JP2006500008A - 抗血小板自己抗体およびそのインヒビターに関連する組成物、方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
本発明には、哺乳類における抗血小板自己抗体を同定する方法が包含される。該方法は、哺乳類から得られるBリンパ球より抗体ファージディスプレイライブラリーを作製すること、血小板成分と特異的に結合するファージを検出するために該ライブラリーをスクリーニングすることを含んでなり(ここで、該スクリーニングは、競合的細胞表面パニングを用いて無傷(intact)血小板上で該ファージをパニングすることを含んでなる)、それにより該哺乳類における抗血小板自己抗体を同定する。
本発明には、抗血小板自己抗体と結合するペプチドを同定する方法が包含される。該方法は、ペプチドディスプレイファージを抗血小板自己抗体と接触させることおよび該ファージが該自己抗体と特異的に結合するかどうかを検出することを含んでなり、それにより抗血小板抗体と特異的に結合するペプチドを同定する。
[発明の詳細な記述]
定義
本明細書において用いる場合、以下の用語の各々は、本節におけるそれと関連する意味を有する。
フルネーム 3文字コード 1文字コード
アスパラギン酸 Asp D
グルタミン酸 Glu E
リシン Lys K
アルギニン Arg R
ヒスチジン His H
チロシン Tyr Y
システイン Cys C
アスパラギン Asn N
グルタミン Gln Q
セリン Ser S
トレオニン Thr T
グリシン Gly G
アラニン Ala A
バリン Val V
ロイシン Leu L
イソロイシン Ile I
メチオニン Met M
プロリン Pro P
フェニルアラニン Phe F
トリプトファン Trp W
「血小板活性化」は,該用語を本明細書において用いる場合、特に血栓形成における血小板機能と関連する生物学的特性を意味する。血小板活性化と関連する生物学的特性には、ある種の膜成分における他の物質(例えば、フィブリノーゲン、フォン・ビルブラント因子、コラーゲンなど)とそれらの相互作用をもたらす構造変化、貯蔵顆粒からの様々な細胞内物質の放出(例えば、とりわけ、セロトニン、フィブリノーゲン、ADP、様々な酵素)、血小板表面上の追加の受容体の発現(例えば、P−セレクチン、アネキシンなど)、ならびに一連の細胞内シグナル伝達経路における酵素および他の成分の開始が包含されるがこれらに限定されるものではない。
記述
本発明は、抗血小板抗体を同定する組成物および方法、ならびにそのような抗体のインヒビターを同定する組成物および方法に関する。さらに、本発明は、血液凝固および様々な血小板機能を阻害する組成物および方法に、そして様々な血小板に関連する自己免疫疾患を処置する方法に関する。
I.単離された核酸
A.抗血小板自己抗体をコードする核酸
本発明には、核酸のヌクレオチド配列が配列番号:1(H4)、配列番号:2(H10)、配列番号:3(H29)、配列番号:4(H36)、配列番号:5(H37)、配列番号:6(H38)、配列番号:7(H39)、配列番号:8(H40)、配列番号:9(H41)、配列番号:10(H42)、配列番号:11(H44)、配列番号:12(H45)、配列番号:13(H46)、配列番号:14(H47)、配列番号:15(H48)および配列番号:16(H83)の少なくとも1つを含んでなる、哺乳類抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントをコードする単離された核酸が包含される。
B.ペプチドインヒビターをコードする核酸
本発明には、核酸がP4−12(配列番号:107);P3−4(配列番号:108);P4−7(配列番号:109);P4−2a(配列番号:110);P73−11(配列番号:115);P123−10(配列番号:117);P74−4(配列番号:119);P73−10(配列番号:121);P74−3(配列番号:123);P74−9(配列番号:125);P74−5(配列番号:127);P73−9(配列番号:129);P124−8(配列番号:131);P123−11(配列番号:133);P124−1(配列番号:135);P73−2(配列番号:137);P73−6(配列番号:139);P124−11(配列番号:141);P124−2(配列番号:143);P73−7(配列番号:145);P74−1a(配列番号:147);P123−8(配列番号:149);P74−8(配列番号:151)よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントのペプチドインヒビターをコードする単離された核酸が包含される。
II.単離されたポリペプチド
本発明にはまた、哺乳類抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントを含んでなる単離されたポリペプチドが包含される。好ましくは、単離されたポリペプチドは重鎖を含んでなり、ここで、該重鎖のアミノ酸は重鎖よりなる群から選択され、そしてここで、該重鎖のアミノ酸は配列番号:54(H4)、配列番号:55(H10)、配列番号:56(H29)、配列番号:57(H36)、配列番号:58(H37)、配列番号:59(H38)、配列番号:60(H39)、配列番号:61(H40)、配列番号:62(H41)、配列番号:63(H42)、配列番号:64(H44)、配列番号:65(H45)、配列番号:66(H46)、配列番号:67(H47)、配列番号:68(H48)および配列番号:69(H83)の少なくとも一つの配列である。
グリシン、アラニン;
バリン、イソロイシン、ロイシン;
アスパラギン酸、グルタミン酸;
アスパラギン、グルタミン;
セリン、トレオニン;
リシン、アルギニン;
フェニルアラニン、チロシン。
III.ベクター
他の関連する態様として、本発明には、プロモーター/調節配列を含んでなる核酸に、該核酸が好ましくは核酸によりコードされるタンパク質の発現を導くことができるように操作可能に連結された、抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントをコードする単離された核酸が包含される。従って、本発明には、例えば、Sambrook et al.(1989,上記)およびAusubel et al.(1997,上記)に記述されているもののような発現ベクターおよび細胞における外来DNAの同時発現を有する細胞への外来DNAの導入の方法が包含される。しかしながら、本発明には、pComb3Hファージミドベクターを含んでなるベクターは包含されない。
IV.アンチセンス分子およびリボザイム
さらに、本発明には、アンチセンス核酸を含んでなる組み換え細胞が包含され、この細胞は、細胞プロセスにおける抗血小板自己抗体の役割(1つもしくは複数)を解明するための有用なモデルである。従って、抗血小板自己抗体をコードする核酸に相補的であるがアンチセンスの向きであるアンチセンス核酸を含んでなるトランスジェニック細胞は、自己抗体の作用機序(1つもしくは複数)および細胞におけるその役割(1つもしくは複数)の研究のそして血小板との自己抗体結合の影響(1つもしくは複数)を改善する治療法の同定の有用な手段である。
V.組み換え細胞およびトランスジェニック非ヒト哺乳類
本発明には、とりわけ、抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントをコードする単離された核酸、それに相補的なアンチセンス核酸、抗血小板自己抗体のペプチドインヒビターをコードする核酸などを含んでなる組み換え細胞が包含される。一つの態様として、組み換え細胞は、抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントをコードする核酸、それに相補的なアンチセンス核酸、抗血小板自己抗体のペプチドインヒビターをコードする核酸の一部をコードするベクター(例えば、プラスミドなど)で一過性トランスフェクションすることができる。核酸は細胞ゲノムに組み込まれる必要はなく、また細胞において発現される必要もない。さらに、細胞は原核もしくは真核細胞であることができ、そして本発明は任意の特定の細胞系もしくは細胞タイプに限定されると解釈されるべきではない。そのような細胞には、繊維芽細胞、マウス幹細胞、両生類卵母細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞などが包含されるが、これらに限定されるものではない。
VI.組成物
本発明には、哺乳類抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントをコードする単離された核酸を含んでなる組成物が包含される。好ましくは、該組成物は製薬学的に許容しうる担体を含んでなる。
VII.方法
A.有用な化合物を同定する方法
本発明にはさらに、哺乳類において抗血小板自己抗体を同定する方法が包含され、ここで、該哺乳類はそのような自己抗体により媒介される疾患に苦しむ。該方法は、当該技術分野において周知である方法を用いて哺乳類の末梢血もしくは脾臓組織のサンプル内に含まれるB細胞からファージディスプレイライブラリーを作製することを含んでなる。すなわち、B細胞は抗原産生細胞であるので、そのような細胞から作られるファージディスプレイライブラリーは、多数の抗体を発現しそして提示するファージを含有することが当該技術分野において十分に理解されている(例えば、Chang et al.(1998,Blood 91:3066−3078;Roark et al.,2002,Blood 100:1388−1398を参照)。好ましくは、タンパク質を提示するファージは、本質的に以前に(Siegel et al.,1997,J.Immunol.Methods 206:73−85)および本明細書に引用することにより組み込まれる米国特許第6,255,455号に記述されているように競合的細胞表面パニングおよび磁気活性化細胞分類を用いて無傷血小板上でパニングすることができる。
本発明には、血小板もしくはその成分と抗血小板自己抗体との結合に基づく多数の方法が包含される。これらの方法は、血小板と自己抗体との結合が、ITPおよびPTPが包含されるがこれらに限定されるものではない疾患、障害もしくは症状を媒介することを包含する、そのような血小板およびそれらの機能(1つもしくは複数)への多数の影響を媒介する点において重要である。処置する方法などは哺乳類に行うことができるが、本発明の方法は、好ましくはヒトに行われると理解されるべきである。
本発明には、前述のようにペプチドインヒビターをそれらの特異性(1つもしくは複数)を特性化するのに役立つ中和アッセイにおいて用いることのようなしかしそれに限定されるものではないある種の疾患、障害もしくは症状を診断する方法が包含される。さらに、GPIIb/IIIa、GPIb/IXおよびGPIa/IIaのような血小板膜成分に対するヒト抗血小板自己抗体は、患者の血清もしくは血小板溶出液における血小板自己抗体を検出するための市販のELISAアッセイキットの陽性コントロールとして役立つことができる。現在、そのようなキットは、陽性コントロールとして使用する既知のITP患者から得られるヒト血清のバイアルを包装する。そのような物質は、供給が限られており、集めるのに費用がかかり、制御されていない組成のものであり、そして実験室研究者に感染症の危険となる。
本発明には、抗血小板自己抗体をコードする核酸、抗血小板自己抗体、そのような結合のペプチドインヒビターもしくはペプチドインヒビターをコードする核酸のような化合物、および/または本発明の組成物、アプリケーター、ならびに本発明の方法を行うための化合物の使用を記述する説明用資料を含んでなる様々なキットが包含される。典型的なキットを以下に記述するが、他の有用なキットの内容は、本開示を考慮に入れると当業者に明らかである。これらのキットの各々は、本発明内に包含される。
[実施例]
特発性血小板減少性紫斑病(ITP)は、最も一般的な自己免疫性血液学的疾患であるが、分子レベルで関連する自己抗体についてほとんど知られていない。結果として、ITPの診断アッセイおよび治療は特異性を欠く。先行技術のB細胞不死化法により課される技術的制約を回避するために、レパートリークローニング(Fab/ファージディスプレイ)を用いて血小板自己抗体をクローン化し、そして免疫グロブリン(Ig)遺伝子使用、クローン性および抗原特異性の間の関係を調べた。ファージディスプレイライブラリーを慢性ITPにかかっている二人の患者からの脾臓細胞より構築し、そして競合的細胞表面選択を用いて数十のユニークなIgG血小板特異的自己抗体を単離した。すなわち、ヒト免疫レパートリーをクローン化するための分子手法、抗体ファージディスプレイ(Siegel et al.,2001,Transfus.Med.Rev.15:35−52)を新規の競合的細胞表面選択スキーム(Siegel et al.,1997,J.Immunol.Methods 206:73−85)と組み合わせて、慢性ITPにかかっている二人の関係のない患者からIgG抗血小板自己抗体のレパートリーを単離し、そして研究した。この戦略を用いて、数十のIgG血小板反応性自己抗体を各患者から単離し、従って、それらの遺伝的原因、体細胞突然変異の程度およびクローン関連性の総合的解析を可能にした。
血小板調製:
多血小板血漿(PRP)は、3μM/LのプロスタグランジンE1(PGE1;Sigma Chemicals,St Louis,MO)を含有するクエン酸ナトリウム(最終濃度、10.5mM/L)に集めた新たに単離された全血を室温で15分間遠心分離(500xg)することにより調製した。ある実験では、血小板は、CP2D抗凝固処理全血(Fenwall;Baxter Healthcare,Deerfield,IL)由来の新鮮貯蔵血小板濃縮物から得られた。両方の供給源からのPRPを1% wt/volウシ血清アルブミン(BSA)を補足した酸−クエン酸塩−デキストロース(ACD;145mM/Lの塩化ナトリウム、5mM/Lのクエン酸、9mM/Lのクエン酸ナトリウムおよび17mM/Lのデキストロース[pH6.5])において3回洗浄した。
患者:
Fab/ファージディスプレイライブラリーは、慢性ITPにかかっている2人の関係のない成人(ITP患者AおよびITP患者B)および血小板減少症にかかっているがITPではない1人のコントロール患者からの脾臓単核細胞より構築した。患者A(56歳の男性)および患者B(43歳の女性)は両方とも、少なくとも8ヶ月間プレドニゾンおよびIVIGでは効果がないITPにかかっていた。脾臓摘出後に、血小板数は正常範囲に上昇した。患者Aは、その後に関係のない原因で死亡し、そして患者Bは4年以上の間臨床的寛解期にある。非免疫性の多因子性血小板減少症にかかっている65歳の男性のコントロール患者からの脾臓細胞は、呼吸不全で死亡した後に検死解剖で採取した。
Fab/ファージディスプレイライブラリーの構築
Siegel et al.(1994,Blood 83:2334−2344)に記述されているIgG1 κおよびλ免疫レパートリーをクローン化するための以前に記述されている方法を用いて、約108個の脾臓細胞から全RNAを調製した。重鎖および軽鎖再編成Ig遺伝子セグメントを逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、そしてDNAをファージミド発現ベクター(pComb3H,Scripps Research Institute,La Jolla,CA)にクローン化した。XL1−Blue細菌(Stratagene,La Jolla)への電気穿孔およびVCSM13ヘルパーファージ(Stratagene)での共感染の後、pIIIバクテリオファージコートタンパク質に融合したヒトFab分子を発現する線状ファージ粒子にIg DNAをパッケージングした。
Fab/ファージディスプレイライブラリーのパニング
Fab/ファージディスプレイライブラリーをSiegel et al.(1997,J.Immunol.Methods 206:73−85)に記述されているような競合的細胞表面選択および磁気活性化細胞分類を用いる以前に記述されている方法の改変により血小板反応性Fabに関して濃縮した。簡潔に言えば、血小板をリン酸緩衝食塩水(PBS)およびPGE1においてBSAなしに洗浄し、5X108/mLの濃度になるように再懸濁し、そしてスルホ−N−ヒドロキシスクシンイミドビオチン(Pierce,Rockford,IL)を400μg/mLになるように加えることにより表面ビオチニル化した。ACDおよびBSAでの2回の洗浄の後、2X108個のビオチニル化血小板を20μLのストレプトアビジンで被覆した常磁性ミクロビーズ(Miltenyi Biotec,Sunnyvale,CA)と100μLのACD、BSAおよびPGE1の総容量において室温で10分間インキュベーションした。約5倍過剰(表面積により)のヒト赤血球(RBC;1X107)を含有するACD−BSAバッファー(1mL)を加えた。細胞混合物を遠心分離し、そして約3X1011コロニー形成単位のFab/ファージディスプレイライブラリーを含有する50μLのACD、BSAおよびPGE1に再懸濁した。断続的に混合しながら室温で2時間のインキュベーションの後、血小板、RBCおよびファージの懸濁液をACDおよびBSAで前もって平衡化したMiniMACSカラム(Mitenyi Biotec,Germany)上に載せた。カラム洗浄(RBSおよび関係のないFab−ファージを除くため)、血小板に結合したFabファージの溶出、およびパニングしたライブラリーの増幅は、Siegel et al.(1997,J.Immunol.Methods 206:73−85)に以前に記述されているように行った。
可溶性抗血小板Fab Igの製造
個々のモノクローナル血小板結合Fabをスクリーニングし、単離しそして特性化するために、ファージ滴定プレートから得られるランダムに選択した細菌コロニーを0.5の600nmでの光学密度まで増やし、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(1mM/L)を加え、そして培養物を30℃で一晩振盪した。可溶性FabをChang et al.(1998,Blood 91:3066−3078)におけるような浸透圧衝撃により細菌ペレットから単離し、そしてさらに精製せずにフローサイトメトリー実験および固相酵素免疫検定法(ELISA)において用いた。示される場合、可溶性Fabは、Siegel et al.(1994,Blood 83:2334−2344)におけるようにニッケルキレート化クロマトグラフィーにより精製した。細菌ペレットのアリコートを用いてヌクレオチドシーケンスもしくは抗体鎖シャッフリングのためのプラスミドDNAを調製した(Qiawell Plus;Qiagen,Valencia,CA)。Chang et al.(1998,Blood 91:3066−3078)において以前に記述されているように重鎖および軽鎖DNAをシーケンスしそして分析した。多数の配列(約60より多い)のために、抗体のサブセットの予測アミノ酸配列のアライメントのみがRoark et al.(2002,Blood 100:1388−1398)に示され、そして残りの配列アライメントは、該雑誌、すなわち、Bloodの公的に利用可能なウェブサイト上で提供され、それらの全ては本明細書にその全部が記載されるように引用することにより組み込まれる。さらに、配列データの全ては、本明細書の他のところに開示されている(例えば、図2A〜2Dを参照)。
フローサイトメトリーによる抗体結合の特性化
5μLのPRP(〜5X106個の血小板)および50μLのFabを用いることにより血小板を染色した。30分のインキュベーションの後、血小板をACDおよびBSAで洗浄し、そして洗浄バッファーに1:25希釈したヤギ抗ヒトF(ab)2特異的Ig(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)のフィコエリトリン(PE)結合F(ab)2フラグメントを用いることにより結合した抗体を検出した。サンプルをミクロ蛍光光度計(FACScan;Becton Dickinson,Mountain View,CA)を用いて分析した。血小板集団の前方および側方散乱光ゲートは、PE結合ヤギ抗マウス試薬(Southern Biotechnology,Birmingham,AL)で対比染色したマウス抗ヒトGPIIIa(SSA6;Dr J.Bennett,University of Pennsylvania)を用いることにより決定した。I型グランツマン血小板無力症にかかっている3人の関係のないドナーからの血小板は、Dr.M.Poncz(University of Pennsylvania)により提供された。GPIa/IIaを発現する安定なK562細胞系は、Dr M.Zutter(Washington University,St Louis,MO)により提供された。
ELISAおよび免疫蛍光法による抗体結合の特性化:
血小板GPIIb/IIIa、GPIb/IXもしくはGPIa/IIaに対する抗体は、PakAutoキット(GTI,Brookfield,WI)を用いることにより測定し;カルジオリピンに対するものは、QuantaLiteキット(Inova,San Diego,CA)で評価した。細胞質もしくは核決定基への結合は、HEp−2細胞(ANAキット、Antibodies Incorporated,Davis,CA)での免疫蛍光法により評価した。
血小板−Fab免疫複合体の免疫沈降:
ビオチニル化血小板膜タンパク質の免疫沈降は、免疫複合体を捕獲するためにプロテインL(Pierce)をプロテインAの代わりに用いたことを除いて、Hou et al.(1995,Eur.J.Haematol.55:307−314)におけるように以前に記述されているとおりに行った。沈降物質を非還元および還元条件下で4%〜12%ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてニトロセルロース膜上に電気泳動的にブロッティングした。沈殿したビオチニル化血小板膜タンパク質は、ビオチニル化西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン複合体(ABC染色キット、Pierce)で検出した。
軽鎖ライブラリーシャッフリング:
H44重鎖を軽鎖のライブラリーとランダムに組み合わせるために、クローンH44L4(ITP患者Aから単離されたGPIIb/IIIa特異的Fab)からの10μgのプラスミドDNAをSacIおよびXbaI(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)で37℃で6時間消化して内因性軽鎖L4を取り除き、そして重鎖を含有するベクターフラグメントをゲル精製した。元のパニングしていないITP患者Aライブラリーからのκおよびλ軽鎖セグメントの調製物は、ライブラリー調製中に得られる細菌ペレットより精製された同等量のプラスミドDNAをSacI/XbaIで消化し、そして切り出された軽鎖をゲル精製することにより得られた。次に、重鎖H44を含有するベクターを軽鎖のライブラリーに連結し、そしてXL1−Blue細菌に電気穿孔した。
血小板結合クローン間の重鎖および軽鎖の交換:
クローンH36/L76、H44/L4およびH47/L64からの軽鎖遺伝子セグメントをSacI/XbaI消化によりそれらのそれぞれのプラスミドDNAから遊離させ、そしてこれら3個のクローンからの制限生成物(すなわち、3個の重鎖含有プラスミドおよび3個の遊離した軽鎖)を組み合わせた。再連結は、3つの元のFabを再生し、そして6つの新規な重鎖−軽鎖組み合わせを生成した。細菌の形質転換後に、数十の細菌クローンをランダムに選択して血小板結合アッセイ用のFabを製造しそしてプラスミドDNAを単離して重鎖および軽鎖組成を決定した。
修飾したスタヒロコッカスプロテインAへのFab結合:
スタヒロコッカスプロテインA(SpA)の超抗原ドメインへのFabの結合は、Silverman et al.(1993,Immunomethods 2:17−32)におけるようにその天然のFc結合ドメインを破壊するために一塩化ヨウ素で化学的に修飾されているSpA(mod−SpAと称する)を用いてELISAにより測定した。Mod−SpA(50μL中1μg)を96ウェルマイクロプレートのウェル上に被覆し、そして4℃で一晩インキュベーションした。蒸留水ですすいだ後、ウェルをPBSおよび1% BSAで37℃で1時間ブロックし、そしてFabサンプルを加えた(50μL/ウェル)。37℃で2時間のインキュベーションの後、ウェルをPBSで3回洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトκ(1:10000)およびγ(1:5000)軽鎖試薬の混合物を加えた(Sigma Chemical)。ウェルを37℃でもう1時間インキュベーションし、PBSで再び洗浄し、そしてP−ニトロフェニルホスフェートで発色させた。
モノクローナルヒト血小板自己抗体の単離
本研究の目的は、慢性ITPにおける血小板自己抗体のレパートリーを遺伝子レベルで特性化することであった。レパートリーを単離するために、Fab/ファージディスプレイ技術を用いて、ヒトモノクローナル抗体を製造するためにB細胞不死化に依存する実験方法に固有の技術的制約を回避した。慢性ITPにかかっている二人の患者および多因子性血小板減少症にかかっているがITPに起因しないコントロール患者からの脾臓リンパ球よりIgG κおよびγライブラリーを構築した。全ての可能な自己抗原決定基をライブラリーに提示するために、そして天然の抗原構造を保ちそして捕獲を最適化する生理学的に適切な方法でそのようにするために、これらのライブラリー(各々、約2X108個より多い独立した形質転換体を含んでなる)を無傷血小板(単離された血小板膜GPとは対照的に)に対してパニングした。血小板結合物の選択を関係のない細胞タイプ(RBC)の存在下で行う磁気活性化競合的細胞表面パニング戦略を用いることにより、パン反応性(panreactive)もしくは非特異的Fab−ファージの捕獲を防いだ。
血小板自己抗体の配列分析:
39のユニークな血小板自己抗体からの重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列を、それらの遺伝的原因および可能な遺伝的相関性を調べるためにMedical Research Council,Cambridge,UKのCenter for Protein Engineerigウェブサイトで利用可能なヒトV遺伝子セグメントのV塩基ディレクトリで整列させた。図1(濃いボックス)に示すように、ITP患者Aからの全ての重鎖(6個のうち6個)およびITP患者Bからの4個以外の全ての重鎖(33個のうち29個)はVH3−30を使用した。軽鎖可変領域遺伝子の使用はそれほど拘束がなかったが、Vκ遺伝子A19/A3、A27およびL6を包含するVL遺伝子の限られた組を含んでなった。
組み換え血小板自己抗体特異性の同定:
ITPにかかっている患者からの自己抗体は、van Leeuwen et al.(1982,Blood 59:23−62)、Kiefel et al.(1991,Brit.J.Haematol.79:256−262)、He et al.(1994,Blood 83:1024−1032)、Hou et al.(1995,Eur.J.Haematol.55:307−314)、Olee et al.(1997,Brit.J.Haematol.96:836−845)、Kunicki et al.(1991,J.Autoimmun.4:415−431)、Woods et al.(1984,Blood 63:368−375)、Woods et al.(1984,Blood 64:156−160)、McMillan et al.(1987,Blood 70:1040−1045)およびGruel et al.(1995,Semin.Thromb.Hemost.21:60−67)に記述されているように、血小板糖タンパク質GPIIb/IIIaもしくはGPIb/IXからなる複合体を認識することが多い。しかしながら、他の同定されたおよび同定されていない抗原に対する自己抗体が、例えば、He et al.(1994,Blood 83:1024−1032),Bierling et al.(1994,Brit.J.Haematol.87:631−633)、Hou et al.(1995,Eur.J.Haematol.55:307−314)、Pfueller et al.(1990,Brit.J.Haematol.74:336−341)、Sugiyama et al.(1987,Blood 69:1712−1720)、Tomiyama et al.(1992,Blood 79:161−168)、Deckmyn et al.(1994,Blood 84:1968−1974)、Honda et al.(1990,Brit.J.Haematol 75:245−249)およびVaron et al.(1990,Clin.Immunol.Immunopathol.54:454−468)に記述されている。
GPIIb/IIIa特異性へのH44L4の重鎖および軽鎖の寄与:
ある種の抗体では、抗原特異性は、Chang et al.(1991,J.Immunol.146:176−182)、Hoet et al.(1999,J.Immunol.163:3304−3312)、Ohlin et al.(1996,Mol.Immunol.33:47−56)およびSmith−Gill et al.(1987,J.Immunol.139:4135−4144)におけるように一方もしくはもう一方の成分鎖により主に決定される。Fab H44L4の抗原標的としての血小板GPIIb/IIIa複合体の同定は、抗原認識へのその構成要素重鎖および軽鎖の寄与の試験を可能にした。H44L4のVH3−30重鎖がGPIIb/IIIa結合に単独で関与する場合、用いられる特定の軽鎖は、それが許容である限り、ほとんど関連性がないかもしれない。あるいはまた、VH3−30重鎖の優れた特異性は、Chang et al.(1998,Blood 91:3066−3078)に記述されているように組み合わされる軽鎖により改変されるかもしくは実際に決定されるかもしれない。ファージディスプレイ由来の抗体の分子操作の施しやすさは、この問題を詳細に調べることを可能にした。
SpAの超抗原ドメインへの血小板自己抗体の結合
慢性ITPにおいてまれにしか有効でない処置である(Williams et al.,1990,Current Studies in Hematology and Blood Transfusion,Karger,Basel,Switzerland;およびOwen et al.,1997,Apheresis:Principles and Practice,pp.225−226,AABB Press Bethesda,MD)、血漿交換中に除かれるIgGの量は除かれるものの約2%のみである(Bussel et al.,2000,Hematology:Basic Principles and Practice pp.2097−2114,Churchill Livingstone,Philadelphia,PA;およびVamvakas et al.,1997,Apheresis:Principles and Practice,pp.375−407,AABB Press,Bethesda,MD)ことを考えれば、SpAを含有するアフィニティーカラムでのITP患者からの血漿の体外吸収は有効なことがある機序は不明である。
血小板自己抗体は、VH遺伝子の限られた組によりコードされる
VH3−30重鎖遺伝子の使用は、一般ライブラリーにおけるその発生頻度と比較してそして抗原特異性における違いにもかかわらずITPにかかっている両方の患者からの血小板反応性Fab間で高度に表示されることが見出された(フィッシャーの直接確率検定によりP<10−13;図1および4)。興味深いことに、この同じ重鎖遺伝子は、ITPにかかっている別の患者からハイブリドーマ技術により得られるIgM抗GPIIb自己抗体(Kunicki et al.,1991,J.Autoimmun.4:433−446;Kunicki et al.,1991,J.Autoimmun.4:415−431)、ならびにIVIGに結合するそれらの能力のために選択されるITP患者からのいくつかの血小板反応性IgGファージディスプレイ由来の抗体(例えば、Jendreyko et al.,1998,Eur.J.Immunol.28:4236−4247;Fischer et al.,1999,Brit.J.Haematol.105:626−640)をコードすることが見出された。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、抗血小板自己抗体のVH3−30重鎖遺伝子へのこの顕著な遺伝子拘束は、VH3−30および関連する遺伝子産物が増大されるかもしくは疾病病因に関与する(例えば、Efremov et al.,1996,Blood 87:3869−3876;Efremov et al.,1997,Ann.N.Y.Acad.Sci.815:443−447;Roben et al.,1996,J.Clin.Invest.98:2827−2837;Braun et al.,1992,J.Clin.Invest.89:1395−1402;Berberian et al.,1993,Science 261:1588−1591;Wisnewski et al.,1996,J.Acquir.Immune.Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.11:31−38;およびBettaieb et al.,1996,Clin.Exp.Immunol.103:19−23を参照)、自己免疫性溶血性貧血、SLE、慢性リンパ性白血病、CVIDおよびHIV感染のような、一見したところ関係のない疾患とITPとの関連性に説明を与えることができる。
慢性ITPにおける自己抗原の役割およびクローン性増殖
ヒト自己免疫疾患の研究は、関連する自己抗体が病因に明白に関与することが明らかである、ITPのような疾患に焦点を当てることにより大きく促進される。しかしながら、自己反応性抗体の発生において自己抗原により果たされる役割および自己免疫応答のクローン性は、まだ十分に理解されていない。軽鎖拘束に基づいて、以前の報告は、慢性ITPにおける血小板自己抗体がクローン的に拘束されることを示唆した(van der Harst et al.,1990,Blood 76:2321−2326;Christie et al.,1993,Brit.J.Haematol.85:277−284;Stockelberg et al.,1995,Brit.J.Haematol.90:175−179;Stockelberg et al.,1996,Ann.Haematol.72:29−34;およびMcMillan et al.,2001,Thromb.Haemost.85:821−823)。
VH遺伝子拘束の臨床的および治療的意味あい
慢性ITPの現在の処置は、比較的非特異的な免疫介入を特徴とする。VH3−30重鎖遺伝子への血小板自己抗体の拘束が、追加の免疫レパートリーの研究により確認される場合、この拘束の利用は、免疫療法のさらに標的を絞った形態の設計を容易にすることができる。例えば、SpAは、ある種のVH3によりコードされるIg、特にVH3−30の遺伝子産物に特異的である、そのよく特性化されたFc結合ドメインと異なる、B細胞超抗原部位を有することが既知である(Silverman,1998,Semin.Immunol.10:43−55;およびGraille et al.2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:5399−5404)。この活性と一致して、本明細書の他のところに開示するデータは、血小板上でのITP患者AおよびBファージディスプレイライブラリーのパニングが、血小板およびmod−SpA結合物の両方の同時濃縮をもたらしたことを示す(図7)。マウスでの研究において、アポトーシス細胞死によるVH3−30ホモログの的を絞った欠失は、組み換えmod−SpA超抗原のインビボ投与で起こり(例えば、Silverman et al.,2000,J.Exp.Med.192:87−98;およびGoodyear et al.,2001,Arthritis Rheum.44:S296)、少量のmod−SpAの注入が、ITPにおける血小板自己抗体の生産を同様にダウンレギュレーションする可能性があることを示唆する。これに関して、そして記述されているような(Sasso et al.,2000,Arthritis Rheum.43:1344)体外免疫吸収処置中のSpA−シリカカラムからの200μgまでのSpAの離脱を示す最近の研究を考慮に入れると、長期の寛解は注入したSpAの結果であり、そしてカラム自体による抗体の除去の結果ではない可能性がある。マウス(Crowley et al.,1990,Mol.Immunol.27:87−94;およびShokri et al.,1991,J.Immunol.146:936−940)もしくはヒト(Fischer et al.,1999,Brit.J.Haematol.105:626−640)由来の抗イディオタイプ抗体のような、このもしくは他のVH3−30を標的とする試薬の治療効果を試験する将来の研究は、免疫レパートリー組成を調節する新規な方法を提供し得る。さらに、血小板自己抗体の遺伝的原因の迅速な同定のための試薬の開発は、個々の患者におけるそのような新規な分子治療法への反応性を予測するのに役立つことができる。
本明細書の他のところに開示する「H44L4」と称するヒト抗GPIIb/IIIaモノクローナル抗血小板自己抗体が結合する血小板糖タンパク質(GP)IIb/IIIa上のエプトープを特定するためにペプチドファージディスプレイを用いた。ペプチドファージディスプレイ技術を用いて得ることができるもののような、小分子「ペプチド模倣物」は、GPIIb/IIIa上のどこにH44L4が結合するかを位置づけるのに役立つだけでなく、インビボでそのような血小板自己抗体の結合を阻害することができる注入可能な薬剤の開発のためのリードとして役立つことができる立体配座エピトープの構造を推測することができる。
H44L4が血小板GPIIb/IIIa分子(GPIIb/IIIa、インテグリン分子は、αIIbβ3とも呼ばれる)上のどこに結合するかを評価するために、αIIbβ3もしくはαIIb−αVβ3キメラ(ここで、αIIbのセグメント(アミノ酸1〜459、1〜223、223〜459もしくはアミノ酸447〜1009のいずれか)をαV(αVβ3もまたインテグリンファミリーのメンバーであり、そして「ビトロネクチン受容体」として知られている)のその部分に置換した)のいずれかを発現する一組のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞とH44L4をインキュベーションした。これらのエピトープマッピングアッセイおよびキメラは、McMillan et al.(2000,Brit.J.Haematol.118:1132−1136)により以前に記述された。それらの研究において、McMillan et al.は、ポリクローナル患者血清もしくは血小板溶出液を試験した(H44L4は、これまでに同定された血小板に対する最初のヒトモノクローナル自己抗体である)。McMillan et al.は、患者由来のポリクローナル抗体物質のほとんどすべてが、結合するためにαIIbのN末端部分を必要としたことを示唆する。
ITP患者において見られる出血は、一般に、血小板の量的欠乏のせいであり、すなわち、抗血小板自己抗体は患者の血小板に結合し、そしてそれらを脾臓マクロファージによる食作用によって取り除かせる。しかしながら、起こり得る出血のいくらかは質的欠乏のためであり得る、すなわち、血小板への血小板自己抗体の結合はそれらの機能を妨げることができ、そして該抗体が脾臓における血小板除去および破壊も誘導するかどうかに影響を及ぼすことができるとも考えられている。
血小板活性化の際に、GPIIb/IIIa(αIIbβ3とも呼ばれる)はフィブリノーゲンの結合の低親和性状態から高親和性状態になる。フィブリノーゲンの結合は、次に、血小板凝集を媒介する。このプロセスを妨げることは、血小板アンタゴニストを開発するために用いられる方法であり、例えば、ヒト化マウスモノクローナル抗体ReoProTMは、GPIIb/IIIaへの結合に関してフィブリノーゲンと競合することによりこれを行う。この競合は、その可変領域にフィブリノーゲンの重要なRGD配列を有する抗体により促進される。
Claims (61)
- 哺乳類における抗血小板自己抗体を同定する方法であって、該哺乳類から得られるBリンパ球より抗体ファージディスプレイライブラリーを作製すること、血小板成分と特異的に結合するファージを検出するために該ライブラリーをスクリーニングすることを含んでなり、ここで、該スクリーニングは競合的細胞表面パニングを用いて無傷血小板上で該ファージをパニングすることを含んでなり、それにより該哺乳類における該抗血小板自己抗体を同定する方法。
- 該哺乳類がヒトである請求項1の方法。
- 該哺乳類が特発性血小板減少性紫斑病に苦しむ請求項2の方法。
- 該血小板成分がGPIa/IIa、GPIIb/IIIaおよびGPIb/IXよりなる群から選択される請求項1の方法。
- 請求項1の方法により同定される自己抗体。
- ヒトモノクローナル抗血小板自己抗体。
- 該自己抗体がIgG抗体である請求項6の自己抗体。
- さらに該自己抗体がGPIIb/IIIaと特異的に結合する請求項6の自己抗体。
- 該自己抗体がGPIIb/IIIaと特異的に結合するが、結合にαIIbのN末端部分を必要としない請求項8の自己抗体。
- 該N末端部分が該αIIb(GenBank受託番号P08514;配列番号:153)の約アミノ酸残基番号1〜約アミノ酸残基番号446を含んでなる請求項9の自己抗体。
- 該自己抗体がαIIb(GenBank受託番号P08514;配列番号:153)の約アミノ酸残基番号447〜約アミノ酸残基番号1009を含んでなるGPIIb/IIIaの結合部分を必要とする請求項9の自己抗体。
- 自己抗体がH44L4[配列番号:64(H44)および配列番号:70(L4)]、H46L16[配列番号:66(H46)および配列番号:71(L16)]、H48L24[配列番号:68(H48)および配列番号:72(L24)]、H36L35[配列番号:57(H36)および配列番号:74(L35)]、H40L36[配列番号:61(H40)および配列番号:75(L36)]、H83L34[配列番号:69(H83)および配列番号:73(L34)]、H39L37[配列番号:60(H39)および配列番号:76(L37)]、H42L38[配列番号:63(H42)および配列番号:77(L38)]、H38L39[配列番号:59(H38)および配列番号:78(L39)]、H37L40[配列番号:58(H37)および配列番号:79(L40)]、H37L41[配列番号:58(H37)および配列番号:80(L41)]、H40L42[配列番号:61(H40)および配列番号:81(L42)]、H39L43[配列番号:60(H39)および配列番号:82(L43)]、H37L44[配列番号:58(H37)および配列番号:83(L44)]、H39L44[配列番号:60(H39)および配列番号:83(L44)]、H37L45[配列番号:58(H37)および配列番号:84(L45)]、H39L46[配列番号:60(H39)および配列番号:85(L46)]、H37L47[配列番号:58(H37)および配列番号:86(L47)]、H37L48[配列番号:58(H37)および配列番号:87(L48)]、H38L49[配列番号:59(H38)および配列番号:88(L49)]、H37L50[配列番号:58(H37)および配列番号:89(L50)]、H41L51[配列番号:62(H41)および配列番号:90(L51)]、H40L52[配列番号:61(H40)および配列番号:91(L52)]、H40L53[配列番号:61(H40)および配列番号:92(L53)]、H38L54[配列番号:59(H38)および配列番号:93(L54)]、H38L55[配列番号:59(H38)および配列番号:94(L55)]、H45L61[配列番号:84(H45)および配列番号:95(L61)]、H47L63[配列番号:67(H47)および配列番号:96(L63)]、H47L64[配列番号:67(H47)および配列番号:97(L64)]、H38L72[配列番号:59(H38)および配列番号:98(L72)]、H38L74[配列番号:59(H38)および配列番号:99(L74)]、H38L75[配列番号:59(H38)および配列番号:100(L75)]、H38L76[配列番号:59(H38)および配列番号:101(L76)]、H36L76[配列番号:57(H36)および配列番号:101(L76)]、H37L92[配列番号:58(H37)および配列番号:103(L92)]、H29L104[配列番号:56(H29)および配列番号:104(L104)]、H4L106[配列番号:54(H4)および配列番号:105(L106)]ならびにH10L122[配列番号:55(H10)および配列番号:106(L122)]よりなる群から選択される抗血小板自己抗体。
- 自己抗体が配列番号:54(H4)、配列番号:55(H10)、配列番号:56(H29)、配列番号:57(H36)、配列番号:58(H37)、配列番号:59(H38)、配列番号:60(H39)、配列番号:61(H40)、配列番号:62(H41)、配列番号:63(H42)、配列番号:64(H44)、配列番号:65(H45)、配列番号:66(H46)、配列番号:67(H47)、配列番号:68(H48)および配列番号:69(H83)よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含んでなる抗血小板自己抗体。
- 該自己抗体が配列番号:70(L4)、配列番号:71(L16)、配列番号:72(L24)、配列番号:73(L34)、配列番号:74(L35)、配列番号:75(L36)、配列番号:76(L37)、配列番号:77(L38)、配列番号:78(L39)、配列番号:79(L40)、配列番号:80(L41)、配列番号:81(L42)、配列番号:82(L43)、配列番号:83(L44)、配列番号:84(L45)、配列番号:86(L47)、配列番号:87(L48)、配列番号:88(L49)、配列番号:89(L50)、配列番号:90(L51)、配列番号:91(L52)、配列番号:92(L53)、配列番号:93(L54)、配列番号:94(L55)、配列番号:95(L61)、配列番号:96(L63)、配列番号:97(L64)、配列番号:98(L72)、配列番号:99(L74)、配列番号:100(L75)、配列番号:101(L76)、配列番号:102(L125)、配列番号:103(L92)、配列番号:104(L104)、配列番号:105(L106)および配列番号:106(L122)よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖をさらに含んでなる請求項13の自己抗体。
- 該重鎖がH38(配列番号:78)であり、そして該軽鎖がL39(配列番号:78)、L54(配列番号:93)、L55(配列番号:94)、L72(配列番号:98)、L74(配列番号:99)、L75(配列番号:100)、L76(配列番号:101)およびL92(配列番号:103)よりなる群から選択される請求項14の自己抗体。
- 該重鎖がH37であり、そして該軽鎖がL40、L41、L44、L45、L47、L48、L50、L93よりなる群から選択される請求項14の自己抗体。
- 自己抗体が配列番号:70(L4)、配列番号:71(L16)、配列番号:72(L24)、配列番号:73(L34)、配列番号:74(L35)、配列番号:75(L36)、配列番号:76(L37)、配列番号:77(L38)、配列番号:78(L39)、配列番号:79(L40)、配列番号:80(L41)、配列番号:81(L42)、配列番号:82(L43)、配列番号:83(L44)、配列番号:84(L45)、配列番号:85(L46)、配列番号:86(L47)、配列番号:87(L48)、配列番号:88(L49)、配列番号:89(L50)、配列番号:90(L51)、配列番号:91(L52)、配列番号:92(L53)、配列番号:93(L54)、配列番号:94(L55)、配列番号:95(L61)、配列番号:96(L63)、配列番号:97(L64)、配列番号:98(L72)、配列番号:99(L74)、配列番号:100(L75)、配列番号:101(L76)、配列番号:102(L125)、配列番号:103(L92)、配列番号:104(L104)、配列番号:105(L106)および配列番号:106(L122)よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含んでなる抗血小板自己抗体。
- 該自己抗体が配列番号:54(H4)、配列番号:55(H10)、配列番号:56(H29)、配列番号:57(H36)、配列番号:58(H37)、配列番号:59(H38)、配列番号:60(H39)、配列番号:61(H40)、配列番号:62(H41)、配列番号:63(H42)、配列番号:64(H44)、配列番号:65(H45)、配列番号:66(H46)、配列番号:67(H47)、配列番号:68(H48)および配列番号:69(H83)よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖をさらに含んでなる請求項17の自己抗体。
- 該軽鎖がL76であり、そして該重鎖がH36およびH38よりなる群から選択される請求項17の自己抗体。
- 抗血小板自己抗体をコードする単離された核酸。
- 該単離された核酸が重鎖をコードし、そして配列番号:1(H4)、配列番号:2(H10)、配列番号:3(H29)、配列番号:4(H36)、配列番号:5(H37)、配列番号:6(H38)、配列番号:7(H39)、配列番号:8(H40)、配列番号:9(H41)、配列番号:10(H42)、配列番号:11(H44)、配列番号:12(H45)、配列番号:13(H46)、配列番号:14(H47)、配列番号:15(H48)、配列番号:16(H83)よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる請求項20の単離された核酸。
- 該核酸が軽鎖をコードし、そして配列番号:17(L4)、配列番号:18(L16)、配列番号:19(L24)、配列番号:20(L34)、配列番号:21(L35)、配列番号:22(L36)、配列番号:23(L37)、配列番号:24(L38)、配列番号:25(L39)、配列番号:26(L40)、配列番号:27(L41)、配列番号:28(L42)、配列番号:29(L43)、配列番号:30(L44)、配列番号:31(L45)、配列番号:32(L46)、配列番号:33(L47)、配列番号34(L48)、配列番号:35(L49)、配列番号:36(L50)、配列番号:37(L51)、配列番号:38(L52)、配列番号:39(L53)、配列番号:40(L54)、配列番号:41(L55)、配列番号:42(L61)、配列番号:43(L63)、配列番号:44(L64)、配列番号:45(L72)、配列番号:46(L74)、配列番号:47(L75)、配列番号:48(L76)、配列番号:49(L125)、配列番号:50(L92)、配列番号:51(L104)、配列番号:52(L106)および配列番号:53(L122)よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる請求項20の単離された核酸。
- 該核酸が配列番号:54(H4)、配列番号:55(H10)、配列番号:56(H29)、配列番号:57(H36)、配列番号:58(H37)、配列番号:59(H38)、配列番号:60(H39)、配列番号:61(H40)、配列番号:62(H41)、配列番号:63(H42)、配列番号:64(H44)、配列番号:65(H45)、配列番号:66(H46)、配列番号:67(H47)、配列番号:68(H48)および配列番号:69(H83)よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖をコードする請求項20の単離された核酸。
- 該核酸が配列番号:70(L4)、配列番号:71(L16)、配列番号:72(L24)、配列番号:73(L34)、配列番号:74(L35)、配列番号:75(L36)、配列番号:76(L37)、配列番号:77(L38)、配列番号:78(L39)、配列番号:79(L40)、配列番号:80(L41)、配列番号:81(L42)、配列番号:82(L43)、配列番号:83(L44)、配列番号:84(L45)、配列番号:85(L46)、配列番号:86(L47)、配列番号:87(L48)、配列番号:88(L49)、配列番号:89(L50)、配列番号:90(L51)、配列番号:91(L52)、配列番号:92(L53)、配列番号:93(L54)、配列番号:94(L55)、配列番号:95(L61)、配列番号:96(L63)、配列番号:97(L64)、配列番号:98(L72)、配列番号:99(L74)、配列番号:100(L75)、配列番号:101(L76)、配列番号:102(L125)、配列番号:103(L92)、配列番号:104(L104)、配列番号:105(L106)および配列番号:106(L122)よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖をコードする請求項20の単離された核酸。
- 血栓を有するかもしくは血栓形成の危険がある哺乳類において血液凝固を阻害する方法であって、糖タンパク質IIb/IIIaと特異的に結合する抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量を該哺乳類に投与することを含んでなり(ここで、該抗体もしくはそのフラグメントは、H44L4抗血小板自己抗体由来の抗原結合領域を含んでなる)、それにより該哺乳類における血液凝固を阻害する方法。
- 該哺乳類がヒトである請求項25の方法。
- 血栓を有するかもしくは血栓形成の危険がある哺乳類において血液凝固を可逆的に阻害する方法であって、糖タンパク質IIb/IIIaと特異的に結合する抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量を該哺乳類に投与することを含んでなり(ここで、該抗体もしくはそのフラグメントは、H44L4抗血小板自己抗体由来の抗原結合領域を含んでなる)、それにより該哺乳類における血液凝固を阻害し、さらに糖タンパク質IIb/IIIaとの該結合のペプチドインヒビターの有効量を該哺乳類に投与することを含んでなり、それにより該哺乳類における血液凝固を可逆的に阻害する方法。
- 該哺乳類がヒトである請求項27の方法。
- 該ペプチドインヒビターがP4−12(配列番号:111)、P3−4(配列番号:112)、P4−7(配列番号:113)、P4−2a(配列番号:114)よりなる群から選択される請求項27の方法。
- 血小板成分と抗血小板自己抗体との結合を阻害する方法であって、該自己抗体を該結合のペプチドインヒビターと接触させることを含んでなり、それにより該成分と該抗血小板自己抗体との結合を阻害する方法。
- 該成分がGPIIb/IIIaであり、そしてさらに該自己抗体がH44L4であり、そして該ペプチドインヒビターがP4−12(配列番号:111)、P3−4(配列番号:112)、P4−7(配列番号:113)、P4−2a(配列番号:114)、P73−11(配列番号:116)、P123−10(配列番号:118)、P74−4(配列番号:120)、P73−10(配列番号:122)、P74−3(配列番号:124)、P74−9(配列番号:126)、P74−5(配列番号:128)、P73−9(配列番号:130)、P124−8(配列番号:132)、P123−11(配列番号:134)、P124−1(配列番号:136)、P73−2(配列番号:138)、P73−6(配列番号:140)、P124−11(配列番号:142)、P124−2(配列番号:144)、P73−7(配列番号:146)、P74−1a(配列番号:148)、P123−8(配列番号:150)、P74−8(配列番号:152)よりなる群から選択される請求項30の方法。
- 哺乳類における血小板粘着を阻害する方法であって、抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量を該哺乳類に投与することを含んでなり(ここで、該自己抗体はGPIb/IXと特異的に結合し、それにより血小板粘着に必要とされるフォン・ビルブラントマルチマーと該GPIb/IXとの相互作用を阻害する)、それにより該哺乳類における血小板粘着を阻害する方法。
- 該哺乳類がヒトである請求項32の方法。
- 哺乳類における血栓性血小板減少性紫斑病を処置する方法であって、抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量を該動物に投与することを含んでなり(ここで、該自己抗体はGPIb/IXと特異的に結合し、それによりフォン・ビルブラントマルチマーと該GPIb/IXとの相互作用を阻害し、そしてここで、該相互作用は血小板粘着に必要とされ、そしてさらにここで、該血小板粘着は該哺乳類における血栓性血小板減少性紫斑病を媒介する)、それにより該哺乳類における血栓性血小板減少性紫斑病を処置する方法。
- 該哺乳類がヒトである請求項34の方法。
- 血小板を抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量と接触させることを含んでなる血小板凝集を阻害する方法。
- さらに該自己抗体がGPIIb/IIIaと特異的に結合する請求項36の方法。
- 該自己抗体がH44L4[配列番号:64(H44)および配列番号:70(L4)]である請求項37の方法。
- 血小板を抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量と接触させることを含んでなる血小板活性化を阻害する方法。
- 血小板を抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量と接触させることを含んでなる血小板機能を阻害する方法。
- 該自己抗体がGPIa/IIa、GPIIb/IIIaおよびGPIb/IXよりなる群から選択される血小板成分と特異的に結合する請求項40の方法。
- 血小板と抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントとの結合を阻害する方法であって、該自己抗体をペプチドインヒビターの有効量と接触させることを含んでなり、それにより該血小板と該自己抗体との結合を阻害する方法。
- 該自己抗体がGPIa/IIa、GPIIb/IIIaおよびGPIb/IXよりなる群から選択される少なくとも1つの血小板成分と特異的に結合する請求項42の方法。
- 該ペプチドインヒビターがP4−12(配列番号:111)、P3−4(配列番号:112)、P4−7(配列番号:113)、P4−2a(配列番号:114)、P73−11(配列番号:116)、P123−10(配列番号:118)、P74−4(配列番号:120)、P73−10(配列番号:122)、P74−3(配列番号:124)、P74−9(配列番号:126)、P74−5(配列番号:128)、P73−9(配列番号:130)、P124−8(配列番号:132)、P123−11(配列番号:134)、P124−1(配列番号:136)、P73−2(配列番号:138)、P73−6(配列番号:140)、P124−11(配列番号:142)、P124−2(配列番号:144)、P73−7(配列番号:146)、P74−1a(配列番号:148)、P123−8(配列番号:150)、P74−8(配列番号:152)よりなる群から選択される請求項43の方法。
- 血小板と抗血小板自己抗体との結合を阻害するペプチドを同定する方法であって、ペプチドディスプレイファージの有無で血小板と抗血小板自己抗体との結合を評価することを含んでなり(ここで、該ペプチドディスプレイファージのない場合の該血小板と該自己抗体との結合と比較して該ペプチドディスプレイファージの存在下での該血小板と該自己抗体との結合の低いレベルは、該ペプチドディスプレイファージにより提示されるペプチドが、該血小板と該自己抗体との結合を阻害することの指標となる)、それにより血小板と抗血小板自己抗体との結合を阻害するペプチドを同定する方法。
- 請求項45の方法により同定されるペプチド。
- 血小板成分と抗血小板自己抗体との結合を阻害するペプチドを同定する方法であって、ペプチドディスプレイファージの有無で血小板成分と抗血小板自己抗体との結合を評価することを含んでなり(ここで、該ペプチドディスプレイファージのない場合の該血小板成分と該自己抗体との結合と比較して該ペプチドディスプレイファージの存在下での該血小板成分と該自己抗体との結合の低いレベルは、該ペプチドディスプレイファージにより提示されるペプチドが、該血小板成分と該自己抗体との結合を阻害することの指標となる)、それにより血小板成分と抗血小板自己抗体との結合を阻害するペプチドを同定する方法。
- 該血小板成分がGPIa/IIa、GPIIb/IIIaおよびGPIb/IXよりなる群から選択される請求項47の方法
- 請求項47の方法により同定されるペプチド。
- 抗血小板自己抗体と結合するペプチドを同定する方法であって、ペプチドディスプレイファージを抗血小板自己抗体と接触させることおよび該ファージが該自己抗体と特異的に結合するかどうかを検出することを含んでなり、それにより抗血小板自己抗体と特異的に結合するペプチドを同定する方法。
- 請求項50の方法により同定されるペプチド。
- 抗血小板自己抗体と特異的に結合するペプチド。
- 哺乳類における特発性血小板減少性紫斑病(ITP)を処置する方法であって、ITPに苦しむ動物にVH3−30を発現するBリンパ球を特異的に殺す化合物の有効量を投与することを含んでなり、それにより該哺乳類における該ITPを処置する方法。
- 該哺乳類がヒトである請求項53の方法。
- 該化合物がスタヒロコッカスプロテインA(SpA)およびVH3−30と特異的に結合する抗体部分を含んでなる免疫毒素から選択される請求項53の方法。
- 糖タンパク質IIb/IIIaと特異的に結合する抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量を含んでなり(ここで、該自己抗体もしくはそのフラグメントは、H44L4抗血小板自己抗体由来の抗原結合領域を含んでなる)、さらにアプリケーターおよびその使用のための説明用資料を含んでなる血液凝固を阻害するためのキット。
- 糖タンパク質IIb/IIIaと特異的に結合する抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量を含んでなり(ここで、該自己抗体もしくはそのフラグメントは、H44L4抗血小板自己抗体由来の抗原結合領域を含んでなる)、さらに糖タンパク質IIb/IIIaとの該結合のペプチドインヒビターを含んでなり、そしてまたアプリケーターおよびその使用のための説明用資料も含んでなる血液凝固を可逆的に阻害するためのキット。
- 抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量を含んでなり、さらにアプリケーターおよびその使用のための説明用資料を含んでなる血小板凝集を阻害するためのキット。
- 抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量を接触させることを含んでなり、さらにアプリケーターおよびその使用のための説明用資料を含んでなる血小板機能を阻害するためのキット。
- 抗血小板自己抗体もしくはその生物学的活性フラグメントの有効量を接触させることを含んでなり、さらにアプリケーターおよびその使用のための説明用資料を含んでなる血小板活性化を阻害するためのキット。
- 該方法が血栓溶解剤を投与することをさらに含んでなる請求項25の方法。
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