 4 horas) exibiram um aumento de 50% da libertação de vWF (p < 0, 005) (o vWF está

empacotado com PS) , com um aumento paralelo de 80% da expressão de PS na superfície (p < 0,0001), medido por ligação específica de um anticorpo anti-PS etiquetado de forma radioactiva. Em condições semelhantes, a adição do dador de NO 3-morfolino-sidnonimina (SIN-1, 0,1 mM) ou do análogo de cGMP 8-bromo-cGMP (cGMP, 10 nM) reduziu a libertação de vWF: vWF de controlo, 11 ± 0,4 mU/ml; SIN-1, 9,1 ± 0,3 mU/ml; cGMP, 9,7 ± 0,2 mU/ml; p < 0,005 para SIN-1 ou cGMP versus Controlo. Em comparação com os controlos, SIN-1 ou cGMP também reduziram a expressão de PS na superfície (decréscimos de 40% e 48%, respectivamente, p < 0,005 para cada). Utilizando um ensaio de aderência imunofluorescente, tanto SIN-1 como cGMP reduziram a ligação de HL60 a HUVECS hipóxicas (decréscimo de 53% e 86% versus controlos, p < 0,05 para cada). A medição da fluorescência de fura-2 demonstrou que a hipoxia aumentou a concentração de cálcio intracelular [Cai] e que [Cai] aumentada podia ser bloqueada por cGMP. Nenhum dos SIN-1 ou cGMP conseguiu reduzir suplementarmente a expressão da PS 142 quando ECs foram colocadas num meio sem cálcio. Estes dados sugerem que a estimulação da via NO/cGMP inibe a expressão da PS ao inibir o fluxo de cálcio em ECs e identificam esta inibição como sendo um mecanismo importante pelo qual nitrovasodilatadores poderão diminuir a ligação de PMNs em tecidos pós-isquémicos. EXEMPLO 9: Factor ixai 0 Factor IX é um factor de coagulação que existe em humanos e noutros mamíferos e é uma parte importante da via de coagulação. No esquema normal da coagulação, o Factor IX é activado pelo Factor Xla ou por um complexo factor de tecidos/VIIa na sua forma activa, Factor IXa. Em seguida, o Factor IXa pode activar o Factor X, que desencadeia a parte final da cascata de coagulação, conduzindo a trombose. Uma vez que o Factor X pode ser activado por uma de duas vias, a via extrínseca (via Vlla/factor de tecidos) ou intrínseca (via Factor IXa), pomos a hipótese da inibição do Factor IXa poder conduzir a enfraquecimento de algumas formas de hemostasia mas deixar intacta a hemostasia em resposta a lesões em tecidos. Por outras palavras, poderá conduzir a bloqueio de alguns tipos de coagulação mas poderá não conduzir a hemorragias excessivas ou indesejadas. 0 Factor IXai é em Factor IX que foi quimicamente modificado de modo a ainda se assemelhar ao Factor IXa (e, consequentemente, poder competir com o Factor IXa nativo) mas sem a sua actividade. Isto pode "sobrepor-se" ou causar uma inibição competitiva da via normal da coagulação dependente do Factor IXa. Uma vez que o Factor IXa se liga a endotélio e plaquetas e talvez a outros sítios, também poderá ser possível bloquear a actividade do Factor IXa administrando agentes que interferem na ligação do Factor IXa (ou por interferência na activação do Factor IX). 143

Acidente vascular cerebral e outras perturbações isquémicas poderão beneficiar clinicamente da lise de um trombo existente, mas também há a complicação potencialmente devastadora de ocorrer hemorragia. Nas presentes experiências utilizou-se o modelo de ratinho de isquemia cerebral e reperfusão (acidente vascular cerebral). Os ratinhos receberam um bolus intravenoso de 300 μς/kg de Factor IXai imediatamente antes da cirurgia. Os acidentes vasculares cerebrais foram criados por oclusão intraluminal da artéria cerebral média direita. Quando se mediram as consequências de acidente vascular cerebral 24 horas mais tarde, observou-se que os animais que tinham recebido Factor IXai exibiram menores volumes de enfarte, perfusão cerebral melhorada, menos deficiências neurológicas e mortalidade reduzida em comparação com controlos que foram submetidos à mesma cirurgia mas que não receberam Factor IXai. Também se notou que os animais que receberam Factor IXai não tiveram hemorragia intracerebral aparente. Em contraste, notou-se ocasionalmente hemorragia intracerebral nos animais de controlo que não receberam Factor IXai. 144

Tabela ιι

Controlo Experimental média d.p. média d.p. Estatística peso 26,91 3,21 25,25 2,49 0,14 dopp. 0,96 0,24 1,04 0,35 0,52 dop. occ. 1 0,18 0,07 0,16 0,08 0,60 dop. occ. 2 0,40 0,22 0,43 0,20 0,68 dop. reper. 0,55 0,42 0,53 0,30 0,89 dop. sac. 0,38 0,25 0,75 0,31 0,02 tipo 2,22 0,67 1, 67 0,49 Razão i/C 1,18 0,20 1,08 vol. enf. 21,16 25,14 3,47 12,03 0,0452 contagem 11 16 EXEMPLO 10: Exacerbação de Lesão Cerebral em Ratinhos que Expressam o Gene da P-Selectina: Identificação de Bloqueio de P-Selectina como Novo Alvo para o Tratamento de Acidente Vascular Cerebral

Resumo

Presentemente há um grande vazio terapêutico no que se refere ao tratamento de acidente vascular cerebral em progressão. Apesar da P-selectina ser rapidamente expressa por células endoteliais hipóxicas in vitro, a importância funcional da expressão de P-selectina em acidente vascular cerebral ainda não foi explorada. Para identificar as consequências patofisiológicas da expressão de P-selectina e para identificar o bloqueio de P-selectina como nova abordagem potencial para o tratamento de acidente vascular cerebral, conduziram-se experiências que utilizam um modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão. A expressão inicial de P-selectina no córtex cerebral pós-isquémico foi demonstrada pela acumulação especifica de IgG anti-P-selectina murina etiquetada de forma radioactiva, em que se 145 verificou, por imuno-histoquímica, que a expressão aumentada de P-selectina estava localizada nas células endoteliais microvasculares cerebrais ipsilaterais. Em experiências concebidas para testar a importância funcional da expressão aumentada de P-selectina em acidente vascular cerebral, demonstrou-se que a acumulação de neutrófilos no córtex isquémico de ratinhos que expressam o gene da P-selectina (PS +/+) foi significativamente mais elevada do que em ratinhos homozigóticos nulos para P-selectina (PS -/-) . 0 influxo reduzido de neutrófilos foi acompanhado de maior refluxo cerebral pós-isquémico (medido por Doppler de laser) nos ratinhos PS -/-. Adicionalmente, ratinhos PS -/-exibiram menores volumes de enfarte (redução de cinco vezes, p < 0,05) e sobrevivência melhorada em comparação com ratinhos PS +/+ (88% versus 44%, p < 0,05). O bloqueio funcional de P-selectina em ratinhos PS +/+ utilizando um anticorpo monoclonal dirigido contra a P-selectina murina também melhorou o refluxo inicial e consequências de acidente vascular cerebral em comparação com controlos, tendo-se notado volumes reduzidos de enfarte cerebral mesmo quando o anticorpo bloqueador foi administrado após oclusão da artéria cerebral média. Estes dados são os primeiros a demonstrar um papel patofisiológico da P-selectina em acidente vascular cerebral e sugerem que o bloqueio de P-selectina poderá representar um novo alvo terapêutico para o tratamento de acidente vascular cerebral.

INTRODUÇÃO

Hoje em dia, o acidente vascular cerebral isquémico é a terceira principal causa de morte nos Estados Unidos \ Até muito recentemente não havia nenhum tratamento directo para reduzir os danos em tecido cerebral em acidente vascular cerebral em progressão. Apesar dos estudos de acidente 146 vascular cerebral agudo com rt-PA de NINDS 2 e ECASS 3 terem sugerido existirem potenciais benefícios terapêuticos de reperfusão inicial 4, a mortalidade acrescida observada após tratamento com estreptoquinase de acidente vascular cerebral isquémico agudo 5 salienta o facto de, presentemente, não existir nenhum tratamento claramente eficaz de acidente vascular cerebral em progressão. Este vazio nos presentes recursos médicos para o tratamento de acidente vascular cerebral conduziu a algumas abordagens inovadoras 6, mas, para além de rt-PA, nenhuma atingiu a esfera clínica. Para identificar um tratamento potencial seguro e eficaz para acidente vascular cerebral em progressão centrámo-nos no papel prejudicial de neutrófilos recrutados. Um trabalho recente num modelo murino de acidente vascular cerebral com reperfusão demonstrou que a depleção de neutrófilos (PMNs) antes do acidente vascular cerebral minimiza lesões em tecidos cerebrais e melhora as consequências funcionais 7; ratinhos sem a molécula de adesão celular específica, ICAM-1, são protegidos de modo semelhante 7. A P-selectina, uma molécula que pode ser rapidamente relocalizada para a superfície endotelial hipóxica a partir de sítios de armazenamento pré-formados 8, é um mediador inicial importante da rotação de neutrófilos 9, que facilita o arresto de neutrófilos mediado pela ICAM-1. Apesar da P-selectina ser expressa em acidente vascular cerebral em primatas 10, a importância funcional da expressão de P-selectina acidente vascular cerebral permanece desconhecida.

Para explorar o papel patofisiológico da P-selectina em acidente vascular cerebral empregámos um modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão 11 que emprega ratinhos de tipo selvagem e ratinhos homozigóticos nulos 147 para o gene da P-selectina 9 e uma estratégia de administração de um anticorpo para a P-selectina funcionalmente bloqueador. Nestes estudos confirmamos não só que a expressão de P-selectina após oclusão da artéria cerebral média está associada a refluxo cerebral reduzido após reperfusão e consequências piores após acidente vascular cerebral mas também que o bloqueio de P-selectina confere um grau significativo de protecção cerebral pós-isquémica. Estes estudos são a primeira demonstração do papel patofisiológico da expressão de P-selectina em acidente vascular cerebral e sugerem a possibilidade excitante de estratégias anti-P-selectina poderem ser úteis para o tratamento de acidente vascular cerebral com reperfusão.

MÉTODOS

Ratinhos. Realizaram-se experiências com ratinhos transgénicos deficientes em P-selectina, criados como previamente relatado 9 por abordagem selectiva de genes em células estaminais embrionárias Jl, injecção em blastocistos C57BL/6 para obter transmissão da linha germinativa e retrocruzamento para obter ratinhos homozigóticos nulos para P-selectina (PS -/-). As experiências foram realizadas com ratinhos primos PS -/- ou de tipo selvagem (PS +/+) da terceira geração de retrocruzamentos com ratinhos C57BL/6J. Os animais tinham sete até doze semanas de idade e pesavam entre 25-36 gramas na altura das experiências. Uma vez que foi relatado que variações da anatomia cerebrovascular resultam em diferenças na susceptibilidade a acidente vascular cerebral experimental em ratinhos 12, efectuou-se coloração com tinta da índia/negro de fumo para visualizar o padrão vascular do Circulo de Willis em ratinhos PS -/- e PS +/+. 148

Estas experiências demonstraram não existirem grandes diferenças anatómicas no padrão vascular da circulação cerebral.

Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média. Os ratinhos foram anestesiados (0,3 cm3 de cetamina 10 mg/cm3 e xilazina 0,5 mg/cm3, i.p.) e foram posicionados em supinação numa superfície operatória com temperatura rectal controlada (Yellow Springs Instruments, Inc., Yellow Springs, OH). A temperatura central dos animais foi mantida a 37 ± 1°C intra-operatoriamente e durante 90 minutos pós-operatoriamente. Criou-se uma incisão na linha média do pescoço para expor a bainha da carótida direita ao microscópio operatório (ampliação 16-25X, Zeiss, Thornwood, NI). A artéria carótida comum foi isolada com uma linha de seda 4-0, e cada uma das artérias occipital, pterigopalatina e carótida externa foi isolada e dividida. Procedeu-se à oclusão da artéria cerebral média (MCAO) fazendo avançar uma sutura de nylon 5-0 com a ponta tratada a quente de 13 mm via o tronco da carótida externa. Após a colocação da sutura de oclusão, o tronco da artéria carótida externa foi cauterizado e a ferida foi fechada. Passados 45 minutos removeu-se a sutura de oclusão, para estabelecer a reperfusão. Estes procedimentos foram previamente descritos em pormenor 11.

Medição do fluxo de sangue cerebral cortical. Fizeram-se medições transcranianas do fluxo de sangue cerebral utilizando Doppler de laser (Perimed, Inc., Piscataway, NJ) como previamente descrito 13. Utilizando uma sonda de Doppler de laser linear de 0,7 mm (modelo #PF303, Perimed, Piscataway, NJ) e pontos de referência previamente publicados (2 mm posterior ao bregma, 6 mm para cada lado 149 da linha média) 11, fizeram-se medições do fluxo relativo de sangue cerebral como indicado: imediatamente após a anestesia, 1 e 10 minutos após oclusão da artéria cerebral média, bem como após 30 minutos, 300 minutos e 22 horas de reperfusão. Os dados estão expressos como razão da intensidade do sinal de Doppler no hemisfério isquémico em comparação com o hemisfério não isquémico. Apesar deste método não quantificar o fluxo de sangue cerebral por grama de tecido, a utilização de medições de fluxo por Doppler de laser em pontos de referência anatómicos definidos de forma precisa é um meio de comparar fluxos de sangue cerebral no mesmo animal em série ao longo do tempo. Considerou-se que o procedimento cirúrgico era tecnicamente adequado se se observasse ^ 50% de redução do fluxo relativo de sangue cerebral imediatamente após a colocação da sutura de oclusão intraluminal. Estes métodos foram utilizados em estudos anteriores 7,11.

Preparação e administração de proteínas etiquetadas com 125I e neutrófilos murinos etiquetados com mIn. Prepararam-se do modo seguinte anticorpos iodados de forma radioactiva. IgG monoclonal de rato anti-P-selectina murina (Clone RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA) 14 e IgG de rato não imunológica (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) foram etiquetadas de forma radioactiva com 125I pelo método de lactoperoxidase 15 utilizando Enzymobeads (Bio-Rad, Hercules, CA) . Prepararam-se do modo seguinte PMNs etiquetados de forma radioactiva. Sangue citrado de ratinhos de tipo selvagem foi diluído 1:1 com NaCl (0,9%), seguido de ultracentrifugação com gradiente em Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Após lise hipotónica de eritrócitos residuais (exposição durante 20 segundos a H20 destilada, seguida de reconstituição com NaCl 1,8%), os 150 PMNs foram suspensos em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Suspenderam-se neutrófilos (5-7,5 x 106) em PBS com 100 μΟί de míndio-oxina (Amersham Mediphysics, Port Washington, NI), tendo sido sujeitos a agitação suave durante 15 minutos a 37°C. Após lavagem com PBS, os PMNs foram suavemente transformados em grânulos (450 x g) e novamente suspensos em PBS para uma concentração final de 1,0 x 106 células/ml. Cálculo dos Volumes de Enfarte: Após o exame neurológico, os ratinhos foram anestesiados e obtiveram-se medições finais do fluxo de sangue cerebral. Realizou-se eutanásia compassiva por decapitação e removeram-se os cérebros, que foram colocados numa matriz de cérebro de ratinho (Activational Systems Inc., Warren, MI) para se fazerem seccionamentos de 1 mm. As secções foram imersas em cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio 2% (TTC, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em solução salina tamponada com fosfato 0,9%, foram incubadas durante 30 minutos a 37°C e colocadas em formalina 10% 16. O cérebro com enfarte foi visualizado na forma uma área de tecido não corado. Calcularam-se os volumes de enfarte a partir de secções em série de planimetria, tendo sido expressos como percentagem de enfarte no hemisfério ipsilateral. Este método de cálculo de volumes de enfarte foi previamente utilizado pelo nosso grupo 7,11 e outros 16,17 e foi correlacionado com os outros indices funcionais de consequências de acidente vascular cerebral que estão descritos acima.

Administração de Anticorpos Não Etiquetados, PMNs Etiquetados de Forma Radioactiva e Anticorpos Etiquetados de Forma Radioactiva. Para experiências em que se administraram anticorpos não etiquetados utilizou-se um de 151 dois tipos diferentes de anticorpos: uma IgG monoclonal de rato anti-P-selectina murina bloqueadora (Clone RB 40.34, Pharmingen Co., San Diego, CA) 14,18,19 ou igQ de rato não imunológica (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Prepararam-se anticorpos na forma de 30 μρ em 0,2 ml de solução salina tamponada com fosfato que continha albumina de soro bovino 0,1%, que depois foi administrado na veia peniana 10 minutos antes da oclusão da artéria cerebral média. Em experiências separadas, anticorpos etiquetados de forma radioactiva (0,15 ml, ~2,6 x 105 cpm/μΐ) foram injectados intravenosamente 10 minutos antes da oclusão da artéria cerebral média. Num terceiro conjunto de experiências, PMNs etiquetados de forma radioactiva foram administrados intravenosamente 10 minutos antes da oclusão da artéria cerebral média na forma de uma injecção de 100 μΐ (os PMNs etiquetados de forma radioactiva foram misturados com soro fisiológico para um volume total de 0,15 ml; *3 x 106 cpm/μΐ) . Para experiências em que se administraram anticorpos não etiquetados, a altura em que as medições foram feitas está indicada no texto, utilizando os métodos descritos acima para determinar o fluxo de sangue cerebral, volumes de enfarte e mortalidade. Para as experiências em que se administraram anticorpos etiquetados de forma radioactiva ou PMNs etiquetados de forma radioactiva, os ratinhos foram sacrificados nos instantes indicados e os cérebros foram imediatamente removidos e divididos nos hemisférios ipsilateral (pós-isquémico) e contralateral. A deposição de anticorpos ou neutrófilos etiquetados de forma radioactiva foi medida e expressa em cpm ipsilateral/contralateral. 152

Imuno-histoquímica. Os cérebros foram removidos à 1 hora após oclusão da artéria cerebral média, foram fixados em formalina 10%, embutidos em parafina e seccionados para análise imuno-histoquímica. As secções foram coradas com um anticorpo policlonal de coelho anti-P-selectina humana purificado por afinidade (diluição 1:25, Pharmingen, San Diego, CA) e os sítios de ligação do anticorpo primário foram visualizados utilizando uma IgG de cabra anti-coelho conjugada com biotina (1:20), detectada com ExtrAvidin peroxidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Análise dos Dados. O fluxo de sangue cerebral, volume de enfarte e deposição de niIn-PMNs foram comparados utilizando o teste t de Student para variáveis desemparelhadas. Efectuou-se ANOVA de duas vias para testar diferenças significativas entre deposição de anticorpos de referência e final (30 minutos) entre os dois grupos (experimental versus simulado) . Utilizou-se o teste t de Student para variáveis desemparelhadas para avaliar diferenças dentro dos grupos (referência versus o instante de 30 minutos). Testaram-se diferenças de sobrevivência entre grupos utilizando análise de contingência com a estatística de Qui-quadrado. Os valores estão expressos como média ± EPM, em que um valor p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

Expressão de P-selectina em Acidente Vascular Cerebral Murino. Uma vez que a P-selectina medeia a fase inicial de adesão de leucócitos a células endoteliais activadas 20, examinámos a expressão inicial cerebral de P-selectina num modelo murino de acidente vascular cerebral com reperfusão. Os ratinhos que receberam uma IgG monoclonal de rato anti- 153 P-selectina murina etiquetada com 125I antes da cirurgia exibiram um aumento de 216% da acumulação de anticorpo aos 30 minutos de reperfusão em comparação com animais operados de forma simulada (p < 0,001, Figura 31A). Para demonstrar que este grau de deposição de anticorpos no hemisfério submetido a reperfusão se deveu a expressão de P-selectina e não a acumulação inespecifica, compararam-se com animais identicamente tratados que receberam uma IgG não imunologica de rato etiquetada com I. Estas expenencias demonstraram ter ocorrido acumulação significativamente mais elevada da IgG anti-P-selectina do que da IgG não imunológica (p < 0,025, Figura 31A), sugerindo que a P-selectina é expressa no cérebro num período de 30 minutos de reperfusão. O exame de secções de tecido do cérebro coradas imunologicamente quanto a P-selectina revela que a expressão de P-selectina está principalmente localizada nas células endoteliais microvasculares no córtex cerebral ipsilateral (Figura 31B).

Acumulação de Neutrófilos em Acidente Vascular Cerebral Murino. Para delinear o período de tempo durante o qual ocorre influxo de PMNs após acidente vascular cerebral mediu-se a acumulação de PMNs etiquetados com mIn em ratinhos de tipo selvagem (PS +/+) antes da MCAO, imediatamente após e 10 minutos depois da MCAO, e aos 30 minutos, 300 minutos e 22 horas de reperfusão. Em ratinhos PS +/+, a acumulação de PMNs começa logo após a iniciação de isquemia focal e continua durante o período de reperfusão (Figura 31C) . Para determinar o papel da P-selectina nesta acumulação de neutrófilos pós-isquémica realizaram-se experiências empregando ratinhos homozigóticos nulos para o gene da P-selectina (PS -/-) . Os ratinhos PS -/- exibiram acumulação de PMNs 154 significativamente reduzida após oclusão da artéria cerebral média e reperfusão (Figura 31B).

Papel da P-selectina na Ausência de Refluxo Cerebrovascular. Para determinar se a redução da acumulação de PMNs em ratinhos PS -/- resultava em fluxo de sangue cerebral melhorado após o restabelecimento do fluxo, obtiveram-se medições em série do CBF relativo por Doppler de laser em ratinhos PS +/+ e PS Antes da iniciação da isquemia (Figura 32, ponto a) , os fluxos relativos de sangue cerebral foram quase idênticos entre grupos. A oclusão da artéria cerebral média (Figura 32, ponto b) esteve associada a uma queda quase idêntica do fluxo de sangue cerebral em ambos os grupos. Imediatamente antes da remoção da sutura de oclusão intraluminal aos 45 minutos de isquemia (Figura 32, ponto c), os fluxos de sangue cerebral tinham aumentado ligeiramente, apesar de permanecerem significativamente decrescidos em comparação com os fluxos de referência. Imediatamente após da remoção da sutura de oclusão para iniciar a reperfusão (Figura 32, ponto d), os fluxos de sangue cerebral em ambos os grupos aumentaram num grau comparável (¾ 60% da referência nos ratinhos PS -/- e PS +/+). A falha imediata dos fluxos de sangue cerebral pós-reperfusão em atingir níveis pré-oclusão é característica de ausência de refluxo cerebrovascular 21, em que o decréscimo subsequente dos fluxos de sangue cerebral pós-reperfusão representa hipoperfusão cerebral pós-isquemica retardada . Aos 30 minutos de reperfusão (Figura 32, ponto e), os fluxos de sangue cerebral entre os dois grupos de animais divergiram, em que os animais PS -/-exibiram fluxos relativos de sangue cerebral significativamente mais elevados do que os controlos PS +/+ (p < 0,05) (Figura 32, ponto f). Esta divergência reflectiu 155 diferenças significativas na hipoperfusão cerebral pós-isquémica retardada e persistiu durante o período de observação de 22 horas.

Consequências de Acidente Vascular Cerebral. Testou-se a importância funcional da expressão de P-selectina comparando índices de consequências de acidente vascular cerebral em ratinhos PS -/- com os de controlos PS +/+. Os ratinhos PS -/- estavam significativamente protegidos dos efeitos de isquemia cerebral focal e reperfusão, com base numa redução de 77% do volume de enfarte (p < 0,01) em comparação com controlos P-selectina +/+ (Figura 33A). Esta redução do volume de enfarte foi acompanhada de sobrevivência acrescida nos animais PS -/-(p < 0,05; Figura 33B) .

Efeito do Bloqueio de P-selectina. Depois de ter observado o papel funcional da expressão de P-selectina em acidente vascular cerebral empregando ratinhos mutantes por deleção, conduziram-se experiências para determinar se o bloqueio farmacológico de P-selectina poderia melhorar as consequências de acidente vascular cerebral em ratinhos PS +/+. Utilizando uma estratégia que consistiu em administrar um anticorpo monoclonal de rato anti-P-selectina de ratinho funcionalmente bloqueador (clone RB 40.34, 14'18'19) ou IgG de rato de controlo não imunológica imediatamente antes da cirurgia, observou-se que os ratinhos que receberam o anticorpo bloqueador imediatamente antes da oclusão da artéria cerebral média exibiram fluxos de sangue cerebral pós-reperfusão melhorados aos trinta minutos, bem como volumes reduzidos de enfarte cerebral e uma tendência para mortalidade reduzida em comparação com controlos (Figura 34, 6 barras mais à esquerda). Para aumentar a relevância 156 clínica potencial de uma estratégia de bloqueio de P-selectina como novo tratamento de acidente vascular cerebral realizaram-se experiências adicionais nas quais o anticorpo de controlo ou bloqueador foi administrado após oclusão intraluminal da artéria cerebral média (porque muitos pacientes apresentam após o início de acidente vascular cerebral) . Nestes estudos observou-se uma redução significativa dos volumes de enfarte, bem como uma tendência para fluxo melhorado de sangue cerebral (Figura 34, 6 barras mais à direita).

DISCUSSÃO

Apesar dos progressos substanciais feitos em anos recentes na prevenção primária de acidente vascular cerebral 4, as opções terapêuticas para tratar acidente vascular cerebral em progressão continuam extremamente limitadas. Não obstante ter-se pensado que a publicação de dois ensaios de referência no Outono passado, demonstrando morbidez reduzida após tratamento de acidente vascular cerebral isquémico com rt-PA 2'3, faria surgir uma nova era de terapia trombolítica no tratamento de acidente vascular cerebral 4, o entusiasmo diminuiu um pouco quando se notou transformação hemorrágica e mortalidade acrescida em pacientes com acidente vascular cerebral isquémico tratados com estreptoquinase 5. Estes ensaios divergentes tornaram mais crítico do que nunca o desenvolvimento de novas terapias seguras para tratar acidente vascular cerebral em progressão. Se bem que o restabelecimento do fluxo de sangue em cérebro pós-isquémico confira novas oportunidades para intervenção terapêutica precoce, a reperfusão é uma espada de dois gumes. Dado o potencial citotóxico dos neutrófilos 23, não é surpreendente que o influxo de neutrófilos para tecido cerebral pós-isquémico possa 157 conduzir a danos suplementares e consequências piores após acidente vascular cerebral experimental 7,24-27 . utilizando um modelo murino de isquemia cerebral focal e reperfusão, identificámos recentemente um papel contributivo importante da molécula de adesão celular ICAM-1 na acumulação de neutrófilos às 22 horas após acidente vascular cerebral 7. No entanto, a expressão aumentada de ICAM-1 endotelial cerebrovascular requer acontecimentos de transcrição e tradução de novo, o que requer tempo. Em contraste, a P-selectina, uma glicoproteina que abrange membranas e que medeia as fases iniciais da adesão de neutrófilos, pode ser mobilizada a partir de reuniões de armazenamento pré-formadas para ser rapidamente expressa na superfície de células endoteliais isquémicas 8,28. Uma vez que os ensaios clínicos de terapia trombolítica para acidente vascular cerebral revelam uma janela temporal estreita para benefícios potenciais (nas primeiras várias horas do início do acidente vascular cerebral) 2'3'5, isto sugere que estratégias concebidas para interferir nas fases iniciais da adesão de PMNs poderão ser teoricamente benéficas em acidente vascular cerebral humano. Estes ensaios deverão conduzir a um maior número de pacientes para intervenção terapêutica precoce, aumentando a necessidade de abordar a questão de lesão de reperfusão em territórios medicamente revascularizados. Adicionalmente, sublinham a necessidade premente de compreender as contribuições de moléculas de adesão individuais para a patogénese de acidente vascular cerebral.

Dada a quantidade considerável de literatura que descreve o papel da P-selectina noutros modelos de isquemia e reperfusão ' , sabe-se surpreendentemente pouco acerca do papel da P-selectina em acidente vascular cerebral. 0 158 conhecimento do papel específico da P-selectina na rede vascular cerebral é importante porque os requisitos de moléculas de adesão podem variar entre leitos vasculares e condições em estudo. Por exemplo, num modelo de transplantação intestinal 33 1 anticorpos anti- P-selectina não reduziram a lesão de reperfusão, ao passo que anticorpos anti -CD11/CD18 conseguiram reduzi-la . Apesar do bloqueio da P- selectina ter sido ineficaz na redução da adesão de PMNs e fugas de albumina num modelo de isquemia mesentérica e reperfusão no rato, o bloqueio de ICAM-1 foi eficaz 34. Num modelo de isquemia/reperfusão da pata traseira de rato, os requisitos da selectina quanto à adesão de PMNs diferiram entre os leitos vasculares pulmonar e do músculo crural 31.

Tanto quanto sabemos, o único estudo publicado que descreve expressão aumentada de P-selectina no cérebro isquémico é uma descrição histopatológica de acidente vascular cerebral em primatas, em que a expressão de P-selectina aumentou na rede microvascular lenticuloestriada 10. Realizaram-se os presentes estudos para investigar se a expressão de P-selectina contribui para a acumulação de neutrófilos, ausência de refluxo e lesão em tecidos cerebrais pós-isquémicos num modelo murino de acidente vascular cerebral com reperfusão. Utilizando um modelo recentemente estabelecido de isquemia cerebral focal e reperfusão em ratinhos n, a expressão de P-selectina foi demonstrada por imunocoloração endotelial acrescida e deposição aumentada de anticorpo etiquetado de forma radioactiva no território isquémico. Na última técnica, a deposição de anticorpos no hemisfério isquémico foi normalizada para a do hemisfério não isquémico em cada animal, não só para minimizar variações potenciais do volume de injecção ou volume de 159 distribuição, mas para permitir comparar animais que receberam anticorpos diferentes. Uma vez que a destruição da função da barreira endotelial no córtex isquémico pode aumentar a deposição de anticorpos sem selectividade, realizaram-se experiências semelhantes com uma IgG de rato de controlo. Estes dados mostram que o anticorpo que se liga à P-selectina é depositado a uma taxa acelerada em comparação com o anticorpo de controlo, sugerindo que a expressão local de P-selectina está aumentada no tecido sujeito a reperfusão. Estes dados do modelo murino são paralelos aos relatados num modelo de babuíno de acidente vascular cerebral 10, no qual a expressão de P-selectina aumentou no período de 1 hora após o acontecimento isquémico.

Demonstrou-se o papel da expressão da P-selectina no recrutamento de PMNs para a zona pós-isquémica utilizando uma estratégia na qual se mediu a acumulação de PMNs etiquetados com 111In. Não obstante termos previamente relatado que, às 22 horas, a acumulação de PMNs está aumentada no hemisfério isquémico 7, os presentes dados temporais demonstram que a acumulação de PMNs começa pouco tempo depois do início da isquemia. A falha em expressar o gene da P-selectina foi associada a acumulação reduzida de PMNs, sugerindo a participação da P-selectina no recrutamento cerebral pós-isquémico de PMNs. No entanto, os animais nulos para P-selectina exibiram uma acumulação de neutrófilos modesta (se bem que inferior aos controlos) às 22 horas. Este dado indica que a P-selectina não é o mecanismo efector exclusivo responsável por recrutamento cerebral pós-isquémico de PMNs e é consistente com os nossos dados anteriores segundo os quais a ICAM-1 também participa na adesão pós-isquémica de PMNs 7. Além disso, 160 este dado não diverge daquele em que instilação intra-abdominal de tioglicolato em ratinhos deficientes em P-selectina causou recrutamento retardado (mas não ausente) de PMNs 9.

Devido à necessidade critica de identificar motivos para reperfusão falhada, os presentes estudos examinaram o papel da P-selectina em hipoperfusão cerebral pós-isquémica retardada ' , o fenomeno em que o fluxo de sangue diminui durante a reperfusão apesar do restabelecimento de pressões de perfusão adequadas. Em modelos cardíacos de isquemia, a ausência de refluxo piora à medida que o tempo decorre após a reperfusão 35, sugerindo um papel importante de mecanismos efectores recrutados, como trombose microcirculatória progressiva, disfunção vasomotora e recrutamento de PMNs. Foi mostrado noutros modelos que reacções de aderência dependentes de P-selectina e de ICAM-1 36 e obstrução capilar por PMNs 37 participam na ausência de refluxo pós-isquémico. No cérebro, os PMNs foram implicados em ausência de refluxo cerebral pós-isquémico q o q q ' , mas o papel da P-selectina não tinha sido previamente elucidado. O presente estudo utiliza uma técnica relativamente não invasiva (Doppler de laser) para obter medições em série do fluxo relativo de sangue cerebral com a finalidade de determinar a existência, decurso temporal e dependência de P-selectina da ausência de refluxo cerebrovascular pós-isquémico. Para demonstrar que o próprio procedimento de costura não causava danos vasculares e enfarte cerebral subsequente, realizaram-se experiências de isquemia simulada (n=10) nas quais uma sutura de nylon era cosida na artéria carótida interna durante um período sem oclusão de 161 45 minutos. Nestas experiências, verificou-se que a costura não causava oclusão, com base na ausência de decréscimo da perfusão por Doppler de laser durante o período de 45 minutos. Quando os cérebros foram recolhidos e corados com TTC às 24 horas, nenhum exibiu evidências de enfarte cerebral. Em consequência, podemos concluir que o procedimento de costura per se não provoca danos suficientes para afectar as nossas principais variáveis de consequências de acidente vascular cerebral. Quando se examinou o fluxo relativo de sangue cerebral após oclusão franca da artéria cerebral média em animais experimentais, observámos que os animais nulos para P-selectina e de controlo tinham sido sujeitos a graus virtualmente idênticos de isquemia (ocorreu uma queda inicial ~ 4,5 vezes do fluxo relativo de sangue cerebral após oclusão da artéria cerebral média em ambos). No entanto, observou-se um ligeiro aumento do fluxo relativo de sangue cerebral nos primeiros 10 minutos após a oclusão, apesar da sutura de oclusão ter permanecido no lugar. Esta é uma observação empírica que fizemos consistentemente, para a qual é provável existirem várias explicações possíveis. É provável que haja algum grau de fluxo colateral que abra o território isquémico. Outra explicação defensável é o facto de poder existir um elemento de espasmos vasculares iniciais na região da ponta do cateter de oclusão, que desaparece modestamente em vários minutos. Apesar destas duas explicações serem possíveis, devido à pequena dimensão da rede vascular murina não podemos identificar com certeza o mecanismo no nosso modelo. Ainda assim, uma vez que observamos o mesmo grau de recrutamento de fluxo em animais de controlo e experimentais, estes dados não alteram as nossas conclusões principais de que a P-selectina é um 162 mediador importante de lesão de tecidos cerebrais em acidente vascular cerebral com reperfusão.

Após a remoção da sutura de oclusão intraluminal, a recuperação instantânea do fluxo de sangue foi igual nos animais P-selectina +/+ e 0 facto dos níveis do fluxo nunca terem regressado aos valores de referência (nem de ter havido uma ultrapassagem, como se poderia observar com hiperemia reactiva) pode dever-se à gravidade e duração do período isquémico, que provavelmente recrutará outros mecanismos de ausência de refluxo cerebrovascular pós-isquémico, como trombose ou recrutamento de neutrófilos, causados por mecanismos não dependentes de selectina. Mesmo quando se examinam instantes posteriores (como 30 minutos até 22 horas após remoção da sutura de oclusão), é interessante notar que há um ligeiro decréscimo do fluxo de sangue cerebral nos animais P-selectina -/-. Este último decréscimo (se bem que limitado) do fluxo de sangue cerebral às 22 horas é consistente com o recrutamento

modesto de PMNs observado nos animais PS -/- durante o mesmo período, sugerindo novamente o recrutamento de outros mecanismos efectores limitadores do fluxo (como ICAM-1) nos animais PS

Os efeitos funcionais da expressão de P-selectina são claros a partir do presente conjunto de estudos: animais que não conseguem expressar o gene da P-selectina (ou animais PS +/+ tratados com um anticorpo anti-P-selectina funcionalmente bloqueador) exibem enfartes menores e sobrevivência melhorada em comparação com os controlos. Quando estes dados são considerados juntamente com dados previamente publicados que demonstram um efeito prejudicial da expressão de ICAM-1 em acidente vascular cerebral 7, 163 torna-se cada vez mais clara a existência de múltiplos meios de recrutamento de PMNs para o córtex cerebral pós-isquémico e que o bloqueio de cada um representa uma estratégia potencial para melhorar as consequências de acidente vascular cerebral em humanos. Dado o presente reconhecimento da importância de reperfusão calendarizada na travagem da onda em progressão de morte neuronal após acidente vascular cerebral, interferir na adesão de PMNs nestas fases iniciais parece ser uma opção atractiva para reduzir a morbidez e a mortalidade. De facto, estratégias anti-moléculas de adesão poderão não só ser benéficas por si próprias (isto é, incluindo pacientes não elegíveis para trombólise), mas poderão estender a janela de oportunidade de intervenção trombolítica 40. 0 presente conjunto de estudos contribui para a compreensão dos mecanismos patofisiológicos que operam em acidente vascular cerebral com reperfusão. Estes estudos sugerem a necessidade de ensaios clínicos de terapias para acidente vascular cerebral em progressão que optimizem o meio de reperfusão para reduzir a acumulação de PMNs.

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Exemplo 11: Utilização de Monóxido de Carbono para Tratar uma Perturbação Isquémica - Exemplo dos Efeitos Protectores do Monóxido de Carbono em Isquemia do Pulmão

Na candidatura de patente inicial revelámos dados indicadores de que a produção endógena de monóxido de carbono ou administração de monóxido de carbono exógeno é benéfica para proteger o cérebro contra lesão isquémica subsequente. Como outro exemplo da utilização de monóxido de carbono no tratamento de uma perturbação isquémica, administrámos monóxido de carbono a ratos para testar os seus efeitos na melhoria da conservação do pulmão para transplantação (este processo é semelhante a uma 168 perturbação isquémica porque os pulmões dadores são removidos de um receptor; durante o período em que os pulmões estão conservados e são transferidos de dador para receptor há uma interrupção do fluxo de sangue). Métodos para Testar o Efeito do Monóxido de Carbono na Conservação do Pulmão

Materiais utilizados para preparar a solução de conservação

Para todas as experiências, a solução de conservação de base consistiu em solução de Euro-Collins (EC) modificada (Na+ 10 mEq/1, K+ 115 mEq/1, Cl“ 15 mEq/1, HP042“ 85 mEq/1, ΕΡΡΟΓ 15 mEq/1, HCCU" 10 mEq/1) .

Remoção, conservação e transplantação do pulmão

Utilizaram-se ratos Lewis machos consanguíneos (250-300 gramas) para todas as experiências de acordo com um protocolo aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade de Columbia, de acordo com as directrizes apresentadas pela American Academy for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).

Realizaram-se experiências de transplante de pulmões da forma seguinte. Os ratos dadores receberam 500 unidades de heparina intravenosamente e a artéria pulmonar (PA) foi lavada com um volume de 30 ml de solução de conservação a 4°C a uma pressão constante de 20 mm Hg. Quando os pulmões são conservados deste modo, a maior parte da solução de lavagem infundida sai por um orifício atrial esquerdo criado no pulmão dador, bem como pelas veias pulmonares após o corte transversal.

Em seguida, removeu-se o pulmão esquerdo, colocou-se um punho em cada tronco vascular, inseriu-se um cilindro no 169 brônquio e submergiu-se o pulmão durante 6 horas em solução de conservação a 4°C, que era idêntica à solução de lavagem da PA. Ratos com género/estirpe/estatura correspondentes foram anestesiados, entubados e ventilados com 100% de O2 utilizando um ventilador de roedores (Harvard Apparatus, South Natick, MA) . A transplantação ortotópica do pulmão esquerdo foi realizada com uma toracotomia esquerda utilizando uma técnica rápida de punho para todas as anastomoses, com tempos isquémicos quentes inferiores a 5 minutos. O grampo cruzado hilar foi libertado, tendo-se restabelecido o fluxo de sangue e ventilação para o pulmão transplantado. Em seguida, passou-se um laço metálico em redor da PA direita e introduziram-se cateteres Millar (2F; Millar Instruments, Houston, TX) na PA principal e auriculo esquerdo (LA). Em redor da PA principal colocou-se uma sonda de fluxo por Doppler (Transonics, Ithaca, NI).

Medição da função do enxerto do pulmão

Monitorizou-se a hemodiâmica em directo utilizando MacLab e um computador Macintosh liei. Os parâmetros hemodinâmicos medidos incluíram as pressões do LA e PA (mm Hg) e fluxo na PA (ml/minuto). Mediu-se a tensão arterial de oxigénio (PO2, mm Hg) durante a inspiração de 100% de O2 utilizando um analisador de gases modelo ABL-2 (Radiometer, Copenhaga, Dinamarca). Calcularam-se as PVRs na forma de (pressão média na PA - pressão no LA)/fluxo médio na PA, tendo sido expressas em mm Hg/ml/minuto. Após as medições de referência, a PA direita nativa foi ligada e fizeram-se medições em série de cinco em cinco minutos até à altura da eutanásia aos 30 minutos (ou até à morte do receptor).

Administração de Monóxido de Carbono 170

Na altura indicada antes da cirurgia (4, 8 ou 12 horas), os ratos foram colocados numa campânula de vidro e administrou-se monóxido de carbono em várias concentrações (0,01%, 0,03% ou 0,1%), em que o restante da mistura gasosa consistiu em ar ambiente. (Fez-se passar o gás por um jarro de água antes da administração com a finalidade de humidificá-lo para conforto dos animais.) Nas alturas indicadas após a iniciação da exposição, os ratos foram anestesiados e removeram-se os pulmões como descrito acima. Estes pulmões dadores foram utilizados em experiências subsequentes de transplante de pulmão.

Resultados e Discussão

Os resultados destas experiências indicam que, em comparação com controlos não tratados, a inalação de monóxido de carbono antes da remoção do pulmão confere aos pulmões protecção significativa após a transplantação. Esta protecção é evidenciada por: (1) oxigenação arterial melhorada dos receptores de pulmões dadores pré-tratados com monóxido de carbono; (2) fluxo de sangue arterial pulmonar aumentado (e resistência vascular pulmonar reduzida) com a utilização de pulmões dadores pré-tratados com monóxido de carbono, e (3) sobrevivência melhorada de receptores de pulmões dadores pré-tratados com monóxido de carbono em comparação com controlos. Os efeitos benéficos do monóxido de carbono dependeram da dose, isto é, observou-se a melhor protecção à dose de 0,1%, com um nível intermédio de protecção observado à dose de 0,03% e com a menor protecção observada à dose de 0,01%. Os efeitos benéficos do monóxido de carbono também dependeram do tempo: exposições mais longas aparentaram conferir a maior protecção. Considerados conjuntamente, estes dados indicam que o monóxido de carbono consegue ser protector noutra 171 perturbação isquémica (isquemia do pulmão) e sugerem que os resultados poderão ser generalizados também a outras perturbações isquémicas.

Exemplo 12: Utilização de um Ensaio Espectrofotométrico de Hemoglobina para Quantificar Objectivamente Hemorragia Intracerebral em Ratinhos

Resumo

Contexto e Objectivo. Há grande interesse em desenvolver novas estratégias anticoagulantes ou trombolíticas para tratar acidente vascular cerebral isquémico. No entanto e presentemente, os meios para avaliar rigorosamente o potencial hemorrágico destes agentes são limitados. Conceberam-se os presentes estudos para desenvolver e validar um método de quantificação rigorosa do grau de hemorragia intracerebral em modelos murinos. Métodos. Num modelo murino, induziu-se hemorragia intracerebral (ICH) por infusão estereotáctica intraparenquimal de colagenase B isoladamente (6 x 10~6 unidades, n=5) ou de colagenase B seguida de activador do plasminogénio em tecidos intravenoso (rt-PA, 0,1 mg/kg, n=6). Os controlos consistiram em cirurgia simulada com infusão estereotáctica de solução salina (n=5) ou em animais não tratados (n=5). A ICH foi (1) classificada com uma escala baseada no diâmetro máximo da hemorragia em secções coronais e (2) quantificada com um ensaio espectrofotométrico que mede a cianometa-hemoglobina em extractos quimicamente reduzidos de cérebro murino homogeneizado. Validou-se este ensaio espectrofotométrico utilizando quantidades conhecidas de hemoglobina ou sangue autólogo adicionadas a um coorte separado de cérebros homogeneizados. Utilizando este ensaio quantificou-se o grau de hemorragia após oclusão da artéria 172 cerebral média focal/reperfusão em ratinhos tratados com uma dose elevada pós-oclusão IV de rt-PA (10 mg/kg, n=ll) e ratinhos de controlo submetidos a acidente vascular cerebral mas tratados com solução de soro fisiológico (n=9). Resultados. Quantidades conhecidas de hemoglobina ou sangue autólogo adicionadas a homogenatos frescos de tecido do cérebro completo exibiram uma relação linear entre a quantidade adicionada e a OD no pico da absorvância da cianometa-hemoglobina (r=l,00 e 0,98, respectivamente). Quando se realizaram estudos in vivo para quantificar ICH induzida experimentalmente, os animais que receberam infusão intracerebral de colagenase B exibiram ODs significativamente mais elevadas do que controlos infundidos com solução salina (aumento de 2,1 vezes, p = 0,05). Num modelo de acidente vascular cerebral com oclusão da artéria cerebral média e reperfusão, a administração de rt-PA após a reperfusão aumentou a OD em 1,8 vezes em comparação com animais que receberam solução de soro fisiológico (p < 0,001). Quando se compararam os dois métodos de medição de ICH (classificação visual e OD) obteve-se uma correlação linear (r=0,88). Experiências adicionais demonstraram que a coloração com trifeniltetrazólio, que é habitualmente utilizado para corar tecido do cérebro viável, não interfere na quantificação espectrofotométrica de ICH. Conclusões. Estes dados demonstram que o ensaio espectrofotométrico quantifica de forma rigorosa e fiável a ICH murina. Este novo método deve ajudar a avaliar objectivamente os riscos hemorrágicos de novas estratégias anticoagulantes ou tromboliticas para tratar acidente vascular cerebral e pode facilitar a quantificação de outras formas de hemorragia intracerebral. 173

Introdução 0 acidente vascular cerebral isquémico é responsável pela grande maioria de apresentações de acidente vascular cerebral agudo. Assim, tem havido um tremendo interesse na concepção de estratégias que consigam restabelecer de forma rápida e eficaz o fluxo de sangue para a região isquémica do cérebro. Não obstante a heparina poder ser eficaz em acidente vascular cerebral incipiente (TIAs) 3, a sua utilização durante as fases agudas de acidente vascular cerebral pode estar associada a um grau elevado de morbidez e hemorragia intracerebral 1-4. De modo semelhante, no inicio da década de 1960, as consequências sombrias dos ensaios de estreptoquinase para acidente vascular cerebral agudo conduziram à relutância dos médicos em interferir no acidente vascular cerebral agudo através de trombólise durante as três décadas subsequentes 5'6. Esta relutância foi validada por ensaios recentes nos quais a utilização de estreptoquinase foi associada a risco acrescido de mortalidade e hemorragia intracerebral 7. Por outro lado, a utilização de activador do plasminogénio do tipo em tecidos recombinante (rt-PA) para tratar acidente vascular cerebral em progressão foi mais prometedora 8, em que um subconjunto de pacientes com acidente vascular cerebral agudo tratados com rt-PA exibiu morbidez de longo prazo reduzida se tratados nas primeiras 3 horas do inicio dos sintomas 9-11. Ainda assim, outros ensaios utilizando o mesmo agente (rt-PA) não exibiram benefícios ou tiveram taxas excessivamente grandes de ICH 9'12-15.

Este pântano confuso de dados clínicos sublinha a necessidade urgente de identificar estratégias melhoradas para obter reperfusão rápida. Para este fim é imperativo identificar um modelo experimental no qual os benefícios 174 potenciais de reperfusão calendarizada em acidente vascular cerebral possam ser pesados objectivamente contra os riscos de hemorragia intracerebral aumentada. Na maior parte dos estudos animais de terapia trombolítica de acidente vascular cerebral clinico, os riscos de hemorragia intracerebral foram estimados, em vez de terem sido medidos quantitativamente 16-24. Conceberam-se os presentes estudos para desenvolver e validar um método de quantificação rigorosa do grau de hemorragia intracerebral em modelos murinos, com a finalidade de avaliar riscos potenciais de novos tratamentos anticoagulantes ou tromboliticos para acidente vascular cerebral agudo.

Materiais e Métodos

Animais Experimentais

No presente estudo, adquiriram-se ratinhos C57BL/6J machos à Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME), tendo sido utilizados com idades entre as 8 e 10 semanas (22-32 g) . Todos os procedimentos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado institucionalmente e estão de acordo com as directrizes fornecidas pela American Academy of Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).

Ensaio espectrofotométrico de hemorragia intracerebral

Quantificou-se o teor de hemoglobina de cérebros sujeitos aos procedimentos experimentais abaixo utilizando um ensaio espectrofotométrico como se descreve a seguir. Obteve-se tecido de cérebro completo de animais de controlo ou experimentais submetidos a eutanásia de fresco e cada cérebro foi tratado individualmente do modo seguinte. Adicionou-se água destilada (250 μΐ) a cada cérebro, seguida de homogeneização durante 30 segundos (Brinkman 175

Instruments, Inc., Westbury, NI), sonicação em gelo com um ultra-sonicador de impulsos durante 1 minuto (SmithKline Corporation, Collegeville, PA) e centrifugação a 13 000 rpm durante 30 minutos (Baxter Scientific Products, Deerfield, IL) . Depois da recolha do sobrenadante que contém hemoglobina, adicionaram-se 80 μΐ de reagente de Drabkin (adquirido à Sigma Diagnostics, St. Louis, MO; K3Fe(CN)6 200 mg/1, KCN 50 mg/1, NaHC03 1 g/1, pH 8, 6 25) a uma aliquota de 20 μΐ, que se deixou repousar durante 15 minutos. Esta reacção converte hemoglobina em cianometa-hemoglobina, que tem um máximo de absorvância a 540 nm, e cuja concentração pode então ser avaliada pela densidade óptica da solução a um comprimento de onda * 550 nm 26. Para validar que a absorvância medida seguindo estes procedimentos reflecte a quantidade de hemoglobina, analisaram-se quantidades conhecidas de hemoglobina de eritrócitos bovinos (Sigma, St. Louis, MO) utilizando procedimentos semelhantes juntamente com cada ensaio de tecido do cérebro. Como medida adicional, obteve-se sangue de ratinhos de controlo por punção cardíaca após a anestesia. Em seguida, alíquotas incrementadas deste sangue foram adicionadas a tecido do cérebro homogeneizado de fresco obtido de ratinhos não tratados, para gerar uma curva-padrão de absorvância.

Hemorragia intracerebral induzida por colagenase

Os procedimentos gerais para induzir hemorragia intracerebral no ratinho foram adaptados de um método que foi previamente descrito em ratos 27. Após anestesia com uma injecção intraperitoneal de 0,35 ml de cetamina (10 mg/ml) e xilazina (0,5 mg/ml), os ratinhos foram posicionados em pronação numa estrutura estereotáctica para a cabeça. O calvarium foi exposto por uma incisão na linha 176

média do escalpe desde o ponto Nasion até à linha superior da nuca, e depois a pele foi retraída lateralmente. Utilizando uma broca de velocidade variável (Dremel, Racine, Wl) fez-se um pequeno buraco no crânio de 1,0 mm 2,0 mm posterior ao bregma e 2,0 mm para a direita da linha média. Inseriu-se uma agulha simples de angiocateter de calibre 22, utilizando orientação estereotáctica, no córtex profundo direito/gânglios basais (coordenadas: 2,0 mm posterior, 2,0 mm lateral). A agulha foi presa, por uma tubagem de plástico, a uma seringa de micro-infusão e as soluções foram infundidas no cérebro, a uma taxa de 0,25 μΐ por minuto durante 4 minutos, com uma bomba de infusão (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) . Os animais receberam um dos seguintes: (1) 0,024 μρ de colagenase B (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha) em 1 μΐ de solução salina normal (Colagenase); (2) 1 μΐ de solução salina normal isoladamente (Simulado); (3) nenhum tratamento (Controlo), ou (4) infusão dirigida de forma estereotáctica de colagenase B como acima mas seguida imediatamente de activador do plasminogénio em tecidos humano recombinante intravenoso (Genentech Inc., San Francisco do Sul, CA, 1 mg/kg em 0,2 ml de solução salina normal) administrado por injecção na veia peniana dorsal (Colagenase + rt-PA). Nos grupos de Colagenase, Simulado e Colagenase + rt-PA, a agulha estereotáctica foi removida imediatamente após a infusão e a incisão foi fechada com grampos cirúrgicos. Recolheu-se tecido do cérebro imediatamente após decapitação rápida com anestesia.

Conversão hemorrágica num modelo de isquemia cerebral focal murina 177

Produziu-se isquemia cerebral focal em animais por oclusão transitória da artéria cerebral média direita utilizando um método previamente descrito em pormenor 28'29. Em resumo, fez-se passar uma sutura de nylon de calibre 5-0 ou 6-0 de 12 ou 13 mm com a ponta tratada a quente na artéria carótida interna direita até ao nivel da artéria cerebral média. Passados 45 minutos removeu-se a sutura de oclusão para restabelecer a perfusão. Imediatamente após a remoção da sutura de oclusão, os animais receberam activador do plasminogénio em tecidos intravenoso (10 mg/kg em 0,2 ml de solução salina normal, Acidente Vascular Cerebral + rt-PA) ou solução salina normal (Acidente Vascular Cerebral + Solução Salina) administrado por injecção na veia peniana dorsal. Às 24 horas recolheu-se tecido do cérebro imediatamente após decapitação rápida com anestesia. Para avaliar o efeito do cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) , que é habitualmente utilizado para distinguir tecido cerebral com enfarte de tecido cerebral sem enfarte 28'30, cérebros não manipulados (controlo) foram divididos a meio, imersos em TTC 2% (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) em solução salina tamponada com fosfato 0,9%, incubados durante 30 minutos a 37°C e depois preparados como descrito acima para o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina. A outra metade de cada cérebro foi imersa em solução salina durante um período de tempo idêntico e depois foi sujeita aos procedimentos descritos acima para o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina.

Validação do ensaio quantitativo de hemorragia int racerebral O grau de ICH foi primeiramente classificado visualmente por um observador cego. Para a classificação visual de hemorragia intracerebral em ratinhos, cérebros obtidos de 178 ratinhos que tinham sobrevivido até às 24 horas após o procedimento (hemorragia induzida por colagenase ou oclusão da MCA) foram colocados numa matriz de cérebro de ratinho (Activational Systems Inc., Warren, MI) para obter secções coronais em série de 1 mm. As secções foram inspeccionadas por um observador cego e atribuiu-se aos cérebros uma classificação de ICH de uma escala baseada no diâmetro máximo de hemorragia observado em qualquer uma das secções [pontuação de ICH: 0, sem hemorragia; 1, <1 mm; 2, 1-2 mm; 3, > 2-3 mm; 4, >3 mm] . Em seguida, as tiras de cada cérebro foram reunidas, homogeneizadas e depois tratadas de acordo com os procedimentos descritos acima para o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina.

Estatística

Efectuaram-se correlações entre pontuações de ICH determinadas visualmente e determinações espectrofotométricas de ICH utilizando correlação linear de Pearson, com os coeficientes de correlação indicados. Para determinar se um dado tratamento (Colagenase, Simulado, Acidente Vascular Cerebral, etc.) teve um efeito significativo na ICH avaliada de forma espectrofotométrica ou visual, fizeram-se comparações utilizando um teste t de duas caudas não emparelhado. Para dados não paramétricos (pontuações visuais de ICH), efectuou-se análise não paramétrica utilizando o teste de Mann-Whitney. Os valores estão expressos como médias ± EPM, em que um valor p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Ensaio espectrofotométrico de hemoglobina

Realizaram-se estudos iniciais para determinar a fiabilidade e reprodutibilidade do ensaio 179 espectrofotométrico de hemoglobina. No primeiro conjunto de experiências, quantidades conhecidas de hemoglobina foram convertidas em cianometa-hemoglobina de acordo com procedimentos previamente publicados, tendo-se medido a OD [Figura 35A] 26. Num segundo conjunto de experiências, quantidades conhecidas de sangue autólogo foram adicionadas a volumes fixos de homogenato de tecido do cérebro fresco, com tratamento suplementar dos espécimes como descrito acima. Estes dados mostram que a densidade óptica de sobrenadantes que contêm cianometa-hemoglobina aos 550 nm está correlacionada linearmente com a quantidade de sangue adicionado [Figura 35B]. Estes dados mostram correlações lineares fortes (r=l,00 e 0,98 para as Figuras 35A e 35B, respectivamente), bem como reprodutibilidade excelente, como avaliado por erros-padrão da média relativamente pequenos. Para determinar que o TTC (habitualmente utilizado para distinguir entre tecido cerebral com enfarte e sem enfarte 28'30) não afecta o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina, cérebros não manipulados (de controlo) foram divididos a meio, em que metade foi sujeita ao procedimento comum de coloração com TTC e metade foi tratada com solução salina como controlo. Estes dados (comparar figura 35B, linhas continua e tracejada) indicam que o pré-tratamento de tecido do cérebro com TTC não afecta o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina.

Para determinar se este método consegue detectar ich, realizou-se o ensaio em hemorragia intracerebral murina causada por dois procedimentos diferentes, infusão intraparenquimal de colagenase ou oclusão da artéria cerebral média/reperfusão. No primeiro procedimento, aplicou-se colagenase B na forma de uma infusão local através de um pequeno buraco no crânio, de modo a 180 enfraquecer a parede vascular para promover ICH (grupo Colagenase). Para aumentar suplementarmente a propensão para ICH e o grau desta, realizou-se um procedimento semelhante com administração imediata de rt-PA após o procedimento (grupo Colagenase + rt-PA). Também se incluíram duas condições de controlo, uma operação simulada, que incluiu perfuração de um pequeno buraco no cérebro mas com instilação de soro fisiológico (Simulado) e um grupo não tratado (Controlo). Estas experiências demonstraram que a infusão de colagenase aumenta a quantidade de sangue intracerebral detectada pelo ensaio espectrofotométrico (especialmente com colagenase + rt-PA) em comparação com animais tratados de forma simulada ou controlos normais [Figura 36A] .

No segundo método, talvez mais clinicamente relevante, para induzir ICH, criou-se um acidente vascular cerebral por oclusão intraluminal transitória da artéria cerebral média seguida de reperfusão. Adicionalmente, tentámos aumentar a propensão para conversão hemorrágica por administração de um agente trombolitico. Estudaram-se dois grupos, um composto pelos animais que tinham recebido solução salina normal e um composto pelos animais que tinham recebido rt-PA imediatamente após a remoção da sutura de oclusão intraluminal. Estes dados indicam que a adição de um agente fibrinolitico após acidente vascular cerebral aumenta a quantidade de ICH detectada pelo ensaio espectrofotométrico de hemoglobina [Figura 36B]. É interessante notar que a absorvância de referência é mais baixa em animais sujeitos a acidente vascular cerebral do que em animais de controlo/não tratados [Figuras 36A e 36B]. Para investigar suplementarmente o modo como sangue intravascular residual poderia afectar o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina 181 realizaram-se experiências nas quais, imediatamente antes da decapitação do animal para a remoção do cérebro, se efectuou uma perfusão cefálica de soro fisiológico (administrado via o ventrículo cardíaco esquerdo). Em animais de controlo (n=5), que receberam perfusão cardíaca de solução salina antes da remoção do cérebro, a Densidade Óptica média após a preparação do tecido e ensaio espectrofotométrico de hemoglobina foi 0,25 ± 0,3 (este valor é inferior à Densidade óptica observada em animais submetidos a perfusão não cardíaca sujeitos a nenhuma cirurgia ou a uma cirurgia simulada (n=10, OD 3,4 ± 0,05, p = 0,05 versus controlos submetidos a perfusão cardíaca). Por outro lado, após acidente vascular cerebral, não houve diferenças na O.D. quer se tivesse ou não efectuado perfusão cardíaca com solução salina (0,15 ± 0,04 para acidente vascular cerebral sem perfusão cardíaca com solução salina, n=5; 0,15 ± 0,03 para acidente vascular cerebral com perfusão cardíaca com solução salina, p=NS) . Quando os animais com acidente vascular cerebral com perfusão com solução salina foram comparados com animais sem acidente vascular cerebral com perfusão com solução salina, observou-se uma redução aparente da OD após o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina. Estes dados sugerem que se detecta menos sangue intracerebral em animais com acidente vascular cerebral, talvez devido a uma redução da quantidade total de sangue na região ipsilateral da MCA após a isquemia.

Classificação visual de ICH

Para validar suplementarmente o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina, comparámo-lo com a avaliação morfométrica da dimensão da hemorragia, que tem sido tradicionalmente utilizada na literatura 31-35. Desenvolvemos um sistema de 182 classificação visual (0-4) no qual um observador cego classificou o grau de ICH em secções cerebrais em série com base no diâmetro máximo da hemorragia. Esta avaliação visual foi efectuada numa fotografia do cérebro tirada imediatamente antes da realização do ensaio espectrofotométrico de hemoglobina [Figura 37], de modo a correlacionar as duas técnicas nos mesmos espécimes. Quando comparados com controlos não submetidos a qualquer intervenção, os animais que receberam uma infusão local simulada (isto é, pequeno buraco no crânio + solução salina) exibiram apenas um ligeiro aumento da pontuação visual de ICH [Figura 38A]. No entanto, quando se adicionou à infusão colagenase isoladamente ou colagenase + rt-PA, as pontuações visuais de ICH aumentaram significativamente [Figura 38A]. No modelo de acidente vascular cerebral, o rt-PA aumentou de modo semelhante a pontuação visual de ICH [Figura 38B]. Quando se representaram graficamente os dados para revelar a relação entre a pontuação visual de ICH e a técnica espectrofotométrica de quantificação de ICH, foi sugerida uma relação linear (r=0,88), mas esta relação não se manteve com graus inferiores de hemorragia (pontuações visuais de ICH de 0 ou 1) [Figura 39].

Discussão

Recentemente tornou-se claro que uma intervenção inicial em acidente vascular cerebral com certos agentes trombolíticos intravenosos (rt-PA) pode ser benéfica se instituída num período de 3 horas do início dos sintomas 9,10. No entanto, a administração de agentes trombolíticos fora desta janela terapêutica estreita pode causar uma incidência inaceitavelmente elevada de ICH devastadora (estreptoquinase versus placebo, mortalidade aos 10 dias de 34,0% versus 18,2%, p = 0,002, mortalidade aos 6 meses de 183 73% versus 59%, p = 0,06) 7. Em consequência, continua a ser um imperativo clinico identificar agentes melhores de restabelecimento da perfusão associados a menores riscos de conversão hemorrágica. Para estudar adequadamente novos agentes que interfiram na coagulação ou mecanismos fibrinoliticos é necessário dispor de um meio objectivo para quantificar o risco a jusante de ICH. Na literatura experimental, a quantificação da ICH tem sido efectuada por procedimentos de imagiologia radiológica 32-37 ou por uma estimativa visual da extensão da hemorragia em tecido do cérebro post-mortem 31-35. Estes procedimentos têm utilidade limitada, dependendo das condições em estudo. Por exemplo, para além das restrições logísticas impostas pela necessidade de equipamento sofisticado, a maior parte das técnicas de imagiologia radiológica têm utilização limitada em modelos murinos, o que pode impossibilitar a sua utilização na avaliação de ratinhos transgénicos, uma ferramenta potencialmente poderosa para estudar a coagulação ou sistemas fibrinolíticos. A estimativa visual de ICH tem natureza subjectiva e, tal como mostram os nossos dados, pode ser relativamente insensível para detectar pequenas extensões de ICH. Suplementarmente, nenhuma das técnicas radiológica ou visual permite quantificar de modo rigoroso a ICH quando a região hemorrágica é descontínua ou multifocal.

Conduziram-se os presentes estudos para desenvolver e validar um método objectivo de quantificação de ICH em animais experimentais. A utilização de um ensaio espectrofotométrico para a quantificação de hemoglobina com base na conversão de hemoglobina em cianometa-hemoglobina foi previamente relatada 26,31. No entanto, tanto quanto sabemos, só foi utilizada no cérebro em ratos para medir a 184 dimensão de um grande coágulo de sangue após a sua remoção de tecido do cérebro adjacente 31. 0 ensaio espectrofotométrico que descrevemos e validamos pode ser utilizado em animais tão pequenos quanto ratinhos, o que facilita a utilização de muitas das estirpes de ratinhos transgénicos presentemente disponíveis (particularmente aquelas com alterações nas cascatas trombótica ou fibrinolítica). Suplementarmente, este ensaio espectrofotométrico permite quantificar ICH mesmo quando há hemorragias descontínuas ou multifocais, que de outro modo seriam difíceis de identificar ou isolar. Por fim, em contraste com o estudo de Lee, validámos o nosso estudo quanto à reprodutibilidade e fiabilidade utilizando quantidades conhecidas de hemoglobina e sangue autólogo misturadas com tecido do cérebro 31. Uma vez que o procedimento cirúrgico utilizado nas experiências de acidente vascular cerebral não alterou significativamente as concentrações de hemoglobina no sangue (dados não mostrados), o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina pode ser utilizado para extrapolar o volume de hemorragia intracerebral quando a concentração de hemoglobina é conhecida na altura da hemorragia.

Com a finalidade de desenvolver e validar o ensaio espectrofotométrico de hemoglobina para situações que possam ser relevantes para ICH clínica, criámos hemorragias intracerebrais por dois métodos diferentes: (1) injecção intracerebral de colagenase (para enfraquecer a parede vascular, como poderia ocorrer com aneurisma ou com traumatismo) e (2) num modelo de acidente vascular cerebral. Em ambos os casos, um coorte de animais também recebeu rt-PA, para validar o modelo na extremidade elevada do espectro de ICH. Uma vez que não havia nenhuma medição 185 de referência estabelecida para ICH em ratinhos, comparámos as nossas medições espectrofotométricas com a extensão de ICH avaliada independentemente por pontuação visual. Por fim, com a finalidade de tornar o ensaio ainda mais útil para modelos experimentais de acidente vascular cerebral nos quais os cérebros são corados com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) para quantificar o volume de enfarte cerebral, os cérebros de animais sujeitos a oclusão da MCA/reperfusão foram corados com TTC antes da reunião e homogeneização, para determinar que o próprio procedimento de coloração com TTC não interfere na capacidade de quantificar ICH pelo ensaio espectrofotométrico de hemoglobina. Estes dados (Figura 1B) indicam não haver interferência cruzada detectável entre os dois procedimentos quando utilizados sequencialmente (coloração com TTC em primeiro lugar, seguida de homogeneização e do ensaio espectrofotométrico de hemoglobina).

Para além da sua capacidade para detectar ICH, os presentes estudos indicam que esta técnica também poderá dar uma indicação da quantidade de sangue intravascular residual após a remoção do cérebro. O procedimento de perfusão cefálica com solução salina não altera a densidade óptica da cianometa-hemoglobina em cérebros sujeitos a acidente vascular cerebral, sugerindo que a quantidade de sangue intravascular é relativamente fixa e não é removida pelo procedimento. No entanto, em animais de controlo que não foram tratados, o tratamento de perfusão com solução salina aparenta diminuir a densidade óptica da cianometa-hemoglobina em cerca de 30%. As nossas experiências não fornecem o motivo desta diferença, mas podemos especular que, após acidente vascular cerebral, há um elemento de vasoconstrição/vaso-oclusão no território do enfarte, o que 186 torna a técnica de perfusão com solução salina menos eficaz no que se refere a eliminar sangue intravascular residual. Além disso, se houver verdadeiramente um elemento de vasoconstrição após acidente vascular cerebral ou hemorragia intracerebral induzida experimentalmente, isto poderá reduzir a reunião de sangue intravascular e, assim, ser responsável por uma diminuição global da densidade óptica quando se comparam cérebros de controlo e sujeitos a acidente vascular cerebral/ICH (mesmo que esteja presente no último grupo algum sangue extravascular).

Também vale a pena mencionar vários aspectos técnicos da técnica espectrofotométrica para medir hemorragia intracerebral. Para as presentes experiências, apesar de haver um pico de absorvância largo para cianometa-hemoglobina centrado em redor de 540 nm, medimos a absorvância da cianometa-hemoglobina a 550 nm. O motivo para fazê-lo é o facto de muitos espectrofotómetros terem capacidades fixas de comprimentos de onda dependendo dos filtros pré-instalados, e 550 nm é um comprimento de onda habitualmente utilizado (especialmente em leitores de placas de ELISA) . Apesar de ser possível que a medição da absorvância a 540 nm tivesse originado medições de densidade óptica ligeiramente mais elevadas, o pico de absorvância da cianometa-hemoglobina é largo nesta área e, assim, pode utilizar-se 550 nm sem ser necessário corrigir a absorvância de ferri- ou ferrocianeto (os coeficientes de extinção de cianometa-hemoglobina a 551 nm e 540 nm são 11,5 e 11,1, respectivamente, em comparação com o coeficiente de extinção 41 vezes mais baixo do ferri- ou ferrocianeto ) . Estudos que empregaram um espectrofotómetro de comprimentos de onda contínuos (que foi utilizado para medir a OD a 540 nm) e um leitor de 187 placas de ELISA de espectro discreto (utilizado para medir OD a 550 nm) originaram resultados semelhantes. Uma vez que a última técnica é mais simples, aumenta o rendimento do procedimento e permite-nos minimizar o volume das amostras, escolhemos utilizar a última técnica para os estudos apresentados na secção Resultados. Há algumas considerações técnicas potenciais diferentes que devem ser tomadas em linha de conta quando se utiliza o ensaio espectrofotométrico. Apesar de termos mostrado que o procedimento espectrofotométrico pode ser utilizado em conjunção com coloração com TTC de secções cerebrais em série para a análise do volume de enfarte, o tecido deve ser subsequentemente homogeneizado e extraído, o que destrói a arquitectura do tecido e impossibilita outras caracterizações histológicas. É possível que esta técnica possa super-estimar o grau de ICH se sangue extracerebral for incluído de forma não intencional durante a remoção do cérebro, ou que a técnica possa subestimar o grau de ICH se sangue residual epidural, subdural ou subaracnóide permanecer aderido ao calvarium, que é descartado durante o processo de remoção do cérebro.

Devido à natureza da técnica de medição, na qual luz com um determinado comprimento de onda é absorvida ao longo de um percurso de comprimento fixo, qualquer agente causador de turvação no sobrenadante do cérebro homogeneizado pode aumentar a leitura de OD. Este agente pode incluir lípidos, proteínas anormais do plasma e estroma de eritrócitos. De facto, em experiências preliminares, verificámos que as ODs eram falsamente aumentadas quando a centrifugação era insuficiente e alguma da camada lipídica era incluída no ensaio. Piridinas livres podem alterar o espectro de 188 absorvância da cianometa-hemoglobina, havendo o potencial de também outros hemocromogénios reagirem com o reagente de Drabkin 39. No entanto, tanto quanto sabemos, estas reacções não devem interferir, numa extensão significativa, na determinação de sangue/hemorragia intracerebrais.

Em resumo, os presentes dados ilustram como um simples e barato ensaio espectrofotométrico para hemoglobina pode proporcionar um método útil de quantificação de ICH. Esta técnica será especialmente útil para avaliar o potencial hemorrágico de terapias tromboliticas ou anticoagulantes desenvolvidas de novo para o tratamento de acidente vascular cerebral.

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Trombose Microvascular e Lesão Cerebral em Acidente Vascular Cerebral Murino Sem Aumentar Hemorragia

Intracerebral

Resumo O dilema clínico do tratamento de acidente vascular cerebral consiste no facto dos agentes que restabelecem a abertura vascular aumentarem o risco de hemorragia intracerebral. O Factor IXa bloqueado no sítio activo (IXai), formado a partir de factor IXa purificado por dansilação do seu sítio activo, compete com o Factor IXa nativo para inibir a reunião de Factor IXa no complexo de activação intrínseco de Factor X. Quando pré-tratados com Factor IXai, ratinhos sujeitos a isquemia cerebral focal e reperfusão exibiram fibrina microvascular e deposição de plaquetas reduzidas, perfusão cerebral acrescida e enfartes cerebrais significativamente menores do que controlos 193 tratados com veículo. A protecção cerebral mediada pelo Factor IXai dependeu da dose, não esteve associada a hemorragia intracerebral em doses terapeuticamente eficazes e foi observada mesmo quando o Factor IXai foi administrado após o início de isquemia cerebral. A administração de Factor IXai é uma estratégia nova para tratar acidente vascular cerebral em progressão sem aumentar o risco de hemorragia intracerebral.

Introdução 0 restabelecimento calendarizado de fluxo de sangue para o cérebro isquémico representa o paradigma actual de tratamento de acidente vascular cerebral agudo 1-3. A administração de um agente trombolítico, mesmo quando feita em condições óptimas, pode não atingir este resultado clínico desejado. É frequente a perfusão não conseguir regressar a níveis pré-isquémicos (hipoperfusão pós-isquémica), sugerindo que a lesão isquémica não é produzida apenas pela oclusão original, havendo também um elemento de falha microcirculatória. Adicionalmente, a trombólise de acidente vascular cerebral agudo está associada a um risco acrescido de hemorragia intracerebral (ICH) 1_4, indicando que continua a ser claramente necessário identificar novos agentes que consigam promover a reperfusão sem aumentar o risco de ICH.

Após um acontecimento isquémico, a parede vascular está modificada do seu estado quiescente, anti-adesivo e antitrombótico num estado que promove a adesão de leucócitos e trombose. No acidente vascular cerebral agudo, o recrutamento activo de leucócitos por receptores de adesão expressos na rede microvascular ipsilateral, como ICAM-1 5 e P-selectina 6, potência a hipoperfusão pós- 194 isquémica. No entanto, experiências com ratinhos mutantes por deleção para cada um destes genes demonstram que, mesmo na sua ausência, o fluxo de sangue cerebral (CBF) pós-isquémico regressa apenas parcialmente aos niveis de referência, sugerindo a existência de mecanismos adicionais responsáveis pela ausência de refluxo cerebrovascular pós-isquémico. Com a finalidade de explorar esta possibilidade concebeu-se o primeiro conjunto de experiências para testar a hipótese de ocorrer trombose local ao nivel da rede microvascular (distai ao sitio da oclusão primária) em acidente vascular cerebral.

Para avaliar as consequências prejudiciais de trombose microvascular em acidente vascular cerebral, com o segundo conjunto de experiências testou-se a hipótese do bloqueio selectivo da via intrínseca da coagulação poder limitar a trombose microvascular, desse modo protegendo o cérebro em acidente vascular cerebral. Escolheu-se a estratégia de inibição selectiva da via intrínseca da coagulação por ser maioritariamente responsável por trombose intravascular. A heparina, hirudina e agentes fibrinolíticos interferem na via comum final da coagulação, inibindo a formação ou acelerando a lise de fibrina, e, em consequência, aumentam a propensão para ICH. Pusemos a hipótese do bloqueio selectivo da reunião do complexo de activação de IXa/VIIIa/X poder proporcionar um novo mecanismo para limitar trombose intravascular enquanto preserva mecanismos de hemostasia extravascular pela via de coagulação extrínseca/factor de tecidos, que pode ser crítica em tecido do cérebro com enfarte ou em regiões adjacentes em que pequenos vasos são frágeis e estão sujeitos a ruptura. Utilizámos uma estratégia nova na qual um inibidor competitivo do Factor IXa (IXa bloqueado no sítio activo, 195 ou IXai) foi administrado a ratinhos sujeitos a acidente vascular cerebral, para testar a hipótese de poder melhorar as consequências de acidente vascular cerebral sem aumentar a ICH. Métodos

Modelo murino de acidente vascular cerebral. Induziu-se isquemia cerebral focal transitória em ratinhos por oclusão intraluminal da artéria cerebral média (45 minutos) e reperfusão (22 horas), como previamente relatado 7. Registaram-se medições em série do fluxo de sangue cerebral (CBF) relativo via fluxometria por Doppler de laser 7 e determinaram-se os volumes de enfarte (% do hemisfério ipsilateral) por análise de planimetria/volumetria de secções cerebrais em série coradas com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) 7.

Estudos de míndio-plaquetas. Determinou-se a acumulação de plaquetas utilizando plaquetas etiquetadas com 11:1índio, recolhidas e preparadas como previamente descrito 8. Imediatamente antes da cirurgia, os ratinhos receberam intravenosamente 5 x 106 plaquetas etiquetadas com li:LIn; quantificou-se a deposição após 24 horas por cpm ipsilateral/cpm contralateral.

Imunocoloração de fibrina. Mediu-se a acumulação de fibrina após o sacrificio (de animais completamente heparinizados) utilizando procedimentos de imunocoloração que foram recentemente descritos e validados 9. Uma vez que a fibrina é extremamente insolúvel, prepararam-se extractos de tecido do cérebro por digestão com plasmina, depois foram aplicados num gel comum de SDS-poliacrilamida para a realização de electroforese, seguida de imunocoloração 196 utilizando um anticorpo policlonal de coelho anti-humano preparado para dimeros da cadeia gama-gama presentes em fibrina com ligações cruzadas, que consegue detectar fibrina murina com relativamente pouca reactividade cruzada com fibrinogénio 10. Foi relatada acumulação de fibrina como uma razão entre ipsilateral e contralateral. Em experiências adicionais, os cérebros foram embutidos em parafina, foram seccionados e submetidos a imunocoloração utilizando o mesmo anticorpo anti-fibrina.

Ensaio espectrofotométrico de hemoglobina e classificação visual de ICH. Quantificou-se a ICH com um ensaio baseado em espectrofotometria que desenvolvemos e validámos 11,12. Em resumo, cérebros de ratinho foram homogeneizados, sonicados e centrifugados e a meta-hemoglobina presente nos sobrenadantes foi convertida (utilizando reagente de Drabkin) em cianometa-hemoglobina, cuja concentração foi avaliada medindo a O.D. a 550 nm contra uma curva padrão gerada com quantidades conhecidas de hemoglobina. A classificação visual de ICH foi efectuada em secções coronais em série de 1 mm por um observador cego com base no diâmetro máximo de hemorragia observado em qualquer uma das secções [pontuação de ICH: 0, sem hemorragia; 1, < 1 mm; 2, 1-2 mm; 3, > 2-3 mm; 4, > 3 mm] .

Preparação de Factor IXai 13: Preparou-se Factor IXai modificando selectivamente o residuo histidina do sitio activo do Factor IXa utilizando dansil-glu-gly-arg-clorometilcetona. Aplicou-se Proplex numa coluna preparativa que continha anticorpo monoclonal imobilizado dependente de cálcio para o Factor IX. A coluna foi lavada, eluiu com tampão que continha EDTA e depois activou-se o Factor IX presente no eluato (confirmado como uma única 197 banda em SDS-PAGE) aplicando Factor Xla (com incubação na presença de CaCl2) . 0 Factor IXa purificado reagiu com um excesso molar de 100 vezes de dansil-glu-gly-arg-clorometilcetona e a mistura foi submetida a diálise. O produto final (IXai), sem actividade pró-coagulante, migra em SDS-PAGE de forma idêntica a IXa. Em seguida utilizou-se este material (Factor IXai) em experiências após filtração (0,2 μπι) e cromatografia em colunas de DeToxi-gel, para remover qualquer contaminação vestigial de endotoxinas (em aliquotas de amostras não havia lipopolissacáridos detectáveis). O Factor IXai foi subsequentemente congelado em aliquotas a -80°C até à altura da utilização. Para experiências em que se utilizou IXai, foi administrado na forma de um único bolus intravenoso nas alturas indicadas e nas doses indicadas.

Resultados

Para criar acidente vascular cerebral num modelo murino introduz-se uma sutura na rede vascular cerebral de modo a proceder à oclusão do orifício da artéria cerebral média direita, tornando isquémico o território abrangido. Ao retirar a sutura após um período de oclusão de 45 minutos cria-se um modelo de acidente vascular cerebral com reperfusão; os ratinhos tratados desta forma exibem deficiências neurológicas focais bem como áreas bem delimitadas de enfarte cerebral. Uma vez que a sutura de oclusão não avança para além do principal afluente vascular (a artéria cerebral média), este modelo proporciona uma oportunidade excelente para investigar acontecimentos "a jusante" que ocorram na rede microvascular cerebral em resposta ao período de fluxo de sangue interrompido. Utilizando este modelo investigou-se do modo seguinte o papel de trombose microvascular. Para demonstrar que 198 ocorrem foci trombóticos ricos em plaquetas no hemisfério cerebral isquémico, administraram-se a ratinhos plaquetas etiquetadas com mIn imediatamente antes da introdução da sutura de oclusão intraluminal, para seguir a sua deposição durante o período subsequente de isquemia cerebral e reperfusão. Em animais não sujeitos ao procedimento cirúrgico para criar acidente vascular cerebral, a presença de plaquetas foi aproximadamente igual entre os hemisférios direito e esquerdo, como seria de esperar [Figura 40A, barra da esquerda]. No entanto, quando os animais foram sujeitos a acidente vascular cerebral (e receberam apenas veículo para controlar experiências subsequentes), as plaquetas etiquetadas de forma radioactiva acumularam-se preferencialmente no hemisfério isquémico (ipsilateral) em comparação com deposição significativamente inferior no hemisfério contralateral (não isquémico) [Figura 40A, barra do meio]. Estes dados corroboram a ocorrência de trombos ricos em plaquetas no território isquémico. Quando se administrou Factor IXai a animais antes da introdução da sutura de oclusão intraluminal, observou-se uma redução significativa da acumulação de plaquetas etiquetadas de forma radioactiva no hemisfério ipsilateral [Figura 40A, barra da direita].

Outro conjunto de evidências também corrobora a ocorrência de trombose microvascular em acidente vascular cerebral. Estes dados provêm da imunodetecção de fibrina utilizando um anticorpo dirigido contra um neoepítopo do dímero da cadeia gama-gama de fibrina com ligações cruzadas. As imunocolorações exibem uma banda de intensidade aumentada no hemisfério ipsilateral (direito) de animais tratados com veículo sujeitos a isquemia cerebral focal e reperfusão [Figura 40B, "Veículo"]. Em animais tratados com Factor 199 IXai (300 μς/kg) antes do acidente vascular cerebral não há nenhum aumento aparente da acumulação ipsilateral de fibrina [Figura 40B, "Factor IXai"]. Para demonstrar que a acumulação de fibrina se deveu à deposição de fibrina intravascular (em vez de se dever a alterações inespecificas da permeabilidade e exposição à matriz subendotelial), a imunocoloração de fibrina localizou claramente a fibrina aumentada nos lúmenes de microvasos intracerebrais ipsilaterais [Figura 40C].

Para investigar se o Factor IXai consegue limitar trombose intracerebral e restabelecer a reperfusão, administrou-se IXai a ratinhos imediatamente antes do acidente vascular cerebral (300 μρ/ΐζρ) . Estas experiências demonstram uma redução da acumulação de inIn-plaquetas no hemisfério ipsilateral [Figura 41A] bem como evidências decrescidas de fibrina intravascular por imunocoloração. Suplementarmente, há um aumento significativo do CBF às 24 horas, sugerindo o restabelecimento da abertura microvascular pelo Factor IXai [Figura 41A]. A relevância clinica desta observação é sublinhada pela capacidade do Factor IXai para reduzir volumes de enfarte cerebral [Figura 41B]. Estes efeitos benéficos do Factor IXai dependeram da dose, em que 600 μg/k:g é a dose óptima [Figura 41C] .

Uma vez que o desenvolvimento de ICH é uma grande preocupação em qualquer estratégia anticoagulante no cenário de acidente vascular cerebral, mediu-se o efeito de IXai em ICH utilizando o nosso método espectrofotométrico recentemente validado para quantificar ICH 11,12. Estes dados indicam que, às doses mais baixas (e as mais eficazes), não há nenhum aumento significativo de ICH 200 [Figura 42A]. À dose mais elevada testada (1200 μς/kg) observa-se um aumento de ICH, que foi corroborado por um método semi-quantitativo de pontuação visual que também relatámos recentemente [Figura 42B] 11,12.

Uma vez que as terapias concebidas para melhorar as consequências de acidente vascular cerebral agudo devem ser administradas após apresentação clinica e uma vez que se continua a formar fibrina após o acontecimento isquémico inicial em acidente vascular cerebral, testámos se IXai poderia ser eficaz quando administrado após iniciação da isquemia cerebral. O Factor IXai administrado após oclusão da artéria cerebral média (após remoção da sutura de oclusão) conferiu protecção cerebral significativa, avaliada pela sua capacidade para reduzir significativamente os volumes de enfarte cerebral em comparação com controlos tratados com veiculo [Figura 43].

Discussão

Os dados destes estudos demonstram evidência clara da formação de trombos intravasculares (plaquetas e fibrina) na rede microvascular cerebral pós-isquémica. A relevância patofisiológica de trombose microvascular em acidente vascular cerebral é sublinhada pela capacidade do Factor IXai para reduzir trombose microvascular (são reduzidas a acumulação de plaquetas e fibrina, com um aumento concomitante do CBF pós-isquémico) e para melhorar as consequências de acidente vascular cerebral. É provável que estas acções antitrombóticas potentes do Factor IXai sejam clinicamente significativas no cenário de acidente vascular cerebral uma vez que o Factor IXai não só reduz volumes de enfarte de uma forma dependente da dose mas também o faz quando administrado após o inicio de acidente vascular 201 cerebral. Adicionalmente, em doses clinicamente relevantes, o tratamento com Factor IXai não provoca um aumento de ICH, tornando a inibição selectiva da reunião de complexo de activação de Factor iXa/Vllla/X com factor IXai num alvo atractivo para terapia de acidente vascular cerebral em humanos. Há alguns motivos pelos quais estratégias anticoagulantes dirigidas poderão ser uma alternativa atractiva à presente utilização de agentes tromboliticos na gestão de acidente vascular cerebral agudo devido ao seu êxito verificado em ensaios clinicos. Teoricamente, um tratamento ideal de acidente vascular cerebral agudo preveniria a formação ou induziria a dissolução da malha de fibrina-plaquetas que provoca trombose microvascular na zona isquémica sem aumentar o risco de hemorragia intracerebral. Todavia, agentes tromboliticos que foram estudados em ensaios clinicos de acidente vascular cerebral agudo aumentaram consistentemente o risco de hemorragia intracerebral 1-4. A estreptoquinase, administrada nas primeiras várias horas (< 6) após o inicio de acidente vascular cerebral, esteve associada a uma taxa acrescida de transformação hemorrágica (até 67%); apesar de ter ocorrido mortalidade inicial aumentada, os pacientes sobreviventes sofreram menos incapacidades residuais. A administração do activador de plasminogénio do tipo em tecidos (tPA) num período de 7 horas (particularmente num período de 3 horas) após o início de acidente vascular cerebral resultou em mortalidade inicial acrescida e taxas aumentadas de conversão hemorrágica (entre 7-20%), apesar dos sobreviventes terem exibido menos incapacidade residual. Para desenvolver terapias anticoagulantes ou trombolíticas melhoradas examinaram-se vários modelos animais de acidente 202 vascular cerebral. Estes modelos consistem geralmente na administração de sangue coagulado na artéria carótida interna seguida de administração de um agente trombolítico. Em ratos, a administração de tPA num período de 2 horas após acidente vascular cerebral melhorou o fluxo de sangue cerebral e reduziu a extensão do enfarte num valor até 77% 14,15. Num modelo semelhante de acidente vascular cerebral embólico no coelho, o tPA foi eficaz no restabelecimento do fluxo de sangue e na redução da extensão do enfarte, com aparecimento ocasional de hemorragia intracerebral 16,17. No entanto, apesar de haver vantagens na dissolução imediata de coágulos, estes estudos (bem como os ensaios clínicos de agentes trombolíticos) indicam que um risco aumentado concomitante de hemorragia intracerebral com esta abordagem terapêutica.

Devido ao início habitualmente precipitado de acidente vascular cerebral isquémico, concebeu-se uma terapia dirigida maioritariamente para a lise dos principais detritos de fibrina/ateroembólicos que procedem à oclusão de um importante afluente vascular para o cérebro. Contudo, tal como demonstrado pelo presente trabalho, há um componente importante de trombose microvascular que ocorre a jusante do sítio da oclusão original, que provavelmente terá considerável importância patofisiológica para hipoperfusão pós-isquémica (ausência de refluxo) e lesão cerebral em acidente vascular cerebral em progressão. Estes dados estão excelentemente de acordo com o que foi previamente relatado, em que micro-trombos foram localizados topograficamente na região isquémica de enfartes cerebrais frescos 18. A utilização de um agente que iniba a reunião do complexo de activação de Factor IXa/VIIIa/X representa uma nova abordagem para limitar 203 trombose que ocorra no interior de lúmenes microvasculares sem enfraquecer a hemostasia extravascular, cuja manutenção poderá ser critica para prevenir ICH. Nos presentes estudos, o tratamento com Factor ixai reduz a acumulação microvascular de plaquetas e fibrina, melhora o fluxo de sangue cerebral pós-isquémico e reduz os volumes de enfarte cerebral no cenário de acidente vascular cerebral sem aumentar a ICH. A potência do Factor IXai como agente anticoagulante provém do papel integral do Factor IX activado na cascata de coagulação. Não só uma estratégia de bloqueio de Factor IXa aparenta ser eficaz no cenário de acidente vascular cerebral mas também aparenta ser eficaz na prevenção de oclusão progressiva da artéria coronária induzida após a aplicação inicial de corrente eléctrica na artéria coronária circunflexa esquerda em cães 13. Tal como nesses estudos, em que o Factor IXai não prolongou o tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) (224), no modelo murino, a administração de Factor IXai na dose terapeuticamente eficaz de 300 μg/kg não alterou significativamente, de modo semelhante, o tempo de pró-trombina ou o APTT [13,4 + 0,7 e 79,9 +8,9 versus 12,1 ± 0,7 e 70,6 ± 8,9 para PT e APTT de ratinhos tratados com IXai (n=7) e tratados com veiculo (n=4), respectivamente, P=NS] .

Os dados que demonstram que o Factor IXai administrado após o inicio de acidente vascular cerebral é eficaz conduzem a outra hipótese interessante, nomeadamente que a formação de trombos representa um equilíbrio dinâmico entre os processos de trombose em progressão e fibrinólise em progressão. Mesmo em cenários normais (não isquémicos), foi 204 mostrado que este equilíbrio dinâmico ocorre no homem 19. Os dados dos presentes estudos, que mostram que o Factor IXai é eficaz mesmo quando administrado após o início de acidente vascular cerebral, sugerem que esta estratégia restabelece o equilíbrio dinâmico, que é deslocado após isquemia cerebral no sentido de favorecer trombose, novamente para um fenótipo de parede vascular quiescente (antitrombótico).

Como consideração final, mesmo que a trombólise remova com êxito o principal trombo de oclusão e/ou que estratégias anticoagulantes sejam eficazes para limitar trombose microcirculatória progressiva, é habitual o fluxo de sangue não conseguir regressar a níveis pré-isquémicos. Este facto é exemplificado pelos dados do presente estudo, em que, apesar do CBF ser consideravelmente melhorado pelo Factor IXai (que limita a acumulação de fibrina/plaquetas), o CBF ainda não regressa a níveis pré-isquémicos. Estes dados corroboram a existência de múltiplos mecanismos efectores de hipoperfusão cerebral pós-isquémica, incluindo acumulação pós-isquémica de neutrófilos e consequente obstrução microvascular, em que a expressão de P-selectina e ICAM-1 por células endoteliais microvasculares cerebrais é particularmente relevante a este respeito 5,6. Quando considerado da perspectiva da expressão de receptores de adesão de leucócitos, mesmo quando estes receptores de adesão estão ausentes, os níveis de CBF estão melhorados após acidente vascular cerebral em comparação com controlos, mas não regressam a níveis pré-isquémicos. Considerados em conjunto, estes dados sugerem que trombose microvascular e adesão de leucócitos contribuem conjuntamente para hipoperfusão cerebral pós-isquémica. 205

Em resumo, a administração de um inibidor competitivo do factor IXa, factor IXa bloqueado no sitio activo, representa uma nova terapia para o tratamento de acidente vascular cerebral. Esta terapia não só reduz trombose microcirculatória, melhora o fluxo de sangue cerebral pós-isquémico e reduz lesão em tecido cerebral após acidente vascular cerebral, mas também pode fazê-lo mesmo que seja administrado após o inicio de isquemia cerebral e sem aumentar o risco de ICH. Esta combinação de propriedades benéficas e risco a jusante relativamente baixo de transformação hemorrágica torna-a numa abordagem extremamente atractiva para a realização de testes suplementares e ensaios clínicos potenciais em acidente vascular cerebral humano.

Referências 1. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. "Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke" New Engl. J. Med. 1995; 333: 1581-1587. 2. Hacke W, Kaste M, Fieschi C, Toni D, Lesaffre E, von Kummer R, Boysen G, Bluhmki E, Hoxter G, Mahagne MH, Hennerici M, para o ECASS Study Group : "Intravenous thrombolysis with recombinant tissue plasminogen activator for acute hemispheric stroke". J A MA 1995,-274 (13) :1017-1025 3. del Zoppo GJ: "Acute stroke - on the threshold of a therapy". N Engl J Med 1995;333(13) :1632-1633 4. Hommel M, Cornu C, Boutitie F, Boissel JP, The MultiCenter Acute Stroke Trial - Europe Study Group : "Thrombolytic therapy with streptokinase in acute ischemic stroke". N Engl J Med 1996;335:145-150 5. Connolly ESJr, Winfree CJ, Springer TA, Naka Y, Liao H, Yan SD, Stern DM, Solomon RA, Gutierrez-Ramos JC, Pinsky DJ: "Cerebral protection in homozygous null ICAM-1 mice after middle 206 cerebral artery occlusion". "Role of neutrophil adhesion in the pathogenesis of stroke". J Clin Invest 1996;97:209-216 6. Exacerbação de lesão cerebral em ratinhos que expressam o gene da P-selectina: identificação de bloqueio de P-selectina como novo alvo para o tratamento de acidente vascular cerebral. Exemplo 10 Aqui Apresentado Acima. 7. Connolly ESJr, Winfree CJ, Stern DM,Solomon RA, Pinsky DJ: "Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia". Neurosurg 1996,-38 (3) :523-532. 8. Naka Y, Chowdhury NC, Liao H, Roy DK, Oz MC, Micheler RE, Pinsky DJ: "Enhanced preservation of orthotopically transplanted rat lungs by nitroglycerin but not hydralazine" : "requirement for graft vascular homeostasis beyond harvest vasodilation". Ciro Res 1995;76:900-906 9. Lawson CA, Yan S-D, Yan S-F, Liao H, Chen G, Sobel J, Kisiel W, Stern DM, Pinsky DJ: "Monocytes and tissue factor promote thrombosis in a murine model of oxygen deprivation". Journal of Clinicai Investigation 1997;99:1729-1738 10. Lahiri B, Koehn JA, Canfield RE, Birken S, Lewis J: "Development of an immunoassay for the COOH-terminal region of the gamma chains if human fibrin". Thromb Res 1981;23:103-112 11. Utilização de um ensaio espectrofotométrico de hemoglobina para quantificar objectivamente hemorragia intracerebral em ratinhos. Exemplo 12 Aqui Apresentado Acima. 12. Choudhri TF, Hoh BL, Solomon RA, Connolly ES, Pinsky DJ: "Spectrophotometric hemoglobin assay" : "A new method to quantify experimental murine intracerebral hemorrhage and its potentiation by tissue plasminogen activator". Annual Meeting Joint Section on Cerebrovascular Surgery 1997 13. Benedict CR, Ryan J, Wolitzky B, Ramos R, Gerlach M, Tijburg P, Stern D: "Active site-blocked Factor IXa prevents intravascular thrombus formation in the coronary vasculature without inhibiting extravascular coagulation in a canine thrombosis model". J Clin Invest 1991;88:1760-1765 207 14. Papadopoulos SM, Chandler WF, Salamat MS, Topol EJ, Sackellares JC: "Recombinant human tissue-type plasminogen activator therapy in acute thromboembolic stroke". J Neurosurg 1987;67:394-398 15. Overgaard K, Sereghy T, Pedersen H, Boysen G: "Neuroprotection with NBQX and thrombolysis with rt-PA in rat embolic stroke". Neurol Res 1993,-15:344-349 16. Cárter LP, Guthkelch AN, Orozco J, Temeltas O: "Influence of tissue plasminogen activator and heparin on cerebral ischemia in a rabbit model". Stroke 1992;23:883-888 17. Phillips DA, Fisher M, Davis MA, Smith TW, Pang RHL: "Delayed treatment with a t-PA analogue and streptokinase in a rabbit embolic stroke model". Stroke 1990;21:602-605 18. Heye N, Paetzold C, Steinberg R, Cervos-Navarro J: "The topography of microthrombi in ischemic brain infarct". Acta Neurológica Scandinavica 1992;86:450-454 19. Nossel HL: "Relative proteolysis of the fibrinogen B beta chain by thrombin and plasmin as a determinant of thrombosis". Nature 1981;291:165-167

Lisboa, 6 de Junho de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um gás que compreende monóxido de carbono numa quantidade suficiente para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento ou prevenção de uma perturbação isquémica num sujeito durante um período de tempo suficiente.

2. Utilização da Reivindicação 1, em que a quantidade de monóxido de carbono compreende desde 0,0001% de monóxido de carbono até 2% de monóxido de carbono num gás inerte.

3. Utilização da Reivindicação 2, em que o referido gás inerte compreende ar, oxigénio, árgon ou azoto.

4. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que a composição farmacêutica está adaptada para inalação.

5. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que a composição farmacêutica está adaptada para exposição extra-corporal a sangue ou fluidos corporais.

6. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 1 até 5, em que a perturbação isquémica compreende uma perturbação vascular periférica, uma trombose venosa, um êmbolo pulmonar, um enfarte do miocárdio, um ataque isquémico transitório, isquemia do pulmão, angina instável, deficiência neurológica isquémica reversível, actividade trombolítica adjunta, condição de coagulação excessiva, anemia de células falciformes ou uma perturbação de acidente vascular cerebral. 2

7. Utilização de qualquer uma das Reivindicações 1 até 6, em que o sujeito é submetido a uma cirurgia seleccionada do grupo que consiste em cirurgia cardíaca, cirurgia pulmonar, cirurgia da espinal-medula, cirurgia cerebral, cirurgia vascular, cirurgia abdominal ou cirurgia de transplantação de órgãos.

8. Utilização da Reivindicação 7, em que a cirurgia de transplantação de órgãos compreende cirurgia de transplantação de coração, pulmão, pâncreas ou fígado.

9. Utilização da Reivindicação 7 ou 8, em que o referido período de tempo compreende desde cerca de 1 dia antes da cirurgia até cerca de 1 dia após a cirurgia.

10. Utilização das Reivindicações 7 até 8 , em que 0 referido período de tempo compreende desde cerca de 12 horas antes da cirurgia até cerca de 12 horas após a cirurgia.

11. Utilização das Reivindicações 7 até 8 , em que 0 referido período de tempo compreende desde cerca de 12 horas antes da cirurgia até cerca de 1 hora após a cirurgia.

12. Utilização das Reivindicações 7 até 8 , em que 0 referido período de tempo compreende desde cerca de 1 hora antes da cirurgia até cerca de 1 hora após a cirurgia. Lisboa, 6 de Junho de 2007